BR112019020697A2

BR112019020697A2 - homoserina desidrogenase modificada e método para a produção de homoserina ou l-aminoácido derivado de homoserina que utiliza a mesma

Info

Publication number: BR112019020697A2
Application number: BR112019020697-3A
Authority: BR
Inventors: Hyo Jin Kim; Lan HUR; Sang Jo Lim; Hyun Ah Kim; Hyung Joon Kim; Chang Il SEO; Seung Bin LEE; Ji Sun Lee
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2018-05-28
Filing date: 2019-05-21
Publication date: 2021-02-17
Also published as: US11555213B2; HUE062601T2; ES2944588T3; AU2019279282A1; PH12020551031A1; TWI740150B; CN110945121A; SG11202006718YA; BR112019020697B1; AR115415A1; CA3091741A1; AU2019279282B2; CN110945121B; RU2733426C1; US20210002682A1; CA3091741C; CN112143719B; EP3597738B1; WO2019231159A1; US11236374B2

Abstract

A presente revelação refere-se à homoserina desidrogenase modificada e a um método para produzir um L-aminoácido derivado de homoserina utilizando a mesma.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “HOMOSERINA DESIDROGENASE MODIFICADA E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE HOMOSERINA OU L-AMINOÁCIDO DERIVADO DE HOMOSERINA QUE UTILIZA A MESMA” [CAMPO DA TÉCNICA]

[001] A presente revelação refere-se à homoserina desidrogenase modificada. Especificamente, a presente revelação refere-se à homoserina desidrogenase modificada que possui um polipeptídeo compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos em uma sequência de aminoácidos de uma proteína com a atividade de homoserina desidrogenase, em que a substituição de aminoácidos é realizada substituindo o aminoácido na posição 285 por isoleucina; o aminoácido na posição 398 por glutamina; ou os aminoácidos em ambas as posições por isoleucina e glutamina, respectivamente. Além disso, a presente revelação refere-se a um método para a produção de homoserina ou L-aminoácido derivado de homoserina utilizando a homoserina desidrogenase modificada, uma composição para produzir homoserina ou um L-aminoácido derivado de homoserina, um método para aumentar a capacidade de produção de homoserina ou um L-aminoácido derivado de homoserina, ou um uso da homoserina desidrogenase modificada.

[ANTECEDENTES DA TÉCNICA]

[002] Entre L-aminoácidos, L-treonina, L- isoleucina e L-metionina comumente usam homoserina produzida pela homoserina desidrogenase (doravante denominada "hom"; EC:1.1.1.3) de aspartato-semialdeído (doravante referido como "ASA"). Portanto, para produzir os aminoácidos por meio de um método de fermentação, é essencial manter as atividades das enzimas usadas na via biossintética em um determinado nível ou mais elevadas, e pesquisas intensivas foram conduzidas.

[003] Em particular, sabe-se que a atividade de homoserina desidrogenase que atua no ponto de ramificação das vias biossintéticas da L-lisina e L-treonina é regulada pela L-treonina e L-isoleucina. Recentemente, houve vários relatos sobre hom dessensibilizadas à inibição de retroalimentação pela L-treonina e um método para produzir L-treonina utilizando a mesma. Em 1991, Eikmann et al. na Alemanha relatou hom dessensibilizada por substituição de glicina, que é o resíduo de aminoácido na posição 378 de hom, por glutamato (Eikmanns BJ et al., Appl. Microbial Biotechnol. 34: 617-622, 1991); e em 1991, Archer et al.

relataram que a dessensibilização ocorre quando o terminal C de hom é danificado devido a uma mutação de mudança de estrutura (Archer JA et al., Gene 107: 53-59, 1991).

[REVELAÇÃO] [PROBLEMA TÉCNICO]

[004] Os presentes inventores conduziram um estudo sobre dessensibilização à inibição de retroalimentação pela treonina e, como resultado, descobriram que um novo gene que codifica hom modificada é isolado e que a capacidade de produção de L-aminoácido é aprimorada em um microrganismo no qual o novo gene é transduzido, completando assim a presente revelação.

[SOLUÇÃO TÉCNICA]

[005] Um objetivo da presente revelação é fornecer homoserina desidrogenase modificada com um polipeptídeo compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos em uma sequência de aminoácidos de uma proteína tendo a atividade de homoserina desidrogenase, em que a substituição de aminoácidos é realizada substituindo o aminoácido na posição 285 por outro aminoácido; o aminoácido na posição 398 por outro aminoácido; ou os aminoácidos em ambas as posições com outros aminoácidos.

[006] Outro objetivo da presente revelação é fornecer um polinucleotídeo que codifica a desidrogenase modificada.

[007] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um microrganismo do gênero Corynebacterium, compreendendo a homoserina desidrogenase modificada.

[008] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um método para a produção de homoserina ou um L-

aminoácido derivado de homoserina, compreendendo: cultivar o microrganismo em um meio; e recuperar homoserina ou um L- aminoácido derivado de homoserina a partir do microrganismo ou meio.

[009] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer uma composição para a produção de homoserina ou um L-aminoácido derivado de homoserina, que compreende a homoserina desidrogenase modificada ou um microrganismo compreendendo a homoserina desidrogenase modificada da presente revelação.

[010] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um método para aumentar a capacidade de produzir homoserina ou um L-aminoácido derivado de homoserina, que compreende expressar a homoserina desidrogenase modificada da presente revelação em um microrganismo do gênero Corynebacterium.

[011] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um uso da homoserina desidrogenase modificada para produzir a homoserina ou L-aminoácido derivado de homoserina da presente revelação.

[012] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um uso do polinucleotídeo para produzir a homoserina ou L-aminoácido derivado de homoserina da presente revelação.

[013] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um uso do microrganismo do gênero Corynebacterium para produzir a homoserina ou L-aminoácido derivado de homoserina da presente revelação.

[014] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um uso da composição para produzir a homoserina ou L-aminoácido derivado de homoserina da presente revelação.

[EFEITOS VANTAJOSOS]

[015] A homoserina desidrogenase modificada da presente revelação pode ser amplamente utilizada para a produção em massa de homoserina eficaz ou um L-aminoácido derivado de homoserina, porque a inibição de retroalimentação por um produto final é dessensibilizada em comparação com o tipo natural ou selvagem.

[MELHOR MODO DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO]

[016] A seguir, a presente revelação será descrita em detalhes. Enquanto isso, cada uma das explicações e modalidades exemplares reveladas aqui pode ser aplicada a outras explicações e modalidades exemplares. Ou seja, todas as combinações de vários fatores aqui revelados pertencem ao escopo da presente revelação. Além disso, o escopo da presente revelação não deve ser limitado pela revelação específica fornecida a seguir.

[017] A fim de alcançar os objetivos acima, um aspecto da presente revelação fornece homoserina desidrogenase modificada com um polipeptídeo compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos em uma sequência de aminoácidos de uma proteína com a atividade de homoserina desidrogenase, em que a substituição de aminoácido é realizada a partir da substituição do aminoácido na posição 285 ou do aminoácido na posição 398 por outro aminoácido, ou por uma combinação dos mesmos.

[018] Especificamente, a presente revelação fornece uma variante de homoserina desidrogenase com um polipeptídeo compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos em uma sequência de aminoácidos de uma proteína com a atividade de homoserina desidrogenase, em que a substituição de aminoácidos é realizada substituindo o amino ácido na posição 285 por isoleucina; o aminoácido na posição 398 por glutamina; ou os aminoácidos em ambas as posições por isoleucina e glutamina, respectivamente. Mais especificamente, a presente revelação fornece homoserina desidrogenase modificada, em que na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o aminoácido na posição 285 é substituído por isoleucina; o aminoácido na posição 398 é substituído por glutamina; ou os aminoácidos em ambas as posições são substituídos por isoleucina e glutamina, respectivamente.

[019] Na presente revelação, a homoserina desidrogenase (EC: 1.1.1.3) refere-se a uma enzima que catalisa a síntese de homoserina, um intermediário comum para a biossíntese de metionina, treonina e isoleucina em plantas e microrganismos. Na presente revelação, a homoserina desidrogenase pode ser incluída, independentemente de sua origem, desde que tenha a atividade de conversão acima, e uma enzima derivada de qualquer organismo (plantas, microrganismos, etc.) pode ser usada como a homoserina desidrogenase. Especificamente, a homoserina desidrogenase pode ser derivada de um microrganismo do gênero Corynebacterium, e mais especificamente pode ser derivada de Corynebacterium glutamicum. Por exemplo, a homoserina desidrogenase pode ser uma proteína que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. A proteína que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 pode ser alternadamente usada com o termo "proteína tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1" ou "proteína que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1".

[020] Na presente revelação, vários métodos bem conhecidos na técnica podem ser utilizados para o método de obtenção de homoserina desidrogenase. Exemplos de tais métodos incluem técnicas de síntese gênica, incluindo otimização de códons, a fim de obter proteínas com alta eficiência em um microrganismo do gênero Corynebacterium, que é comumente usado para a expressão de proteínas, e métodos para rastrear recursos enzimáticos úteis utilizando bioinformática baseada no metagenoma de microrganismos, mas os métodos não se limitam aos mesmos.

[021] Na presente revelação, a proteína com a atividade de homoserina desidrogenase não exclui uma mutação que pode ocorrer devido a uma adição de sequência sem sentido a montante ou a jusante da sequência de aminoácidos de uma proteína com a atividade de homoserina desidrogenase, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou uma mutação que ocorra naturalmente ou uma mutação silenciosa na mesma. Além disso, a proteína que possui a mesma atividade ou atividade correspondente à proteína, incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, corresponde à proteína que possui a atividade de homoserina desidrogenase da presente revelação. Como um exemplo específico, a proteína com a atividade de homoserina desidrogenase da presente revelação pode ser uma proteína que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos com uma homologia de pelo menos 80%, 90%, 95% ou 97%.

[022] Além disso, embora descrito como "uma proteína ou um polipeptídeo incluindo a sequência de aminoácidos de uma SEQ ID NO particular" na presente revelação, é aparente que qualquer proteína que tenha uma sequência de aminoácidos com deleção, modificação, substituição ou a adição em parte da sequência também pode pertencer ao escopo da presente revelação, desde que a proteína tenha uma sequência de aminoácidos com qualquer uma das homologias acima e exiba um efeito correspondente à proteína acima. Por exemplo, na presente revelação, a proteína que possui a atividade de homoserina desidrogenase pode ser homoserina desidrogenase derivada de Corynebacterium glutamicum. Mais especificamente, a proteína com a atividade de homoserina desidrogenase pode ser a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) da homoserina desidrogenase derivada de Corynebacterium glutamicum ATCC13032, a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 49) da homoserina desidrogenase derivada de Corynebacterium glutamicum ATCC14067, ou a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 50) da homoserina desidrogenase derivada de Corynebacterium glutamicum ATCC13869. Uma vez que as homoserinas desidrogenases com as sequências acima mostram uma homologia de 80%, 90%, 95% ou 97% ou mais entre si, e como as homoserinas desidrogenases exibem efeitos correspondentes aos da desidrogenase homoserina, é aparente que eles estão incluídos na proteína com a atividade de homoserina desidrogenase da presente revelação.

[023] Como aqui utilizado, o termo "homologia" refere-se à porcentagem de identidade entre duas porções polinucleotídicas ou polipeptídicas. A homologia refere-se a um grau de correspondência com uma determinada sequência de aminoácidos ou sequência nucleotídica e pode ser expressa como uma porcentagem. Na presente revelação, uma sequência de homologia com uma atividade idêntica ou semelhante à dada sequência de aminoácidos ou sequência de nucleotídeos é expressa como "% de homologia". A homologia entre sequências de uma porção para outra pode ser determinada por técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, a homologia pode ser confirmada utilizando um software padrão, ou seja, BLAST 2.0, para calcular parâmetros como pontuação, identidade e semelhança, ou a partir da comparação de sequências por meio de experimentos de hibridação Southern, e as condições de hibridação apropriadas a serem definidas podem ser determinadas por um método conhecido dos especialistas na técnica (por exemplo, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edição, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989; FM Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nova York).

[024] Como aqui utilizado, o termo "modificação", "modificado" ou "variante" refere-se a uma cultura ou um indivíduo que mostra uma alternância herdável ou não herdável em um fenótipo estabilizado. Especificamente, o termo "variante" pode significar uma variante na qual sua atividade é eficientemente aumentada porque um ou mais aminoácidos na sequência de aminoácidos correspondentes a uma proteína que possui a atividade de homoserina desidrogenase são modificados em comparação com o tipo selvagem , nativo ou não modificado, ou uma variante na qual a inibição da retroalimentação por isoleucina, treonina ou um derivado é liberada ou uma variante na qual o aumento da atividade e a inibição da retroalimentação são liberados.

[025] Na presente revelação, o termo "homoserina desidrogenase modificada" pode ser usado de forma intercambiável com "variante de homoserina desidrogenase".

Por outro lado, essa variante pode não ocorrer naturalmente.

[026] Especificamente, a homoserina desidrogenase modificada da presente revelação pode ser uma proteína modificada com um polipeptídeo compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos na sequência de aminoácidos de uma proteína com a atividade de homoserina desidrogenase, em que a substituição de aminoácidos é realizada substituindo o aminoácido na posição 285 por isoleucina, o aminoácido na posição 398 por glutamina ou uma combinação dos mesmos. A sequência de aminoácidos da proteína com a atividade de homoserina desidrogenase é como descrito acima e pode ser, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Além disso, o aminoácido na posição 285 pode ser aquele em que a treonina é substituída por isoleucina e o aminoácido na posição 398 pode ser aquele em que a arginina é substituída por glutamina.

[027] Além disso, a homoserina desidrogenase modificada da presente revelação pode ser uma proteína modificada com um polipeptídeo compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos na sequência de aminoácidos de uma proteína com a atividade de homoserina desidrogenase, em que a substituição de aminoácidos é realizada substituindo o aminoácido na posição 378 por triptofano.

Além disso, a homoserina desidrogenase modificada da presente revelação pode ser uma proteína modificada com um polipeptídeo compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos na sequência de aminoácidos de uma proteína com a atividade de homoserina desidrogenase, em que a substituição de aminoácidos é realizada substituindo o aminoácido na posição 285 por isoleucina, o aminoácido na posição 398 por glutamina ou uma combinação dos mesmos; nesta homoserina desidrogenase modificada, o aminoácido na posição 378 pode ainda ser substituído por triptofano. Mais especificamente, o aminoácido na posição 378 pode ser aquele em que a glicina é substituída por triptofano.

[028] Ainda mais especificamente, a homoserina desidrogenase modificada da presente revelação é uma proteína modificada com um polipeptídeo compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, em que a substituição de aminoácidos é realizada por substituir o aminoácido na posição 285 por isoleucina, o aminoácido na posição 398 por glutamina ou uma combinação dos mesmos.

Por exemplo, a homoserina desidrogenase modificada da presente revelação pode ser uma proteína que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, 11, 12 ou 13. Além disso, uma mutação que pode ocorrer devido a uma adição de sequência sem sentido a montante ou a jusante da sequência de aminoácidos, uma mutação que ocorra naturalmente ou uma mutação silenciosa na mesma não é excluída.

Além disso, a proteína que possui a mesma atividade ou atividade correspondente à homoserina desidrogenase modificada corresponde à proteína que possui a atividade de homoserina desidrogenase da presente revelação.

Como um exemplo específico, a homoserina desidrogenase modificada da presente revelação pode ser uma proteína que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID

NO: 10, 11, 12 ou 13, ou uma proteína que tem uma homologia com a sequência de aminoácidos acima de pelo menos 80%,

90%, 95% ou 97%. Além disso, embora descrito como "uma proteína ou um polipeptídeo com a sequência de aminoácidos de uma SEQ ID NO específica" na presente revelação, é aparente que qualquer proteína com uma sequência de aminoácidos com deleção, modificação, substituição ou adição em parte da sequência também pode pertencer ao escopo da presente revelação, desde que a proteína tenha uma sequência de aminoácidos com qualquer uma das homologias acima e exiba um efeito correspondente à proteína acima.

[029] Além disso, a homoserina desidrogenase modificada da presente revelação é a homoserina desidrogenase modificada tendo um polipeptídeo compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos na sequência de aminoácidos de uma proteína que tem a atividade de homoserina desidrogenase. É aparente que qualquer proteína que inclua modificação na qual o aminoácido na posição 285 ou 398 seja substituída por outro aminoácido, e que exiba um efeito correspondente à homoserina desidrogenase, pertence ao escopo da presente revelação.

[030] Além disso, diferente da proteína de tipo selvagem ou nativa ou de uma proteína não modificada com atividade de homoserina desidrogenase, a homoserina desidrogenase modificada da presente revelação pode ser aquela em que a inibição da retroalimentação por um produto final, ou seja, isoleucina, treonina, metionina ou homoserina, um derivado ou análogo é liberado ou dessensibilizado. Como usado aqui, o termo "inibição de retroalimentação" significa que um produto final do metabolismo impede a reação do estágio anterior. Portanto, quando a inibição da retroalimentação da homoserina desidrogenase é liberada ou dessensibilizada, a produtividade de homoserina e de um L-aminoácido derivado de homoserina pode ser melhorada em comparação com quando a inibição da retroalimentação não é liberada ou dessensibilizada.

[031] O L-aminoácido derivado de homoserina refere-se a um L-aminoácido que pode ser biossintetizado utilizando L-homoserina como precursor, e não é limitado desde que seja um material que possa ser biossintetizado a partir de L-homoserina. O L-aminoácido derivado de homoserina pode incluir não apenas um L-aminoácido derivado de homoserina, mas também um derivado do mesmo. Por exemplo, o L-aminoácido derivado de homoserina pode ser L- treonina, L-isoleucina, O-acetil-homoserina, O-succinil-L- homoserina, O-fosfo-L-homoserina, L-metionina e/ou L- glicina, mas não se limita aos mesmos. Mais especificamente, o L-aminoácido derivado de homoserina pode ser L-treonina, L-isoleucina, O-acetil-homoserina, O- succinil-L-homoserina e/ou L-metionina, mas não está limitado aos mesmos.

[032] Outro aspecto da presente revelação fornece um polinucleotídeo que codifica a homoserina desidrogenase modificada.

[033] A homoserina desidrogenase e variante são como descritas acima.

[034] Como usado aqui, o termo "polinucleotídeo" é um polímero de nucleotídeos composto por monômeros de nucleotídeos covalentemente ligados em uma cadeia, e seus exemplos são cadeias de DNA ou RNA com um comprimento predeterminado ou mais longo e, mais especificamente, refere-se a um fragmento de polinucleotídeo que codifica a homoserina desidrogenase modificada. O polinucleotídeo que codifica a proteína modificada da presente revelação pode ser incluído sem limitação, desde que tenha uma sequência polinucleotídica que codifica a proteína modificada tendo a atividade da homoserina desidrogenase da presente revelação.

[035] Na presente revelação, o polinucleotídeo que codifica a sequência de aminoácidos da variante de homoserina desidrogenase pode ser especificamente derivado de um microrganismo do gênero Corynebacterium, e mais especificamente derivado de Corynebacterium glutamicum, mas não está limitado aos mesmos.

[036] Além disso, no polinucleotídeo que codifica a proteína, várias modificações podem ser feitas na região de codificação sem alterar uma sequência de aminoácidos da proteína, devido à degeneração do códon ou à consideração dos códons preferidos em um organismo no qual a proteína é para ser expressa. Especificamente, o polinucleotídeo pode ser um polinucleotídeo incluindo uma sequência polinucleotídica que codifica a proteína ou uma sequência polinucleotídica que possui uma homologia com a sequência polinucleotídica acima de pelo menos 80%, 90%, 95% ou 97%.

Além disso, é aparente que uma sequência polinucleotídica com deleção, modificação, substituição ou adição em parte da sequência também pode pertencer ao escopo da presente revelação, desde que seja uma sequência polinucleotídica que codifique a proteína com as homologias acima e exibindo um efeito substancialmente igual ou correspondente à proteína acima. O polinucleotídeo que codifica a proteína que possui a atividade da homoserina desidrogenase da presente revelação pode ter uma sequência polinucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

Por exemplo, o polinucleotídeo pode ter a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 48, mas não está limitado a mesma. Além disso, o polinucleotídeo que codifica a homoserina desidrogenase modificada da presente revelação pode ter uma sequência polinucleotídica que codifica o polipeptídeo compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e, especificamente, pode ter uma sequência polinucleotídica que codifica SEQ ID NO: 10, 11, 12 ou 13. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ter a sequência polinucleotídica de

SEQ ID NO: 6, 7, 8 ou 9, mas não está limitada às mesmas.

[037] Além disso, uma sonda que pode ser preparada a partir de uma sequência genética conhecida, por exemplo, qualquer sequência que hibrida com uma sequência complementar a toda ou parte da sequência polinucleotídica sob condições rigorosas para codificar uma proteína com a atividade da homoserina desidrogenase da presente revelação, também pode ser incluída sem limitação. As "condições rigorosas" significam condições sob as quais é permitida a hibridação específica entre polinucleotídeos.

Tais condições são especificamente descritas na literatura (por exemplo, J. Sambrook et al., infra). As condições rigorosas podem incluir, por exemplo, condições sob as quais os genes com alta homologia, homologia de 80% ou mais, especificamente 90% ou mais, mais especificamente 95% ou mais, muito mais especificamente 97% ou mais, ainda muito mais especificamente 99% ou mais de homologia são hibridizados entre si e genes com homologia menor que a homologia acima não são hibridados entre si, ou condições de lavagem comuns da hibridação Southern, ou seja, lavagem uma vez, especificamente, duas ou três vezes em uma concentração de sal e uma temperatura correspondente a 60 °C, 1xSSC, 0,1% SDS, especificamente, 60 °C, 0,1xSSC, 0,1% SDS, e mais especificamente 68 °C, 0,1xSSC, 0,1% SDS. A hibridação requer que dois polinucleotídeos contenham sequências complementares, embora, dependendo do rigor da hibridação, sejam possíveis incompatibilidades entre as bases. O termo "complementar" é usado para descrever a relação entre bases nucleotídicas que são hibridáveis entre si. Por exemplo, em relação ao DNA, a adenosina é complementar à timina e a citosina é complementar à guanina. Portanto, a presente revelação também pode incluir um fragmento de nucleotídeo isolado complementar à sequência inteira, bem como uma sequência de nucleotídeos substancialmente semelhante a ela. Especificamente, o polinucleotídeo com homologia pode ser detectado utilizando condições de hibridação, incluindo uma etapa de hibridação a um valor de Tm de 55 °C nas condições descritas acima.

Além disso, o valor de Tm pode ser 60 °C, 63 °C ou 65 °C, mas não está limitado a isso, e pode ser adequadamente controlado pelos especialistas na técnica, dependendo da finalidade do mesmo. O rigor apropriado para hibridar polinucleotídeos depende do comprimento dos polinucleotídeos e do grau de complementação, e essas variáveis são bem conhecidas na técnica (ver Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8).

[038] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um microrganismo compreendendo a homoserina desidrogenase modificada. Especificamente, a presente revelação fornece um microrganismo do gênero

Corynebacterium que produz homoserina ou um L-aminoácido derivado de homoserina, compreendendo a homoserina desidrogenase modificada. Além disso, a presente revelação fornece um microrganismo do gênero Corynebacterium que produz L-alanina, compreendendo a homoserina desidrogenase modificada. No entanto, a presente revelação não está limitada a ela.

[039] A homoserina desidrogenase e variante são como descritas acima.

[040] Especificamente, o microrganismo compreendendo a homoserina desidrogenase modificada da presente revelação refere-se a um microrganismo que inerentemente tem a capacidade de produzir homoserina ou um L-aminoácido derivado de homoserina ou um microrganismo ao qual a capacidade de produzir homoserina ou um o L- aminoácido derivado de homoserina é conferida à sua cepa progenitora sem a capacidade de produzir homoserina ou um L-aminoácido derivado de homoserina. Especificamente, o microrganismo compreendendo a homoserina desidrogenase pode ser um microrganismo que expressa a homoserina desidrogenase modificada, em que na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o aminoácido na posição 285 é substituído por isoleucina; o aminoácido na posição 398 é substituído por glutamina; ou os aminoácidos em ambas as posições são substituídos por isoleucina e glutamina,

respectivamente, mas o microrganismo não está limitado a eles. O microrganismo pode ser uma célula ou microrganismo que inclui um polinucleotídeo que codifica a homoserina desidrogenase modificada ou que é capaz de expressar um polipeptídeo modificado transformando-se em um vetor incluindo um polinucleotídeo que codifica a homoserina desidrogenase modificada. Para os objetivos da presente revelação, a célula hospedeira ou microrganismo pode ser qualquer microrganismo capaz de produzir homoserina ou um L-aminoácido derivado de homoserina, que inclui o polipeptídeo modificado.

[041] O microrganismo compreendendo a homoserina desidrogenase modificada da presente revelação tem a capacidade aprimorada de produzir homoserina, um L- aminoácido derivado de homoserina ou L-alanina em comparação com o tipo selvagem ou um microrganismo, incluindo uma proteína com a atividade de homoserina desidrogenase modificada. Portanto, a homoserina, um L- aminoácido derivado de homoserina ou L-alanina pode ser obtido com alto rendimento a partir desse microrganismo.

[042] Na presente revelação, o tipo de microrganismo incluindo a homoserina desidrogenase modificada não é particularmente limitado, mas pode ser Enterobacter sp., Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., Pseudomonas sp., Providencia sp., Corynebacterium sp.,

ou Brevibacterium sp. Mais especificamente, o microrganismo pode ser um microrganismo do gênero Corynebacterium.

[043] Na presente revelação, o "microrganismo do gênero Corynebacterium" pode ser especificamente Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens, etc. Mais especificamente, na presente revelação, o microrganismo do gênero Corynebacterium pode ser Corynebacterium glutamicum.

[044] Enquanto isso, o microrganismo compreendendo a homoserina desidrogenase modificada pode ser um microrganismo no qual um vetor incluindo um polinucleotídeo que codifica uma variante de homoserina desidrogenase é introduzido, mas não está limitado ao mesmo.

[045] Como aqui utilizado, o termo "vetor" refere- se a uma construção de DNA incluindo a sequência nucleotídica do polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo, na qual a proteína alvo está operacionalmente ligada a uma sequência de controle adequada para que possa ser expressa em um hospedeiro apropriado. A sequência de controle inclui um promotor capaz de iniciar a transcrição, qualquer sequência de operador para o controle da transcrição, uma sequência que codifica um domínio de ligação ao ribossomo de mRNA apropriado e uma sequência que controla o término da transcrição e tradução. O vetor, depois de ser transformado com uma célula hospedeira adequada, pode ser replicado ou funcionar independentemente do genoma do hospedeiro, ou pode ser integrado ao próprio genoma do hospedeiro.

[046] O vetor usado na presente revelação não é particularmente limitado, desde que seja capaz de se replicar na célula hospedeira, e qualquer vetor conhecido na técnica pode ser usado. Exemplos de vetores convencionais podem incluir um plasmídeo natural ou recombinante, cosmídeo, vírus e bacteriófago. Por exemplo, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A e Charon21A podem ser usados como um vetor de fago ou vetor cosmídeo; e tipo pBR, tipo pUC, tipo pBluescriptII, tipo pGEM, tipo pTZ, tipo pCL e tipo pET podem ser utilizados como vetor plasmídico.

Especificamente, os vetores pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 e pCC1BAC podem ser utilizados, mas o vetor não está limitado aos mesmos.

[047] Um vetor utilizável na presente revelação não é particularmente limitado, e qualquer vetor de expressão conhecido pode ser usado. Além disso, um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo no cromossomo pode ser inserido através de um vetor para inserção cromossômica. A inserção do polinucleotídeo no cromossomo pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica (por exemplo, recombinação homóloga), mas o método não está limitado a isso. O marcador de seleção pode ser adicionalmente incluído para confirmar uma inserção gênica bem-sucedida no cromossomo. Um marcador de seleção é para rastrear as células que são transformadas com o vetor, em outras palavras, para determinar se a molécula polinucleotídica alvo está inserida. Podem ser utilizados os marcadores que fornecem fenótipos selecionáveis, como resistência a medicamentos, auxotrofia, resistência a agentes tóxicos celulares ou expressão de proteínas de superfície. Em um ambiente tratado com um agente seletivo, apenas as células que expressam o marcador de seleção podem sobreviver, ou as células mostram um fenótipo diferente e, portanto, as células transformadas com sucesso podem ser selecionadas por esse método.

[048] Como aqui utilizado, o termo "transformação" refere-se à introdução de um vetor incluindo um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo em uma célula hospedeira, de modo que a proteína codificada pelo polinucleotídeo seja expressa na célula hospedeira. Desde que o polinucleotídeo transformado possa ser expresso na célula hospedeira, ele pode ser integrado ou colocado no cromossomo da célula hospedeira, ou pode existir extracromossomicamente. Além disso, o polinucleotídeo inclui DNA e RNA que codificam a proteína alvo.

O polinucleotídeo pode ser introduzido de qualquer forma,

desde que possa ser introduzido na célula hospedeira e expresso nela.

Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira na forma de um cassete de expressão, que é uma construção de gene incluindo todos os elementos necessários para sua expressão autônoma.

O cassete de expressão pode incluir um promotor operacionalmente ligado ao polinucleotídeo, terminador de transcrição, locais de ligação ao ribossomo ou terminador de tradução.

O cassete de expressão pode estar na forma de um vetor de expressão auto replicável.

Além disso, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira no estado em que se encontra e operacionalmente ligado às sequências necessárias para a expressão na célula hospedeira, mas não está limitado a isso.

O método de transformação inclui qualquer método de introdução de um polinucleotídeo em uma célula e pode ser realizado selecionando uma técnica padrão adequada conhecida na técnica, dependendo de uma célula hospedeira.

Exemplos do método incluem eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio (Ca(H2PO4)2, CaHPO4 ou Ca3(PO4)2), precipitação com cloreto de cálcio (CaCl2), microinjeção, uma técnica de polietilenoglicol (PEG), uma técnica de DEAE-dextrano, uma técnica de lipossomas catiônicos, uma técnica de acetato de lítio-DMSO, etc., mas não estão limitados aos mesmos.

[049] Além disso, o termo "ligação operável" significa que a sequência polinucleotídica está funcionalmente ligada a uma sequência promotora que inicia e medeia a transcrição do polinucleotídeo que codifica a proteína alvo da presente revelação. A ligação operável pode ser preparada utilizando uma técnica recombinante de gene conhecida na técnica, e a clivagem e ligação de DNA específicas do local podem ser preparadas utilizando uma liase e ligase conhecidas, mas elas não estão limitadas às mesmas.

[050] O microrganismo compreendendo a homoserina desidrogenase modificada pode ser um que foi transformado para incluir a homoserina desidrogenase modificada em um microrganismo do gênero Corynebacterium. Por exemplo, o microrganismo do gênero Corynebacterium pode incluir uma cepa resistente ao 2-amino-3-hidroxi-valerato (AHV); uma cepa que produz L-treonina substituindo a leucina, que é o aminoácido na posição 377 da aspartato quinase (LysC), por lisina para resolver a inibição de realimentação da LysC, que é a primeira enzima importante que atua na via biossintética da treonina; uma cepa que produz L-isoleucina substituindo o aminoácido na posição 323 do gene ilvA, que codifica L-treonina desidratase (a primeira enzima que atua na via biossintética da isoleucina) na cepa produtora de L-

treonina, por alanina (Appl. Enviro, Microbiol., Dec. 1996, p.4345-4351); uma cepa que produz O-acetil-homoserina por inativação de O-acetil-homoserina (tiol)-liase, que está envolvida na via de degradação da O-acetil-homoserina e cistationina gama-sintase; ou uma cepa que produz metionina por inativação de fatores reguladores da transcrição de metionina e cisteína, mas não está limitada às mesmas.

[051] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um método para produzir homoserina ou um L- aminoácido derivado de homoserina, compreendendo: cultivar o microrganismo em um meio; e recuperar homoserina ou um L- aminoácido derivado de homoserina a partir do microrganismo ou meio.

[052] Como descrito acima, o microrganismo pode ser um microrganismo do gênero Corynebacterium, compreendendo a variante de homoserina desidrogenase da presente revelação e, mais especificamente, pode ser Corynebacterium glutamicum. Além disso, o microrganismo do gênero Corynebacterium ou Corynebacterium glutamicum pode ser um microrganismo que produz homoserina ou um L- aminoácido derivado de homoserina. O L-aminoácido derivado de homoserina pode incluir não apenas um L-aminoácido derivado de homoserina, mas também um derivado do mesmo.

Por exemplo, o L-aminoácido derivado de homoserina pode ser L-treonina, L-isoleucina, O-acetil-homoserina, O-succinil-

L-homoserina, O-fosfo-L-homoserina, L-metionina e/ou L- glicina, mas não se limita aos mesmos. Mais especificamente, o L-aminoácido derivado de homoserina pode ser L-treonina, L-isoleucina, O-acetil-homoserina, O- succinil-L-homoserina e/ou L-metionina, mas não está limitado aos mesmos. Além disso, o microrganismo do gênero Corynebacterium ou Corynebacterium glutamicum pode ser um microrganismo que produz L-alanina.

[053] A homoserina ou L-aminoácido derivado de homoserina pode ser um meio de cultura de homoserina ou um L-aminoácido derivado de homoserina, que é produzido pelo microrganismo descrito na presente revelação, um sobrenadante da cultura, um produto processado do mesmo, ou uma forma purificada do mesmo. É evidente para os especialistas na técnica que a homoserina ou L-aminoácido derivado de homoserina inclui não apenas a sua forma neutra, mas também um sal do mesmo.

[054] Um método para produzir a homoserina ou L- aminoácido derivado de homoserina pode ser facilmente determinado por aqueles especialistas na técnica sob condições de cultivo otimizadas e condições de atividade enzimática conhecidas na técnica.

[055] No método acima, o cultivo do microrganismo pode ser realizado em um processo em batelada, processo contínuo, processo em batelada alimentada, etc. conhecido na técnica, mas o processo de cultura não é particularmente limitado aos mesmos. Em particular, com relação às condições de cultivo, o pH da cultura pode ser ajustado para um pH adequado (por exemplo, pH 5 a pH 9, especificamente pH 6 a pH 8 e, mais especificamente, com um composto básico apropriado (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amônia) ou composto ácido (por exemplo, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico), e a condição aeróbica da cultura pode ser mantida através da introdução de oxigênio ou uma mistura gasosa de oxigênio na cultura. A temperatura de cultivo pode geralmente estar na faixa de 20 °C a 45 °C, e especificamente de 25 °C a 40 °C por cerca de 10 a 160 horas, mas as condições de cultivo não se limitam às mesmas. A treonina, isoleucina ou acetil homoserina produzida pelo cultivo acima pode ser secretada na cultura ou pode ser retida nas células.

[056] Além disso, exemplos das fontes de carbono a serem usadas no meio de cultura podem incluir açúcares e carboidratos (por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, amido e celulose); óleos e gorduras (por exemplo, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco); ácidos graxos (por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico); álcoois (por exemplo, glicerol e etanol); e ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético), mas não estão limitados a isso. Essas fontes de carbono podem ser usadas sozinhas ou em combinação, mas não estão limitadas às mesmas. Exemplos de fontes de nitrogênio a serem usadas no meio de cultura podem incluir compostos orgânicos contendo nitrogênio (por exemplo, peptona, extrato de levedura, molho de carne, extrato de malte, licor de maceração de milho, farinha de soja e ureia) ou compostos inorgânicos (por exemplo, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio), etc.

Essas fontes de nitrogênio podem ser usadas sozinhas ou em combinação, mas não estão limitadas às mesmas. Exemplos das fontes de fósforo a serem usadas no meio de cultura podem incluir di-hidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato de dipotássio, sais correspondentes contendo sódio, etc., mas não estão limitados às mesmas. Além disso, sais metálicos (por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro), aminoácidos, vitaminas, etc., que são materiais essenciais para promover o crescimento, podem estar contidos no meio.

[057] Na presente revelação, o método para recuperar a homoserina ou L-aminoácido derivado de homoserina produzido na etapa de cultivo pode ser realizado coletando o produto alvo do caldo de cultura utilizando um método apropriado conhecido na técnica. Por exemplo, métodos como centrifugação, filtração, cromatografia de troca aniônica, cristalização, HPLC, etc. podem ser usados, e o material desejado, que é a homoserina ou o L-aminoácido derivado de homoserina, pode ser recuperado de uma cultura ou microrganismo cultivado utilizando um método apropriado conhecido na técnica. Além disso, a recuperação pode incluir um processo de purificação adicional e pode ser realizada utilizando um método apropriado conhecido na técnica. Um processo adicional pode ser inserido para aumentar a recuperação de um produto alvo antes/após a etapa de cultivo ou a etapa de recuperação.

[058] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece uma composição para a produção de homoserina ou um L-aminoácido derivado de homoserina, que compreende a homoserina desidrogenase modificada ou um microrganismo compreendendo a homoserina desidrogenase modificada da presente revelação.

[059] A composição para a produção de homoserina ou um L-aminoácido derivado de homoserina refere-se a uma composição capaz de produzir homoserina ou um L-aminoácido derivado de homoserina, em que a composição compreende homoserina desidrogenase modificada, em que na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o aminoácido na posição 285 é substituído por isoleucina, o aminoácido na posição 398 é substituído por glutamina ou os aminoácidos em ambas as posições são substituídos por isoleucina e glutamina,

respectivamente; um polinucleotídeo que codifica a homoserina desidrogenase modificada; ou um microrganismo compreendendo o polinucleotídeo. Por exemplo, o polinucleotídeo pode incluir uma constituição adicional capaz de operar o polinucleotídeo sem limitação. Por exemplo, o polinucleotídeo pode estar em uma forma incluída em um vetor para que o gene operacionalmente ligado possa ser expresso na célula hospedeira introduzida.

[060] Além disso, a composição pode ainda incluir qualquer excipiente adequado comumente usado em composições para a produção de homoserina ou L-aminoácidos derivados de homoserina. O excipiente pode ser, por exemplo, um conservante, umectante, um dispersante, um agente de suspensão, um tampão, um estabilizador, um agente isotônico, etc., mas não está limitado aos mesmos.

[061] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um método para aumentar a capacidade de produzir homoserina ou um L-aminoácido derivado de homoserina em um microrganismo, que compreende substituir o aminoácido na posição 285 por isoleucina; o aminoácido na posição 398 por glutamina; ou os aminoácidos em ambas as posições por isoleucina e glutamina, respectivamente, na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 com atividade de homoserina desidrogenase.

[062] Os termos "homoserina desidrogenase" e

"homoserina ou L-aminoácido derivado de homoserina" são como descritos acima.

[063] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um uso da homoserina desidrogenase modificada para produzir homoserina ou um L-aminoácido derivado de homoserina.

[064] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um uso de um polinucleotídeo que codifica a homoserina desidrogenase modificada para produzir homoserina ou um L-aminoácido derivado de homoserina.

[065] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um uso de um microrganismo do gênero Corynebacterium, que compreende a homoserina desidrogenase modificada, para produzir homoserina ou um L-aminoácido derivado de homoserina.

[066] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um uso da composição para produzir homoserina ou um L-aminoácido derivado de homoserina, para produzir homoserina ou um L-aminoácido derivado de homoserina.

[MODO DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO]

[067] A seguir, a presente revelação será descrita em detalhes com modalidades exemplares em anexo. No entanto, as modalidades exemplares reveladas neste documento são apenas para fins ilustrativos e não devem ser interpretadas como limitativas do escopo da presente revelação.

EXEMPLO 1: TRIAGEM DE MICRORGANISMOS RESISTENTES A AHV

ATRAVÉS DE MODIFICAÇÃO ARTIFICIAL

[068] Neste exemplo, foi conduzida uma experiência de conferir resistência a 2-amino-3-hidroxi-valerato (doravante referido como "AHV"), que é um análogo de L- treonina, utilizando Corynebacterium glutamicum KFCC10881 (patente coreana nº 0159812) como uma cepa progenitora, a fim de liberar a inibição da realimentação por L-treonina da homoserina desidrogenase (doravante denominada "hom", CE: 1.1.1.3).

[069] A modificação foi induzida por um método de modificação artificial utilizando N-metil-Nʹ-nitro-N- nitrosoguanidina (daqui em diante referido como "NTG"). A cepa KFCC10881, que foi cultivada em um meio de semente por 18 horas, foi inoculada em 4 ml do meio de semente e, em seguida, cultivada até OD660 atingir cerca de 1,0. O meio de cultura foi centrifugado para recuperar as células e, em seguida, as células foram lavadas duas vezes com um tampão Tris-malato 50 mM (pH 6,5) e suspensas nos 4 ml finais do mesmo tampão. Uma solução de NTG (2 mg/ml em tampão Tris- malato 0,05 M (pH 6,5)) foi adicionada à suspensão de células para ter uma concentração final de 150 mg/l e, em seguida, deixada repousar à temperatura ambiente por 20 minutos. Depois disso, as células foram recuperadas por centrifugação e lavadas duas vezes com o mesmo tampão para remover o NTG. As células finalmente lavadas foram suspensas em 4 ml de uma solução de glicerol a 20% e depois armazenadas a -70 °C até o uso. As cepas tratadas com NTG foram plaqueadas em um meio mínimo contendo 3 g/l de AHV e, em seguida, foram obtidas 155 cepas KFCC10881 resistentes a AHV através do procedimento acima.

MEIO DE SEMENTE (pH 7,0)

[070] Glicose 20 g, peptona 10 g, extrato de levedura 5 g, ureia 1,5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O

0.5 g, biotina 100 µg, tiamina HCl 1.000 µg, pantotenato de cálcio 2.000 µg, nicotinamida 2.000 µg (baseado em 1 l de água destilada) MEIO MÍNIMO (pH 7,2)

[071] Glicose 5 g, KH2PO4 1 g, (NH4)2SO4 5 g, MgSO4 7H2O 0.4 g, NaCl 0,5 g, biotina 200 µg, tiamina HCl 100 µg, pantotenato de cálcio 100 µg, nicotinamida 0,03 g, ureia 2 g, Na2B4O7 10H2O 0.09 mg, (NH4)6Mo7O27 4H2O 0.04 mg, ZnSO4 7H2O 0,01 mg, CuSO4 5H2O, MnCl2 4H2O 0,01 mg, FeCl3 6H2O 1 mg, CaCl2 0,01 mg (com base em 1 l de água destilada) EXEMPLO 2: ENSAIO DE PRODUÇÃO DE L-TREONINA PARA CEPAS KFCC10881 RESISTENTES A AHV

[072] Foi conduzido um teste para a capacidade de produção de L-treonina nas 155 cepas resistentes a AHV obtidas no Exemplo 1. As 155 cepas obtidas no Exemplo 1 foram inoculadas em um balão defletor de canto (250 ml) contendo o meio de semente (25 ml) e depois cultivadas com agitação a 30 °C a 200 rpm por 20 horas. O meio de cultura de sementes (1 ml) foi inoculado em um balão defletor de canto (250 ml) contendo o meio de produção de L-treonina abaixo (24 ml) e, em seguida, cultivado com agitação a 30 °C a 200 rpm por 48 horas.

MEIO DE PRODUÇÃO DE L-TREONINA (pH 7,2)

[073] Glicose 30 g, KH2PO4 2 g, ureia 3 g, (NH4)2SO4 40 g, peptona 2,5 g, CSL (Sigma) 5 g (10 ml), MgSO4 7H2O

0.5 g, leucina 400 mg, CaCO3 20 g (baseado em 1 l de água destilada)

[074] Após a cultura, as quantidades dos vários aminoácidos produzidos utilizando HPLC foram medidas. As concentrações dos meios de cultura dos aminoácidos para as 22 cepas, que demonstram ter uma excelente capacidade de produção de L-treonina entre as 155 cepas experimentadas, foram mostradas na Tabela 1. Os candidatos para as 22 cepas confirmadas através do procedimento acima foram nomeados como KFCC10881-1 a KFCC10881-22.

[TABELA 1] EXPERIMENTOS SOBRE PRODUÇÃO DE L-TREONINA DE

EXCELENTES CEPAS RESISTENTES AO AHV OD Thr Hse Gly Ala Ile Lys Thr+Hse

+Gly+Ile KFCC10881 58,5 0,0 0,1 0,3 0,1 0,0 13,3 0,4 KFCC10881-1 60,1 2,0 1,5 2,8 1,6 2,7 5,7 7,7 KFCC10881-2 57,1 3,0 2,2 0,8 3,1 1,3 12,5 7,3 KFCC10881-3 47,3 2,8 2,3 0,8 3,4 1,4 10,5 7,3 KFCC10881-4 51,7 3,2 2,1 0,8 3,2 1,3 13,4 7,4 KFCC10881-5 58,4 3,1 2,2 0,8 3,3 1,3 12,4 7,4 KFCC10881-6 52,6 3,4 2,5 0,7 3,4 1,0 12,8 7,6 KFCC10881-7 14,2 0,4 0,2 0,3 0,2 0,6 11,1 1,5 KFCC10881-8 55,8 3,0 2,0 0,8 3,3 1,3 13,0 7,1 KFCC10881-9 44,3 3,2 2,8 0,6 3,1 0,9 12,6 7,5 KFCC10881-10 47,5 3,7 3,0 0,7 3,4 0,8 12,6 8,2 KFCC10881-11 57,0 2,7 1,8 0,7 3,4 1,2 11,6 6,4 KFCC10881-12 51,8 3,3 3,5 0,6 3,2 0,9 12,4 8,3 KFCC10881-13 49,8 3,0 2,3 0,7 3,4 1,3 12,8 7,3 KFCC10881-14 62,7 2,4 2,1 2,5 3,2 3,0 3,3 10,0 KFCC10881-15 62,4 2,9 2,7 0,7 3,2 1,1 12,3 7,4 KFCC10881-16 59,6 2,8 2,5 0,8 3,3 1,3 11,4 7,4 KFCC10881-17 24,1 0,1 0,2 0,2 1,6 0,2 10,4 0,7 KFCC10881-18 60,5 2,6 2,5 0,7 3,2 1,0 12,3 6,8 KFCC10881-19 60,0 3,0 1,9 2,8 2,7 3,0 5,4 9,3 KFCC10881-20 65,8 2,7 2,0 0,8 3,4 1,4 13,0 6,9 KFCC10881-21 17,3 0,3 0,3 0,3 0,2 0,6 11,1 1,5 KFCC10881-22 60,1 3,5 1,9 2,0 2,5 2,8 2,7 10,2

[075] Como mostrado na Tabela 1, as quantidades de

L-treonina, L-homoserina, L-glicina, L-alanina e L- isoleucina, produzidas pelos 22 tipos de cepas com resistência ao AHV, foram aumentadas em comparação a um grupo de controle, enquanto a quantidade de L-lisina foi diminuída.

[076] As vias biossintéticas da L-treonina e L- lisina são separadas do aspartato-semialdeído (daqui em diante referido como "ASA") como ponto de partida. Ou seja, a quantidade de L-lisina produzida diminui à medida que a quantidade de L-treonina produzida é aumentada.

Consequentemente, as quantidades de homoserina (Hse), L- glicina (Gly) e L-isoleucina (Ile), que podem ser subprodutos da via biossintética da L-treonina, podem ser aumentadas à medida que a quantidade de L-treonina produzida é aumentada e, assim, a quantidade total produzida (Thr + Hse + Gly + Ile) também foi confirmada.

[077] Portanto, entre as cepas resistentes ao AHV acima, os 4 tipos de cepas (KFCC10881-1, KFCC10881-14, KFCC10881-19 e KFCC10881-22), que têm a quantidade reduzida de L-lisina produzida, a quantidade aumentada de L-treonina produzida e a quantidade total aumentada de Thr + Hse + Gly + Ile produzida foram selecionadas como as cepas resistentes ao AHV mais excelentes.

EXEMPLO 3: ANÁLISE DE SEQUÊNCIAS DE NUCLEOTÍDEOS DE

CEPAS COM EXCELENTE CAPACIDADE DE PRODUZIR TREONINA

DERIVADA DE KFCC10881

[078] A fim de analisar as seqüências nucleotídicas das enzimas de biossíntese de L-treonina das cepas selecionadas no Exemplo 1 acima, foi realizada a seguinte experiência. Com base nas informações gênicas fornecidas pela Enciclopédia de Quioto de Genes e Genomas (KEGG), cada uma das sequências nucleotídicas de hom (SEQ ID NO: 1, NCgl1136), que codifica a homoserina desidrogenase de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 e a sequência nucleotídica de thrB (SEQ ID NO: 2, Gene Nº NCgl1137), que codifica a homoserina-quinase, foi obtido.

Hom e thrB são conhecidos por consistirem em uma estrutura do operon (Peoples et al., Mol. Biol. 2 (1): 63-72, 1988).

[079] A fim de obter o fragmento de DNA contendo o operon hom-thrB das cepas selecionadas, a PCR foi realizada utilizando o DNA genômico das cepas como molde e uma combinação de iniciadores de SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4. A polimerase de DNA de alta fidelidade PfuUltraTM (Stratagene) foi usada como polimerase para a reação de PCR. As condições de PCR foram as seguintes: desnaturação a 96 °C por 30 segundos; recozimento a 52 °C por 30 segundos; e polimerização a 72 °C por 3 minutos, e um total de 30 ciclos foram repetidos. Como resultado, foi possível amplificar um fragmento de gene (2778 pb; SEQ ID NO: 5), que inclui a sequência nucleotídica (300 pb) contendo um local promotor a montante do códon de iniciação da SEQ ID NO: 1 para incluir o 200 pb a jusante do códon de terminação da SEQ ID NO: 2.

[080] A sequência nucleotídica foi determinada utilizando o iniciador preparado acima por um analisador ABI PRISM 3730XL (tipo capilar 96; Applied Biosystems). Na sequência nucleotídica correspondente a hom entre o operon hom-thrB em KFCC10881-1, a citosina, que é o nucleotídeo na posição 854 da SEQ ID NO: 1, foi mutada para tiamina e, portanto, o códon ACT que codifica o resíduo de treonina foi mutado para o códon ATT que codifica o resíduo de isoleucina (daqui em diante referido como "modificação T285I"; SEQ ID NO: 6). Além disso, na sequência de nucleotídeos correspondente ao operon hom-thrB em KFCC10881-14, a guanina, que é o nucleotídeo na posição 1193 da SEQ ID NO: 1, foi transformada em adenina e, portanto, o códon CGA que codifica o resíduo de arginina foi mudou para o códon CAA que codifica o resíduo de glutamina (doravante referido como "modificação R398Q"; SEQ ID NO: 7). Além disso, na sequência de nucleotídeos correspondente ao operon hom-thrB em KFCC10881-19, a guanina, que é o nucleotídeo na posição 1132 da SEQ ID NO: 1, sofreu mutação na citosina e, portanto, o códon GGG que codifica o resíduo de glicina foi mudou para o códon TGG que codifica o resíduo de triptofano (doravante referido como "modificação G378W"; SEQ ID NO: 8). Além disso, na sequência de nucleotídeos correspondente ao operon hom-thrB em KFCC10881-22, a guanina, que é o nucleotídeo na posição 1132 da SEQ ID NO: 1, foi transformada em adenina e a guanina, que é o nucleotídeo na posição 1134, foi mutado para citosina e, portanto, o códon GGG que codifica o resíduo glicina foi mutado para o códon AGC que codifica o resíduo serina (doravante referido como "modificação G378S"; SEQ ID NO: 9). Enquanto isso, nenhuma modificação foi descoberta em thrB, correspondente à SEQ ID NO: 2.

[081] Em vista das análises da sequência de nucleotídeos acima, foi possível confirmar, consequentemente, que a inibição da retroalimentação por L- treonina foi dessensibilizada como na Hom (SEQ ID NO: 10) expresso em KFCC10881-1, treonina, que é a o resíduo de aminoácido na posição 285 foi mutado para isoleucina (modificação T285I); na Hom (SEQ ID NO: 11) expresso em KFCC10881-14, a arginina, que é o resíduo de aminoácido na posição 398, foi mutada para glutamina (modificação de R398Q); na Hom (SEQ ID NO: 12) expresso em KFCC10881-19, a glicina, que é o resíduo de aminoácido na posição 378, foi transformada em triptofano (modificação G378W); e na Hom (SEQ ID NO: 13) expresso em KFCC10881-22, a glicina, que é o resíduo de aminoácido na posição 378, foi mutada para serina (modificação G378S).

EXEMPLO 4: PREPARAÇÃO DE NOVAS CEPAS ÀS QUAIS É

INTRODUZIDA A HOMOSERINA DESIDROGENASE

[082] Os iniciadores de SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15 foram preparados para preparar as cepas nas quais as variantes (T285I, R398Q, G378W e G378S) identificadas no Exemplo 2 foram introduzidas às cepas do tipo selvagem.

[083] A fim de preparar as cepas nas quais são introduzidas cada uma das modificações hom de T285I, R398Q, G378W e G378S, a PCR foi realizada utilizando o DNA genômico extraído de cada um dos KFCC10811-1, KFCC10811-14, KFCC10811-19 e as cepas KFCC10811-22 como modelo e utilizando os iniciadores de SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15.

A polimerase de DNA de alta fidelidade PfuUltraTM (Stratagene) foi usada como polimerase para a reação de PCR. As condições de PCR foram as seguintes: desnaturação a 95 °C por 30 segundos; recozimento a 55 °C por 30 segundos; e polimerização a 72 °C por 2 minutos, e um total de 28 ciclos foi repetido. Como resultado, foi obtido um fragmento de gene (1668 pb) incluindo um promotor local (cerca de 300 pb) do gene hom (1338 pb). O produto amplificado foi purificado utilizando um kit de purificação por PCR (QUIAGEN) e depois usado como um fragmento de DNA de inserção para a preparação de um vetor. Enquanto isso, após o tratamento com uma enzima de restrição smaI, a proporção da concentração molar (M) do vetor pDZ tratada termicamente a 65 °C por 20 minutos para o fragmento de DNA de inserção amplificado pela PCR acima foi fixada em 1:2 e, em seguida, estes foram clonados utilizando um kit de clonagem de infusão (TaKaRa), de acordo com o manual.

Posteriormente, foram preparados os vetores, isto é, pDZ- T285I, pDZ-R398Q, pDZ-G378W e pDZ-G378S, para a introdução das modificações T285I, R398Q, G378W e G378S no cromossomo.

[084] Corynebacterium glutamicum ATCC13032 foi transformado com cada um dos vetores preparados por eletroporação. Após o cruzamento secundário, foram obtidas cepas substituídas por cada um dos nucleotídeos modificados no cromossomo. Utilizando uma combinação dos iniciadores listados abaixo e utilizando uma técnica de PCR MASA (Amplificação Específica para Alelos Mutantes) (Takeda et al., Hum. Mutation, 2, 112-117 (1993)), a adequação da substituição foi determinada principalmente por selecionar cepas amplificadas na combinação dos iniciadores correspondentes a cada uma das sequências modificadas (CTR- T285I: SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 17; CTR-R398Q: SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 18; CTR - G378W: SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 19; e CTR-G378S: SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 20). Além disso, foram realizadas análises das sequências hom das cepas selecionadas para confirmar secundariamente a adequação da substituição utilizando SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 21 e analisando as sequências modificadas da mesma maneira que no Exemplo 2. As cepas substituídas com cada um dos nucleotídeos modificados foram nomeadas como CTR-T285I, CTR-R398Q, CTR-G378W e CTR-G378S, respectivamente.

EXEMPLO 5: MEDIÇÃO DA ATIVIDADE DA HOMOSERINA

DESIDROGENASE

[085] A atividade da enzima hom foi medida nas cepas preparadas. A cepa de tipo selvagem ATCC13032 em um grupo de controle e CTR-T285I, CTR-R398Q, CTR-G378W e CTR- G378S preparada no Exemplo 4 foram inoculadas em 25 ml do meio de semente e depois cultivadas até atingirem a fase tardia do log. As células foram recuperadas por centrifugação, lavadas duas vezes com tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,6) e finalmente suspensas em 2 ml do mesmo tampão contendo glicerol a uma concentração de 30%. A suspensão celular foi fisicamente interrompida por um método convencional de vórtice de esferas de vidro por 10 minutos e, em seguida, o sobrenadante foi recuperado através de duas centrifugações (13.000 rpm, 4 °C, 30 minutos) e usado como um extrato bruto para medir a atividade da enzima hom. Para a medição da atividade de hom, uma solução de coenzima (0,1 ml) foi adicionada a uma solução de reação para medir a atividade enzimática (um tampão de fosfato de potássio (pH 7,0), NADPH 25 mM, NADPH 25 mM, semi-aldeído aspartato 5 mM) e depois reagiu a 30 °C. A atividade U de hom foi definida como o número de µmol de NADPH consumido por minuto, de acordo com a presença de L-treonina (0 mM, 10 mM), e os resultados da atividade enzimática são mostrados na Tabela 2 abaixo.

[TABELA 2] MEDIÇÃO DA ATIVIDADE DE HOM (U) E DESSENSIBILIZAÇÃO POR L-TREONINA Atividade enzimática (U) de acordo com a Cepa quantidade de L-treonina adicionada (mM) 0 mM 10 mM ATCC13032 0,92 0,02 CTR-T285I 1,11 0,82 CTR-R398Q 1,31 1,12 CTR-G378W 1,39 1,21 CTR-G378S 1,38 1,22

[086] Como resultado do experimento, foi confirmado que, na hom contendo cada uma das modificações T285I, R398Q, G378W e G378S, a inibição da atividade foi reduzida sob a condição de conter 10 mM de L-treonina, diferentemente da hom do tipo selvagem, e assim ocorreu dessensibilização à L-treonina.

EXEMPLO 6: PREPARAÇÃO E AVALIAÇÃO DA CEPA DE

MICRORGANISMO DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM COM PRODUTIVIDADE DE L-TREONINA

[087] As cepas produtoras de L-treonina foram desenvolvidas a partir de Corynebacterium glutamicum do tipo selvagem ATCC13032. Especificamente, para resolver a inibição de retroalimentação de aspartato quinase (LysC), que é uma enzima importante atuada pela primeira vez na via da biossíntese de treonina, a leucina, que é um aminoácido na posição 377 da LysC, foi substituída por lisina (SEQ ID NÃO: 22).

[088] Mais especificamente, a fim de preparar as cepas nas quais a modificação LysC (L377K) é introduzida, a PCR foi realizada utilizando o cromossomo ATCC13032 como modelo e utilizando os iniciadores das SEQ ID NOs: 23 e 24 ou SEQ ID NOs: 25 e 26. A polimerase de DNA de alta fidelidade PfuUltraTM (Stratagene) foi usada como polimerase para a reação de PCR. As condições de PCR foram as seguintes: desnaturação a 95 °C por 30 segundos; recozimento a 55 °C por 30 segundos; e polimerização a 72 °C por 1 minuto, e um total de 28 ciclos foram repetidos.

Como resultado, um fragmento de DNA (515 pb) na região a montante 5' e um fragmento de DNA (538 pb) na região a jusante 3' foram obtidos com o local de modificação do gene lysC como centro. A PCR foi realizada com os dois fragmentos de DNA amplificado como um modelo utilizando os iniciadores de SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 26. Após desnaturação a 95 °C por 5 minutos, a PCR foi realizada por um total de 28 ciclos sob as seguintes condições: desnaturação a 95 °C por 30 segundos; recozimento a 55 °C por 30 segundos; e polimerização a 72 °C por 2 minutos.

Depois disso, a reação de polimerização foi realizada a 72 °C por 5 minutos. Como resultado, o fragmento de DNA (1023 pb) incluindo a modificação do gene lysC, que codifica uma variante de aspartoquinase, na qual a leucina na posição 377 é substituída pela lisina, foi amplificada. O produto amplificado foi purificado utilizando um kit de purificação por PCR (QUIAGEN) e usado como um fragmento de DNA de inserção para a preparação de um vetor. Enquanto isso, após o tratamento com uma enzima de restrição SmaI, a proporção da concentração molar (M) do vetor pDZ tratada termicamente a 65 °C por 20 minutos para o fragmento de DNA de inserção amplificado pela PCR acima foi fixada em 1:2 e, em seguida, estes foram clonados utilizando um kit de clonagem de infusão (TaKaRa), de acordo com o manual. Depois disso, o vetor pDZ-L377K para a introdução da modificação L377K no cromossomo foi preparado.

[089] ATCC13032 foi transformado com o vetor preparado por eletroporação. Após o cruzamento secundário, uma cepa na qual cada uma das modificações de nucleotídeos é substituída por nucleotídeos modificados foi obtida e a cepa foi denominada como CJP1.

[090] A fim de confirmar claramente a alteração na produção de L-treonina da cepa, cada uma das modificações identificadas no Exemplo 4 foi introduzida em um gene que codifica a homoserina desidrogenase. Especificamente, para introduzir cada uma das modificações T285I, R398Q, G378W e G378S na cepa CTR-L377K, a CJP1 foi transformada com cada um dos vetores pDZ-T285I, pDZ-R398Q, pDZ-G378W e pDZ-G378S preparados no Exemplo 4 por eletroporação e, em seguida, as cepas nas quais cada uma das modificações de nucleotídeos é substituída por nucleotídeos modificados no cromossomo foram obtidas pelo cruzamento secundário, da mesma maneira que no Exemplo 4. As cepas substituídas por cada um dos nucleotídeos modificados foram nomeadas como CJP1-T285I, CJP1-R398Q, CJP1-G378W e CJP1-G378S.

[091] As cepas CJP1-T285I e CJP1-R398Q foram depositadas no Centro de Cultura Coreano de Microrganismos (KCCM), que é uma Autoridade Depositária Internacional sob o Tratado de Budapeste, em 26 de setembro de 2017, com os números de acesso KCCM12119P e KCCM12120P, respectivamente.

[TABELA 3] CONFIRMAÇÃO DA CAPACIDADE PRODUTIVA DE L-TREONINA DE 4

CEPAS PREPARADAS Aminoácido (g/l) Cepa Thr Lys

CJP1 0,40 3,60 CJP1-T285I 1,10 3,00 CJP1-R398Q 1,21 2,75 CJP1-G378W 1,30 2,68 CJP1-G378S 1,25 2,78

[092] Como resultado, nas cepas nas quais cada uma das modificações é introduzida, a quantidade de L-lisina produzida foi diminuída e a quantidade de L-treonina produzida foi aumentada de 0,7 g/l para 0,9 g/l, como comparado com a cepa CJP1.

[093] Enquanto isso, para obter uma cepa simultaneamente incluindo as modificações T285I e R398Q, a cepa CJP1-T285I foi transformada com o vetor pDZ-R398Q e, em seguida, a cepa (CJP1-T285I, R398Q) foi obtida pelo mesmo método descrito acima. Além disso, para obter uma cepa simultaneamente, incluindo as modificações G378W e R398Q, a cepa CJP1-G378W foi transformada com o vetor pDZ- R398Q e, em seguida, a cepa (CJP1-G378W, R398Q) foi obtida pelo mesmo método descrito acima. Além disso, para obter cepas simultaneamente incluindo as modificações T285I e G378W, a cepa CJP1-T285I foi transformada com o vetor pDZ- G378W e, em seguida, a cepa (CJP1-T285I, G378W) foi obtida pelo mesmo método descrito acima. O teste da capacidade de produzir L-treonina foi conduzido pelo método descrito no Exemplo 2, e os resultados são mostrados na Tabela 4 abaixo.

[TABELA 4] CONFIRMAÇÃO DA CAPACIDADE PRODUTIVA DE L-TREONINA DE 3

CEPAS PREPARADAS Cepa Aminoácido (g/l) Thr Lys CJP1 0,41 3,55 CJP1-G378W 1,30 2,68 CJP1-T285I,R398Q 1,41 2,65 CJP1-G378W,R398Q 2,12 1,92 CJP1-T285I,G378W 1,92 2,15

[094] Como resultado, confirmou-se que a capacidade de produção de treonina é maior quando os dois tipos de modificações da presente revelação foram introduzidos, em comparação com a cepa CJP1-G378W que mostra a maior capacidade de produção de treonina nos Exemplos. Nas cepas nas quais as duas modificações são introduzidas, a quantidade de treonina produzida foi aumentada de 1,1 g/l para 1,7 g/l em comparação com a cepa CJP1, que é um grupo de controle, e, portanto, foi confirmado que o efeito de dessensibilização de hom foi muito melhorado.

EXEMPLO 7: PREPARAÇÃO E AVALIAÇÃO DA CEPA DE MICRORGANISMO DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM PRODUZINDO L-

ISOLEUCINA

[095] Para produzir cepas produtoras de isoleucina, foi preparado um vetor para melhorar a expressão do gene ilvA modificado (V323A) (Appl. Enviro.

Microbiol., dezembro de 1996, p.4345-4351), que codifica L- treonina desidratase conhecida (a primeira enzima na via de biossíntese da isoleucina) nas cepas preparadas no Exemplo

6.

[096] Especificamente, para preparar um vetor para a introdução de uma modificação, que tem como alvo o gene ilvA, um par de iniciadores (SEQ ID NOs: 27 e 28) para amplificar a região a montante 5ʹ e um par de iniciadores (SEQ ID NOs: 29 e 30) para amplificar a região a jusante 3’ foram criados com o local de modificação como o centro. Os locais da enzima de restrição BamHI (sublinhados) foram inseridos em cada terminal dos iniciadores de SEQ ID NOs: 27 e 30, e os iniciadores de SEQ ID NOs: 28 e 29 foram projetados de modo que uma modificação substituída por nucleotídeo (sublinhada) seja posicionada em uma região onde um cruzamento será induzido.

[TABELA 5]

SEQ ID NO: Sequência nucleotídica 27 ACGGATCCCAGACTCCAAAGCAAAAGCG 28 ACACCACGgCAGAACCAGGTGCAAAGGACA 29 CTGGTTCTGcCGTGGTGTGCATCATCTCTG 30 ACGGATCCAACCAAACTTGCTCACACTC

[097] A PCR foi realizada com o cromossomo do tipo selvagem como um modelo utilizando os iniciadores de SEQ ID NOs: 27, 28, 29 e 30. Após desnaturação a 95 °C por 5 minutos, a PCR foi realizada por um total de 30 ciclos nas seguintes condições: desnaturação a 95 °C por 30 segundos; recozimento a 55 °C por 30 segundos; e polimerização a 72 °C por 30 segundos. Depois disso, a reação de polimerização foi realizada a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, um fragmento de DNA (627 pb) na região a montante de 5 and e um fragmento de DNA (608 pb) na região a jusante da 3 with foram obtidos com o local de modificação do gene ilvA como centro.

[098] A PCR foi realizada com os dois fragmentos de DNA amplificado como um modelo utilizando os iniciadores de SEQ ID NOs: 27 e 30. Após desnaturação a 95 °C por 5 minutos, a PCR foi realizada por um total de 30 ciclos sob as seguintes condições: desnaturação a 95 °C por 30 segundos; recozimento a 55 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 60 segundos. Depois disso, a reação de polimerização foi realizada a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, o fragmento de DNA (1217 pb) foi amplificado, incluindo a modificação do gene ilvA que codifica a variante IlvA na qual a valina na posição 323 é substituída por alanina. O vetor pECCG117 (Patente Coreana Nº 10-0057684) e o fragmento de DNA (1011 pb) foram tratados com uma enzima de restrição BamHI, ligada utilizando DNA ligase e depois clonada para obter um plasmídeo. O plasmídeo assim obtido foi nomeado como pECCG117-ilvA (V323A).

[099] O vetor pECCG117-ilvA (V323A) foi introduzido em cada uma das cepas CJP1-T285I, R398Q, CJP1- G378W, R398Q e CJP1-T285I, G378W preparadas no Exemplo 6 por eletroporação e manchadas em um meio seletivo contendo canamicina (25 mg/l) para obter cepas transformadas. As cepas transformadas assim obtidas foram cultivadas pelo mesmo método de cultivo em frasco do Exemplo 2, e as concentrações de L-isoleucina nos meios de cultura foram analisadas. Os resultados são mostrados na Tabela 6.

[TABELA 6]

AVALIAÇÃO DE CEPAS PREPARADAS Cepa L-isoleucina

(g/l) CJP1/pECCG117-ilvA(V323A) 0,7 CJP1-G378W/pECCG117-ilvA(V323A) 0,9 CJP1-T285I,R398Q/pECCG117-ilvA(V323A) 1,1 CJP1-G378W,R398Q/pECCG117-ilvA(V323A) 1,2 CJP1-T285I,G378W/pECCG117-ilvA(V323A) 1,0

[0100] Como resultado, foi confirmado que na cepa incluindo a modificação hom (G378W), a concentração de L- isoleucina foi melhorada em 0,2 g/l em comparação com a cepa de controle. Além disso, na cepa incluindo a modificação hom, na qual duas modificações foram introduzidas simultaneamente, a capacidade de produzir L- isoleucina foi melhorada ainda mais em 0,3 g/l para 0,5 g/l em comparação com a cepa de controle. Além disso, entre as cepas preparadas, 1,1 g/l de L-isoleucina foi produzida na cepa CJP1-T285I, R398Q/pECCG117-ilvA (V323A), incluindo as modificações T285I e R398Q.

EXEMPLO 8: PREPARAÇÃO E AVALIAÇÃO DA CEPA PRODUTORA DE O-ACETIL-HOMOSERINA (OAH) SUBSTITUÍDA COM HOM MODIFICADA 8-1. PREPARAÇÃO DA CEPA ATCC13032 SUBSTITUÍDA COM HOM

MODIFICADA

[0101] Os dois tipos de modificações (T285I e

R398Q) foram introduzidos na cepa ATCC13032 da mesma maneira que no Exemplo 7, e a cepa assim preparada foi nomeada como ATCC13032::HomFBR.

8-2. DELEÇÃO DO GENE METB

[0102] Neste exemplo, o gene metB que codifica a cistationina gama-sintase na via de degradação de O-acetil- homoserina foi obtido por PCR utilizando o DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 como modelo. Com base no GenBank dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH GenBank), foram obtidas as informações da sequência nucleotídica do metB (Registro NCBI Ncgl2360; SEQ ID NO: 31). Além disso, com base nisso, os iniciadores (SEQ ID NOS: 32 e 33) contendo o terminal N e a sequência ligante do gene metB e os iniciadores (SEQ ID NOS: 34 e 35) contendo o terminal C e a sequência ligante do gene metB foram sintetizados. A PCR foi realizada com o DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 como um modelo utilizando os oligonucleotídeos das sequências nucleotídicas das SEQ ID NOS: 32 e 33 e SEQ ID NOS: 34 e 35 como iniciadores. A polimerase de DNA de alta fidelidade PfuUltraTM (Stratagene) foi usada como polimerase. As condições de PCR foram as seguintes: desnaturação a 96 °C por 30 segundos; recozimento a 53 °C por 30 segundos; e polimerização a 72 °C por 1 minuto, e um total de 30 ciclos foram repetidos. Como resultado, foi obtido um gene amplificado (500 pb) contendo o terminal N e o ligante do gene metB e um gene amplificado (500 pb) contendo o terminal C e o ligante do gene metB.

[0103] A PCR foi realizada utilizando os dois genes amplificados assim obtidos como modelo para um total de 10 ciclos nas seguintes condições: desnaturação a 96 °C por 60 segundos; recozimento a 50 °C por 60 segundos; e polimerização a 72 °C durante 1 minuto. Depois disso, as sequências nucleotídicas da SEQ ID NOS: 32 e 35 foram adicionadas às mesmas e, em seguida, um total de 20 ciclos foram repetidos. Como resultado, foi obtido um gene ΔmetB amplificado (1000 pb), que é um cassete de inativação metB contendo o terminal N-terminal-ligante-C-terminal do gene metB. O gene metB obtido através da PCR foi tratado com as enzimas de restrição XbaI e SalI incluídas nos terminais e depois clonado em um vetor pDZ (KR 0924065), no qual as enzimas de restrição XbaI e SalI são tratadas via ligação.

Depois disso, foi preparado um vetor recombinante pDZ-ΔmetB no qual a fita de inativação metB é finalmente clonada.

[0104] Os Corynebacterium glutamicum ATCC13032 e ATCC13032::HomFBR foram transformados com o vetor pDZ-ΔmetB assim preparado. Após cruzamento secundário, foram obtidas Corynebacterium glutamicum ATCC13032 ΔmetB e ATCC13032::HomFBR ΔmetB, em que o gene metB é inativado no cromossomo. O gene metB inativado foi finalmente confirmado através da realização de PCR utilizando os iniciadores de SEQ ID NOS: 32 e 25 e, em seguida, foi comparado com o ATCC13032 no qual o gene metB não está inativado.

8-3. DELEÇÃO DO GENE DE METY

[0105] Neste exemplo, o gene metY que codifica O- acetil-homoserina (tiol)-liase na via de degradação de O- acetil-homoserina foi obtido por PCR utilizando o DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 como modelo. Com base no GenBank dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH GenBank), foram obtidas as informações da sequência nucleotídica do gene metY (Registro NCBI Ncgl0625; SEQ ID NO: 36). Além disso, com base nisso, os iniciadores (SEQ ID NOS: 37 e 38) contendo o terminal N e a sequência ligante do gene metY e os iniciadores (SEQ ID NOS: 39 e 40) que contêm o terminal C e a sequência ligante do gene metY foram sintetizados.

[0106] A PCR foi realizada com o DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 como um modelo utilizando os oligonucleotídeos das sequências nucleotídicas da SEQ ID NOS: 39 e 40 como os iniciadores. A polimerase de DNA de alta fidelidade PfuUltraTM (Stratagene) foi usada como polimerase. As condições de PCR foram as seguintes: desnaturação a 96 °C por 30 segundos; recozimento a 53 °C por 30 segundos; e polimerização a 72 °C por 1 minuto, e um total de 30 ciclos foram repetidos.

Como resultado, foi obtido um gene amplificado (500 pb) contendo o terminal N e o ligante do gene metY e um gene amplificado (500 pb) contendo o terminal C e o ligante do gene metY. A PCR foi realizada utilizando os dois genes amplificados assim obtidos como modelo para um total de 10 ciclos nas seguintes condições: desnaturação a 96 °C por 60 segundos; recozimento a 50 °C por 60 segundos; e polimerização a 72 °C durante 1 minuto. Depois disso, as sequências nucleotídicas da SEQ ID NOS: 37 e 40 foram adicionadas e, em seguida, um total de 20 ciclos foram repetidos. Como resultado, foi obtido um gene ΔmetY amplificado (1000 pb), que é um cassete de inativação metB contendo o terminal N-terminal-ligante-C-terminal do gene metY.

[0107] O gene metY obtido através da PCR foi tratado com as enzimas de restrição XbaI e SalI incluídas nos terminais e depois clonado em um vetor pDZ (KR2008- 0025355), no qual as enzimas de restrição XbaI e SalI são tratadas via ligação. Depois disso, foi preparado um vetor recombinante pDZ-ΔmetY no qual a fita de inativação metY é finalmente clonada.

[0108] As cepas Corynebacterium glutamicum ATCC13032, ATCC13032::HomFBR, ATCC13032 ΔmetB e ATCC13032::HomFBR ΔmetB foram transformadas com o vetor pDZ- ΔmetY assim preparado. Após cruzamento secundário,

Corynebacterium glutamicum ATCC13032 ΔmetY, ATCC13032::HomFBR ΔmetY, ATCC13032 ΔmetB metmet e ATCC13032::HomFBR ΔmetB metmet, em que o gene metY é inativado no cromossomo, foram obtidos. O gene metY inativado foi finalmente confirmado através da realização de PCR utilizando os iniciadores da SEQ ID NOS: 37 e 40 e, em seguida, foi comparado com o ATCC13032 no qual o gene metY não está inativado.

8-4. PREPARAÇÃO E AVALIAÇÃO DA CEPA PRODUZINDO O- ACETIL-HOMOSERINA

[0109] Foi feita uma comparação entre as habilidades produtoras de O-acetil-homoserina do ATCC13032, ATCC13032 ΔmetB, ATCC13032 ΔmetY, ATCC13032 ΔmetB ΔmetY, ATCC13032::HomFBR, ATCC13032::HomFBR ΔmetB, ATCC13032::HomFBR ΔmetB, ATCC13032::HomFBR: Cepas HomFBR ΔmetB ΔmetY preparadas nos Exemplos 8-1 a 8-3, nas quais o gene metB, metY, metBY são excluídos e o gene hom modificado é substituído.

[0110] Especificamente, colônias únicas foram cultivadas em meio LB sólido durante a noite em uma incubadora a 32 °C e uma alça de cada uma das colônias únicas foi inoculada em meio de título O-acetil-homoserina (25 ml) e, em seguida, as resultantes foram cultivadas a 32 °C a 250 rpm por 42 a 64 horas. A O-acetil-homoserina de cada um dos produtos cultivados foi analisada por HPLC, e seus resultados são mostrados na Tabela 7 abaixo.

MEIO DE PRODUÇÃO DE L-O-ACETIL-HOMOSERINA (PH 7,2)

[0111] Glicose 30 g, KH2PO4 2 g, ureia 3 g, (NH4)2SO4 40 g, peptona 2,5 g, CSL (Sigma) 5 g (10 ml), MgSO4·7H2O 0,5 g, metionina 400 mg, leucina 400 mg , CaCO3 20 g (baseado em 1 L de água destilada) [TABELA 7] AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE L-O-ACETIL-HOMOSERINA Produção de O-AH Cepas (g/l) - 0,0 metB 0,3 ATCC13032 metY 0,3 metBY 0,5 - 0,0 ATCC13032::HomFBR metB 1,2 (T285I + R398Q) metY 1,4 metBY 3,5

[0112] Como resultado, como mostrado na Tabela 7 acima, o O-acetil-homoserina não foi acumulado quando Corynebacterium glutamicum ATCC13032, uma cepa de controle, foi cultivada; considerando que cada uma das 0,3 g/l, 0,3 g/l e 0,5 g/l de O-acetil-homoserina foi acumulada nas cepas ATCC13032 ΔmetB, ATCC13032 ΔmetY e ATCC13032 ΔmetB ΔmetY, respectivamente, nas quais os genes metB, metY e metBY são inativados.

[0113] Além disso, no caso da cepa ATCC13032::HomFBR, na qual o gene hom é substituído em uma forma mutante, e a cepa ATCC13032::HomFBR ΔmetB, ATCC13032::HomFBR ΔmetY e ATCC13032::HomFBR ΔmetB ΔmetY em em que os genes metB, metY e metBY são inativados, respectivamente, foi confirmado que o O-acetil-homoserina estava acumulado em uma quantidade de 1,2 g/l, 1,4 g/l e 3,5 g/l para cada uma dessas cepas.

[0114] Portanto, a partir dos resultados acima, foi confirmado que a quantidade de produção do aminoácido alvo, que utiliza a homoserina como precursor utilizando a hom modificada da presente revelação, poderia ser bastante aumentada.

EXEMPLO 9: PREPARAÇÃO E AVALIAÇÃO DA CEPA PRODUZINDO METIONINA (MET) EXEMPLO 9-1: PREPARAÇÃO DO VETOR RECOMBINANTE PARA

DELEÇÃO DO GENE MCBR

[0115] Neste exemplo, para preparar cepas produtoras de metionina, um vetor para inativação do gene mcbR (J. Biotechnol. 103: 51-65, 2003), que codifica proteínas reguladoras da transcrição conhecidas de metionina e cisteína nas cepas preparadas no Exemplo 6, foi preparado.

[0116] Especificamente, um vetor plasmídeo recombinante foi preparado utilizando o método abaixo, a fim de eliminar o gene mcbR no cromossomo de Corynebacterium ATCC13032. Com base nas sequências nucleotídicas relatadas no Genbank dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH GenBank), foram obtidos o gene mcbR e sua sequência circundante (SEQ ID NO: 41) de Corynebacterium glutamicum.

[0117] Com o objetivo de obter o gene deletado em mcbR, a PCR foi realizada com o DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 como um modelo utilizando os iniciadores de SEQ ID NOS: 42 e 43 e SEQ ID NOS: 44 e 45. Após desnaturação a 95 °C por 5 minutos, a PCR foi realizada por um total de 30 ciclos nas seguintes condições: desnaturação a 95 °C por 30 segundos; recozimento a 53 °C por 30 segundos; e polimerização a 72 °C por 30 segundos. Como resultado, foram obtidos fragmentos de DNA (700 pb).

[0118] Um vetor pDZ (Patente Coreana Nº 10- 0924065), que não pode ser clonado em Corynebacterium glutamicum, e os fragmentos do gene mcbR amplificado foram tratados com uma enzima de restrição smaI para introdução cromossômica. Posteriormente, eles foram ligados utilizando DNA ligase e depois transformados com E. coli DH5α,

seguidos de manchas no mesmo em um meio sólido LB contendo canamicina (25 mg/l). As colônias transformadas com o vetor, no qual fragmentos deletados dos genes alvo são inseridos por PCR, foram selecionados e um plasmídeo foi obtido utilizando um método de extração de plasmídeo. O plasmídeo assim obtido foi nomeado como pDZ-ΔmcbR.

EXEMPLO 9-2: PREPARAÇÃO E AVALIAÇÃO DA CEPA DO MICRORGANISMO DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM PRODUZINDO L-

METIONINA

[0119] Cada uma das cepas CJP1-G378W, CJP1-T285I, R398Q, CJP1-G378W, R398Q, CJP1-T285I, G378W e CJP1, preparadas no exemplo 6 por recombinação homóloga no cromossomo, foi transformada com o Vetor pDZ-ΔmcbR preparado no Exemplo 9 utilizando eletroporação (van der Rest et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 52: 541-545, 1999). Depois disso, a recombinação secundária foi realizada em um meio sólido contendo X-gal. As cepas nas quais o gene mcbR é excluído foram confirmadas por um método de PCR com as cepas transformadas de Corynebacterium glutamicum, nas quais a recombinação secundária foi concluída, utilizando os iniciadores de SEQ ID NOS: 46 e

47. Essas cepas recombinantes foram nomeadas como Corynebacterium glutamicum CJP1 -G378W/ΔmcbR, CJP1-T285I, R398Q/ΔmcbR, CJP1-G378W, R398Q/ΔmcbR, CJP1-T285I, G378W/ΔmcbR e CJP1/ΔmcbR, respectivamente.

[0120] Para analisar a capacidade de produção de L- metionina das CJP1-G378W/ΔmcbR, CJP1-T285I, R398Q/ΔmcbR, CJP1-G378W, R398Q/ΔmcbR e CJP1-T285I, G378W as cepas foram cultivadas em conjunto com a sua cepa progenitora, Corynebacterium glutamicum CJP1/ΔmcbR, da seguinte maneira.

[0121] Corynebacterium glutamicum CJP1/ΔmcbR e as cepas da invenção (Corynebacterium glutamicum CJP1- G378W/ΔmcbR, CJP1-T285I, R398Q/ΔmcbR, CJP1-G378/a, R398Q/C39) foram inoculadas em um balão defletor de canto (250 ml) contendo o meio de semente abaixo (25 ml) e, em seguida, cultivado com agitação a 30 °C a 200 rpm por 20 horas. Posteriormente, o meio de cultura de sementes (1 ml) foi inoculado em um balão defletor de canto (250 ml) contendo o meio de produção abaixo (24 ml) e depois cultivado com agitação a 30 °C a 200 rpm por 48 horas. As composições do meio de semente e do meio de produção são as seguintes.

[0122] Glicose 20 g, peptona 10 g, extrato de levedura 5 g, ureia 1,5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4·7H2O

0.5 g, biotina 100 µg, tiamina HCl 1.000 µg, pantotenato de cálcio 2.000 µg, nicotinamida 2.000 µg (baseado em 1 l de água destilada) <MEIO DE PRODUÇÃO (pH 8,0)>

[0123] Glicose 50 g, (NH4)2S2O3 12 g, extrato de levedura 5 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 1,2 g, biotina 100 µg, tiamina HCl 1.000 µg, pantotenato de cálcio 2.000 µg, nicotinamida 3.000 µg, CaCO3 30 g (baseado em 1 l de água destilada)

[0124] Após o cultivo utilizando o método de cultivo acima, a concentração de L-metionina em cada meio de cultura foi analisada e os resultados são mostrados na Tabela 8.

[TABELA 8]

AVALIAÇÃO DE CEPAS PREPARADAS Cepa L-metionina (g/l) CJP1/ΔmcbR 0,01 CJP1-G378W/ΔmcbR 0,13 CJP1-T285I,R398Q/ΔmcbR 0,18 CJP1-G378W,R398Q/ΔmcbR 0,20 CJP1-T285I,G378W/ΔmcbR 0,17

[0125] Como resultado, foi confirmado que na cepa incluindo a modificação homogênea de G378W, a capacidade de produção de L-metionina foi melhorada em 0,12 g/l em comparação com a cepa de controle. Adicionalmente, foi confirmado que nas cepas incluindo a modificação homológica, na qual duas modificações foram introduzidas simultaneamente, a capacidade de produção de L-metionina foi melhorada de 0,16 g/l para 0,19 g/l em comparação com a cepa de controle.

[0126] Com base nos resultados acima, foi confirmado que a quantidade de L-metionina produzida poderia ser bastante aumentada usando a hom modificada da presente revelação.

[0127] Embora a presente revelação tenha sido descrita com referência às modalidades ilustrativas particulares, será entendido por aqueles versados na técnica aos quais a presente revelação se refere que a presente revelação pode ser incorporada em outras formas específicas sem se afastar do espírito da técnica ou das características essenciais da presente revelação. Portanto, as modalidades descritas acima são consideradas ilustrativas em todos os aspectos e não restritivas. Além disso, o escopo da presente revelação é definido pelas reivindicações anexas, e não pela descrição detalhada, e deve ser entendido que todas as modificações ou variações derivadas dos significados e escopo da presente revelação e seus equivalentes estão incluídas no escopo das reivindicações anexas.

[NÚMERO DE ACESSO]

[0128] Nome da Agência Depositária: Centro de Cultura Coreano de Microorganismos (Autoridade Depositária

Internacional) Número de deposição: KCCM12119P Data de Deposição: 26 de setembro de 2017

[0129] Nome da Agência Depositária: Centro de Cultura Coreano de Microrganismos (Autoridade Depositária Internacional) Número de deposição: KCCM12120P Data de Deposição: 26 de setembro de 2017

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Homoserina desidrogenase modificada caracterizada por, na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o aminoácido na posição 285 ser substituído por isoleucina; o aminoácido na posição 398 ser substituído por glutamina; ou os aminoácidos em ambas as posições serem substituídos por isoleucina e glutamina, respectivamente.

2. Homoserina desidrogenase modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por, na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o aminoácido na posição 378 ser ainda substituído com triptofano.

3. Polinucleotídeo caracterizado por codificar a homoserina desidrogenase modificada selecionada a partir de qualquer uma das reivindicações 1 e 2.

4. Microrganismo do gênero Corynebacterium caracterizado por compreender a homoserina desidrogenase modificada, em que na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o aminoácido na posição 285 é substituído por isoleucina; o aminoácido na posição 398 é substituído por glutamina; ou os aminoácidos em ambas as posições são substituídos por isoleucina e glutamina, respectivamente.

5. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o microrganismo do gênero Corynebacterium ser um microrganismo do gênero Corynebacterium que produz homoserina ou um L-aminoácido derivado de homoserina.

6. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o L-aminoácido derivado de homoserina ser pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste em L- treonina, L-isoleucina, O-acetil-homoserina e L-metionina.

7. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o microrganismo do gênero Corynebacterium produzir L-alanina.

8. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o microrganismo do gênero Corynebacterium ser Corynebacterium glutamicum.

9. Método para produzir homoserina ou um L-aminoácido derivado de homoserina caracterizado por compreender: cultivar um microrganismo do gênero Corynebacterium, compreendendo a homoserina desidrogenase modificada, em que na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o aminoácido na posição 285 é substituído por isoleucina; o aminoácido na posição 398 é substituído por glutamina; ou os aminoácidos em ambas as posições são substituídos por isoleucina e glutamina, respectivamente, em um meio; e recuperar homoserina ou um L-aminoácido derivado de homoserina a partir do microrganismo ou meio.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o L-aminoácido derivado da homoserina ser pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste em L- treonina, L-isoleucina, O-acetil-homoserina e L-metionina.

11. Composição para a produção de homoserina ou um L- aminoácido derivado de homoserina caracterizada por compreender a homoserina desidrogenase modificada, de acordo com a reivindicação 1, ou o microrganismo, de acordo com a reivindicação 4.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por o L-aminoácido derivado da homoserina ser pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste em L- treonina, L-isoleucina, O-acetil-L-homoserina e L- metionina.

13. Método para aumentar a capacidade de produzir homoserina ou um aminoácido L derivado de homoserina em um microrganismo do gênero Corynebacterium, caracterizado por compreender substituir o aminoácido na posição 285 por isoleucina; o aminoácido na posição 398 por glutamina; ou os aminoácidos em ambas as posições por isoleucina e glutamina, respectivamente, na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 com atividade de homoserina desidrogenase.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o L-aminoácido derivado da homoserina ser pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste em L- treonina, L-isoleucina, O-acetil-L-homoserina e L- metionina.

15. Uso da homoserina desidrogenase modificada de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por ser para a produção de homoserina ou um L-aminoácido derivado de homoserina.

16. Uso do polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por ser para a produção de homoserina ou um L-aminoácido derivado de homoserina.

17. Uso do microrganismo do gênero Corynebacterium, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por ser para a produção de homoserina ou um L-aminoácido derivado de homoserina.