CN101208427A - 氨基酸制备的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了应用遗传修饰的细菌产生氨基酸的方法和组合物。

Description

氨基酸制备的方法和组合物

交叉引用相关的申请

此申请要求2003年5月30日提交的U.S.S.N.60/475,000和2004年3月10日提交的U.S.S.N.60/551,860的优先权的利益。这些申请的全部内容在此并入作为参考。

技术领域

本发明涉及微生物和分子生物学，更具体地，涉及氨基酸的制备方法和组合物。

背景技术

细菌的工业发酵被用于商业上产生有用的代谢物，诸如氨基酸、核苷酸、维生素和抗体。这些发酵过程中应用的许多细菌生产菌株，已经通过随机突变和突变体的选择来产生(Demain，A.L.Trends Biotechnol.18：26-31，2000)。在突变的生产菌株中次级突变(secondary mutation)的积累和这些菌株的衍生物，由于生长和应激耐受力(stress-tolerance)性质的改变，可降低代谢物产生的效率。生产菌株和相关细菌生物体的基因组信息的可用性，提供了机会通过将克隆的核酸导入天然的、未处理(unmanipulated)的宿主菌株来构建新的生产菌株，由此允许在不存在有害突变的条件下产生氨基酸(Ohnishi，J.，等Appl Microbiol Biotechnol.58：217-223，2002)。相似地，此信息提供了机会来鉴定现有的产生菌株并克服现有产生菌株的局限。

发明内容

本发明涉及在细菌中产生氨基酸和相关的代谢物的组合物和方法。在不同的实施方案中，本发明的特点在于细菌菌株，其被设计以增加天冬氨酸家族的氨基酸和相关的代谢物的生产。所述的菌株可被设计以含有一种或多种核酸分子(例如，重组核酸分子)，其编码多肽(例如，与所述的宿主细胞异源或同源的多肽)和/或它们可被设计以增加或减少多肽的表达和/或活性(例如，通过突变内源的核酸序列)。这些多肽，其可以通过本技术领域的技术人员熟悉的各种方法表达，包括变体多肽，如具有降低的反馈抑制的变体多肽。这些变体多肽可通过氨基酸生物合成途径的产物或中间体，诸如S-腺苷甲硫氨酸、赖氨酸、苏氨酸或甲硫氨酸，相对于所述蛋白质的野生型显示降低的反馈抑制。特点也在于由所述核酸编码的变体多肽，以及含有所述核酸和所述多肽的细菌细胞。核酸的组合，和包括所述的核酸的组合的细胞也在这里提供。本发明也涉及改进的细菌生产菌株，包括但不限于棒杆菌的细菌和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(例如，大肠杆菌(E.coli))的菌株。

调节产生来自氨基酸的天冬氨酸家族的氨基酸或相关的代谢物的细菌多肽包括，例如，涉及甲硫氨酸，苏氨酸，异亮氨酸，天冬氨酸，赖氨酸，半胱氨酸和硫的新陈代谢的多肽，如催化将氨基酸生物合成途径的中间体转化为其他中间体和/或终产物的酶，和直接调控这些的酶的表达和/或功能的多肽。以下列表只是涉及氨基酸生物合成的多肽的一部分列表：高丝氨酸O-乙酰基转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶(O-acetylhomoserinesulfhydrylase)、甲硫氨酸腺苷基转移酶(methionine adenosyltransferase)、胱硫醚beta-裂合酶(cystathionine beta-lyase)、O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶/O-乙酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶(O-succinylhomoserine(thio)-lyase/O-乙酰homoserine(thio)-lyase)、McbR基因产物、高半胱氨酸甲基转移酶(homocysteinemethyltransferase)、天冬氨酸激酶(aspartokinase)、丙酮酸羧化酶(pyruvatecarboxylase)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase)、天冬氨酸转氨酶、天冬氨酸半醛脱氢酶(aspartate semialdehyde dehydrogenase)、高丝氨酸脱氢酶(homoserine dehydrogenase)、二氢吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase)、二氢吡啶二羧酸还原酶(dihydrodipicolinatereductase)、N-琥珀酰-LL-二氨基庚二酸转氨酶(N-succinyl-LL-diaminopimelateaminotransferase)、四氢吡啶二羧酸N-琥珀酰转移酶(tetrahydrodipicolinateN-succinyl transferase)、N-琥珀酰-LL-二氨基庚二酸脱琥珀酰酶(N-succinyl-LL-diaminopimelate desuccinylase)、二氨基庚二酸表异构酶(diaminopimelate epimerase)、二氨基庚二酸脱羧酶(diaminopimelatedecarboxylase)、二氨基庚二酸脱氢酶(diaminopimelate dehydrogenase)、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase)、5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶(5-methyltetrahydropteroyltriglutamate-homocysteine methyltransferase)、丝氨酸羟甲基转移酶(serine hydroxymethyltransferase)、5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(5，10-methylene tetrahydrofolate reductase)、丝氨酸O-乙酰基转移酶、D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(D-3-phosphoglycerate dehydrogenase)和高丝氨酸激酶(homoserine kinase)。

异源蛋白可由除所述宿主细菌菌种外的任何细菌生物体的基因编码。所述的异源基因可来自下列非限制性的细菌列表：耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)；地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)；天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)；Thermobifida fusca；菊欧文氏菌(Erwiniachrysanthemi)；Shewanella oneidensis；植物乳杆菌(Lactobacillus phantarum)；Bifidobacterium loyagum；球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)和菊果胶杆菌(Pectobacterium chrysanthemi)。当然，来自肠杆菌科的宿主菌株的异源基因也包括来自棒杆菌的细菌的基因。同样地，棒杆菌的细菌的宿主菌株的异源基因也包括来自肠杆菌科成员的基因。在一些实施方案中，所述的宿主菌株是大肠杆菌，而且所述的异源基因是除棒杆菌的细菌之外的菌种的基因。在一些实施方案中，所述的宿主菌株是棒杆菌的细菌，而且所述的异源基因是除大肠杆菌之外的菌种的基因。在一些实施方案中，所述的宿主菌种是大肠杆菌，而且所述的异源基因是除棒杆菌的细菌之外的菌种的基因。在一些实施方案中，所述的宿主菌株是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，而且所述的异源基因是除大肠杆菌之外的菌种的基因。

在不同的实施方案中，所述的多肽由从放线菌目(order Actinomycetales)的生物体中得到的基因编码。在不同的实施方案中，所述的异源核酸分子由耻垢分枝杆菌、天蓝色链霉菌、Thermobifida fusca、地中海拟无枝酸菌或棒杆菌的细菌中得到。在不同的实施方案中，所述的异源蛋白由从所述的肠杆菌科的生物体得到的基因编码。在不同的实施方案中，所述的异源核酸分子是从菊欧文氏菌或大肠杆菌中得到的。

在不同的实施方案中，所述的宿主细菌(例如，棒杆菌的细菌或来自肠杆菌科的细菌)也使由基因编码的多肽的水平增加，所述的基因来自所述的宿主细菌(例如，来自棒杆菌或肠杆菌科的细菌如大肠杆菌细菌)。由来自宿主细菌的基因编码的多肽的提高水平可导致下列之一：在天然存在的启动子控制下导入来自所述宿主细菌的基因的附加拷贝；在启动子，例如，来自所述宿主或异源生物体、比天然存在的启动子更适宜产生氨基酸的启动子控制下，导入来自所述宿主细菌的基因的附加拷贝；或用来自所述宿主或异源生物体、更适宜产生氨基酸的启动子，替换来自所述宿主细菌的基因的天然存在的启动子。将用于产生水平增加的蛋白的载体整合入所述的宿主基因组或作为作为游离型质粒存在。

在不同的实施方案中，所述的宿主细菌具有活性降低的多肽(例如，涉及氨基酸合成的多肽，例如，内源多肽)(例如，与对照相比降低的)。降低涉及氨基酸合成的具体多肽的活性可有利于增加具体的氨基酸和相关的代谢物的产生。在一个实施方案中，二氢吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase)多肽的表达在细菌中是不足的(例如，所述细菌中内源dapA基因被突变或缺失)。在不同的实施方案中，一种或多种下列多肽的表达是不足的：mcbR基因产物、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、甲硫氨酸腺苷基转移酶、高丝氨酸O-乙酰基转移酶和烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(phosohoenolpyruvatecarboxykinbase)。

在不同的实施方案中，所述的核酸分子包括启动子，所述的启动子包括，例如，来自大肠杆菌(或其衍生物)的lac、trc、trcRBS、phoA、tac或λP_L/λP_R启动子或来自棒杆菌的phoA、gpd、rplM或rpsJ启动子。

在一个方面，本发明的特点在于宿主细菌(例如，棒杆菌的细菌或肠杆菌科的细菌如大肠杆菌细菌)包含下列至少一种(两种、三种或四种)：(a)核酸分子，其包括编码异源细菌天冬氨酸激酶多肽或其功能变体的序列；(b)核酸分子，其包括编码异源细菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能变体的序列；(c)核酸分子，其包括编码异源细菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽或其功能变体的序列；(d)核酸分子，其包括编码异源细菌丙酮酸羧化酶多肽或其功能变体的序列；(e)核酸分子，其包括编码异源细菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能变体的序列；(f)核酸分子，其包括编码异源细菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体的序列；(g)核酸分子，其包括编码异源细菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽或其功能变体的序列；(h)核酸分子，其包括编码异源细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能变体的序列；(i)核酸分子，其包括编码异源细菌甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽或其功能变体的序列；(j)核酸分子，其包括编码异源细菌mcbR基因产物多肽或其功能变体的序列；(k)核酸分子，其包括编码异源细菌O-琥珀酰高丝氨酸/乙酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽或其功能变体的序列；(l)核酸分子，其包括编码异源细菌胱硫醚(cystathionine)beta-裂合酶多肽或其功能变体的序列；(m)核酸分子，其包括编码异源细菌5-甲基四氢叶酸(methyltetrahydrofolate)高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体的序列和(n)核酸分子，其包括编码异源细菌5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体的序列。

在不同的实施方案中，所述的核酸分子是分离的核酸分子(例如，所述的核酸分子没有这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列天然位于所述生物体中序列的侧翼，从所述的生物体中衍生得到了所述的核酸分子，例如，所述的核酸分子是重组核酸分子)。

在不同的实施方案中，所述的细菌包括含有序列的核酸分子，所述的序列编码两种或多种不同的异源细菌多肽，其中每种所述的异源多肽编码同类的多肽(例如，所述的细菌包括核酸分子，所述的核酸分子含有编码来自第一种(species)的天冬氨酸激酶的序列和编码来自第二种的天冬氨酸激酶的序列)。

在不同的实施方案中，所述的多肽选自肠杆菌科多肽，放线菌类多肽，或其变体。在不同的实施方案中，所述的多肽是下列放线菌菌种中一种的多肽：耻垢分枝杆菌、天蓝色链霉菌、Thermobifida fusca、地中海拟无枝酸菌或棒杆菌的细菌，包括谷氨酸棒杆菌。在不同的实施方案中，所述的多肽是下列肠杆菌菌种中一种的多肽：菊欧文氏菌和大肠杆菌。

在不同的实施方案中，所述的多肽是具有降低的反馈抑制的变体多肽(例如，相对于所述多肽的野生型)。在不同的实施方案中，所述的细菌进一步包括涉及产生氨基酸的附加的异源细菌基因产物。在不同的实施方案中，所述的细菌进一步包括核酸分子，所述的核酸分子编码在此处描述的异源细菌多肽(例如，编码异源细菌高丝氨酸脱氢酶多肽的核酸分子)。在不同的实施方案中，所述的细菌进一步包括核酸分子，所述的核酸分子编码异源细菌多肽(即，细菌多肽，其对于所述的宿主菌种或其功能变体来说是天然的)，如在这里描述的细菌多肽。所述的同源细菌多肽可以高水平和/或有条件地表达。例如，编码所述同源细菌多肽的核酸可以与启动子可操作地连接，所述的启动子允许所述多肽表达超过野生型水平，和/或所述的核酸可以以多拷贝存在于所述的细菌中。

在不同的实施方案中，所述的异源细菌天冬氨酸激酶或其功能变体选自：(a)耻垢分枝杆菌天冬氨酸激酶多肽或其功能变体，(b)地中海拟无枝酸菌天冬氨酸激酶多肽或其功能变体，(c)天蓝色链霉菌天冬氨酸激酶多肽或其功能变体，(d)Thermobifida fusca天冬氨酸激酶多肽或其功能变体，(e)菊欧文氏菌天冬氨酸激酶多肽或其功能变体，和(f)Shewanella oneidensis天冬氨酸激酶多肽或其功能变体。在一些实施方案中，所述的异源细菌天冬氨酸激酶多肽是大肠杆菌天冬氨酸激酶多肽或其功能变体。在一些实施方案中，所述的异源细菌天冬氨酸激酶多肽是谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶多肽或其功能变体。在一些实施方案中，所述的异源细菌天冬氨酸激酶多肽或其功能变体具有降低的反馈抑制。

在不同的实施方案中，所述的异源细菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能变体选自：(a)耻垢分枝杆菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能变体，(b)地中海拟无枝酸菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能变体，(c)天蓝色链霉菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能变体和(d)Therinobifida fusca天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能变体。在一些实施方案中，所述的异源细菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽是大肠杆菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能变体。在一些实施方案中，所述的异源细菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽是谷氨酸棒杆菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能变体。在不同的实施方案中，所述的异源细菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽或其功能变体选自：(a)耻垢分枝杆菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽或其功能变体，(b)天蓝色链霉菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽或其功能变体，(c)Thermobifida fusca磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽或其功能变体，和(d)菊欧文氏菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽或其功能变体。在一些实施方案中，所述的异源细菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽是大肠杆菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽或其功能变体。在一些实施方案中，所述的异源细菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽是谷氨酸棒杆菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽或其功能变体。

在不同的实施方案中，所述的异源细菌丙酮酸羧化酶多肽或其功能变体选自：(a)耻垢分枝杆菌丙酮酸羧化酶多肽或其功能变体，(b)天蓝色链霉菌丙酮酸羧化酶多肽或或其功能变体，和(c)Thermobifida fusca丙酮酸羧化酶多肽或其功能变体。在一些实施方案中，所述的异源细菌丙酮酸羧化酶多肽是谷氨酸棒杆菌丙酮酸羧化酶或其功能变体。

在不同的实施方案中，所述的细菌选自棒杆菌的细菌或肠杆菌科的细菌，如大肠杆菌细菌。棒杆菌的细菌包括，但不限于，谷氨酸棒杆菌、醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)、Corynebacterium melassecola、Corynebacterium thermoaminogenes、乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、Brevibacterium lactis和黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)。

在不同的实施方案中：所述的耻垢分枝杆菌天冬氨酸激酶多肽包括SEQID NO：1或其变体序列，所述的地中海拟无枝酸菌天冬氨酸激酶多肽包括SEQID NO：2或其变体序列，所述的天蓝色链霉菌天冬氨酸激酶多肽包括SEQ IDNO：3或其变体序列，所述的Thermobifida fusca天冬氨酸激酶多肽包括SEQID NO：4或其变体序列，所述的菊欧文氏菌天冬氨酸激酶多肽包括SEQ IDNO：5或其变体序列，和所述的Shewanella oneidensis天冬氨酸激酶多肽包括SEQ ID NO：6或其变体序列，所述的大肠杆菌天冬氨酸激酶多肽包括SEQ IDNO：203或其变体序列，所述的谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶多肽包括SEQ IDNO：202或其变体序列，所述的谷氨酸棒杆菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽包括SEQ ID NO：204或其变体序列，所述的大肠杆菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽包括SEQ ID NO：205或其变体序列，耻垢分枝杆菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽或其功能变体包括氨基酸序列，其与SEQ ID NO：8(麻风分枝杆菌(M.leprae)磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)至少80％同一性(例如，与SEQ ID NO：8至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)，所述的天蓝色链霉菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽包括SEQ ID NO：9或其变体序列，所述的Thermobifida fusca磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽包括SEQ IDNO：7或其变体序列，所述的菊欧文氏菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽包括SEQID NO：10或其变体序列，所述的耻垢分枝杆菌丙酮酸羧化酶多肽包括SEQ IDNO：13或其变体序列，所述的天蓝色链霉菌丙酮酸羧化酶多肽包括SEQ IDNO：12或其变体序列，和所述的谷氨酸棒杆菌丙酮酸羧化酶多肽包括SEQ IDNO：208或其变体序列。

在不同的实施方案中，所述的耻垢分枝杆菌天冬氨酸激酶多肽包括至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点279的丙氨酸变为1组氨基酸残基；在位点301的丝氨酸变为6组氨基酸残基；在位点311的苏氨酸变为2组的氨基酸残基；和在位点345的甘氨酸变为3组的氨基酸残基，所述的耻垢分枝杆菌天冬氨酸激酶包括至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点279的丙氨酸变为脯氨酸，在位点301的丝氨酸变为酪氨酸，在位点311的苏氨酸变为异亮氨酸，和在位点345的甘氨酸变为天冬氨酸。

在不同的实施方案中，所述的地中海拟无枝酸菌天冬氨酸激酶多肽包括至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点279的丙氨酸变为1组的氨基酸残基；在位点301的丝氨酸变为6组的氨基酸残基；在位点311的苏氨酸变为2组的氨基酸残基；和在位点345的甘氨酸变为3组的氨基酸残基。

在不同的实施方案中，所述的地中海拟无枝酸菌天冬氨酸激酶多肽包括至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点279的丙氨酸变为脯氨酸；在位点301的丝氨酸变为酪氨酸；在位点311的苏氨酸变为异亮氨酸；和在位点345的甘氨酸变为天冬氨酸。

在不同的实施方案中，所述的天蓝色链霉菌天冬氨酸激酶多肽包括至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点282的丙氨酸变为1组的氨基酸残基；在位点304的丝氨酸变为6组的氨基酸残基；在位点314的丝氨酸变为2组的氨基酸残基；和在位点348的甘氨酸变为3组的氨基酸残基。

在不同的实施方案中，所述的天蓝色链霉菌天冬氨酸激酶多肽包括至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点282的丙氨酸变为脯氨酸；在位点304的丝氨酸变为酪氨酸；在位点314的丝氨酸变为异亮氨酸；和在位点348的甘氨酸变为天冬氨酸。

在不同的实施方案中，所述的菊欧文氏菌天冬氨酸激酶多肽包括至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点328的甘氨酸变为3组的氨基酸残基；在位点330的亮氨酸变为6组的氨基酸残基；在位点350的丝氨酸变为2组的氨基酸残基；和在位点352的缬氨酸变为除缬氨酸外的2组的氨基酸残基。

在不同的实施方案中，所述的菊欧文氏菌天冬氨酸激酶多肽包括至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点328的甘氨酸变为天冬氨酸；在位点330的亮氨酸变为苯丙氨酸；在位点350的丝氨酸变为异亮氨酸；和在位点352的缬氨酸变为甲硫氨酸。

在不同的实施方案中，所述的Shewanella oneidensis天冬氨酸激酶多肽包括至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点323的甘氨酸变为3组的氨基酸残基；在位点325的亮氨酸变为6组的氨基酸残基；在位点345的丝氨酸变为2组的氨基酸残基；和在位点347的缬氨酸变为除缬氨酸外的2组的氨基酸残基。

在不同的实施方案中，所述的Shewanella oneidensis天冬氨酸激酶多肽包括至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点323的甘氨酸变为天冬氨酸；在位点325的亮氨酸变为苯丙氨酸；在位点345的丝氨酸变为异亮氨酸；和在位点347的缬氨酸变为甲硫氨酸。

在不同的实施方案中，所述的谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶多肽包括至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点279的丙氨酸变为除丙氨酸外的1组的氨基酸残基；在位点301的丝氨酸变为6组的氨基酸残基；在位点311的苏氨酸变为2组的氨基酸残基；和在位点345的甘氨酸变为3组的氨基酸残基。

在不同的实施方案中，所述的谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶多肽包括至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点279的丙氨酸变为脯氨酸；在位点301的丝氨酸变为酪氨酸；在位点311的苏氨酸变为异亮氨酸；和在位点345的甘氨酸变为天冬氨酸。

在不同的实施方案中，所述的大肠杆菌天冬氨酸激酶多肽包括至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点323的甘氨酸变为3组的氨基酸残基；在位点325的亮氨酸变为6组的氨基酸残基；在位点345的丝氨酸变为2组的氨基酸残基；和在位点347的缬氨酸变为除缬氨酸外的2组的氨基酸残基。

在不同的实施方案中，所述的大肠杆菌天冬氨酸激酶多肽包括至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点323的甘氨酸变为天冬氨酸；在位点325的亮氨酸变为苯丙氨酸；在位点345的丝氨酸变为异亮氨酸；和在位点347的缬氨酸变为甲硫氨酸。

在不同的实施方案中，所述的谷氨酸棒杆菌丙酮酸羧化酶多肽或其变体包括在位点458的脯氨酸变为4组的氨基酸残基。在不同的实施方案中，所述的谷氨酸棒杆菌丙酮酸羧化酶多肽或其变体包括在位点458的脯氨酸变为丝氨酸。

在不同的实施方案中，所述的耻垢分枝杆菌丙酮酸羧化酶多肽或其变体包括在位点448的脯氨酸变为4组的氨基酸残基。在不同的实施方案中，所述的耻垢分枝杆菌丙酮酸羧化酶多肽或其变体包括在位点448的脯氨酸变为丝氨酸。

在不同的实施方案中，所述的天蓝色链霉菌丙酮酸羧化酶多肽或其变体包括在位点449的脯氨酸变为4组的氨基酸残基。在不同的实施方案中，所述的天蓝色链霉菌丙酮酸羧化酶多肽或其变体包括在位点449的脯氨酸变为丝氨酸。

本发明的特点也在于棒杆菌的细菌或肠杆菌科的细菌，如大肠杆菌细菌，其包括核酸分子，所述的核酸分子编码异源细菌二氢吡啶二羧酸合酶或其功能变体。

在不同的实施方案中，所述的异源细菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能变体选自：耻垢分枝杆菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能变体；天蓝色链霉菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能变体；Thermobifida fusca二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能变体；和菊欧文氏菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能变体。在一些实施方案中，所述具有降低的反馈抑制的异源细菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能变体是大肠杆菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能变体。在一些实施方案中，所述的异源细菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能变体具有降低的反馈抑制。

在不同的实施方案中，所述的耻垢分枝杆菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽与SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16至少80％同一性(例如，与SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)；所述的天蓝色链霉菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽包括SEQ ID NO：17或其变体序列；所述的Thermobifida fusca二氢吡啶二羧酸合酶多肽包括SEQ ID NO：14或其变体序列；和菊欧文氏菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽包括SEQ ID NO：18或其变体序列。

在不同的实施方案中，所述的菊欧文氏菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽包括至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点80的天冬酰胺变为2组的氨基酸残基；在位点88的亮氨酸变为6组的氨基酸残基；和在位点118的组氨酸变为6组的氨基酸残基。

在不同的实施方案中，所述的菊欧文氏菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽包括至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点80的天冬酰胺变为异亮氨酸；在位点88的亮氨酸变为苯丙氨酸；和在位点118的组氨酸变为酪氨酸。

在不同的实施方案中，所述的天蓝色链霉菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽包括至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点89的天冬酰胺变为2组的氨基酸残基；在位点97的亮氨酸变为6组的氨基酸残基；和在位点127的组氨酸变为6组的氨基酸残基。

在不同的实施方案中，所述的天蓝色链霉菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽包括至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点89的天冬酰胺变为异亮氨酸；在位点97的亮氨酸变为苯丙氨酸；和在位点127的组氨酸变为酪氨酸。

在不同的实施方案中，所述的耻垢分枝杆菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽包括至少一个选自下列的氨基酸改变：对应于SEQ ID NO：16的酪氨酸90的氨基酸残基变为2组的氨基酸残基；对应于SEQ ID NO：16的亮氨酸98的氨基酸残基变为6组的氨基酸残基；和对应于SEQ ID NO：16的组氨酸128的氨基酸残基变为6组的氨基酸残基。

在不同的实施方案中，所述的耻垢分枝杆菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽包括至少一个选自下列的氨基酸改变：对应于SEQ ID NO：16的酪氨酸90的氨基酸残基变为异亮氨酸；对应于SEQ ID NO：16的亮氨酸98的氨基酸残基变为苯丙氨酸；和对应于SEQ ID NO：16的组氨酸128的氨基酸残基变为组氨酸。

在不同的实施方案中，所述的大肠杆菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽包括至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点80的天冬酰胺变为2组的氨基酸残基；在位点81的丙氨酸变为2组的氨基酸残基；在位点84的谷氨酸变为5组的氨基酸残基；在位点88的亮氨酸变为6组的氨基酸残基；和在位点118的组氨酸变为6组的氨基酸。

在不同的实施方案中，所述的大肠杆菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽包括至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点80的天冬酰胺变为异亮氨酸；在位点81的丙氨酸变为缬氨酸；在位点84的谷氨酸变为赖氨酸；在位点88的亮氨酸变为苯丙氨酸；和在位点118的组氨酸变为酪氨酸。

本发明的特点也在于棒杆菌的细菌或肠杆菌科的细菌，如大肠杆菌细菌，其包括核酸分子，所述的核酸分子编码异源细菌高丝氨酸脱氢酶或其功能变体。

在不同的实施方案中，所述的异源细菌高丝氨酸脱氢酶多肽选自：(a)耻垢分枝杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体；(b)天蓝色链霉菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体；(c)Thermobifida fusca高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体；和(d)菊欧文氏菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体。在一些实施方案中，所述的异源细菌高丝氨酸脱氢酶多肽是来自棒杆菌细菌的高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体(例如，谷氨酸棒杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体，或乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体)。在一些实施方案中，所述的异源高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体是大肠杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体。在一些实施方案中，所述的异源高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体具有降低的反馈抑制。

在不同的实施方案中，所述的异源细菌高丝氨酸脱氢酶多肽是具有降低的反馈抑制的天蓝色链霉菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体；所述的天蓝色链霉菌高丝氨酸脱氢酶多肽包括SEQ ID NO：19或其变体序列；所述的Thermobifida fusca高丝氨酸脱氢酶多肽包括SEQ ID NO：21或其变体序列；所述的谷氨酸棒杆菌和乳发酵短杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽包括SEQ ID NO：209或其变体序列；而且所述的大肠杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽包括SEQ IDNO：210、SEQ ID NO：211或其变体序列。

在不同的实施方案中，所述的谷氨酸棒杆菌或乳发酵短杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽包括至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点23的亮氨酸变为6组的氨基酸残基；在位点59的缬氨酸变为1组的氨基酸残基；在位点104的缬氨酸变为另一个2组的氨基酸残基；在位点378的甘氨酸变为3组的氨基酸残基；和在位点428的赖氨酸氨基酸残基之后截短所述的高丝氨酸脱氢酶蛋白的改变。在一个实施方案中，所述的谷氨酸棒杆菌或乳发酵短杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽由WO93/09225 SEQ ID NO.3中描述的hom^dr序列编码。

在不同的实施方案中，所述的谷氨酸棒杆菌或乳发酵短杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽包括至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点23的亮氨酸变为苯丙氨酸；在位点59的缬氨酸变为丙氨酸；在位点104的缬氨酸变为异亮氨酸；和在位点378的甘氨酸变为谷氨酸。

在不同的实施方案中，所述的耻垢分枝杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽包括至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点10的缬氨酸变为6组的氨基酸残基；在位点46的缬氨酸变为1组的氨基酸残基；和在位点364的甘氨酸变为3组的氨基酸残基。

在不同的实施方案中，所述的耻垢分枝杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽包括至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点10的缬氨酸变为苯丙氨酸；在位点46的缬氨酸变为丙氨酸；和在位点378的甘氨酸变为谷氨酸。

在不同的实施方案中，所述的天蓝色链霉菌高丝氨酸脱氢酶多肽包括至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点10的亮氨酸变为6组的氨基酸残基；在位点46的缬氨酸变为1组的氨基酸残基；在位点362的甘氨酸变为3组的氨基酸残基；在位点412的精氨酸氨基酸残基之后截短所述的高丝氨酸脱氢酶蛋白的改变。在不同的实施方案中，所述的天蓝色链霉菌高丝氨酸脱氢酶多肽包括至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点10的亮氨酸变为苯丙氨酸；在位点46的缬氨酸变为丙氨酸；和在位点362的甘氨酸变为谷氨酸。

在不同的实施方案中，所述的Thermobifida fusca高丝氨酸脱氢酶多肽包括至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点192的亮氨酸变为6组的氨基酸残基；在位点228的缬氨酸变为1组的氨基酸残基；在位点545的甘氨酸变为3组的氨基酸残基。在不同的实施方案中，所述的Thermobifida fusca高丝氨酸脱氢酶多肽在位点595的精氨酸氨基酸残基之后被截短。

在不同的实施方案中，所述的Thermobifida fusca高丝氨酸脱氢酶多肽包括至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点192的亮氨酸变为苯丙氨酸；在位点228的缬氨酸变为丙氨酸；和在位点545的甘氨酸变为谷氨酸。

在不同的实施方案中，所述的大肠杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽包括SEQ IDNO：211中至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点330的甘氨酸变为3组的氨基酸残基；和在位点352的丝氨酸变为6组的氨基酸残基。

在不同的实施方案中，所述的大肠杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽包括SEQ IDNO：211中至少一个选自下列的氨基酸改变：在位点330的甘氨酸变为天冬氨酸；和在位点352的丝氨酸变为苯丙氨酸。

本发明的特点也在于：棒杆菌的细菌或肠杆菌科的细菌，如大肠杆菌细菌，其包括核酸分子，所述的核酸分子编码异源细菌O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽或其功能变体。

在不同的实施方案中，所述异源细菌O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽选自：耻垢分枝杆菌O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽或其功能变体；天蓝色链霉菌O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽或其功能变体；Thermobifida fusca O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽或其功能变体；和菊欧文氏菌O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽或其功能变体。在一些实施方案中，所述的异源细菌O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽是来自谷氨酸棒杆菌的O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽或其功能变体。在一些实施方案中，所述的异源O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽或其功能变体具有降低的反馈抑制。在不同的实施方案中，所述的耻垢分枝杆菌O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽与SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23至少80％同一性(例如，与SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)；所述的异源细菌O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽是Thermobifida fusca O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽或其功能变体；所述的Thermobifida fusca O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽包括SEQ ID NO：24或其变体序列；所述的异源细菌O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽是谷氨酸棒杆菌O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽或其功能变体，所述的谷氨酸棒杆菌O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽包括SEQ ID NO：212或其变体序列；或所述的异源细菌O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽是大肠杆菌O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽或其功能变体；所述的大肠杆菌O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽包括SEQ ID NO：213或其变体序列。

本发明的特点也在于棒杆菌的细菌或肠杆菌科的细菌，如大肠杆菌细菌，其包括核酸分子，所述的核酸分子编码异源细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶或其功能变体。

在不同的实施方案中，所述的异源细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽选自：(a)耻垢分枝杆菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能变体；(b)天蓝色链霉菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能变体；和(c)Thermobifida fusca O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能变体。在一些实施方案中，所述的异源细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽是来自谷氨酸棒杆菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能变体。在一些实施方案中，所述的异源O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能变体具有降低的反馈抑制。

在不同的实施方案中，所述的耻垢分枝杆菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽与SEQ ID NO：26至少80％同一性(例如，与SEQ ID NO：26至少80％、85％、90％、92％、94％、95％，96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)；所述的Thermobifida fusca O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽包括SEQ IDNO：25或其变体序列；和所述的谷氨酸棒杆菌异源细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽包括SEQ ID NO：214或其变体序列。

本发明的特点也在于棒杆菌的细菌或肠杆菌科的细菌，如大肠杆菌细菌，其包括核酸分子，所述的核酸分子编码异源细菌甲硫氨酸腺苷基转移酶或其功能变体。

在不同的实施方案中，所述的异源细菌甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽选自：耻垢分枝杆菌甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽或其功能变体；天蓝色链霉菌甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽或其功能变体；Thermobifida fusca甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽或其功能变体；和菊欧文氏菌甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽或其功能变体。在一些实施方案中，所述的异源细菌甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽是来自谷氨酸棒杆菌甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽或其功能变体。在一些实施方案中，所述的异源细菌甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽是来自大肠杆菌的甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽或其功能变体。在一些实施方案中，所述的异源甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽或其功能变体具有降低的反馈抑制。

在不同的实施方案中，所述的耻垢分枝杆菌O-甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽与SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28至少80％同一性(例如，与SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)；所述的天蓝色链霉菌甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽包括SEQ ID NO：30或其变体序列；所述的异源细菌甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽是Thermobifida fusca甲硫氨酸腺苷基转移酶或其功能变体；所述的Thermobifida fusca甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽包括SEQ ID NO：29或其变体序列；所述的谷氨酸棒杆菌异源细菌甲硫氨酸腺苷基转移酶包括SEQ ID NO：215或其变体序列；而且所述的大肠杆菌异源细菌甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽包括SEQ ID NO：216或其变体序列。

在不同的实施方案中，所述的细菌进一步包括核酸分子，所述的核酸分子编码异源细菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能变体。

在不同的实施方案中，所述的异源细菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能变体选自：耻垢分枝杆菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能变体；天蓝色链霉菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能变体；Thermobifida fusca二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能变体；菊欧文氏菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能变体；大肠杆菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能变体；和谷氨酸棒杆菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能变体。在一些实施方案中，所述的异源二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能变体具有降低的反馈抑制。

在不同的实施方案中，所述的细菌进一步包括下列的至少一种：(a)核酸分子，其编码异源细菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体；(b)核酸分子，其编码异源细菌O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽或其功能变体；(c)核酸分子，其编码异源O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能变体。在一些实施方案中，一种或多种异源多肽或其功能变体具有降低的反馈抑制。

在不同的实施方案中，所述的异源细菌高丝氨酸脱氢酶多肽选自：耻垢分枝杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体；天蓝色链霉菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体；Thermobifida fusca高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体；大肠杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体；谷氨酸棒杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体；和菊欧文氏菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体。在一些实施方案中，所述的异源高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体具有降低的反馈抑制。

在不同的实施方案中，所述的异源细菌O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽选自：耻垢分枝杆菌O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽或其功能变体；天蓝色链霉菌O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽或其功能变体；Thermobifida fusca O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽或其功能变体；菊欧文氏菌O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽或其功能变体；大肠杆菌O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽或其功能变体；和谷氨酸棒杆菌O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽或其功能变体。在一些实施方案中，所述的异源O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽或其功能变体具有降低的反馈抑制。

在不同的实施方案中，所述的异源细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽选自：耻垢分枝杆菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶或其功能变体；天蓝色链霉菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能变体；Thermobifida fusca O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能变体；和谷氨酸棒杆菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能变体。在一些实施方案中，所述的异源O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能变体具有降低的反馈抑制。

在不同的实施方案中，所述的细菌进一步包括核酸分子，所述的核酸分子编码异源细菌甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽(例如，耻垢分枝杆菌甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽或其功能变体；天蓝色链霉菌甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽或其功能变体；Thermobifida fusca甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽或其功能变体；菊欧文氏菌甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽或其功能变体；大肠杆菌甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽或其功能变体；或谷氨酸棒杆菌甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽或其功能变体)。

本发明的特点在于棒杆菌的细菌或肠杆菌科的细菌，如大肠杆菌细菌，其包括下列的至少两种：(a)核酸分子，其编码异源细菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体；(b)核酸分子，其编码异源细菌O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽或其功能变体；和(c)核酸分子，其编码异源细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能变体。在一些实施方案中，一种或多种所述的异源细菌多肽或其功能变体具有降低的反馈抑制。

在另一方面，本发明的特点在于大肠杆菌或棒杆菌细菌，其包括下列的至少一个或两个：(a)遗传上改变的核酸分子，其包括序列，所述的序列编码细菌天冬氨酸激酶多肽或其功能变体；(b)遗传上改变的核酸分子，其包括序列，所述的序列编码细菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能变体；(c)遗传上改变的核酸分子，其包括序列，所述的序列编码细菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽或其功能变体；和(d)遗传上改变的核酸分子，其包括序列，所述的序列编码细菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能变体。在不同的实施方案中，所述遗传上改变的核酸分子是基因组核酸分子(例如，其中导入突变的基因组核酸分子，例如，导入基因的编码区或调控区)。在不同的实施方案中，所述的核酸分子是重组核酸分子。

在不同的实施方案中，至少两种遗传上改变的核酸分子中的至少一种编码异源多肽。在一个实施方案中，所述的细菌包括(a)和(b)、(a)和(c)、(a)和(d)、(b)和(c)、(b)和(d)或(c)和(d)。在一个实施方案中，所述的细菌包括(a)-(e)中至少三种。在一个实施方案中，所述的细菌，相对于对照具有活性降低的一种或多种下列多肽：(a)高丝氨酸脱氢酶多肽；(b)高丝氨酸激酶多肽；和(c)磷酸烯醇丙酮酸羧酶多肽。在一个实施方案中，所述的细菌包括在内源的hom基因中或内源的ThrB基因中的突变(例如，降低由所述基因编码的所述多肽的活性的突变(例如，催化区域中的突变)或降低由所述基因编码的所述多肽表达的突变(例如，引起所述多肽早期终止的突变)，或降低转录体或蛋白稳定性或半衰期的突变。在一个实施方案中，所述的细菌包括在内源的hom基因中或内源的ThrB基因中的突变。在一个实施方案中，所述的细菌包括在内源的pck基因中的突变。

在另一方面，本发明的特点在于大肠杆菌或棒杆菌的细菌，其包括下列的至少一种或两种：(a)遗传上改变的核酸分子，其包括序列，所述序列编码细菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽或其功能变体；(b)遗传上改变的核酸分子，其包括序列，所述序列编码细菌天冬氨酸激酶多肽或其功能变体；(c)遗传上改变的核酸分子，其包括序列，所述序列编码细菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能变体；(d)遗传上改变的核酸分子，其包括序列，所述序列编码细菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体；(e)遗传上改变的核酸分子，其包括序列，所述序列编码细菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽或其功能变体；(f)遗传上改变的核酸分子，其包括序列，所述序列编码细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能变体；(g)遗传上改变的核酸分子，其包括序列，所述序列编码细菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体；(h)遗传上改变的核酸分子，其包括序列，所述序列编码细菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽或其功能变体；(i)遗传上改变的核酸分子，其包括序列，所述序列编码细菌5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体；(j)遗传上改变的核酸分子，其包括序列，所述序列编码细菌甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽或其功能变体；(k)遗传上改变的核酸分子，其包括序列，所述序列编码细菌丝氨酸羟基甲基转移酶多肽或其功能变体；和(l)遗传上改变的核酸分子，其包括序列，所述序列编码细菌胱硫醚beta-裂合酶多肽或其功能变体。

在不同的实施方案中，至少两种遗传上改变的核酸分子中的至少一种编码异源多肽。在不同的实施方案中，所述的细菌包括(a)和(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)和(l)中至少一种。在不同的实施方案中，所述的细菌包括(b)和(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(i)、(k)和(l)中至少一种。在不同的实施方案中，所述的细菌包括(c)和(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)和(l)中至少一种。在不同的实施方案中，所述的细菌包括(d)和(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)和(l)中至少一种。在不同的实施方案中，所述的细菌包括(e)和(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)和(l)中至少一种。在不同的实施方案中，所述的细菌包括(f)和(g)、(h)、(i)、(j)、(k)和(l)中至少一种。在不同的实施方案中，所述的细菌包括(g)和(h)、(i)、(j)、(k)和(l)中至少一种。在不同的实施方案中，所述的细菌包括(h)和(i)、(j)、(k)和(l)中至少一种。在不同的实施方案中，所述的细菌包括(i)和(j)(k)和(l)中至少一种。在不同的实施方案中，所述的细菌包括(j)和(k)和(l)中至少一种。在不同的实施方案中，所述的细菌包括(k)和(l)。在不同的实施方案中，所述的细菌包括(a)-(l)中至少三种。

在一些实施方案中，所述的细菌相对于对照，具有活性降低的一种或多种下列多肽：(a)高丝氨酸激酶多肽；(b)磷酸烯醇丙酮酸羧酶多肽；(c)高丝氨酸脱氢酶多肽；和(d)mcbR基因产物多肽，例如，所述的细菌在内源的hom基因、内源的thrB基因、内源的pck基因或内源的mcbR基因，或它们的组合中包含突变。

在另一方面，本发明的特点在于大肠杆菌或棒杆菌的细菌，其包括下列的至少两种：(a)遗传上改变的核酸分子，其包括序列，所述序列编码细菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽或其功能变体；(b)遗传上改变的核酸分子，其包括序列，所述序列编码细菌天冬氨酸激酶多肽或其功能变体；(c)遗传上改变的核酸分子，其包括序列，所述序列编码细菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能变体；(d)遗传上改变的核酸分子，其包括序列，所述序列编码细菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体。

在不同的实施方案中，至少两种多肽中的至少一种编码异源多肽。

在不同的实施方案中，所述细菌包括(a)和(b)、(a)和(c)、(a)和(d)、(b)和(c)、(b)和(d)或(c)和(d)；或所述细菌包括(a)-(d)中至少三种。

在不同的实施方案中，所述细菌具有活性降低的一种或多种的下列多肽，相对于对照：(a)磷酸烯醇丙酮酸羧酶；和(b)mcbR基因产物多肽，例如，所述的细菌在内源pck基因或内源mcbR基因中包含突变，例如，所述细菌在内源pck基因和内源mcbR基因中包含突变。

本发明的特点也在于产生氨基酸或相关代谢物的方法，所述的方法包括：在允许产生所述的氨基酸所述的代谢物的条件下，培养细菌(例如，在这里描述的细菌)，和从所述的培养物中收集包含所述的氨基酸或相关代谢物的组合物。所述的方法进一步包括分级至少一部分的所述培养物，以获得富含所述氨基酸或代谢物的级分。

本发明的特点在于产生L-赖氨酸的方法，所述的方法包括：在允许产生L-赖氨酸的条件下，培养细菌并收集所述的培养物。所述的培养物可进行分级(例如，以去除细胞和/或以获得富含L-赖氨酸的级分)。

在另一方面，本发明的特点在于制备动物饲料添加剂的方法，所述的动物饲料添加剂含有天冬氨酸衍生的氨基酸，所述方法包括下列步骤的两种或多种：(a)在允许产生所述的天冬氨酸-衍生的氨基酸的条件下，培养细菌(例如，在这里描述的细菌)；(b)收集组合物，所述的组合物包含至少一部分天冬氨酸-衍生的氨基酸；(c)将收集的组合物浓缩，以富集天冬氨酸-衍生的氨基酸；和(d)任选地，加入一种或多种物质，以获得所需要的动物饲料添加剂。

可加入的物质包括，例如，常规的有机或无机辅助物质或载体，如明胶(gelatin)、纤维素衍生物(例如，纤维素醚)、硅石(silica)、硅酸盐(silicate)、硬脂酸盐(stearate)、砂砾(grit)、糠(bran)、粗粉(meal)、淀粉、树胶(gum)、海藻酸盐(alginate)、糖类或其他，和/或用常规的增稠剂或粘合剂(thickeners orbinders)混合并稳定化。

在不同的实施方案中，收集的所述组合物缺乏细菌细胞。在不同的实施方案中，收集的所述组合物含有少于10％、5％、1％、0.5％的细菌细胞，所述的细菌细胞是由培养所述的细菌而产生的。在不同的实施方案中，所述的组合物包括至少1％(例如，至少1％、5％、10％、20％、40％、50％、75％、80％、90％、95％或直至100％)的那种细菌细胞，所述细菌细胞是由培养所述的细菌而产生的。

本发明的特点在于产生L-甲硫氨酸的方法，所述的方法包括：在允许产生L-甲硫氨酸的条件下，培养在这里描述的细菌并收集所述的培养物。所述的培养物可进行分级(例如，以去除细胞和/或以获得富含L-甲硫氨酸的级分)。

本发明的特点在于产生S-腺苷甲硫氨酸(S-AM)的方法，所述的方法包括：在允许产生S-腺苷甲硫氨酸的条件下，培养在这里描述的细菌并收集所述的培养物，所述的培养物可进行分级(例如，以去除细胞和/或以获得富含S-AM的级分)。本发明的特点在于产生L-苏氨酸或L-异亮氨酸的方法，所述的方法包括：在允许产生L-苏氨酸或L-异亮氨酸的条件下，培养在这里描述的细菌并收集所述的培养物，所述的培养物可进行分级(例如，以去除细胞和/或以获得富含L-苏氨酸或L-异亮氨酸的级分)。本发明的特点也在于产生高丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸和其衍生物的方法，所述的方法包括：在允许产生高丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸和其衍生物的条件下，培养在这里描述的细菌并收集所述的培养物，所述的培养物可进行分级(例如，以去除细胞和/或以获得富含高丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸和其衍生物的级分)。

本发明的特点在于棒杆菌的细菌或肠杆菌科的细菌，如大肠杆菌细菌，其包括核酸分子，所述的核酸分子编码异源细菌胱硫醚beta-裂合酶多肽(例如，耻垢分枝杆菌胱硫醚beta-裂合酶多肽或其功能变体；长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)胱硫醚beta-裂合酶多肽或其功能变体；植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)胱硫醚beta-裂合酶多肽或其功能变体；谷氨酸棒杆菌胱硫醚beta-裂合酶多肽或其功能变体；大肠杆菌胱硫醚beta-裂合酶多肽或其功能变体)或其功能变体。

在不同的实施方案中，所述的耻垢分枝杆菌胱硫醚beta-裂合酶多肽包括与SEQ ID NO：59至少80％同一性的序列(例如，与SEQ ID NO：59至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)，或其变体序列；所述的长双歧杆菌胱硫醚beta-裂合酶多肽包括SEQ ID NO：60或其变体序列；所述的植物乳杆菌胱硫醚beta-裂合酶多肽包括SEQ ID NO：61或其变体序列；所述的谷氨酸棒杆菌胱硫醚胱硫醚beta-裂合酶多肽包括SEQID NO：217或其变体序列；和所述的大肠杆菌胱硫醚beta-裂合酶多肽包括SEQ ID NO：218或其变体序列。

本发明的特点在于棒杆菌的细菌或肠杆菌科的细菌，如大肠杆菌细菌，其包括核酸分子，所述的核酸分子编码异源细菌谷氨酸脱氢酶多肽(例如，天蓝色链霉菌谷氨酸脱氢酶或其功能变体；Thermobifida fusca谷氨酸脱氢酶多肽或其功能变体；植物乳杆菌谷氨酸脱氢酶多肽或其功能变体；谷氨酸棒杆菌谷氨酸脱氢酶多肽或其功能变体；大肠杆菌谷氨酸脱氢酶多肽或其功能变体)或其功能变体。

在不同的实施方案中，所述的耻垢分枝杆菌谷氨酸脱氢酶多肽包括SEQID NO：62或其变体序列；所述的Thermobifida fusca谷氨酸脱氢酶多肽包括SEQ ID NO：63或其变体序列；所述的植物乳杆菌谷氨酸脱氢酶多肽包括SEQID NO：65或其变体序列；所述的谷氨酸棒杆菌谷氨酸脱氢酶多肽包括SEQ IDNO：219或其变体序列；和所述的大肠杆菌谷氨酸脱氢酶多肽包括SEQ ID NO：220或其变体序列。

本发明的特点也在于棒杆菌的细菌或肠杆菌科的细菌，如大肠杆菌细菌，其包括核酸分子，所述的核酸分子编码异源细菌二氨基庚二酸脱氢酶多肽或其功能变体(例如，球形芽孢杆菌二氨基庚二酸脱氢酶多肽或其功能变体；谷氨酸棒杆菌谷氨酸脱氢酶多肽或其功能变体)。

在不同的实施方案中，球形芽孢杆菌二氨基庚二酸脱氢酶多肽包括SEQID NO：65或其变体序列。

本发明的特点也在于棒杆菌的细菌或肠杆菌科的细菌，如大肠杆菌细菌，其包括核酸分子，所述的核酸分子编码异源细菌洗涤剂敏感性拯救子(rescuer)多肽(例如，耻垢分枝杆菌洗涤剂敏感性拯救子多肽或其功能变体；天蓝色链霉菌洗涤剂敏感性拯救子多肽或其功能变体；Thermobifida fusca洗涤剂敏感性拯救子多肽或其功能变体；谷氨酸棒杆菌洗涤剂敏感性拯救子多肽或其功能变体)或其功能变体。

在不同的实施方案中，所述的耻垢分枝杆菌洗涤剂敏感性拯救子多肽包括与SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69至少80％同一性的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)，或其变体序列，所述的异源细菌洗涤剂敏感性拯救子多肽是天蓝色链霉菌洗涤剂敏感性拯救子多肽或其功能变体；所述的天蓝色链霉菌洗涤剂敏感性拯救子多肽包括SEQ ID NO：67或其变体序列；所述的Thermobifida fusca洗涤剂敏感性拯救子多肽包括SEQ ID NO：66或其变体序列；和所述的谷氨酸棒杆菌洗涤剂敏感性拯救子多肽包括SEQ ID NO：221或其变体序列。本发明的特点在于棒杆菌的细菌或肠杆菌科的细菌，如大肠杆菌细菌，其包括核酸分子，所述的核酸分子编码异源细菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽(例如，耻垢分枝杆菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体；天蓝色链霉菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体；Thermobifida fusca 5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体；植物乳杆菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体；谷氨酸棒杆菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体；大肠杆菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体)或其功能变体。

在不同的实施方案中，所述的耻垢分枝杆菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽包括与SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73至少80％同一性的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)，或其变体序列；所述的天蓝色链霉菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽包括SEQ ID NO：71或其变体序列；所述的Thermobifida fusca 5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽包括SEQ IDNO：70或其变体序列；所述的植物乳杆菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽包括SEQ ID NO：74或其变体序列，所述的谷氨酸棒杆菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽包括SEQ ID NO：222或其变体序列，和所述的大肠杆菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽包括SEQ IDNO：223或其变体序列。

本发明的特点也在于棒杆菌的细菌或肠杆菌科的细菌，如大肠杆菌细菌，其包括核酸分子，所述的核酸分子编码异源细菌5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶多肽(例如，耻垢分枝杆菌5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体；天蓝色链霉菌5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体；谷氨酸棒杆菌5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体；大肠杆菌5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体)或其功能变体。

在不同的实施方案中，所述的耻垢分枝杆菌5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶多肽包括与SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：76至少80％同一性的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)；所述的天蓝色链霉菌5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶多肽包括SEQ ID NO：77或其变体序列；所述的谷氨酸棒杆菌5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶多肽包括SEQ ID NO：224或其变体序列；和所述的大肠杆菌5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶多肽包括SEQ ID NO：225或其变体序列。

本发明特点在于棒杆菌的细菌或肠杆菌科的细菌，如大肠杆菌细菌，其包括核酸分子，所述的核酸分子编码异源细菌丝氨酸羟基甲基转移酶多肽(例如，耻垢分枝杆菌丝氨酸羟基甲基转移酶多肽或其功能变体；天蓝色链霉菌丝氨酸羟基甲基转移酶多肽或其功能变体；Thermobifida fusca丝氨酸羟基甲基转移酶多肽或其功能变体；植物乳杆菌丝氨酸羟基甲基转移酶多肽或其功能变体；谷氨酸棒杆菌丝氨酸羟基甲基转移酶多肽或其功能变体；大肠杆菌丝氨酸羟基甲基转移酶多肽或其功能变体)或其功能变体。

在不同的实施方案中，所述的耻垢分枝杆菌丝氨酸羟基甲基转移酶多肽与SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：81至少80％同一性的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)；所述的天蓝色链霉菌丝氨酸羟基甲基转移酶多肽包括SEQ ID NO：78或其变体序列；所述的Thermobifida fusca丝氨酸羟基甲基转移酶多肽包括SEQ IDNO：79或其变体序列；所述的植物乳杆菌丝氨酸羟基甲基转移酶多肽包括SEQ ID NO：82或其变体序列；所述的谷氨酸棒杆菌丝氨酸羟基甲基转移酶多肽包括SEQ ID NO：226或其变体序列；和所述的大肠杆菌丝氨酸羟基甲基转移酶多肽包括SEQ ID NO：227或其变体序列。

本发明特点在于棒杆菌的细菌或肠杆菌科的细菌，如大肠杆菌细菌，其包括核酸分子，所述的核酸分子编码异源细菌5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶多肽(例如，天蓝色链霉菌5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶多肽或其功能变体；Thermobifida fusca 5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶多肽或其功能变体；谷氨酸棒杆菌5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶多肽或其功能变体；大肠杆菌5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶多肽或其功能变体)或其功能变体。

在不同的实施方案中，所述的天蓝色链霉菌5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶多肽包括SEQ ID NO：84或其变体序列；所述的Thermobifida fusca 5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶多肽包括SEQ ID NO：83或其变体序列；所述的谷氨酸棒杆菌5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶多肽包括SEQ ID NO：228或其变体序列；和所述的大肠杆菌5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶多肽包括SEQ ID NO：229或其变体序列。

本发明的特点在于棒杆菌的细菌或肠杆菌科的细菌，如大肠杆菌细菌，其包括核酸分子，所述的核酸分子编码异源细菌丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽(例如，耻垢分枝杆菌丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽或其功能变体；植物乳杆菌丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽或其功能变体；谷氨酸棒杆菌丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽或其功能变体；大肠杆菌丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽或其功能变体)或其功能变体。

在不同的实施方案中，所述的耻垢分枝杆菌丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽与SEQ ID NO：85或SEQ ID NO：86至少80％同一性的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)；所述的植物乳杆菌丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽包括SEQ ID NO：87或其变体序列；所述的谷氨酸棒杆菌丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽包括SEQ ID NO：230或其变体序列；和所述的大肠杆菌丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽包括SEQ IDNO：231或其变体序列。

本发明的特点在于棒杆菌的细菌或肠杆菌科的细菌，如大肠杆菌细菌，其包括核酸分子，所述的核酸分子编码异源细菌D-3-磷酸甘油酸脱氢酶多肽(例如，耻垢分枝杆菌D-3-磷酸甘油酸脱氢酶多肽或其功能变体；天蓝色链霉菌D-3-磷酸甘油酸脱氢酶多肽或其功能变体；Thermobifida fusca D-3-磷酸甘油酸脱氢酶多肽或其功能变体；植物乳杆菌D-3-磷酸甘油酸脱氢酶多肽或其功能变体；谷氨酸棒杆菌D-3-磷酸甘油酸脱氢酶多肽或其功能变体；大肠杆菌D-3-磷酸甘油酸脱氢酶多肽或其功能变体)或其功能变体。

在不同的实施方案中，所述的耻垢分枝杆菌D-3-磷酸甘油酸脱氢酶多肽与SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：89至少80％同一性的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)；所述的天蓝色链霉菌D-3-磷酸甘油酸脱氢酶多肽包括SEQ ID NO：91或其变体序列；所述的Thermobifida fusca D-3-磷酸甘油酸脱氢酶多肽包括SEQ IDNO：90或其变体序列；植物乳杆菌D-3-磷酸甘油酸脱氢酶多肽包括SEQ IDNO：92或其变体序列；所述的谷氨酸棒杆菌丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽包括SEQ ID NO：232或其变体序列；和所述的大肠杆菌丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽包括SEQ ID NO：233或其变体序列。

本发明的特点在于棒杆菌的细菌或肠杆菌科的细菌，如大肠杆菌细菌，其包括核酸分子，所述的核酸分子编码异源细菌赖氨酸输出体(exporter)多肽(例如，谷氨酸棒杆菌赖氨酸输出体多肽或其功能变体；耻垢分枝杆菌赖氨酸输出体多肽或其功能变体；天蓝色链霉菌赖氨酸输出体多肽或其功能变体；大肠杆菌赖氨酸输出体多肽或其功能变体或植物乳杆菌赖氨酸输出体蛋白或其功能变体)或其功能变体。

在不同的实施方案中，耻垢分枝杆菌赖氨酸输出体多肽与SEQ ID NO：93或SEQ ID NO：94至少80％同一性的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)；所述的天蓝色链霉菌赖氨酸输出体多肽包括SEQ ID NO：95或其变体序列；所述的植物乳杆菌赖氨酸输出体多肽包括SEQ ID NO：96或其变体序列；所述的谷氨酸棒杆菌赖氨酸输出体多肽包括SEQ ID NO：234或其变体序列；和所述的大肠杆菌赖氨酸输出体多肽包括SEQ ID NO：237或其变体序列。

本发明的特点在于棒杆菌的细菌或肠杆菌科的细菌，如大肠杆菌细菌，其包括核酸分子，所述的核酸分子编码细菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶/O-乙酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽(例如，谷氨酸棒杆菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽或其功能变体；耻垢分枝杆菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽或其功能变体；天蓝色链霉菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽或其功能变体；Thermobifida fusca O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽或其功能变体；大肠杆菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽或其功能变体；或植物乳杆菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽或其功能变体)或其功能变体。

在不同的实施方案中，所述的耻垢分枝杆菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽与SEQ ID NO：97或SEQ ID NO：98至少80％同一性的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)；所述的天蓝色链霉菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽包括SEQ ID NO：99或其变体序列；所述的Thermobifida fusca O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽包括SEQ ID NO：100或其变体序列；所述的植物乳杆菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽包括SEQ ID NO：101或其变体序列；所述的谷氨酸棒杆菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽包括SEQ ID NO：235或其变体序列；和所述的大肠杆菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽包括SEQ ID NO：236或其变体序列。

本发明的特点在于棒杆菌的细菌或肠杆菌科的细菌，如大肠杆菌细菌，其包括核酸分子，所述的核酸分子编码苏氨酸流出物(efflux)多肽(例如谷氨酸棒杆菌苏氨酸流出物多肽或其功能变体；谷氨酸棒杆菌苏氨酸流出物多肽的同源物或其功能变体；天蓝色链霉菌推定的苏氨酸流出物多肽或其功能变体)或其功能变体。

在不同的实施方案中，所述的谷氨酸棒杆菌苏氨酸流出物多肽包括SEQID NO：196或其变体序列；所述的谷氨酸棒杆菌苏氨酸流出物多肽的同源物包括SEQ ID NO：196的同源物或其变体序列；和所述的天蓝色链霉菌推定的苏氨酸流出物多肽包括SEQ ID NO：102或其变体序列。

本发明的特点也在于棒杆菌的细菌或肠杆菌科的细菌，如大肠杆菌细菌，其包括核酸分子，所述的核酸分子编码谷氨酸棒杆菌假设的多肽(SEQ ID NO：198)，谷氨酸棒杆菌假设的多肽的细菌同源物(SEQ ID NO：198)，(例如，耻垢分枝杆菌假设的多肽或其功能变体；天蓝色链霉菌假设的多肽或其功能变体；Thermobifida fusca假设的多肽或其功能变体；大肠杆菌假设的多肽或其功能变体；或植物乳杆菌假设的(hypothetical)多肽或其功能变体)或其功能变体。

在不同的实施方案中，所述的细菌同源物为：耻垢分枝杆菌假设的多肽，其与SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：105至少80％同一性(例如，与SEQ IDNO：104或SEQ ID NO：105至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)；所述的天蓝色链霉菌假设的多肽包括SEQ ID NO：103或其变体序列；所述的Thermobifida fusca假设的多肽包括SEQ ID NO：106或其变体序列；植物乳杆菌假设的多肽包括SEQ ID NO：107或其变体序列。

本发明的特点也在于棒杆菌的细菌或肠杆菌科的细菌，如大肠杆菌细菌，其包括核酸分子，所述的核酸分子编码谷氨酸棒杆菌推定的膜多肽(SEQ IDNO：201)，谷氨酸棒杆菌推定的膜多肽的细菌同源物(SEQ ID NO：201)，(例如，天蓝色链霉菌推定的膜多肽或其功能变体；Thermobifida fusca推定的膜多肽或其功能变体；菊欧文氏菌推定的膜多肽或其功能变体；大肠杆菌推定的膜多肽或其功能变体；植物乳杆菌推定的膜多肽或其功能变体；或菊果胶杆菌推定的膜多肽或其功能变体)或其功能变体。

在不同的实施方案中，所述的天蓝色链霉菌推定的膜多肽包括SEQ IDNO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114或其变体序列；所述的Thermobifida fusca推定的膜多肽包括SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110或其变体序列；所述的菊欧文氏菌推定的膜多肽包括SEQ ID NO：115或其变体序列；所述的菊果胶杆菌推定的膜多肽包括SEQ IDNO：116或其变体序列；所述的植物乳杆菌推定的膜多肽包括SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119或其变体序列。

本发明的特点也在于棒杆菌的细菌或肠杆菌科的细菌，如大肠杆菌细菌，其包括核酸分子，所述的核酸分子编码谷氨酸棒杆菌药物通透酶(drugpermease)多肽(SEQ ID NO：199)，谷氨酸棒杆菌药物通透酶多肽的细菌同源物(SEQ ID NO：199)，(例如，天蓝色链霉菌药物通透酶多肽或其功能变体；Thermobifida fusca药物通透酶多肽或其功能变体；大肠杆菌药物通透酶多肽或其功能变体；或植物乳杆菌药物通透酶多肽或其功能变体)或其功能变体。

在不同的实施方案中，所述的天蓝色链霉菌药物通透酶多肽包括SEQ IDNO：120、SEQ ID NO：121，或其变体序列；所述的Thermobifida fusca药物通透酶多肽包括SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123，或其变体序列；所述的植物乳杆菌药物通透酶多肽包括SEQ ID NO：124或其变体序列。

本发明的特点也在于棒杆菌的细菌或肠杆菌科的细菌，如大肠杆菌细菌，其包括核酸分子，所述的核酸分子编码谷氨酸棒杆菌假设的膜多肽(SEQ IDNO：197)，谷氨酸棒杆菌假设的膜多肽(SEQ ID NO：197)的细菌同源物，(例如，Thermobifida fusca假设的膜多肽或其功能变体)。

在不同的实施方案中，所述的Thermobifida fusca假设的膜多肽包括SEQID NO：125或其变体序列。

如上所述，本发明也提供了核酸，其编码变体细菌蛋白。包括编码变体细菌多肽的序列的核酸可以在生物体中表达，从所述的生物体中得到所述的序列，或者它们可以在除所述生物体之外的生物体(例如，异源生物体)中表达，从所述生物体中得到所述的序列。

在一个方面，本发明的特点在于分离的核酸(例如，核酸表达载体)，其编码细菌多肽的变体(例如，野生型细菌多肽的变体)，所述的变体调控一种或多种来自氨基酸的天冬氨酸家族的氨基酸或相关的代谢物的产生。所述的细菌多肽可包括，例如，所述的下列氨基酸序列：G₁-X₂-K₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X_13a-X_13b-X_13c-X_13d-X_13e-X_13f-X_13g-X_13h-X_13i-X_13j-X_13k-X_13l-F₁₄-X₁₅-Z₁₆-X₁₇-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-X_21a-X_21b-X_21c-X_21d-X_21e-X_21f-X_21g-X_21h-X_21i-X_21j-X_21k-X_21l-X_21m-X_21n-X_21o-X_21p-X_21q-X_21r-X_21s-X_21t-D₂₂(SEQID NO：__)，其中X₂、X₄-X₁₃、X₁₅和X₁₇-X₂₀中的每个独立地为任意的氨基酸，其中X_13a-X_13l中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，其中X_21a-X_21t中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，而且其中Z₁₆选自缬氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；所述的细菌多肽的变体，相对于所述的细菌蛋白，在SEQ ID NO：__的G₁、K₃、F₁₄、Z₁₆或D₂₂中的一个或多个，或者在SEQID NO：__的G₁、K₃、F₁₄、Z₁₆或D₂₂中的8、5、3、2或1个残基内的氨基酸包含氨基酸改变。在一个实施方案中，所述细菌多肽的变体是其他方面与所述的细菌蛋白在氨基酸序列上相同，或与所述的细菌多肽至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性，例如，所述的变体包括少于50、40、25、15、10、7、5、3、2或1个改变，相对于所述的细菌多肽。

可替换地或此外，所述的细菌多肽包括所述的下列氨基酸序列：L₁-X₂-X₃-G₄-G₅-X₆-F₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁(SEQ ID NO：__)，其中X₂、X₄-X₁₃、X₁₅和X₁₇-X₂₀中的每个独立地为任意的氨基酸，其中X₈选自缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或天冬氨酸，而且其中X₁₁选自缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或甲硫氨酸；而所述的细菌蛋白的变体在SEQ ID NO：__的L₁、G₄、X₈、X₁₁中的一个或多个，或者在SEQ ID NO：__的L₁、G₄、X₈、X₁₁中的8、5、3、2或1个残基内的氨基酸残基包含氨基酸改变。

在不同的实施方案中，诱导所述细菌多肽的变体的S-腺苷甲硫氨酸的反馈抑制，例如，相对于所述的细菌多肽(例如，相对于野生型细菌蛋白)或相对于参比蛋白(reference protein)。

所述细菌多肽的变体中的氨基酸改变可以变为丙氨酸(例如，其中原始的残基是除丙氨酸之外的氨基酸残基)或非-保守的改变。所述的改变可为保守的改变。

本发明的特点也在于由在此描述的核酸编码的多肽，例如，由编码细菌多肽的变体(例如，野生型细菌多肽的变体)的核酸编码的多肽，其调控来自所述天冬氨酸家族的氨基酸或相关代谢物的一种或多种氨基酸的产生，其中所述的细菌多肽包括SEQ ID NO：__或SEQ IDNO：__，而且其中所述的变体包括相对于所述细菌多肽的氨基酸改变。

也提供了产生核酸的方法，所述的核酸编码细菌多肽的变体，其调控来自所述天冬氨酸家族的氨基酸或相关代谢物的一种或多种氨基酸的产生，所述方法包括，例如，在野生型细菌多肽的氨基酸序列中鉴定基序，并构建核酸，所述的核酸编码变体，其中所述基序内部和/或附近的(例如，10、8、7、5、3、2或1个残基之内)一个或多个氨基酸残基(例如，一个、两个、三个、四个或五个残基)被改变。

在不同的实施方案中，所述细菌多肽中的基序包括下列氨基酸序列：G₁-X₂-K₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X_13a-X_13b-X_13c-X_13d-X_13e-X_13f-X_13g-X_13h-X_13i-X_13j-X_13k-X_13l-F₁₄-X₁₅-Z₁₆-X₁₇-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-X_21a-X_21b-X_21c-X_21d-X_21e-X_21f-X_21g-X_21h-X_21i-X_21j-X_21k-X_21l-X_21m-X_21n-X_21o-X_21p-X_21q-X_21r-X_21s-X_21t-D₂₂(SEQID NO：__)，其中X₂、X₄-X₁₃、X₁₅和X₁₇-X₂₀中的每个独立地为任意的氨基酸，其中X_13a-X_13l中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，其中X_21a-X_21t中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，而且其中Z₁₆选自缬氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或亮氨酸。在不同的实施方案中，SEQ ID NO：__的G₁、K₃、F₁₄、Z₁₆或D₂₂中的一个或多个被改变。在一个实施方案中，所述细菌多肽的变体是其他方面与所述的细菌多肽在氨基酸序列上相同。在不同的实施方案中，所述细菌多肽中的基序包括下列氨基酸序列：L₁-X₂-X₃-G₄-G₅-X₆-F₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁(SEQ ID NO：__)，其中X₂、X₄-X₁₃、X₁₅和X₁₇-X₂₀中的每个独立地为任意的氨基酸，其中X₈选自缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和天冬氨酸，而且其中X₁₁选自缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或甲硫氨酸。在不同的实施方案中，SEQ ID NO：__的L₁、G₄、X₈、X₁₁中的一个或多个被改变。在一个实施方案中，所述细菌多肽的变体是其他方面与所述的细菌蛋白在氨基酸序列上相同。

本发明的特点也在于细菌，其包括在此描述的核酸，例如，编码细菌多肽的变体(例如，野生型细菌多肽的变体)的核酸，所述的细菌多肽的变体调控来自所述天冬氨酸家族的氨基酸或相关代谢物的一种或多种氨基酸的产生，其中所述的细菌多肽包括SEQ ID NO：__或SEQ IDNO：__，而且其中所述的变体包括相对于所述细菌多肽的氨基酸改变。所述的细菌可为遗传上改变的细菌，例如，细菌，其已经被改变以包括所述的核酸(例如，通过所述核酸的转化，例如，其中所述的核酸是游离型的，或其中所述的核酸整合入所述细菌的基因组中，或在随机的位置，或在具体靶向的位置)，和/或它在其基因组中已经被改变(例如，被改变以致于内源基因已通过突变被改变，或通过重组被替换，或被改变以包括内源基因上游的异源启动子。

本发明的特点也在于产生氨基酸或相关代谢物的方法。所述方法包括，例如：培养细菌(例如，遗传上改变的细菌)，其包括编码细菌多肽变体(例如，野生型细菌多肽的变体)的核酸，所述的细菌多肽的变体调控来自所述天冬氨酸家族的氨基酸或相关代谢物的一种或多种氨基酸的产生，其中所述的细菌多肽包括SEQ ID NO：__或SEQ ID NO：__，而且其中所述的变体包括相对于所述细菌多肽的氨基酸改变。在表达所述核酸且允许产生所述的氨基酸(或相关代谢物)的条件下，培养所述的细菌，并收集包含所述的氨基酸(或相关代谢物)的组合物。所述的组合物可包括，例如，培养物上清、加热或用其他方法杀死细胞或纯化的氨基酸。

在一个方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽。在一些实施方案中，所述变体细菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽显示降低的反馈抑制，例如，相对于野生型的所述细菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽。在不同的实施方案中，所述核酸编码高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽具有降低的S-腺苷甲硫氨酸的反馈抑制。在不同的实施方案中，所述细菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽选自：谷氨酸棒杆菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽、耻垢分枝杆菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽、Thermobifidafusca高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽、地中海拟无枝酸菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽、天蓝色链霉菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽、菊欧文氏菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽、Shewanella oneidensis高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽、大肠杆菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽、醋谷棒杆菌(Corynebactericumacetoglutamicum)高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽、Corynebacterium melassecola高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽、Corynebacterium thermoaminogenes高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽、Brevibacterium lactis高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽和黄色短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码细菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽的变体，其中所述的变体高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽为包括下列氨基酸序列的高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽的变体：G₁-X₂-K₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X_13a-X_13b-X_13c-X_13d-X_13e-X_13f-X_13g-X_13h-X_13i-X_13j-X_13k-X_13l-F₁₄-X₁₅-Z₁₆-X₁₇-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-X_21a-X_21b-X_21c-X_21d-X_21e-X_21f-X_21g-X_21h-X_21i-X_21j-X_21k-X_21l-X_21m-X_21n-X_21o-X_21p-X_21q-X_21r-X_21s-X_21t-D₂₂(SEQID NO：__)，其中X₂、X₄-X₁₃、X₁₅和X₁₇-X₂₀中的每个独立地为任意的氨基酸，其中X_13a-X_13l中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，其中X_21a-X_21t中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，而且其中Z₁₆选自缬氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；其中所述的变体高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽在SEQ ID NO：__的G₁、K₃、F₁₄、Z₁₆或D₂₂中的一个或多个，包含氨基酸改变。在不同的实施方案中，所述的氨基酸改变是变为丙氨酸。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽，其中所述的变体高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽是谷氨酸棒杆菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽，其在SEQ ID NO：__的一个或多个下列残基中包含氨基酸改变：甘氨酸231、赖氨酸233、苯丙氨酸251、缬氨酸253和天冬氨酸269。在不同的实施方案中，所述的氨基酸改变是变为丙氨酸。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽，其中所述的变体高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽是T.fusca高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽，其在SEQ ID NO：__的一个或多个下列残基中包含氨基酸改变：甘氨酸81、天冬氨酸287、苯丙氨酸269。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽，其中所述的变体高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽是大肠杆菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽，其在SEQ ID NO：__的谷氨酸252包含氨基酸改变。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽，其中所述的变体高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽是分枝杆菌的高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽，其在对应于SEQ ID NO：__中列出的麻风分枝杆菌(M.leprae)高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽的一个或多个下列残基的残基中包含氨基酸改变：甘氨酸73、天冬氨酸278和酪氨酸260。在不同的实施方案中，所述的变体细菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽是耻垢分枝杆菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽的变体。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽，其中所述的变体高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽是结核分枝杆菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽，其在SEQ ID NO：__的一个或多个下列残基中包含氨基酸改变：甘氨酸73、酪氨酸260和天冬氨酸278。

本发明的特点也在于由编码变体细菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶的核酸编码的多肽，和包括编码变体细菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶的核酸的细菌。在不同的实施方案中，所述的细菌为棒杆菌的细菌。所述的细菌可进一步包括核酸，其编码其他变体细菌蛋白(例如，涉及氨基酸产生的变体细菌蛋白，例如，在这里描述的变体细菌蛋白)。

在另一方面，本发明的特点在于产生L-甲硫氨酸或相关中间物，诸如O-乙酰基高丝氨酸、胱硫醚、高半胱氨酸、甲硫氨酸、SAM及其衍生物的方法，所述方法包括：在表达所述核酸且允许产生L-甲硫氨酸(或相关代谢物)的条件下，培养遗传上改变的细菌，所述细菌包括编码变体细菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶的核酸，并收集所述的培养物。可以将所述的培养物分级(例如，以去除细胞和/或以获得富含L-甲硫氨酸的级分)。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶多肽。在一些实施方案中，所述的变体细菌高丝氨酸O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽显示降低的反馈抑制，例如，相对于野生型的所述细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽。

在不同的实施方案中，所述的核酸编码O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽，其具有降低的S-腺苷甲硫氨酸的反馈抑制。

在不同的实施方案中，所述的细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽选自：谷氨酸棒杆菌高丝氨酸O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽、耻垢分枝杆菌高丝氨酸O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽、Thermobifida fusca O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽、地中海拟无枝酸菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽、天蓝色链霉菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽、菊欧文氏菌高丝氨酸O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽、Shewanella oneidensis O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽、结核分枝杆菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽、大肠杆菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽、醋谷棒杆菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽、Corynebacteriummelassecola O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽、Corynebacteriumthermoaminogenes O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽、乳发酵短杆菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽、Brevibacterium lactis O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽和黄色短杆菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽，其中所述的变体O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽为包括下列氨基酸序列的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽的变体：G₁-X₂-K₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X_13a-X_13b-X_13c-X_13d-X_13e-X_13f-X_13g-X_13h-X_13i-X_13j-X_13k-X_13l-F₁₄-X₁₅-Z₁₆-X₁₇-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-X_21a-X_21b-X_21c-X_21d-X_21e-X_21f-X_21g-X_21h-X_21i-X_21j-X_21k-X_21l-X_21m-X_21n-X_21o-X_21p-X_21q-X_21r-X_21s-X_21t-D₂₂(SEQID NO：__)，其中X₂、X₄-X₁₃、X₁₅和X₁₇-X₂₀中的每个独立地为任意的氨基酸，其中X_13a-X_13l中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，其中X_21a-X_21t中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，而且其中Z₁₆选自缬氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；其中所述的变体O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽在SEQ ID NO：__的G₁、K₃、F₁₄、Z₁₆或D₂₂中的一个或多个，包含氨基酸改变。

在不同的实施方案中，所述的氨基酸改变是变为丙氨酸。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽，其中所述的变体O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽是包括下列氨基酸序列的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽的变体：L₁-X₂-X₃-G₄-G₅-X₆-F₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁(SEQ ID NO：__)，其中X为任意的氨基酸，其中X₈选自缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和天冬氨酸，而且其中X₁₁选自缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或甲硫氨酸；其中所述细菌多肽的变体在SEQ ID NO：__的L₁、G₄、X₈、X₁₁中的一个或多个，包含氨基酸改变。

在不同的实施方案中，所述的氨基酸改变是变为丙氨酸。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽，其中所述的变体O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽是谷氨酸棒杆菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽，其在SEQ ID NO：__的一个或多个下列残基中包含氨基酸改变：甘氨酸227、亮氨酸229、天冬氨酸231、甘氨酸232、甘氨酸233、苯丙氨酸235、天冬氨酸236、缬氨酸239、苯丙氨酸368、天冬氨酸370、天冬氨酸383、甘氨酸346和赖氨酸348。在不同的实施方案中，所述的氨基酸改变是变为丙氨酸。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽，其中所述的变体O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽是T.fusca O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽，其在SEQ ID NO：__的一个或多个下列残基中包含氨基酸改变：甘氨酸240、天冬氨酸244、苯丙氨酸379和天冬氨酸394。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽，其中所述的变体O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽是耻垢分枝杆菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽，其在SEQ ID NO：__的一个或多个下列残基中包含氨基酸改变：甘氨酸303、天冬氨酸307、苯丙氨酸439、天冬氨酸454。

在另一方面，本发明的特点在于由核酸编码的多肽，所述的核酸编码变体细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶。

在另一方面，本发明的特点在于细菌，其包括核酸，所述的核酸编码变体细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽。在不同的实施方案中，所述的细菌为棒杆菌的细菌。所述的细菌可进一步包括一种或多种核酸，其编码其他变体细菌多肽(例如，涉及氨基酸产生的变体细菌多肽，例如，在这里描述的变体细菌多肽)。

在另一方面，本发明的特点在于产生L-甲硫氨酸或相关中间物(例如，高半胱氨酸、甲硫氨酸、S-AM或其衍生物)的方法，所述的方法包括：在表达所述核酸且允许产生L-甲硫氨酸的条件下，培养遗传上改变的细菌，所述细菌包括编码变体细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的核酸，并收集所述的培养物。可以将所述的培养物分级(例如，以去除细胞和/或以获得富含L-甲硫氨酸的级分)。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌mcbR基因产物。在不同的实施方案中，所述的变体细菌mcbR基因产物显示降低的反馈抑制，相对于野生型的所述的mcbR基因产物。在不同的实施方案中，所述的核酸编码mcbR基因产物，其具有降低的S-腺苷甲硫氨酸的反馈抑制。在不同的实施方案中，所述的细菌mcbR基因产物选自：谷氨酸棒杆菌mcbR基因产物，醋谷棒杆菌mcbR基因产物、Corynebacterium melassecola mcbR基因产物和Corynebacterium thermoaminogenes mcbR基因产物。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌mcbR基因产物，其中所述的变体mcbR基因产物为包括下列氨基酸序列的mcbR基因产物的变体：G₁-X₂-K₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X_13a-X_13b-X_13c-X_13d-X_13e-X_13f-X_13g-X_13h-X_13i-X_13j-X_13k-X_13l-F₁₄-X₁₅-Z₁₆-X₁₇-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-X_21a-X_21b-X_21c-X_21d-X_21e-X_21f-X_21g-X_21h-X_21i-X_21j-X_21k-X_21l-X_21m-X_21n-X_21o-X_21p-X_21q-X_{2 1r}-X_21s-X_21t-D₂₂(SEQ ID NO：__)，其中X₂、X₄-X₁₃、X₁₅和X₁₇-X₂₀中的每个独立地为任意的氨基酸，其中X_13a-X_13l中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，其中X_21a-X_21t中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，而且其中Z₁₆选自缬氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；其中所述的变体mcbR基因产物在SEQ ID NO：__的G₁、K₃、F₁₄、Z₁₆或D₂₂中的一个或多个，包含氨基酸改变。在不同的实施方案中，所述的氨基酸改变是变为丙氨酸。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌mcbR基因产物，其中所述的变体mcbR基因产物是谷氨酸棒杆菌mcbR基因产物，其在SEQ ID NO：__的一个或多个下列残基中包含氨基酸改变：甘氨酸92、赖氨酸94、苯丙氨酸116、甘氨酸118和天冬氨酸134。在不同的实施方案中，所述的氨基酸改变是变为丙氨酸。

本发明的特点也在于多肽，其由编码变体细菌mcbR基因产物的核酸编码。

本发明的特点也在于细菌，其包括编码变体细菌mcbR基因产物的核酸。在不同的实施方案中，所述的细菌是棒杆菌的细菌。所述细菌可进一步包括一种或多种核酸，其编码其他的变体细菌多肽(例如，涉及氨基酸产生的变体细菌多肽，例如，在这里描述的变体细菌多肽)。

在另一方面，本发明的特点在于产生L-甲硫氨酸的方法，所述的方法包括：在表达所述核酸且允许产生L-甲硫氨酸的条件下，培养遗传上改变的细菌，所述细菌包括编码变体细菌mcbR基因产物的核酸，并收集所述的培养物。可以将所述的培养物分级(例如，以去除细胞和/或以获得富含L-甲硫氨酸的级分)。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌天冬氨酸激酶多肽。在不同的实施方案中，所述的变体细菌天冬氨酸激酶多肽显示降低的反馈抑制，相对于野生型的所述的天冬氨酸激酶多肽。在不同的实施方案中，所述的核酸编码天冬氨酸激酶多肽，其具有降低的S-腺苷甲硫氨酸的反馈抑制。在不同的实施方案中，所述的细菌天冬氨酸激酶多肽选自：谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶多肽、耻垢分枝杆菌天冬氨酸激酶多肽、Thermobifidafusca天冬氨酸激酶多肽、地中海拟无枝酸菌天冬氨酸激酶多肽、天蓝色链霉菌天冬氨酸激酶多肽、菊欧文氏菌天冬氨酸激酶多肽、Shewanella oneidensis天冬氨酸激酶多肽、结核分枝杆菌天冬氨酸激酶多肽、大肠杆菌天冬氨酸激酶多肽、醋谷棒杆菌天冬氨酸激酶多肽、Corynebacterium melassecola天冬氨酸激酶多肽、Corynebacterium thermoaminogenes天冬氨酸激酶多肽、乳发酵短杆菌天冬氨酸激酶多肽、Brevibacterium lactis天冬氨酸激酶多肽和黄色短杆菌天冬氨酸激酶多肽。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌天冬氨酸激酶多肽，其中所述的变体天冬氨酸激酶多肽为包括下列氨基酸序列的天冬氨酸激酶多肽的变体：G₁-X₂-K₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X_13a-X_13b-X_13c-X_13d-X_13e-X_13f-X_13g-X_13h-X_13i-X_13j-X_13k-X_13l-F₁₄-X₁₅-Z₁₆-X₁₇-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-X_21a-X_21b-X_21c-X_21d-X_21e-X_21f-X_21g-X_21h-X_21i-X_21j-X_21k-X_21l-X_21m-X_21n-X_21o-X_21p-X_{21 q}-X_21r-X_21s-X_21t-D₂₂(SEQ ID NO：__)，其中X₂、X₄-X₁₃、X₁₅和X₁₇-X₂₀中的每个独立地为任意的氨基酸，其中X_13a-X_13l中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，其中X_21a-X_21t中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，而且其中Z₁₆选自缬氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；其中所述的变体天冬氨酸激酶在SEQ ID NO：__的G₁、K₃、F₁₄、Z₁₆或D₂₂中的一个或多个，包含氨基酸改变。在不同的实施方案中，所述的氨基酸改变是变为丙氨酸。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌天冬氨酸激酶多肽，其中所述的变体天冬氨酸激酶多肽是谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶多肽，其在SEQ ID NO：__的一个或多个下列残基中包含氨基酸改变：甘氨酸208、赖氨酸210、苯丙氨酸223、缬氨酸225和天冬氨酸236。在不同的实施方案中，所述的氨基酸改变是变为丙氨酸。

本发明的特点也在于多肽，其由编码变体细菌天冬氨酸激酶多肽的核酸编码。

本发明的特点也在于细菌，其包括编码变体细菌天冬氨酸激酶多肽的核酸。在不同的实施方案中，所述的细菌是棒杆菌的细菌。所述细菌可进一步包括一种或多种核酸，其编码其他的变体细菌多肽(例如，涉及氨基酸产生的变体细菌多肽，例如，在这里描述的变体细菌多肽)。在不同的实施方案中，所述的细菌进一步包括一种或多种核酸分子(例如，重组核酸分子)，其编码涉及氨基酸产生的多肽(例如，与所述的宿主细胞异源或同源的多肽，或其变体)。在不同的实施方案中，所述的细菌进一步包括内源序列中的突变，其导致涉及氨基酸产生的多肽活性的增加或减少(例如，通过突变编码涉及氨基酸产生的多肽的内源序列，或调控所述多肽表达的序列，例如，启动子序列)。

在另一方面，本发明的特点在于产生氨基酸的方法，所述的方法包括：在表达所述核酸且允许产生所述氨基酸的条件下，培养遗传上改变的细菌，所述细菌包括编码变体细菌天冬氨酸激酶多肽的核酸，并收集所述的培养物。可以将所述的培养物分级(例如，以去除细胞和/或以获得富含所述氨基酸的级分)。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌O-琥珀酰高丝氨酸/乙酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽(O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶)。在不同的实施方案中，所述的变体O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽显示降低的反馈抑制，相对于野生型的所述的O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽。在不同的实施方案中，所述的核酸编码O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽，其具有降低的S-腺苷甲硫氨酸的反馈抑制。在不同的实施方案中，所述的细菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽选自：谷氨酸棒杆菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽、耻垢分枝杆菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽、Thermobifida fusca O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽、地中海拟无枝酸菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽、天蓝色链霉菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽、菊欧文氏菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽、Shewanella oneidensis O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽、结核分枝杆菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽、大肠杆菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽、醋谷棒杆菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽、Corynebacteriummelassecola O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽、Corynebacteriumthermoaminogenes O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽、乳发酵短杆菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽、Brevibacterium lactis O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽和黄色短杆菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽，其中所述的变体O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽为包括下列氨基酸序列的O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽的变体：G₁-X₂-K₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X_13a-X_13b-X_13c-X_13d-X_13e-X_13f-X_13g-X_13h-X_13i-X_13j-X_13k-X_13l-F₁₄-X₁₅-Z₁₆-X₁₇-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-X_21a-X_21b-X_21c-X_21d-X_21e-X_21f-X_21g-X_21h-X_21i-X_21j-X_21k-X_21l-X_21m-X_21n-X_21o-X_21p-X_21q-X_21r-X_21s-X_21t-D₂₂(SEQ ID NO：__)，其中X₂、X₄-X₁₃、X₁₅和X₁₇-X₂₀中的每个独立地为任意的氨基酸，其中X_13a-X_13l中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，其中X_21a-X_21t中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，而且其中Z₁₆选自缬氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；其中所述的变体O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶在SEQ ID NO：__的G₁、K₃、F₁₄、Z₁₆或D₂₂中的一个或多个，包含氨基酸改变。在不同的实施方案中，所述的氨基酸改变是变为丙氨酸。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽，其中所述的变体O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽是谷氨酸棒杆菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽，其在SEQ IDNO：__的一个或多个下列残基中包含氨基酸改变：甘氨酸72、赖氨酸74、苯丙氨酸90、异亮氨酸92和天冬氨酸105。在不同的实施方案中，所述的氨基酸改变是变为丙氨酸。

本发明的特点也在于多肽，其由编码变体细菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽的核酸编码。

本发明的特点也在于细菌，其包括编码变体细菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽的核酸。在不同的实施方案中，所述的细菌是棒杆菌的细菌。所述的细菌可进一步包括一种或多种核酸，其编码其他变体细菌多肽(例如，涉及氨基酸产生的变体细菌多肽，例如，在这里描述的变体细菌多肽)。

在另一方面，本发明的特点在于产生L-甲硫氨酸的方法，所述的方法包括：在表达所述核酸且允许产生L-甲硫氨酸的条件下，培养遗传上改变的细菌，所述细菌包括编码变体细菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽的核酸，并收集所述的培养物。可以将所述的培养物分级(例如，以去除细胞和/或以获得富含L-甲硫氨酸的级分)。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌胱硫醚beta-裂合酶多肽。在不同的实施方案中，所述的变体胱硫醚beta-裂合酶多肽显示降低的反馈抑制，相对于野生型的所述的胱硫醚beta-裂合酶多肽。在不同的实施方案中，所述的核酸编码胱硫醚beta-裂合酶多肽，其具有降低的S-腺苷甲硫氨酸的反馈抑制。在不同的实施方案中，所述的细菌胱硫醚beta-裂合酶多肽选自：谷氨酸棒杆菌胱硫醚beta-裂合酶多肽、耻垢分枝杆菌胱硫醚beta-裂合酶多肽、Thermobifida fusca胱硫醚beta-裂合酶多肽、地中海拟无枝酸菌胱硫醚beta-裂合酶多肽、天蓝色链霉菌胱硫醚beta-裂合酶多肽、菊欧文氏菌胱硫醚beta-裂合酶多肽、Shewanella oneidensis胱硫醚beta-裂合酶多肽、结核分枝杆菌胱硫醚beta-裂合酶多肽、大肠杆菌胱硫醚beta-裂合酶多肽、醋谷棒杆菌胱硫醚beta-裂合酶多肽、Corynebacterium melassecola胱硫醚beta-裂合酶多肽、Corynebacterium thermoaminogenes胱硫醚beta-裂合酶多肽、乳发酵短杆菌胱硫醚beta-裂合酶多肽、Brevibacterium lactis胱硫醚beta-裂合酶多肽和黄色短杆菌胱硫醚beta-裂合酶多肽。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌胱硫醚beta-裂合酶多肽，其中所述的变体胱硫醚beta-裂合酶多肽为包括下列氨基酸序列的胱硫醚beta-裂合酶多肽的变体：G₁-X₂-K₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X_13a-X_13b-X_13c-X_13d-X_13e-X_13f-X_13g-X_13h-X_13i-X_13j-X_13k-X_13l-F₁₄-X₁₅-Z₁₆-X_{1 7}-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-X_21a-X_21b-X_21c-X_21d-X_21e-X_21f-X_21g-X_21h-X_21i-X_21j-X_21k-X_21l-X_21m-X_21n-X_21o-X_21p-X_21q-X_21r-X_21s-X_21t-D₂₂(SEQ ID NO：__)，其中X₂、X₄-X₁₃、X₁₅和X₁₇-X₂₀中的每个独立地为任意的氨基酸，其中X_13a-X_13l中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，其中X_21a-X_21t中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，而且其中Z₁₆选自缬氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；其中所述的变体胱硫醚beta-裂合酶在SEQ ID NO：__的G₁、K₃、F₁₄、Z₁₆或D₂₂中的一个或多个，包含氨基酸改变。在不同的实施方案中，所述的氨基酸改变是变为丙氨酸。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌胱硫醚beta-裂合酶多肽，其中所述的变体胱硫醚beta-裂合酶多肽是谷氨酸棒杆菌胱硫醚beta-裂合酶多肽，其在SEQ ID NO：__的一个或多个下列残基中包含氨基酸改变：甘氨酸296、赖氨酸298、苯丙氨酸312、甘氨酸314和天冬氨酸335。在不同的实施方案中，所述的氨基酸改变是变为丙氨酸。

本发明的特点也在于多肽，其由编码变体细菌胱硫醚beta-裂合酶多肽的核酸编码。

本发明的特点也在于细菌，其包括编码变体细菌胱硫醚beta-裂合酶多肽的核酸。在不同的实施方案中，所述的细菌是棒杆菌的细菌。所述的细菌可进一步包括一种或多种核酸，其编码其他变体细菌多肽(例如，涉及氨基酸产生的变体细菌多肽，例如，在这里描述的变体细菌多肽)。

在另一方面，本发明的特点在于产生L-甲硫氨酸的方法，所述的方法包括：在表达所述核酸且允许产生L-甲硫氨酸的条件下，培养遗传上改变的细菌，所述细菌包括编码变体细菌胱硫醚beta-裂合酶多肽的核酸，并收集所述的培养物。可以将所述的培养物分级(例如，以去除细胞和/或以获得富含L-甲硫氨酸的级分)。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽。在不同的实施方案中，所述的变体5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽显示降低的反馈抑制，相对于野生型的所述的5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽。在不同的实施方案中，所述的核酸编码5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽，其具有降低的S-腺苷甲硫氨酸的反馈抑制。在不同的实施方案中，所述的细菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽选自：谷氨酸棒杆菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽、耻垢分枝杆菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽、Thermobifida fusca5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽、地中海拟无枝酸菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽、天蓝色链霉菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽、菊欧文氏菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽、Shewanella oneidensis5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽、结核分枝杆菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽、大肠杆菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽、醋谷棒杆菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽、Corynebacterium melassecola5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽、Corynebacterium thermoaminogenes5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽、乳发酵短杆菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽、Brevibacterium lactis 5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽和黄色短杆菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽，其中所述的变体5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽为包括下列氨基酸序列的5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽的变体：G₁-X₂-K₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X_13a-X_13b-X_13c-X_13d-X_13e-X_13f-X_13g-X_13h-X_13i-X_13j-X_13k-X_13l-F₁₄-X₁₅-Z₁₆(SEQ IDNO：__)，其中X为任意的氨基酸，其中X_13a-X_13l中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，而且其中Z₁₆选自缬氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；其中所述的变体5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶在SEQ ID NO：的G₁、K₃、F₁₄或Z₁₆中的一个或多个，包含氨基酸改变。在不同的实施方案中，所述的氨基酸改变是变为丙氨酸。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽，其中所述的变体5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽是谷氨酸棒杆菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽，其在SEQ ID NO：__的一个或多个下列残基中包含氨基酸改变：甘氨酸708、赖氨酸710、苯丙氨酸725和亮氨酸727。在不同的实施方案中，所述的氨基酸改变是变为丙氨酸。

本发明的特点也在于多肽，其由编码变体细菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽的核酸编码。

本发明的特点也在于细菌，其包括编码变体细菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽的核酸。在不同的实施方案中，所述的细菌是棒杆菌的细菌。所述的细菌可进一步包括一种或多种核酸，其编码其他变体细菌多肽(例如，涉及氨基酸产生的变体细菌多肽，例如，在这里描述的变体细菌多肽)。

在另一方面，本发明的特点在于产生L-甲硫氨酸的方法，所述的方法包括：在表达所述核酸且允许产生L-甲硫氨酸的条件下，培养遗传上改变的细菌，所述细菌包括编码变体细菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽的核酸，并收集所述的培养物。可以将所述的培养物分级(例如，以去除细胞和/或以获得富含L-甲硫氨酸的级分)。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽。在不同的实施方案中，所述的变体S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽显示降低的反馈抑制，相对于野生型的所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽。在不同的实施方案中，所述的核酸编码S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽，其具有降低的S-腺苷甲硫氨酸的反馈抑制。在不同的实施方案中，所述的细菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽选自：谷氨酸棒杆菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽、耻垢分枝杆菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽、Thermobifida fuscaS-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽、地中海拟无枝酸菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽、天蓝色链霉菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽、菊欧文氏菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽、Shewanella oneidensisS-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽、结核分枝杆菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽、大肠杆菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽、醋谷棒杆菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽、Corynebacterium melassecolaS-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽、Corynebacterium thermoaminogenesS-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽、乳发酵短杆菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽、Brevibacterium lactis S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽和黄色短杆菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽，其中所述的变体S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽为包括下列氨基酸序列的S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽的变体：G₁-X₂-K₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X_13a-X_13b-X_13c-X_13d-X_13e-X_13f-X_13g-X_13h-X_13i-X_13j-X_13k-X_13l-F₁₄-X₁₅-Z₁₆-X₁₇-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-X_21a-X_21b-X_21c-X_21d-X_21e-X_21f-X_21g-X_21h-X_21i-X_21j-X_21k-X_21l-X_21m-X_21n-X_21o-X_21p-X_21q-X_21r-X_21s-X_21t-D₂₂(SEQID NO：__)，其中X₂、X₄-X₁₃、X₁₅和X₁₇-X₂₀中的每个独立地为任意的氨基酸，其中X_13a-X_13l中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，其中X_21a-X_21t中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，而且其中Z₁₆选自缬氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；其中所述的变体S-腺苷甲硫氨酸合成酶在SEQID NO：__的G₁、K₃、F₁₄、Z₁₆或D₂₂中的一个或多个，包含氨基酸改变。在不同的实施方案中，所述的氨基酸改变是变为丙氨酸。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽，其中所述的变体S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽是谷氨酸棒杆菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽，其在SEQ ID NO：__的一个或多个下列残基中包含氨基酸改变：甘氨酸263、赖氨酸265、苯丙氨酸282、甘氨酸284和天冬氨酸291。

在不同的实施方案中，所述的氨基酸改变是变为丙氨酸。

本发明的特点也在于多肽，其由编码变体细菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽的核酸编码。

本发明的特点也在于细菌，其包括编码变体细菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽的核酸。在不同的实施方案中，所述的细菌是棒杆菌的细菌。所述的细菌可进一步包括一种或多种核酸，其编码其他变体细菌多肽(例如，涉及氨基酸产生的变体细菌多肽，例如，在这里描述的变体细菌多肽)。

本发明的特点也在于产生L-甲硫氨酸的方法，所述的方法包括：在表达所述核酸且允许产生L-甲硫氨酸的条件下，培养遗传上改变的细菌，所述细菌包括编码变体细菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽的核酸，并收集所述的培养物。可以将所述的培养物分级(例如，以去除细胞和/或以获得富含L-甲硫氨酸的级分)。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌高丝氨酸激酶多肽。在不同的实施方案中，所述的变体高丝氨酸激酶多肽显示降低的反馈抑制，相对于野生型的所述的高丝氨酸激酶多肽。在不同的实施方案中，所述的核酸编码高丝氨酸激酶多肽，其具有降低的S-腺苷甲硫氨酸的反馈抑制。在不同的实施方案中，所述的细菌高丝氨酸激酶多肽选自：谷氨酸棒杆菌高丝氨酸激酶多肽、耻垢分枝杆菌高丝氨酸激酶多肽、Thermobifida fusca高丝氨酸激酶多肽、地中海拟无枝酸菌高丝氨酸激酶多肽、天蓝色链霉菌高丝氨酸激酶多肽、菊欧文氏菌高丝氨酸激酶多肽、Shewanella oneidensis高丝氨酸激酶多肽、结核分枝杆菌高丝氨酸激酶多肽、大肠杆菌高丝氨酸激酶多肽、醋谷棒杆菌高丝氨酸激酶多肽、Corynebacterium melassecola高丝氨酸激酶多肽、Corynebacterium thermoaminogenes高丝氨酸激酶多肽、乳发酵短杆菌高丝氨酸激酶多肽、Brevibacterium lactis高丝氨酸激酶多肽和黄色短杆菌高丝氨酸激酶多肽。

在另一方面，本发明的特点在于分离的核酸，其编码变体细菌高丝氨酸激酶多肽，其中所述的变体高丝氨酸激酶多肽是谷氨酸棒杆菌高丝氨酸激酶多肽，其在SEQ ID NO：__的一个或多个下列残基中包含氨基酸改变：甘氨酸160、赖氨酸161、苯丙氨酸186、丙氨酸188和天冬氨酸205。在不同的实施方案中，所述的氨基酸改变是变为丙氨酸。其中原始残基是除丙氨酸之外的氨基酸残基。

本发明的特点也在于多肽，其由编码变体细菌高丝氨酸激酶多肽的核酸编码。

本发明的特点也在于细菌，其包括编码变体细菌高丝氨酸激酶多肽的核酸。在不同的实施方案中，所述的细菌是棒杆菌的细菌。所述的细菌可进一步包括一种或多种核酸，其编码其他变体细菌多肽(例如，涉及氨基酸产生的变体细菌多肽，例如，在这里描述的变体细菌多肽)。

本发明的特点也在于产生氨基酸的方法，所述的方法包括：在表达所述核酸且允许产生所述氨基酸的条件下，培养遗传上改变的细菌，所述细菌包括编码变体细菌高丝氨酸激酶多肽的核酸，并收集所述的培养物。可以将所述的培养物分级(例如，以去除细胞和/或以获得富含所述氨基酸的级分)。

在另一方面，本发明的特点在于细菌，其包括下列的两种或多种：核酸，其编码变体细菌高丝氨酸O-乙酰转移酶多肽；核酸，其编码变体细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶；核酸，其编码变体细菌McbR基因产物多肽；核酸，其编码变体细菌天冬氨酸激酶多肽；核酸，其编码变体细菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽；核酸，其编码变体细菌胱硫醚beta-裂合酶多肽；核酸，其编码变体细菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽；和核酸，其编码变体细菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽。

在不同的实施方案中，所述的细菌包括核酸，其编码变体细菌高丝氨酸O-乙酰转移酶和核酸，其编码变体细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶。在一些实施方案中，至少一种所述变体细菌多肽具有降低的反馈抑制(例如，相对于野生型的所述多肽)。

在另一方面，本发明的特点在于细菌，其包括下列的两种或多种：(a)核酸，其编码变体细菌高丝氨酸O-乙酰转移酶多肽，其中所述的变体高丝氨酸O-乙酰转移酶多肽为包括下列氨基酸序列的高丝氨酸O-乙酰转移酶多肽的变体：G₁-X₂-K₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X_13a-X_13b-X_13c-X_13d-X_13e-X_13f-X_13g-X_13h-X_13i-X_13j-X_13k-X_13l-F₁₄-X₁₅-Z₁₆-X₁₇-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-X_21a-X_21b-X_21c-X_21d-X_21e-X_21f-X_21g-X_21h-X_21i-X_21j-X_21k-X_21l-X_21m-X_21n-X_21o-X_21p-X_21q-X_21r-X_21s-X_{21 t}-D₂₂(SEQ ID NO：__)，其中X₂、X₄-X₁₃、X₁₅和X₁₇-X₂₀中的每个独立地为任意的氨基酸，其中X_13a-X_13l中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，其中X_21a-X_21t中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，而且其中Z₁₆选自缬氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；其中所述的变体高丝氨酸O-乙酰转移酶多肽在SEQ ID NO：__的G₁、K₃、F₁₄、Z₁₆或D₂₂中的一个或多个，包含氨基酸改变；(b)核酸，其编码变体细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽，其中所述的变体O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽为包括下列氨基酸序列的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽的变体：G₁-X₂-K₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X_13a-X_13b-X_13c-X_13d-X_13e-X_13f-X_13g-X_13h-X_13i-X_13j-X_13k-X_13l-F₁₄-X₁₅-Z₁₆-X₁₇-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-X_21a-X_21b-X_21c-X_21d-X_21e-X_21f-X_21g-X_21h-X_21i-X_21j-X_21k-X_21l-X_21m-X_21n-X_21o-X_21p-X_21q-X_21r-X_21s-X_21t-D₂₂(SEQID NO：__)，其中X₂、X₄-X₁₃、X₁₅和X₁₇-X₂₀中的每个独立地为任意的氨基酸，其中X_13a-X_13l中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，其中X_21a-X_21t中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，而且其中Z₁₆选自缬氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；其中所述的变体O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽在SEQ ID NO：__的G₁、K₃、F₁₄、Z₁₆或D₂₂中的一个或多个，包含氨基酸改变；和(c)核酸，其编码变体细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽，其中所述的变体O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽为包括下列氨基酸序列的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽的变体：L₁-X₂-X₃-G₄-G₅-X₆-F₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁(SEQID NO：__)，其中X是任意的氨基酸，其中X₈选自缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和天冬氨酸，而且其中X₁₁选自缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或甲硫氨酸；其中所述细菌蛋白的变体在SEQ ID NO：__的L₁、G₄、X₈、X₁₁中的一种或多种，包括氨基酸改变。

在另一方面，本发明的特点在于细菌，其包括下列的两种或多种：(a)核酸，其编码变体细菌高丝氨酸O-乙酰转移酶多肽，其中所述的变体高丝氨酸O-乙酰转移酶多肽是谷氨酸棒杆菌高丝氨酸O-乙酰转移酶多肽，其在SEQ IDNO：__的一种或多种下列残基包括氨基酸改变：甘氨酸231、赖氨酸233、苯丙氨酸251和缬氨酸253；(b)核酸，其编码变体细菌高丝氨酸O-乙酰转移酶多肽，其中所述的变体高丝氨酸O-乙酰转移酶多肽是T.fusca高丝氨酸O-乙酰转移酶多肽，其在SEQ ID NO：__的一种或多种下列残基包括氨基酸改变：甘氨酸81、天冬氨酸287、苯丙氨酸269；(c)核酸，其编码变体细菌高丝氨酸O-乙酰转移酶多肽，其中所述的变体高丝氨酸O-乙酰转移酶多肽是大肠杆菌高丝氨酸O-乙酰转移酶多肽，其在SEQ ID NO：__的谷氨酸252包括氨基酸改变；(d)核酸，其编码变体细菌高丝氨酸O-乙酰转移酶多肽，其中所述的变体高丝氨酸O-乙酰转移酶多肽是分枝杆菌的高丝氨酸O-乙酰转移酶多肽，其在对应于SEQ ID NO：__中列出的麻风分枝杆菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽的一个或多个下列残基的残基中包含氨基酸改变：甘氨酸73、天冬氨酸278和酪氨酸260；(e)核酸，其编码变体细菌高丝氨酸O-乙酰转移酶多肽，其中所述变体高丝氨酸O-乙酰转移酶多肽是结核分枝杆菌高丝氨酸O-乙酰转移酶多肽，其在SEQ ID NO：__的一个或多个下列残基中包含氨基酸改变：甘氨酸73、酪氨酸260和天冬氨酸278；(f)核酸，其编码变体细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽，其中所述的变体O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽是谷氨酸棒杆菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽，其在SEQ ID NO：的一个或多个下列残基中包含氨基酸改变：甘氨酸227、亮氨酸229、天冬氨酸231、甘氨酸232、甘氨酸233、苯丙氨酸235、天冬氨酸236、缬氨酸239、苯丙氨酸368、天冬氨酸370、天冬氨酸383、甘氨酸346和赖氨酸348；和(g)核酸，其编码变体细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽，其中所述的变体O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽是T.fusca O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽，其在SEQ ID NO：__的一个或多个下列残基中包含氨基酸改变：甘氨酸240、天冬氨酸244、苯丙氨酸379和天冬氨酸394。

在另一方面，本发明的特点在于细菌，其包括核酸，所述的核酸编码游离型高丝氨酸O-乙酰转移酶多肽和游离型O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽。在不同的实施方案中，所述的细菌是棒杆菌。在不同的实施方案中，所述的游离型高丝氨酸O-乙酰转移酶多肽和所述的游离型O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽属于所述细菌的同一菌种(例如，都属于谷氨酸棒杆菌)。在不同的实施方案中，所述的游离型高丝氨酸O-乙酰转移酶多肽和所述的游离型O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽属于与所述菌株不同的菌种。在不同的实施方案中，所述的游离型高丝氨酸O-乙酰转移酶多肽是细菌高丝氨酸O-乙酰转移酶多肽的变体，其具有降低的反馈抑制，相对于野生型的高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽。在不同的实施方案中，所述的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽是细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽的变体，其具有降低的反馈抑制，相对于野生型的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽。

“氨基酸和相关代谢物的天冬氨酸家族”包括L-天冬氨酸、β-天冬氨酰磷酸(β-aspartyl phosphate)、L-天冬氨酸-β-半醛、L-2，3-二氢吡啶二羧酸、L-Δ¹-哌啶-2，6-二羧酸盐(L-Δ¹-piperideine-dicarboxylate)、N-琥珀酰-2-氨基-6-酮-L-庚二酸(N-succinyl-2-amino-6-keto-L-pimelate)、N-琥珀酰-2，6-L，L-二氨基庚二酸、L，L-二氨基庚二酸、D，L-二氨基庚二酸、L-赖氨酸、高丝氨酸、O-乙酰-L-高丝氨酸(O-acetyl-L-homoserine)、O-琥珀酰-L-高丝氨酸(O-succinyl-L-homoserine)、胱硫醚、L-高半胱氨酸、L-甲硫氨酸、S-腺苷-L-甲硫氨酸、O-磷酸-L-高丝氨酸、苏氨酸、2-oxo丁酸盐、(S)-2-乙酰-2-羟基丁酸盐((S)-2-aceto-2-hydroxybutanoate)、(S)-2-羟基-3-甲基-3-oxo戊酸盐((S)-2-hydroxy-3-methyl-3-oxopentanoate)、(R)-2，3-二羟基-3-甲基戊酸盐((R)-2，3-Dihydroxy-3-methylpentanoate)、(R)-2-氧-3-甲基戊酸盐((R)-2-oxo-3-methylpentanoate)、L-异亮氨酸、L-天冬酰胺。在不同的实施方案中，所述的氨基酸和相关代谢物的天冬氨酸家族包括天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸和S-腺苷-L-甲硫氨酸。具有“降低的反馈抑制”的多肽或其功能变体包括多肽，其在抑制因子存在的条件下被较少的抑制，如与所述多肽的野生型相比较；或多肽，其在抑制因子存在的条件下被较少的抑制，如与相应的内源多肽相比较，所述的内源多肽在所述的生物体中表达，在所述的生物体中已经导入所述的变体。例如，来自大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌的野生型天冬氨酸激酶，在设定浓度的赖氨酸或赖氨酸加苏氨酸分别存在的条件下，可具有减少10倍的活性。具有降低的反馈抑制的变体，在相同浓度的赖氨酸存在的条件下，可具有，例如，减少5倍、减少2倍或野生型水平的活性。

“功能变体”蛋白是能够催化由野生型蛋白催化的生物合成反应的蛋白，其中所述的蛋白是酶，或者当所述蛋白不起催化作用时，提供与野生型蛋白相同的生物学功能。例如，通常调控一个或多个基因转录的蛋白的功能变体，当转化入细菌时仍然可以调控一个或多个相同基因的转录。在一些实施方案中，功能变体蛋白至少部分地或完全地抵抗氨基酸的反馈抑制。在一些实施方案中，所述的变体具有少于20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或1个氨基酸改变，与所述野生型蛋白相比较；在一些实施方案中，所述的氨基酸改变是保守的改变。变体序列是对应于变体多肽，例如，功能变体多肽的核苷酸序列或氨基酸序列。

“对应于”参比序列中的氨基酸的氨基酸，占据与参比序列中的位点同源的位点。对应的氨基酸可以由相关序列的比对进行鉴定。

如在这里应用的，“异源的”核酸或蛋白的意思是包括除宿主生物体(菌种)之外的生物体(菌种)的核酸或蛋白或核酸或蛋白的功能变体，所述的宿主生物体用于产生所述氨基酸和相关代谢物的天冬氨酸家族的成员。在一些实施方案中，当所述的宿主生物体是棒杆菌的细菌时，所述的异源基因不会从大肠杆菌中得到。在其他具体的实施方案中，当所述的宿主生物体是大肠杆菌时，所述的异源基因不会从棒杆菌的细菌中得到。

“基因”，如在这里应用的，包括编码(coding)、启动子、操纵子、增强子、终止子、共-转录的(例如，来自操纵子的序列)和与具体的编码序列有关的其他调控序列。

如在这里应用的，“同源的”核酸或蛋白的意思是包括与宿主生物体相同菌种的生物体的核酸或蛋白或核酸或蛋白的功能变体。所述的宿主生物体用于产生所述氨基酸和相关代谢物的天冬氨酸家族的成员。

如本领域的技术人员所知，一个氨基酸对于另一个的一些取代容许在野生型酶的一种或多种氨基酸残基发生，而不消除所述酶的活性或功能。如在这里应用的，术语“保守的取代”指蛋白序列的相同的保守的取代分组中，用一个氨基酸交换另一个氨基酸。保守的氨基酸取代是本技术领域公知的，并通常基于所述氨基酸侧链取代基的相对的相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等等。在一个实施方案中，保守的取代通常包括下列组内的取代：1组：甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸；2组：缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸；3组：天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；4组：丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸；5组：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6组：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。每组提供氨基酸的列表，所述的氨基酸可以在蛋白序列中被那个具体的组中的其他氨基酸中的任一个所取代。

有若干规则用于建立氨基酸的分组用于保守的取代。例如，所述的亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用的生物学功能上的重要性，通常在本技术领域中是被理解的(Kyte和Doolittle，Mol.Biol.157：105-132(1982))。众所周知，一种氨基酸可以被其他氨基酸所取代，所述的其他氨基酸具有相似的亲水指数或分数并仍然保持相似的生物活性。氨基酸亲水性也用作建立保守的氨基酸分组的规则(参见，例如美国专利No.4,554,101)。

关于一个氨基酸取代另一个的信息通常是本技术领域中所公知的(参见，例如，Introduction to Protein Architecture：The Structural Biology of Proteins，Lesk，A.M.，Oxford University Press；ISBN：0198504748；Introduction to ProteinStructure，Branden，C.-I.，Tooze，J.，Karolinska Institute，Stockholm，Sweden(January 15，1999)；和Protein Structure Prediction：Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)，Webster，D.M.(Editor)，August 2000，HumanaPress，ISBN：0896036375)。

在一些实施方案中，将异源序列和/或宿主菌株的核酸和/或蛋白序列进行比较，并确定所述的同源性。

可以采用同源性比较，例如，用来鉴定对应的氨基酸。两个序列之间的百分比同一性是由所述序列共享的同一性位点数目的函数，并考虑缺口的数目和每个缺口的长度，其需要被导入所述的两个序列的最优排列。比较序列合确定两个序列之间的百分比同一性可以应用数学的算法进行。例如，两个核苷酸序列之间的百分比同一性可以应用Needleman和Wunsch算法((1970)J.Mol.Biol.48：444-453)的算法来确定，所述的算法被整合入所述CGC软件包中的GAP程序，采用Blosum 62矩阵和缺口权重(gap weight)为12，缺口延伸罚分为4，和移码缺口罚分为5。

通常，为了确定两个核酸或蛋白序列的百分比同一性，将所述的序列为了最优对比目的进行排列(例如，可在第一个和第二个核酸或氨基酸序列的一个或两个中导入缺口，用于最优的排列，而且可以忽视非-同源序列用于对比目的)。为了对比目的进行排列的测试序列的长度可以为所述参比序列长度的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％。然后比较了在对应的核苷酸或氨基酸位点的核苷酸或氨基酸。当第一个序列中的位点被与第二个序列中的对应的位点相同的核苷酸或氨基酸占据，于是所述的分子在该位点是同一的(如在这里应用的，“同一性”等于“同源性”)。

在这里描述的蛋白序列可以用作“查询序列”例如，来对非-冗余序列的数据库进行查询。可以应用Altschul，等(1990)J Mol.Biol.215：403-10的BLASTP和TBLASTN程序(version 2.0)进行所述的查询。BLAST蛋白查询可以用所述的BLASTP程序进行，采用，例如，所述的Blosum 62矩阵，字长(wordlength)为3，和缺口存在成本(gap existence cost)为11和缺口延伸罚分为1。进行BLAST分析的软件是通过National Center for BiotechnologyInformation可以公开获得的，并可以采用默认的参数。在这里描述的序列也可以用作TBLASTN查询中的查询序列，采用具体的或默认的参数。

在这里描述的核酸序列可用作“查询序列”，例如来对非-冗余序列的数据库进行查询。这样的查询可以应用Altschul，等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的BLASTN和BLASTX程序(version 2.0)进行，BLAST核苷酸查询可以用所述的BLASTN程序，分数＝100，字长＝11来进行，以在所述的核酸水平估计同一性。BLAST蛋白查询可以用所述的BLASTX程序，分数＝50，字长＝3来进行，以在所述的蛋白水平估计同一性。为了得到出于对比目的进行的缺口的排列，可以应用如Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402中描述的Gapped BLAST。当应用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以采用所述各自程序(例如，BLASTX和BLASTN)的默认的参数。对了对比也可以进行核苷酸序列的排列，例如，通过Smith & Watennan，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法(local homology algorithm)，通过Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性排列算法(homologyalignment algorithm)，通过Pearson & Lipman，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的查询相似性方法(search for similarity method)，通过这些算法计算机化的实现(Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI)，或通过手工的排列和目测(visual inspection)(参见，例如，Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等，eds.1995 supplement))。

可以分析核酸序列的杂交性质。如在这里应用的，术语“在低严紧性、中严紧性、高严紧性或非常高严紧性条件下杂交”描述了用于杂交和洗涤的条件。对进行杂交反应的指导可以在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。水性的和非水性的方法在该参考文献中进行了描述并可采用任一种。这里提到的具体的杂交条件如下：1)低严紧性杂交条件，在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)在大约45℃，然后在0.2×SSC，0.1％SDS至少在50℃洗涤两次(对于低严紧性条件，所述的洗涤温度可以提高到55℃)；2)中严紧性杂交条件，在6×SSC在大约45℃，然后在0.2×SSC，0.1％SDS在60℃洗涤一次或多次；3)高严紧性杂交条件，在6×SSC在大约45℃，然后在0.2×SSC，0.1％SDS在65℃洗涤一次、两次、三次、四次或更多次；4)非常高严紧性杂交条件为0.5M磷酸钠(sodiumphosphate)，7％SDS在65℃，然后在0.2×SSC，1％SDS在65℃洗涤一次或多次。非常高严紧性条件(洗涤至少4次或更多)是优选的条件，而且除非另外说明应该应用这些条件。

下面结合附图和说明列出了本发明的一个或多个实施方案的详述。本发明的其他特点、目的和优势在所述的说明书、附图以及所述的权利要求中显而易见。

附图说明

图1是天冬氨酸氨基酸家族的生物合成图示。

图2是甲硫氨酸生物合成途径的图示。

图3是质粒MB3961(载体骨架质粒)的限制酶切图谱。

图4是质粒MB4094(载体骨架质粒)的限制酶切图谱。

图5是质粒MB4083(hom-thrB缺失构建体)的限制酶切图谱。

图6是质粒MB4084(thrB缺失构建体)的限制酶切图谱。

图7是质粒MB4165(mcbR缺失构建体)的限制酶切图谱。

图8是质粒MB4169(hom-thrB缺失/gpd-耻垢分枝杆菌lysC(T311I)-asd替换构建体)的限制酶切图谱。

图9是质粒MB4192(hom-thrB缺失/gpd-天蓝色链霉菌hom(G362E)替换构建体)的限制酶切图谱。

图10是质粒MB4276(pck缺失/gpd-耻垢分枝杆菌lysC(T311I)-asd替换构建体)的限制酶切图谱。

图11是质粒MB4286(mcbR缺失/trcRBS-T.fusca metA替换构建体)的限制酶切图谱。

图12A是质粒MB4287(mcbR缺失/trcRBS-谷氨酸棒杆菌metA(K233A)-metB替换构建体)的限制酶切图谱。

图12B描绘了MB4278(trcRBS-谷氨酸棒杆菌metAYH)中DNA序列的核苷酸序列，其从所述的trcRBS启动子跨越至所述metH基因的结束。

图13是描述在IPTG存在和不存在的条件下，测定来自两株谷氨酸棒杆菌菌株MA-442和MA-449的谷氨酸棒杆菌MetA的体外O-乙酰基转移酶活性的试验结果的图。

图14是描述测定谷氨酸棒杆菌菌株MA-442中的MetA被甲硫氨酸和S-AM抑制的敏感性的试验结果的图。

图15是描述测定谷氨酸棒杆菌菌株MA-456、MA570、MA-578和MA-479中表达的T.fusca MetA的体外O-乙酰基转移酶活性的试验结果的图。速率(rate)的测定方法是每纳克(nanogram)蛋白OD412的变化除以时间。

图16是描述测定谷氨酸棒杆菌菌株MA-456和MA-570中表达的T.fuscaMetY的体外MetY活性的试验结果的图。速率的测定方法是每纳克蛋白OD412的变化除以时间。

图17是描述测定表达异源野生型和突变体lysC变体的谷氨酸棒杆菌和乳发酵短杆菌菌株中赖氨酸产生的试验结果的图。

图18是描述在存在和不存在天蓝色链霉菌hom G362E变体的条件下，测定谷氨酸棒杆菌菌株MA-0331中赖氨酸和高丝氨酸产生的试验结果的图。

图19是描述在存在和不存在菊欧文氏菌ppc的条件下，测定谷氨酸棒杆菌菌株MA-0331和MA-0463中天冬氨酸浓度的试验结果的图。

图20是描述测定用异源野生型dapA基因转化的谷氨酸棒杆菌菌株MA-0331和MA-0463中赖氨酸产生的试验结果的图。

图21是描述测定谷氨酸棒杆菌菌株MA-1378及其亲代菌株中代谢物水平的试验结果的图。

图22是描述测定在IPTG存在和不存在的条件下生长的谷氨酸棒杆菌菌株MA-0428、MA-0579、MA-1351、MA-1559中的高丝氨酸和O-乙酰高丝氨酸水平的试验结果的图。IPTG诱导含有T.fusca metA基因的游离型质粒的表达。

图23是描述测定谷氨酸棒杆菌菌株MA-1559及其亲代菌株中代谢物水平的试验结果的图。

图24是描述来自两株谷氨酸棒杆菌菌株MA-622和MA-699的发酵的发酵液中甲硫氨酸浓度的图，所述的MA-622和MA-699表达MetA K233A突变体多肽。描述了通过细胞进行的生产，所述的细胞是在IPTG存在和不存在的条件下培养的。

图25是描述来自两株谷氨酸棒杆菌菌株MA-622和MA-699的发酵的发酵液中甲硫氨酸浓度的图，所述的MA-622和MA-699表达MetY D231A突变体多肽。描述了通过细胞进行的生产，所述的细胞是在IPTG存在和不存在的条件下培养的。

图26是描述来自两株谷氨酸棒杆菌菌株MA-622和MA-699的发酵的发酵液中甲硫氨酸浓度的图，所述的MA-622和MA-699表达MetY G232A突变体多肽。描述了通过细胞进行的生产，所述的细胞是在IPTG存在和不存在的条件下培养的。

图27是描述测定谷氨酸棒杆菌菌株MA-1906、MA-2028、MA-1907和MA-2025中代谢物水平的试验结果的图。所述的菌株在IPTG存在和不存在的条件下生长。

图28是描述测定谷氨酸棒杆菌菌株MA-1667和MA-1743中代谢物水平的试验结果的图。所述的菌株在IPTG存在和不存在的条件下生长。

图29是描述测定谷氨酸棒杆菌菌株MA-0569、MA-1688、MA-1421和MA-1790中代谢物水平的试验结果的图。所述的菌株在IPTG存在和/或不存在的条件下生长。

图30是描述测定谷氨酸棒杆菌菌株MA-1668及其亲代菌株中代谢物水平的试验结果的图。

发明详述

本发明提供了核酸和包含核酸的修饰的细菌，所述的核酸编码蛋白，该蛋白改善天冬氨酸-衍生的氨基酸和中间物化合物的发酵产量。尤其，公开了与L-天冬氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、S-腺苷-L-甲硫氨酸、苏氨酸、L-异亮氨酸、高丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸、高半胱氨酸和胱硫醚的产生相关的核酸和细菌。所述的核酸包括基因，所述基因编码代谢途径蛋白，所述的代谢途径蛋白或直接地(例如，通过中间物的酶转化)或间接地(例如，通过酶表达的转录调控或氨基酸输出的调控)调节这些氨基酸、中间物和相关代谢物的生物合成。编码所述蛋白的核酸序列可从除用于产生所述天冬氨酸家族成员的氨基酸和相关代谢物的所述宿主生物体(菌种)之外的细菌菌种中得到。本发明也提供产生所述细菌和所述氨基酸的方法，其包括产生用于动物饲料添加剂的氨基酸。

涉及氨基酸产生的一些细菌蛋白序列的修饰，可导致氨基酸产量的增加。修饰的或未修饰的(例如，野生型)的细菌酶的调控的(例如，降低的或增加的)表达同样能增加氨基酸产生。在这里描述的方法和组合物应用于细菌蛋白和编码这些蛋白的核酸，所述的细菌蛋白调控氨基酸和相关的代谢物(例如，涉及甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、半胱氨酸和硫的新陈代谢的蛋白)的产生。这些蛋白包括酶，其催化氨基酸生物合成途径的中间物转化未其他中间物和/或终产物，和蛋白，其直接调控上述酶的表达和/或功能。操作的目标蛋白包括那些酶，其经过各种类型的调控，诸如阻遏(repression)、衰减(attenuation)或反馈抑制(feedback-inhibition)。细菌菌种中的氨基酸生物合成途径、关于涉及这些途径的蛋白的信息、与这些蛋白的序列的关联和其他相关的用于鉴定如在这里描述的操作和/或表达的蛋白的资源可以通过连接的数据库得到，所述的数据库由错误！超链接引用无效Bono等，GenomeResearch，8：203-210，1998描述。

操纵氨基酸生物合成的效率用于商业生产的策略包括过量表达(overexpression)、表达不足(underexpression)(包括基因破坏或替换)和具体基因的条件表达，以及遗传改变以优化蛋白的活性。可能降低生物合成的酶对于抑制刺激的敏感性，例如，由于生物合成途径终产物和中间物存在而引起的反馈抑制。例如，用于商业生产赖氨酸的源自棒杆菌的细菌和大肠杆菌的菌株通常显示对于赖氨酸的反馈抑制的相对的非敏感性。有用的棒杆菌的细菌菌株也相对地抵抗苏氨酸的抑制。在这里描述的新的方法和组合物导致氨基酸产生增加。不受理论的限制，这些方法和组合物可产生酶，其在S-腺苷甲硫氨酸(S-AM)和/或甲硫氨酸存在的条件下，由于降低的反馈抑制而增加。用于操作的代表性的目标基因是细菌的dapA、hom、thrB、ppc、pyc、pck、metE、glyA、metA、metY、mcbR、lysC、asd、metB、metC、metH和metK基因。这些目标基因可以单独地或以不同的组合进行操作。

在一些实施方案中，构建具体基因活性降低的菌株是有用的(例如，通过突变或外源基因的缺失)。例如，hom、thrB、pck或mcbR基因产物中一种或多种活性降低的菌株可以显示氨基酸和相关中间物的产生增加。

两种指导碳流向氨基酸和相关代谢物的天冬氨酸家族的中心碳代谢酶包括磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(Ppc)和丙酮酸羧化酶(Pyc)。生物合成天冬氨酸家族氨基酸的初始步骤在图1中显示。两种酶催化草酰乙酸盐(oxaloacetate)的形成，其是三羧酸(TCA)循环成分，可转氨成为天冬氨酸。天冬氨酸激酶(其由棒杆菌细菌中的lysC编码)催化氨基酸的天冬氨酸家族中的第一个酶反应，并已知受反馈-抑制和阻遏的调控。因此，这种酶的反调节(deregulation)对于产生天冬氨酸氨基酸途径的任何商业上重要的氨基酸和相关的代谢物(例如天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、甲硫氨酸、S-腺苷-L-甲硫氨酸、苏氨酸和异亮氨酸)来说是关键性的。由于调节碳流流向氨基酸的关键酶源自天冬氨酸，过量表达(通过增加拷贝数和/或应用强启动子)和/或反调控这些酶中的每一种或两种可以增加上列的氨基酸的产生。

其他生物合成的酶可以用于增加具体氨基酸的产生。涉及L-赖氨酸生物合成的酶的实例包括：二氢吡啶二羧酸合酶(DapA)、二氢吡啶二羧酸还原酶(DapB)、二氨基庚二酸脱氢酶(Ddh)和二氨基庚二酸脱羧酶(LysA)。涉及赖氨酸生物合成的酶的列表在表1中提供。这些酶中每种的过量表达和/或反调控可以增加赖氨酸的产生。生物合成的酶的过量表达可通过增加目标基因的拷贝数和/或可操作地将所述的基因与对于表达最优的启动子，例如，强启动子或条件启动子连接而实现。

在过量表达一般的和具体的调控酶的菌株中，可增加赖氨酸生产能力。大肠杆菌的天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合酶中具体的氨基酸取代通过降低反馈抑制可导致的赖氨酸产生的增加。lysC和/或dapA(或野生型或反馈-不敏感的等位基因)的增强表达可以增加赖氨酸产生。类似地，异源lysC和dapA基因的反调节的等位基因可以在棒杆菌的细菌，例如谷氨酸棒杆菌的菌株中表达。同样地，pyc或ppc的过量表达可以增加赖氨酸产生。

表1.赖氨酸生物合成中涉及的基因和酶

基因	酶	说明
			Pyc	丙酮酸羧化酶	添补(anaplerotic)反应
Ppc	磷酸烯醇丙酮酸羧化酶	添补反应
			AspC	天冬氨酸转氨酶	将OAA转化为天冬氨酸。
LysC	天冬氨酸激酶III	依赖于来源菌种，被赖氨酸或赖氨酸加苏氨反馈-抑制，并在一些菌株中，被赖氨酸抑制。
			Asd	天冬氨酸半醛脱氢酶
Hom	高丝氨酸脱氢酶	赖氨酸和甲硫氨酸/苏氨酸之间关键的分支点。
			DapA	二氢吡啶二羧酸合酶	在赖氨酸生物合成中催化第一个关键步骤。在大肠杆菌中被赖氨酸抑制。
DapB	二氢吡啶二羧酸还原酶
			DapC	N-琥珀酰-LL-二氨基庚二酸转氨酶
DapD	四氢吡啶二羧酸N-琥珀酰转移酶
			DapE	N-琥珀酰-LL-二氨基庚二酸脱琥珀酰酶
DapF	二氨基庚二酸表异构酶
			LysA	二氨基庚二酸脱羧酶	赖氨酸生物合成中的最后步骤
Ddh	二氨基庚二酸脱氢酶	冗余的一步途径，用于在棒杆菌中将四氢吡啶二羧酸转化为内消旋(meso)-二氨基庚二酸

甲硫氨酸生物合成中的步骤在图2中显示。调控甲流氨酸生物合成的酶的实例包括：高丝氨酸脱氢酶(Hom)、O-高丝氨酸乙酰基转移酶(MetA)和O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶(MetY)。过量表达(通过增加目标基因的拷贝数和/或通过应用强启动子)和/或反调节(deregulation)这些酶中每一种可增加甲硫氨酸的产生。

甲硫氨酸腺苷基转移酶(MetK)催化从甲硫氨酸产生S-腺苷-L-甲硫氨酸。降低表达metK-的酶活性可以防止甲硫氨酸转化为S-腺苷-L-甲硫氨酸，从而增加来自细菌菌株的甲硫氨酸的产量。相反地，如果想要增加碳流从甲硫氨酸流向S-腺苷-L-甲硫氨酸，就可以过量表达所述的metK基因被使其或对于反馈抑制变得不敏感。

细菌宿主菌株

用于产生氨基酸的合适的宿主菌株包括肠杆菌科的细菌，如大肠杆菌细菌和棒杆菌属的菌株。下面的列表包括菌种和菌株的实例，所述菌种和菌株可以用作表达异源基因并产生氨基酸的宿主菌株。

大肠杆菌W3110F^-IN(rrnD-rrnE)1λ^-(大肠杆菌Genetic Stock Center)

谷氨酸棒杆菌ATCC(American Type Culture Collection)13032

谷氨酸棒杆菌ATCC 21526

谷氨酸棒杆菌ATCC 21543

谷氨酸棒杆菌ATCC21608

醋谷棒杆菌ATCC 15806

醋谷棒杆菌ATCC 21491

醋谷棒杆菌NRRLB-11473

醋谷棒杆菌NRRLB-11475

醋谷棒杆菌ATCC 13870

Corynebacterium melassecola ATCC 17965

Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539

Brevibacterium lactis

乳发酵短杆菌ATCC 13869

乳发酵短杆菌NRRL B-11470

乳发酵短杆菌NRRL B-11471

乳发酵短杆菌ATCC 21799

乳发酵短杆菌ATCC 31269

黄色短杆菌ATCC 14067

黄色短杆菌ATCC 21269

黄色短杆菌NRRL B-11472

黄色短杆菌NRRL B-11474

黄色短杆菌ATCC 21475

Brevibacterium divaricatum ATCC 14020

用作有用基因来源的细菌菌株

对于异源细菌基因的合适的菌种和菌株包括，但不限于，下面列出的这些。

耻垢分枝杆菌ATCC 700084

地中海拟无枝酸菌

天蓝色链霉菌A3(2)

Thermobifida fusca ATCC 27730

菊欧文氏菌ATCC 11663

Shewanella oneidensis

麻风分枝杆菌

结核分枝杆菌H37Rv

植物乳杆菌ATCC 8014

球形芽孢杆菌

用于增加氨基酸产生的代表性蛋白的氨基酸序列，在表16中提供。编码这些蛋白的核苷酸序列在表17中提供。能够在宿主菌株中表达的序列不限于由这些表提供的那些序列。

天冬氨酸激酶(aspartokinase)

天冬氨酸激酶(也称作天冬氨酸激酶(aspartate kinase))是催化天冬氨酸家族氨基酸的生物合成中的第一个确认的步骤。天冬氨酸激酶的水平和活性通常被所述途径的一种或多种终产物(赖氨酸或赖氨酸加苏氨酸，依据所述的细菌菌种)，通过反馈抑制(也称作别构调节(allosteric regulation))和转录控制(也称阻遏)来调控。棒杆菌和大肠杆菌天冬氨酸激酶的细菌的同源物可用于增加氨基酸产生。棒杆菌和大肠杆菌天冬氨酸激酶可以在异源生物体中表达以增加氨基酸产生。

来自棒杆菌细菌的LysC蛋白的同源物

在棒杆菌细菌中，天冬氨酸激酶由lysC基因座编码。所述的lysC基因座含有2个重叠基因，lysC alpha和lysC beta。lysC alpha和lysC beta分别编码天冬氨酸激酶的47-和18-kD亚基。第三个开放阅读框邻近于所述的lysC基因座，并编码天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)。所述的asd起始密码子从所述lysC开放阅读框的24个碱基对下游开始，表达为所述lysC操纵子的一部分。

天冬氨酸激酶蛋白的一级序列和所述lysC基因座的结构在放线菌目的几个成员中是保守的。编码与来自棒杆菌细菌的蛋白高度相关的天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶的生物体的实例包括耻垢分枝杆菌、地中海拟无枝酸菌、天蓝色链霉菌A3(2)和Thermobifida fusca。在一些实例中，这些生物体包含所述的lysC和asd基因，其排列如在棒杆菌细菌中一致。表2显示了来自这些放线菌的蛋白与所述谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶蛋白的百分比同源性。

表2.异源天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶蛋白与谷氨酸棒杆菌蛋白的百分比同一性

生物体	天冬氨酸激酶(与谷氨酸棒杆菌LysC的％同一性)	天冬氨酸半醛脱氢酶(与谷氨酸棒杆菌Asd的％同一性)
			耻垢分枝杆菌	73	68
地中海拟无枝酸菌	73	62
			天蓝色链霉菌	64	50
Thermobifida fusca	64	48

来源菌株，诸如耻垢分枝杆菌、地中海拟无枝酸菌、天蓝色链霉菌和Thermobifida fusca的分离是可行的。所述的lysC操纵子可以从由每种来源菌株制备的基因组DNA中扩增，而且可以将所得到的PCR产物连接到大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌穿梭载体。然后可将来自所述来源菌株的天冬氨酸激酶的同源物导入宿主菌株并表达。

大肠杆菌天冬氨酸激酶III同源物

在棒杆菌细菌中，有天冬氨酸激酶被赖氨酸和苏氨酸协同的反馈抑制。这和大肠杆菌形成对比，在大肠杆菌中有三种不同的天冬氨酸激酶，其单独地变构地被赖氨酸、苏氨酸或甲硫氨酸调控。所述的大肠杆菌天冬氨酸激酶III(和其他同工酶(isoenzyme))的同源物可以用作反调节的天冬氨酸激酶蛋白的替换来源。这些酶在棒杆菌细菌中的表达可降低途径调控的复杂性。例如，所述的天冬氨酸激酶III基因仅仅被赖氨酸而不是赖氨酸和苏氨酸反馈抑制。因此，表达天冬氨酸激酶III等位基因的反馈-抗性等位基因的优点包括：(1)增加完全反调节的可能性；和(2)能去除构建hom中“泄漏的(leaky)”突变或构建需要被补充的苏氨酸营养缺陷型的需要。这些特点可导致被赖氨酸降低的反馈抑制。

编码天冬氨酸激酶III同工酶的基因可以从细菌中分离，所述的细菌与棒杆菌的亲缘关系比上述的放线菌更远。例如菊欧文氏菌和S.oneidensis基因产物分别与所述的大肠杆菌lysC蛋白77％和60％相同(并与谷氨酸棒杆菌lysC 26％和35％相同)。可从非-埃希氏杆菌(Escherichia)、菊欧文氏菌和Shewanella oneidensis中扩增编码天冬氨酸激酶III或其功能变体的基因，并连接到合适的穿梭载体，用于在谷氨酸棒杆菌中表达。

构建反调节的天冬氨酸激酶等位基因

赖氨酸同源物(例如S-(2-氨乙基)半胱氨酸(AEC))或高浓度的赖氨酸(和/或苏氨酸)可以用于鉴定赖氨酸产生增加的菌株。来自谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌的已知的赖氨酸-抗性菌株的相当一部分，含有在所述lysC基因座的突变。重要地，已经鉴定出具体的氨基酸取代，其赋予对于AEC增加的抗性，而且这些取代对应于(map to)充分-保守的残基。造成赖氨酸产量增加的具体的氨基酸取代，至少在野生型菌株中，包括，但不限于，在表3中列出的那些。在很多实例中，在具体残基的几种有用的取代已经得到鉴定。此外，在不同的实施例中，已经鉴定了含有多于一个lysC突变的菌株。序列排列确认，先前与反馈-抗性(即AEC-抗性)结合的残基在来自亲缘关系疏远的细菌的多种天冬氨酸激酶蛋白中是保守的。

表3.释放天冬氨酸激酶反馈抑制的氨基酸取代

标准的定点突变方法可用于构建不经过变构调节的天冬氨酸激酶变体。将PCR-扩增的lysC或天冬氨酸激酶III基因克隆到适当的穿梭载体之后，寡核苷酸-介导的定点突变被用于提供修饰的等位基因，其编码诸如在表3中列出的那些取代。可将含有野生型基因和修饰的等位基因的载体以及控制载体转化入谷氨酸棒杆菌中。可筛选得到的转化体，例如，根据赖氨酸产量、对AEC抗性增加、赖氨酸营养缺陷型的相对的互养(cross-feeding)或其他本领域的技术人员公知的方法以鉴定最需要的突变体等位基因。测定赖氨酸产量和/或酶活性的实验可用于确认所述的筛选结果，并选出有用的突变体等位基因。定量氨基酸和相关代谢物的天冬氨酸家族成员的水平的方法，诸如高压液相色谱(HPLC)和HPLC-质谱(MS)实验，是本领域的技术人员公知的。

可以采用通过如突变PCR的方法，在所述lysC编码序列之内随机产生氨基酸取代的方法。这些方法对于本领域的那些技术人员是熟知的；例如，应用GeneMorph PCR突变试剂盒(Stratagene，La Jolla，Ca)，根据制造者的使用说明进行PCR，以获得中等和高度范围的突变频率。

所述异源酶的评价可以在所述宿主菌株内源的LysC、DapA、Pyc和Ppc蛋白存在的条件下进行。在一些实例中，具有用来具体地评价所述的异源生物合成蛋白的功能的试剂是有帮助的。AEC抗性的表型实验或酶测定可用于确认异源天冬氨酸激酶的野生型和修饰的变体的功能。克隆的异源基因的功能，可以通过大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌遗传上表征的突变体的互补进行确认。许多的大肠杆菌菌株可以从E.coli Genetic Stock Center(http://cgsc.biology.yale.edu/top.html)中公开地获得。已经描述了谷氨酸棒杆菌突变体。

二氢吡啶二羧酸合酶

由dapA编码的二氢吡啶二羧酸合酶，是分支点(branch point)酶，其将碳用于赖氨酸生物合成而不用于产生苏氨酸/甲硫氨酸。dapA将天冬氨酸-p-半醛转化为2，3-二氢吡啶二羧酸。已经显示过量表达dapA导致在大肠杆菌和棒杆菌细菌中的赖氨酸产生增加。在大肠杆菌中，dapA被赖氨酸别构调节，而已存在的证据显示，谷氨酸棒杆菌调节发生在基因表达水平。二氢吡啶二羧酸合酶蛋白在放线菌中不像lysC蛋白那样充分保守。

可以表达与所述谷氨酸棒杆菌蛋白或所述大肠杆菌dapA蛋白同源的野生型和反调节的dapA蛋白，以增加赖氨酸产生。可作为dapA基因来源的候选生物体在表4中显示。可以应用来自结核分枝杆菌或麻风分枝杆菌的已知序列来鉴定来自耻垢分枝杆菌的同源基因。

表4.二氢吡啶二羧酸合酶蛋白的百分比同一性

已经描述了减轻大肠杆菌dapA被赖氨酸反馈抑制的氨基酸取代。这样的取代的实例在表5中列出。一些可被改变以减轻反馈抑制的残基在所有的候选dapA蛋白中是保守的(例如Leu 88、His 118)。此序列保守显示，在来自放线菌的蛋白中相似的取代可进一步增强蛋白功能。定点突变可以用于构建反调节的dapA变体。

可以测定dapA分离物用于应用上述的方法来增加赖氨酸产生。例如，可以将需要赖氨酸的细菌的培养物分布在缺乏赖氨酸的生长培养基上。然后可将通过定点突变得到的大量dapA突变体(通过转化或接合)导入野生型棒杆菌菌株，并随后铺在含有分布的赖氨酸营养缺陷型的琼脂平板上。反馈-抗性的dapA突变体可以过量产生赖氨酸，所述的赖氨酸被分泌到所述的生长培养基中，并满足先前分布在琼脂平板上的所述营养缺陷型的生长需要。由此，含有菌落的dapA突变周围的赖氨酸营养缺陷型的生长圈，可显示所需的反馈-抗性突变的存在。

表5.释放反馈抑制的二氢吡啶二羧酸合酶中的氨基酸取代

丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶

丙酮酸羧化酶(Pyc)和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(Ppc)催化草酰乙酸(OAA)的合成，所述的草酰乙酸是柠檬酸循环中间物，其直接供给赖氨酸生物合成。已将这些添补反应(anaplerotic reaction)与包括赖氨酸的几种氨基酸的产量增加相联系，并显然对于最大化OAA形成是重要的。

此外，已经显示含有P458S取代的谷氨酸棒杆菌Pyc蛋白的变体具有增加的活性，如通过增加赖氨酸产生所表明的。脯氨酸458是大范围的丙酮酸羧化酶，包括来自放线菌天蓝色链霉菌(氨基酸残基449)和耻垢分枝杆菌(氨基酸残基448)的蛋白中高度保守的氨基酸位点。这些蛋白中相似的氨基酸取代可增加添补活性。第三个基因，PEP羧激酶(pck)，表达催化由OAA(用于糖质新生(gluconeogenesis))形成磷酸烯醇丙酮酸的酶，并由此在功能上与pyc和ppe竞争。pyc和ppc的表达增加可使OAA形成最大化。降低或消除pck活性也可以改进OAA形成。

高丝氨酸脱氢酶

高丝氨酸脱氢酶(Hom)催化天冬氨酸半醛转化为高丝氨酸。Hom在棒杆菌细菌中被苏氨酸反馈抑制，并被甲硫氨酸阻遏。认为此酶对于天冬氨酸半醛比赖氨酸分支中的竞争二氢吡啶二羧酸合酶(DapA)反应具有更大的亲和力，但轻微的碳“泄漏”(spillage)到所述苏氨酸途径仍可阻断Hom活性。Hom的反馈-抗性变体，hom的过量表达和/或hom的反调节的转录，或这些方法的任意组合可增加甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸或S-腺苷-L-甲硫氨酸产生。降低的Hom活性可增加赖氨酸产生。具有高丝氨酸脱氢酶活性的双功能酶，如由大肠杆菌metL(天冬氨酸激酶II-高丝氨酸脱氢酶II)和thrA(天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I)编码的酶，也可以用于增加氨基酸产生。

可产生目标的氨基酸取代，或用来降低，而不是消除Hom活性，或用来减轻Hom被苏氨酸的反馈抑制。导致Hom活性降低的突变被称为“泄漏的”Hom突变。在谷氨酸棒杆菌高丝氨酸脱氢酶中，已经鉴定可被突变以增加或降低Hom活性的氨基酸残基。这些具体的氨基酸中的几个在其他放线菌的Hom蛋白中是充分保守的(参见表6)。

表6.导致″泄漏的″Hom等位基因或消除苏氨酸的反馈抑制的Hom蛋白的氨基酸取代。

^*The hom^dr突变在WO93/09225的第11页描述。此突变是在1964bp的单碱基对缺失，其破坏了在密码子429的所述hom^dr阅读框。这导致移码突变，其诱导大约十个氨基酸改变和早期(premature)终止或截短，即缺失所述多肽的大约最后七个氨基酸残基。

认为此在所述homdr基因的羧基末端的单碱基缺失，根本上改变了所述酶的羧基末端的蛋白序列，防止以苏氨酸与结合位点相互作用这样的方式改变其构象。

高丝氨酸O-乙酰转移酶

高丝氨酸O-乙酰转移酶(MetA)在甲硫氨酸生物合成中的第一个确定的步骤起作用(Park，S.等，Mol.Cells 8：286-294，1998)。所述的MetA酶催化高丝氨酸转化为O-乙酰-高丝氨酸。MetA被所述甲硫氨酸生物合成途径的终产物强烈地调控。在大肠杆菌中，别构调节通过S-AM和甲硫氨酸明显发生在两个单独的别构位点上。而且，MetJ和S-AM引起metA的转录阻遏。在棒杆菌细菌中，与大肠杆菌类似，MetA可被甲硫氨酸和S-AM别构地抑制。MetA合成可被甲硫氨酸单独阻遏。此外，在早期研究中，已经将三氟甲硫氨酸-抗性与metA相联系。通过S-AM和甲硫氨酸降低负向调控可增加甲硫氨酸或S-腺苷-L-甲硫氨酸产生。增加的MetA活性可增加天冬氨酸-衍生的氨基酸，如甲硫氨酸和S-AM的产生，而降低的MetA活性可促进氨基酸，如苏氨酸和异亮氨酸的形成。

O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶

O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶(MetY)催化O-乙酰高丝氨酸转化为高半胱氨酸。MetY在棒杆菌细菌中可被甲硫氨酸阻遏，在0.5mM甲硫氨酸存在的条件下，酶活性降低99％。可能此抑制代表别构调节和基因表达抑制的组合的效果。此外，酶活性被甲硫氨酸、高丝氨酸和O-乙酰丝氨酸抑制。可能S-AM也调控MetY活性。反调节的MetY可增加甲硫氨酸或S-AM产生。

高丝氨酸激酶

高丝氨酸激酶由thrB基因编码，所述thrB基因为hom-thrB操纵子的一部分。ThrB使高丝氨酸磷酸化。已在几种菌种中观察到高丝氨酸激酶的苏氨酸抑制。一些研究显示，高丝氨酸通过高丝氨酸激酶的磷酸化可在一些条件下限制苏氨酸生物合成。提高的ThrB活性可增加天冬氨酸-衍生的氨基酸，如异亮氨酸和苏氨酸的产生，而降低的ThrB活性可促进氨基酸的形成，所述的氨基酸包括，但不限于赖氨酸和甲硫氨酸。

甲硫氨酸腺苷基转移酶

甲硫氨酸腺苷基转移酶将甲硫氨酸转化为S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)。下调甲硫氨酸腺苷基转移酶(MetK)可通过抑制向S-AM的转化而促进甲硫氨酸的产生。metK的表达增加或MetK活性增加可使S-AM的产生最大化。

O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶/O-乙酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶

O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶(MetB；也称为胱硫醚gamma合成酶)催化O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰高丝氨酸转会为胱硫醚。增加MetB的表达或活性可以导致甲硫氨酸或SAM的增加。

胱硫醚beta-裂合酶

胱硫醚beta-裂合酶(MetC)可将胱硫醚转化为高半胱氨酸。增加高半胱氨酸的产生可导致产生甲硫氨酸增加。因此，提高MetC表达或活性可增加甲硫氨酸或S-腺苷-L-甲硫氨酸产生。

谷氨酸脱氢酶

由所述的gdh基因编码的谷氨酸脱氢酶，催化α-酮戊二酸的还原性氨基化，以产生谷氨酸。增加谷氨酸脱氢酶的表达或活性可引起赖氨酸、苏氨酸、亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸或色氨酸增加。

二氨基庚二酸脱氢酶

由棒杆菌细菌中的ddh基因编码的二氨基庚二酸脱氢酶，催化氨和L-2-氨基-6-oxopimelate的依赖于NADPH的还原，以形成内消旋-2，6-二氨基庚二酸，其为赖氨酸生物合成的替换途径中L-赖氨酸的直接前体。二氨基庚二酸脱氢酶的过量表达可增加赖氨酸产生。

洗涤剂敏感性拯救子

洗涤剂敏感性拯救子(dtsR1)，其编码与乙酰CoA羧化酶的alpha亚基相关的蛋白，是表面活性剂抗性基因。增加DtsR1的表达或活性可导致赖氨酸的产生增加。

5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶

5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶(MetH)催化高半胱氨酸转化为甲硫氨酸。此反应依赖于钴胺素(cobalamin)(维生素B12)。增加MetH表达或活性可导致甲硫氨酸或S-腺苷-L-甲硫氨酸的产生增加。

5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶

5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶(MetE)也催化高半胱氨酸转化为甲硫氨酸。增加MetE表达或活性可导致甲硫氨酸或S-腺苷-L-甲硫氨酸的产生增加。

丝氨酸羟基甲基转移酶

增加丝氨酸羟基甲基转移酶(GlyA)表达或活性可导致甲硫氨酸或S-腺苷-L-甲硫氨酸产生增加。

5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶

5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MetF)催化亚甲基四氢叶酸还原为甲基四氢叶酸，其为辅因子，用于将高半胱氨酸甲基化为甲硫氨酸。增加MetF表达或活性可导致甲硫氨酸或S-腺苷-L-甲硫氨酸的产生增加。

丝氨酸O-乙酰基转移酶

丝氨酸O-乙酰基转移酶(CysE)催化丝氨酸转化为O-乙酰丝氨酸。增加CysE的表达或活性可导致甲硫氨酸或S-腺苷-L-甲硫氨酸表达增加。

D-3-磷酸甘油酸脱氢酶

D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)催化丝氨酸生物合成中的第一个步骤，并被丝氨酸别构抑制。增加SerA的表达或活性可导致甲硫氨酸或S-腺苷-L-甲硫氨酸的产生增加。

McbR基因产物

将谷氨酸棒杆菌的mcbR基因产物鉴定为TetR-家族的推定的转录抑制子，并可涉及在谷氨酸棒杆菌中指导甲硫氨酸合成的代谢网络的调控(Rey等，J Biotechnol.103(1)：51-65，2003)。所述mcbR基因产物抑制metY、metK、cysK、cysl、hom、pyk、ssuD和其他可能的基因的表达。可能McbR与小分子，如S-AM或甲硫氨酸结合阻遏表达。迄今，尚未鉴定出防止结合S-AM或甲硫氨酸的McbR的具体的等位基因。降低McbR的表达和/或阻止McbR被S-AM调控可增加氨基酸产生。

McbR涉及含有硫的氨基酸(例如，半胱氨酸、甲硫氨酸)的调控。降低McbR表达或活性也可增加氨基酸的天冬氨酸家族的任何一种的产生，所述的氨基酸源自高丝氨酸(例如，高丝氨酸、O-乙酰-L-高丝氨酸、O-琥珀酰-L-高丝氨酸、胱硫醚、L-高半胱氨酸、L-甲硫氨酸、S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-AM)、O-磷酸-L-高丝氨酸、苏氨酸、2-oxobutanoate、(S)-2-乙酰-2-羟基丁酸、(S)-2-羟基-3-甲基-3-oxopentanoate、(R)-2，3-二羟基-3-甲基戊酸、(R)-2-氧-3-甲基戊酸和L-异亮氨酸)。

赖氨酸输出体蛋白

赖氨酸输出体蛋白(LysE)是特异性的赖氨酸易位体(translocator)，其介导赖氨酸从所述细胞中的流出。在lysE基因中具有缺失的谷氨酸棒杆菌中，L-赖氨酸可达到多于1M的胞内浓度(Erdmann，A.，等J Gen Microbiol.139：3115-3122，1993)。此输出体蛋白的过量表达或活性提高可增加赖氨酸产生。

流出蛋白

大量的细菌基因编码膜转运蛋白(membrane transport protein)。这些膜转运蛋白中的亚类介导氨基酸从所述细胞中的流出。例如，谷氨酸棒杆菌表达苏氨酸流出蛋白。此方便的活性损失导致苏氨酸的胞内高度累积(Simic等，JBacteriol.183(18)：5317-5324，2001)。增加流出蛋白的表达或活性可导致多种氨基酸的产生增加。有用的流出蛋白包括所述的药物/代谢物运载体家族的蛋白。表16中列出的谷氨酸棒杆菌蛋白或其同源物可用于增加氨基酸产生。

分离细菌基因

可将用于在宿主菌株中表达的细菌基因通过本技术领域中公知的方法分离。重组核酸的构建方法参见，例如，Sambrook，J.和Russell，D.W.(MolecularCloning：A Laboratory Manual，3nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001)。可应用公知的方法制备来自来源菌株的基因组DNA(参见，例如，Saito，H.和Miura，K.Biochim Biophys Acta.72：619-629，1963)而且可以从基因组DNA中应用PCR扩增基因(U.S.Pats.4,683,195和4,683,202，Saiki，等Science 230：350-1354，1985)。

用于扩增反应的DNA引物是与双链DNA的3’末端互补的那些，所述的双链DNA含有目标基因的完整区域和部分区域。当只扩增一部分的基因时，需要应用这样的DNA片段作为引物以进行含有来自染色体DNA文库的完整区域的DNA片段的筛选。当扩增完整区域基因时，将包括DNA片段的PCR反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳，所述的DNA片段中含有扩增的基因，然后提取DNA片段并克隆入合适的载体，用于在细菌系统中表达。

可基于，例如，所述来源菌株中已知的序列(Richaud，F.等，J.Bacteriol.297，1986)足够地制备用于PCR的DNA引物。例如，可以采用引物，所述引物能够扩增包括核苷酸碱基的区域，所述核苷酸碱基编码目标异源基因。可通过常规的方法，如phosphoamidite方法(参见Tetrahed Lett.22：1859，1981)，应用商业上可得到的DNA合成仪(例如，由Applied Biosystems Inc.产生的DNASynthesizer Model 380B)进行所述引物的合成。此外，所述的PCR可以通过应用商业上可得到的PCR设备和Taq DNA聚合酶或显示更高保真度的其他聚合酶，依照由供应商指定的方法进行。

构建变体等位基因

许多调节氨基酸产生的酶受到由生物合成途径中间物或终产物的别构反馈抑制。这些酶的有用的变体可通过取代负责反馈抑制的残基而产生。例如，酶，如高丝氨酸O-乙酰转移酶(由metA编码)被S-AM反馈抑制。为了产生高丝氨酸O-乙酰转移酶的反调节的变体，我们鉴定了高丝氨酸O-乙酰基转移酶氨基酸序列中推定的S-AM结合残基，并随后构建了质粒以表达含有具体氨基酸取代的MetA变体，预测所述的氨基酸取代为S-AM的别构调节赋予增加的抗性。表达这些变体的菌株显示甲硫氨酸的产生增加(参见下面的实施例)。

多种酶中附加的推定的S-AM结合残基包括，但不限于表9和10中列出的那些。表9和10中的一种或多种残基可用非-保守的残基，或用丙氨酸(例如，其中所述的野生型残基是除丙氨酸之外的残基)取代。序列排列证实，可能与对于S-AM的反馈-敏感性相关联的残基在来自亲缘关系疏远的细菌的多种MetA和MetY蛋白中是保守的。

标准的定点突变方法可用于构建变体，所述的变体对于别构调节较不敏感。将一个或多个PCR-扩增的基因克隆到适合的穿梭载体之后，寡核苷酸-介导的定点突变用于提供修饰的等位基因，其编码具体的氨基酸取代。可将含有野生型基因或修饰的等位基因的载体，以及控制载体，转化入谷氨酸棒杆菌或另外的适合的宿主菌株中。可筛选得到的转化体，例如，根据氨基酸产量、对S-AM的反馈抑制的抗性增加、目标酶的活性或其他本领域的技术人员公知的方法以鉴定最需要的变体等位基因。测定氨基酸产量和/或酶活性的实验可用于证实所述的筛选结果，并选出有用的变体等位基因。如高压液相色谱(HPLC)和HPLC-质谱(MS)实验的方法用来定量氨基酸和相关代谢物的水平，是本领域的技术人员公知的。

可以采用在编码序列中，通过诸如突变PCR的方法，产生随机的氨基酸取代的方法(例如，以产生变体用于筛选降低的反馈抑制或用于进一步将变异导入增强的变体序列)。例如，可以应用GeneMorpe

PCR突变试剂盒(Stratagene，La Jolla，Ca)，按照制造商的使用说明进行PCR，以获得中等的和高范围的突变频率。其他方法也是本技术领域公知的。

酶的评价可在附加酶存在的条件下进行，所述的附加酶对于所述的宿主菌株是内源的。在一些实例中，具有用来具体地评价生物合成蛋白的功能的试剂是有帮助的，所述的生物合成蛋白对于所述的生物体不是内源的(例如，游离表达的蛋白)。反馈抑制的表型实验或酶测定可用于确认生物合成酶的野生型和变体的功能。克隆的基因的功能可以通过宿主生物体(例如，所述的宿主大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌细菌)的遗传上表征的突变体的互补进行确认。许多大肠杆菌菌株可公开地从E.coli Genetic Stock Center(http://cgsc.biology.yale.edu/top.html)得到。也描述了谷氨酸棒杆菌突变体。

表达基因

细菌基因可以在宿主细菌菌株中应用本领域公知的方法表达。在一些情况下，细菌基因的过量表达(例如，异源和/或变体基因)会增加所述宿主菌株的氨基酸产生。基因的过量表达可以以多种方式得到。例如，可以表达所述基因的多个拷贝，或可以修饰基因(例如，基因的变体等位基因，或内源基因)上游的启动子、调控元件和/或核糖体结合位点用于在所述的宿主菌株中优化表达。此外，所述基因的甚至一个附加拷贝的存在可实现表达增加，即使其中所述的宿主菌株已经携带对应基因的一个或多个拷贝，其对于所述宿主菌种是天然的。可以将所述基因可操作地连接于强的结构的启动子或可诱导的启动子(例如，trc、lac)并在促使最大的氨基酸产生的条件下诱导。增强所述mRNA的稳定性的方法是本领域的技术人员所公知的，并可用于确保一直高水平地表达蛋白。参见，例如，Keasling，J.，Trends in Biotechnology 17：452-460，1999。培养基和培养条件的优化也可以增加所述基因的表达。

已经描述了促进基因在细菌中表达的方法。参见，例如，Guerrero，C，等，基因138(1-2)：35-41，1994；Eikmanns，B.J.，等Gene 102(1)：93-8，1991；Schwarzer，A.，和Puhler，A.Biotechnol.9(1)：84-7，1991；Labarre，J.，等，J Bacteriol.175(4)：1001-7，1993；Malumbres，M.，等Gene 134(1)：15-24，1993；Jensen，P.R.，和Hammer，K.Biotechnol Bioeng.158(2-3)：191-5，1998；Makrides，S.C.Microbiol Rev.60(3)：512-38，1996；Tsuchiya等Bio/Technology 6：428-431，1988；U.S.Pat.5,965,931；U.S.Pat.4,601,893和U.S.Pat.5,175,108。

应将目标基因(例如，异源或变体基因)可操作地连接于适当的启动子，如天然的和或宿主菌株-衍生的启动子、噬菌体启动子、充分表征的大肠杆菌启动子中的一种(例如tac、trp、phoA、araBAD或其变体等)。其他合适的启动子也是可得到的。在一个实施方案中，所述的异源基因可操作地连接于允许表达所述的异源基因的启动子，所述异源基因在所述宿主菌株中的表达水平比内源同源物的水平高至少2-倍、5-倍或10-倍。可以应用质粒载体，其有助于通过整合入所述的染色体赖扩增基因的方法。参见，例如，通过Reinscheid等(Appl.Environ Microbiol.60：126-132，1994)。在此方法中，将所述的完整基因克隆入可以在宿主(通常为大肠杆菌)中，但不在谷氨酸棒杆菌中复制的质粒载体。这些载体包括，例如，pSUP301(Simon等，Bio/Technol.1，784-79，1983)、pK18mob或pK19mob(Schfer等，Gene 145：69-73，1994)、PGEM-T(Promega Corp.，Madison，Wisc.，USA)、pCR2.1-TOPO(Shuman J BiolChem.269：32678-84，1994；U.S.Pat.5,487,993)、pCR.RTM.Blunt(Invitrogen，Groningen，Holland；Bernard等，JMol Biol.，234：534-541，1993)、pEM1(Schrumpf等J Bacteriol.173：4510-4516，1991)或pBGS8(Spratt等，Gene41：337-342，1996)。然后，将含有待扩增的基因的质粒载体，通过接合或转化，转入谷氨酸棒杆菌的所需菌株中。描述了接合的方法，例如，通过Schfer等(Appl Environ Microbiol.60：756-759，1994)。描述了转化的方法，例如，通过Thierbach等(Appl Microbiol Biotechnol.29：356-362，1988)、Dunican和Shivnan(Biol Technol.7：1067-1070，1989)和Tauch等(FEMS Microbiol Lett.123：343-347，1994)。通过遗传交换事件进行同源重组之后，得到的菌株含有所需的整合入所述宿主基因组的基因。

适合的表达质粒也可以包含至少一种可选择的标记。可选择的标记可为在宿主细胞中赋予抗生素抗性的核苷酸序列。这些可选择的标记包括氨苄青霉素(ampicillin)、头孢唑林(cefazolin)、力百汀(augmentin)、头孢西丁(cefoxitin)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢噻呋(ceftiofur)、头孢噻吩(cephalothin)、enrofloxicin、卡那霉素(kanamycin)、大观霉素(spectinomycin)、链霉素(streptomycin)、四环素(tetracycline)、替卡西林(ticarcillin)、替米考星(tilmicosin)或氯霉素(chloramphenicol)抗性基因。附加的可选择的标记包括基因，其可补足具体宿主菌株中存在的营养缺陷型(例如亮氨酸、丙氨酸或高丝氨酸营养缺陷型)。

在一个实施方案中，复制型载体用于表达所述的异源基因。代表性的复制型载体可包括下列：a)可选择的标记，例如，抗生素标记、如kanR(来自pACYC184)；b)大肠杆菌中的复制起点，如P15a ori(来自pACYC184)；c)谷氨酸棒杆菌中的复制起点，如在pBL1中发现的；d)启动子区段，具有或不具有伴随的阻遏基因；和e)终止子区段。所述启动子区段可为lac、trc、trcRBS、tac或λP_L/λP_R(来自大肠杆菌)，或phoA、gpd、rplM、rpsJ(来自谷氨酸棒杆菌)。所述的阻遏基因可为lacI或cI857，分别对于lac、trc、trcRBS、tac或λP_L/λP_R。所述的终止子区段可来自大肠杆菌rrnB(来自ptrc99a)、T7终止子(来自pET26)或来自谷氨酸棒杆菌的终止子区段。

在另一个实施方案中，整合型的载体用于表达所述的异源基因。代表性的整合型载体可包括：可选择的标记，例如，抗生素标记、如kanR(来自pACYC184)；b)大肠杆菌中的复制起点，如P15a ori(来自pACYC184)；c)和d)所述谷氨酸棒杆菌基因组的两个片段，其侧翼连接待替换的片段，如pck或hom基因；e)来自芽孢杆菌的sacB基因；f)启动子片段以控制所述异源基因的表达，具有或不具有伴随的阻遏基因；和g)终止子区段。所述启动子区段可为lac、trc、trcRBS、tac或λP_L/λP_R(来自大肠杆菌)，或phoA、gpd、rplM、rpsJ(来自谷氨酸棒杆菌)。所述的阻遏基因可为lacI或cI857，分别对于lac、trc、trcRBS、tac或λP_L/λP_R。所述的终止子区段可来自大肠杆菌rrnB(来自ptrc99a)、T7终止子(来自pET26)或来自谷氨酸棒杆菌的终止子区段。可能的整合型或复制型质粒，或用于构建这些质粒的试剂，不限于在这里描述的那些。其他质粒对于本领域的技术人员是熟悉的。

为了应用来自谷氨酸棒杆菌的终止子区段，可通过单基因片段提供所述的终止子和侧翼序列。在此情况下，上述的元件在所述质粒中可以下列顺序安排：标记；复制起点；所述谷氨酸棒杆菌基因组的片段，其侧翼连接待替换的片段；启动子；谷氨酸棒杆菌终止子；sacB基因。也可将所述的sacB基因置于复制起点和所述谷氨酸棒杆菌侧翼区段之间。整合和剪切导致只插入所述的启动子、终止子和目标基因。

多克隆位点可位于上述质粒元件之间的几个可能的位置之一，以促进将具体的目标基因(例如，lysC等)插入所述的质粒。对于复制型和整合型载体而言，加入接合转移的起点，如RP4mob，可促进基因在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌之间的转移。

在一个实施方案中，细菌基因在具有游离型质粒的宿主菌株中表达。合适的质粒包括在选择的宿主菌株，如谷氨酸棒杆菌中复制的那些。许多公知的质粒载体，例如pZ1(Menkel等，Applied Environ Microbiol.64：549-554，1989)、pEKExl(Eikmanns等，Gene 102：93-98，1991)或pHS2-1(Sonnen等，Gene107：69-74，1991)基于所述的隐蔽性质粒pHM1519、pBL1或pGA1。可采用的其他质粒载体包括那些基于pCG4(U.S.Pat.4,489,160)或pNG2(Serwold-Davis等，FEMS Microbiol Lett.66：119-124，1990)或pAG1(U.S.Pat.5,158,891)。可选择地，可将所述的一个或多个基因通过应用转导、转座子(Berg，D.E.和Berg，C.M.，Biol Techhol.1：417，1983)、Mu噬菌体(日本专利申请Laid-open No.2-109985)或同源或非-同源重组(Experiments in MolecularGenetics，Cold Spring Harbor Lab.，1972)的方法整合入宿主微生物的染色体。

此外，产生氨基酸有利于增加具体生物合成途径、糖酵解、回补或氨基酸输出的一种或多种酶，应用多于一个的基因或应用与其他生物合成途径基因结合的基因。

同时衰减(attenuate)具体基因产物的表达也是有利的，以最大化具体氨基酸的产生。例如，衰竭metK表达或MetK活性可通过防止甲硫氨酸向S-AM的转化来增加甲硫氨酸的产生。

将核酸导入宿主细胞的方法是本领域公知的。参见，例如，Sambrook，J.，和Russell，D.W.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3Ed.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001。合适的方法包括应用氯化钙(Mandel，M.and Higa，A.J.Mol Biol.53：159，1970)和电穿孔(Rest，M.E.van der，etal.Appl Microbiol.BiotecSnol.52：541-545，1999)或接合进行转化。

培养细菌

包含目标基因的细菌(例如，异源基因、编码具有降低的反馈抑制的酶的变体基因)可连续培养或通过分批发酵过程进行培养(分批培养)。其他商业上应用的本领域的技术人员公知的过程变化包括补料分批培养(补料过程)或重复补料分批培养(重复补料过程)。公知的培养方法的总结在Chmiel(Bioprozesstechnik 1.Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav FischerVerlag，Stuttgart，1991))的手册或Storhas(Bioreaktoren und periphereEinrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))的手册中描述。

所采用的培养基满足具体宿主菌株要求。适合多种微生物的培养基的一般描述可以在American Society for Bacteriology(Washington D.C.，USA，1981)的书“Manual of Methods for General Bacteriology”中找到，尽管本领域的技术人员会认识到所述培养基的组合常常被改变，超越单一生长要求以使产物形成最大化。

糖类和碳水化合物，例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油和脂肪，例如豆油、向日葵油、花生(ground nut)油和椰子脂；脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇类，例如甘油和乙醇；和有机酸类，例如乙酸，可单独和作为混合物被用作碳源。

含有机氮的化合物，如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆(corn steep liquor)、大豆蛋白水解物、大豆粉和尿素，或无机化合物，如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵，可以用作氮源。所述的氮源可以单独和作为混合物应用。

磷酸，硫酸二氢钾、磷酸氢二钾，或对应的含钠盐可以用作磷源。

有机和无机的含硫化合物，例如，硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐、还原性的来源，如H₂S、硫化物、硫化物的衍生物、甲硫醇、巯基乙醇酸酯(thioglycolyte)、硫氰酸盐和硫脲，可以用作硫源用于制备含硫氨基酸。

所述的培养基也可以包含金属的盐，例如，硫酸镁或硫酸铁，其对于生长是必需的。除上面提及的物质外还可应用必需的生长物质，诸如氨基酸和维生素(例如钴胺素)。而且可将合适的前体加入所述的培养基。可将提及的起始物质作为一批加入培养物，或不时地在培养过程中的多个点补加。

碱性化合物，诸如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钙、氨或氨水；或酸性化合物，诸如磷酸或硫酸，可以以合适的方式应用以控制pH。可应用消泡剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯来控制泡沫的产生。具有选择作用的合适的物质，例如抗生素，可以加入所述的培养基以保持质粒的稳定性。为了保持需氧条件，将氧气或含氧气体混合物，例如空气导入所述培养物。所述培养物的温度通常为20-45℃并优选25-40℃。培养一直持续直到形成所需产品的最大量，通常为10小时至160小时。

这种方法得到的发酵培养液可包含干重为重量百分比2.5％至25％的目标氨基酸。如果以对于发酵循环的某部分而言，优选至少发酵过程的30％，通过加糖速率限制所述生产微生物的生长和代谢的方式进行所述的发酵也是有利的。例如，所述发酵培养基中可利用的糖浓度在此时期保持在≤3g/l。

然后可将所述发酵液进一步处理。来自所述发酵液的全部或部分生物量可以通过任何液-液分离方法从所述发酵液中去除，诸如离心、过滤、倾析或其组合，或其可完全留在所述培养液中。然后将水从所述培养液中通过已知的方法去除，所述方法诸如借助于多效蒸发器(multiple-effect evaporator)、薄膜蒸发器(thin film evaporator)、降膜蒸发器(falling film evaporator)或通过反渗透(reverse osmosis)。然后可将浓缩的发酵液通过冷冻干燥、干燥、喷雾干燥、流化床干燥的方法或通过其他过程进行操作，以得到优选易流动的、细碎的粉末。

然后可将所述易流动的、细碎的粉末依次通过合适的压缩或粒化过程转化为质地粗糙的、容易流动的、可贮藏的及基本无尘的产品。在压缩或粒化过程中，应用常规的有机或无机辅助物质或载体是有利的，所述物质或载体诸如淀粉、凝胶、纤维素衍生物或类似物质，诸如通常在食品或食品加工中用作粘合剂、胶凝剂(gelling agent)或增稠剂(thickener)，或其他物质，例如，硅石(silica)、硅酸盐或硬脂酸盐。

可选地，然而，可将所述产品吸收到有机或无机载体物质上，所述的载体物质在食品加工中是公知和常规的，例如，硅石、硅酸盐、粗砂(grit)、糠(bran)、粗粉(meal)、淀粉、糖或其他，和/或与常规增稠剂或粘合剂混合并稳定的。

最后，通过应用成膜剂的涂覆过程，所述产物达到其稳定地被动物的胃，尤其是反刍动物的胃消化的状态，所述的成膜剂例如，金属碳酸盐、硅石、硅酸盐、藻酸盐(alginate)、硬脂酸盐、淀粉、树胶(gum)和纤维素醚，如在DE-C-4100920中所述。

如果所述生物量在所述过程中分离开，其他无机固体，例如，发酵过程中加入的那些，通常被除去。

在本发明的一个方面，可将所述生物量分离到直至70％的程度，优选直至80％，优选直至90％，优选直至95％，并特别优选直至100％。在本发明的另一个方面，直至20％的生物量，优选直至15％，优选直至10％，优选直至5％，特别优选没有生物量被分离。

在发酵液的溶液中形成或添加并存在的有机物质，可以通过合适的方法保持或分离。这些有机物质包括除所需L-氨基酸外的任选产生的有机副产物，和由发酵中应用的微生物任选释放的有机副产物。这些包括L-氨基酸，其选自L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸或L-色氨酸。它们包括维生素，其选自维生素B1(硫胺素)、维生素B2(核黄素)、维生素B5(泛酸)、维生素B6(吡哆醇)、维生素B12(氰钴胺素)、尼克酸/尼克酰胺和维生素E(生育酚)。它们也包括带有1至3个羧基的有机酸，诸如乙酸、乳酸、柠檬酸、马来酸或富马酸。最后，它们也包括糖类，例如，海藻糖(trehalose)。如果这些化合物改善了所述产物的营养值，那么它们就是任选需要的。

这些有机物质，包括L-和/或D-氨基酸和/或消旋混合物D，L-氨基酸，也可根据需要，在合适的过程步骤中作为浓缩物或纯物质以固体或液体形式添加。这些提及的有机物质可以单独或作为混合物加入得到的或浓缩的发酵液中，或者也在干燥或粒化的过程中加入。同样能将有机物质或几种有机物质的混合物加入发酵液中，并将其他的有机物质或几种有机物质的其他混合物在后面的过程步骤，例如粒化中加入。上述产物可用作饲料添加剂，即用于动物营养的饲料添加剂。用作饲料添加剂的氨基酸制备方法，参见，例如，WO02/18613，其内容在此并入作为参考。

实施例1.构建用于表达增加天冬氨酸-衍生的氨基酸产生的基因的载体

产生质粒，用于表达与产生天冬氨酸-衍生的氨基酸有关的基因。许多目标基因显示于图1和图2，其描述了大多数的生物合成的基因，所述基因直接涉及产生天冬氨酸-衍生的氨基酸。这些质粒，或者可以自主复制，或整合如所述的宿主谷氨酸棒杆菌染色体，通过所述的电穿孔导入棒杆菌的菌株(参见Follettie，M.T.，等J.Bacteriol.167：695-702，1993)。所有质粒包含kanR基因，其可赋予卡那霉素抗生素抗性。在含有卡那霉素(25mg/L)的培养基上选择转化体。

为了表达游离型质粒，应用隐蔽性谷氨酸棒杆菌低-拷贝pBL1质粒的衍生物构建载体(参见Santamaria等J.Gen.Microbiol.130：2237-2246，1984)。游离型质粒含有编码复制酶的序列，所述复制酶可使所述质粒在谷氨酸棒杆菌内复制；因此，这些质粒可以传代而无需整合入染色体。质粒MB3961和MB4094是所述的载体骨架，用于构建在此描述的游离型表达质粒(参见图3和图4)。对于在棒杆菌中应用而言，质粒MB4094相对于MB3961含有改进的复制起点；因此，此骨架用于大多数研究。MB3961和MB4094都含有来自pTrc99A的调控序列(参见Amann等，Gene 69：301-315，1988)。lacIq-trcIPTG-诱导启动子盒的3’部分居于多接头内，这样一来可以插入目标基因作为含有NcoI-NotI相容突出端的片段，其具有邻近目标基因的起始位点的NcoI位点(也可用额外的多接头位点，如KpnI替换所述的NotI位点)。此外，有用的启动子，诸如修饰的trc启动子(trcRBS)和谷氨酸棒杆菌gpd、rplM和rpsJ启动子可在方便的限制片段上插入所述MB3961和MB4094骨架，所述限制片段包括NheI-NcoI片段。所述的trcRBS启动子含有修饰的核糖体结合位点，该位点显示可提高蛋白的表达水平。在这些基因表达的研究中应用的启动子的序列在表7中显示。

表7.用于在棒杆菌中控制基因表达的启动子。

启动子	序列	SEQ IDNO：
			LacIq-trc	ctagctacgttgacaccatcgaatggtgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagcgcgaattgatctggtttgacagcttatcatcgactgcacggtgcaccaatgcttctggcgtcaggcagccatcggaagctgtggtatggctgtgcaggtcgtaaa

	tcactgcataattcgtgtcgctcaaggcgcactcccgttctggataatgttttttgcgccgacatcataacggttctggcaaatattctgaaatgagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagac
			LacIq-trcRBS	ctagctacgttgacaccatcgaatggtgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagcgcgaattgatctggtttgacagcttatcatcgactgcacggtgcaccaatgcttctggcgtcaggcagccatcggaagctgtggtatggctgtgcaggtcgtaaatcactgcataattcgtgtcgctcaaggcgcactcccgttctggataatgttttttgcgccgacatcataacggttctggcaaatattctgaaatgagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagagaattcaaaggaggacaac
谷氨酸	Ctagcctaaaaacgaccgagcctattgggattaccattgaagccagtgtgagttgca

棒杆菌gpd	tcacattggcttcaaatctgagactttaatttgtggattcacgggggtgtaatgtagttcataattaaccccattcgggggagcagatcgtagtgcgaacgatttcaggttcgttccctgcaaaaactatttagcgcaagtgttggaaatgcccccgtttggggtcaatgtccatttttgaatgtgtctgtatgattttgcatctgctgcgaaatctttgtttccccgctaaagttgaggacaggttgacacggagttgactcgacgaattatccaatgtgagtaggtttggtgcgtgagttggaaaaattcgccatactcgcccttgggttctgtcagctcaagaattcttgagtgaccgatgctctgattgacctaactgcttgacacattgcatttcctacaatctttagaggagacacaac
			谷氨酸棒杆菌rplM	ctagcggggttgctgcactttttaaaaaggcaaaaaatagcgaaaacacaccccaggtttttcccgtaaccccgctaggctatgcaatttcggtttaacccagtttttcaaagaaggtcactagcttttccgctggtcaccttctttttggtttttcaacgcagagatagtacactttactctttgtgtgtggagtcaaacctcccctttaaggggtgcgcttggacagcaggacaaattcgggtcaccaccggccgccgaatttagcttccttccgaacatattcctggctggcagttctagaccgactaattcaaggagtcattc
谷氨酸棒杆菌rpsJ	ctagctatttcagtgcggggcagtgaaagtaaaaacgcaactttcttacagaacagggttgtctttcagacgactatgtggttaactacttgggctgctttaacacggcgtgaattaaccatgccagttggtaaggcaaacatgacaccttcaattggagtcgaggcgcatgaaaatgcacttcaacttcagggggtatccactgaagccgggtgactggtgaaggcggaaccggagaaggggcatggcaaataaacagcggcagttacgttagggectagatcacgcattttggtcccttccgatttocctgacttcattgttgggttcatcgtggagcgttttatttgtacagcgcccgtgatccaatgtcagaagcatttgacaggtcaggttaaacactggcgttgcgcccgagccccaagcccggacaacgttatagagaaagaatgaagcgaattcccaccgcttttccaaaatggaagatgtgggacgagcgaggaagaggataagc

质粒也设计为通过基因缺失使天然谷氨酸棒杆菌基因失活。在一些实例中，这些构建体既缺失天然基因，又将异源基因插入宿主染色体的缺失事件的基因座上。表8列出了缺失的内源基因和导入的异源基因(如果有的话)。缺失质粒含有核苷酸序列，其与作为缺失事件目标的基因的上游区和下游区同源；在一些实例中，这些序列包括将被失活的基因的少量编码序列。这些侧翼序列用于促进同源重组。单交换事件(single cross-over event)将所述质粒靶向交换到宿主染色体缺失基因的上游和下游的位点。缺失质粒也包含sacB基因，其编码来自枯草芽孢杆菌的蔗糖6-果糖基转移酶(levansucrase)基因。将含有整合的质粒的转化体在缺少卡那霉素的BHI培养基上划线。1天以后，将菌落在含有10％蔗糖的BHI培养基上划线。此规程用于选择所述sacB基因已被切除的菌株，由于其聚合蔗糖以形成对谷氨酸棒杆菌有毒性的果聚糖(levan)(参见Jager，W.，等J.Bacteriol.174：5462-5465，1992)。转化体在含有蔗糖的培养基上生长的过程中，sacB允许重组事件的阳性选择，产生洁净的缺失事件或去除所述整合型质粒的所有部分，除了调控具体目标基因的诱导表达的盒(参见Jager，W.，等J.Bacteriol.174：5462-5465，1992)。应用PCR，连同在特征培养基上的生长，来证实所预期的重组事件发生在蔗糖-抗性的菌落中。图5-图12A显示了在此描述的缺失质粒。

表8.用于缺失谷氨酸棒杆菌基因，有时连同插入表达盒的质粒。

质粒	缺失的天然基因	在基因座插入的元件
			MB4083	hom-thrB	无
MB4084	thrB	无
			MB4165	mcbR	无
MB4169	hom-thrB	gpd-耻垢分枝杆菌lysC(T311I)-asd
			MB4192	hom-thrB	gpd-天蓝色链霉菌hom(G362E)-asd
MB4276	pck	gpd-耻垢分枝杆菌lysC(T311I)-asd
			MB4286	mcbR	trcRBS-T.fusca metA
MB4287	mcbR	trcRBS-谷氨酸棒杆菌metA(K233A)-metB

实施例2.分离用于增加天冬氨酸-衍生的氨基酸产生的基因

来自耻垢分枝杆菌的天冬氨酸激酶alpha(lysC-alpha)和beta(lysC-beta)以及天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)的野生型等位基因(谷氨酸棒杆菌中lysC/asd的同源物)；编码来自天蓝色链霉菌的天冬氨酸激酶-asd(lysC-asd)、dapA和hom的基因；来自Thermobifida fusca的metA和metYA和来自菊欧文氏菌的dapA和ppc，应用分离自每种生物体的基因组DNA通过PCR扩增获得。此外，在一些情况下，每个基因对应的野生型等位基因可从谷氨酸棒杆菌中分离。随后将扩增子克隆到pBluescript SK11^-用于序列验证；在具体实例中，在这些载体中也优选定点突变以产生激活的等位基因。基因组DNA从在BHI培养基中在37℃生长72小时的耻垢分枝杆菌中，应用QIAGEN Genomic-tips(Qiagen，Valencia，CA)根据试剂盒制造者的推荐进行分离。为了从天蓝色链霉菌中分离基因组DNA，对在TYE培养基(ATCC培养基1877ISP培养基1)中在25℃生长7天的细胞采用盐析步骤(Salting Out Procedure)(如Practical Streptomyces Genetics，pp.169-170，Kieser，T.等，John Innes Foundation，Norwich，England 2000)。

为了从T.fusca中分离基因组DNA，将细胞在TYG培养基(ATCC培养基741)中在50℃生长5天。将所述100ml培养物离心(5000rpm在4℃进行10分钟)和用40ml 10mM Tris、20mM EDTA pH 8.0洗涤两次。所述细胞沉淀置入终体积为40ml的10mM Tris、20mM EDTA pH 8.0。将此悬浮液经过微流化器(Microfluidizer)(Microfluidics Corporation，Newton MA)进行10个循环并收集。所述的设备用额外的20ml缓冲液冲洗并收集。裂解的细胞的终体积为60ml。DNA通过异丙醇沉淀从裂解细胞的悬浮液中沉淀，并将所述的沉淀在2ml TE pH 8.0中重悬。该样品用酚/氯仿抽提，而所述的DNA用异丙醇再次沉淀。为了从菊欧文氏菌中分离DNA，应用Genomic Tip500/G，如对于大肠杆菌的描述(Qiagen基因组规程)制备基因组DNA。

对于PCR扩增所述耻垢分枝杆菌lysC-asd操纵子，根据lysC基因的序列上游和asd终止附近的序列设计了引物。上游引物是5′-CCGTGAGCTGCTCGGATGTGACG-3′(SEQ ID NO：_)，下游引物是5′-TCAGAGGTCGGCGGCCAACAGTTCTGC-3′(SEQ ID NO：_)。所述基因应用Pfu Turbo(Stratagene，La Jolla，CA)在反应混合物中扩增，所述反应混合物含有10μl 10×Cloned Pfu缓冲液、8μl dNTP混合物(每种2.5mM)、2μl每种引物(20μM)、1μl Pfu Turbo、10ng基因组DNA和水加至终反应体积100μl。所述反应条件为94℃进行2分钟，然后是94℃进行30秒、60℃进行30秒、72℃进行9分钟的28个循环。该反应以在72℃最终延伸4分钟，并将该反应冷却到4℃而结束。得到的产物通过Qiagen凝胶提取规程进行纯化，然后是平端连入pBluescript SK II-的SmaI位点。将连接物转化入大肠杆菌DH5α，和通过蓝/白筛选进行选择。处理阳性转化体以通过Qiagen方法分离质粒DNA并测序。MB3902是得到的包含预期插入体的质粒。

用于扩增天蓝色链霉菌基因的引物对为：5′-ACCGCACTTTCCCGAGTGAC-3′(SEQ ID NO：____)和5′-TCATCGTCCGCTCTTCCCCT-3′(lysC-asd)(SEQ ID NO：__)；5′-ATGGCTCCGACCTCCACTCC-3′(SEQ ID NO：____)和5′-CGTGCAGAAGCAGTTGTCGT-3′(dapA)(SEQ ID NO：__)；和5′-TGAGGTCCGAGGGAGGGAAA-3′(SEQ ID NO：____)和5′-TTACTCTCCTTCAACCCGCA-3′(hom)(SEQ ID NO：_)。用于扩增来自T.fusca的metYA操纵子的引物对为：5′-CATCGACTACGCCCGTGTGA-3′(SEQID NO：__)和5′-TGGCTGTTCTTCACCGCACC-3′(SEQ ID NO：__)。用于扩增菊欧文氏菌基因的引物对为：5′-TTGACCTGACGCTTATAGCG-3′(SEQ IDNO：__)和5′-CCTGTACAAAATGTTGGGAG-3′(dapA)(SEQ ID NO：__)；和5′-ATGAATGAACAATATTCCGCCA-3′(SEQ ID NO：__)和5′-TTAGCCGGTATTGCGCATCC-3′(ppc)(SEQ ID NO：__)。

基因扩增通过如前的类似方法，或通过应用来自Eppendorf的TripleMaster PCR System(Eppendorf，Hamburg，Germany)完成。实施平末端连接以将复制子克隆入pBluescript SK II-的SmaI位点。得到的质粒为MB3947(天蓝色链霉菌lysC-asd)、MB3950(天蓝色链霉菌dapA)、MB4066(天蓝色链霉菌hom)、MB4062(T.fusca metYA)、MB3995(菊欧文氏菌dapA)和MB4077(菊欧文氏菌ppc)。这些质粒用于插入体的序列验证，并随后克隆入表达载体；这些载体的子集也经过定点突变以产生具体基因的反调节的等位基因。

实施例3.增加涉及天冬氨酸-衍生的氨基酸产生的基因活性的定向取代

定点突变在几个含有实施例2所述的异源基因的pBluescript SKII-质粒上进行。定点突变应用来自Stratagene的QuikChange Site-Directed MutagenesisKit进行。对于异源天冬氨酸激酶(lysC/ask)基因而言，构建取代突变，其对应于谷氨酸棒杆菌蛋白中的T311I、S301Y、A279P和G345D氨基酸取代。这些取代可通过赖氨酸和苏氨酸的组合降低反馈抑制。在所有实例中，所突变的lysC/ask等位基因在一个操纵子中与所述的异源asd基因一起表达。用于构建耻垢分枝杆菌反馈抗性lysC等位基因的寡核苷酸为：5′-GGCAAGACCGACATCATATTCACGTGTGCGCGTG-3′(SEQ ID NO：__)和5′-CACGCGCACACGTGAATATGATGTCGGTCTTGCC-3′(T311I)(SEQ IDNO：__)；5′-GGTGCTGCAGAACATCTACAAGATCGAGGACGGCAA-3′(SEQID NO：__)和5′-TTGCCGTCCTCGATCTTGTAGATGTTCTGCAGCACC-3′(S301Y)(SEQ ID NO：__)；5′-GACGTTCCCGGCTACGCCGCCAAGGTGTTCCGC-3′(SEQ ID NO：__)和5′-GCGGAACACCTTGGCGGCGTAGCCGGGAACGTC-3′(A279P)(SEQ ID NO：__)；和5′-GTACGACGACCACATCGACAAGGTGTCGCTGATCG-3′和5′-CGATCAGCGACACCTTGTCGATGTGGTCGTCGTAC-3′(G345D)(SEQ ID NO：__)。用于构建天蓝色链霉菌反馈抗性lysC等位基因的寡核苷酸为：5′-CGGGCCTGACGGACATCRTCTTCACGCTCCCCAAG-3′(SEQ ID NO：__)和5′-CTTGGGGAGCGTGAAGAYGATGTCCGTCAGGCCCG-3′(S314I/S314V)(SEQ ID NO：__)；和5′-GTCGTGCAGAACGTGTACGCCGCCTCCACGGGC-3′(SEQ ID NO：__)；和5′-GCCCGTGGAGGCGGCGTACACGTTCTGCACGAC-3′(S304Y)(SEQ ID NO：__)。

可以进行定点突变以产生与天冬氨酸-衍生的氨基酸产生相关的附加蛋白的反调控的等位基因。例如，可以产生对应于谷氨酸棒杆菌hom基因的V59A、G378E或羧基-末端截短的突变。应用Transformer Site-DirectedMutagenesis Kit(BD Biosciences Clontech)来产生天蓝色链霉菌hom(G362E)取代。应用寡核苷酸5′-GTCGACGCGTCTTAAGGCATGCAAGC-3′(SEQ IDNO：__)和5′-CGACAAACCGGAAGTGCTCGCCC-3′(SEQ ID NO：__)来构建所述的突变。也应用定点突变来产生T.fusca和谷氨酸棒杆菌metA和metY基因的特异性的等位基因(参见即时说明书的实施例5和6)。相似的策略可用于构建附加途径蛋白质的反调节的等位基因。例如，寡核苷酸5′-TTCATCGAACAGCGCTCGCACCTGCTGACCGCC-3′(SEQ ID NO：__)和5′-GGCGGTCAGCAGGTGCGAGCGCTGTTCGATGAA-3′(SEQ ID NO：__)可用于在天蓝色链霉菌pyc基因中产生取代，其对应于谷氨酸棒杆菌pyc P458S突变。定点突变也可用于导入对应于上述反调节的dapA等位基因的突变。

然后将异源(和谷氨酸棒杆菌)基因的野生型和反调控的等位基因克隆到适于表达的载体。通常，应用寡核苷酸进行PCR以便将基因作为NcoI-NotI片段进行克隆。进行DNA序列分析证实，突变不是在扩增的循环中导入的。在一些情况下，构建合成的操纵子以表达两个或多个来自相同启动子的异源或内源基因。例如，产生质粒MB4278以表达来自trcRBS启动子的谷氨酸棒杆菌metA、metY和metH基因。图12B显示MB4278中的DNA序列，其从trcRBS启动子横越至所述metH基因的结束；此构建体中的基因顺序是metAYH。图12B中的开放阅读框以大写字母显示。注意到所述构建体设计为使每个开放阅读框之前加上同样的DNA伸展(stretch)。此保守序列作为核糖体-结合序列，其促进谷氨酸棒杆菌蛋白的有效翻译。相似的基因间序列用于构建附加的合成操纵子。

实施例4：分离高丝氨酸脱氢酶的附加的苏氨酸-不敏感的突变体

克隆自实施例2中的天蓝色链霉菌的hom基因应用从Stratagene得到的GeneMorphRandom Mutagenesis试剂盒进行易错PCR。在此试剂盒规定的条件下，应用寡核苷酸引物5′-CACACGAAGACACCATGATGCGTACGCGTCCGCT-3′(含有BbsI位点和切割得到NcoI相容的突出端)(SEQ ID NO：__)和5′-ATAAGAATGCGGCCGCTTACTCTCCTTCAACCCGCA-3′(含有NotI位点)(SEQ ID NO：__)来从质粒MB4066扩增所述的hom基因。得到的突变体种群用BbsI和NotI消化，连接入NcoI/NotI消化的含有MB4094质粒骨架中的trcRBS启动子的游离型质粒，并转入谷氨酸棒杆菌ATCC13032。将转化的细胞铺于含有棒杆菌的合成培养基的琼脂平板上(参见Guillouet，S.，等Appl.Environ.Microbiol.65：3100-3107，1999)，其含有卡那霉素(25mg/L)、20mg/L的AHV(alpha-氨基beta-羟基缬氨酸；苏氨酸类似物)和0.01mM IPTG。30℃进行72小时后，对得到的转化体进行筛选，用于通过在添加苏氨酸的合成培养基琼脂平板上影印平板培养(replica plating)进行高丝氨酸分泌，所述平板上事先用指示物谷氨酸棒杆菌菌株MA-331(hom-thrBΔ)的10⁶个细胞平铺。推定的反馈-抗性突变体通过在影印平板培养的转化体周围的指示物菌株的生长环进行鉴定。所述的hom基因从这些菌落的每一个应用上述的引物对进行PCR扩增，如上所述消化该复制子，并连接如上述的游离型质粒。这些推定的hom突变体的每个后续重新转化入谷氨酸棒杆菌ATCC 13032，并涂布于含有25mg/L卡那霉素和0.01mM IPTG的基本培养基琼脂平板。来自每个转化的一个菌落在含有10，20，50和100mg/LAHV的棒杆菌合成培养基上进行影印平板培养，并根据对苏氨酸同源物抗性的最高水平进行分类。来自每组的代表在基本培养基中生长到2.0的OD，离心收获细胞，并在存在和缺失20mM苏氨酸的条件下，测定高丝氨酸脱氢酶活性，如在Chassagnole，C.，等，Biochem.J.356：415-423，2001中所引用的。所述的hom基因从那些显示反馈-抗性的培养物中PCR扩增并测序。得到的质粒用于产生表达质粒以增加氨基酸产生。

实施例5.高丝氨酸O-乙酰转移酶(metA)和O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶(met)的分离反馈-抗性突变体

将克隆自T fusca的异源metA基因应用从Stratagene得到的GeneMorph

Random Mutagenesis试剂盒进行易错PCR。在此试剂盒详述的条件下，寡核苷酸引物5′-CACACACCTGCCACACATGAGTCACGACACCACCCCTCC-3′(含有BspMI位点和得到符合NcoI的突出端的切割)(SEQID NO：__)和5′-ATAAGAATGCGGCCGCTTACTGCGCCAGCAGTTCTT-3′(含有NotI位点)(SEQ ID NO：__)用于从质粒MB4062中扩增所述的metA基因。将得到的突变体复制子消化并连接入实施例4所述的经NcoI/NotI消化的游离型质粒中，然后转化入谷氨酸棒杆菌菌株MA-428。MA-428是ATCC 13032的衍生体，所述的ATCC 13032已经用整合型质粒MB4192转化。重组事件选择之后，得到的菌株MA-428以插入反调节的天蓝色链霉菌hom基因的方式缺失hom-thrB。所述的经转化的MA-428细胞铺在含卡那霉素(25mg/L)、0.01mM IPTG和100μg/ml或500μg/ml的三氟甲硫氨酸(TFM；甲硫氨酸类似物)的基本培养基琼脂平板上。在30℃、72小时后，随后对O-乙酰高丝氨酸分泌，通过在预先铺有～10⁶个得自ATCC(#204524)的指示物菌株-酿酒酵母(S.cerevisiae)B-7588(MATa ura3-52，ura3-58，leu2-3，leu2-112，trp1-289，met2，HIS3+)的基本培养基上进行影印平板培养来筛选得到的转化体。通过O-乙酰高丝氨酸(OAH)的分泌来鉴定推定的反馈-抗性的突变体，这支持了一圈(halo)的指示物菌株环绕所述的影印平板培养的转化体的生长。

所述的metA基因从这些互养菌落中的每个应用上述引物对进行PCR扩增，用BspMI和NotI消化，并连接到实施例4所述的经NotI/NcoI消化的游离型质粒。随后将这些推定的metA突变体等位基因的每个重-转化入谷氨酸棒杆菌ATCC 13032，并铺于含有25mg/L卡那霉素的基本培养基琼脂平板上。来自每个转化的一个菌落在含有100、200、500和1000μg/L TFM加0.01mM IPTG的基本培养基上进行影印平板培养，并根据对甲硫氨酸类似物抗性的最高水平进行分类。来自每组的代表在基本培养基中生长到2.0的OD，离心收获细胞，并在存在和缺失20mM甲硫氨酸或S-AM的条件下，通过由Kredich和Tomkins(J.Biol.Chem.241：4955-4965，1966)所述的方法测定高丝氨酸O-乙酰转移酶活性。所述的metA基因从那些显示反馈-抗性的培养物中PCR扩增并测序。得到的质粒用于产生表达质粒以增加氨基酸产生。

以类似的方式，将来自T.fusca的metY基因进行诱变的PCR(mutagenicPCR)。寡核苷酸引物5′-CACAGGTCTCCCATGGCACTGCGTCCTGACAGGAG-3′(含BsaI位点和得到符合NcoI的突出端的切割)(SEQ ID NO：__)和5′-ATAAGAATGCGGCCGCTCACTGGTATGCCTTGGCTG-3′(含NotI位点)(SEQ ID NO：__)用于克隆到如前所述的游离型质粒中，并且用于通过从Stratagene得到的GeneMorph

Random Mutagenesis试剂盒的说明进行诱变反应。主要的区别在于将突变的metY种群转化入已经产生高水平的O-乙酰高丝氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株。此菌株(MICmet2)通过用含有上述在trcRBS启动子的控制下的反调节的T.fusca metA等位基因的质粒MB4286的改进型(modified version)转化MA-428进行构建。转化之后，所述的sacB选择系统实现内源的mcbR基因座的缺失并用反调节的异源metA等位基因替换。

所述的T.fusca metY变体转化的MICmet2菌株铺于含25mg/L卡那霉素、0.25mM IPTG和抑制浓度的毒性甲硫氨酸类似物(例如，乙硫氨酸(ethionine)、硒代蛋氨酸(selenomethionine)，TFM)的基本琼脂平板；所述的转化体可在这三种不同的甲硫氨酸类似物或单独一种或两种或三种组合中生长)。所述的metY基因从生长于选择平板的那些菌落中扩增，消化所述的复制子并连接到实施例4所述的游离型质粒中，并将得到的质粒转化入MICmet2。所述的转化体在含有25mg/L卡那霉素的基本培养基琼脂平板上生长。将得到的菌落在含有10-倍范围的毒性甲硫氨酸类似物乙硫氨酸、TFM和硒代甲硫氨酸(加0.01mM IPTG)的琼脂平板上进行影印平板培养，并根据类似物敏感性进行分类。来自每组的代表在基本培养基中生长到2.0的OD，离心收获细胞，并在存在和缺失20mM甲硫氨酸的条件下，通过Kredich和Tomkins(J.Biol.Chem.241：4955-4965，1966)的方法的改进型测定O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶酶活性(参见实施例9)。所述的metY基因从那些显示反馈-抗性的培养物中PCR扩增并测序。得到的质粒用于产生表达质粒以增加氨基酸产生。含有来自T.fusca的反馈抗性metY和metA变体构建如下。所述的T.fusca metYA操纵子应用寡核苷酸5′-CACACACATGTCACTGCGTCCTGACAGGAGC-3′(含PciI位点和得到符合NcoI的突出端的切割(也改变第二个密码子从Ala＞Ser))(SEQ IDNO：__)和5′-ATAAGAATGCGGCCGCTTACTGCGCCAGCAGTTCTT-3′(含NotI位点)(SEQ ID NO：__)进行扩增。所述复制子用PciI和NotI消化，并将该片段连接到上述已经用NotI、HaeIII甲基化酶和NcoI处理的游离型质粒。应用来自Stratagene的QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit进行定点突变，用于将所述的T.fusca metA和metY中的取代突变整合入表达反调节的等位基因的单质粒作为操纵子。得到的质粒用于增加氨基酸产生。

基本培养基：10g葡萄糖、1g NH₄H₂PO₄、0.2gKCl、0.2gMgSO₄-7H₂O、30μg生物素和1ml TE每升去离子水(pH 7.2)。痕量元素溶液(TE)包括：88mgNa₂B₄O₇-10H₂O、37mg(NH₄)₆Mo₇O₂₇-4H₂O、8.8mg ZnSO₄-7H₂O、270mgCuSO₄-5H₂O、7.2mg MnCl₂-4H₂O和970mg FeCl₃-6H₂O每升去离子水。(当为了满足营养缺陷型的需要，补充氨基酸和嘌呤至30mg/L终浓度。)

实施例6.在细菌的氨基酸序列中鉴定S-AM-结合残基

许多调节氨基酸产生的酶受到S-AM的变构的反馈抑制。我们假设，具有对S-AM调控的抗性(例如，通过对于S-AM结合的抗性或对于S-AM-诱导的别构效应的抗性)的这些酶的变体会是抗反馈抑制的。S-AM结合基序已经在细菌DNA甲基转移酶中得到鉴定(Roth等，J.Biol.Chem.，273：17333-17342，1998)。Roth等鉴定了对于通过酶的S-AM结合显现关键性的EcoRV α-腺嘌呤-N⁶-DNA甲基转移酶中高度保守的氨基酸基序。我们在谷氨酸棒杆菌的下列蛋白的氨基酸序列中查找相关的基序：MetA、MetY、McbR、LysC、MetB、MetC、MetE、MetH和MetK。推定的S-AM结合基序在MetA、MetY、McbR、LysC、MetB、MetC、MetH和MetK中鉴定。我们也鉴定了metY中的附加的残基，其类似于酵母蛋白中的S-AM结合基序(Pintard等，Mol.Cell Biol.，20(4)：1370-1381，2000)。每种涉及S-AM结合的蛋白的残基在表9中列出。

表9.谷氨酸棒杆菌中涉及S-AM结合的推定的残基

蛋白	涉及S-AM结合的推定的残基
		MetA	G231K233F251V253D269
MetY	G227L229D231G232G233F235D236V239F368D370D383G346K348
		McbR	G92K94F116G118D134
LysC	G208K210F223V225D236
		MetB	G72

	K74F90I92D105
		MetC	G296K298F312G314D335
MetH	G708K710F725L727
		MetK	G263K265F282G284D291

来自其他菌种的MetA和MetY序列的比对被用于鉴定附加的推定的S-AM-结合残基。这些残基在表10中列出。

表10.细菌MetA和MetY蛋白中推定的S-AM结合氨基酸

MetA和MetY基因从实施例2中所述的谷氨酸棒杆菌中克隆。表11列出了用于表达MetA和MetY基因的野生型和突变的等位基因的质粒和菌株。表12和13列出了用于表达的质粒和用于定点突变以产生MetA和MetY变体的寡核苷酸。

实施例7：制备蛋白提取物用于MetA和MetY测定

将谷氨酸棒杆菌单菌落接种到种子培养基(参见下面的实施例10)并在33℃搅拌下生长24小时。种子培养物在生产大豆培养基中(40mL)稀释为1∶20(实施例10)并生长8小时。然后通过离心收获，所述沉淀在1体积的水中洗涤1×。将所述沉淀在250μl裂解缓冲液(1ml HEPES缓冲液，pH 7.5，0.5ml 1MKOH，10μl 0.5M EDTA，加水至5ml)、30μl蛋白酶抑制物混合物(cocktail)和1体积的0.1mm酸洗过的玻璃珠中重悬。可选地将所述的混合物涡旋并保留在冰上15秒，每种重复8次。在4,000rpm离心5’后，除去所述的上清并在10,000rpm重-旋转20’。Bradford测定用于测定澄清上清中的蛋白浓度。

实施例8：在含游离型质粒的谷氨酸棒杆菌菌株中定量MetA活性

在表达内源和游离型metA基因的谷氨酸棒杆菌中测定了MetA活性。在粗蛋白提取物中应用由Kredich和Tomkins(J.Biol.Chem.241(21)：4955-4965，1966)所述的规程测定MetA活性。制备蛋白提取物在实施例7中描述。简要地，1μg蛋白提取物加入微孔板(microtiter plate)。将反应混合物(250μl；100mM tris-HCl pH 7.5，2mM 5，5′-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTN)，2mM钠EDTA，2mM乙酰CoA，2mM高丝氨酸)加入微孔板的每个孔中。在反应的过程中，MetA活性从乙酰-CoA释放CoA。在CoA和DTN之间发生二硫互换(disulfide interchange)以产生硫代硝基苯甲酸(thionitrobenzoic acid)。然后通过分光光度计测量硫代硝基苯甲酸的产生。30分钟时间段后每5分钟测定在412nm的吸光度。包括无蛋白提取物的孔作为对照。通过添加S-腺苷甲硫氨酸(S-AM；.02mM，.2mM，2mM)和甲硫氨酸(.5mM，5mM，50mM)测定MetA活性的抑制。将抑制物在其加入蛋白提取物之前直接加入所述的反应混合物。在源自含有内源和游离型谷氨酸棒杆菌MetA和MetY基因的谷氨酸棒杆菌菌株MA-442和MA-449的粗蛋白提取物中测定体外O-乙酰转移酶活性。游离型metA和metY基因表达为合成的操纵子；所述metAY操纵子的核酸序列如图12B的metAYH操纵子所示，仅缺乏metH序列。在这些游离型质粒中采用所述的trcRBS启动子。MA-442以metA-metY的顺序表达游离型基因。MA-449以metY-metA的顺序表达游离型基因。在存在和缺失IPTG的条件下进行实验，所述的IPTG诱导含有MetA和MetY基因的质粒的表达。图13显示MetA活性的时间过程(time course)。仅在所述的基因在来自8小时和20小时培养物的样品中呈MetA-MetY(MA-442)构象时，观察到MetA活性。相反，来自菌株MA-449(MetY-MetA)的提取物中的MetA活性，相对于缺少蛋白的对照样品在8小时和20小时点、诱导或不诱导都没有显著的升高。此数据与Northern印迹分析一致，当所述的两个基因为metY-metA方向时，所述Northern印迹分析显示metA的低表达。

接着，测定了来自菌株MA-442的提取物对于反馈抑制的敏感性。MA-442提取物在存在5mM甲硫氨酸、0.2mM S-AM或缺失附加的甲硫氨酸或S-AM的条件下测定，而MetA活性如上述测定。如在图14中所示，MetA活性在5mM甲硫氨酸和0.2mM S-AM存在的条件下降低。因此，降低MetA的别构阻遏可增加MetA活性，允许产生更高水平的甲硫氨酸。可能别构阻遏也会在甲硫氨酸或S-AM的更低水平观察到。无论如何，所测定的水平是菌株中生理上相应的水平，所述的菌株设计为产生氨基酸，如甲硫氨酸。构建表达游离型T fusca MetA的谷氨酸棒杆菌菌株(菌株MA-578和MA-579)或表达游离型T fusca MetA和MetY的谷氨酸棒杆菌菌株(菌株MA-456和MA-570)，并从这些菌株中制备提取物测定MetA活性。与每个游离型基因关联的调控元件在表12中列出。通过计算OD₄₁₂的变化除以时间每ng蛋白，测定每种菌株的提取物中MetA活性的比率。这些实验的结果描绘在图15中，其显示出，菌株MA-578在诱导条件下显示大约2.75单位的比率(change inOD₄₁₂的变化/时间/ng蛋白)，而该比率在非-诱导条件下大约为1。菌株MA-579在诱导条件下显示大约2.5的比率，而在非-诱导条件下大约0.4的比率。菌株MA-456，其在组成型启动子的控制下表达metA和metY，显示大约2.2的比率。菌株MA-570在诱导条件下显示大约1的比率，和在非-诱导条件下大约0.3的比率。阴性对照样品(无蛋白)显示大约0.1的比率。这些数据显示，谷氨酸棒杆菌中T.fusca metA的游离型表达提高了MetA活性的比率。所述的提高与用谷氨酸棒杆菌MetA在谷氨酸棒杆菌中的游离型表达观察到的提高很相似。

实施例9：在含游离型质粒的谷氨酸棒杆菌菌株中定量MetY活性

游离型T fusca MetY的体外活性在几种谷氨酸棒杆菌菌株中得到测定。MetY活性在谷氨酸棒杆菌粗蛋白提取物中应用Kredich和Tomkins(J.Biol.Chem.，241(21)：4955-4965，1966)的改进的规程测定。粗蛋白提取物如上述制备。简要地，900μl的反应混合物(50mM Tris pH 7.5，1mM EDTA，1mM硫化钠九水合物(Na₂S)，0.2mM吡哆醛-5-磷酸(PLP)与45μg的蛋白提取物混合。在时间0点，加入O-乙酰高丝氨酸(OAH；Toronto Research Chemicals Inc)至终浓度0.625mM。200μl的反应在0时间点立即去除。反应的剩余物在30℃温育。三个200μl样品在10分钟间隔去除。从30℃去除后，立即通过加入125μl1mM亚硝酸终止反应，所述的亚硝酸使高半胱氨酸的巯基亚硝基化以形成S-亚硝基硫醇。5分钟后，加入30μl、0.5％氨基磺酸铵(去除过剩的亚硝酸)并涡旋所述的样品。2分钟后，加入400μl的检测溶液(1份0.4N HCl中的1％HgCl2，4份0.4N HCl中的3.44％％sulfanilamide，2份0.4N HCl中的0.1％1-萘基乙二胺二盐酸化物(1-naphthylethylenediamine dihydrochloride))并将该溶液涡旋。在存在汞离子的条件下，所述的S-亚硝基硫醇快速分解得到亚硝酸，使磺胺重氮化，然后其与萘基乙二胺偶联以产生稳定的偶氮染料(azo dye)作为chromaphore。5分钟后，将该溶液转移到微量滴定盘，并测定在540nm的吸收度。包括无蛋白提取物的反应作为对照。

所述测定的结果在图16中描绘。菌株MA-456，其在组成型启动子控制下表达游离型野生型T.fusca metA和metY等位基因，显示0.04的比率。菌株MA-570，其在可诱导的启动子控制下表达游离型野生型T.fusca metA和metY等位基因，在诱导条件下显示大约0.038的比率，并在非-诱导条件下显示低于0.01的比率。因此，表达异源MetY产生显著高于内源MetY的酶活性。

表11.谷氨酸棒杆菌菌株用于测定MetA和MetY蛋白的活性，和过量表达产生天冬氨酸-衍生的氨基酸的效果

菌株名称	相关的菌株基因型	游离型质粒	相关的质粒调控序列	游离型metY菌种	游离型metA菌种
						MA-2(ATCC13032)	n/a	n/a	n/a	n/a	n/a
MA-422	MA-2的乙基硫氨酸抗性变体	n/a	n/a	n/a	n/a
						MA-428	具有Δhom-ΔthrB::谷氨酸棒杆菌gpd启	n/a	n/a	n/a	n/a

	动子-天蓝色链霉菌hom(G362E)a的MA-2衍生物
						MA-442	MA-428衍生物	MB-4135b	lacIQ-TrcRBS	Cg野生型	Cg野生型
MA-449	MA-428衍生物	MB-4138	lacIQ-TrcRBS	Cg野生型	Cg野生型
						MA-456	MA-428衍生物	MB-4168	gpd	Tf野生型	Tf野生型
MA-570	MA-428衍生物	MB-4199	lacIQ-TrcRBS	Tf野生型	Tf野生型
						MA-578	MA-428衍生物	MB-4205	gpd	无	Tf野生型
MA-579	MA-428衍生物	MB-4207	lacIQ-TrcRBS	无	Tf野生型
						MA-622	MA-422衍生物	n/a	n/a	n/a	n/a
MA-641	MA-622衍生物	MB-4136	gpd	Cg野生型	Cg野生型
						MA-699	MA-622衍生物	n/a	n/a	n/a	n/a
MA-721	MA-622衍生物	MB-4236b	lacIQ-TrcRBS	Cg野生型	Cg K233A
						MA-725	MA-622衍生物	MB-4238b	lacIQ-TrcRBS	Cg D231A	Cg野生型
MA-727	MA-622衍生物	MB-4239b	lacIQ-TrcRBS	Cg G232A	Cg野生型

缩写-Cg(谷氨酸棒杆菌)，Tf(Thermobifida fusca)，lacIQ-TrcRBS(见上文)(来自pTrc99A的lacIQ-Trc调控序列(Amann等，Gene(1988)69：301-315))；gpd(谷氨酸棒杆菌gpd启动子)

^a内源的hom(thrA)-thrB基因座用谷氨酸棒杆菌gpd(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)启动子下的天蓝色链霉菌hom(G362E)序列替换。

^b在此质粒中，基因顺序为MetA-MetY。除非另外指出，在其他质粒中所述基因顺序为MetY-MetA。

表12.用于定点突变的质粒和寡核苷酸以产生MetA和MetY变体。

质粒	寡核苷酸1	寡核苷酸2	基因	野生型/变体	生物体
						MB4238	MO4057	MO4058	MetY	D231A	谷氨酸棒杆菌
n/a	MO4045	MO4046	MetY	D244A	T.fusca
						n/a	MO4041	MO4042	MetA	D287A	T.fusca
n/a	MO4049	MO4050	MetY	D394A	T.fusca
						n/a	MO4039	MO4040	MetA	F269A	T.fusca
n/a	MO4047	MO4048	MetY	F379A	T.fusca
						MB4239	MO4059	MO4060	MetY	G232A	谷氨酸棒杆菌
n/a	MO4043	MO4044	MetY	G240A	T.fusca
						n/a	MO4037	MO4038	MetA	G81A	T.fusca
MB4236	MO4051	MO4052	MetA	K233A	谷氨酸棒杆菌
						MB4135	n/a	n/a	MetA	野生型	谷氨酸棒杆菌
MB4135	n/a	n/a	MetY	野生型	谷氨酸棒杆菌
						MB4210	n/a	n/a	MetY	野生型	T.fusca
MB4210	n/a	n/a	MetA	野生型	T.fusca

表13.用于定点突变以产生MetA和MetY变体的寡核苷酸序列。

寡核苷        寡核苷酸序列        SEQ ID

酸名称                                                NO：

MO4037 5′GTAGGCCCGGAAGGCCCCGCGCACCCCAGCCCAGGCTGG 3′

MO4038 5′CCAGCCTGGGCTGGGGTGCGCGGGGCCTTCCGGGCCTAC 3′

MO4039 5′CCGATGGCCGGGGGCCGGGCCGCTGTCGAGTCGTACCTG 3′

MO4040 5′CAGGTACGACTCGACAGCGGCCCGGCCCCCGGCCATCGG 3′

MO4041 5′AAACTCGCCCGCCGGTTCGCCGCGGGCAGCTACGTCGTG 3′

MO4042 5′CACGACGTAGCTGCCCGCGGCGAACCGGCGGGCGAGTTT 3′

MO4043 5′CACGGCACCACGATCGCGGCCATCGTGGTGGACGCCGGC 3′

MO4044 5′GCCGGCGTCCACCACGATGGCCGCGATCGTGGTGCCGTG 3′

MO4045 5′ATCGCGGGCATCGTGGTGGCCGCCGGCACCTTCGACTTC 3′

MO4046 5′GAAGTCGAAGGTGCCGGCGGCCACCACGATGCCCGCGAT 3′

MO4047 5′ATCGAGGCCGGACGCGCCGCCGTGGACGGCACCGAACTG 3′

MO4048 5′CAGTTCGGTGCCGTCCACGGCGGCGCGTCCGGCCTCGAT 3′

MO4049 5′CAGCTCGTCAACATCGGTGCCGTGCGCAGCCTCATCGTC 3′

MO4050 5′GACGATGAGGCTGCGCACGGCACCGATGTTGACGAGCTG 3′

MO4051 5′GACGAACGCTTCGGCACCGCAGCCCAAAAGAACGAAAAC 3′

MO4052 5′GTTTTCGTTCTTTTGGGCTGCGGTGCCGAAGCGTTCGTC 3′

MO4057 5′CTGGGCGGCGTGCTTATCGCCGGCGGAAAGTTCGATTGG 3′

MO4058 5′CCAATCGAACTTTCCGCCGGCGATAAGCACGCCGCCCAG 3′

MO4059 5′GGCGGCGTGCTTATCGACGCCGGAAAGTTCGATTGGACT 3′

MO4060 5′AGTCCAATCGAACTTTCCGGCGTCGATAAGCACGCCGCC 3′

实施例10：产生和检测天冬氨酸-衍生的氨基酸的方法

对于摇瓶产生天冬氨酸-衍生的氨基酸，将每个菌株从琼脂平板接种到125ml Erlenmeyer摇瓶的10ml的种子培养基(Seed Culture Medium)中。所述的种子培养基在250rpm在摇床上在31℃温育16小时。通过将种子培养基进行1∶20稀释到125ml Erlenmeyer摇瓶的10ml的批式培养基中来制备监测氨基酸生产的培养基。合适时，将IPTG加入一组培养物中以诱导表达所述的IPTG调控的基因(终浓度0.25mM)。甲硫氨酸发酵在31℃搅拌下(250rpm)进行60-66小时。对于在这里报道的研究，在几乎所有的情况下，将多个转化体平行发酵，而且每个转化体常常一式两份生长。大多数的报道的数据点反映出代表转化体的至少两次发酵的平均，连同在相同时间生长的对照菌株。

培养之后，应用液相色谱-质谱(LCMS)测定所得到的发酵液中的氨基酸水平。收获大约1ml的培养物，并离心为沉淀细胞和颗粒碎片。所得上清的一部分1∶5000稀释到水性的0.1％甲酸并以10μl的部分注射到反相HPLC柱(Waters Atlantis C18，2.1×150mm)上。在0.350mLmin^-1的流速应用乙腈中的0.1％甲酸(″B″)和水中的0.1％甲酸(″A″)的梯度混合物洗脱化合物(1％B→50％B超过4分钟，保持在50％B进行0.2分钟，50％B→1％超过1分钟，保持在1％进行1.8分钟)。应用正电喷射离子化(positive electrospray ionization)用三倍-quadropole质谱仪检测洗脱化合物。所述仪器以MRM模式操作以检测氨基酸(赖氨酸：147→84(15eV)；甲硫氨酸：150→104(12eV)；苏氨酸/高丝氨酸：120→74(10eV)；天冬氨酸：134→88(15eV)；谷氨酸：148→84(15eV)；O-乙酰高丝氨酸：162→102(12eV)和高半胱氨酸：136→90(15eV))。有时，应用相似的方法定量附加的氨基酸(例如高半胱氨酸、甘氨酸、S-腺苷甲硫氨酸)。个别的氨基酸通过与在同样条件下注射的氨基酸标准进行比较来定量。应用此质谱仪的方法，不可能区别高丝氨酸和苏氨酸。因此，必要时，样品也用荧光标记衍生并进行液相色谱，然后是荧光检测。此方法用于分辨高丝氨酸和苏氨酸，以及确认用LCMS方法测定的浓度。

用于生产实验的种子培养基

葡萄糖            100g/L

乙酸铵            3g/L

KH₂PO₄            1g/L

MgSO₄-7H₂O        0.4g/L

FeSO₄-7H₂O        10mg/L

MnSO₄-4H₂O        10mg/L

生物素            50μg/L

硫胺素-HCl        200μg/L

大豆蛋白          15ml/L

水解产物(总氮7％)

酵母提取物        5g/L

pH7.5

用于生产实验的分批生产培养基

葡萄糖            50g/L

(NH₄)₂SO₄         45g/L

KH₂PO₄            1g/L

MgSO₄-7H₂O        0.4g/L

FeSO₄-7H₂O        10mg/L

MnSO₄-4H₂O        10mg/L

生物素            50μg/L

硫胺素-HCl        200μg/L

大豆蛋白          15ml/L

水解产物(总氮7％)

CaCO₃             50g/L

钴胺素            1g/ml

pH7.5

(当赖氨酸是目标天冬氨酸-衍生的氨基酸时，不需添加钴胺素)

实施例11：异源野生型和突变体lysC变体在谷氨酸棒杆菌和乳发酵短杆菌中增加赖氨酸产生。

天冬氨酸激酶对于在棒杆菌中产生赖氨酸常常是速率-限制活性。调控天冬氨酸激酶活性的主要机理是通过赖氨酸和苏氨酸的组合别构调节。编码天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶的异源操纵子克隆自耻垢分枝杆菌和天蓝色链霉菌，如实施例2中所述。定点突变产生反调节的等位基因(参见实施例3)，并将这些修饰的基因插入适合在棒杆菌中表达的载体(实施例1)。将所得的质粒和野生型对应物(counterpart)转化入菌株，包括野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC 13032和野生型乳发酵短杆菌菌株ATCC 13869，分析其赖氨酸产生(图17)。

菌株MA-0014、MA-0025、MA-0022、MA-0016、MA-0008和MA-0019包含具有MB3961骨架的质粒(参见实施例1)。通过向生产培养基中添加IPTG，野生型或反调节的异源lysec-asd操纵子表达增加促进赖氨酸的产生。菌株ATCC 13869是这些菌株的未转化的对照。含有耻垢分枝杆菌S301Y、T311I和G345D等位基因的质粒在增加赖氨酸产生是最有效的；选择这些等位基因用于从改进的载体中表达。将含有反调节的耻垢分枝杆菌等位基因的改进的载体转化入谷氨酸棒杆菌(ATCC 13032)以产生菌株MA-0333、MA-0334、MA-0336、MA-0361和MA-0362(质粒含有trcRBS或gpd启动子，MB4094骨架；参见实施例1)。菌株ATCC 13032(A)是菌株MA-0333、MA-0334和MA-0336的未转化的对照。菌株ATCC 13032(B)是菌株MA-0361和MA-0362的未转化的对照。菌株MA-0333、MA-0334、MA-0336、MA-0361和MA-0362都显示赖氨酸产生的改进。例如，菌株MA-0334由50g/L葡萄糖产生超过20g/L的赖氨酸。此外，当由所述的trcRBS或gpd启动子表达时，显示所述的T311I和G345D等位基因是有效的。

实施例12：天蓝色链霉菌hom G362E变体在谷氨酸棒杆菌菌株MA-0331中增加向高丝氨酸的碳流

如在实施例11中所示，反调节天冬氨酸激酶增加向天冬氨酸-衍生的氨基酸的碳流。原则上，天冬氨酸激酶活性可以通过利用反调节的lysC等位基因和/或通过消除介导所述别构调节的小分子(赖氨酸或苏氨酸)来增加。图18(菌株MA-0331)显示，当所述的hom-thrB基因座被失活时，发酵液中积累了高水平的赖氨酸。hom和thrB分别编码高丝氨酸脱氢酶和高丝氨酸激酶，这两种蛋白是产生苏氨酸必需的。当仅仅缺失所述的thrB基因时，也观察到赖氨酸积累(参见图21的菌株MA-0933(MA-0933是一个实例，尽管将MA-0933与MA-0331直接比较是不合适的，因为这些菌株来自不同的遗传背景)。

为了增加向甲硫氨酸途径中间物的碳流，将天蓝色链霉菌hom基因的推定的反调节的变体转化入MA-0331。类似的策略用于构建包含只有thrB缺失的菌株。菌株MA-0384、MA-0386和MA-0389分别含有在rplM、gpd和trcRBS启动子控制下的天蓝色链霉菌hom G362E变体。这些质粒也包含附加的取代(G43S)，其作为定点突变策略的部分被导入；后续的实验证实，所述的G43S取代不增加hom活性。图18显示应用菌株MA-0331、MA-0384、MA-0386和MA-0389进行的摇瓶实验的结果，在所述菌株的发酵液中分析天冬氨酸-衍生的氨基酸，包括赖氨酸和高丝氨酸。表达天蓝色链霉菌hom G362E基因的菌株显示赖氨酸产生的显著下降，以及高丝氨酸水平的显著增加。高丝氨酸的发酵液水平在菌株如MA-0389中超过5g/L。可能显著水平的高丝氨酸仍然保留在细胞内或者一些高丝氨酸已经被转化为附加产物。过量表达反调节的lysC和hom下游的其他基因，连同hom，可增加高丝氨酸-基的氨基酸，包括甲硫氨酸的产生(参见如下)。

实施例13：异源磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(Ppc)酶增加向天冬氨酸-衍生的氨基酸的碳流。

磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(Ppc)，连同丙酮酸羧化酶(Pyc)，催化草酰乙酸(OAA)的合成，所述的草酰乙酸是柠檬酸循环(citric acid cycle)中间物，其直接流入天冬氨酸-衍生的氨基酸的产生。将所述的野生型菊欧文氏菌ppc基因克隆入IPTG诱导的trcRBS启动子控制下的表达载体。将此质粒转化入高赖氨酸菌株MA-0331和MA-0463(图19)。菌株在缺失或存在IPTG的条件下生长，并分析天冬氨酸-衍生的氨基酸，包括天冬氨酸的产生。菌株MA-0331包含hom-thrBΔ突变，而MA-0463包含在缺失的hom-thrB基因座整合的耻垢分枝杆菌lysC(T311I)-asd操纵子；所述的溶解-酶操纵子在所述谷氨酸棒杆菌gpd启动子的控制下。图19显示，菊欧文氏菌ppc基因增加天冬氨酸的积累。此差别在将大部分可得到的天冬氨酸转化为赖氨酸的菌株中甚至是可以检测的。

实施例14：异源二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)酶增加赖氨酸产生。

二氢吡啶二羧酸合酶是分支点酶，其将碳用于赖氨酸生物合成而不用于产生高丝氨酸-基的氨基酸。DapA将天冬氨酸-B-半醛转化为2，3-二氢吡啶二羧酸。将野生型菊欧文氏菌和天蓝色链霉菌dapA基因克隆入trcRBS和gpd启动子控制下的表达载体中。将得到的质粒转化入菌株MA-0331和MA-0463，这两种菌株已经被改造以产生高水平的赖氨酸(参见实施例13)。MA-0463已被改造以增加耻垢分枝杆菌lysC(T311I)-asd操纵子的表达。预期此操作驱动天冬氨酸-B-半醛(DapA催化反应的底物)的产生，菌株MA-0481、MA-0482、MA-0472、MA-0501、MA-0502、MA-0492、MA-0497在摇瓶中生长，并分析所述发酵液的天冬氨酸-衍生的氨基酸，包括赖氨酸。如图20所示，菊欧文氏菌或天蓝色链霉菌dapA基因增加的表达使MA-0331和MA-0463背景中的赖氨酸产生增加。菌株MA-0502在50g/L葡萄糖过程产生大约35g/L赖氨酸。于是可能通过构建这些异源dapA基因的反调节的变体以得到进一步提高赖氨酸。

实施例15：构建产生高水平高丝氨酸的菌株。

通过基因工程和突变策略的组合，可以产生高水平高丝氨酸-基的氨基酸的菌株。例如，进行五种不同的基因操作以构建MA-1378，该菌株产生＞10g/L高丝氨酸(图21)。为了产生MA-1378，首先将野生型谷氨酸棒杆菌应用亚硝基胍(NTG)突变进行突变(根据在″A short course in bacterial genetics.″J.H.Miller.Cold Spring Harbor Laboratory Press.1992，page 143中描述的规程)，然后选择在含有高水平乙硫氨酸(毒性的甲硫氨酸类似物)的基本平板上生长的菌落。然后在一个得到的乙硫氨酸-抗性菌株(MA-0422)中，应用质粒MB4154将内源mcbR基因座缺失以产生菌株MA-0622。McbR是转录阻遏物，其调控产生含硫氨基酸，如甲硫氨酸所必需的几种基因的表达(参见Rey，D.A.，Puhler，A.和Kalinowski，J.，J.Biotechnology 103：51-65，2003)。在几种情况下，我们观察到McbR的失活产生高丝氨酸-基的氨基酸水平增加的菌株。质粒MB4084用于在MA-0622中缺失所述的thrB基因座，产生赖氨酸和高丝氨酸的积累；甲硫氨酸和甲硫氨酸途径中间物也积累到较低的程度。由此操作得到MA-0933。如前所述，人们相信所述的赖氨酸和高丝氨酸积累是通过苏氨酸产生的缺乏反调节lysC的结果。为了进一步优化向天冬氨酸-B-半醛和下游氨基酸的碳流，用表达耻垢分枝杆菌lysC(T311I)-asd操纵子(菌株MA-1162)的游离型质粒转化MA-0933。然后将高水平高丝氨酸产生菌株MA-1162用NTG突变，并在含一定水平甲硫氨酸氯化甲锍(methionine methylsulfoniumchloride)(MMSC)的基本培养基平板上筛选菌落，所述的MMSC通常是抑制生长的。MA-1378是一株这样的MMSC-抗性菌株。

实施例16：异源高丝氨酸乙酰基转移酶(MetA)酶增加向高丝氨酸-基的氨基酸的碳流。

MetA是甲硫氨酸生物合成的规定步骤。将野生型T.fusca metA基因克隆到在trcRBS启动子控制下的表达载体。将此质粒转化到高水平高丝氨酸产生菌株中以检测增加的MetA活性(图22和23)。MA-0428、MA-0933和MA-1514是高水平高丝氨酸产生菌株的实例。MA-0428是野生型ATCC 13032衍生物，其已经用质粒MB4192(参见实施例1)改造以缺失所述的hom-thrB基因座，并整合所述的gpd-天蓝色链霉菌hom(G362E)表达盒。通过应用新生霉素(novobiocin)以允许来自菌株MA-1378的耻垢分枝杆菌lysC(T311I)-asd操纵子质粒的丢失来构建MA-1514。进行此操作以允许用含有T.fusca metA基因和kanR可选择标记的游离型质粒进行转化。菌株MA-1559通过用在trcRBS启动子控制下的T fusca metA基因转化菌株MA-1514产生。MA-0933如实施例15中所述。在这些高水平高丝氨酸菌株的每株中诱导T.fusca metA的表达，导致在培养物发酵液中积累O-乙酰高丝氨酸。例如，菌株MA-1559显示OAH水平超过9g/L。可以进行附加的操作以引起OAH转化为其他产物，包括甲硫氨酸。

实施例17：metA变体对于在谷氨酸棒杆菌中产生甲硫氨酸的效果。

通过MetA-编码DNA的定点突变(实施例6)产生谷氨酸棒杆菌高丝氨酸乙酰基转移酶(MetA)变体。将谷氨酸棒杆菌菌株MA-0622和MA-0699用高拷贝质粒MB4236转化，所述高拷贝质粒MB4236编码在位点233具有赖氨酸到丙氨酸突变的MetA(MetA(K233A))。此质粒也包含谷氨酸棒杆菌metY基因的野生型拷贝。通过用质粒MB4192转化MA-0622以缺失hom-thrB基因座并整合所述的gpd-天蓝色链霉菌hom(G362E)表达盒来构建菌株MA-0699。metA和metY以在trc启动子的改进型的控制下合成的metAY操纵子进行表达。将所述的菌株在存在和缺少IPTG诱导的条件下培养，并测定甲硫氨酸生产力。来自每个菌株的甲硫氨酸产生绘制在图24。如所示，当MA-622和MA-699的单独转化体在诱导条件下培养时，每种产生超过3000μM甲硫氨酸。MA-699菌株，其在组成型启动子的控制下表达天蓝色链霉菌hom G362E变体，在缺乏IPTG的条件下产生超过3000μM甲硫氨酸。IPTG诱导导致甲硫氨酸产生增加1000-2500μM。这些数据显示，MetA(K233A)的表达增加了甲硫氨酸产生。甲硫氨酸生物合成在多点的操作可进一步增加生产。

实施例17：metY变体对于在谷氨酸棒杆菌中产生甲硫氨酸的效果

通过MetA-编码DNA的定点突变(实施例6)产生谷氨酸棒杆菌高丝氨酸乙酰基转移酶(MetA)变体。将谷氨酸棒杆菌菌株MA-0622和MA-0699用高拷贝质粒MB4238转化，所述高拷贝质粒MB4238编码在位点231具有天冬氨酸到丙氨酸突变的MetY(MetY(D231A))。此质粒也包含谷氨酸棒杆菌metA基因的野生型拷贝，如实施例16中表达。将所述的菌株在存在和缺少IPTG诱导的条件下培养，并测定甲硫氨酸生产力。来自每个菌株的甲硫氨酸产生绘制在图25中。如所示，当MA-622的单独转化体在诱导表达MetY(D231A)的条件下培养时，每种产生超过1800μM甲硫氨酸。MA-622菌株显示，由单独的转化体产生的甲硫氨酸水平不同(即，诱导时转化体1和2产生大约1800μM甲硫氨酸，而诱导时转化体3和4产生超过4000μM甲硫氨酸)。MA-699菌株，其表达天蓝色链霉菌Hom变体，在缺乏IPTG的条件下产生大约3000μM甲硫氨酸。IPTG诱导使甲硫氨酸产生增加1500-2000μM；这些数据显示MetY(D231A)的表达增加甲硫氨酸产生。甲硫氨酸产生也在菌株MA-699中，相对于MA-622中增加。MetY(D231A)在菌株MA-699中表达在那种菌株中进一步增加甲硫氨酸产生。

metY的第二个变体等位基因在谷氨酸棒杆菌表达，并测定其对于产生甲硫氨酸的效果。将谷氨酸棒杆菌菌株MA-622和菌株MA-699用高拷贝质粒MB4239转化，所述高拷贝质粒MB4239编码在位点232具有甘氨酸到丙氨酸突变的MetY(MetY(G232A))。将所述的菌株在存在和缺少IPTG诱导的条件下培养，并测定甲硫氨酸生产力。来自每个菌株的甲硫氨酸产生绘制在图26中。如所示，当MA-622的单独转化体在诱导表达MetY(G232A)的条件下培养时，每种产生超过1700μM甲硫氨酸。在缺乏IPTG的条件下MA-699菌株产生大约3000μM甲硫氨酸。IPTG诱导使甲硫氨酸产生增加2000-3000μM。这些数据显示MetY(G232A)的表达增加甲硫氨酸产生。甲硫氨酸产生也在菌株MA-699中，相对于MA-622增加。MetY(G232A)在菌株MA-699中表达在那种菌株中进一步增加甲硫氨酸产生。

实施例18：在表达metA和metY野生型和突变体等位基因的谷氨酸棒杆菌菌株中产生甲硫氨酸

在五种不同的谷氨酸棒杆菌菌株中测定甲硫氨酸产生。这些菌株中的四种表达游离型谷氨酸棒杆菌metA和metY等位基因的唯一组合，如在表14中所列出。第五种菌株MA-622不包含游离型metA或metY等位基因。由每株菌株产生的甲硫氨酸的量(g/L)列于表14中。

在表达野生型metA和变体metY组合，或野生型metY和变体metA组合的菌株中观察到产生甲硫氨酸的最高水平。

表14.在表达谷氨酸棒杆菌metA和metY野生型和突变体等位基因的菌株中产生甲硫氨酸

菌株	IPTG	metA等位基因	metY等位基因	甲硫氨酸(g/L)
					MA-622	-	无	无	0.00
MA-641	-	野生型	野生型	0.03
					MA-721	-	K233A	野生型	0.00
MA-721	+	K233A	野生型	0.53
					MA-725	-	野生型	D231A	0
MA-725	+	野生型	D231A	0.28
					MA-727	-	野生型	G232A	0
MA-727	+	野生型	G232A	0.37

实施例19：组合基因操作，应用异源和天然基因，得到天冬氨酸-衍生的氨基酸的生产

如前所述，基因组合可优化产生天冬氨酸-衍生的氨基酸的棒杆菌。下面是显示多个操作怎样增加甲硫氨酸产生的实例。图27显示分别由菌株MA-2028和MA-2025连同来自它们亲代菌株MA-1906和MA-1907的效价(titer)产生几种天冬氨酸-衍生的氨基酸。通过应用质粒MB4276以缺失MA-0622中天然的pck基因座并以用于组成型表达所述耻垢分枝杆菌lysC(T311I)-asd操纵子的盒替换pck来构建MA-1906。通过MB4276类似地转化入MA-0933来产生MA-1907。MA-2028和MA-2025通过用MB4278转化各自的亲代来构建，所述的MB4278是游离型质粒，用于诱导表达合成的谷氨酸棒杆菌metAYH操纵子(参见实施例3)。亲代菌株MA-1906和MA-1907分别产生赖氨酸或赖氨酸和高丝氨酸；甲硫氨酸和甲硫氨酸途径中间物也通过这些菌株产生。赖氨酸和高丝氨酸的标度在左边y-轴上；甲硫氨酸和O-乙酰高丝氨酸的标度在右边y-轴上。在IPTG诱导下，MA-2028显示赖氨酸水平的降低和甲硫氨酸水平的升高。MA-2025也显示依赖于IPTG的赖氨酸产生的下降，连同甲硫氨酸和O-乙酰高丝氨酸产生的增加。

菌株MA-1743是组合的改造怎样能用于产生生产甲硫氨酸的菌株的实例。MA-1743通过用metAYH表达质粒MB4278转化MA-1667来产生。MA-1667通过首先用质粒MB4084改造菌株MA-0422(参见实施例15)以缺失thrB，然后应用质粒MB4286以缺失mcbR基因座并用含有trcRBS-T.fuscametA表达盒替换mcbR来构建。在此实施例和在trcRBS已经以单拷贝整合的其他实施例中，表达看起来并不如用游离型质粒看起来那样紧密地调控(如通过氨基酸产生作为判断)。这可能是由于lacIq抑制物蛋白的水平降低的原因。菌株MA-1743的IPTG诱导引起甲硫氨酸和途径中间物，包括O-乙酰高丝氨酸的产生(图28；赖氨酸和高丝氨酸的标度在左边的y-轴上；甲硫氨酸和O-乙酰高丝氨酸的标度在右边y-轴上)。

菌株MA-1688和MA-1790是两株用多个基因进行改造的附加菌株，所述的多个基因包括MB4278metAYH表达质粒(参见图29；赖氨酸和高丝氨酸的标度在左边的y-轴上；甲硫氨酸和O-乙酰高丝氨酸的标度在右边y-轴上)。用MB4278转化MA-0569产生MA-1688。通过顺序地应用MB4192和MB4165以首先缺失hom-thrB基因座并整合gpd-天蓝色链霉菌hom(G362E)表达盒然后缺失mcbR来构建MA-0569。构建MA-1790需要几步。首先，根据允许沙门氏菌metE突变体生长的能力，鉴定MA-0428的NTG突变体衍生物。简言之，将突变的MA-0428细胞的种群铺于含有苏氨酸和菌苔(lawn)的基本培养基上(＞10⁶个沙门氏菌metE突变体细胞)。所述的沙门氏菌metE突变体生长需要甲硫氨酸。目视检查之后，分离由一圈沙门氏菌生长环绕的棒杆菌菌落(例如MA-0600)，并进行摇瓶分析。接着将菌株MA-600突变为如上所述的乙硫氨酸抗性，一株得到的菌株命名为MA-0993。然后从MA-0993中应用质粒MB4165将所述的mcbR基因座缺失，而MA-1421是此操作的产物。用MB4278转化MA-1421产生MA-1790。图29显示IPTG诱导在MA-1688和MA-1790中刺激甲硫氨酸产生，并降低赖氨酸和高丝氨酸效价。

图30显示菌株MA-1668及其亲代菌株的代谢水平。赖氨酸和高丝氨酸的标度在左边y-轴上；甲硫氨酸和O-乙酰高丝氨酸的标度在右边y-轴上。菌株MA-1668通过用质粒MB4287转化MA-0993来产生。以MB4287的操作产生mcbR基因座的缺失并用谷氨酸棒杆菌metA(K233A)-metB来替换。菌株MA-1668产生大约2g/L甲硫氨酸，相对于其来源菌株具有赖氨酸和高丝氨酸水平的降低。菌株MA-1668对于更多轮的分子变换(molecular manipulation)而言仍是经得起检验的。

表15列出了在这些研究中应用的菌株。所述的′::′术语显示，将′::′后的表达构建体整合在′::′之前指定的基因座。EthR6和EthR10代表了独立分离的乙硫氨酸抗性突变体。所述的Mcf3突变赋予了使沙门氏菌(Salmonella)metE突变体生长的能力(参见实施例19)。所述的Mms13突变赋予了甲硫氨酸氯化甲锍抗性(参见实施例15)。

表15.在此描述的研究中应用的菌株。

名称	菌株基因型
		MA-0002	是ATCC 13032
MA-0003	是ATCC 13869
		MA-0008	lacIq-trc-天蓝色链霉菌lysC-asd(A191V)(游离型)
MA-0014	lacIq-trc-耻垢分枝杆菌lysC-asd(游离型)
		MA-0016	lacIq-trc-耻垢分枝杆菌lysC(G345D)-asd(游离型)
MA-0019	lacIq-trc-天蓝色链霉菌lysC(S314I)-asd(A191V)(游离型)
		MA-0022	lacIq-trc-耻垢分枝杆菌lysC(T311I)-asd(游离型)
MA-0025	lacIq-trc-耻垢分枝杆菌lysC(S301Y)-asd(游离型)
		MA-0331	Δhom-ΔthrB
MA-0333	lacIq-trcRBS-耻垢分枝杆菌lysC(S301Y)-asd(游离型)
		MA-0334	lacIq-trcRBS-耻垢分枝杆菌lysC(T311I)-asd(游离型)
MA-0336	lacIq-trcRBS-耻垢分枝杆菌lysC(G345D)-asd(游离型)
		MA-0361	gpd-耻垢分枝杆菌lysC(T311I)-asd(游离型)
MA-0362	gpd-耻垢分枝杆菌lysC(G345D)-asd(游离型)
		MA-0384	Δhom-ΔthrB+rplM-天蓝色链霉菌hom(G362E；G43S)(游离型)
MA-0386	Δhom-ΔthrB+gpd-天蓝色链霉菌hom(G362E；G43S)(游离型)
		MA-0389	Δhom-ΔthrB+lacIq-trcRBS-天蓝色链霉菌hom(G362E；G43S；K19N)(游离型)
MA-0422	EthR6
		MA-0428	Δhom-ΔthrB::gpd-天蓝色链霉菌hom(G362E；G43S)
MA-0442	Δhom-ΔthrB+gpd-天蓝色链霉菌hom(G362E；G43S)+lacIq-

	trcRBS-谷氨酸棒杆菌metA-RBS-谷氨酸棒杆菌metY(游离型)
		MA-0449	Δhom-ΔthrB+gpd-天蓝色链霉菌hom(G362E；G43S)+lacIq-trcRBS-谷氨酸棒杆菌metY-RBS-谷氨酸棒杆菌metA(游离型)
MA-0456	Δhom-ΔthrB::gpd-天蓝色链霉菌hom(G362E；G43S)+gpd-T.fusca metY-RBS-T.fusca metA(游离型)
		MA-0463	Δhom-ΔthrB::gpd-耻垢分枝杆菌lysC(T311I)-asd
MA-0466	Δhom-ΔthrB+lacIq-trcRBS-菊欧文氏菌ppc(游离型)
		MA-0472	Δhom-ΔthrB+gpd-天蓝色链霉菌dapA(游离型)
MA-0477	Δhom-ΔthrB+lacIq-trcRBS-天蓝色链霉菌dapA(游离型)
		MA-0481	Δhom-ΔthrB+gpd-菊欧文氏菌dapA(游离型)
MA-0482	Δhom-ΔthrB+lacIq-trcRBS-菊欧文氏菌dapA(游离型)
		MA-0486	Δhom-ΔthrB::gpd-耻垢分枝杆菌lysC(T311I)-asd+lacIq-trcRBS-菊欧文氏菌ppc(游离型)
MA-0492	Δhom-ΔthrB::gpd-耻垢分枝杆菌lysC(T311I)-asd+gpd-天蓝色链霉菌dapA(游离型)
		MA-0497	Δhom-ΔthrB::gpd-耻垢分枝杆菌lysC(T311I)-asd+lacIq-trcRBS-天蓝色链霉菌dapA(游离型)
MA-0501	Δhom-ΔthrB::gpd-耻垢分枝杆菌lysC(T311I)-asd+gpd-菊欧文氏菌dapA(游离型)
		MA-0502	Δhom-ΔthrB::gpd-耻垢分枝杆菌lysC(T311I)-asd+lacIq-trcRBS-E.chrysayathemi dapA(游离型)
MA-0569	ΔmcbR+Δhom-ΔthrB::gpd-天蓝色链霉菌hom(G362E；G43S)
		MA-0570	Δhom-ΔthrB+gpd-天蓝色链霉菌hom(G362E；G43S)+lacIq-trcRBS-T.fusca metY-RBS-T.fusca metA(游离型)
MA-0578	Δhom-ΔthrB+gpd-天蓝色链霉菌hom(G362E；G43S)+gpd-T.fusca metA(游离型)
		MA-0579	Δhom-ΔthrB+gpd-天蓝色链霉菌hom(G362E；G43S)+lacIq-trcRBS-T.fusca metA(游离型)
MA-0600	Δhom-ΔthrB+gpd-天蓝色链霉菌hom(G362E；G43S)+Mcf3
		MA-0622	ΔmcbR+EthR6

MA-0641	ΔmcbR+EthR6+gpd-谷氨酸棒杆菌metA-RBS-谷氨酸棒杆菌metY(游离型)
		MA-0699	mcbR+EthR6+Δhom-ΔthrB::gpd-天蓝色链霉菌hom(G362E)
MA-0721	ΔmcbR+EthR6+lacIq-trcRBS-谷氨酸棒杆菌metA(K233A)-RBS-谷氨酸棒杆菌metY(游离型)
		MA-0725	ΔmcbR+EthR6+lacIq-trcRBS-谷氨酸棒杆菌metA-RBS-谷氨酸棒杆菌metY(D231A)(游离型)
MA-0727	ΔmcbR+EthR6+lacIq-trcRBS-谷氨酸棒杆菌metA-RBS-谷氨酸棒杆菌metY(G232A)(游离型)
		MA-0933	ΔthrB+ΔmcbR+EthR6
MA-0993	Δhom-ΔthrB::gpd-天蓝色链霉菌hom(G362E；G43S)+Mcf3+EthR10
		MA-1162	ΔthrB+ΔmcbR+EthR6+lacIq-trcRBS-耻垢分枝杆菌lysC(T311I)-asd(游离型)
MA-1351	ΔthrB+ΔmcbR+EthR6+lacIq-trcRBS-T.fuscame metA(游离型)
		MA-1378	ΔthrB+ΔmcbR+EthR6+Mms13+lacIq-trcRBS-耻垢分枝杆菌lysC(T311I)-asd
MA-1421	Δhom-ΔthrB::gpd天蓝色链霉菌hom(G362E；G43S)+ΔmcbR+Mcf3+EthR10
		MA-1514	ΔthrB+ΔmcbR+EthR6+Mms13
MA-1559	ΔthrB+ΔmcbR+EthR6+Mms13+lacIq-trcRBS-T.fusca metA(游离型)
		MA-1667	ΔthrB+EthR6+ΔmcbR::lacIq-trcRBS-T.fusca metA(游离型)
MA-1668	Δhom-ΔthrB::gpd-天蓝色链霉菌hom(G362E；G43S)+ΔmcbR::lacIq-trcRBS-谷氨酸棒杆菌metA(K233A)-RBS-谷氨酸棒杆菌metB+Mcf3+EthR10
		MA-1688	ΔmcbR+Δhom-ΔthrB::gpd-天蓝色链霉菌hom(G362E；G43S)+lacIq-trcRBS-谷氨酸棒杆菌metA-RBS-谷氨酸棒杆菌metY-RBS-谷氨酸棒杆菌metH(游离型)
MA-1743	ΔthrB+ΔmcbR::lacIq-trcRBS-T.fusca metA+EthR6+lacIq-trcRBS-

	谷氨酸棒杆菌metA-RBS-谷氨酸棒杆菌metY-RBS-谷氨酸棒杆菌metH(游离型)
		MA-1790	Δhom-ΔthrB::gpd-天蓝色链霉菌hom(G362E；G43S)+ΔmcbR+Mcf3+EthR10+lacIq-trcRBS-谷氨酸棒杆菌metA-RBS-谷氨酸棒杆菌-metY-RBS-谷氨酸棒杆菌-metH(游离型)
MA-1906	ΔmcbR+EthR6+Δpck::gpd-耻垢分枝杆菌lysC(T311I)-asd
		MA-1907	ΔmcbR+EthR6+Δpck::gpd-耻垢分枝杆菌lysC(T311I)-asd+ΔthrB
MA-2025	ΔmcbR+EthR6+Δpck::gpd-耻垢分枝杆菌lysC(T311I)-asd+ΔthrB+lacIq-trcRBS-谷氨酸棒杆菌metA-RBS-谷氨酸棒杆菌metY-RBS-谷氨酸棒杆菌metH(游离型)
		MA-2028	ΔmcbR+EthR6+Δpck::gpd-耻垢分枝杆菌lysC(T311I)-asd+lacIq-trcRBS-谷氨酸棒杆菌metA-RBS-谷氨酸棒杆菌metY-RBS-谷氨酸棒杆菌metH(游离型)

表16.用于大肠杆菌和棒杆菌细菌中产生氨基酸的代表性异源蛋白的氨基酸序列。基因栏下的NC编号对应于相应的谷氨酸棒杆菌基因的Genbank

蛋白记录。

表17.用于大肠杆菌和棒杆菌细菌中产生氨基酸的代表性异源蛋白的核苷酸序列。注释：此表提供了每个基因的编码序列。一些GenBank条目包含与所述基因有关的附加的非-编码序列。

已经描述了本发明的许多实施方案。然而，可以理解可以不背离本发明的精神和范围进行各种的改变。因此，其他实施方案包含在如下权利要求的范围内。

Claims (96)

1.肠杆菌科或棒杆菌的细菌，包括下列至少一种：

(a)核酸分子，其包括序列，所述序列编码异源细菌天冬氨酸激酶多肽或其功能变体；

(b)核酸分子，其包括序列，所述序列编码异源细菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能变体；

(c)核酸分子，其包括序列，所述序列编码异源细菌磷酸烯醇丙酮酸羧酶多肽或其功能变体；

(d)核酸分子，其包括序列，所述序列编码异源细菌丙酮酸羧化酶多肽或其功能变体；

(e)核酸分子，其包括序列，所述序列编码异源细菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能变体；

(f)核酸分子，其包括序列，所述序列编码异源细菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体；

(g)核酸分子，其包括序列，所述序列编码异源细菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽或其功能变体；

(h)核酸分子，其包括序列，所述序列编码异源细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能变体；

(i)核酸分子，其包括序列，所述序列编码异源细菌甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽或其功能变体；

(j)核酸分子，其包括序列，所述序列编码异源细菌mcbR基因产物多肽或其功能变体；

(k)核酸分子，其包括序列，所述序列编码异源细菌O-琥珀酰高丝氨酸/乙酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽或其功能变体；

(l)核酸分子，其包括序列，所述序列编码异源细菌胱硫醚beta-裂合酶多肽或其功能变体；

(m)核酸分子，其包括序列，所述序列编码异源细菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体；和

(n)核酸分子，其包括序列，所述序列编码异源细菌5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体。

2.权利要求1的细菌，其中所述的细菌是大肠杆菌细菌。

3.权利要求1的细菌，其中所述的细菌是谷氨酸棒杆菌细菌。

4.权利要求1的细菌，其中所述的序列编码多肽，所述的多肽具有降低的反馈抑制。

5.权利要求1的细菌，其中所述的多肽选自肠杆菌科多肽、放线菌多肽或其变体。

6.权利要求5的细菌，其中所述的多肽为下列放线菌菌种中的一种的多肽：耻垢分枝杆菌、天蓝色链霉菌、Thermobifida fusca、地中海拟无枝酸菌或包括谷氨酸棒杆菌的棒杆菌的细菌。

7.权利要求5的细菌，其中所述的多肽为下列肠杆菌科菌种中的一种的多肽：菊欧文氏菌和大肠杆菌。

8.权利要求1的细菌，其中所述的异源的细菌天冬氨酸激酶多肽或其功能变体选自：

(a)耻垢分枝杆菌天冬氨酸激酶多肽或其功能变体；

(b)地中海拟无枝酸菌天冬氨酸激酶多肽或其功能变体；

(c)天蓝色链霉菌天冬氨酸激酶多肽或其功能变体；

(d)Thermobifida fusca天冬氨酸激酶多肽或其功能变体；

(e)菊欧文氏菌天冬氨酸激酶多肽或其功能变体；和

(f)Shewanella oneidensis天冬氨酸激酶多肽或其功能变体。

9.权利要求1的细菌，其中所述的异源细菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能变体选自：

(a)耻垢分枝杆菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能变体；

(b)地中海拟无枝酸菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能变体；

(c)天蓝色链霉菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能变体；和

(d)Thermobifida fusca天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能变体。

10.权利要求1的细菌，其中所述的异源细菌磷酸烯醇丙酮酸羧酶多肽或其功能变体选自：

(a)耻垢分枝杆菌磷酸烯醇丙酮酸羧酶多肽或其功能变体；

(b)天蓝色链霉菌磷酸烯醇丙酮酸羧酶多肽或其功能变体；

(c)Thermobifida fusca磷酸烯醇丙酮酸羧酶多肽或其功能变体；和

(d)菊欧文氏菌磷酸烯醇丙酮酸羧酶多肽或其功能变体。

11.权利要求1的细菌，其中所述的异源细菌丙酮酸羧化酶多肽或其功能变体选自：

(a)耻垢分枝杆菌丙酮酸羧化酶多肽或其功能变体；和

(b)天蓝色链霉菌丙酮酸羧化酶多肽或其功能变体。

12.权利要求1的细菌，其中所述的细菌包括下列的至少两种：

(a)核酸分子，其编码异源细菌天冬氨酸激酶多肽或其功能变体；

(b)核酸分子，其编码异源细菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能变体；

(c)核酸分子，其编码异源细菌磷酸烯醇丙酮酸羧酶多肽或其功能变体；

(d)核酸分子，其编码异源细菌丙酮酸羧化酶多肽或其功能变体；

(e)包含序列的核酸分子，所述序列编码异源细菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能变体；

(f)包含序列的核酸分子，所述序列编码异源细菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体；

(g)包含序列的核酸分子，所述序列编码异源细菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽或其功能变体；

(h)包含序列的核酸分子，所述序列编码异源细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能变体；

(i)包含序列的核酸分子，所述序列编码异源细菌甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽或其功能变体；

(j)包含序列的核酸分子，所述序列编码异源细菌mcbR基因产物多肽或其功能变体；

(k)包含序列的核酸分子，所述序列编码异源细菌O-琥珀酰高丝氨酸/乙酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽或其功能变体；

(l)包含序列的核酸分子，所述序列编码异源细菌胱硫醚beta-裂合酶多肽或其功能变体；

(m)包含序列的核酸分子，所述序列编码异源细菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体；和

(n)包含序列的核酸分子，所述序列编码异源细菌5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体。

13.权利要求1的细菌，其中所述的细菌包括下列的至少三个：

(a)核酸分子，其编码异源细菌天冬氨酸激酶多肽或其功能变体；

(b)核酸分子，其编码异源细菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能变体；

(c)核酸分子，其编码异源细菌磷酸烯醇丙酮酸羧酶多肽或其功能变体；和

(d)核酸分子，其编码异源细菌丙酮酸羧化酶多肽或其功能变体；

(e)包含序列的核酸分子，所述序列编码异源细菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能变体；

(f)包含序列的核酸分子，所述序列编码异源细菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体；

(g)包含序列的核酸分子，所述序列编码异源细菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽或其功能变体；

(h)包含序列的核酸分子，所述序列编码异源细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能变体；

(i)包含序列的核酸分子，所述序列编码异源细菌甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽或其功能变体；

(j)包含序列的核酸分子，所述序列编码异源细菌mcbR基因产物多肽或其功能变体；

(k)包含序列的核酸分子，所述序列编码异源细菌O-琥珀酰高丝氨酸/乙酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽或其功能变体；

(l)包含序列的核酸分子，所述序列编码异源细菌胱硫醚beta-裂合酶多肽或其功能变体；

(m)包含序列的核酸分子，所述序列编码异源细菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体；和

(n)包含序列的核酸分子，所述序列编码异源细菌5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体。

14.大肠杆菌或棒杆菌的细菌，其包括含有序列的核酸分子，所述序列编码异源细菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能变体。

15.权利要求14的细菌，其中所述的异源细菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能变体选自：

(a)耻垢分枝杆菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能变体；

(b)天蓝色链霉菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能变体；

(c)Thermobifida fusca二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能变体；和

(d)菊欧文氏菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能变体。

16.大肠杆菌或棒杆菌的细菌，其包括含有序列的核酸分子，所述序列编码异源细菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体。

17.权利要求16的细菌，其中所述的异源细菌高丝氨酸脱氢酶多肽选自：

(a)耻垢分枝杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体；

(b)天蓝色链霉菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体；

(c)Thermobifida fusca高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体；和

(d)菊欧文氏菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体。

18.大肠杆菌或棒杆菌的细菌，其包括含有序列的核酸分子，所述序列编码异源细菌O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽或其功能变体。

19.权利要求18的细菌，其中所述的异源细菌O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽选自：

(a)耻垢分枝杆菌O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽或其功能变体；

(b)天蓝色链霉菌O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽或其功能变体；

(c)Thermobifida fusca O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽或其功能变体；和

(d)菊欧文氏菌O-高丝氨酸乙酰基转移酶多肽或其功能变体。

20.大肠杆菌或棒杆菌的细菌，其包括核酸分子，所述核酸分子编码异源细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能变体。

21.权利要求20的细菌，其中所述的异源细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽选自：

(a)耻垢分枝杆菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能变体；

(b)天蓝色链霉菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能变体；和

(c)Thermobifida fusca O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能变体。

22.大肠杆菌或棒杆菌的细菌，其包括含有序列的核酸分子，所述序列编码异源细菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体。

23.权利要求22的细菌，其中所述的异源细菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽选自：

(a)细菌的5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽，其与来自分枝杆菌属的菌种的SEQ ID No：72或73，或其功能变体具有至少80％同一性；

(b)天蓝色链霉菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体；

(c)Thermobifida fusca 5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体；和

(d)植物乳杆菌5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体。

24.大肠杆菌或棒杆菌的细菌，其包括含有序列的核酸分子，所述序列编码异源细菌5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体。

25.权利要求24的细菌，其中所述的异源细菌5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶多肽选自：

(a)细菌的5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶多肽，其与来自分枝杆菌属的菌种的SEQ ID No：75或76，或其功能变体至少80％相同；

(b)天蓝色链霉菌5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体；

(c)Thermobifida fusca 5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体；和

(d)植物乳杆菌5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体。

26.大肠杆菌或棒杆菌的细菌，其包括含有序列的核酸分子，所述序列编码异源细菌甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽或其功能变体。

27.权利要求26的细菌，其中所述的异源细菌甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽选自：

(a)耻垢分枝杆菌甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽或其功能变体；

(b)天蓝色链霉菌甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽或其功能变体；

(c)Thermobifida fusca甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽或其功能变体；和

(d)菊欧文氏菌甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽或其功能变体。

28.大肠杆菌或棒杆菌的细菌，其包括下列的至少两种：

(a)遗传上改变的包含序列的核酸分子，所述序列编码细菌的天冬氨酸激酶多肽或其功能变体；

(b)遗传上改变的包含序列的核酸分子，所述序列编码细菌的天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能变体；

(c)遗传上改变的包含序列的核酸分子，所述序列编码细菌的磷酸烯醇丙酮酸羧酶多肽或其功能变体；和

(d)遗传上改变的包含序列的核酸分子，所述序列编码细菌的二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能变体。

29.权利要求28的细菌，其中至少两种遗传上改变的核酸分子中的至少一种，编码异源的多肽。

30.权利要求28的细菌，其中所述的细菌包括(a)和(b)、(a)和(c)、(a)和(d)、(b)和(c)、(b)和(d)或(c)和(d)。

31.权利要求30的细菌，其中所述的细菌包括(a)-(e)中的至少三种。

32.权利要求28的细菌，其中所述细菌的一种或多种下列多肽，相对于对照具有降低的活性：

(a)高丝氨酸脱氢酶多肽；

(b)高丝氨酸激酶多肽；和

(c)磷酸烯醇丙酮酸羧激酶多肽。

33.权利要求32的细菌，其中所述的细菌在内源的hom基因或内源的thrB基因中包含突变。

34.权利要求32的细菌，其中所述的细菌在内源的hom基因和内源的thrB基因中包含突变。

35.权利要求32的细菌，其中所述的细菌在内源的pck基因中包含突变。

36.大肠杆菌或棒杆菌的细菌，其包括下列的至少两种：

(a)遗传上改变的包含序列的核酸分子，所述序列编码细菌的磷酸烯醇丙酮酸羧酶多肽或其功能变体；

(b)遗传上改变的包含序列的核酸分子，所述序列编码细菌的天冬氨酸激酶多肽或其功能变体；

(c)遗传上改变的包含序列的核酸分子，所述序列编码细菌的天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能变体；

(d)遗传上改变的包含序列的核酸分子，所述序列编码细菌的高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体；

(e)遗传上改变的包含序列的核酸分子，所述序列编码细菌的高丝氨酸O-乙酰基转移酶多肽或其功能变体；

(f)遗传上改变的包含序列的核酸分子，所述序列编码细菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能变体；

(g)遗传上改变的包含序列的核酸分子，所述序列编码细菌的5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体；

(h)遗传上改变的包含序列的核酸分子，所述序列编码细菌的O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽或其功能变体；

(i)遗传上改变的包含序列的核酸分子，所述序列编码细菌的5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能变体；

(j)遗传上改变的包含序列的核酸分子，所述序列编码细菌的甲硫氨酸腺苷基转移酶多肽或其功能变体；

(k)遗传上改变的包含序列的核酸分子，所述序列编码细菌的丝氨酸羟基甲基转移酶多肽或其功能变体；和

(l)遗传上改变的包含序列的核酸分子，所述序列编码细菌的胱硫醚beta-裂合酶多肽或其功能变体。

37.权利要求36的细菌，其中至少两种遗传上改变的核酸分子中的至少一种，编码异源的多肽。

38.权利要求36的细菌，其中所述细菌包括(a)和(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)和(l)中至少一种。

39.权利要求36的细菌，其中所述细菌包括(b)和(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)和(l)中至少一种。

40.权利要求36的细菌，其中所述细菌包括(c)和(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)和(l)中至少一种。

41.权利要求36的细菌，其中所述细菌包括(d)和(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)和(l)中至少一种。

42.权利要求36的细菌，其中所述细菌包括(e)和(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)和(l)中至少一种。

43.权利要求36的细菌，其中所述细菌包括(f)和(g)、(h)、(i)、(j)、(k)和(l)中至少一种。

44.权利要求36的细菌，其中所述细菌包括(g)和(h)、(i)、(j)、(k)和(l)中至少一种。

45.权利要求36的细菌，其中所述细菌包括(h)和(i)、(j)、(k)和(l)中至少一种。

46.权利要求36的细菌，其中所述细菌包括(i)和(j)、(k)和(l)中至少一种。

47.权利要求36的细菌，其中所述细菌包括(j)和(k)和(l)中至少一种。

48.权利要求36的细菌，其中所述细菌包括(k)和(l)。

49.权利要求36的细菌，其中所述细菌包括(a)-(l)中至少三种。

50.权利要求36的细菌，其中所述细菌的一种或多种下列多肽，相对于对照具有降低的活性：

(a)高丝氨酸激酶多肽；

(b)磷酸烯醇丙酮酸羧激酶多肽；

(c)高丝氨酸脱氢酶多肽；和

(d)mcbR基因产物多肽。

51.权利要求50的细菌，其中所述的细菌在内源的hom基因、内源的thrB基因、内源的pck基因或内源的mcbR基因中包含突变。

52.权利要求50的细菌，其中所述的细菌在内源的hom基因、内源的thrB基因中包含突变。

53.权利要求50的细菌，其中所述的细菌在内源的hom基因、内源的thrB基因、内源的pck基因或内源的mcbR基因的两个或多个中包含突变。

54.大肠杆菌或棒杆菌的细菌，其包括下列的至少两种：

(a)遗传上改变的包含序列的核酸分子，所述序列编码细菌的磷酸烯醇丙酮酸羧酶多肽或其功能变体；

(b)遗传上改变的包含序列的核酸分子，所述序列编码细菌的天冬氨酸激酶多肽或其功能变体；

(c)遗传上改变的包含序列的核酸分子，所述序列编码细菌的天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能变体；

(d)遗传上改变的包含序列的核酸分子，所述序列编码细菌的高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能变体.

55.权利要求54的细菌，其中至少两种多肽中的至少一种，编码异源的多肽。

56.权利要求54的细菌，其中所述的细菌包括(a)和(b)、(a)和(c)、(a)和(d)、(b)和(c)、(b)和(d)或(c)和(d)。

57.权利要求54的细菌，其中所述的细菌包括(a)-(d)中的至少三种。

58.权利要求54的细菌，其中所述细菌的一种或多种下列多肽，相对于对照具有降低的活性：

(a)磷酸烯醇丙酮酸羧激酶多肽；和

(b)mcbR基因产物多肽。

59.权利要求58的细菌，其中所述的细菌在内源的pck基因或内源的mcbR基因中包含突变。

60.权利要求58的细菌，其中所述的细菌在内源的pck基因和内源的mcbR基因中包含突变。

61.产生氨基酸或相关的代谢物的方法，所述的方法包括：在允许产生所述的氨基酸或代谢物的条件下，培养权利要求1的细菌，和从所述的培养物中收集包含所述的氨基酸或相关的代谢物的组合物。

62.权利要求61的方法，进一步包括分级至少一部分的所述培养物，以获得富含所述氨基酸或代谢物的级分。

63.产生L-赖氨酸或相关的代谢物的方法，所述的方法包括：在允许产生L-赖氨酸的条件下，培养权利要求1或28的细菌，和从所述的培养物中收集包含所述的氨基酸或相关的代谢物的组合物。

64.权利要求63的方法，进一步包括分级至少一部分的所述培养物，以获得富含L-赖氨酸的级分。

65.产生甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸的方法，所述的方法包括：在允许产生甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸的条件下，培养权利要求36的细菌，和从所述的培养物中收集包含所述的甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸的组合物。

66.权利要求65的方法，进一步包括分级至少一部分的所述培养物，以获得富含甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸的级分。

67.产生异亮氨酸或苏氨酸的方法，所述的方法包括：在允许产生异亮氨酸或苏氨酸的条件下，培养权利要求54的细菌，和从所述的培养物中收集包含所述的异亮氨酸或苏氨酸的组合物。

68.权利要求67的方法，进一步包括分级至少一部分的所述培养物，以获得富含异亮氨酸或苏氨酸的级分。

69.分离的核酸，其编码变体细菌蛋白，其中所述的细菌蛋白调控从氨基酸或相关的代谢物的天冬氨酸家族中产生氨基酸，而且其中所述的变体蛋白，相对于所述蛋白的野生型，具有增加的活性。

70.权利要求69的核酸，其中所述的细菌蛋白调控从氨基酸或相关的代谢物的天冬氨酸家族中产生氨基酸，而且其中所述的变体蛋白，相对于所述蛋白的野生型，具有S-腺苷甲硫氨酸的降低的反馈抑制。

71.分离的核酸，其编码细菌蛋白的变体，其中所述的细菌蛋白包括下列氨基酸序列：

G₁-X₂-K₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X_13a-X_13b-X_13c-X_13d-X_13e-X_13f-X_13g-X_13h-X_13i-X_13j-X_13k-X_13l-F₁₄-X₁₅-Z₁₆-X₁₇-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-X_21a-X_21b-X_21c-X_21d-X_21e-X_21f-X_21g-X_21h-X_21i-X_21j-X_21k-X_21l-X_21m-X_21n-X_21o-X_21p-X_21q-X_21r-X_21s-X_21t-D₂₂(SEQ ID NO：__)，

其中X₂、X₄-X₁₃、X₁₅和X₁₇-X₂₀中的每个独立地为任意的氨基酸，其中X_13a-X_13l中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，其中X_21a-X_21t中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，而且其中Z₁₆选自缬氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；

其中所述的变体细菌蛋白，在SEQ ID NO：__的G₁、K₃、F₁₄、Z₁₆或D₂₂中的一个或多个，包含氨基酸改变。

72.权利要求71的核酸，其中细菌蛋白的变体S-腺苷甲硫氨酸的反馈抑制，相对于所述的细菌蛋白降低。

73.权利要求71的核酸，其中所述的氨基酸改变是改变为丙氨酸。

74.由权利要求69的核酸编码的多肽。

75.由权利要求71的核酸编码的多肽。

76.包含权利要求69的核酸的细菌。

77.包含权利要求71的核酸的细菌。

78.产生氨基酸或相关的代谢物的方法，所述的方法包括：

在表达所述的核酸并且允许产生所述的氨基酸的条件下，培养遗传上改变的包含权利要求69的核酸的细菌，和从所述的培养物中收集包含所述的氨基酸或相关的代谢物的组合物。

79.产生氨基酸或相关的代谢物的方法，所述的方法包括：

在表达所述的核酸并且允许产生所述的氨基酸的条件下，培养遗传上改变的包含权利要求71的核酸的细菌，和从所述的培养物中收集包含所述的氨基酸或相关的代谢物的组合物。

80.分离的核酸，其编码变体细菌的高丝氨酸O-乙酰基转移酶，其中所述的变体高丝氨酸O-乙酰基转移酶，是包括下列氨基酸序列的高丝氨酸O-乙酰基转移酶的变体：

G₁-X₂-K₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X_13a-X_13b-X_13c-X_13d-X_13e-X_13f-X_13g-X_13h-X_13i-X_13j-X_13k-X_13l-F₁₄-X₁₅-Z₁₆-X₁₇-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-X_21a-X_21b-X_21c-X_21d-X_21e-X_21f-X_21g-X_21h-X_21i-X_21j-X_21k-X_21l-X_21m-X_21n-X_21o-X_21p-X_21q-X_21r-X_21s-X_21t-D₂₂(SEQ ID NO：__)，

其中X₂、X₄-X₁₃、X₁₅和X₁₇-X₂₀中的每个独立地为任意的氨基酸，其中X_13a-X_13l中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，其中X_21a-X_21t中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，而且其中Z₁₆选自缬氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；

其中所述的变体高丝氨酸O-乙酰基转移酶，在SEQ ID NO：__的G₁、K₃、F₁₄、Z₁₆或D₂₂中的一个或多个，包含氨基酸改变。

81.分离的核酸，其编码变体细菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶，其中所述的变体O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶，是包括下列氨基酸序列的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的变体：

G₁-X₂-K₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X_13a-X_13b-X_13c-X_13d-X_13e-X_13f-X_13g-X_13h-X_13i-X_13j-X_13k-X_13l-F₁₄-X₁₅-Z₁₆-X₁₇-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-X_21a-X_21b-X_21c-X_21d-X_21e-X_21f-X_21g-X_21h-X_21i-X_21j-X_21k-X_21l-X_21m-X_21n-X_21o-X_21p-X_21q-X_21r-X_21s-X_21t-D₂₂(SEQ ID NO：__)，

其中X为任意的氨基酸，其中X_13a-X_13l中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，其中X_21a-X_21t中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，而且其中Z₁₆选自缬氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；

其中所述的变体O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶，在SEQ ID NO：的G₁、K₃、F₁₄、Z₁₆或D₂₂中的一个或多个，包含氨基酸改变。

82.分离的核酸，其编码变体细菌的mcbR基因产物，其中所述的变体mcbR基因产物，是包括下列氨基酸序列的mcbR基因产物的变体：

G₁-X₂-K₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X_13a-X_13b-X_13c-X_13d-X_13e-X_13f-X_13g-X_13h-X_13i-X_13j-X_13k-X_13l-F₁₄-X₁₅-Z₁₆-X₁₇-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-X_21a-X_21b-X_21c-X_21d-X_21e-X_21f-X_21g-X_21h-X_21i-X_21j-X_21k-X_21l-X_21m-X_21n-X_21o-X_21p-X_21q-X_21r-X_21s-X_21t-D₂₂(SEQ ID NO：__)，

其中X₂、X₄-X₁₃、X₁₅和X₁₇-X₂₀中的每个独立地为任意的氨基酸，其中X_13a-X_13l中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，其中X_21a-X_21t中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，而且其中Z₁₆选自缬氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；

其中所述的变体mcbR基因产物，在SEQ ID NO：__的G₁、K₃、F₁₄、Z₁₆或D₂₂中的一个或多个，包含氨基酸改变。

83.分离的核酸，其编码变体细菌的天冬氨酸激酶，其中所述的变体天冬氨酸激酶，是包括下列氨基酸序列的天冬氨酸激酶的变体：

G₁-X₂-K₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X_13a-X_13b-X_13c-X_13d-X_13e-X_13f-X_13g-X_13h-X_13i-X_13j-X_13k-X_13l-F₁₄-X₁₅-Z₁₆-X₁₇-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-X_21a-X_21b-X_21c-X_21d-X_21e-X_21f-X_21g-X_21h-X_21i-X_21j-X_21k-X_21l-X_21m-X_21n-X_21o-X_21p-X_21q-X_21r-X_21s-X_21t-D₂₂(SEQ ID NO：__)，

其中X₂、X₄-X₁₃、X₁₅和X₁₇-X₂₀中的每个独立地为任意的氨基酸，其中X_13a-X_13l中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，其中X_21a-X_21t中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，而且其中Z₁₆选自缬氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；

其中所述的变体天冬氨酸激酶，在SEQ ID NO：__的G₁、K₃、F₁₄、Z₁₆或D₂₂中的一个或多个，包含氨基酸改变。

84.分离的核酸，其编码变体细菌的O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶，其中所述的变体O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶，是包括下列氨基酸序列的O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶的变体：

G₁-X₂-K₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X_13a-X_13b-X_13c-X_13d-X_13e-X_13f-X_13g-X_13h-X_13i-X_13j-X_13k-X_13l-F₁₄-X₁₅-Z₁₆-X₁₇-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-X_21a-X_21b-X_21c-X_21d-X_21e-X_21f-X_21g-X_21h-X_21i-X_21j-X_21k-X_21l-X_21m-X_21n-X_21o-X_21p-X_21q-X_21r-X_21s-X_21t-D₂₂(SEQ ID NO：__)，

其中X₂、X₄-X₁₃、X₁₅和X₁₇-X₂₀中的每个独立地为任意的氨基酸，其中X_13a-X_13l中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，其中X_21a-X_21t中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，而且其中Z₁₆选自缬氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；

其中所述的变体O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶，在SEQ ID NO：__的G₁、K₃、F₁₄、Z₁₆或D₂₂中的一个或多个，包含氨基酸改变。

85.分离的核酸，其编码变体细菌的胱硫醚beta-裂合酶，其中所述的变体胱硫醚beta-裂合酶，是包括下列氨基酸序列的胱硫醚beta-裂合酶的变体：

G₁-X₂-K₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X_13a-X_13b-X_13c-X_13d-X_13e-X_13f-X_13g-X_13h-X_13i-X_13j-X_13k-X_13l-F₁₄-X₁₅-Z₁₆-X₁₇-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-X_21a-X_21b-X_21c-X_21d-X_21e-X_21f-X_21g-X_21h-X_21i-X_21j-X_21k-X_21l-X_21m-X_21n-X_21o-X_21p-X_21q-X_21r-X_21s-X_21t-D₂₂(SEQ ID NO：__)，

其中X₂、X₄-X₁₃、X₁₅和X₁₇-X₂₀中的每个独立地为任意的氨基酸，其中X_13a-X_13l中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，其中X_21a-X_21t中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，而且其中Z₁₆选自缬氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；

其中所述的变体胱硫醚beta-裂合酶，在SEQ ID NO：__的G₁、K₃、F₁₄、Z₁₆或D₂₂中的一个或多个，包含氨基酸改变。

86.分离的核酸，其编码变体细菌的5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶，其中所述的变体5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶，是包括下列氨基酸序列的5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶的变体：

G₁-X₂-K₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X_13a-X_13b-X_13c-X_13d-X_13e-X_13f-X_13g-X_13h-X_13i-X_13j-X_13k-X_13l-F₁₄-X₁₅-Z₁₆(SEQ ID NO：__)，

其中X₂、X₄-X₁₃、X₁₅和X₁₅-X₁₆中的每个独立地为任意的氨基酸，其中X_13a-X_13l中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，其中Z₁₆选自缬氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；

其中所述的变体高半胱氨酸甲基转移酶，在SEQ ID NO：__的G₁、K₃、F₁₄、或Z₁₆中的一个或多个，包含氨基酸改变。

87.分离的核酸，其编码变体细菌的S-腺苷甲硫氨酸合成酶，其中所述的变体S-腺苷甲硫氨酸合成酶，是包括下列氨基酸序列的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的变体：

G₁-X₂-K₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X_13a-X_13b-X_13c-X_13d-X_13e-X_13f-X_13g-X_13h-X_13i-X_13j-X_13k-X_13l-F₁₄-X₁₅-Z₁₆-X₁₇-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-X_21a-X_21b-X_21c-X_21d-X_21e-X_21f-X_21g-X_21h-X_21i-X_21j-X_21k-X_21l-X_21m-X_21n-X_21o-X_21p-X_21q-X_21r-X_21s-X_21t-D₂₂(SEQ ID NO：__)，

其中X₂、X₄-X₁₃、X₁₅和X₁₇-X₂₀中的每个独立地为任意的氨基酸，其中X_13a-X_13l中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，其中X_21a-X_21t中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，而且其中Z₁₆选自缬氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；

其中所述的变体S-腺苷甲硫氨酸合成酶，在SEQ ID NO：__的G₁、K₃、F₁₄、Z₁₆或D₂₂中的一个或多个，包含氨基酸改变。

88.包括下列两种或多种的细菌：

核酸，其编码的变体细菌的高丝氨酸O-乙酰基转移酶，相对于所述的高丝氨酸O-乙酰基转移酶的野生型，具有降低的反馈抑制；

核酸，其编码的变体细菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶，相对于所述的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的野生型，具有降低的反馈抑制；

核酸，其编码的变体细菌的McbR基因产物，相对于所述的McbR基因产物的野生型，具有降低的反馈抑制；

核酸，其编码的变体细菌的天冬氨酸激酶，相对于所述的天冬氨酸激酶的野生型，具有降低的反馈抑制；

核酸，其编码的变体细菌的O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶，相对于所述的野生型具有降低的反馈抑制；

核酸，其编码的变体细菌的胱硫醚beta-裂合酶，相对于所述的胱硫醚beta-裂合酶的野生型，具有降低的反馈抑制；

核酸，其编码的变体细菌的高半胱氨酸甲基转移酶，相对于所述的5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶的野生型，具有降低的反馈抑制；和

核酸，其编码的变体细菌的S-腺苷甲硫氨酸合成酶，相对于所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的野生型，具有降低的反馈抑制。

89.包含下列两种或多种的细菌：

(a)核酸，其编码的变体细菌的高丝氨酸O-乙酰基转移酶，其中所述的变体高丝氨酸O-乙酰基转移酶，是包括下列氨基酸序列的高丝氨酸O-乙酰基转移酶的变体：

G₁-X₂-K₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X_13a-X_13b-X_13c-X_13d-X_13e-X_13f-X_13g-X_13h-X_13i-X_13j-X_13k-X_13l-F₁₄-X₁₅-Z₁₆-X₁₇-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-X_21a-X_21b-X_21c-X_21d-X_21e-X_21f-X_21g-X_21h-X_21i-X_21j-X_21k-X_21l-X_21m-X_21n-X_21o-X_21p-X_21q-X_21r-X_21s-X_21t-D₂₂(SEQ ID NO：__)，

其中X₂、X₄-X₁₃、X₁₅和X₁₇-X₂₀中的每个独立地为任意的氨基酸，其中X_13a-X_13l中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，其中X_21a-X_21t中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，而且其中Z₁₆选自缬氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；

其中所述的变体高丝氨酸O-乙酰基转移酶，在SEQ ID NO：__的G₁、K₃、F₁₄、Z₁₆或D₂₂中的一个或多个，包含氨基酸改变；

(b)核酸，其编码的变体细菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶，其中所述的变体O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶，是包括下列氨基酸序列的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的变体：

G₁-X₂-K₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X_13a-X_13b-X_13c-X_13d-X_13e-X_13f-X_13g-X_13h-X_13i-X_13j-X_13k-X_13l-F₁₄-X₁₅-Z₁₆-X₁₇-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-X_21a-X_21b-X_21c-X_21d-X_21e-X_21f-X_21g-X_21h-X_21i-X_21j-X_21k-X_21l-X_21m-X_21n-X_21o-X_21p-X_21q-X_21r-X_21s-X_21t-D₂₂(SEQ ID NO：__)，

其中X₂、X₄-X₁₃、X₁₅和X₁₇-X₂₀中的每个独立地为任意的氨基酸，其中X_13a-X_13l中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，其中X_21a-X_21t中的每个独立地为任意的氨基酸或不存在，而且其中Z₁₆选自缬氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；

其中所述的变体O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶，在SEQ ID NO：__的G₁、K₃、F₁₄、Z₁₆或D₂₂中的一个或多个，包含氨基酸改变；和

(c)核酸，其编码的变体细菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶，其中所述的变体O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶，是包括下列氨基酸序列的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的变体：

L₁-X₂-X₃-G₄-G₅-X₆-F₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁(SEQ ID NO：__)，其中X为任意的氨基酸，其中X₈选自缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或天冬氨酸，而且其中X₁₁选自缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或甲硫氨酸；其中所述的细菌蛋白的变体在SEQ ID NO：__的L₁、G₄、X₈、X₁₁中的一个或多个，包含氨基酸改变。

90.包含下列两种或多种的细菌：

(a)核酸，其编码的变体细菌的高丝氨酸O-乙酰基转移酶，其中所述的变体高丝氨酸O-乙酰基转移酶是谷氨酸棒杆菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶，其在SEQ ID NO：__的一个或多个下列残基中包含氨基酸改变：甘氨酸231、赖氨酸233、苯丙氨酸251和缬氨酸253；

(b)核酸，其编码的变体细菌的高丝氨酸O-乙酰基转移酶，其中所述的变体高丝氨酸O-乙酰基转移酶是T.fusca高丝氨酸O-乙酰基转移酶，其在SEQ ID NO：__的一个或多个下列残基中包含氨基酸改变：甘氨酸81、天冬氨酸287、苯丙氨酸269；

(c)核酸，其编码的变体细菌的高丝氨酸O-乙酰基转移酶，其中所述的变体高丝氨酸O-乙酰基转移酶是大肠杆菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶，其在SEQ ID NO：__的谷氨酸252包含氨基酸改变；

(d)核酸，其编码的变体细菌的高丝氨酸O-乙酰基转移酶，其中所述的变体高丝氨酸O-乙酰基转移酶是分枝杆菌的高丝氨酸O-乙酰基转移酶，其在与SEQ ID NO：__列出的M.leprae高丝氨酸O-乙酰基转移酶的一个或多个下列残基相对应的残基中，包含氨基酸改变：甘氨酸73、天冬氨酸278和酪氨酸260；

(e)核酸，其编码的变体细菌的高丝氨酸O-乙酰基转移酶，其中所述的变体高丝氨酸O-乙酰基转移酶是、结核分枝杆菌高丝氨酸O-乙酰基转移酶，其在SEQ ID NO：__的一个或多个下列残基中包含氨基酸改变：甘氨酸73、酪氨酸260和天冬氨酸278；

(f)核酸，其编码的变体细菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶，其中所述的变体O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶是谷氨酸棒杆O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶，其在SEQ ID NO：__的一个或多个下列残基中包含氨基酸改变：甘氨酸227、亮氨酸229、天冬氨酸231、甘氨酸232、甘氨酸233、苯丙氨酸235、天冬氨酸236、缬氨酸239、苯丙氨酸368、天冬氨酸370、天冬氨酸383、甘氨酸346和亮氨酸348；和

(g)核酸，其编码的变体细菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶，其中所述的变体O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶是T.fusca O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶，其在SEQ ID NO：__的一个或多个下列残基中包含氨基酸改变：甘氨酸240、天冬氨酸244、苯丙氨酸379和天冬氨酸394。

91.包含核酸的细菌，所述的核酸编码游离型高丝氨酸O-乙酰基转移酶或其变体，和游离型O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶或其变体。

92.权利要求91的细菌，其中所述的游离型高丝氨酸O-乙酰基转移酶和所述的游离型O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶来自不同于所述细菌的菌种。

93.制备动物饲料添加剂的方法，所述的动物饲料添加剂含有天冬氨酸衍生的氨基酸，所述方法包括：

(d)在允许产生所述的天冬氨酸-衍生的氨基酸的条件下，培养权利要求1、28、36和54中任一项的细菌；

(e)收集组合物，所述的组合物包含至少一部分天冬氨酸-衍生的氨基酸，所述的天冬氨酸-衍生的氨基酸是由培养所述细菌产生的；

(f)将收集的组合物浓缩，以富集天冬氨酸-衍生的氨基酸；和

(g)任选地，加入一种或多种物质，以获得所需要的动物饲料添加剂。

94.权利要求93的方法，其中所述的细菌是大肠杆菌或棒杆菌的细菌。

95.权利要求94的方法，其中所述的细菌是谷氨酸棒杆菌。

96.权利要求93的方法，其中所述的天冬氨酸-衍生的氨基酸为赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或异亮氨酸的一种或多种。

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