KR0159812B1

KR0159812B1 - 코리네박테리움 글루타미컴 씨에이치 77 및 이 균주를 이용한 l-라이신의 제조 방법

Info

Publication number: KR0159812B1
Application number: KR1019950072246A
Authority: KR
Inventors: 성진석; 신현철; 곽영현; 전영중; 이재홍
Original assignee: 손경식; 제일제당주식회사
Priority date: 1995-12-20
Filing date: 1995-12-20
Publication date: 1998-11-16
Also published as: KR970043035A

Abstract

1. 청구범위에 기재되어 있는 발명의 속하는 기술 분야

미생물.

2. 그 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제

L-라이신의 제조에서 수율증대.

3. 그 기술적 과제의 해결방법의 요지

신균주 코리네박테리움 글루타미컴 CH77의 사용.

4. 발명의 중요한 용도

의약 및 식품 첨가제등.

Description

코리네박테리움 글루타미컴 씨에이치77 및 이 균주를 이용한 L-라이신의 제조방법.

본 발명은 호흡억제제인 아지드화나트륨 2mg/1 이하의 농도에 대해 민감성을 가지는 코리네박테리움 글루타미컴 CH77(Corynebacterium glutamicum CH77)및 이를 이용하여 L-라이신을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 출원인은 코리네박테리움 글루타미컴 CH77을 한국미생물보존센터에 1995년 12월 18일에 수탁번호 KFCC010

881로 기탁하였다.

L-라이신은 필수아미노산의 일종으로 가축의 사료, 식품첨가제, 의약원료, 영양제 등으로 사용되고 있으며, 특히 L-라이신의 함량이 적은 곡류의 가축사료에 첨가함으로써 아미노산의 구성비를 효율적으로 조화시켜 사료효율을 향상시킬 수 있기 때문에 최근 수요가 급증하고 있다.

최근 L-라이신 생성 균주의 개발방법으로 세포융합법, 유전자 재조합법이 적용되고 있기는 하지만 이런 방법에 의해 개발된 균주의 현장적용은 그리 수월한 편은 아니라서 인공 돌연변이법에 의해 개발된 균주가 현장에 적용되고 있다.

종래 L-라이신을 제조하는 방법은 대한민국 특허공고 79-1782, 81-1746 및 92-7402, 일본특허공개 소57-9797, 소57-14839, 소61-35840, 평4-4887, 평4-88991, 평5-111386등과 일본특허공고 소62-24073, 소62-36673등에 기술되어 있는데, 특히 아미노산 요구성, 아미노산 유도체에 대한 내성, 항생제 및 기타 약제에 관한 내성을 부여하고 있다.

본 발명자들은 호흡억제제인 아지드화나트륨 10mg/L에 대한 내성주를 획득한 다음, 다시 인공변이시켜 아지드화나트륨 2mg/L 이하의 농도에 대해 민감주를 선별하여, 공지의 균주인 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC10672에 비해 발효농도가 획기적으로 향상된 신규한 균주 코리네박테리움 글루타미컴 CH77을 획득하였다.

본 발명은 호흡억제제인 아지드화나트륨 2mg/L 이하의 농도에 대해 민감성을 갖고 L-라이신의 생성수율을 높여줄 수 있는 신규한 미생물 코리네박테리움 글루타미컴 CH77을 제공한다.

또한, 본 발명은 발효균주로서 상기한 본 발명의 균주를 이용하여 L-라이신을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명자들이 코리네박테리움 글루타미컴 CH77을 획득했을 때 수행한 돌연변이 절차는 다음과 같다.

참고로, 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC10672의 아지드화나트륨에 대한 내성도를 측정하기 위하여 하기의 액체최소배지에 아지드화나트륨을 농도별로 첨가한 뒤 그 세포성장도를 흡광도로 측정하였으며, 그 결과는 상대성장도로 하기 표1에 나타낸 바와 같다.

표1에 나타낸 결과와 같이 5mg/L 이상의 농도에서 세포의 성장이 억제됨을 알 수 있었다.

일차로, 아지드화나트륨 10mg/L에 대한 내성주는 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC10672(특성: α-아미노-β-하이드록시 발레르산, S-(β-아미노에틸)-L-시스테인, 메틸라이신, 아르기닌 하이드록사메이트 내성 및 루이신과 호모세린 요구성)를 세포농도 10세포/ml로 하여 0.1몰 황산마그네슘 용액에 현탁시켜 자외선을 80초 조사시켜 이에 따라 변이처리된 균주를 인산칼륨 완충액(pH7.0)으로 4회 세척한 후 아지드화나트륨이 10mg/L로 함유된 하기의 최소배지에 농축도말하여 내성주를 300여주 선별하였다.

최소배지성분 :

글루코오스 10g/L, (NH)SO2g/L, 우레아 2g/L, 루이신 0.1 g/L, 트레오닌 0.1g/L, 메티오닌 0.1g/L, KHPO0.2g/L, KHPO0.2g/L, MgSO·7HO 0.1g/L, CaCl·2HO 0.1g/L, FeSO·7HO 12mg/L, MnSO·5HO 12mg/L, 바이오틴 100μg/L, 티아민·HC1 100μg/L, NaBO·10HO 80μg/L, (NH)MoO·4HO 40μg/L, ZnSO·7HO 10μg/L, CuSO·7HO 300μg/L, MnCl·4HO 10μg/L, FeCl·6HO1mg/L, 한천 20g/L pH 7.0(살균전).

그런 후 이들 균주를 33℃에서 3 내지 4일 배양시킨 뒤 콜로니의 크기가 큰것부터 선별하여 30℃, 230rpm, 65시간의 배양조건에서 하기의 플라스크 역가배지를 사용하여 그 발효농도를 실험하였다.

플라스크 발효배지 : 당밀(환원당으로서)100g/L, (NH)SO27g/L, 옥수수 침지액 100g/L, 우레아 4g/L, 루이신 0.2g/L, 트레오닌 0.1g/L, 메티오닌 0.1g/L, KHPO1g/L, NaC1 2.5g/L, MgSO·7HO 12g/L, FeSO·7HO 12mg/L, MnSO·5HO 12mg/L, 바이오틴 300μg/L, 티아민 ·HC1 500μg/L, CaCo40g/L pH 7.0(살균후).

그 결과 발효농도는 거의 동일하였으나 세포성장도가 모균주에 비해 10% 증가된 균주를 1주 선별하였으며, 이를 코리네박테리움 글루타미컴 CH67이라 명명하였다. 이의 발효실험 결과는 다음 표2에 나타낸 바와 같다.

L-라이신 농도는 고성능 액체 크로마토그라피 (High Performance Liquid Chromatography)로 총당은 버트란트(Bertrand)법을 사용하여 정량하였고, 건조세포량(DCW)은 그 때의 흡광도(optical density, 562nm)를 미리 구해 둔 건조세포량과 흡광도의 상호관계식에 대입하여 구하였다.

계속해서, 선별된 코리네박테리움 글루타미컴 CH67을 모균주로 하여 전술한 방법으로 인공돌연변이 처리하였다. 변이처리된 균은 아지드화나트륨이 함유되지 않은 상기의 최소배지에 희석 도말하고 배양시켰다. 이렇게 배양된 균은 아지드화나트륨이 2mg/L로 함유된 최소배지와 함유되지 않은 최소배지에 동시 투스 피킹(tooth picking)작업을 통해 아지드화나트륨 2mg/L에서 자라지 않는 균주를 10여주 선별할 수 있었으며 그 중 플라사크 역가실험에서 KFCC10672 대비 세포건조량은 오히려 5% 정도 감소하고 발효농도가 5% 이상 증가한 신균주 1주를 획득하였다. 이의 역가실험 결과는 하기 표2에 기재되어 있다. 본 발명자들은 획득한 신균주를 코리네박테리움 글루타미컴 CH77이라 명명하였다.

이하의 실시예로 본 발명에 따른 미생물을 이용한 발효로 L-라이신을 제조하는 방법을 예시한다.

[실시예 1]

본 발명은 신균주 코리네박테리움 글루타미컴 CH77를 하기의 7L 발효조 배양배지 및 배양조건으로 발효를 실시하고 수득된 발효액으로부터 통상의 정제공정에 따라 L-라이신을 분리하였다.

7L발효조 배지성분 및 배양조건 :

당밀(환원당으로서) 230g/L, 옥수수 침지액 100g/L, (NH)SO30g/L, KHPO0.7g/L, FeSO·7HO 7mg/L, MnSO·5HO 7mg/L, 루이신 1.1g/L, 트레오닌 0.5g/L 메티오닌 0.5g/L를 기준으로 추가당 및 추가물을 발효 중에 첨가하는 유가식발효(fed-batch fermentation)로 온도 30 내지 33℃, pH6.9 내지 7.2, 교반속도 700 내지 800 rpm, 통기량 1 vvm의 조건에서 55 내지 60시간 발효를 실시하였다.

[비교실시예 1]

실시예 1에서와 동일한 배지 및 조건하에서 코리네박테리움 글루카미컴 KFCC10672로 발효를 실시하였다.

상기 실시예 1 및 비교실시예 1의 발효결과는 하기 표3에 나타낸 바와 같다.

상기 결과는 신균주인 코리네박테리움 글루타미컴 CH77이 공지균주 KFCC10672 대비 세포 건조량이 4.3% 감소하고 발효농도가 3% 이상 향상되었음을 보여준다.

Claims

호흡억제제인 아지드화나트륨 2mg/1 이하의 농도에 대해 민감성을 갖고 L-라이신을 고수율로 생성하는 코리네박테리움 글루타미컴 CH77(Corynebacterium glutamicum CH77).
발효에 의한 L-라이신의 제조방법에 있어서, 제1항에 따른 코리네박테리움 글루타미컴 CH77을 사용함을 특징으로 하는 방법.