KR100970106B1 - 신규한 폴리펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 코리네형 세균(Coryneform bacteria)에 속하는 미생물 유래의 폴리뉴클레오타이드 및 이의 단편, 당해 폴리뉴클레오타이드 및 이의 단편으로부터 암호화되는 폴리펩타이드, 당해 폴리뉴클레오타이드 및 이의 단편을 함유하는 폴리뉴클레오타이드 어레이, 당해 폴리뉴클레오타이드 및 이의 단편의 염기 서열을 기록하는 컴퓨터로 판독할 수 있는 기록매체 및 이의 용도에 관한 것이다.
코리네형 세균, 뉴클레오타이드 어레이, 하이브리드화, 항체, 컴퓨터 시스템, 컴퍼레이터, 기록 매체, 기억 장치, 형질전환체, L-라이신, 시그널 전달 경로, 생합성 경로, 프로테옴

Description

신규한 폴리펩타이드 {Novel polypeptides}
본 발명은 코리네형 세균(Coryneform bacteria)에 속하는 미생물 유래의 폴리뉴클레오타이드 및 이의 단편, 당해 폴리뉴클레오타이드 및 이의 단편으로부터 암호화되는 폴리펩타이드, 당해 폴리뉴클레오타이드 및 이의 단편을 함유하는 폴리뉴클레오타이드 어레이, 당해 폴리뉴클레오타이드 및 이의 단편의 염기 서열을 기록하는 컴퓨터로 판독할 수 있는 기록매체 및 이들의 사용 및 당해 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드 서열 정보를 사용하는 비교 방법에 관한 것이다.
코리네형 세균은 아미노산, 핵산, 비타민, 당(예: 리불로오스), 유기산(예: 피루브산) 및 상기물질의 동족체(예: N-아세틸아미노산) 등의 다양한 유용 물질의 생산에 이용되고 산업상 대단히 유용한 미생물이며 다수의 변이주가 공지되어 있다.
예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰은 글루탐산 생산균으로서 동정된 그램 양성 세균이며 이의 변이주에 의해 많은 아미노산이 생산되고 있다. 예를 들면, 감미 조미료로서 유용한 L-글루탐산은 전세계에서 연간 100만톤, 가축사료의 첨가물 등에 중요한 L-라이신은 연간 25만톤, 이외에도 L-알기닌, L-프롤린, L-글 루타민, L-트립토판 등의 아미노산이 이러한 균에 의해 각각 연간 수 백톤 이상의 규모로 생산되고 있다[참조: 닛케이 바이오연감 99, 닛케이BP사제, 1998].
코리네박테리움 글루타미쿰에 의한 아미노산 생산은 주로 대사 경로 및 이의 조절 기구가 변화된 변이주(대사 변이주)에 의해 실시되고 있다. 일반적으로 생물은 필요량 이상의 아미노산을 만들지 않도록 다양한 대사 조절기구를 이용하고 있다. 예를 들면, L-라이신의 생합성에서 코리네박테리움속에 속하는 미생물에서는 라이신 및 트레오닌, 메티오닌의 공통 생합성 효소 아스파르토키나제에 대한 라이신과 트레오닌에 의한 협조적인 활성 저해에 의해 과잉생산이 일어나지 않도록 조절되고 있다[참조: J. Biochem., 65, 849-859(1969)]. 또한 알기닌에 관해서는 이의 생합성 효소의 유전자의 발현량이 알기닌에 의해 억제되며 과잉생산이 일어나지 않도록 조절되고 있다[참조: Microbiology, 142, 99-l08(1996)]. 아미노산 생산 변이주에 있어서는, 이러한 대사 조절기구가 해제되어 있다고 간주되어 있다. 핵산, 비타민, 당, 유기산 및 상기 물질의 동족체 등의 생산 변이주에 관해서도 동일하게 대사 제어의 해제에 의해 목적 산물의 생산성을 향상시키고 있다.
그러나 대장균이나 고초균 등과 비교하여 코리네형 세균에 관해서는 기본적인 유전학적, 생화학적, 분자생물학적인 지식의 집적이 충분하다고는 할 수 없으며 아미노산 생산 변이주에서의 변이 유전자에 관해서도 밝혀진 바가 매우 적다. 이와 같이, 이들 미생물에서는 아직 공지되지 않은 다양한 생육 및 대사 조절기구가 존재하고 있다.
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032주에 관해서는 염색체의 물리적 지도가 작성되어 있으며 게놈 사이즈가 약 3,100킬로베이스인 것이 보고되어 있다[참조: Mol. Gen. Genet., 252, 255-265(1996)]. 통상적인 세균의 유전자 밀도로부터 산정하면, 이러한 약 3,100킬로베이스의 게놈중에는 약 3,000개의 유전자가 존재한다고 예상되지만 코리네박테리움 글루타미쿰에서는 아미노산 생합성 유전자를 중심으로 하여 백개 정도의 유전자밖에 공지되어 있지 않으며, 대부분의 유전자에 관한 염기 서열은 아직 해명되어 있지 않다.
최근에, 몇개의 미생물, 예를 들면, 대장균, 결핵균, 효모 등에 관해서 이의 게놈의 전체 염기 서열 결정이 보고되어 있다[참조: Science, 277, 1453-62(1997), Nature, 393, 537-544(1998), Nature, 387, 5-105(l997)]. 결정된 전체 염기 서열에 근거하여 유전자 영역의 추정, 공지된 유전자와의 염기 서열과 비교가 실시되고 있으며 유전학적, 생화학적, 분자생물학적인 실험을 수행하지 않고 방대한 수의 유전자 기능의 추정이 이루어지고 있다.
또한, 최근에 유전자 또는 유전자 영역 이외의 게놈 영역의 부분 핵산 단편을 고체 지지체에 고착된 DNA 칩 또는 DNA 어레이(DNA array) 등을 사용하여 방대한 수의 유전자에 관해서 발현 상황을 동시에 보거나 변이를 검출하는 기술이 개발되고 있으며 효모, 결핵균 및 BCQ 백신에 사용된다. 마이코박테리움 보비스 등의 미생물의 해석에서 성과를 올리고 있다[참조: Science, 278, 680-686(1997), Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, 96, 12833-38(1999), Science, 284, 1520-23(1999)].
본 발명의 목적은 산업상 유용한 코리네형 세균 유래의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드, 당해 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 서열 정보, 당해 미생물의 해석방법, 당해 해석에 사용하는 장치 및 시스템, 및 당해 미생물의 육종법을 제공하는 것이다.
본 발명은 코리네형 세균 유래의 폴리뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드, 당해 폴리뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드를 고착한 올리고뉴클레오타이드 어레이, 폴리뉴클레오타이드에 암호화되는 폴리펩타이드, 당해 폴리펩타이드를 인식하는 항체, 당해 폴리펩타이드 또는 당해 항체를 고착한 폴리펩타이드 어레이, 당해 폴리뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드의 염기 서열 및 당해 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 기록한 컴퓨터로 판독할 수 있는 기록매체 및 당해 기록매체를 사용하는 '컴퓨터 이용' 시스템 및 당해 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드 서열 정보를 사용하는 비교 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 산업상 유용한 코리네형 세균 유래의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드, 당해 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 서열 정보, 당해 미생물의 해석방법, 당해 해석에 사용하는 장치 및 시스템 및 당해 미생물의 육종법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 전체 염기 서열을 결정함 으로써 아직 동정되어 있지 않은 유전자 영역의 특정, 공지된 유전자의 염기 서열 및 공지된 유전자에 유래하는 아미노산 서열과의 비교에 의한 당해 미생물 유래의 미지 유전자의 기능 추정, 당해 미생물에 의한 유용 생산물의 대사 조절기구의 추정에 의한 유용한 생산 변이주를 취득할 수 있다고 생각하여 예의 연구를 거듭한 결과, 전체 게놈 샷건법(shotgun method)을 적용함으로써 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈의 모든 염기 서열을 결정할 수 있다는 것을 밝혀내고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 하기의 (1) 내지 (68)에 관한 것이다:
(1) (a) 서열 1 내지 3501 중의 어느 하나에 기재된 염기 서열로 이루어진 제1 폴리뉴클레오타이드류, 제1 폴리뉴클레오타이드와 엄격한 조건하에 하이브리드화하는 제2 폴리뉴클레오타이드류 및 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드류의 연속하는 적어도 10 내지 200개 염기 서열로 이루어진 제3 폴리뉴클레오타이드류로 이루어진 그룹중에서 선택된 2종류 이상의 폴리뉴클레오타이드를 고체 지지체에 고착하여 폴리뉴클레오타이드 어레이를 작제하는 단계,
(b) 코리네형 세균 유래의 표지된 폴리뉴클레오타이드, 코리네형 세균의 변이주 유래의 표지된 폴리뉴클레오타이드 또는 표지된 피검 폴리뉴클레오타이드중 하나 이상을 하이브리드화 조건하에 상기 폴리뉴클레오타이드 어레이에 고착된 폴리뉴클레오타이드와 함께 항온 처리하는 단계,
(c) 하이브리드화를 검출하는 검출 단계 및
(d) 하이브리드화 결과를 해석하는 해석 단계를 포함하는,
[1] 코리네형 세균의 변이주 유래의 유전자의 변이점의 동정, [2] 코리네형 세균 유래의 유전자의 발현량 측정, [3] 코리네형 세균 유래의 유전자의 발현 프로필의 해석, [4] 코리네형 세균 유래된 유전자의 발현 패턴의 분석, 또는 [5] 피검 유전자와 상동인 유전자를 코리네형 세균으로 검색하기 위한 방법.
여기서, 폴리뉴클레오타이드 2종 이상은 예를 들면, 제1 폴리뉴클레오타이드류에서 선택되는 2종 이상, 제2 폴리뉴클레오타이드류에서 선택되는 2종 이상, 제3 폴리뉴클레오타이드류에서 선택되는 2종 이상 또는 제1, 제2 및 제3 폴리뉴클레오타이드류를 조합하여 선택되는 2종 이상의 것일 수 있다.
(2) 코리네형 세균이 코리네박테리움속, 브레비박테리움속 또는 마이크로박테리움속에 속하는 미생물인 상기 (1)에 기재된 방법.
(3) 코리네박테리움속에 속하는 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 아세토액시도필룸 (Corynebacterium acetoacidophilum), 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 (Corynebacterium acetoglutamicum), 코리네박테리움 칼루내 (Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 허쿨리스 (Corynebacterium herculis), 코리네박테리움 릴리움 (Corynebacterium lilium), 코리네박테리움 멜라쎄콜라 (Corynebacterium melassecola), 코리네박테리움 더모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes) 및 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) 중에서 선택된 미생물인 상기 (2)에 기재된 방법.
(4) 코리네형 세균 유래의 폴리뉴클레오타이드, 코리네형 세균 변이주 유래 의 폴리뉴클레오타이드 또는 피검 폴리뉴클레오타이드가 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산 및 이들의 동족체로부터 선택되는 하나 이상의 화합물의 생합성에 관계하는 유전자인 상기 (1)에 기재된 방법.
(5) 피검 폴리뉴클레오타이드가 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)로부터 유래되는 상기 (1)에 기재된 방법.
(6) 서열 1 내지 3501 중의 어느 하나에 기재된 염기서열로 이루어진 제1 폴리뉴클레오타이드류, 제1 폴리뉴클레오타이드류와 엄격한 조건하에 하이브리드화하는 제2 폴리뉴클레오타이드류 및 제1 또는 제2 폴리뉴클레오타이드류의 서열중 연속하는 적어도 10 내지 200개 염기 서열로 이루어진 제3 폴리뉴클레오타이드류로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드 2종류 이상이 고체 지지체에 고착된 폴리뉴클레오타이드 어레이.
(7) 서열 1에 기재된 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 당해 폴리뉴클레오타이드와 80% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드.
(8) 서열 2 내지 3431 중의 어느 하나에 기재된 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드 또는 당해 폴리뉴클레오타이드와 엄중한 조건하에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드.
(9) 서열 3502 내지 6931 중의 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 당해 폴리뉴클레오타이드와 엄중한 조건하에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드.
(10) 서열 1에 기재된 염기 서열을 갖는 전체 폴리뉴클레오타이드에서 서열 2 내지 3431중에서 선택된 어느 하나의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 5' 상류 또는 3' 하류에 위치하여 당해 폴리뉴클레오타이드의 발현 조절 활성을 갖는 폴리뉴클레오타이드.
(11) 폴리뉴클레오타이드가 갖는 염기 서열 중의 연속하는 적어도 10 내지 200개 염기를 포함하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 또는 당해 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 염기 서열을 포함하는 상기 (7) 내지 (10) 중의 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오타이드.
(12) 상기 (8) 내지 (11) 중의 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 재조합 DNA.
(13) 상기 (8) 내지 (11) 중의 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 (12)에 따른 재조합 DNA를 함유하는 형질전환체.
(14) 상기 (13)에 따른 형질전환체를 배지에 배양하여 배양물 중에 (8) 또는 (9)에 따른 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드를 생성 축적시켜, 당해 배양물로부터 폴리펩타이드를 채취함을 특징으로 하는, 폴리펩타이드의 제조방법.
(15) 상기 (13)에 따른 형질전환체를 배지에 배양하여 배양물 중에 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산 및 이들의 동족체중에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 생성 축적시켜, 당해 배양물로부터 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산 및 이들의 동족체중에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 채취하는 것을 특징으로 하는, 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산 및 이들의 동족체로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 제조하는 방법.
(16) 서열 2 내지 3431로부터 선택되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드.
(17) 서열 3502 내지 6931로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
(18) 상기 (16) 또는 (17)에 기재된 폴리펩타이드의 아미노산 서열에서 1이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가되지 않은 폴리펩타이드에 존재하는 활성과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩타이드.
(19) 상기 (16) 또는 (17)에 기재된 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 함유하며 또한 당해 폴리펩타이드에 존재하는 활성과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩타이드.
(20) 상기 (16) 내지 (19) 중의 어느 한 항에 기재된 폴리펩타이드를 인식하는 항체.
(21) 상기 (16) 내지 (19) 중의 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 및 당해 폴리펩타이드의 부분 단편 폴리펩타이드로부터 선택되는 폴리펩타이드 또는 이의 부분 단편 폴리펩타이드 하나 이상이 고체 지지체에 고착된 폴리펩타이드 어레이.
(22) 상기 (16) 내지 (19) 중의 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 및 당해 폴리펩타이드의 부분 단편 폴리펩타이드로부터 선택되는 폴리펩타이드 또는 이의 부분 단편 폴리펩타이드를 인식하는 하나 이상의 항체가 고체 지지체에 고착된 폴리 펩타이드 어레이.
(23) (i) 서열 1 내지 3501로부터 선택된 하나 이상의 염기 서열 정보 및 표적 서열 또는 표적 구조 모티프 정보를 입력하기 위한 입력 수단,
(ii) 입력된 정보를 적어도 일시적으로 기록하기 위한 데이터 기록 수단,
(iii) 당해 데이터 기록 수단에 의해 기록된 서열 1 내지 3501로부터 선택된 하나 이상의 염기서열 정보를 표적 서열 또는 표적 구조 모티프 정보와 비교하여 표적 서열 또는 표적 구조 모티프 정보와 일치하거나 유사한 염기 서열 정보를 검색하거나 해석하기 위한 컴퍼레이터 수단 및,
(iv) 당해 컴퍼레이터 수단에 의해 얻어진 검색 또는 해석 결과를 표시하는 출력수단을 구비함을 특징으로 하는,
코리네형 세균 유래의 표적 서열 또는 표적 구조 모티프를 동정하기 위한 컴퓨터 이용 시스템.
(24) (i) 서열 1 내지 3501로부터 선택된 하나 이상의 염기 서열 정보 및 표적 서열 정보 또는 표적 구조 모티프 정보를 입력하는 단계,
(ii) 입력된 정보를 적어도 일시적으로 기록하는 단계,
(iii) 서열 1 내지 3501로부터 선택된 하나 이상의 염기 서열 정보를 표적 서열 또는 표적 구조 모티프 정보와 비교하는 단계, 및
(iv) 표적 서열 또는 표적 구조 모티프 정보와 일치하거나 유사한 염기 서열 정보를 검색하고 해석하는 단계를 포함함을 특징으로 하여,
코리네형 세균 유래의 표적 서열 또는 표적 구조 모티프를 동정하기 위해 컴퓨터를 이용하는 방법.
(25) (i) 서열 3502 내지 7001로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열 정보 및 표적 서열 또는 표적 구조 모티프 정보를 입력하기 위한 입력 수단,
(ii) 입력된 정보를 적어도 일시적으로 기록하기 위한 데이터 기록 수단,
(iii) 당해 데이터 기록 수단에 의해 기록된 서열 3502 내지 7001로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열 정보를 표적 서열 또는 표적 구조 모티프 정보와 비교하여 표적 서열 또는 표적 구조 모티프 정보와 일치하거나 유사한 아미노산서열 정보를 검색하거나 해석하기 위한 컴퍼레이터 수단 및,
(iv) 당해 컴퍼레이터 수단에 의해 얻어진 검색 또는 해석 결과를 표시하는 출력수단을 구비함을 특징으로 하는,
코리네형 세균 유래의 표적 서열 또는 표적 구조 모티프를 동정하기 위한 컴퓨터 이용 시스템.
(26) (i) 서열 3502 내지 7001로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열 정보 및 표적 서열 정보 또는 표적 구조 모티프 정보를 입력 수단에 입력하는 단계,
(ii) 입력된 정보를 적어도 일시적으로 기록하는 단계,
(iii) 당해 데이터 기록수단에 기록된 서열 3502 내지 7001로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열 정보를 표적 서열 또는 표적 구조 모티프 정보와 비교하는 단계, 및
(iv) 표적 서열 또는 표적 구조 모티프 정보와 일치하거나 유사한 아미노산 서열 정보를 검색하고 해석하는 단계를 포함함을 특징으로 하여,
코리네형 세균 유래의 표적 서열 또는 표적 구조 모티프를 동정하기 위해 컴퓨터를 이용하는 방법.
(27) (i) 서열 2 내지 3501로부터 선택된 하나 이상의 염기 서열 정보, 염기 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 기능 정보 및 표적 염기 서열 정보를 입력하기 위한 입력 수단,
(ii) 입력된 정보를 적어도 일시적으로 기록하기 위한 데이터 기록 수단,
(iii) 당해 데이터 기록 수단에 기록된 서열 2 내지 3501로부터 선택된 하나 이상의 염기서열 정보를 표적 염기 서열 정보와 비교하여 서열 2 내지 3501로부터 선택되는 하나 이상의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드와 일치하거나 유사한 표적 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드 기능을 결정하기 위한 컴퍼레이터 수단 및,
(iv) 당해 컴퍼레이터 수단에 의해 얻어진 기능을 표시하는 출력수단을 구비함을 특징으로 하는,
코리네형 세균 유래의 표적 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드의 기능을 결정하기 위한 컴퓨터 이용 시스템.
(28) (i) 서열 2 내지 3501로부터 선택된 하나 이상의 염기 서열 정보, 염기 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 기능 정보 및 표적 염기 서열 정보를 입력하는 단계,
(ii) 입력된 정보를 적어도 일시적으로 기록하는 단계,
(iii) 당해 데이터 기록 수단에 기록된 서열 2 내지 3501로부터 선택된 하나 이상의 염기서열 정보를 표적 염기 서열 정보와 비교하는 단계,
(iv) 서열 2 내지 3501로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드와 일치하거나 유사한 표적 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드 기능을 결정하는 단계를 포함함을 특징으로 하여,
코리네형 세균 유래의 표적 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드의 기능을 결정하기 위해 컴퓨터를 이용하는 방법.
(29) (i) 서열 3502 내지 7001로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열 정보, 아미노산 서열에 기초한 기능 정보 및 표적 아미노산 서열 정보를 입력하기 위한 입력 수단,
(ii) 입력된 정보를 적어도 일시적으로 기록하기 위한 데이터 기록 수단,
(iii) 당해 데이터 기록 수단에 기록된 서열 3502 내지 7001로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열 정보를 표적 아미노산 서열 정보와 비교하여 서열 3502 내지 7001로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드와 일치하거나 유사한 표적 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 기능을 결정하기 위한 컴퍼레이터 수단 및,
(iv) 당해 컴퍼레이터 수단에 의해 얻어진 기능을 표시하는 출력수단을 구비함을 특징으로 하는,
코리네형 세균 유래의 표적 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 기능을 결 정하기 위한 컴퓨터 이용 시스템.
(30) (i) 서열 3502 내지 7001로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열 정보, 아미노산 서열에 기초한 기능 정보 및 표적 아미노산 서열 정보를 입력하는 단계,
(ii) 입력된 정보를 적어도 일시적으로 기록하는 단계,
(iii) 당해 데이터 기록 수단에 기록된 서열 3502 내지 7001로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열 정보를 표적 아미노산 서열 정보와 비교하는 단계,
(iv) 서열 3502 내지 7001로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드와 일치하거나 유사한 표적 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 기능을 결정하는 단계를 포함함을 특징으로 하여,
코리네형 세균 유래의 표적 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 기능을 결정하기 위해 컴퓨터를 이용하는 방법.
(31) 상기 (23), (25), (27) 및 (29) 중의 어느 한 항에 있어서. 코리네형 세균이 코리네박테리움속, 브레비박테리움속 또는 마이크로박테리움속에 속하는 미생물인 시스템.
(32) 상기 (24), (26), (28) 및 (30) 중의 어느 한 항에 있어서, 코리네형 세균이 코리네박테리움속, 브레비박테리움속 또는 마이크로박테리움속에 속하는 미생물인 방법.
(33) 코리네박테리움속에 속하는 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 아세토액시도필룸, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰, 코리네박테리움 칼루내, 코리네박테리움 허쿨리스, 코리네박테리움 릴리움, 코리네박테리움 멜라쎄콜라, 코리네박테리움 더모아미노게네스 및 코리네박테리움 암모니아게네스중에서 선택된 미생물인 상기 (31)에 기재된 시스템.
(34) 코리네박테리움속에 속하는 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 아세토액시도필룸, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰, 코리네박테리움 칼루내, 코리네박테리움 허쿨리스, 코리네박테리움 릴리움, 코리네박테리움 멜라쎄콜라, 코리네박테리움 더모아미노게네스 및 코리네박테리움 암모니아게네스중에서 선택된 미생물인 상기 (32)에 기재된 방법.
(35) 서열 1 내지 3501로부터 선택되는 하나 이상의 염기 서열 정보 또는 당해 서열에 기초하는 기능 정보가 기록된, 상기 (23) 또는 (27)에 기재된 시스템 또는 (24) 또는 (28)에 기재된 방법에 사용할 수 있는, 컴퓨터로 판독할 수 있는 기록 매체 또는 기억 장치.
(36) 서열 3502 내지 7001로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열 정보 또는 당해 서열에 근거하는 기능 정보가 기록된, 상기 (25) 또는 (29)에 기재된 시스템 또는 (26) 또는 (30)에 기재된 방법에 사용할 수 있는, 컴퓨터로 판독할 수 있는 기록 매체 또는 기억 장치.
(37) 컴퓨터로 판독할 수 있는 매체가 플로피 디스크, 하드 디스크, 자기 테이프, 랜덤 엑세스 메모리(RAM), 판독 전용 메모리(R0M), 자기광학 디스크(M0), CD-R0M, CD-R, CD-RW, DVD-R0M, DVD-RAM 및 DVD-RW로 이루어진 그룹중에서 선택되는 상기 (35) 또는 (36)에 기재된 기록 매체 또는 기억 장치.
(38) 코리네형 세균 유래의 호모세린데하이드로게나제의 N 말단에서 59번째의 Val 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 갖는, 호모세린데하이드로게나제 활성을 갖는 폴리펩타이드.
(39) 서열 6952에 기재된 아미노산 서열의 59번째의 Val 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드.
(40) 59번째의 Val 잔기가 Ala 잔기로 치환된 아미노산 서열을 갖는 상기 (38) 또는 (39)에 기재된 폴리펩타이드.
(41) 코리네형 세균 유래의 피루브산카복실라제의 N 말단에서 458번째의 Pro 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 갖는 피루브산카복실라제 활성을 갖는 폴리펩타이드.
(42) 서열 4265에 기재된 아미노산 서열의 458번째의 Pro 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드.
(43) 458번째의 Pro 잔기가 Ser 잔기로 치환된 아미노산 서열을 갖는 상기 (41) 또는 (42)에 기재된 폴리펩타이드.
(44) 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 상기 (38) 내지 (43)중의 어느 한 항에 기재된 폴리펩타이드.
(45) 상기 (38) 내지 (44) 중의 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA.
(46) 상기 (45)에 따른 DNA를 함유하는 재조합 DNA.
(47) 상기 (46)에 따른 재조합 DNA를 포함하는 형질전환체.
(48) 상기 (45)에 따른 DNA가 염색체에 통합된 형질전환체.
(49) 코리네형 세균인 상기 (47) 또는 (48)에 기재된 형질전환체.
(50) 코리네형 세균이 코리네박테리움 글루타미쿰인 상기 (49)에 기재된 형질전환체.
(51) 상기 (47) 내지 (50)중의 어느 한 항에 따른 형질전환체를 배지에 배양하여 배양물 중에 L-라이신를 생성 축적시켜 당해 배양물로부터 L-라이신을 채취함을 특징으로 하는 L-라이신의 제조 방법.
(52) (i) 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산 및 이들의 동족체로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 발효법에 의해 생산할 수 있도록 변이 육종된 코리네형 세균 유래의 생산 균주의 게놈 또는 유전자의 염기 서열을 서열 1 내지 3431 내의 대응하는 염기 서열과 비교하는 단계,
(ii) (i)에서 얻어진 비교 결과로부터 상기 생산 균주에 존재하는 변이점을 동정하는 단계,
(iii) (ii)의 단계에서 동정한 변이점을 당해 변이를 갖지 않는 코리네형 세균에 도입하는 단계 및,
(iv) (iii)의 단계에서 수득한 코리네형 세균의 (i)에서 선택된 화합물의 발효법에 의한 생산성을 조사하는 단계를 포함하여,
서열 1 내지 3431에 기재된 염기 서열 정보를 사용하여 코리네형 세균을 육종하는 방법.
(53) 유전자가 생합성 경로 또는 시그널 전달경로상의 효소를 암호화하는 유 전자인 상기 (52)에 기재된 육종 방법.
(54) 변이점이 생산성을 향상시키거나 안정화시키는 유효 변이에 관한 변이점인 (52)에 기재된 육종 방법.
(55) (i) 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산 및 이들의 동족체로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 발효법에 의해 생산할 수 있도록 변이 육종된 코리네형 세균 유래의 생산 균주의 게놈 또는 유전자의 염기 서열을 서열 1 내지 3431 내의 대응하는 염기 서열과 비교하는 단계,
(ii) (i)에서 얻어진 비교 결과로부터 상기 생산 균주에 존재하는 변이점을 동정하는 단계,
(iii) 변이점을 갖는 코리네형 세균으로부터 (ii)에서 동정된 변이점을 결실시키는 단계 및,
(iv) (iii)의 단계에서 수득한 코리네형 세균의 (i)에서 선택된 화합물의 발효법에 의한 생산성을 조사하는 단계를 포함하여,
서열 1 내지 3431에 기재된 염기 서열 정보를 사용하여 코리네형 세균을 육종하는 방법.
(56) 유전자가 생합성 경로 또는 시그널 전달경로상의 효소를 암호화하는 유전자인 상기 (55)에 기재된 육종 방법.
(57) 변이점이 생산성을 감소시키거나 불안정화시키는 변이점인 상기 (55)에 기재된 육종 방법.
(58) (i) 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산 및 이들의 동족체로부터 선택 되는 하나 이상의 화합물의 생합성에 관여하는 아이소자임을 서열 2 내지 3431에 기재된 염기 서열 정보에 근거하여 동정하는 단계,
(ii) (i)의 단계에서 동정한 아이소자임을 동일한 활성을 갖는 아이소자임으로 분류하는 단계,
(iii) 동일한 활성을 갖는 아이소자임을 암호화하는 모든 유전자를 일괄적으로 변이시키는 단계 및,
(iv) (iii)의 단계에서 수득한 유전자를 사용하여 형질전환시킨 코리네형 세균의 (i)에서 선택된 화합물의 발효법에 의한 생산성을 조사하는 단계를 포함하여,
서열 2 내지 3431에 기재된 염기 서열 정보를 사용하여 코리네형 세균을 육종하는 방법.
(59) (i) 서열 2 내지 3431에 기재된 개방 판독 프레임(ORF)의 기능 정보를 정리하는 단계,
(ii) 공지된 생합성 경로 또는 시그널 전달경로상의 효소에 상기에서 정리된 ORF를 대응시키는 단계,
(iii) 코리네형 세균에서 공지되어 있는 생합성 경로 또는 시그널 전달경로에 관한 정보와 조합하여 코리네형 세균에서의 미지의 생합성 경로 및 시그널 전달경로를 해명하는 단계,
(iv) (iii)의 단계에서 해명된 경로와 목적하는 유용 생산물의 생합성 경로를 비교하는 단계 및,
(v) (iv)의 단계에서 목적하는 유용 생산물의 생합성에 중요하다고 판단되는 경로를 강화시키거나 (iv)의 단계에서 목적하는 유용 생산물의 생합성에 중요하지 않은 경로를 약화시키기 위해, 서열 2 내지 3431에 기재된 염기 서열 정보에 근거하여 유전공학적 방법에 의해 코리네형 세균을 변이시키는 단계를 포함하여,
서열 2 내지 3431에 기재된 염기 서열 정보를 사용하여 코리네형 세균을 육종하는 방법.
(60) 상기 (52) 내지 (59)항 중의 어느 한 항에 따른 육종방법에 의해 수득되는 코리네형 세균.
(61) 코리네박테리움속, 브레비박테리움속 또는 마이크로박테리움속에 속하는 미생물인 상기 (60)에 기재된 코리네형 세균.
(62) 코리네박테리움속에 속하는 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 아세토액시도필룸, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰, 코리네박테리움 칼루내, 코리네박테리움 허쿨리스, 코리네박테리움 릴리움, 코리네박테리움 멜라쎄콜라, 코리네박테리움 더모아미노게네스 및 코리네박테리움 암모니아게네스로부터 선택되는 미생물인 상기 (61)에 기재된 코리네형 세균.
(63) 상기 (60) 내지 (62) 중의 어느 한 항에 따른 코리네형 세균을 배지에 배양하여 배양물 중에 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산 및 이들의 동족체로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 생성 축적시켜 당해 배양물로부터 상기 화합물을 채취하는 것을 특징으로 하는, 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산 및 이들의 동족체로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 제조하는 방법.
(64) 화합물이 L-라이신인 상기 (63)에 기재된 제조 방법.
(65) (i) 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산 및 이들의 동족체로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 발효법에 의해 생산할 수 있도록 변이 육종된 코리네형 세균 유래의 생산균주 및 당해 생산균주의 친주의 균체로부터 각각 균체 유래의 단백질을 조제하는 단계,
(ii) (i)의 단계에서 조제된 단백질을 2차원 전기영동법에 의해 분리하는 단계,
(iii) 분리된 단백질을 검출하고 생산균주 유래의 단백질과 친주 유래의 단백질의 각각의 발현량을 비교하는 단계,
(iv) 비교 결과, 상이한 발현량을 나타내는 단백질을 펩티다제로 처리하여 펩타이드 단편을 추출하는 단계,
(v) (iv)의 단계에서 수득한 펩타이드 단편의 아미노산 서열을 해석하는 단계 및,
(vi) (v)의 단계에서 수득한 아미노산 서열과 서열 3502 내지 7001에 기재된 아미노산 서열을 비교하여 당해 아미노산 서열을 갖는 단백질을 동정하는 단계를 포함하여,
프로테옴 해석에 근거하여 유용 변이에 관한 단백질을 동정하는 방법.
여기서 프로테옴(proteom)이란 단백질과 게놈으로 이루어진 조어이며 유전자의 발현을 폴리펩타이드의 수준에서 조사하는 방법이다.
(66) 코리네형 세균이 코리네박테리움속, 브레비박테리움속 또는 마이크로박 테리움속에 속하는 미생물인 상기 (65)에 기재된 동정 방법.
(67) 코리네박테리움속에 속하는 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 아세토액시도필룸, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰, 코리네박테리움 칼루내, 코리네박테리움 허쿨리스, 코리네박테리움 릴리움, 코리네박테리움 멜라쎄콜라, 코리네박테리움 더모아미노게네스 및 코리네박테리움 암모니아게네스로부터 선택되는 미생물인 상기 (66)에 기재된 동정 방법.
(68) 코리네박테리움 글루타미쿰 AHP-3 (FERM BP-7382).
본 발명에 의해 코리네형 세균 유래의 폴리뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드, 당해 폴리뉴클레오타이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드를 고착한 올리고뉴클레오타이드 어레이, 폴리뉴클레오타이드에 암호화되는 폴리펩타이드, 당해 폴리펩타이드를 인식하는 항체, 당해 폴리펩타이드 및/또는 항체를 고착한 폴리펩타이드 어레이, 당해 폴리뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드의 염기 서열 및 당해 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 기록한 컴퓨터로 판독할 수 있는 기록매체 및 당해 기록매체를 사용하는 컴퓨터에 기초하는 시스템을 제공할 수 있다.
하기에 코리네형 세균의 전체 염기 서열 결정에 근거하여 본 발명을 상세하게 설명한다.
1. 코리네형 세균의 전체 염기 서열의 결정
본원에서 사용되는 바와 같은 코리네형 세균이란 문헌[Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 8, 599 (1974)]에서 정의되는 코리네박테리움속, 브레비박테리움속 또는 마이크로박테리움속에 속하는 미생물을 말한다.
구체적으로는, 코리네박테리움 아세토악시도필룸, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰, 코리네박테리움 칼루내, 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 허쿨리스, 코리네박테리움 릴리움, 코리네박테리움 멜라쎄콜라, 코리네박테리움 더모아미노게네스, 브레비박테리움 사카로리티쿰, 브레비박테리움 임마리오필룸, 브레비박테리움 로제움, 브레비박테리움 티오게니탈리스, 마이크로박테리움 암모니아필룸 등을 들 수 있다.
보다 구체적으로는. 코리네박테리움 아세토악시도필룸 ATCC 13870, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ATCC l5806, 코리네박테리움 칼루내 ATCC 15991, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC l3032, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13060, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13826[구(舊) 속종 브레비박테리움 플라붐 또는 코리네박테리움 락토퍼멘툼], 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 14020[구 속종 브레비박테리움 디바리카툼], 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869[구 속종 브레비박테리움 락토퍼멘툼], 코리네박테리움 허쿨리스 ATCC 13868, 코리네박테리움 릴리움 ATCC 15990, 코리네박테리움 멜라쎄콜라 ATCC 17965, 코리네박테리움 더모아미노게네스 FERM 9244, 브레비박테리움 사카로리티쿰 ATCC 14066, 브레비박테리움 임마리오필룸 ATCC 14068, 브레비박테리움 로제움 ATCC 13825, 브레비박테리움 티오게니탈리스 ATCC 19240, 마이크로박테리움 암모니아필룸 ATCC 15354를 들 수 있다.
(1) 코리네형 세균의 게놈 DNA의 조제
코리네형 세균을 통상적인 방법에 의해 배양한다.
배지로서 당해 미생물이 자화(資化)할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하며 당해 미생물의 배양을 효율적으로 실시할 수 있는 배지이면 천연배지, 합성배지의 어느 것이나 사용할 수 있다.
예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰에서는 당해 배지로서 1% 글리신을 함유하는 BY 배지(7g/ℓ 육즙, 10g/ℓ 펩톤, 3g/ℓ 염화나트륨, 5g/ℓ 효모 추출물, pH 7.2) 등을 들 수 있다. 배양은 25 내지 35℃에서 밤새 수행한다.
배양 완료 후, 배양액으로부터 원심분리에 의해 균체를 회수한다. 수득된 균체를 세정액으로 세정한다.
당해 세정액으로서 예를 들면, STE 완충액[l0.3% 수크로즈, 25mmol/ℓ 트리스 염산염, 25mmol/ℓ 에틸렌디아민테트라아세트산(이하, EDTA라고 약기), pH 8.0] 등을 들 수 있다.
당해 세정 균체로부터 게놈 DNA의 취득은 리소자임 및 계면활성제인 SDS 등을 사용하여 균체의 세포벽을 용해한 다음, 페놀 용액 및 페놀/클로로포름 용액을 사용하여 단백질 등을 제거하고 에탄올 등을 사용하여 게놈 DNA를 침전시키는 일반적인 게놈 DNA의 취득법에 준하여 실시할 수 있지만 구체적으로는 하기의 방법을 예시할 수 있다.
당해 세정한 균체를 5 내지 20㎎/㎖의 리소자임을 함유하는 세정액에 현탁해 진탕한 다음, 5 내지 20% SDS를 첨가하여 용균시킨다. 진탕은 통상적으로 25 내지 40℃에서 30분 내지 2시간 동안 완만하게 실시한다. 진탕 후에 60 내지 70℃에서 5 내지 15분 동안 유지시킴으로써 용균시킬 수 있다.
용균 후, 현탁액을 상온까지 냉각하여 5 내지 20㎖의 트리스 중화 페놀을 가하여 실온에서 15 내지 45분 동안 완만하게 진탕한다.
진탕한 다음, 원심분리(15.000 × g, 20분 동안, 20℃)를 실시하여 수층을 분리하여 취한다.
동일한 조작으로 페놀/클로로포름 추출, 클로로포름 추출(2회)을 실시한 다음, 수층에 1/10량의 3mol/ℓ 아세트산나트륨 용액(pH 5.2), 2배량의 이소프로판올을 가하여 완만하게 혼화하여 게놈 DNA를 침전시킨다.
게놈 DNA를 다시 0.01 내지 0.04㎎/ℓ의 RNase를 함유하는 완충액에 용해한다. 당해 완충액으로서 예를 들면, TE 완충액(10mmol/ℓ 트리스 염산염, 1mmol/ℓ EDTA, pH 8.0)을 사용할 수 있다. 용해한 다음, 25 내지 40℃에서 20 내지 50분 동안 유지한 다음, 상기와 동일하게 페놀 추출, 페놀/클로로포름 추출, 클로로포름 추출을 실시한다.
추출한 다음, 이소프로판올 침전을 실시하여 발생한 게놈 DNA 침전을 70% 에탄올로 세정한 다음, 공기 건조하여 TE 완충액에 용해함으로써 게놈 DNA 용액을 취득할 수 있다.
(2) 샷건 라이브러리의 작제
상기 (1)에서 조제한 코리네형 세균의 게놈 DNA를 사용하여 게놈 DNA 라이브러리를 작제하는 방법으로서는 문헌[Molecular Cloning, A laboratory Manual, Second Edition (1989)(이하, 몰리큘러 클로닝 제2판이라고 약칭한다)]에 기재된 방법을 사용할 수 있지만, 특히 샷건법에 의한 전체 염기 서열의 결정에 사용하는데 적절한 게놈 DNA 라이브러리의 작제법으로서는 하기에 기재된 방법을 예시하는 할 수 있다.
상기 (1)에서 조제한 코리네형 세균의 게놈 DNA 0.01㎎을 전체량 0.4㎖가 되도록 TB 완충액 등의 완충액을 가하여 초음파 분쇄기(Yamato Powersonic Model 50)를 사용하여 1 내지 10kb의 단편으로 분단한다. 초음파 분쇄기의 처리 조건으로서는 출력 20으로 연속적으로 5초 동안 처리하는 조건을 들 수 있다.
수득된 게놈 DNA 단편의 말단을 DNA 블런팅 키트(DNA blunting Kit, 다카라슈조사제) 등을 사용하여 평활화한다.
평활화한 게놈 단편을 아가로스 겔 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 등에 의해 분획하여 1 내지 2kb의 게놈 단편을 겔로부터 절단 인출한다.
당해 겔에 DNA 용출용의 완충액, 예를 들면, MG 용출 완충액(0.5mol/ℓ 아세트산암모늄, 10mmol/ℓ 아세트산 마그네슘, 1mmol/ℓ EDTA, 0.1% SDS) 등을 0.2 내지 0.5㎖ 가하여 25 내지 40℃에서 밤새 진탕하여 DNA를 용출한다.
생성된 DNA 용출액을 페놀/클로로포름 처리 후, 에탄올 침전하여 게놈 라이브러리 삽입체를 취득한다.
당해 삽입체를 T4 리가제(T4 ligase, 다카라슈조사제) 등을 사용하여 적당한 벡터 예를 들면, pUC18 SmaI/BAP(Amersham Pharmacia Biotech사제) 등에 결합시킨다. 결합 조건으로서는 10 내지 20℃에서 20 내지 50시간 동안 정치하는 조건을 들 수 있다.
수득된 결합 반응물을 에탄올 침전하여 5 내지 20㎕의 TE 완충액에 용해한다.
당해 결합 용액 0.5 내지 2㎕를 사용하여 통상적인 방법에 따라 대장균을 형질전환시킨다. 당해 형질전환 방법으로서는 대장균에 ELECTR0 MAX DH10B (Life Technologies사제)를 사용하는 전기천공법을 예시할 수 있다. 전기천공법은 첨부 실험서에 기재된 조건으로 실시할 수 있다.
형질전환된 대장균을 한천을 함유하는 적당한 선택 배지, 예를 들면, 클로닝벡터로 pUC18을 사용하는 경우에는 10 내지 100㎎/ℓ의 암피실린을 함유하는 LB 평판 배지[한천을 1.6% 함유하는 LB배지(10g/ℓ 박토트립톤, 5g/ℓ 효모 추출물, 10g/ℓ 염화나트륨, pH 7.0)]에 도포하여 배양한다.
형질전환체는 당해 평판 배지 위에 형성되는 콜로니로서 취득할 수 있다. 이때, 평판 배지에 X-gal 및 IPTG(이소프로필-β-티오갈락토피라노시드)를 첨가하고 훑어서 게놈 DNA를 함유하는 재조합체 DNA를 보유하는 형질전환주를 백색 콜로니로서 선택할 수 있다.
당해 형질전환체는 0.1㎎/㎖ 암피실린을 함유하는 LB 배지를 0.05㎖씩 첨가한 96웰 역가 플레이트 중에서 정치 배양하여 배양에 의해 얻어진 배양물은 하기 (4)의 실험에 사용할 수 있다. 또한 당해 배양액에 20% 글리세롤을 함유하는 LB 배지를 0.05㎖씩 첨가 혼합함으로써 당해 배양액은 -80℃로 보존할 수 있으며 필요한 때에 사용할 수 있다.
(3) 코스미드 라이브러리의 작성
상기 (1)에서 조제한 코리네형 세균의 게놈 DNA 0.1㎎을 제한효소, 예를 들면, Sau3AI 등으로 부분 절단하고 10% 수크로즈 완충액(1 mol/ℓ NaC1, 20mmol/ℓ 트리스 염산염, 5mmol/ℓ EDTA, 10% 수크로즈, pH 8.0) 및 40% 수크로즈 완충액(10% 수크로즈 완충액의 수크로즈의 농도를 40%로 한 것)을 사용하여 작제한 10 내지 40% 수크로즈 밀도 구배를 사용하고 초원심 분리(26,000rpm, 18시간, 20℃)를 실시한다.
원심분리 후, 분리액을 l㎖씩 튜브에 분배하여 아가로스 겔 전기영동으로 각 분획의 DNA 단편 길이를 확인한 다음, 약 40kb의 DNA 단편을 많이 함유하는 분획을 에탄올 침전시킨다.
수득된 DNA 단편을 당해 단편과 연결할 수 있는 부착 말단을 갖는 코스미드 벡터에 연결한다. 게놈 DNA를 Sau3AI를 사용하여 부분 절단하는 경우에는 예를 들면, superCosl(Stratagene사제)의 BamHI 부위에 당해 부분 절단물을 제조원의 지침에 따라 연결할 수 있다.
수득된 연결 산물은 몰리큘러 클로닝 제2판에 기재된 방법에 따라 조제할 수 있는 패키징 추출물을 사용하여 패키징한 다음, 대장균의 형질전환에 사용할 수 있지만 보다 구체적으로는 시판하는 패키징 추출물인 Gigapack III Gold Packaging Extract(Stratagene사제) 등을 사용하여 제조원의 지침에 따라 패키징하여 대장균 XL-1-BlueMR(Stratagene사제)주 등에 도입할 수 있다.
형질전환된 대장균은 암피실린를 함유하는 LB 평판 배지에 도포하여 배양한다.
형질전환체는 당해 평판 배지 위에 형성된 콜로니로서 취득할 수 있다.
당해 형질전환체를 암피실린 0.1㎎/㎖를 함유하는 LB 배지 0.05㎖를 첨가한 96웰 역가 플레이트 중에서 정치 배양한다.
배양에 의해 수득된 배양물은 하기 (4)의 실험에 사용할 수 있다. 당해 배양액에 20% 글리세롤를 함유하는 LB 배지를 0.05㎖씩 첨가, 혼합함으로써 당해 배양액은 -80℃로 보존할 수 있으며 필요한 때에 사용할 수 있다.
(4) 염기 서열의 결정
(4-1) 주형의 조제
코리네형 세균 게놈 DNA의 전체 염기 서열은 전체 게놈 샷건법[참조: Science, 269, 496-512 (1995)]을 기본으로 하여 결정할 수 있다.
전체 게놈 샷건법에서 사용하는 주형으로서는 상기 (2)에서 조제한 라이브러리를 사용하여 PCR에 의해 조제할 수 있다[참조: DNA Research, 5, 1-9(1998)].
구체적으로는, 하기의 방법으로 주형을 조제할 수 있다.
암피실린 0.1㎎/㎖를 함유하는 LB 배지를 웰당 0.08㎖씩 분주(分注)한 96웰 역가 플레이트의 각 웰에 전체 게놈 샷건 라이브러리 유래 클론을 레플리케이터 (GENETIX사제)에서 식균하여 37℃에서 밤새 정치 배양을 실시한다.
다음으로, 당해 배양액을 TaKaRa Ex Taq(다카라슈조사제)를 사용하고 PCR용 반응액을 0.025㎖씩 분주한 96웰 반응 플레이트(PE Biosystems사제)에 카피 플레이트(토켄사제)를 사용하여 이식하고 GeneAmp PCR system 9700(PB Biosystems사제)를 사용하여 마키노 등의 프로토콜[Makino et al., DNA Research, 5, 1-9(1998)]에 따라 PCR을 실시하여 삽입 단편의 증폭을 실시한다.
PCR 산물 정제용 키트(Amersham Pharmacia Biotech사제)에 의해 잉여 프라이머 및 뉴클레오타이드의 제거를 실시하여 이것을 서열 분석 반응의 주형으로서 사용한다.
또한, 이본쇄 DNA 플라스미드를 주형으로 하여 염기 서열을 결정할 수 있다.
주형으로서 사용하는 이본쇄 DNA 플라스미드는 하기의 방법으로 취득할 수 있다.
암피실린 0.05㎎/㎖를 함유하는 2×YT 배지(16g/ℓ 박토트립톤, 10g/ℓ 효모 추출물, 5g/ℓ 염화나트륨, pH 7.0)을 1.5㎖씩 분주한 24웰 또는 96웰 플레이트의 각 웰에 전체 게놈 샷건 라이브러리 유래 클론을 식균하여 37℃에서 밤새 진탕 배양을 실시한다.
당해 배양액으로부터 플라스미드 자동조제기 KURAB0 PI-50(구라시키보세키사제), 멀티스크린(Millipore사제) 등을 사용하고 구라시키보세키사 또는 밀리포어 (Millipore)사의 프로토콜에 따라 이본쇄 DNA 플라스미드를 조제할 수 있다.
플라스미드의 정제에는 벡크맨 콜터사(Beckman Coulter)의 바이오멕 2000(Biomek 2000) 등을 사용할 수 있다.
수득된 정제 이본쇄 DNA 플라스미드를 0.1㎎/㎖ 정도가 되도록 물에 용해하여 서열 분석의 주형으로서 사용할 수 있다.
(4-2) 서열 분석 반응
서열 분석 반응은 시판하는 서열 키트 등을 사용하여 실시할 수 있으며 구체적으로는 하기에 기재하는 방법을 예시할 수 있다.
ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(PE Biosystems사제) 용액 6㎕에 대하여 M13 정방향 프라이머(M13-21) 또는 M13 역방향 프라이머(M13REV)[DNA Research, 5, 1-9(1998)]를 각각 1 내지 2pmo1 및 상기 (4-1)에서 조제한 주형(PCR 산물 또는 플라스미드) 50 내지 200ng를 혼합하고 10㎕의 서열 분석 반응액을 조제한다.
당해 반응액을 사용하여 GeneAmp PCR System 9700(PE Biosystems사제) 등을 사용하여 35 내지 55사이클의 다이 터미네이터(dye terminator) 서열 분석 반응을 실시한다. 사이클 파라미터는 시판하는 키트, 예를 들면, ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit 등에 부속하는 매뉴얼에 따라 실시할 수 있다.
샘플의 정제는 Mu1tiScreen HV Plate(Millipore사제) 등의 시판하는 제품을 사용하여 시판하는 제품에 부속의 매뉴얼에 따라 실시할 수 있다.
이렇게 정제된 반응물을 에탄올 침전, 건조하여 분석에 사용한다. 당해 건 조 반응물은 -30℃의 암소(暗所)에서 보존할 수 있으며 필요한 때에 사용할 수 있다.
당해 건조 반응물은 시판하는 서열 분석기(sequencer) 및 분석기(analyzer)를 사용하여 부속 매뉴얼에 따라 분석할 수 있다.
시판하는 서열 분석기로서는 ABI PRISM 377 DNA 서열 분석기(Pe Biosystems사제) 등을 들 수 있다. 분석기로서는 ABI PRISM 3700 DNA 분석기(PE Biosystems사제) 등을 들 수 있다.
(5) 어셈블리
상기 (4)에서 얻어진 서열 정보의 해석에 사용하는 베이스콜에는 phred(The University of Washington) 등의 소프트웨어 를 사용할 수 있다. 벡터서열 정보를 제거하는데는 Cross-Match(The University of Washington), SPS Cross-Match (Southwest Parallel Softwrare사제) 등의 소프트웨어를 사용할 수 있다.
어셈블리에는 phrap(The University of Washingt), SPS phrap(Southwest Parallel Software사제) 등의 소프트웨어를 사용할 수 있다.
상기한 해석 및 결과의 출력 작업에는 UNIX, PC, 매킨토시 등의 컴퓨터를 이용할 수 있다.
어셈블리의 결과, 수득되는 콘티그는 그래피컬 에디터 consed(The University of Washington) 등을 사용하여 해석할 수 있다.
베이스 콜(base call)로부터 어셈블리까지의 일련의 작업을 consed에 부속하 는 스크립트 pbredPhrap를 이용하여 일괄적으로 실시할 수 있다. 본 발명에서는, 소프트웨어는 또한 컴퍼레이터(comparator)로서 기재된다.
(6) 갭 부분의 염기 서열 결정
상기 (3)에서 구축한 코스미드 라이브러리 중의 각 코스미드를 (4-1)에 기재한 이본쇄 DNA 플라스미드 조제와 동일한 방법으로 조제한다. 이러한 코스미드의 삽입 단편 말단부의 염기 서열을 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(PE Biosystems사제) 등의 시판하는 키트를 사용하여 제조원의 지침에 따라 결정한다.
코스미드 약 800개 클론의 삽입 단편의 양쪽 말단의 서열 분석을 실시하여 이의 서열과 일치하는 (5)에서 얻어진 샷건 서열 분석 유래 콘티그 중의 염기 서열을 검색한다. 당해 작업에 의해 각 코스미드 클론과 각 콘티그의 연쇄 관계를 해명하여 상호 정렬화를 실시한다. 또한 이러한 결과를 공지된 물리적 지도와 대응시킴으로써 코스미드와 콘티그의 맵핑을 실시한다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032주의 경우에는 문헌[Mol. Gen. Genet., 252, 255-265 (1996)]의 물리적 지도를 이용할 수 있다.
또한 콘티그에서는 카버되지 않는 영역(갭부)의 서열은 하기의 방법으로 결정한다.
콘티그의 말단에 위치하는 서열을 함유하는 클론을 선발한다. 이들 중에서 삽입 단편의 한쪽 말단만의 서열밖에 결정되어 있지 않은 클론를 선발하여 삽입 단 편의 역말단의 서열을 결정한다.
2개의 콘티그에 삽입 단편의 각각의 말단의 서열이 함유되도록 전체 게놈 유래 샷건 라이브러리 클론 또는 코스미드 클론를 동정하며 당해 클론의 삽입 단편의 전체 염기 서열을 결정한다.
당해 방법에 의해, 이러한 갭 부분의 염기 서열을 결정할 수 있다.
갭 부분을 카버하는 샷건 라이브러리 클론 또는 코스미드 클론이 없는 경우에는 이의 콘티그 말단의 서열에 상보하는 프라이머를 작성하여 PCR에 의해 갭 영역의 DNA 단편을 증폭한다. 당해 증폭 DNA 단편을 주형으로서 사용하는 프라이머 워킹법에 의해 또는 당해 증폭 DNA 단편으로부터 조제한 샷건 클론의 서열을 결정하는 샷건법에 의해 서열 분석을 실시하여 당해 영역의 염기 서열을 결정할 수 있다.
서열 정밀도가 낮은 영역에 관해서는 consed(The Uhiversity of Washington)의 AUT0FINISH 기능과 NAVIGATING 기능을 이용하여 프라이머를 합성하여 프라이머 워킹법에 의해 서열 결정을 실시하여 서열 정밀도를 높일 수 있다.
이와 같이 결정되는 전체 게놈의 염기 서열로서 예를 들면, 서열 1에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032주 게놈의 전체 염기 서열을 들 수 있다.
(7) 서열 1의 염기 서열을 이용한 미생물 게놈 DNA의 염기 서열의 결정
상기 결정된 서열 1에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032주 게놈의 전체 염기 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 염기 서열을 서열 1의 염기 서열을 이용하여 결정할 수 있으며, 본 발명의 서열 1의 염기 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드도 본 발명의 폴리뉴클레오타이드이다. 본 발명의 서열 1의 염기 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드란 서열 1의 염기 서열에서 연속한 5 내지 50개 염기로 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 사용하여 예를 들면, 염색체 DNA를 주형으로 하는 PCR법을 이용하고 이의 염색체 DNA의 전체 염기 서열을 결정할 수 있는 폴리뉴클레오타이드이다. 전체 염기 서열을 결정하는데에 특히 바람직한 프라이머는 서로 300 내지 500bp 정도 떨어저 위치하는 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이며 당해 올리고뉴클레오타이드중에서도 주요 대사경로에 관한 단백질을 암호화하는 DNA에서 선택하는 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드가 특히 바람직하다. 당해 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 염색체 DNA의 전체 염기 서열을 결정할 수 있는 폴리뉴클레오타이드로서는 예를 들면, 코리네속에 속하는 미생물 유래의 염색체 DNA를 구성하는 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있으며, 바람직하게는 코리네박테리움속에 속하는 미생물 유래의 염색체 DNA를 구성하는 폴리뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체 DNA를 구성하는 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있다.
2. 전체 게놈 염기 서열 정보를 이용한 ORF 및 발현 조절 단편의 동정 및 ORF의 기능 추정
상기 1에 의해 결정된 코리네형 세균 유래의 게놈의 전체 염기 서열 정보에 의해 ORF 및 발현 조절 단편을 동정할 수 있으며 또한, 동정된 ORF의 기능을 추정할 수 있다.
ORF란 mRNA의 염기 서열 중에서 아미노산 서열로서 해독되며 단백질로 될 수 있는 연속된 영역이며 mRNA의 ORF를 암호화하는 DNA상의 영역도 ORF라고 불린다.
발현 조절 단편(expression modulating fragment, 이하, EMF로 약기한다)이란 작동가능하게 연결된 ORF 또는 이외의 서열의 발현을 조절하는 일련의 폴리뉴클레오타이드 단편을 의미한다. 「작동가능하게 연결된 서열의 발현을 조절한다」란 EMF의 존재에 의해 서열의 발현이 변화하는 것을 의미한다. EMF로서는 프로모터, 오퍼레이터, 인핸서, 사일런서(silencer), 리보솜 결합 서열, 전사 종결 서열 등을 들 수 있다. 코리네형 세균의 경우, EMF는 통상적으로 유전자간 세그먼트(2개의 유전자 사이에 있는 단편; 길이 약 10 내지 200 뉴클레오타이드)에 존재한다. 즉, 길이 10개 뉴클레오타이드 이상의 유전자간 세그먼트에는 EMF가 존재하는 경우가 많다. EMF는 또한 공지된 EMF의 서열을 표적 서열, 표적구조 모티프(또는 표적 모티프)에 사용하고 FASTA[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444-48(1988)], BLAST[참조: J. Mol. Biol., 215, 403-410(1990)] 등의 적당한 소프트웨어 또는 컴퍼레이터에 의해 추정할 수 있다. 또는 공지된 EMF 포획 벡터(예: pKK232-8: Amersham Pharmacia Biotech사제)에 의해 동정 및 평가할 수 있다.
「표적 서열」이란 6개 이상의 뉴클레오타이드의 염기 서열 또는 2개 이상의 아미노산 서열 또는 당해 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열이다. 표적서열은 서열이 길어질수록 데이터 베이스중에 랜덤하게 나타날 가능성은 적어진다. 표적 서열의 가장 바람직한 길이는 약 10 내지 100개의 아미노산 또는 약 30 내지 300개의 뉴클레오타이드 잔기이다.
「표적구조 모티프」 또는 「표적 모티프」란 당업자가 공지된 수단에 의해 임의의 합리적으로 선택되는 서열 또는 서열의 조합을 말하며, 폴리펩타이드를 폴딩하여(folding) 형성되는 3차원 구조에 근거하여 선택되는 것으로 다양한 모티프가 공지되어 있다.
폴리펩타이드의 표적 모티프는 예를 들면, 효소 활성부위, 단백질-단백질 상호작용 부위나 시그널 서열이지만 이들에 한정되지 않는다. 핵산의 표적 모티프로서는 프로모터 서열, 전사 조절인자 결합서열이나 헤어핀 구조 등을 들 수 있다.
유용성이 높은 EMF로서는 예를 들면, 고효율 프로모터나 유도발현 프로모터를 들 수 있다. 이들의 취득은 발현이 높은 것으로 나타나고 있거나 예상되는 유전자(예: 리보솜 RNA 유전자: GenBank 접속 번호 M16175, Z46753)나 목적하는 유도 패턴을 나타내는 유전자[예: 아세트산으로 유도되는 이소시트르산 리아제 유전자: 일본 공개특허공보 제(평)5-56782]의 염기 서열을 상기 1에서 결정한 전체 게놈 염기 서열과 정렬하여 위치를 결정하고 이의 상류부분(통상적으로 해독 개시위치로부터 200 내지 500개 뉴클레오타이드)의 게놈 단편을 단리하는 것에 의해 가능하다. 또한 상기 EMF 포획 벡터로 포획한 프로모터 중에서 고효율의 것이나 목적하는 유도 패턴을 나타내는 것을 선택함으로써 유용성이 높은 EMF를 취득할 수 있다.
ORF의 동정은 개개의 ORF에 공통하는 특징을 추출하여 여기에 근거하는 일반적 모델을 구축하여 대상 서열과 이의 모델의 적합도를 측정함으로써 실시할 수 있 다. 당해 동정에는 GeneMark[참조: Nuc. Acids. Res., 22, 4756-67(1994): GenePro사제], CeneMark.hmm(CenePro사제), CeneHacker[참조: 단백질 핵산효소, 42, 3001-07(1997)], Glimmer[The Institute of Genomic Research; Nuc. Acids. Res. 26, 544-548(1998)] 등의 소프트웨어를 사용할 수 있다. 통상적으로 이들 소프트웨어를 사용하는 예측에는 데폴트(초기 설정)의 파라미터를 사용하지만 필요에 따라 파라미터를 변경할 수 있다.
상기한 예측 작업에는 UNIX, PC, 매킨토시 등의 컴퓨터를 이용할 수 있다.
당해 방법에 의해 예측되는 ORF로서 예를 들면, 서열 1에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈중에 존재하는 서열 2 내지 3501에서 기재된 염기 서열을 갖는 ORF 등을 들 수 있다. 당해 ORF에는 서열 3502 내지 7001에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드가 암호화되어 있다.
ORF의 기능추정은 동정된 ORF의 아미노산 서열을 GenBank 데이터 베이스, 0WL 등의 유래의 단백질 암호화 영역으로 이루어진 데이터 베이스인 Swiss-Prot, PIR, CenBank-nr-aa, CenPept 등의 아미노산 데이터 베이스에 대하여 공지된 상동체(homolog) 서열과의 상동성 검색 소프트웨어 BLAST, FASTA, Smith & Waterman 등을 사용하는 상동성 검색을 수행함으로써 실시할 수 있다.
또한, 상동성 검색에 의해 공지된 단백질의 아미노산 서열과의 동일성 및 유사성도 해석할 수 있다.
동일성이란 예를 들면, 3개의 아미노산 위치가 다른 10개 아미노산 길이의 2개의 폴리펩타이드는 70%의 동일성을 갖는 것을 의미한다. 또한, 서로 다른 3개 의 아미노산 중의 1개에 관해서 아미노산은 상이해도 유사(예: 류신과 이소류신)이면 80%의 유사성을 갖는것으로 된다.
구체적인 예로서 표 1(표 1aa 내지 표 1fe)의 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032주 유래의 ORF의 염기 서열과 가장 상동성이 높으면 판정된 서열의 공지 데이터 베이스에서의 등록번호 및 당해 서열의 유전자 명칭, 당해 유전자의 기능 및 당해 공지된 아미노산 해독서열과의 비교에서 동일성 및 유사성을 나타낸다.
이와 같이 본 발명의 방법에 따라 코리네형 세균 유래의 게놈의 전체 염기 서열을 결정함으로써 방대한 수의 코리네형 세균 유래의 신규 유전자를 동정할 수 있으며 또한 당해 유전자의 기능의 추정이 가능하다. 코리네형 세균은 산업상 유용한 미생물이므로 동정된 유전자의 대부분은 산업상 유용하다.
또한 추정된 기능을 분류하는 것으로 그 미생물의 특징이 분명해지며 육종상의 귀중한 정보를 얻을 수 있다.
또한, 상기에서 수득한 코리네형 세균 유래의 ORF 정보로부터 당해 미생물에서 대응하는 ORF를 문헌(몰리큘러 클로닝 제2판) 등에 기재된 통상적인 방법에 의해 조제하여 취득할 수 있다. 즉, ORF에 인접하는 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 합성하여 그것을 프라이머로서 코리네형 세균으로부터 수득한 염색체 DNA를 주형으로서 사용하여 통상적인 PCR 클로닝 기법에 의해 ORF를 단리, 취득할 수 있다. 이와 같이 취득되는 ORF 서열로서 예를 들면, 서열 2 내지 3501 중 어느 하나에 기재된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있다.
ORF 또는 프라이머는 상기서열 정보에 근거하여 폴리뉴클레오타이드 합성기 를 사용해도 조제할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드로서는 상기에서 취득되는 ORF의 염기 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드 및 당해 폴리뉴클레오타이드와 엄격한 조건하에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있다.
본 발명에서 말하는 폴리뉴클레오타이드란 일본쇄 및 이본쇄 DNA 및 일본쇄 RNA를 함유하지만 이들에 한정되는 것이 아니다.
상기에서 취득하는 ORF의 염기 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드와 엄격한 조건하에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드에는 당해 ORF의 축퇴성 변이체가 포함된다. 축퇴성 변이체란 염기 서열에서는 본 발명의 ORF의 서열과 다르지만 유전 암호화의 축퇴성에 의해 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 단편을 말한다.
구체적인 예로서는 서열 2 내지 3431 중 어느 하나에 기재된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드, 당해 폴리뉴클레오타이드와 엄격한 조건하에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드 등을 들 수 있다.
엄격한 조건하에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드란 상기에서 동정된 ORF의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 프로브로서 콜로니 하이브리드화 방법, 플라그 하이브리드화 방법 또는 서던 블롯 하이브리드화 등을 사용함으로써 얻어지는 폴리뉴클레오타이드를 의미하며, 구체적으로는 콜로니 또는 플라그 유래의 폴리뉴클레오타이드를 고정화한 필터를 사용하여 0.7 내지 1.0mol/ℓ의 염화나트륨 존재하에, 65℃에서 하이브리드화를 실시한 다음, 0.1 내지 2배 농도의 SSC 용액(1 배 농도의 SSC 용액의 조성은 150mmol/ℓ 염화나트륨, 15mmol/ℓ 시트르산나트륨으로 이루어진다)을 사용하여 65℃ 조건하에 필터를 세정함으로써 동정할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있다.
하이브리드화는 문헌[몰리큘러 클로닝 제2판, Current Protoco1s in Molecu1ar Biology, John Wiley & Sons(1987-1997)(이하, 커런트 프로토콜 인 몰리큘러 바이올로지라고 약기한다), DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition. 0xford University(1995)] 등에 기재되어 있는 방법에 준하여 실시할 수 있다. 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드로서 구체적으로는 FASTA, BLAST, Smith-Waterman[Meth. Enzym., 164, 765(1988)] 등의 상동성 검색 소프트웨어에 의해 데폴트(초기 설정)의 파라미터를 사용하여 계산할 때에 서열 2 내지 3431에 기재된 염기 서열과 적어도 60% 이상의 상동성을 갖는 DNA, 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖는 DNA, 보다 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드로서 서열 3502 내지 6931 중의 어느 하나에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 당해 폴리뉴클레오타이드와 엄격한 조건하에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드로서 서열 1에 기재된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에서 서열 2 내지 3431로부터 선택하는 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 5' 상류 또는 3' 하류 영역에 위치하며 당해 폴리뉴클레오타이드 가 암호화하는 폴리펩타이드의 발현을 조절하는 활성을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있다. 당해 폴리뉴클레오타이드가 암호화하는 폴리펩타이드의 발현을 조절하는 활성을 갖는 폴리뉴클레오타이드로서 구체적으로는 상술한 EMF 즉, 프로모터, 오퍼레이터, 인핸서, 사일런서, 리보솜 결합 서열, 전사 종결 서열 등을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있다.
상기 PCR 클로닝 기법에 의해 ORF를 취득할 때에 사용하는 프라이머로서는 당해 ORF 및 인접하는 영역의 염기 서열 중의 연속한 10 내지 200개 염기와 동일한 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 또는 당해 올리고뉴클레오타이드와 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 들 수 있다. 예를 들면, 서열 1 내지 3431의 어느 하나에 기재된 염기 서열 중의 연속한 10 내지 200개 염기와 동일한 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 또는 당해 올리고뉴클레오타이드와 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 들 수 있다. 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머로서 사용하는 경우에는 양자의 융해 온도(Tm) 및 염기수가 극단적으로 변하지 않는 상기한 올리고뉴클레오타이드가 바람직하다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드로서 서열 1 내지 3431 중 어느 하나에 기재된 염기 서열 중 연속한 10 내지 200개 염기와 동일한 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 또는 당해 올리고뉴클레오타이드와 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 들 수 있다.
또한 이들 올리고뉴클레오타이드의 유도체(이하, 올리고뉴클레오타이드 유도체라고 한다)도 본 발명의 올리고뉴클레오타이드로서 이용할 수 있다.
당해 올리고뉴클레오타이드 유도체로서는 올리고뉴클레오타이드 중의 인산디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 변환된 올리고뉴클레오타이드 유도체, 올리고뉴클레오타이드 중 인산디에스테르 결합이 N3'-P5' 포스포아미데이트 결합으로 변환된 올리고뉴클레오타이드 유도체, 올리고뉴클레오타이드 중의 리보스와 인산디에스테르 결합이 펩타이드 핵산 결합으로 변환된 올리고뉴클레오타이드 유도체, 올리고뉴클레오타이드 중의 우라실이 C-5프로피닐우라실로 치환된 올리고뉴클레오타이드 유도체, 올리고뉴클레오타이드 중의 우라실이 C-5 티아졸우라실로 치환된 올리고뉴클레오타이드 유도체, 올리고뉴클레오타이드 중의 시토신이 C-5 프로피닐시토신으로 치환된 올리고뉴클레오타이드 유도체, 올리고뉴클레오타이드 중 시토신이 페녹사진-변형된 시토신(phenoxazine-modified cytosine)으로 치환된 올리고뉴클레오타이드 유도체, 올리고뉴클레오타이드 중의 리보스가 2'-O-프로필리보오스로 치환된 올리고뉴클레오타이드 유도체 또는 올리고뉴클레오타이드 중의 리보오스가 2'-메톡시에톡시리보오스로 치환된 올리고뉴클레오타이드 유도체 등을 들 수 있다[참조: Cell Engineering, 16, 1463(1997)].
본 발명의 올리고뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드 유도체는 프라이머 이외에도 하기의 하이브리드화용 프로브, 안티센스 핵산으로서도 유용하다.
안티센스 핵산으로서 사용하는 경우에는, 상기한 올리고뉴클레오타이드에 한하지 않으며 본 발명의 폴리뉴클레오타이드와 엄격한 조건으로 하이브리드화하며 또한 당해 폴리뉴클레오타이드가 암호화하는 폴리펩타이드의 발현을 조절하는 활성을 갖는 폴리뉴클레오타이드이면 사용할 수 있다.
3.아이소자임의 추정
코리네형 세균을 사용하는 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산등의 유용 물질의 생산에서 이들 유용 물질의 생산에 유용한 변이주는 다수 취득되어 있다.
그러나, 상기 미생물에서는 유전자 서열 정보의 발견이 적으므로 주로 니트로소구아니딘(NTG) 등의 변이제에 의한 변이 조작에 의해 유용 변이주가 취득되고 있다.
상기 변이제에 의한 변이법으로서는 랜덤하게 유전자를 변이시킬 수 있지만 중간물질의 대사에 관계하는 유사 성질을 갖는 아이소자임을 암호화하는 각각의 유전자를 일괄적으로 변이시키는 것은 곤란하다. 또한 변이제에 의한 변이법으로서는 랜덤하게 유전자가 변이하므로 생육 지연이나 발포성 상승 등의 배양 특성 저하를 가져오는 유해한 변이도 동시에 부여될 가능성이 높다.
그러나, 유전자 서열 정보가 있으면 목적하는 아이소자임을 암호화하는 전체 유전자를 목적에 따라 모두 변이시키는 것이 가능해지며 목적하는 유전자 이외의 유해한 변이가 도입되는 경우는 없다.
즉, 상기 2에서 동정된 ORF 정보에 의해 코리네형 세균중의 목적하는 아이소자임의 정확한 수, 서열 정보를 취득할 수 있으며 당해 서열 정보를 이용하여 몰리큘러 클로닝 제2판 등에 기재된 부위 특이적 변이도입법 등에 의해 목적하는 아이소자임 유전자 모두를 목적하는 성질을 갖는 유전자로 변이시켜 유용 물질의 생산성이 향상된 유용 변이주를 취득할 수 있다.
4.생합성 경로 및 시그널 전달 경로의 해명
생합성 경로 및 시그널 전달 경로는 다수의 생물에서 해명이 시도되고 있으며 많은 발견이 있었다. 그러나, 코리네형 세균에서는 아직 많은 유전자가 동정되어 있지 않으므로 불명인 점이 다수 존재한다.
이러한 불명인 점은 하기 방법에 의해 해명할 수 있다.
상기 2의 방법에 의해 동정된 코리네형 세균 유래의 ORF의 추정 기능정보를 정리한다. 여기서 말하는 「정리」란 추정된 기능 정보에 따라 각각의 ORF가 어떠한 물질의 생합성 경로 또는 어떠한 시그널 전달 경로에 속하는지를 공지된 정보를 이용하여 분류하는 것을 말한다. 다음에 공지된 타생물의 생합성 경로 또는 시그널 전달 경로상의 효소에 당해 정리된 ORF를 대응시킨다. 코리네형 세균에서 공지되어 있는 정보와 조합하여 불명이던 코리네형 세균에서의 생합성 경로 및 시그널 전달 경로를 해명할 수 있다.
불명 또는 명확하지 않던 경로를 해명함으로써 목적하는 유용 생산물을 생산하기 위한 유용 변이주를 효율이 좋게 취득할 수 있다.
즉, 명확해진 경로가 목적하는 유용 생산물의 생합성에 중요하다고 판단되는 경우에는 당해 경로를 강화한 변이주를 취득함으로써 유용 변이주를 취득할 수 있다. 또한, 명확해진 경로가 목적하는 유용 생산물의 생합성에는 중요하지 않다고 판단되는 경우에는 당해 경로의 이용 빈도를 저하시킨 변이주를 취득함으로써 유용 변이주를 취득할 수 있다.
5.유효 변이점의 해명
코리네형 세균에서 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산 등의 목적하는 유용 생산물의 생산에 적절한 유용한 변이주가 다수 취득되어 있지만 어떠한 변이점을 유전자에게 부여하면 생산성을 향상시키는 것이 가능한가는 거의 공지되어 있지 않다.
그러나, 코리네형 세균으로부터 변이 수법에 의해 육종된 생산 균주의 게놈 DNA의 원하는 서열을 상기 1 및 2의 방법에 의해 결정된 코리네형 세균 유래의 대응하는 게놈 DNA 및 ORF의 염기 서열과 비교 해석함으로써 생산 균주가 갖는 변이점을 동정할 수 있다.
또한, 대사 경로나 대사 조절 기구, 효소의 구조 활성 상관 등에 관한 공지된 정보에 근거하면 이들의 변이점 중에서 생산에 기여하고 있는 유효 변이점을 용이하게 특정할 수 있다.
공지된 정보에 의해 유효 변이의 특정이 어려운 경우에는 동정된 변이점을 코리네형 세균의 야생형주 또는 당해 변이를 갖고 있지 않은 생산균에 도입하여 생산에 플러스의 효과를 가져오는지 여부를 확인할 수 있다.
예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰의 라이신 생산균 B-6주[Appl. Microbio1. Biotechno1., 32 269-273(1989)]의 호모세린데하이드로게나제 유전자 hom의 염기 서열을 본 발명의 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 게놈의 대응하는 염기 서열과 비교함으로써 59번째의 발린이 알라닌으로 치환된 아미노산 치환 변이(Val59Ala)를 동정할 수 있다. 또한, 이러한 변이를 유전자 치환법으로 ATCC 13032주에 도입하여 수득한 균주는 라이신을 생산하게 되는 것으로부터 당해 변이가 라이신 생산에 기여하는 유효 변이인 것을 찾아낼 수 있다.
동일하게 B-6주의 피루브산카복실라제 유전자 pyc의 염기 서열을 ATCC 13032 게놈의 대응하는 서열과 비교함으로써 458번째의 프롤린이 세린으로 치환된 아미노산 치환 변이(Pro458Ser)를 동정할 수 있다. 또한, 이러한 변이를 유전자 치환법으로 당해 변이를 갖고 있지 않은 코리네박테리움 글루타미쿰의 라이신 생산균 No.58주(FERM BP-7134)에 도입하여 얻은 균주는 라이신 생산성이 No. 58주와 비교하여 향상하는 점으로부터 당해 변이가 라이신 생산에 기여하는 유효 변이인 것을 찾아낼 수 있다.
이밖에도, B-6주의 글루코스-6-인산데하이드로게나제 유전자 zwf를 동일하게 검색함으로써 라이신 생산에 관계하는 유효 변이로서 글루코스-6-인산데하이드로게나제 내의 변이 A1a213Thr을 특정할 수 있다.
또한, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCCl3032의 아스파르트키나제 유전자 lysC의 932번째의 염기를 시토신으로 치환함으로써 311번째의 트레오닌를 이소류신으로 치환(Thr311Ile)하면 코리네박테리움 글루타미쿰에 의한 라이신의 생산성을 향상시키게 되는 점으로부터 당해 변이가 라이신 생산에 기여하는 유효 변이인 것을 찾아낼 수 있다.
동정된 변이점이 유효 변이인가 여부를 확인하는 별도의 방법으로서 라이신 생산균이 갖는 당해 변이를 유전자 치환법으로 야생형의 서열에 되돌리고 생산에 마이너스의 영향을 미치는가 여부로 조사하는 방법도 있다. 예를 들면, 라이신 생산균 B-6주의 hom이 갖는 아미노산 치환 변이 Val59Ala를 야생형으로 되돌린 균주는 라이신 생산성이 B-6주와 비교하여 저하되는 점으로부터 당해 변이는 라이신 생산에 기여하는 유효 변이인 것을 찾아낼 수 있다.
필요에 따라, 하기의 DNA 어레이 해석이나 프로테옴 해석을 조합하면 유용 변이점의 추출을 보다 효율적으로 또한 망라적으로 실시할 수 있다.
6. 공업적으로 유리한 생산균주의 육종방법
아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산 등의 목적하는 유용 생산물의 발효생산에 공업적으로 사용되고 있는 생산균주는 일반적으로 NTG 등의 변이제를 사용하는 랜덤 변이와 선택에 근거하는 변이 육종을 중첩시킴으로써 조성되어 있다.
최근에, 재조합 DNA 기술에 의한 생산균주의 개량예도 다수 보고되어 있지만 이들 육종에서도 변이 수법에 의해 육종된 생산균주가 친주로서 사용되고 있는 경우가 대부분이다[W. Leuchtenberger, Amino Acids- Technical Production and Use. In: Roehr(ed) Biotechnology, second edition. vol.6, products of primary metabolsm. VCH Ver1agsgesellschaft mbH, Weinheim, P 465(1996)].
변이 수법은 발효공업에 큰 공헌을 가져왔지만 염색체의 여러 곳에 랜덤하게 다수의 변이가 도입되는 중대한 결점이 있다. 균주 개량의 정도에 다수의 변이가 동일 염색체상에 축적되어 있으므로 변이 육종된 생산 균주는 야생형 주와 비교하여 일반적으로 생육이 나쁜 당의 소비가 느린 온도나 산소 등의 스트레스에 약한 성질 등을 갖게 되며 생산성이 충분하게 오르지 않는 잡균 오염의 영향을 받기 쉬운 배양관리가 번잡하게 되는 등의 실제 제조에서 제조원가를 높이는 요인으로 되고 있다. 또한, 랜덤 변이이므로 생산성 향상의 기구는 명확하지 않으며 하기 생산성 향상을 향한 합리적인 육종 전략을 세우기 어렵다.
본 발명에 따르면 코리네형 세균으로부터 변이 수법에 의해 육종된 생산균주의 염색체상에 축적된 다수의 변이점 중에서 생산에 기여하는 유효 변이점을 효율적으로 특정할 수 있으므로 코리네형 세균에 이들 유효 변이를 조합한다는 새로운 육종방법을 확립할 수 있다. 당해 방법에 의해 유용 생산균의 재구축을 행할 수 있게 되며 야생형주로부터도 유용 생산균주를 구축할 수 있다.
구체적으로는 하기의 방법으로 유용 변이주를 구축할 수 있다.
변이점 1개를 코리네형 세균의 야생형주에 도입하여 생산에 플러스의 효과를 가져오는지 여부를 조사한다. 이 평가로 효과가 있는 경우에는 그 변이점을 남기며 효과가 없는 경우에는 그 변이점을 떼어낸다. 다음에 효과가 있는 변이점만을 갖는 균주를 친주로서 같은 조작을 되풀이하여 실시한다. 일반적으로는 생합성 경로의 하류에 율속점이 존재하면 상류의 변이의 유효성을 명확히 평가할 수 없는 경우가 있는 점에서 본 방법을 사용하는 경우에는 변이점의 평가를 하류에서 상류로 향하여 순차적으로 실시하는 것이 바람직하다.
이상과 같이, 야생형주 또는 야생형주와 같이 생육 속도나 당의 소비능력이 높은 균주를 베이스에 유효 변이를 재구성하면 상기와 같은 종래법의 결점을 가지지 않는 단시간에 발효생산을 할 수 있거나 발효를 보다 높은 온도에서 실시할 수 있는 공업적으로 유리한 균주를 조성할 수 있게 된다.
예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰의 야생형주 ATCC l3032로부터 수회에 걸쳐 변이육종된 라이신 생산 변이주 B-6[Appl. Microbiol. Biotechnol., 32, 269-273(1989)]에서는 라이신 발효를 30 내지 34℃ 사이에서 실시할 수 있지만, 34℃을 넘으면 생육과 라이신의 생산성이 저하되므로 발효온도를 34℃ 이하로 유지할 필요가 있다. 그러나 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC l3032를 친주로서 사용하여 상기 5에서 공개한 라이신 생산에 관계하는 유효 변이를 재구성하여 얻은 생산균주에서는 40 내지 42℃의 고온이라도 30 내지 34℃로 배양한 경우와 동등 이상의 결과를 얻을 수 있으며 발효시의 냉각 부담을 대폭 경감할 수 있으므로 공업적으로 유리하다.
43℃를 넘는 고온에서의 배양이 요청되는 경우에는 코리네박테리움속에 속하며 43℃를 넘는 고온이라도 생육할 수 있는 미생물을 베이스에 유효 변이를 재구성하면 43℃를 넘는 고온에서의 발효생산을 할 수 있는 생산균주를 얻을 수 있다. 코리네박테리움속에 속하며 43℃를 넘는 고온이라도 생육할 수 있는 미생물로서는 예를 들면, 코리네박테리움 더모아미노게네스를 들 수 있다. 구체적으로는 코리네박테리움 더모아미노게네스 FERM 9244, FERM 9245, FERM 9246 및 FERM 9277을 들 수 있다.
이상과 같이, 재구축한 생산균주를 친주로 사용하여 통상적인 변이처리법, 재조합 DNA 기술에 의한 유전자 증폭법이나 유전자 치환법, 형질도입법 또는 세포융합법을 사용하여 다시 육종을 하면 목적 생산물의 생산성이 한층 높아진 균주를 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명의 미생물로서는 육종 과정에서 2개 이상의 유효 변이를 코리네형 세균에 집적시킨다는 공정을 거친 생산균주이면 변이주, 세포융합주, 형질전환주, 형질도입주 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 조성한 재조합주 중의 하나이며 특별히 한정되는 것이 아니다.
한편, 생육이나 생산에서 유해하다고 판단되는 변이점이 특정된 경우에는 현재 사용하고 있는 생산균주에 당해 변이점이 존재하는지 여부를 조사하여 당해 변이를 갖고 있는 경우에는 야생형의 유전자로 되돌리는 것에 의해 더욱 유용한 생산균주로 육종할 수 있다.
이상과 같은 육종방법은 코리네형 세균 이외의 산업상 유리한 성질을 갖는 미생물(보다 염가인 탄소원을 빠르게 이용할 수 있는 미생물, 보다 고온이라도 생육할 수 있는 미생물 등)에도 적용할 수 있다.
7. 폴리뉴클레오타이드 어레이의 작제 및 이용
(1)폴리뉴클레오타이드 어레이의 작제
상기 1 및 2에서 취득되는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 폴리뉴클레오타이드 어레이를 작제할 수 있다.
구체적으로는, 서열 2 내지 3501 중 어느 하나에 기재된 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드, 당해 폴리뉴클레오타이드와 엄격한 조건하에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 이들 폴리뉴클레오타이드가 갖는 염기 서열 중 연속하는 적어도 10 내지 200개로 이루어진 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 하나 이상을 고체 지지체에 고착한 폴리뉴클레오타이드 어레이 및 서열 3502 내지 7001 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 당해 폴리뉴클레오타이드와 엄격한 조건하에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 이들 폴리뉴클레오타이드가 갖는 염기 서열 중의 연속하는 적어도 10 내지 200개 염기로 이루어진 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 하나 이상을 고체 지지체에 고착한 폴리뉴클레오타이드 어레이를 들 수 있다.
본 발명에서 폴리뉴클레오타이드 어레이란 DNA 칩, DNA 마이크로 어레이, DNA 마크로 어레이 등으로 불리는 것을 포함하며 고체 지지체의 표면에 복수의 폴리뉴클레오타이드 또는 당해 단편을 고착시킨 것을 말한다.
고체 지지체로서는 평판 유리나 나일론막 등을 사용할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 또는 당해 단편의 고체 지지체 표면에 대한 고착에는 어레이 작제의 일반적인 수법을 사용할 수 있다. 즉, 폴리라이신 등의 다가양이온의 부착 등의 화학적으로 표면처리한 고체 지지체에 고착시키는 방법[Nat. Genet., 21 15-19(1999)] 등을 사용할 수 있다. 이러한 화학적으로 표면처리한 고체 지지체는 시판되고 있으며 당해 시판품을 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 어레이의 고체 지지체로서 사용할 수 있다.
고체 지지체에 고착시킨 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드로서는 상기 1 및 2에서 취득되는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드를 사용할 수 있다.
고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 고밀도로 고착함으로써 하기의 해석을 효율적으로 실시할 수 있지만 반드시 고밀도일 필요는 없다.
고밀도로 고착하기 위한 어레이어 로봇 등의 장치는 다카라슈조사(GUS417 Arrayer) 등에서 시판하고 있으며 당해 시판품을 사용할 수 있다.
또한 사진석판술 등에 의해 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 고체 지지체상에서 직접 합성할 수 있다[Nat. Genet., 21, 20-24(1999)]. 당해 방법에서는 우선, 광조사에 의해 제거할 수 있는 보호기를 가진 링커를 슬라이드 유리 등의 고체 지지체에 고착시킨다. 당해 고착 부위가 한정된 부분만 빛을 투과시키기 위한 마스크(사진석판 마스크)를 통해 빛을 접촉시킨다. 당해 영역에 광조사에 의해 제거할 수 있는 보호기를 가진 올리고뉴클레오타이드를 가함으로써 빛이 접촉된 부분만 당해 뉴클레오타이드와의 연결반응이 일어난다. 당해 조작을 되풀이함으로써 영역마다 상이한 목적하는 서열의 올리고뉴클레오타이드를 합성할 수 있다. 통상적으로 합성하는 올리고뉴클레오타이드의 길이는 10 내지 30개 염기이다.
(2) 폴리뉴클레오타이드 어레이의 이용
상기 (1)에서 작제된 폴리뉴클레오타이드 어레이를 사용하고 하기 (a), (b)를 실시할 수 있게 된다.
(a) 코리네형 세균의 변이주의 변이점의 동정 및 게놈에 암호화되는 유전자의 발현량 및 발현 프로필의 해석
코리네형 세균의 변이주 유래 유전자 또는 피검 유전자에 관해서 하기 (i) 내지 (iv)의 공정을 실시함으로써 당해 유전자의 변이점의 동정 또는 당해 유전자의 발현량 및 발현 프로필를 해석할 수 있다.
(i) 상기 (1)의 방법으로 폴리뉴클레오타이드 어레이를 작제하는 공정,
(ii) (i)의 공정에서 작제된 폴리뉴클레오타이드 어레이를 사용하여 당해 폴리뉴클레오타이드 어레이상에 고정화된 폴리펩타이드와 표지화된 코리네형 세균의 변이주 유래 유전자를 하이브리드화 조건하에 항온 처리하는 공정,
(iii) 하이브리드화를 검출하는 검출공정,
(iv) 하이브리드화 결과를 해석하는 해석공정.
코리네형 세균의 변이주 유래 유전자 또는 피검 유전자로서 예를 들면, 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산 및 이들의 동족체로부터 선택되는 하나 이상의 생합성에 관계하는 유전자를 들 수 있다.
구체적인 방법을 하기에 상술한다.
폴리뉴클레오타이드 어레이를 사용하여 인간의 2,300kb에 걸치는 영역중의 SNP(1염기 다형)이 동정되어 있다[Science, 280, 1077-82(1998)]. 당해 SNP의 동정방법 및 문헌[Science, 278, 680-686(1997), Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, 96, 12833-38(1999), Science, 284, 1520-23(1999)] 등에 기재된 방법에 준하여 상기 (1)에서 작제된 폴리뉴클레오타이드 어레이 및 코리네형 세균 유래의 핵산 분자(DNA, RNA)를 사용하고 하이브리드화법에 의해 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산 등에 유용한 당해 미생물의 유용 변이주의 변이점의 동정 및 유전자 발현량 및 발현 프로필의 해석을 할 수 있다.
코리네형 세균 유래의 핵산 분자(DNA, RNA)의 취득은 몰리큘러 클로닝 제2판 등에 기재된 통상적인 방법에 따라 실시할 수 있다.
코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 mRNA의 취득에 관해서는 Bormann 등의 방법[Mo1ecular Microbiology, 6, 317-326(1992)]도 사용할 수 있다.
통상적으로 목적하는 mRNA에 추가하여 상당히 과잉으로 리보솜 RNA(rRNA)도 취득되지만 해석상 큰 지장은 되지 않는다.
취득된 코리네형 세균 유래의 핵산 분자를 표지화한다. 당해 표지에는 형광색소를 사용하는 방법이나 방사성 동위원소를 사용하는 방법 등이 사용된다.
구체적으로는 미생물에서 추출한 RNA에 솔라렌-바이오틴을 자외선광으로 크로스 링크시켜 하이브리드화 반응 후에 스트렙토아비딘을 결합시킨 형광색소를 바이오틴 잔기에 결합시킴으로써 표지화하는 방법[Nat. Biotechnol., 16, 45-48(1998)], 미생물에서 추출한 RNA를 주형, 랜덤 프라이머를 프라이머로 하는 역전사 반응을 실시하여 형광색소, 예를 들면, Cy3, Cy5를 결합시킨 dUTP(Amersham Pharmacia Biotech사제)를 cDNA에 편입함으로써 표지화하는 방법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 12833-38(1999)] 등을 들 수 있다.
랜덤 프라이머 대신에 ORF의 3' 말단의 상보 서열군을 프라이머에 사용하는 것으로 표지의 특이성을 보다 높일 수 있다[J. Bacterio1., 181, 6425-40(1999)].
하이브리드화법에서의 하이브리드화 및 그 후의 세정조작은 통상적인 방법으로 실시할 수 있다[Nat. Biotechno1., 14, 1675-80(1996) 등].
당해 조작 후, 표지에 사용하는 핵산 분자의 하이브리드화량에 따른 하이브 리드화의 강도를 측정함으로써 변이점의 동정 및 유전자의 발현량을 산정할 수 있다.
하이브리드화의 강도는 형광 시그널, 방사능, 발광량 등을 레이저 공초점 현미경, CCD 카메라, 방사선의 이미징 장치(예: Amersham Pharmacia Biotech사제, STORM) 등에 의해 가시화한 다음, 당해 가시화 데이터를 정량화함으로써 측정할 수 있다.
고체 지지체 위의 폴리뉴클레오타이드 어레이에 관한 해석·정량에는 GMS418 어레이 스캐너(다카라슈조사제) 등의 시판하는 장치를 사용할 수 있다.
유전자 발현량의 해석에는 시판하는 해석 소프트웨어(예: 다카라슈조사제, ImaGene: 후지필름사제, Array Cauge; Amersham Pharmacia Biotech사제, ImageQuant 등)을 사용할 수 있다.
코리네형 세균 유래의 핵산 분자로서 배양 경과시에 따라 취득된 핵산 분자를 사용함으로써 특정한 유전자의 발현 변동을 추적할 수 있다. 당해 변동을 파악함으로써 배양조건을 최적화할 수 있다.
또한, 당해 미생물의 전체 게놈 서열로부터 분명하게 된 다수의 유전자의 서열을 갖는 핵산 분자를 사용함으로써 당해 미생물의 전체 유전자 수준에서의 발현 프로필, 즉 게놈에 암호화되는 다수의 유전자중에 어떠한 유전자군이 어떠한 비율로 발현하는가를 분명히 할 수 있다. 이와 같이, 전체 게놈서열로부터 분명하게 된 유전자의 발현 프로필을 파악함으로써 당해 미생물의 생물학적인 상태를 전체 유전자 수준에서의 발현 패턴으로 파악할 수 있다.
(b) 피검 유전자에 상동인 유전자의 코리네형 세균에서의 존재 확인
상기 (1)에서 작제된 폴리뉴클레오타이드 어레이를 사용하여 코리네형 세균 이외의 생물에 존재하는 피검 유전자에 상동인 유전자가 코리네형 세균에 존재하는지 여부를 검색할 수 있다.
당해 검색은 상기 (a)의 동정·해석방법에서 코리네형 세균 유래의 핵산 분자 대신에 코리네형 세균 이외의 생물에 존재하는 피검 유전자를 사용하는 방법에 의해 실시할 수 있다.
8. 전체 게놈 염기 서열 및 ORF 정보를 기록한 컴퓨터로 판독할 수 있는 기록매체 또는 기억장치
「컴퓨터로 판독할 수 있는 기록매체 또는 기억장치」란 컴퓨터에 의해 직접 판독되고 엑세스될 수 있는 임의의 기록매체 또는 기억장치를 말한다. 이러한 기록매체 또는 기억장치로서는 플로피 디스크, 하드 디스크, 자기 테이프 등의 자기기록매체, CD-ROM, CD-R, CD-RW, DVD-ROM, DVD-RAM, DVD-RW 등의 광학기록매체, RAM이나 ROM 등의 전기 기록매체 및 이들 범주의 혼합물(예: MO 등의 자기/광학기록 매체)을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것이 아니다.
상기한 기록매체 또는 기억장치에 기록 또는 입력시키기 위한 기기 또는 기록매체 중의 정보를 판독하기 위한 기기 또는 장치의 선택은 기록매체의 종류와 엑세스 방법에 근거한다. 또한 여러가지 데이터 프로세서 프로그램, 소프트웨어, 컴 퍼레이터 및 포맷이 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열 정보 등을 당해 매체에 기록하여 이용하기 위해 사용된다. 당해 정보는 예를 들면, 시판하는 소프트웨어로 포맷된 바이너리 파일(binary file), 텍스트 파일 또는 ASCII 파일의 형태로 나타낼 수 있다. 이들 서열 정보에 엑세스하기 위한 소프트웨어도 공적으로 입수할 수 있다.
당해 매체에 기록하는 정보로서는 상기 2에서 취득된 코리네형 세균의 전체 게놈 염기 서열 정보, ORF의 염기 서열 정보, 당해 ORF에 암호화되는 아미노산 서열 정보, 당해 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드가 갖는 기능정보 등을 들 수 있다.
본 발명의 컴퓨터로 판독할 수 있는 기록매체 또는 기억장치는 상기정보를 기록한 매체이다. 구체적으로는 서열 1 내지 3501에 기재된 염기 서열 정보, 3502 내지 7001에 기재된 아미노산 서열 정보, 서열 1 내지 3501에 기재된 염기 서열이 갖는 기능 정보 및 3502 내지 7001에 기재된 아미노산 서열이 갖는 기능정보, 표 1(표 1aa 내지 제 표 1fe)에 기재된 정보 등을 기록한 컴퓨터로 판독할 수 있는 기록매체를 들 수 있다.
9. 본 발명의 컴퓨터로 판독할 수 있는 기록매체를 이용한, 컴퓨터 이용 시스템
「컴퓨터 이용 시스템」이란 본 발명의 컴퓨터로 판독할 수 있는 기록매체에 기록된 정보를 분석하기 위해 사용되는 하드웨어수단, 소프트웨어 수단 및 데이터 기록수단으로 구성된 것을 말한다.
하드웨어 수단은 기본적으로 입력 장치, 데이터 기록 장치, 중앙연산처리 장치, 출력 장치로 이루어진다.
소프트웨어 수단은 기록된 정보와 상기 하드웨어 수단을 사용하여 본 발명의 매체에 기록된 정보에 관한 검색 또는 해석을 실시할 수단을 수행한다. 구체적으로는, 본 발명의 기록매체에 기록된 염기 서열, 아미노산 서열 등의 정보로부터 생물학적으로 의미가 있는 구조, 정보를 검색, 해석 또는 비교하기 위해 '컴퓨터를 이용하는' 시스템으로 실행되는 하나 또는 그 이상의 프로그램을 사용하는 수단을 의미한다.
ORF, EMF 영역의 동정을 위한 소프트웨어로서는 GeneMark[Nuc. Acids. Res., 22, 4756-67(1994)], GeneHacker[단백질 핵산효소, 42, 3001-07(1997)], Glimmer[The Institute of Genomic Research; Nuc. Acids. Res., 26, 544-548(1998)] 등을 들 수 있다. 통상적으로, 이들 소프트웨어를 사용한 예측에는 데폴트(초기 설정)의 파라미터를 사용하지만 필요에 따라 파라미터를 변경할 수 있다.
표적 서열 또는 표적구조 모티프에 유사한 게놈 영역 또는 폴리펩타이드 영역의 동정(상동성 검색)을 위한 소프트웨어로서는 FASTA, BLAST, Smith-Waterman, GenetyxMac(Software Development사제), GCG 패키지(Genetics Computer Group사제), GenCore(Compugen사제) 등을 들 수 있다. 통상적으로 이들 소프트웨어를 사용한 예측에는 데폴트(초기 설정)의 파라미터를 사용하지만 필요에 따라 파라미터를 변경할 수 있다.
이러한 전체 게놈서열의 정보를 함유하는 기록매체는 코리네형 세균의 게놈 DNA가 암호화하는 유전자의 발현량 및 당해 미생물의 전체 유전자 수준에서의 발현 프로필, 즉 당해 미생물의 게놈에 암호화되는 다수의 유전자중에 어떠한 유전자군이 어떠한 비율로 발현하는가를 분명하게 할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 어레이를 작제하기 위해 유용하다.
데이터 기록 수단이란 본 발명의 기록매체에 기록된 정보 및 표적 서열, 표적구조 모티프 정보 등을 기록하는 메모리 및 여기에 엑세스할 수 있는 메모리 엑세스 수단을 말한다.
즉, 본 발명의 '컴퓨터 이용' 시스템은,
(ⅰ) 본 발명의 기록매체에 기록된 정보 및 표적서열 또는 표적구조 모티프 정보를 입력하기 위한 입력 수단,
(ⅱ) 입력된 정보를 적어도 일시적으로 기록하기 위한 데이터 기록 수단,
(ⅲ) (ⅱ)의 데이터 기록수단에 의해 기록된 본 발명의 기록매체에 기록된 정보와 표적 서열 또는 표적구조 모티프 정보를 비교하고 표적 서열 또는 표적구조 모티프 정보와 일치하거나 유사한 염기 서열 정보를 검색 또는 해석하는 컴퍼레이터 수단 및,
(ⅰv) (ⅲ)의 컴퍼레이터 수단에 의해 얻어진 검색 또는 해석결과를 표시하기 위한 출력 수단을 구비하는 것을 특징으로 하는 컴퓨터를 이용하는 시스템이다.
당해 시스템을 상기 2 내지 5의 방법에 사용함으로써 코리네형 세균의 ORF, EMF 영역, 표적 서열, 표적구조 모티프 등의 검색·해석, 상동체의 검색, 아이소자 임의 검색·해석, 생합성 경로·시그널 전달 경로의 해명, 유용 변이점의 해명 및 프로테옴 해석으로 찾아낸 스폿의 동정에 이용할 수 있다. 상기 상동체에는 오소로그(ortholog), 파라로그(paralog) 양쪽 모두 포함된다.
10. 코리네형 세균 유래의 ORF를 이용한 폴리펩타이드의 제조
상기 2의 방법으로 취득되는 ORF를 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 본 발명의 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 즉, 본 발명의 폴리펩타이드는 몰리큘라 클로닝 제2판이나 커런트 프로토콜즈 인 몰리큘라 바이올로지 등에 기재된 방법등을 사용하여 예를 들면, 하기의 방법에 따라 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 단편을 숙주 세포 속에서 발현시켜 제조할 수 있다.
전체 길이의 ORF 서열을 바탕으로 하여 필요에 따라 당해 폴리펩타이드를 암호화하는 부분을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편을 조제한다.
또한 필요에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 부분의 염기 서열을 숙주 세포의 발현에 최적인 코돈으로 되도록 염기를 치환한 DNA를 조제한다. 당해 DNA는 본 발명의 폴리펩타이드의 효율적 제조에 유용하다.
이들 DNA 단편을 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써 재조합 벡터를 작제한다.
당해 재조합 벡터를 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입한다.
숙주 세포로서는 세균, 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 등의 목적하는 유전자를 발현할 수 있는 것이면 어느것이나 사용할 수 있다.
발현 벡터는 상기 숙주 세포에서 자립복제가 가능하거나 염색체 중으로 편입할 수 있으며, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 사용된다.
세균 등의 원핵생물을 숙주 세포로서 사용하는 경우에는 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 함유하여 이루어진 재조합 벡터는 원핵생물 중에서 자립 복제할 수 있는 동시에 프로모터, 리보솜 결합 서열, 본 발명의 DNA, 전사 종결서열이 적어도 작동할 수 있는 상태로 구성된 벡터인 것이 바람직하다. 프로모터를 제어하는 유전자가 함유될 수 있다.
발현벡터로서는 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰으로 복제할 수 있는 벡터 플라스미드인 pCG1[참조: 일본 공개특허공보 제(소)57-134500호], pCG2[참조: 일본 공개특허공보 제(소)58-35197호], pCG4[참조: 일본 공개특허공보 제(소)57-183799호], pCG11[참조: 일본 공개특허공보 제(소)57-134500호], pCG116, pCE54, pCB101[모두 일본 공개특허공보 제(소)58-105999호], pCE51, pCE52, pCE53[어느것이나 Mol. Gen. Genet., 196, 175-178(1984)] 및 에스케리치아 콜라이로 복제할 수 있는 벡터인 pET3, pET11(이상 Stratagene사제), pBAD, pThioHis, pTrcHis(이상, Invitrogen사제), pKK223-3, pGEX2T(이상, Amersham Pharmacia Biotech사제) 이외에 pBTrp2, pBTac1, pBTac2(어느것이나 Boehringer Mannheim사제로부터 시판), pSE280(Invitrogen사제), pGEMEX-1(Promega사제), pQE-8(QIAGEN사제), pKYPl0[일본 공개특허공보 제(소)58-110600호], pKYP200[Agric. Biol. Chem., 48, 669(1984)], pLSA1[Agric. Biol, Chem., 53, 277(1989)], pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306(1985)], pBluescript Ⅱ SK(-)(Stratagene사제), pTrs30[에스케리치아 콜라이 JM109/pTrS30(FERM BP-5407)로부터 조제], pTrs32[에스케리치아 콜라이 JM109/pTrS32(FERM BP-5408)로부터 조제], pGHA2[에스케리치아 콜라이 IGHA2(FERM BP-400)로부터 조제, 일본 공개특허공보 제(소)60-221091호], pGKA2[에스케리치아 콜라이 IGKA2(PERM BP-6798)로부터 조제, 일본 공개특허공보 제(소)60-221091호], pTerm2(US 4686191, US 4939094, US 5160735), pSupex, pUB110, pTP5, pCl94, pEG400[J. Bacteriol., 172, 2392(1990)], pGEX(Pharmacia사제), pET 시스템(Novagen사제) 등을 들 수 있다.
프로모터로서는 숙주 세포 속에서 기능하는 것이면 어떠한 것이라도 좋다. 예를 들면, trp 프로모터(Ptrp), lac 프로모터, PL 프로모터, PR 프로모터, T7 프로모터 등의 대장균이나 파아지 등에 유래하는 프로모터를 들 수 있다. 또한 Ptrp를 2개 직렬시킨 프로모터(Ptrp×2), tac 프로모터, lac T7 프로모터, let I 프로모터와 같이 인위적으로 설계 변형된 프로모터 등도 사용할 수 있다.
리보솜 결합서열인 샤인-달가르노(Shine-Da1garno) 서열과 개시 코돈 사이를 적당한 거리(예: 6 내지 18염기)로 조절한 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 재조합 벡터에서는 본 발명의 DNA의 발현에는 전사 종결서열은 반드시 필요하지 않지만 구조 유전자의 바로 아래에 전사 종결서열을 배치하는 것이 바람직하다. 상기 구성 요소의 코돈은 이용되는 숙주 세포나 환경 상태에 따라 공지된 방법에 따라 최적화할 수 있다.
숙주 세포로서는 에스케리치아속, 세라티아속, 바실러스속, 브레비박테리움속, 코리네박테리움속, 마이크로박테리움속, 슈도모나스속 등에 속하는 미생물, 예를 들면, 에스케리치아 콜라이 XL1-Blue, 에스케리치아 콜라이 XL2-Blue, 에스케리치아 콜라이 DH1, 에스케리치아 콜라이 MC1000, 에스케리치아 콜라이 KY3276, 에스케리치아 콜라이 W1485, 에스케리치아 콜라이 JM109, 에스케리치아 콜라이 HB101, 에스케리치아 콜라이 No.49, 에스케리치아 콜라이 W3110, 에스케리치아 콜라이 LY49, 에스케리치아 콜라이 GI698, 에스케리치아 콜라이 TB1, 세라티아 피카리아, 세라티아 폰티콜라, 세라티아 리퀘패시언스, 세라티아 마르세센스, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 아밀로리퀘패시언스, 코리네박테리움 암모니아게네스, 브레비박테리움 임마리오필룸 ATCC14068, 브레비박테리움 사카로리티쿰 ATCC14066, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067(구 속종 브레비박테리움 플라붐), 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCCl3869(구 속종 브레비박테리움 락토퍼멘툼 또는 코리네박테리움 락토퍼멘툼), 코리네박테리움 아세토악시도필룸 ATCCl3870, 코리네박테리움 더모아미노게네스 FERM 9244, 마이크로박테리움 암모니아필룸 ATCC15354, 슈도모나스 푸티다, 슈도모나스 종 D-01l0 등을 들 수 있다.
코리네박테리움 글루타미쿰 또는 이의 유연 미생물을 숙주로 하는 경우, 당해 폴리펩타이드의 발현에 필요한 EMF는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드가 EMF를 함 유하는 한, 벡터측에 특별히 구비하고 있지 않아도 이러한 EMF가 당해 폴리뉴클레오타이드에 포함되지 않은 경우에는 별도로 EMF를 조제하여 작동할 수 있는 상태로 폴리뉴클레오타이드에 연결할 필요가 있다. 또는, 보다 높은 발현량 또는 특이적인 발현조절을 기대하는 경우에도 여기에 적당한 EMF를 작동할 수 있는 상태로 폴리뉴클레오타이드에 연결할 필요가 있다. 예를 들면, 문헌 [Microbiology, 142, 1297-1309 (1996)]에 구체적인 예가 기재되어 있다.
재조합 벡터의 도입방법으로서는 상기숙주 세포로 DNA를 도입하는 방법이면 어느 것이나 사용할 수 있으며 예를 들면, 칼슘 이온을 사용하는 방법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110(1972)], 원형질체법[일본 공개특허공보 제(소) 63-248394], 문헌[Gene, 17, l07(1982)] 또는 문헌[Mol. Gen. Genet., 168, lll(1979)]에 기재된 방법 등을 들 수 있다.
효모를 숙주 세포로서 사용하는 경우에는 발현벡터로서 예를 들면, pYES2(invitrogen사제), YEPl3(ATCC37115), YEp24(ATCC37051), YCp50(ATCC37419), pHS19, pHSl5 등을 들 수 있다.
프로모터로서는 효모 균주 중에서 발현할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있으며 예를 들면, 헥소스 키나제 등의 해당계의 유전자의 프로모터, PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터, gal1 프로모터, gal10 프로모터, 열 쇼크 폴리펩타이드 프로모터, MFα1 프로모터, CUP1 프로모터 등을 들 수 있다.
숙주 세포로서는 사카로마이세스속, 쉬조사카로마이세스속, 클루이베로마이 세스속, 트리코스포론속, 슈반니오마이세스속, 피치아속, 칸디다속 등에 속하는 미생물, 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애, 쉬조사칼로마이세스 폼베, 클루이베로마이세스 락티스, 트리코스포론 풀루란스, 슈반니오마이세스 알루비우스, 칸디다 우틸루스 등을 들 수 있다.
재조합 벡터의 도입방법으로서는 효모에 DNA를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있으며 예를 들면, 전기천공법[Meth. Enzym., 194, 182(1990)],스페로플라스트법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929(1978)], 아세트산리튬법[J. Bacteriology, 153, 163(1983)], 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 1929(1978)]에 기재된 방법 등을 들 수 있다.
동물세포를 숙주로서 사용하는 경우에는 발현벡터으로서 예를 들면, pcDNA3.1, pSinRep5, pCEP4(Invitrogen사제), pRev-Tre(Clontech사제), pAxCAwt(다카라슈조사제), pcDNAI, pcDM8(프나코시사제), pAGE107[일본 공개특허공보 제(평)3-22979호, Cytotechnology, 3, 133(1990)], pAS3-3[일본 공개특허공보 제(평)2-227075호], pCDM8[Nature, 329, 840(1987)], pcDNAI/Amp(Invitrogen사제), pPREP4(Invitrogen사제), pAGEl03[J. Biochem., 101, 1307(1987)], pAGE2l0 등을 들 수 있다.
프로모터로서는 동물세포 속에서 기능하는 것이면 모두 사용할 수 있으며 예를 들면, 사이토메갈로바이러스(CMV)의 IE(immediate early) 유전자의 프로모터, SV40의 초기 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 열 쇼크 프로모터, SRα프로모터 등을 들 수 있다. 또한 사람 CMV의 IE 유전자의 인 핸서를 프로모터와 같이 사용할 수 있다.
숙주세포로서는 사람 세포인 나말바(Namalwa) 세포, 원숭이의 세포인 C0S 세포, 챠이니스 햄스터의 세포인 CH0 세포, HBT5637[일본 공개특허공보 제(소)63-299) 등을 들 수 있다.
동물세포로의 재조합 벡터의 도입방법으로서는 동물세포에 DNA를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있으며 예를 들면, 전기천공법[Cytotechnology, 3, 133(1990)], 인산칼슘법[일본 공개특허공보 제(평)2-227075호], 리포펙션법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413(1987)], 문헌[Virology, 52, 456(1973)] 등을 들 수 있다.
곤충세포를 숙주로서 사용하는 경우에는 예를 들면, 문헌[커런트 프로토콜스 인 몰리큘러 바이올로지, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York(1992), Bio/Technology, 6, 47(1988)] 등에 기재된 방법에 의해 폴리펩타이드를 발현할 수 있다.
즉, 재조합 유전자 도입 벡터 및 바큘로바이러스를 곤충세포에 공도입하여 곤충세포 배양 상등액 중에 재조합 바이러스를 얻은 다음, 다시 재조합 바이러스를 곤충세포에 감염시켜 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다.
당해 방법에서 사용되는 유전자도입 벡터로서는 예를 들면, pB1ueBac4.5, pVLl392, pVLl393, pBlueBacIII(모두 Invitorogen사제) 등을 들 수 있다.
바큘로바이러스로서는 예를 들면, 밤도둑나방과 곤충에게 감염하는 바이러스인 오토그라파 칼리포니카 뉴클레아 폴리헤드로시스 바이러스 (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 등을 사용할 수 있다.
곤충세포로서는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)의 난소세포인 Sf9, Sf21[Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York(1992)], 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)의 난소세포인 High5(Invitrogen사제) 등을 사용할 수 있다.
재조합 바이러스를 조제하기 위한 곤충세포로의 재조합 유전자 도입 벡터와 바큘로바이러스의 공도입 방법으로서는 예를 들면, 인산칼슘법(일본 공개특허공보 제(평)2-227075호), 리포펙션법[Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, 84, 7413(1987)] 등을 들 수 있다.
식물세포를 숙주 세포로서 사용하는 경우에는 발현벡터로서 예를 들면, Ti플라스미드, 담배 모자이크 바이러스 벡터 등을 들 수 있다.
프로모터로서는 식물세포 속에서 발현할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있으며 예를 들면, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV)의 35S 프로모터, 벼 액틴1 프로모터 등을 들 수 있다.
숙주 세포로서는 담배, 감자, 토마토, 당근, 대두, 유채, 알파파, 벼, 소맥, 대맥 등의 식물세포 등을 들 수 있다.
재조합 벡터의 도입방법으로서는 식물세포에 DNA를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있으며 예를 들면, 아그로박테리움(Agrobacterium)[일본 공개특허공보 제(소)59-140885호, 제(소)60-70080호, W0 94/00977], 전기천공법[일본 공개특허공보 제(소)60-251887호], 파티클 건(유전자총)을 사용하는 방법[일본 특허 제 2606856호,특허 제2517813호) 등을 들 수 있다.
본 발명의 형질전환체로서 상기한 재조합 벡터를 유지하는 형질전환체 뿐만 아니라, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 재조합 벡터로서가 아닌 그 자체로서 유지하는 형질전환체, 즉 본 발명의 폴리뉴클레오타이드가 숙주의 염색체에 편입된 상태에서 유지된 형질전환체도 포함된다.
효모, 동물세포, 곤충세포 또는 식물세포에 의해 발현시킨 경우에는 당 또는 당쇄가 부가된 폴리펩타이드를 수득할 수 있다.
이상과 같이, 수득되는 본 발명의 형질전환체를 배지에 배양하여 배양물 중에 본 발명의 폴리펩타이드 또는 본 발명의 EMF의 제어하에 발현되는 임의의 폴리펩타이드를 생성 축적시켜 당해 배양물로부터 채취함으로써 이들의 폴리펩타이드를 제조할 수 있다.
본 발명의 형질전환체를 배지에 배양하는 방법은 숙주의 배양에 사용되는 통상적인 방법에 따라 실시할 수 있다.
본 발명의 형질전환체가 대장균 등의 원핵생물 또는 효모 등의 진핵생물을 숙주로 하여 얻어진 형질전환체인 경우, 당해 형질전환체를 배양한다.
배지로서 당해 형질전환체가 자화할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하여 당해 형질전환체의 배양을 효율적으로 실시할 수 있는 배지이면 천연배지, 합성배지 중 어느 것을 사용할 수 있다.
탄소원으로서는 당해 형질전환체가 자화할 수 있는 것이면 양호하며 글루코스, 푸럭토스, 수크로즈, 이들을 함유하는 당밀, 전분 또는 전분 가수분해물 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알콜류 등을 사용할 수 있다.
질소원으로서는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄등의 무기산 또는 유기산의 암모늄염, 기타 질소 함유 화합물 및 펩톤, 고기 추출물, 효모 추출물, 옥수수 침지물, 카제인 가수분해물, 대두박 및 대두박 가수분해물, 각종 발효 균체 및 이의 절단물 등을 사용할 수 있다.
무기염으로서는 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제1철, 황산망간, 황산구리, 탄산칼슘 등을 사용할 수 있다.
배양은 진탕 배양 또는 심부 통기 교반 배양 등의 호기적 조건하에서 실시한다. 배양 온도는 15 내지 40℃가 양호하며 배양시간은 통상적으로 16시간 내지 7일간이다. 배양중의 pH는 3.0 내지 9.0으로 유지하는 것이 바람직하다. pH의 조정은 무기산 또는 유기산, 알칼리 용액, 요소, 탄산칼슘, 암모니아 등을 사용하여 실시한다.
또한 배양중에 필요에 따라 암피실린이나 테트라사이클린 등의 항생물질을 배지에 첨가할 수 있다.
프로모터로서 유도성의 프로모터를 사용하는 재조합 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는 필요에 따라 인듀서(inducer)를 배지에 첨가할 수 있다.
예를 들면, lac 프로모터를 사용하는 재조합 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 등, trp 프로모터를 사용하는 재조합 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는 인돌아크릴산 등을 배지에 첨가 할 수 있다.
동물세포를 숙주로 하여 얻어진 형질전환체를 배양하는 배지로서는 일반적으로 사용되고 있는 RPMI1640 배지[The Journal of the American Medical Association, 199, 519(1967)], 이글스(eagle's) MEM 배지[Science, 122, 501(1952)], 둘벡코 변형(Dulbeco modified) MEM 배지[Virology, 8, 396(1959)], 199 배지[Proceeding of the Society for the Biologica1 Medicine, 73, 1(1950)] 또는 이들 배지에 소 태아 혈청 등을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다.
배양은 통상적으로 pH 6 내지 8, 30 내지 40℃, 5% CO2 존재하 등의 조건하에 1 내지 7일 동안 실시한다.
또한 배양중에 필요에 따라 카나마이신, 페니실린 등의 항생 물질을 배지에 첨가할 수 있다.
곤충세포를 숙주로 하여 얻어진 형질전환체를 배양하는 배지로서는 일반적으로 사용되고 있는 TNM-FH 배지(Pharmingen사제), Sf-900IISFM 배지(Life Technologies사제), ExCe11400, ExCe11405(모두 JRH Biosciences사제), 그레이스 곤충 배지(Grace's Insect Medium)[Nature, 195, 788(1962)] 등을 사용할 수 있다.
배양은 통상적으로 pH 6 내지 7, 25 내지 30℃ 등의 조건하에 1 내지 5일 동안 실시한다.
또한 배양중에 필요에 따라 겐타마이신 등의 항생물질을 배지에 첨가할 수 있다.
식물세포를 숙주로 하여 얻어진 형질전환체는 세포로서 또는 식물의 세포나 기관에 분화시켜 배양할 수 있다. 당해 형질전환체를 배양하는 배지로서는 일반적으로 사용되고 있는 무라시게 앤드 스크그(MS) 배지, 화이트(White) 배지 또는 이들 배지에 옥심, 사이토카이닌 등의 식물 호르몬을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다.
배양은 통상적으로 pH 5 내지 9, 20 내지 40℃의 조건하에 3 내지 60일 동안 실시한다.
또한 배양중에 필요에 따라 카나마이신, 하이그로마이신 등의 항생 물질을 배지에 첨가할 수 있다.
상기한 대로 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 편입한 재조합 벡터를 보유하는 미생물, 동물세포 또는 식물세포 유래의 형질전환체를 통상적인 배양방법에 따라 배양하여 당해 폴리펩타이드를 생성 축적시켜 당해 배양물로부터 폴리펩타이드를 채취함으로써 폴리펩타이드를 제조할 수 있다.
유전자의 발현방법으로서는 직접 발현 이외에 몰리큘러 클로닝 제2판에 기재되어 있는 방법 등에 준하여 분비생산, 융합 폴리펩타이드 발현 등을 실시할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드의 생산방법으로서는 숙주 세포내에 생산시키는 방법, 숙주 세포외에 분비시키는 방법 또는 숙주 세포 외막 위에 생산시키는 방법이 있으며 사용하는 숙주 세포나 생산시키는 폴리펩타이드의 구조를 바꾸는 것에 의해 당해 방법을 선택할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드가 숙주 세포내 또는 숙주 세포 외막 위에 생산하는 경우, 포울슨 등의 방법[J. Biol. Chem., 264, 17619(1989)], 로우 등의 방법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227(1989), Genes Deve1op., 4, 1288(1990)] 및/또는 문헌[일본 공개특허공보 제(평)5-336963호, W0 제94/23021호] 등에 기재된 방법을 준용함으로써 당해 폴리펩타이드를 숙주 세포외에 적극적으로 분비시킬 수 있다.
즉, 유전자 재조합의 수법을 사용하여 본 발명의 폴리펩타이드의 활성부위를 함유하는 폴리펩타이드 바로 앞에 시그널 펩타이드를 부가한 형으로 발현시킴으로써 본 발명의 폴리펩타이드를 숙주 세포외에 적극적으로 분비시킬 수 있다.
또한 일본 공개특허공보 제(평)2-227075호에 기재되어 있는 방법에 준하여 디하이드로엽산 환원 효소 유전자 등을 사용하는 유전자 증폭계를 이용하여 생산량을 상승시킬 수 있다.
또한, 유전자가 도입된 동물개체(형질전환된 사람 아닌 동물) 또는 식물 개체(형질전환 식물)을 조성함으로써 본 발명의 폴리펩타이드를 제조할 수 있다.
형질전환체가 동물 개체 또는 식물 개체의 경우에는 통상적인 방법에 따라 사육 또는 재배하여 당해 폴리펩타이드를 생성 축적시켜 동물 개체 또는 식물 개체로부터 폴리펩타이드를 채취함으로써 폴리펩타이드를 제조할 수 있다.
동물 개체를 사용하여 본 발명의 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서는 예를 들면, 공지된 방법[American Journal of Clinical Nutrition, 63, 639S(1996), American Journa1 of Clinical Nutrition, 63, 627S(1996), Bio/Technology, 9, 830(1991)]에 준하여 유전자를 도입하여 조성한 동물중에 본 발명의 폴리펩타이드 를 생산하는 방법을 들 수 있다.
동물 개체의 경우에는 예를 들면, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 도입하는 형질전환된 사람 아닌 동물을 사육하고 당해 폴리펩타이드를 상기 동물중에 생성, 축적시켜 동물중으로부터 폴리펩타이드를 채취함으로써 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 당해 동물중의 생성, 축적장소로서는 예를 들면, 동물의 밀크[참조: 일본 공개특허공보 제(소)63-309192호], 알(egg) 등을 들 수 있다. 이 때에 사용되는 프로모터로서는 동물에서 발현할 수 있는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있지만 예를 들면, 유선세포 특이적 프로모터인 α카제인 프로모터, β카제인 프로모터, β락토글로불린 프로모터, 호에 산성 프로테인 프로모터 등이 적절하게 사용된다.
식물 개체를 사용하여 본 발명의 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서는 예를 들면, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 도입한 형질전환 식물을 공지된 방법[소시키바이요, 20(1994), 소시키바이요, 21(1995), Trends in Biotechnology, 15, 45(1997)]에 준하여 재배하여 당해 폴리펩타이드를 식물중에 생성, 축적시켜 당해 식물중으로부터 폴리펩타이드를 채취함으로써 폴리펩타이드를 생산하는 방법을 들 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 시험관내 해독에 의해 취득할 수 있다.
시험관내 해독 시스템을 사용하여 본 발명의 폴리펩타이드를 생산할 수 있다. 시험관내 해독에는 예를 들면, RNA를 주형으로 하는 방법과 DNA를 주형로 하는 방법의 2가지가 있지만, 주형 RNA로서는 전체 RNA, mRNA, 시험관내 전사 산물 등을 사용할 수 있으며, 주형 DNA로서는 전사 프로모터와 해독 개시점의 하류에 편입된 목적 유전자를 함유하는 플라스미드나 PCR/RT-PCR 산물을 사용할 수 있다. 시험관내 해독의 최적인 시스템의 선택에는 합성하는 단백질을 암호화하는 유전자의 유래(원핵세포/진핵세포), 주형의 종류(DNA/RNA) 또는 합성후의 단백질의 사용 목적 등을 고려하여 실시하는 것이 필요하다. 여러가지 특징을 갖는 시험관내 해독의 키트가 각 사(Boehringer Mannheim사, Promega사, Stratagene사 등)로부터 시판되고 있지만 어떠한 키트를 사용해도 본 발명의 폴리펩타이드를 제조할 수 있다.
환형 DNA에 대한 시험관내 전사/해독 시스템 이. 콜라이 T7 S30 추출 시스템(Promega사제; 카탈로그 번호 L1130)을 사용하면 T7 프로모터를 함유하는 플라스미드에 클로닝된 DNA 염기 서열의 전사/해독을 실시할 수 있다. 또한 선형 주형에 대한 시험관내 해독 전사/해독 시스템 이. 콜라이 S30 추출 시스템(Promega사제; 카탈로그 번호 L1030)을 사용하면 슈퍼코일 비감수성의 프로모터, 예를 들면, lacUV5, tac, λPL(con)이나 λPR 등이 가지는 직쇄상의 원핵생물의 DNA를 주형으로 하여 전사/해독을 실시할 수 있다. 직쇄상의 원핵생물의 DNA를 주형으로 하는 것은 DNA 단편, PCR 증폭 DNA 산물, 중복 올리고뉴클레오타이드 연결체, 시험관내 전사 RNA, 원핵생물 RNA 등을 사용할 수 있다.
이러한 시스템을 사용하는 것으로 본 발명의 폴리펩타이드를 제조할 수 있는 이외에 방사성 표지 단백질의 합성, 클로닝된 유전자의 발현능의 확인, 전사반응 또는 해독반응의 기능 해석연구 등을 실시할 수 있다.
본 발명의 형질전환체에 의해 제조된 폴리펩타이드를 단리 정제하기 위해서 는 통상적인 효소의 단리정제법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩타이드가 세포내에 용해 상태로 발현하는 경우에는 배양 종료 후, 세포를 원심분리에 의해 회수하여 수계 완충액에 현탁한 다음, 초음파 파쇄기, 프렌치 프레스, 맨톤 가우링 균질화기, 다이노밀 등에 의해 세포를 파쇄하여 무세포 추출액을 얻는다. 당해 무세포 추출액을 원심분리함으로써 얻어지는 상등액으로부터 통상적인 효소의 단리정제법, 즉 용매추출법, 유안 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸(DEAE)-세파로스, DIAION HPA-75(미쓰비시가가쿠사제) 등의 수지를 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피법, S-세파로스 FF(Pharmacia사제) 등의 수지를 사용하는 양이온 교환 크로마토그래피법, 부틸세파로스, 페닐세파로스 등의 수지를 사용하는 소수성 크로마토그래피법, 분자체를 사용하는 겔 여과법, 친화성 크로마토그래피법, 크로마토포커싱법, 등전점 전기영동 등의 전기영동법 등의 수법을 단독 또는 조합 사용하여 정제 표준품을 얻을 수 있다.
또한 당해 폴리펩타이드가 숙주 세포내에 불용체를 형성하여 발현하는 경우에는 동일하게 세포를 회수한 다음, 파쇄하여 원심분리를 실시하여 침전 분획으로서 폴리펩타이드의 불용체를 회수한다. 회수한 폴리펩타이드의 불용체를 단백질 변성제로 가용화한다. 당해 가용화액을 희석하거나 투석하여 가용화액 중의 단백질 변성제의 농도를 낮춤으로써 당해 폴리펩타이드를 정상적인 입체구조로 재구성한다. 당해 조작 후에 상기와 같은 단리정제법에 의해 당해 폴리펩타이드의 정제 표준품을 얻을 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드 또는 당해 폴리펩타이드에 당쇄가 부가된 폴리펩타이드 등의 유도체가 세포외에 분비된 경우에는 배양 상등액에 당해 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 유도체를 회수할 수 있다. 즉, 당해 배양물을 상기와 동일한 원심분리 등의 수법에 의해 처리함으로써 배양 상등액을 취득하여 당해 배양 상등액으로부터 상기와 같은 단리정제법을 사용함으로써 정제 표준품을 얻을 수 있다.
상기한 방법으로 취득되는 폴리펩타이드가 본 발명의 폴리펩타이드이며 예를 들면, 서열 2 내지 3431로부터 선택하는 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 암호화되는 폴리펩타이드 또는 서열 3502 내지 6931 중의 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 들 수 있다.
또한, 당해 폴리펩타이드가 갖는 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며 또한 당해 폴리펩타이드의 활성과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩타이드도 본 발명에 포함된다. 당해 폴리펩타이드의 활성과 실질적으로 동일한 활성이란 결실, 치환, 삽입 또는 부가하기 전의 폴리펩타이드가 갖는 고유의 기능 또는 효소활성 등으로 대표되는 활성과 동일한 활성을 의미하고 있다. 당해 폴리펩타이드는 문헌[몰리큘러 클로닝 제2판, 커런트 프로토콜즈 인 몰리큘러 바이올로지, Nuc. Acids. Res., 10, , 6487(1982), Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982), Gene, 34, 315(1985), Nuc. Acids. Res., 13, 4431(1985), Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, 82, 488(1985)] 등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법을 사용하여 취득할 수 있다. 예를 들면, 서열 3502 내지 6931 중의 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴 리펩타이드를 암호화하는 DNA에 부위 특이적 변이을 도입함으로써 취득할 수 있다. 결실, 치환, 삽입 또는 부가되는 아미노산 잔기의 수는 특별히 한정되지 않지만 상기한 부위 특이적 변이법 등의 공지된 방법에 의해 결실, 치환, 삽입 또는 부가할 수 있는 정도의 수이며 1 내지 수십개, 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 l 내지 10개, 더욱 바람직하게는 l 내지 5개이다.
본 발명의 폴리펩타이드가 갖는 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된다는 것은 동일 서열 중의 임의적이며 또한 1 또는 복수의 아미노산 서열 중의 위치에서 1 또는 복수의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 또는 부가가 있는 것을 의미하여 결실, 치환, 삽입 또는 부가가 동시에 생겨도 양호하며 치환, 삽입 또는 부가되는 아미노산 잔기는 천연형과 비천연형을 묻지 않는다. 천연형 아미노산 잔기로서는 L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파라긴산, L-글루타민, L-글루탐산, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, L-시스테인 등을 들 수 있다.
이하에 서로 치환할 수 있는 아미노산 잔기의 예를 기재한다. 동일군에 포함되는 아미노산 잔기는 서로 치환할 수 있다.
A군: 류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, O-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 사이클로헥실알라닌;
B군: 아스파라긴산, 글루탐산, 이소아스파라긴산, 이소글루탐산, 2-아미노아디핀산, 2-아미노스베린산;
C 군: 아스파라긴, 글루타민;
D 군: 라이신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산;
E 군: 프롤린, 3-하이드록시프롤린, 4-하이드록시프롤린;
F 군: 세린, 트레오닌, 호모세린;
G 군: 페닐알라닌, 티로신.
또한, 수득되는 변이 폴리펩타이드가 변이전의 폴리펩타이드가 갖는 활성과 실질적으로 동일한 활성을 갖기 위해서는 변이전의 폴리펩타이드가 갖는 아미노산 서열과 BLAST나 FASTA 등의 해석 소프트웨어로 디폴트(초기 설정)의 파라미터를 사용하여 계산했을 때에 적어도 60% 이상, 통상은 80% 이상, 특히 95 % 이상의 상동성을 갖고 있는 것이 바람직하다.
또한 본 발명의 폴리펩타이드는 Fmoc법(플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 의해서도 제조할 수 있다. 또한 Advanced ChemTech사 제품, Perkin elmer사 제품, Ph.rmacia사 제품, Protein Techno1ogy Instrument사 제품, Synthecell-Vega사 제품, PerSeptive사 제품, 시마쯔 세이사꾸쇼 등의 펩타이드 합성기를 이용하여 화학 합성하는 것도 할 수 있다.
본 발명의 형질 전환체는 본 발명의 폴리펩타이드 생산 이외의 목적으로도 사용할 수 있다.
구체적으로는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터를 함유하는 형질 전환체를 배지에 배양하여 배양물 중에 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산 및 이들의 동족체로부터 선택되는 하나 이상을 생성 축적시켜 상기 배양물로부터 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산 및 이들의 동족체로부터 선택되는 적어도 1종을 채취, 제조할 수 있다.
또한, 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산 및 이들의 동족체 등의 생리 활성 물질의 생합성 경로, 분해 경로 및 그 조절 메카니즘은 생물종에 따라 다르다. 그 차이를 이용하여 이종 유래의 그러한 생합성 관련 유전자를 도입함으로써 이들 생리 활성 물질의 생산성을 높이는 것이 가능하다. 예를 들면, 식물 종자에서의 필수 아미노산의 하나인 라이신의 함유량은 세균 유래의 생합성 효소 유전자의 도입에 의해 증대된다는 것이 보고되어 있다[WO 제93/19190호]. 또한 대장균 유래의 아르기닌 생합성 유전자를 코리네박테리움 글루타미쿰에 도입하면 아르기닌의 과잉 생산이 일어난다는 것이 보고되어 있다[일본 특허 공고 평 제5-23750호].
그러한 생리 활성 물질의 생산을 위한 본 발명의 형질 전환체의 배양은 상기본 발명의 폴리펩타이드 생산을 위한 형질 전환체의 배양 방법과 같은 방법으로 실시할 수 있다. 배양물로부터의 상기 생리 활성 물질의 채취도 이온 교환 수지법, 침전법, 기타 공지된 방법의 조합으로 실시할 수 있다.
공지 방법이란 예를 들면, 숙주 생물이 세균인 경우, 전기천공법, 칼슘트랜스펙션, 원형질체법, 바이러스를 통한 방법 등이며, 진핵 생물의 경우에는 미세주입법, 인산 칼슘트랜스펙션, 양성 하전 지질 중개법 또는 바이러스를 사용하는 방법 등을 들 수 있다[몰리큘러 클로닝 제2판 및 스펙터 등, Cells/a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1998)]. 숙주 생물이란 원핵 생물, 하등 진핵 생물(예를 들면 효모) 또는 고등 진핵 생물(예: 포유류 동물)이며, 이러한 생물로부터 단리된 세포를 함유한다. 재조합 폴리뉴클레오타이드 단편의 숙주 세포내에서의 존재 형태로서는 숙주 염색체에 통합되어도 좋고, 염색체외에서 독립된 복제 단위를 갖는 인자(예: 프라스미드)에 재조합된 형태이어도 좋다. 이러한 형질 전환체는 본 발명의 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈의 ORF에 의해 암호화되는 폴리펩타이드 이외에, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 그 단편을 생산하기 위해 사용할 수 있다. 또는, 본 발명의 EMF의 제어하에 임의의 폴리펩타이드를 생산하기 위해서 사용할 수 있다.
11. 본 발명의 폴리펩타이드를 인식하는 항체의 조제
본 발명의 폴리펩타이드 또는 당해 폴리펩타이드의 부분 단편 폴리펩타이드의 정제 표준품 또는 본 발명의 폴리펩타이드의 일부의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 항원으로서 사용함으로써 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 등, 본 발명의 폴리펩타이드를 인식하는 항체를 제작할 수 있다.
(1) 폴리클로날 항체의 제작
본 발명의 폴리펩타이드 또는 당해 폴리펩타이드의 부분 단편 폴리펩타이드의 정제 표준품 또는 본 발명의 폴리펩타이드의 일부의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 항원으로서 사용하여 동물에게 투여함으로써 폴리클로날 항체를 제작할 수 있다.
투여하는 동물로서 토끼, 염소, 래트, 마우스, 햄스터, 닭 등을 사용할 수 있다.
상기 항원의 투여량은 동물 1마리당 50 내지 100㎍이 바람직하다.
펩타이드를 사용하는 경우에는 펩타이드를 스카시가이헤모시아닌(keyhole l impet haemocyanin) 또는 소 티로글로불린 등의 캐리어 단백에 공유 결합시킨 것을 항원으로 하는 것이 바람직하다. 항원으로 하는 펩타이드는 펩타이드 합성기로 합성할 수 있다.
상기 항원의 투여는 1 회째의 투여 후 1 내지 2주 간격을 두고 3 내지 10회 실시한다. 각 투여 후, 3 내지 7일째에 안저 정맥총으로부터 채혈하고, 상기 혈청이 면역에 사용한 항원과 반응하는 것을 효소 면역 측정법[효소 면역 측정법(ELISA 법) 의학서원 간행(1976년), Antibodies-A Laboratory Manual, Co1d Spring Harber Laboratory (1988)] 등으로 확인한다.
면역에 사용하는 항원에 대하여 그 혈청이 충분한 항체가를 나타낸 면역된 사람 아닌 포유 동물로부터 혈청을 취득하고, 이 혈청을 분리, 정제함으로써 폴리클로날 항체를 취득할 수 있다.
분리, 정제하는 방법으로서는 원심 분리, 40 내지 50% 포화 황산암모늄에 의한 염석, 카프릴산 침전[Antibodies, A Laboratory Manua1, Cold Spring Harber Laboratory, (1988)] 또는 DEAE-세파로스 칼럼, 음이온 교환 칼럼, 프로테인 A 또는 G-칼럼 또는 겔 여과 칼럼 등을 사용하는 크로마토그래피 등을 단독 또는 조합하여 처리하는 방법을 들 수 있다.
(2) 모노클로날 항체의 제작
(a) 항체 생산 세포의 조제
면역에 사용하는 본 발명의 폴리펩타이드의 부분 단편 폴리펩타이드에 대하여 그 혈청이 충분한 항체가를 나타낸 래트를 항체 생산 세포의 공급원으로서 제공한다.
상기 항체가를 나타낸 래트에 항원 물질을 최종 투여한 후 3 내지 7일째에 비장을 적출한다.
상기 비장을 MEM 배지(닛스이 세이야꾸사 제품) 중에서 가늘게 절단하여 핀셋으로 해체시켜 1,200rpm에서 5분 동안 원심 분리한 후 상청액을 버렸다.
얻어진 침전 분획의 비장 세포를 트리스-염화 암모늄 완충액(pH 7.65)에서 1 내지 2분 동안 처리하여 적혈구를 제거한 다음, MEM 배지에서 3회 세정하여 수득된 비장 세포를 항체 생산 세포로서 사용한다.
(b) 골수종 세포의 조제
골수종 세포로서는 마우스 또는 래트로부터 취득한 확립 세포주를 사용한다. 예를 들면, 8-아자구아닌 내성 마우스(BALB/c 유래) 골수종 세포주 P3-X63Ag8-U1(이하, P3-U1라 약칭한다) [Curr. Topics. Microbiol. Immunol., 81, 1(1978), Europ. J. Immunol., 6, 511(1976)], SP2/0-Ag14(SP-2) [Nature, 276, 269(1978)], P3-X63-Ag8653(653) [J. Immunol., 123, 1548(1979)], P3-X63-Ag8(X63) [Nature, 256, 495(1975)] 등을 사용할 수 있다. 이러한 세포주는 8-아자구아닌 배지[1.5 mmol/ℓ글루타민, 5×10-5mol/ℓ 2-머캅토에탄올, 10 ㎍/㎖ 센타마이신 및 10% 소 태아 혈청(FCS:CSL사 제품)이 되도록 RPMI1640 배지에 첨가한 배지(이하, 정상 배지라 함)에 다시 8-아자구아닌을 15 ㎍/㎖ 첨가한 배지]로 계대하는데 세포 융합 3 내지 4일 전에 정상 배지로 배양하고, 융합에는 상기 세포를 2×107개 이상 사용한다.
(c) 하이브리도마의 제작
(a)에서 취득한 항체 생산 세포와 (b)에서 취득한 골수종 세포를 MEM 배지 또는 PBS(1.83g 인산이나트륨, 0.21g 인산-칼륨, 7.65g 식염, 증류수 1 리터, pH 7.2)로 잘 세정하여 세포 수가 항체 생산 세포:골수종 세포 = 5 내지 10:1이 되도록 혼합하고 1,200rpm에서 5분 동안 원심 분리한 후 상청액을 버린다.
얻어진 침전 분획의 세포군을 잘 분리하고, 상기 세포군에 교반하면서 37 ℃에서 108 항체 생산 세포당 폴리에틸렌글리콜-1000(PEG-1000) 2g, MEM 2 ㎖ 및 디메틸설폭시드(DMS0) 0.7 ㎖를 혼합한 용액을 0.2 내지 1 ㎖첨가하고, 다시 1 내지 2 분 동안마다 MEM 배지 1 내지 2 ㎖를 수회 첨가한다.
첨가 후, MEM 배지를 첨가하여 전량이 50 ㎖로 되도록 조제한다. 상기 조제액를 900rpm에서 5분 동안 원심 분리 후, 상청액을 버린다. 얻어진 침전 분획의 세포를 완만히 푼 다음, 메스 피펫에 의한 흡입하고 방출하여, 내뿜기로 완만히 HAT 배지[10-4mol/ℓ히포크산틴, 1.5×l0-5mol/ℓ티미딘 및 4×10-7mol/ℓ아미노프테린이 되도록 정상 배지에 첨가한 배지] 100 ㎖ 중에 현탁한다.
상기 현탁액를 96웰 배양용 플레이트에 100 ㎕/웰씩 분주하고, 5 % CO2 항온 배양기 중, 37 ℃에서 7 내지 14일째 배양한다.
배양 후, 배양 상청액의 일부를 덜어 문헌[Antibodies, A Laboratory manua1, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter l4(1988)] 등에 기술되어 있는 효소 면역 측정법에 의해 본 발명의 폴리펩타이드의 부분 단편 폴리펩타이드에 특이적으로 반응하는 하이브리도마를 선택한다.
효소 면역 측정법의 구체적인 예로서 하기의 방법을 들 수 있다.
면역시, 항원에 사용한 본 발명의 폴리펩타이드의 부분 단편 폴리펩타이드를 적당한 플레이트에 코팅하여 하이브리도마 배양 상청액 또는 후술하는 (d)에서 얻어지는 정제 항체를 제1 항체로서 반응시키고 다시 제2 항체로서 바이오틴, 효소, 화학발광 물질 또는 방사선 화합물 등으로 표지한 항래트 또는 항마우스 면역글로불린 항체를 반응시킨 다음에 표지 물질에 따른 반응을 실시하여 본 발명의 폴리펩타이드에 특이적으로 반응하는 것을 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마로서 선택한다.
상기 하이브리도마를 사용하여 한계 희석법에 의해 클로닝을 2회 반복하고[1회째는 HT 배지(HAT 배지에서 아미노프테린을 제외한 배지), 2회째는 정상 배지를 사용한다], 안정되고 강한 항체가가 인정된 것을 본 발명의 모노클로날 항체를 생 산하는 하이브리도마주로서 선택한다.
(d) 모노클로날 항체의 조제
프리스탄 처리[2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸(pristane) 0.5 ㎖를 복강내 투여하여 2주간 사육한다]한 8 내지 10 주령의 마우스 또는 누드 마우스에게, (c)에서 취득한 본 발명의 폴리펩타이드 모노클로날 항체 생산 하이브리도마 세포 5 내지 20×106 세포/마리를 복강내에 주사하였다. 10 내지 21일 만에 하이브리도마로 복수암(ascite tumor)이 유발된다.
상기 복수암화된 마우스로부터 복수를 채취하여 3,000rpm에서 5분 동안 원심 분리하여 고형분을 제거한다.
얻어진 상청액으로부터 폴리클로날로 사용하는 방법과 같은 방법으로 모노클로날 항체를 정제, 취득할 수 있다.
항체의 서브 클래스의 결정은 마우스 모노클로날 항체 타이핑 키트 또는 래트 모노클로날 항체 타이핑 키트를 사용하여 실시한다. 폴리펩타이드량은 로리 방법(Lowry method) 또는 280nm에서의 흡광도로부터 산출한다.
상기에서 취득되는 항체는 본 발명의 항체이다.
상기 항체는 항체를 사용한 통상의 분석법 즉, 방사성 면역분석법(RIA), 경쟁적 결합 분석법, 면역조직 화학 염색법(ABC법, CSA 법 등), 면역 침강법, 웨스턴 플롯 분석, ELISA 분석법 등에 사용할 수 있다[An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, 엘세비아 사이언스 출판사(1986), Techniques in Immunocytochemistry, academic, press 제1권(1982), 제2권(1983), 제3권(1985), Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, 엘세비아 사이언스 출판사(1985), 효소 면역 측정법(ELISA법) : 의학서원 간행(1976년), Antibodier A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988), 단클론 항체 실험 매뉴얼(고단샤 사이언티픽) (1987), 속 생화학 실험 강좌 5, 면역 생화학 연구법(도꾜 화학 동인) (1986)].
본 발명의 항체는 그대로 또는 표지하여 사용할 수 있다.
표지로서는 방사성 동위원소, 친화도 표지(바이오틴, 아비딘 등), 효소 표지(서양 고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제 등), 형광 표지(FITC 또는 로다민 등), 로다민 원자를 사용한 표지를 들 수 있다[J. Histochem. Cytochem., 18, 315(1970), Meth. Enzym., 62, 308(1979), Immunol., 109, 129(1972), J. Immunol. Meth., 13, 215(1979)].
표기 분석법, 후술하는 폴리펩타이드 어레이 또는 프로테옴 해석법에 의해 상기 항체 또는 상기 표지 항체를 사용하여 코리네형 세균에서의 본 발명의 폴리펩타이드의 발현, 상기 발현의 변동, 핵 폴리펩타이드의 구조 변화의 유무, 코리네형 세균 이외의 생물에서의 본 발명의 폴리펩타이드에 상응하는 폴리펩타이드의 존재의 유무를 해석할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체를 사용한 면역 친화도 크로마토그래프에 의해 상기 항체가 인식하는 폴리펩타이드를 정제할 수 있다.
12. 폴리펩타이드 어레이의 작제 및 이용
(1) 폴리펩타이드 어레이의 작제
상기 10에서 취득되는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 상기 11에서 취득되는 본 발명의 항체를 사용하여 폴리펩타이드 어레이를 작제할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드 어레이란 단백질 칩이라는 것을 포함하여 본 발명의 폴리펩타이드 또는 항체를 고체 지지체의 표면에 복수로 고착시킨 것을 말한다.
고체 지지체로서는 폴리카보네이트와 같은 플라스틱, 폴리아크릴아미드와 같은 아크릴 수지, 아가로스 및 세파로스와 같은 복합 탄수화물, 실리카 또는 실리카 베이스의 재료, 카본, 금속, 무기 유리, 라텍스 비드 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드 또는 항체를 문헌[Biotecbniques, 27, 1258-61(1999), Molecular medicine Today, 5, 326-7(1999), Handbook of Experimental Immunology 4th edition Blackwell Scientific Publcations chapter10 (1986), Meth, Enzym., 34(1974), Advances in Experimental Medicine and Biology, 42(1974), 미국 특허 제4,681,870호, 미국 특허 제4,282,287호, 미국 특허 제4,762,881호] 등에 기재된 방법에 준하여 고체 지지체 표면에 고착할 수 있다.
고체 지지체에 본 발명의 폴리펩타이드 또는 항체를 고밀도로 고착함으로써 후술하는 해석을 효율적으로 실시하는 것이 가능한데, 반드시 고밀도일 필요는 없다.
(2) 폴리펩타이드 어레이의 이용
상기 (1)에서 작제된 본 발명의 폴리펩타이드를 고착한 폴리펩타이드 어레이를 사용하면 어레이에 고착된 본 발명의 폴리펩타이드와 결합하여 상호 작용하는 폴리펩타이드 또는 화합물을 동정할 수 있다.
즉, 본 발명의 폴리펩타이드에 관해서 하기 (i) 내지 (iv)의 공정을 실시함으로써 상기 폴리펩타이드와 결합하여 상호 작용하는 폴리펩타이드 또는 화합물을 탐색할 수 있다.
(i) 상기 (1)의 방법으로 본 발명의 폴리펩타이드가 고착된 폴리펩타이드 어레이를 제작하는 공정,
(ii) 상기 폴리펩타이드 어레이상에 고정화된 본 발명의 폴리펩타이드와, 임의의 제2 폴리펩타이드 또는 화합물 하나 이상을 항온 처리하는 공정,
(iii) 어레이상에 고정화된 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드 또는 화합물 중 적어도 하나와 형성된 결합체를, 예를 들면 제2 폴리펩타이드 또는 화합물의 적어도 하나와의 결합을 표지하거나 당해 결합체로부터 결합하지 않은 물질을 제거하여 당해 결합체 성분과 특이적으로 결합하는 표지를 사용하여 검출하는 검출 공정,
(iv) 상기 검출 결과를 해석하는 해석 공정.
본 발명의 폴리펩타이드가 고착된 폴리펩타이드 어레이로서 구체적으로는 서열 3502 내지 7001로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 당해 폴리펩타이드의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 상기 폴리펩타이드의 활성과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드의 아미노산 배열과 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며 상기 폴리펩타이드의 활성과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드의 부분 단편 폴리펩타이드 및/또는 상기 폴리펩타이드 일부의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 하나 이상을 고체 지지체에 고착시킨 폴리펩타이드 어레이를 들 수 있다.
또한, 상기 (1)에서 작제된 본 발명의 항체를 고착된 폴리펩타이드 어레이에 사용하면 코리네형 세균의 폴리펩타이드 발현량의 해석을 행하는 것이 가능해진다.
즉, 코리네형 세균의 변이주 유래 유전자에 관해서 하기 (i) 내지 (iv)의 공정을 실시함으로써 상기 유전자의 발현량을 해석할 수 있다.
(i) 상기 (1)의 방법으로 폴리펩타이드 어레이를 작제하는 공정,
(ii) 상기 폴리펩타이드(제1 항체) 어레이와 코리네형 세균 유래의 폴리펩타이드를 항온 처리하는 공정,
(iii) 어레이상에 고정화된 항체와 결합한 폴리펩타이드를, 표지한 본 발명의 제2 항체를 사용하여 검출하는 검출 공정,
(iv) 상기 검출 결과를 해석하는 해석 공정.
본 발명의 항체가 고착된 폴리펩타이드 어레이로서 구체적으로는 서열 3502 내지 7001로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 당해 폴리펩타이드의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 상기 폴리펩타이드의 활성과 실질적으로 동일한 활성 을 갖는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며 상기 폴리펩타이드의 활성과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드의 부분 단편 폴리펩타이드 및/또는 상기 폴리펩타이드의 일부의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 인식하는 항체 하나 이상을 고체 지지체에 고착한 폴리펩타이드 어레이를 들 수 있다.
또한 코리네형 세균 유래의 폴리펩타이드로서 배양 경과 시간에 따라 취득된 폴리펩타이드를 사용함으로써 특정한 폴리펩타이드의 발현 변동을 추적할 수 있다. 상기 변동을 파악함으로써 배양 조건을 최적화하는 것이 가능해진다.
코리네형 세균의 변이주 유래의 폴리펩타이드를 사용하는 경우에는 변이 폴리펩타이드를 검출할 수 있다.
13. 프로테옴 해석에 의한 변이주에서의 유용 변이의 동정
프로테옴(proteome)이란 단백질과 게놈(genome)으로 이루어지는 조어로 유전자의 발현을 폴리펩타이드의 수준에서 조사하는 방법이다. 통상, 폴리펩타이드를 2차원 전기 영동으로 분리하고, 분리된 폴리펩타이드를 효소 절단한 후, 질량 분석계(MS)와 데이터 베이스 검색을 사용하여 상기 폴리펩타이드를 동정하는 방법을 가리킨다.
2차원 전기 영동이란 원리가 다른 2종류의 전기 영동을 조합하여 행하는 전기 영동법을 말한다. 예를 들면, 1차 영동을 폴리펩타이드의 분자량으로 분리하고, 이어서 겔을 90도 또는 180도 회전시켜 등전점에서 2차 영동하여 분리함으로써 여러가지의 분리 패턴을 실현시킬 수가 있다(JIS K 36002474).
데이터 베이스 검색에는 상기 2 및 8에서 작제된 본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열 정보 및 본 발명의 기록 매체를 이용할 수 있다.
코리네형 세균 및 상기 미생물의 변이주를 각각 프로테옴 해석함으로써 양자간에 변동이 인정된 폴리펩타이드를 동정할 수 있다.
코리네형 세포의 야생형주와 목적 산물의 생산성이 향상된 생산 균주를 각각 프로테옴 해석함으로써 목적 산물의 생산 능력의 향상을 목적으로 하는 육종에 유용한 변이 단백질 또는 발현량이 변동된 단백질을 효율적으로 동정할 수 있다.
구체적으로는, 코리네박테리움 글루타미쿰에서는 야생형주와 라이신 공정 균주를 각각 프로테옴 해석함으로써 야생형주와 비교하여 라이신 공정 균주에서 증대되는 지점을 발견하여 데이터 베이스 검색함으로써 라이신 생산성의 향상에 따라 생산량이 증대된 폴리펩타이드를 동정할 수가 있다. 예를 들면, 야생형주와 라이신 공정 균주의 프로테옴 해석에 의해 서열 3785로 기재된 아미노산 서열을 갖는 카탈라제의 생산량이 라이신 생산균 변이주에서 증가하고 있다는 것을 발견할 수 있다.
또한, 본 발명의 코리네형 세균의 게놈의 염기 서열 정보, 아미노산 서열 정보 및 상기 서열이 기록된 기록 매체를 사용하여 발현 수준이 높은 단백질을 프로테옴 해석에 의해 동정함으로써 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 염기 서열과 그 상류 영역의 염기 서열도 동시에 검색하는 것이 가능해져 고발현 프로모터를 갖는 염기 서열을 효율적으로 선택할 수 있다.
또한, 프로테옴 해석에서는 변동하는 지점이 변형된 단백질에 유래하는 수가 있는데, 본 발명의 코리네형 세균 게놈의 염기 서열 정보, 아미노산 서열 정보 및 상기 서열이 기록된 기록 매체를 사용하는 검색에 의해 변형된 단백질을 효율적으로 동정할 수가 있다.
또한, 동정된 상기 단백질에 관한 염기 서열(프로모터, ORF 등의 염기 서열)을 본 발명의 코리네형 세균 게놈의 염기 서열 정보, 아미노산 서열 정보 및 상기 서열이 기록된 기록 매체를 사용하여 검색하고, 발견된 염기 서열을 기초로 설계한 프라이머를 사용함으로써 용이하게 유용 변이주가 갖는 유용 변이점을 특정할 수 있다. 상기 변이점이 특정됨으로써 용이하게 상기 유용 변이 또는 상기 유용 변이로부터 유도되는 유용 변이를 갖는 산업상 유용한 변이주를 육종할 수 있다.
이하에서, 본 발명을 실시예를 기초로 상세히 설명하지만, 이에 제한되지는 않는다.
실시예 1
코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈의 전체 염기 서열의 결정
코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈의 전체 염기 서열의 결정은 전체 게놈 샷건법[Science, 269, 496-512(1995)]을 기본으로 하였다. 이 방법에서는 게놈 라이브러리를 작성하여 그 말단 서열을 랜덤하게 결정하고, 그 서열을 컴퓨터상에서 연결하여 전체 게놈을 조사하였다. 구체적으로는 아래와 같이 행하였다.
(1) 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032주의 게놈 DNA의 조제
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032주를 1% 글리신을 함유하는 BY 배지 (7g/ℓ고기 추출물, 10g/ℓ펩톤, 3g/ℓ염화나트륨, 5g/ℓ효모 추출물, pH 7.2) 50㎖로, 30 ℃에서 밤새 배양하고 원심 분리에 의해 균체를 회수하였다. STE 완충액(10.3% 수크로즈, 25 mmol/ℓ 트리스 염산염, 25 mmol/ℓ EDTA), pH 8.0)로 균체를 세정한 다음, 10 ㎎/㎖의 리소자임을 함유하는 STE 완충액 10 ㎖에 현탁하고 37 ℃에서 1 시간 완만하게 진탕하였다. 10% SDS를 2 ㎖첨가하여 용균시키고 65 ℃에서 10분 동안 유지한 후, 상온까지 냉각하였다. 10 ㎖의 트리스 중화 페놀을 첨가하여 실온에서 30분 동안 완만하게 진탕한 후, 원심 분리(15.000 ×g, 20 분 동안, 20 ℃)하였다. 수층을 분취하고 동일한 조작으로 페놀/클로로포름 추출, 클로로포름 추출(2회)을 실시한 다음, 수층에 1/10량의 3mol/ℓ아세트산나트륨 용액(pH 5.2), 2배량의 이소프로판올을 첨가하고 완만하게 혼화하여 게놈 DNA를 침전시켰다. 다시 게놈 DNA를 0.02 ㎎/㎖의 RNase를 함유하는 TE 완충액(10 mmol/ℓ 트리스 염산염, 1 mmol/ℓ EDTA, pH 8.0) 3 ㎖에 용해하여 37 ℃에서 45분 동안 유지한 다음, 상기와 같이 페놀 추출, 페놀/클로로포름 추출, 클로로포름 추출을 행하였다. 이소프로판올 침전을 실시하여 발생한 게놈 DNA 침전을 70% 에탄올로 3회 세정한 다음, 바람으로 건조하여 1.25 ㎖의 TE 완충액에 용해하여 게놈 DNA 용액(농도 0.1 ㎎/㎖)를 수득하였다.
(2) 샷건 라이브러리의 제작
조제한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032주 게놈 DNA 0.01 ㎎을 전체 량이 0.4 ㎖가 되도록 TE 완충액를 첨가하고 초음파 분쇄기(yamato powersonic model 50)로 출력 20에서 연속 5초간 처리하여 1 내지 10 kb의 단편으로 분단하였다. DNA 블런팅 키트(DNA Blunting kit, 다카라슈조사 제품)를 사용하여 게놈 단편의 말단을 평활화한 후, 6 % 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 분획하였다. 1 내지 2 kb의 게놈 단편을 겔로부터 추출하고, 0.3 ㎖의 MG 용출 완충액(0.5mol/ℓ아세트산암모늄, 10 mmol/ℓ아세트산마그네슘, 1 mmol/ℓ EDTA, 0.1 % SDS)를 첨가하여 37 ℃에서 밤새 진탕하여 DNA를 용출하였다. DNA 용출액을 페놀/클로로포름 처리 후, 에탄올 침전하여 게놈 라이브러리 삽입체를 얻었다. T4 리가제(다카라슈조사 제품)를 사용하여 삽입체 전량과 pUC18 SmaI/BAP(Amersham Pharmacia Biotech사 제품) 500 ng을 16 ℃에서 40 시간 결합하였다.
결합 반응물을 에탄올 침전하여 0.01 ㎖의 TE 완충액에 용해하였다. 대장균 ELECTR0 MAX DH10B(Life Technologies사 제품) 0.04 ㎖에 대하여 0.001 ㎖의 결합 용액을 첨부된 실험서에 기재된 조건으로 전기천공법에 의해 도입하였다. 이것을 0.1 ㎎/㎖ 암피실린, 0.1 ㎎/㎖ X-ga1, 1 mmol/ℓ이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTC)를 포함하는 LB 평판 배지[한천을 1.6 % 포함하는 LB 배지(10g/ℓ박토 트립톤, 5g/ℓ효모 추출물, 10g/ℓ염화나트륨, pH 7.0)]에 도포하여 37 ℃에서 밤새 배양하였다.
상기 평판 배지 위에 형성된 콜로니로부터 수득된 형질 전환체를 0.1 ㎎/㎖암피실린를 함유하는 LB 배지 0.05 ㎖를 첨가한 96웰 역가 플레이트 속에서 37 ℃에서 밤새 정치 배양한 다음, 20% 글리세롤을 함유하는 LB 배지를 0.05㎖ 첨가하고 교반하여 글리세롤 스톡으로서 사용하였다.
(3) 코스미드 라이브러리의 작성
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032주 게놈 DNA 약 0.1㎎을 Sau3AI(다카라슈조사 제품)에서 부분 절단하고 10% 및 40% 수크로즈 완충액(1mol/ℓNaC1, 20 mmol/ℓ 트리스 염산염, 5 mmol/ℓ EDTA, 10% 또는 40% 수크로즈, pH 8.0)를 사용하여 작제한 10 내지 40% 수크로즈 밀도 구배를 사용하여 초원심 분리(26,000rpm, 18 시간, 20 ℃)을 행하였다. 원심 분리 후 1 ㎖씩 튜브에 분취하고 아가로스 겔 전기 영동으로 각 분획의 DNA 단편 길이를 확인한 다음, 40 kb의 DNA 단편을 많이 포함하는 분획을 에탄올 침전하였다.
이 DNA 단편을 superCos1(Stratagene사 제품)의 BamHI 부위에 첨부한 실험 절차서에 따라 연결하였다. 연결산물은 Gigapack IIIGo1d Packaging Extract (Stratagene사 제품)를 사용하여 첨부된 실험 절차서에 따라 대장균 XL1-BlueMR (Stratagene사 제품) 균주에 도입하였다. 이것을 암피실린 0.1 ㎎/㎖를 함유하는 LB 평판 배지에 도포하고 37 ℃에서 밤새 배양하여 콜로니를 단리하였다. 얻어진 콜로니는 96웰 역가 플레이트로 암피실린 0.1 ㎎/㎖를 함유하는 LB 배지 각 웰 0.05 ㎖에서 37 ℃ 밤새 정치 배양한 다음, 20% 글리세롤를 함유하는 LB 배지를 0.05 ㎖ 첨가하고 교반하여 글리세롤 스톡으로 하였다.
(4) 염기 서열의 결정
(4-1) 주형의 조제
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032주 게놈의 전체 염기 서열을 전체 게놈 샷건법을 기본으로 하여 결정하였다. 상기 방법에서 사용하는 주형은 상기 (2)에서 조제한 라이브러리에 의거 PCR법을 사용하여 조제하였다.
구체적으로는, 암피실린 0.1 ㎎/㎖를 함유하는 LB 배지를 웰당 0.08 ㎖씩 분주한 96웰 역가 플레이트에 전체 게놈 샷건 라이브러리 유래 클론을 리플리케터 (GENETIX사 제품)로 식균하고 37 ℃에서 밤새 정치 배양을 행하였다.
상기 배양액을 PCR용 반응액[TaKaRa Ex Taq(다카라슈조사 제품)]을 0.025 ㎖씩 분주한 96웰 반응 플레이트(PE Biosystems사 제품)에 카피 플레이트(도켄사 제품)를 사용하여 이식하고 GeneAmp PCR sytem 9700(PE Biosystems사 제품)를 사용하여 마키노 등의 프로토콜[DNA Research, 5, 1-9(1998)]에 따라 PCR을 실시하여 삽입 단편의 증폭을 행하였다.
PCR 산물 정제용 키트(Amersham Pharmacia Biotech사 제품)에 의해 잉여 프라이머 및 누클레오타이드의 제거를 실시하고 이것을 서열 분석 반응의 주형로서 사용하였다.
일부의 염기 서열 결정은 이본쇄 DNA 플라스미드를 주형으로 하여 행하였다.
주형으로서 사용하는 이본쇄 DNA 플라스미드는 하기의 방법으로 취득하였다. 암피실린 0.05 ㎎/ℓ를 함유하는 2 ×YT 배지(16g/ℓ박토트립톤, 10g/ℓ효모 추출물, 5g/ℓ염화나트륨, pH 7.0)를 1.5 ㎖씩 분주한 24웰 또는 96웰 플레이트의 각 웰에 전체 게놈 샷건 라이브러리 유래 클론을 식균하여 37 ℃에서 밤새 진탕 배양 을 행하였다.
상기 배양액으로부터 플라스미드 자동 조제기 KURAB0P PI-50(구라시키 방적사 제품) 또는 멀티 스크린(Millipore사 제품)을 사용하고 구라시키 방적사 또는 밀리포어사의 프로토콜에 따라 이본쇄 DNA 플라스미드를 조제하였다.
멀티 스크린을 사용하고 이본쇄 DNA 플라스미드의 정제에는 벡크만 콜터사의 바이오멕 2000 등을 사용하였다.
얻어진 이본쇄 DNA 플라스미드를 0.1 ㎎/㎖ 정도가 되도록 물에 용해하여 서열 분석용의 주형으로서 사용하였다.
(4-2) 서열 분석 반응
ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(PE Biosystems사 제품) 용액 6 ㎕에 대하여 M1 정방향(M13-21) 프라이머 또는 M13 역방향(M13REV) 프라이머[DNA Research, 5, 1-9(1998)] 및 상기 (4-1)에서 조제한 주형(PCR 산물 또는 플라스미드)를 섞어 10 ㎕의 서열 분석 반응액으로 하였다. 프라이머 및 주형의 양은 각각 1.6 pMole 및 50 내지 200 ng이다.
상기 반응액을 사용하여 geneAmp PCR System 9700(PE Biosystems사 제품)에서 45 사이클의 다이 터미네이터(dye terminator) 서열 분석 반응을 행하였다. 사이클 파라미터는 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit에 부속되는 매뉴얼에 따랐다. 샘플의 정제는 MultiScreen HV plate(Milipore사 제품)를 사용하고 밀리포어사의 매뉴얼에 따라 행하였다. 정제된 반응물은 에 탄올 침전, 건조 후 -30 ℃의 어두운 곳에서 보존하였다.
ABI PRISM 377 DNA 서열 분석기 및 ABI PRISM 3700 DNA 분석기(모두 PE Biosystems사 제품)를 사용하여 부속된 매뉴얼에 따라 상기 건조 반응물을 분석하였다.
377 DNA 서열 분석기에서 얻어진 약 42,000개 서열과 3700 DNA 분석기에서 얻어진 약 8,000개 반응의 합계 약 50,000개 서열의 데이터는 서버(알파 서버 4100; C0MPAQ사 제품)로 전송하여 보존하였다. 약 50,000개 서열분의 데이터는 게놈 사이즈의 약 6배에 상당하였다.
(5) 어셈블리
모든 작업은 UNIX 플랫폼에 근거하여 행하고, 해석 결과의 출력은 X 윈도우 시스템을 사용하여 매킨토시 플랫폼에서 행하였다. 베이스 콜(base call)을 phred(The University of Washington)로, 벡터 서열의 제거를 SPS Cross_Match(Southwest Parallel Software사 제품)로 실시하고, 어셈블리를 phrap(The University of Washington)의 고속판인 SPS Phrap(Southwest Parallel Software사 제품)로 행하였다. 어셈블리의 결과로 수득되는 콘티그는 그래피컬 에디터 consed(The University of Washington)를 사용하여 해석하였다. 베이스 콜로부터 어셈블리까지의 일련의 작업은 consed에 부속하는 스크립트 phredPhrap를 사용함으로써 일괄적으로 수행하였다.
(6) 갭 부분의 염기 서열 결정
(3)에서 구축한 코스미드 라이브러리 중의 각 코스미드를 (4-1)에 기재한 이본쇄 DNA 플라스미드 조제와 동일한 방법으로 조제하였다. 이 코스미드의 삽입 단편 말단부의 염기 서열을 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit(PE Biosystems사 제품)를 사용하여 부속하는 매뉴얼에 따라 결정하였다.
코스미드 약 800개 클론의 삽입 단편의 양쪽 말단의 서열 분석을 실시하여 그 서열과 일치하는 (5)에서 얻어진 샷건 서열 분석 유래 콘티그 중의 염기 서열을 검색하였다. 이 작업에 의해 각 코스미드 클론과 각 콘티그의 연쇄 관계를 해명하여 상호정렬화를 행하였다. 또한, 이 결과를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032주의 물리적 지도[Mol. Gen. Genet., 252, 255-265(1996)]와 대응시킴으로써 코스미드와 콘티그의 맵핑을 행하였다.
또한, 콘티그에서는 커버되지 않은 영역(갭부)의 서열은 하기의 방법으로 결정하였다.
콘티그의 말단에 위치하는 서열을 함유하는 클론을 선발하였다. 이들 중으로부터 삽입 단편의 한쪽의 말단만의 서열밖에 결정되어 있지 않은 약 1,000개 클론을 선발하여 삽입 단편의 역말단의 서열을 결정하였다. 계속해서 2개의 콘티그에 삽입 단편의 각각의 말단의 서열이 포함되도록 전체 게놈 유래 샷건 라이브러리 클론 또는 코스미드 클론을 동정하며 상기 클론의 삽입 단편의 전체 염기 서열을 결정함으로써 이러한 갭 부분의 염기 서열을 결정하였다. 갭 부분을 커버하는 샷건 라이브러리 클론 또는 코스미드 클론이 없는 경우에는 이의 콘티그 말단의 서열에 상보하는 프라이머를 작성하여 PCR에 의해 갭 영역의 DNA 단편을 증폭하여 이것을 주형으로 하는 프라이머-워킹법 또는 증폭한 PCR 단편으로부터 조제한 샷건 클론의 서열을 결정하는 샷건법에 의해 서열 분석을 행하고 상기 영역의 염기 서열을 결정하였다.
서열 정밀도가 낮은 영역에 관해서는 consed(The University of Washington)의 AUTOFINISH 기능과 NAVIGATING 기능을 이용하여 프라이머를 합성하여 프라이머 워킹법에 의해 서열 결정을 실시하여 서열 정밀도를 높였다. 이와 같이 결정한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032주 게놈의 전체 염기 서열을 서열 1에 나타낸다.
(7) ORF의 동정과 기능 추정
서열 1에 기재된 염기 서열 중의 ORF의 동정은 아래와 같이 실시하였다. 우선, UNIX 플랫폼상에서 ORF 동정 소프트웨어 Glimmer, GeneMark, 및 GeneMark.hmm을 사용하여 소프트웨어에 부속하는 매뉴얼에 따라 ORF 영역의 추정을 행하였다.
이들의 결과를 바탕으로 서열 1에 기재된 염기 서열 중의 ORF를 동정하였다.
ORF의 기능 추정은 동정된 ORF의 염기 서열을 GeneBank 데이터 베이스 유래의 단백질 암호화 영역으로 이루어진 데이터 베이스인 Swiss-Prot, PIR, GenPept 등의 아미노산 데이터 베이스에 대하여 상동성 검색 소프트웨어 Frame Search(Compugen사 제품)를 사용하여 상동성을 검색함으로써 또는 동정된 ORF의 아미노산 서열을 GeneBank 데이터 베이스 유래의 단백질 암호화 영역으로 이루어진 데이터 베이스인 Swiss-Prot, PIR, GenPept 등의 아미노산 데이터 베이스에 대하여 상동성 검색 소프트웨어 BLAST를 사용하여 상동성을 검색함으로써 행하였다. 이와 같이 결정한 ORF의 염기 서열을 서열 2 내지 3501에 또한 해당 ORF로 암호화되는 아미노산 서열을 서열 3502 내지 7001에 나타낸다.
여기서, ATG 이외의 염기 서열 TTG, TGT, GGT 등도 Met를 암호화하는 개시 코돈이 되는 경우가 있다.
상동성 검색 소프트웨어 Frame Search(Compugen사)에 의한 아미노산 해독 서열에서의 상동성 검색의 결과, 상기 ORF 서열과 가장 상동성이 높다고 판정되는 서열의 상기 데이터 베이스에서의 등록 번호 및 그 서열의 유전자 명칭, 그 유전자의 기능, 및 상기 공지된 아미노산 해독 서열과의 비교에서 발견된 일치 길이와 그 동일성 및 유사성을 표 1aa 내지 표 1fe에 나타내었다. 또한 해당 위치를 임의의 ORF의 염기 서열과 서열 1의 염기 서열과의 얼라인먼트를 취하는 것에 의해 확인하였다. ORF 이외의 염기 서열(예: 리보솜 RNA 유전자나 트랜스퍼 RNA 유전자, IS 서열 등)에 관해서도 동등하게 게놈상의 위치 결정을 하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032주의 대표적인 유전자의 게놈상의 위치를 도 1에 나타낸다.
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실시예 2
유효 변이점의 해명
(1) 라이신 생산균 B-6주와 야생형주 ATCC 13032의 유전자 염기 서열 비교에 의한 변이점의 동정
코리네박테리움 글루타미쿰 B-6주[(S-(2-아미노에틸) -시스테인(AEC), 리팜피신, 스트렙토마이신 및 6-아자우라실에 내성을 갖는다]는 야생형주 ATCC 13032로부터 돌연 변이제인 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG)에 의한 랜덤 변이와 선택을 수회에 걸쳐 반복하는 것에 의해 변이 육종된 라이신 생산 변이주이다 [Appl Microbiol Biotechnol, 32, 269-273(1989)]. 우선, 라이신 생산에 관련한다고 생각되는 B-6주 유래의 유전자에 관해서 염기 서열을 상기 서술한 것과 같은 방법에 의해 결정하였다. 라이신 생산 관련 유전자에게는 라이신 배출계 유전자인 lysE 및 lysG, 라이신 생합성계 유전자인 ddh , dapA, hom, 및 lysC(각각, 디아미노피멜린산 데하이드로게나제, 디하이드로피콜린산신타제, 호모세린데하이드로게나제 및 아스팔트키나제를 암호화), 그리고 당대사계 유전자인 pyc 및 zwf(각각, 피루브산카복실라제, 글루코스-6-인산 데하이드로게나제를 암호화)의 유전자가 포함되고 있다. 이들 생산균 유래의 유전자의 염기 서열을 서열 1 내지 3501에 기재된 ATCC 13032주 게놈의 대응하는 염기 서열과 비교 해석하였다. 그 결과, 다수의 유전자에서 변이점이 발견됐다. 예를 들면, lysE, lysG, ddh, dapA 등에는 변이점이 발견되지 않았지만, hom, lysC, pyc, zwf 등에는 아미노산 치환 변이가 발견되었다. 이들의 변이점 중에서 기존에 공지된 생화학적 또는 유전학적 정보에 근거하여 생산에 기여하고 있다고 예상되는 변이점을 추출하였다. 이와 같이 추출한 변이점 중에서 hom내 변이 Val59A1a 및 pyc내 변이 Pro458Ser에 관해서 이들 변이가 유효 변이인가 아닌가의 평가를 아래와 같이 행하였다.
(2) hom내 변이 Val59Ala 및 pyc내 변이 Pro458Ser의 평가
호모세린의 요구성 또는 부분 요구성을 가져오는 hom의 변이는 야생형주에 라이신의 생산을 부여하는 것은 공지되어 있다[아미노산 발효, //상전호 등 편, 학회출판 센터]. 그러나, hom내 변이 Val59A1a와 라이신 생산과의 관련에 관해서는 지금까지 공지된 바가 없다. hom내 변이 Val59A1a가 유효 변이인지 아닌지는 야생형주에 상기 변이를 도입하여 수득된 균주의 라이신 생산능을 조사함으로써 분명히 할 수 있다. 한편, pyc내 변이 Pro458Ser이 유효한지 아닌지를 조사하기 위해서는 라이신 생합성 경로의 대사 조절이 해제되어 있으며 또한 당해 pyc변이를 가지고 있지 않은 라이신 생산 균주에 상기 변이를 도입하여 수득된 균주의 라이신 생산성을 친주와 비교함으로써 분명히 할 수 있다. 이러한 라이신 생산균으로서 No.58주 (FERM BP-7134)를 선택하였다. 이상에 근거하여 hom내의 변이 Val59A1a 및 pyc내 변이 Pro458Ser를 유전자 치환법을 사용하여 각각, 코리네박테리움 글루타미쿰의 야생형주 ATCC 13032 및 라이신 생산균 No. 58주에 도입하는 것을 시도하는 것으로서, 이를 위한 유전자 치환용 플라스미드 벡터 pCES30을 아래와 같이 작제하였다.
카나마이신 내성 유전자를 갖고 코리네형 세균으로 자율 복제할 수 있는 플라스미드 벡터 pCE53[Mol. Gen. Genet., 196, 175-178(1984)] 및 고초균의 레반슈크라제(levansucrase) 유전자(sacB)를 함유하는 플라스미드 pMOB3(ATCC 77282) [Molecular Microbiology, 6, 1195-1204(1992)]를 각각 PstI으로 절단하였다. 이어서 아가로스 겔 전기영동 후, pCE53 단편 및 sacB를 포함하는 2.6kb의 DNA 단편을 각각 GENECLEAN Kit(BIO 101사 제품)를 사용하여 추출 정제하였다. pCE53 단편과 당해 2.6kb의 DNA 단편을 결합 키트 ver.2(다카라슈조사 제품)를 사용하여 연결하여 ATCC 13032주에 전기 천공법[FEMS Microbiology Letters, 65, 299(1989)]에 의해 도입하여 25μg/㎖의 카나마이신을 포함하는 BYC 한천 배지[l0g 글루코스, 20g 펩톤(극동제약공업사 제품), 5g 효모 추출물(Difco사 제품), 16g 박토아가(Difco사 제품)를 물 1L에 포함하고 pH 7.2로 조정한 배지]상에서 30℃에서 2시간 배양하여 카나마이신 내성이 된 형질전환주를 취득하였다. 수득된 형질전환주로부터 알칼리 SDS 방법에 의해 추출한 플라스미드는 제한 효소에 의한 절단 해석의 결과, pCE53의 PstI 부위에 상기 2.6kb의 DNA 단편이 삽입된 구조를 갖고 있는 것을 확인하였다. 상기 플라스미드를 pCES30이라 명명하였다.
다음에 변이점을 갖는 2종의 유전자, hom 및 pyc를 PCR 방법으로써 증폭하고 TA 클로닝법(바이오 실험 일러스트레이티드 vo1.3)에 의해 pCES30에 삽입하였다. 구체적으로는, pCES30을 BamHI(다카라슈조사 제품)에서 절단 후, 아가로스 전기 영동하고, GENECLEAN Kit(BIO 101사 제품)를 사용하여 추출 정제하였다. 수득된 pCES30 단편의 양쪽 말단을 DNA 블런팅 키트(DNA Blunting Kit, 다카라슈조사 제품)를 사용하여 부착된 프로토컬에 따라 평활화하였다. 평활화한 pCES30 단편을 페놀 클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의해 농축한 다음, Taq DNA 폴리머라제(Roche diagnostics사제), dTTP 존재하에 70℃, 2시간 반응시켜 3' 말단에 티민(T) 염기 하나를 부가하여 pCES30의 T 벡터를 조제하였다.
한편, 라이신 생산균 B-6주에서 염색체 DNA를 사이토 등의 방법[Biochimica et Biophysica Acta, 72, 619(1963)]에 의해 조제하고, 이것을 주형으로서 변이형 hom 유전자의 경우에는 서열 7002 및 7003으로 염기 서열을 갖는 DNA를 프라이머 세트로서, 한편, 변이형 pyc 유전자의 경우에는 서열 7004 및 7005로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA를 프라이머 세트로서 각각 Pfu turbo DNA 폴리머라제(Stratagene사 제품)를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 수득된 pCR 산물을 아가로스 전기영동한 다음, GENECLEAN Kit(BIO 101사 제품)를 사용하여 추출 정제하였다. 이어서, 이 PCR 산물을 Taq 폴리머라제(Roche diagostics사 제품), dATP 존재하에 72℃, 10분 동안 반응시켜 3' 말단에 아데닌(A) 하나를 부가하였다.
상기한 pCES30의 T 벡터 단편과 A 염기를 부가한 PCR 산물의 변이형 hom 유전자(1.7kb) 또는 변이형 pyc 유전자(3.6kb)를 페놀 클로로포름 추출하고 에탄올 침전에 의해 농축후, 결합 키트 ver.2를 사용하여 연결하였다. 당해 연결물을 ATCC 13032주에 전기천공법에 의해 도입하여 25μg/㎖의 카나마이신을 포함하는 BYG 한천 배지상에서 30℃에서 2일간 배양하여 카나마이신 내성이 된 형질전환주를 취득하였다. 수득된 형질 전환주를 25㎍/㎖의 카나마이신을 포함하는 BYG 액체 배지로써 밤새 배양하여 배양액으로부터 알칼리 SDS 방법에 의해 플라스미드를 추출하였다. 상기 플라스미드는 제한 효소에 의한 절단 해석의 결과, pCES30에 당해 1.7kb 또는 상기 3.6kb의 DNA 단편이 삽입된 구조를 갖고 있는 것을 확인하였다. 이와 같이 작제한 플라스미드를 각각, pChom59, pCpyc458이라 명명하였다.
유전자 치환법에 의한 야생형주 ATCC 13032 및 라이신 생산균 No. 58주에의 양쪽 변이의 도입은 다음과 같은 방법으로 행하였다. 즉, ATCC 13032주 및 No. 58주에 각각, pChom59 및 pCpyc458을 도입 후, 이케다 등의 방법[Microbiology, 144, 1863(1998)]를 사용하여 상기 플라스미드가 상동 재조합하여 염색체 DNA 중에 재조합된 주를 선택하였다. 이어서, pCES30으로 암호화되는 고초균 레반슈크라제가 자살 기질을 생산하는 것을 이용한 선택법[J. of Bacterio1., 174, 5462(1992)]에 의해 2번째의 상동 재조합이 실시된 주를 선택하고, 당해 선택주 중에서 ATCC 13032주 및 No. 58주가 종래 보유하고 있는 야생형의 hom 및 pyc 유전자가 변이형의 hom 및 pyc 유전자로 각각 치환된 주를 단리하였다. 이하에 그 구체적 방법을 나타낸다.
플라스미드 pChom59 또는 pCpyc458을 보유하는 상기 형질 전환주의 각 1주를 선택하여 당해 균주를 20㎍/㎖의 카나마이신을 포함하는 BYG 배지 중에 배양하여 전기천공법에 의해 pCGl1[일본 특허 공고 평 제6-91827호]의 도입 조작을 행하였다. pCG11은 스펙티노마이신 내성 유전자 및 pCE53과 같은 복제 오리진을 갖는 플라스미드 벡터이다. pCG11의 도입 조작 후, 당해 균주를 20㎍/㎖의 카나마이신 및 100μg/㎛의 스펙티노마이신을 함유하는 BYG 한천 배지상에서 30℃에서 2일간 배양하여 카나마이신 및 스펙티노마이신에 내성이 된 형질전환주를 각각 얻었다. 이들 형질전환주의 각 1주의 염색체를 이케다 등의 보고[Microbiclogy, 144, 1863(1998)]에 따라 서든 블롯 하이브리드화에 의해 조사하였다. 그 결과, pChom59 또는 pCpyc458이 Campbell 유형의 상동 재조합에 의해 염색체에 재조합되어 있는 것이 확인되었다. 이러한 주에서는 야생형 및 변이형의 hom 또는 pyc 유전자가 염색체상에 근접하여 존재하고 있으며 그 사이에서 2회째의 상동 재조합이 일어나기 쉽게 되어 있다.
상기 형질전환주(1회 재조합체) 각각을 Suc 한천 배지[수크로즈 100g, 육류 추출물 7g, 펩톤 10g, 염화나트륨 3g, 효모 추출물(Difco사 제품) 5g, 박토아가(Difco사 제품) 18g을 물 1L에 포함하고 pH 7.2로 조정한 배지]위에 도포하여 30℃로 1일간 배양하여 생육하는 콜로니를 각각 선택하였다. sacB 유전자가 존재하는 주는 수크로즈를 자살 기질로 전환시키기 때문에 이 배지로서는 생육할 수 없다[J. Bacterio1., 174, 5462(1992)]. 이것에 대하여 염색체상에 근접하여 존재하는 야생형과 변이형의 hom 또는 pyc 유전자 사이에서의 2회째의 상동 재조합에 의해 sacB 유전자가 결실된 주에서는 자살 기질은 가능하지 않아 이 배지로 생육할 수 있다. 이러한 상동 재조합의 경우에는 야생형 유전자 또는 변이형 유전자 중의 어느 하나가 sacB와 함께 결실된다. 이 때, 야생형이 sacB와 함께 결실한 주에서는 변이형에의 유전자 치환이 일어나게 된다.
이와 같이 각각 수득된 2회 재조합체의 염색체 DNA를 상기, 사이토 등의 방법에 의해 조제하여 hom 유전자의 경우에는 서열 7002 및 7003으로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA를 프라이머 세트로서 한편 pyc 유전자의 경우에는 서열 7004 및 7005로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA를 프라이머 세트로서 Pfu turbo DNA 폴리머라제(Stratagene사 제품)와 부착의 완충액을 사용하여 PCR을 행하였다. 이들 PCR 산물의 염기 서열을 통상적인 방법에 의해 결정하여 2회 재조합체의 hom 또는 pyc 유전자가 야생형인지 변이형인지를 판정하였다. 그 결과, HD-1 및 No. 58pyc라 명명한 2회 재조합체는 각각 변이형의 hom 유전자 및 pyc 유전자를 갖는 목적하는 균주인 것이 확인되었다.
(3) HD-1 주 및 No. 58pyc 주의 라이신 생산 시험
취득한 HD-1 주(ATCC 13032주에 hom 유전자내 변이 Val59Ala를 도입한 균주) 및 No. 58pyc 주(No. 58주에 pyc 유전자내 변이 Pro458Ser를 도입한 균주)를 각각, ATCC 13032주, No.58주를 대조군으로 하고 5ℓ자르 발효기(jar fementer)에 의한 배양 시험을 행하고 라이신의 생산성을 조사하였다.
BYG 한천 배지상에서 30℃에서 24시간 배양한 각 균주를 씨드 배지(수크로즈 50g, 옥수수 침지액 40g, 황산암모늄 8.3g, 요소 1g, 인산2수소칼륨 2g, 황산마그네슘7수화물 0.83g, 황산철7수화물 10㎎, 황산구리5수화물 1㎎, 황산아연7수화물 10㎎, β-알라닌 10㎎, 니코틴산 5㎎, 티아민염산염 1.5㎎, 바이오틴 0.5㎎을 물 1L에 포함하고 pH 7.2로 조정하여 탄산칼슘을 30g 가한 배지) 250㎖를 함유하는 2 리터 버플 부착된 삼각 플라스크에 식균하여 30℃에서 12시간 내지 16시간 배양하였다. 이 씨드 배양액 전체량을 본 배양 배지(글루코스 60g, 옥수수 침지액 20g, 염화암모늄 25g, 인산2수소칼륨 2.5g, 황산마그네슘7수화물 0.75g, 황산철7수화물 50㎎, 황산망간5수화물 13㎎, 염화칼슘2수화물 50㎎, 황산구리5수화물 6.3㎎, 황산아연7수화물 1.3㎎, 염화니켈6수화물 5㎎, 염화코발트6수화물 1.3㎎, 몰리브덴산암모늄 4수화물 13㎎, 니코틴산 14㎎, β-알라닌 23㎎, 티아민염산염 7㎎, 바이오틴 0.42㎎을 물 1L에 포함하는 배지) 1,400㎖를 함유하는 5리터 자르 발효기에 식균하여 32℃, 1vvm, 800rpm 조건하에 pH 7.0에 암모니아수로 조정하면서 배양하였다. 배지 중의 글루코스가 소비된 시점에서 글루코스 피드액(글루코스 400g, 염화암모늄 45g을 물 1L에 포함하는 배지)을 연속적으로 첨가하였다. 상기 피드액의 첨가는 용존 산소 농도가 0.5 내지 3 ppm의 범위로 유지되도록 첨가 속도를 조정하면서 실시하여 배양시간이 29시간에 달한 점에서 배양을 종료하였다. 원심 분리에 의해 배양물로부터 균체를 제거하여 상청액 중의 L-라이신 염산염의 축적량을 고속액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 정량하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.
균주 L-라이신 염산염 (g/ℓ)
ATCC 13032 0
HD-1 8
No. 58 45
No. 58pyc 51
표 2로부터 명확해지는 바와 같이 hom내 변이 Val59A1a 또는 pyc내 변이 Pro458Ser의 도입에 의해 라이신 생산성의 부여 또는 향상이 확인되기 때문에 양쪽 변이는 어느 것도 라이신 생산에 관계하는 유효 변이인 것이 해명되었다. 코리네박테리움 글루타미쿰의 야생형주 ATCC 13032에 hom 유전자내 변이 Val59A1a와 pyc 유전자내 변이 Pro458Ser을 lysC 유전자내 변이 Thr331Ile와 같이 도입한 균주 AHP-3는 통산성공업기술원 생명공학공업기술연구소[일본국 이바라기겐 쓰쿠바시 도1초메 1반3고(우편번호 305-8566)]에 평성 12년 12월 5일자로 수탁 번호 FERM BP-7382로서 기탁되어 있다.
실시예 3
게놈 정보에 근거하는 라이신 생산균의 재구축
코리네박테리움 글루타미쿰의 야생형주 ATCC 13032로부터 NTG에 의한 랜덤 변이와 선택을 수회에 걸쳐 반복하는 것에 의해 변이 육종된 라이신 생산 변이주 B-6[Appl. Microbiol. Biotechnol, 32, 269-273(1989)]은 글루코스를 탄소원으로 하는 32℃의 자(jar) 배양으로 현저한 양의 라이신 염산염을 생산하지만 발효 시간이 길기 때문에, 시간당의 생산성은 2.1g/ℓ/h에 만족되지 않는다. B-6주에 도입되어 있는 추정 300개 이상의 변이점 중에서 라이신의 생산에 기여하는 유효 변이만을 야생형주 ATCC 13032에 재구성하는 육종을 시도하였다.
(1) B-6주와 ATCC 13032주의 유전자 염기 서열 비교에 의한 변이점의 동정과 유효 변이의 특정
전항에서 서술한 것같이 B-6주 유래의 유전자의 염기 서열을 서열 1 내지 3501에 기재된 ATCC 13032주 게놈의 대응하는 염기 서열과 비교 해석함으로써 B-6주의 염색체에 축적된 다수의 변이점을 동정하였다. 이들 중으로부터 전항에서 서술한 방법에 의해 라이신 생산에 관계하는 유효 변이로서, hom내 변이 Val59A1a, lysC내 변이 Thr3llIle, pyc내 변이 Pro458Ser 및 zwf내 변이 Ala213Thr를 특정하였다. 이들 4종의 변이를 야생형주에 재구성하여 공업적으로 우수한 라이신 생산균을 재구축하는 육종을 이하에 나타내도록 순서로 실시하였다.
(2) 변이형 유전자를 갖는 유전자 치환용 플라스미드의 제작
변이형 hom 유전자를 갖는 유전자 치환용 플라스미드 pChom59 및 변이형 lysC 유전자를 갖는 유전자 치환용 플라스미드 pCpyc458은 실시예 2(2)에서 사전에 제작 완료하였다. 변이형의 lysC 및 zwf을 갖는 유전자 치환용 플라스미드는 다음과 같이 제작하였다.
변이점을 갖는 lysC 및 zwf를 PCR 방법으로써 증폭하고 실시예 2(2)에 기재된 TA 클로닝법(바이오 실험 일러스트레이티드 Vol.3)에 의해 유전자 치환용 플라스미드 벡터 pCES30에 삽입하였다.
한편, 라이신 생산 변이주 B-6으로부터 염색체 DNA를 사이토 등의 방법[Biochimica et Biophysica Acta, 72, 619(1963)]에 의해 조제하고, 이것을 주형으로서 변이형 lysC 유전자의 경우에는 서열 7006 및 7007로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA를 프라이머 세트로서, 한편, 변이형 zwf 유전자의 경우에는 서열 7008 및 7009로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA를 프라이머 세트로서 각각 Pfu turbo DNA 폴리머라제(Stratagene사 제품)를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 수득된 pCR 산물을 아가로스 전기영동한 다음, GENECLEAN Kit(BIO 101사 제품)를 사용하여 추출 정제하였다. 이어서, 이 PCR 산물을 Taq DNA 폴리머라제(Roche diagnostics사 제품), dATP 존재하에 72℃, 10분 동안 반응시켜 3' 말단에 아데닌(A) 하나를 부가하였다.
상기한 pCES30의 T 벡터 단편과 A 염기를 부가한 PCR 산물의 변이형 lysC 유전자(1.5kb) 또는 변이형 zwf 유전자(2.3kb)를 페놀 클로로포름 추출하여 에탄올 침전에 의해 농축한 후, 결합 키트 ver 2를 사용하여 연결하였다. 당해 연결물을 ATCC 13032주에 전기천공법에 의해 도입하여 25㎍/㎖의 카나마이신을 포함하는 BYG 한천 배지상에서 30℃에서 2일간 배양하여 카나마이신 내성이 된 형질전환주를 취득하였다. 수득된 형질전환주를 25μg/㎖의 카나마이신을 포함하는 BYG 액체 배지 중에 밤새 배양하여 배양액으로부터 알칼리 SDS 방법에 의해 플라스미드를 추출하였다. 상기 플라스미드는 제한 효소에 의한 절단 해석의 결과, pCES30에 상기 1.5kb 또는 상기 2.3kb의 DNA 단편이 삽입된 구조를 갖고 있는 것을 확인하였다. 이와 같이 작제한 플라스미드를 각각, pClys311, pCzwf213이라 명명하였다.
(3) 1점 변이주 HD-1로의 lysC내 변이 Thr311Ile의 도입
이미, 실시예 2(2)에서 야생형주 ATCC 13032에 hom내 변이 Val59A1a를 도입한 1점 변이주 HD-1를 취득하고 있기 때문에 실시예 2(2)에서 서술한 유전자 치환법에 의해 상기(2)에서 작제한 pClysC311를 사용하여 HD-1주에 lysC내 변이 Thr311Ile를 도입하였다. 이와 같이 하여 수득된 균주의 염색체 DNA를 사용하여 서열 7006 및 7007로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA를 프라이머 세트로서 실시예 2(2)와 동일한 방법에 의해 PCR을 수행하였다. 이들 PCR 산물의 염기 서열을 통상적인 방법에 의해 결정한 결과, AHD-2로 명명한 주는 변이형의 hom 유전자에 가하여 변이형의 lysC 유전자를 갖는 2점 변이주인 것이 확인되었다.
(4) 2점 변이주 AHD-2로의 pyc내 변이 Pro458Ser의 도입
실시예 2(2)에서 서술한 유전자 치환법에 의해 실시예 2(2)에서 작제한 pCpyc458를 사용하여 AHD-2주에 pyc내 변이 Pro458Ser를 도입하였다. 이와 같이 하여 수득된 균주의 염색체 DNA를 사용하여 서열 7004 및 7005로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA를 프라이머 세트로서 실시예 2(2)와 동일한 방법에 의해 PCR을 행하였다. 이들 PCR 산물의 염기 서열을 통상적인 방법에 의해 결정한 결과, AHP-3으로 명명한 주는 변이형의 hom 유전자 및 lysC 유전자에 가하여 변이형의 pyc 유전자를 갖는 3점 변이주인 것이 확인되었다.
(5) 3점 변이주 AHP-3으로의 zwf내 변이 Ala213Thr의 도입
실시예 2(2)에서 서술한 유전자 치환법에 의해 상기(2)에서 제작하였다.
pCzwf213를 사용하여 AHP-3주에 zwf내 변이 Ala213Thr를 도입하였다. 이와 같이 하여 수득된 균주의 염색체 DNA를 사용하여 서열 7008 및 7009로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA를 프라이머 세트로서 실시예 2(2)와 동일한 방법에 의해 PCR을 행하였다. 이들 PCR 산물의 염기 서열을 통상적인 방법에 의해 결정한 결과, APZ-4로 명명한 주는 변이형의 hom 유전자, lysC 유전자, pyc 유전자에 가하여 변이형의 zwf 유전자를 갖는 4점 변이주인 것이 확인되었다.
(6) HD-1주, AHD-2주, AHP-3주 및 APZ-4주의 라이신 생산 시험
이상과 같이 하여 취득한 HD-1주, AHD-2주, AHP-3주 및 APZ-4주에 관해서 실시예 2(3)와 동일한 방법으로 5리터 자르 발효기에 의한 배양 시험을 실시한 결과를 표 3에 나타낸다.
균주 L-라이신 염산염 (g/ℓ) 생산성 (g/ℓ/h)
HD-1 8 0.3
AHD-2 73 2.5
AHP-3 80 2.8
APZ-4 86 3.0
랜덤 변이와 선택에 의해 변이 육종된 라이신 생산 변이주 B-6의 생산성은 2.1g/ℓ/h에 만족하지 않기 때문에, 3.0g/ℓ/h라는 높은 생산성을 주는 APZ-4주는 공업적으로 분명히 유리하다. 이러한 생산성은 야생형주가 원래 갖고 있는 높은 생육능과 당소비능이 APZ-4주에 반영되어 달성된 것이다.
(7) APZ-4주에 의한 고온 조건으로의 라이신 발효
야생형주에 4개의 유효 변이를 도입함으로써 재구축된 APZ-4주에 대하여, 배양 온도를 40℃로 행하는 이외는 모두 실시예 2(3)와 동일한 방법으로 5리터 자르 발효기에 의한 배양 시험을 실시한 결과를 표 4에 나타낸다.
배양온도(℃) L-라이신 염산염 (g/ℓ) 생산성 (g/ℓ/h)
32 86 3.0
40 95 3.3
표 4로부터 명확한 바와 같이, 40℃의 고온 배양에서도 32℃의 경우와 동일한 라이신 염산염 역가와 생산성이 얻어졌다. 변이 육종된 라이신 생산 변이주 B-6으로서는 34℃을 넘는 온도로서는 생육과 라이신의 생산성이 저하하기 때문에 라이신 발효를 실시할 수 없지만, APZ-4주에서는 40℃의 고온이라도 라이신 발효를 실시할 수 있기 때문에 냉각의 부담을 대폭 경감할 수 있으며 공업적으로 유리하다. 이러한 고온에서의 라이신 발효의 성립은 야생형주가 원래 갖고 있는 고온 적응성이 APZ-4주에 반영되어 달성된 것이다.
이상에서 나타낸 라이신 생산균의 재구축으로부터 예증되도록, 본 발명은 종래의 변이 육종의 결점을 배제하여 공업적으로 유리한 균주를 취득하는 데에서 유효하고 또한 신규한 육종법을 제공한다. 이 유효 변이를 재구성하여 생산균을 재구축하는 방법론은 본 발명에서 개시한 게놈의 염기 서열 정보를 이용함으로써 효율적으로 실시할 수 있는 접근이며, 이의 유효성은 본 발명에 의해 처음으로 발견된 것이다.
실시예 4
DNA 마이크로어레이의 제작 및 이용
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032주의 전체 염기 서열로부터 소프트웨어를 사용하고 예측한 ORF의 염기 서열 정보를 바탕으로 하여 DNA 마이크로어레이를 제작하여 배양시의 탄소원에 의해 발현 변동하는 유전자의 탐색을 실시하였다.
(1) DNA 마이크로어레이의 제작
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032주로부터 사이토 등의 방법[Biochemica et Biophysica Acta, 72, 619(1963)]에 의해 염색체 DNA를 조제하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032주의 전체 게놈 염기 서열을 바탕으로 소프트웨어에 의해 예측된 표 1에 나타내는 ORF에서 임의로 선택한 서열 207, 3433, 281, 3435, 3439, 765, 3445, 1226, 1229, 3448, 3451, 3453, 3455, 1743, 3470, 2132, 3476, 3477, 3485, 3488, 3489, 3494, 3496 및 3497로 나타내는 염기 서열을 갖는 24개의 유전자와 내부 표준용의 토끼 글로빈 유전자의 염기 서열[GenBank 접근 번호; VOO882]를 바탕으로 하여 상기 유전자의 염기 서열을 표적으로 하는 서열 7010 내지 7059에 나타내는 PCR 증폭을 위한 올리고 DNA 프라이머를 통상적인 방법에 의해 합성하였다.
토끼 글로빈 유전자의 염기 서열을 갖는 DNA의 증폭을 위한 PCR용으로 사용된 올리고 DNA 프라이머는,
서열 207의 염기 서열을 갖는 DNA의 증폭에는 서열 7010 및 7011에서 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA,
서열 3433의 염기 서열을 갖는 DNA의 증폭에는 서열 7012 및 7013으로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA,
서열 281의 염기 서열을 갖는 DNA의 증폭에는 서열 7014 및 7015로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA,
서열 3435의 염기 서열을 갖는 DNA의 증폭에는 서열 7016 및 7017로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA,
서열 3439의 염기 서열을 갖는 DNA의 증폭에는 서열 7018 및 7019로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA,
서열 765의 염기 서열을 갖는 DNA의 증폭에는 서열 7020 및 7021에서 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA,
서열 3445의 염기 서열을 갖는 DNA의 증폭에는 서열 7022 및 7023으로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA,
서열 1226의 염기 서열을 갖는 DNA의 증폭에는 서열 7024 및 7025로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA,
서열 1229의 염기 서열을 갖는 DNA의 증폭에는 서열 7026 및 7027로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA,
서열 3448의 염기 서열을 갖는 DNA의 증폭에는 서열 7028 및 7029로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA,
서열 3451의 염기 서열을 갖는 DNA의 증폭에는 서열 7030 및 7031에서 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA,
서열 3453의 염기 서열을 갖는 DNA의 증폭에는 서열 7032 및 7033으로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA,
서열 3455의 염기 서열을 갖는 DNA의 증폭에는 서열 7034 및 7035로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA,
서열 1743의 염기 서열을 갖는 DNA의 증폭에는 서열 7036 및 7037로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA,
서열 3470의 염기 서열을 갖는 DNA의 증폭에는 서열 7038 및 7039로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA,
서열 2132의 염기 서열을 갖는 DNA의 증폭에는 서열 7040 및 7041로 염기 서열을 갖는 DNA,
서열 3476의 염기 서열을 갖는 DNA의 증폭에는 서열 7042 및 7043으로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA,
서열 3477의 염기 서열을 갖는 DNA의 증폭에는 서열 7044 및 7045로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA,
서열 3485의 염기 서열을 갖는 DNA의 증폭에는 서열 7046 및 7047로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA,
서열 3488의 염기 서열을 갖는 DNA의 증폭에는 서열 7048 및 7049로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA,
서열 3489의 염기 서열을 갖는 DNA의 증폭에는 서열 7050 및 7051로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA,
서열 3494의 염기 서열을 갖는 DNA의 증폭에는 서열 7052 및 7053으로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA,
서열 3496의 염기 서열을 갖는 DNA의 증폭에는 서열 7054 및 7055로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA,
서열 3497의 염기 서열을 갖는 DNA의 증폭에는 서열 7056 및 7057로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA, 및
서열 7058 및 7059로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA를 각각 프라이머 세트로서 사용하였다.
PCR 반응은 서멀 사이클러(GeneAmp PCR system 9600, Perkinelmer사 제품), Takara EX-Taq(다카라슈조사제), 염색체 DNA 100ng 및 Takara EX-Taq 시약 부착의 완충액을 사용하여 95℃에서 15초간, 68℃에서 3분 동안의 사이클을 30회 수행하였다. 토끼 글로불린 유전자에 관해서는 토끼 글로불린 mRNA(라이프테크놀로지사 제품)로부터 역전사 효소 RAV-2(다카라슈조사제)를 사용하여, 사용 설명서에 따라 합성한 일본쇄 cDNA를 주형 DNA로 하였다. 증폭한 각각의 유전자의 PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동하여 QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제품)를 사용하여 추출, 정제하였다. 정제한 PCR 산물은 에탄올 침전에 의해 농축하여 200ng/㎕로 조제하였다. 슬라이드 글라스상에의 스폿팅에는 GTMASS SYSTEM(일본 레이저덴시사 제품)을 사용설명서에 따라 사용하여 각 PCR 산물에 관해서 각각 2회 MAS 코팅 부착 슬라이드 글라스(마쓰나미가라스제)상에 스폿팅하였다.
(2) 형광 표지 cDNA의 합성
ATCC 13032주를 BY 한천 배지[펩톤(극동제약공업사 제품) 20g, 효모 추출물(Difco사 제품) 5g, 박토아가(Difco사 제품) l6g을 물 1L에 포함하고 pH 7.2로 조정된 배지]에 도포하여 30℃에서 2일간 배양하였다. 이것을 또한 BY 액체 배지 5㎖에 식균하여 30℃에서 밤새 배양하였다. 다음에 이것을 글루코스 110mmol/ℓ 또는 아세트산암모늄 200mmol/ℓ를 함유하는 최소 배지(황산암모늄 5g, 요소 5g, 인산2수소1칼륨 0.5g, 인산1수소2칼륨 0.5g, 모르폴리노프로판설폰산 20.9g, 황산마그네슘7수화물 0.25g, 염화칼슘2수화물 10㎎, 황산망간1수화물 10㎎, 황산제1철7수화물 10㎎, 황산아연7수화물 1㎎, 황산구리 0.2㎎, 바이오틴 0.2㎎을 물 1L에 포함하고 pH 6.5에 조정된 배지) 30㎖에 식균하여 660nm에서의 흡광도가 1.0이 될 때까지 삼각 플라스크에서 30℃로 배양하였다. 4℃, 5,000rpm, 10분간의 원심 분리에 의해 균체를 조제 후, 수득된 균체로부터 베르만 등의 방법[Molecular Microbiology 6, 317-326(1992)]에 의해 전체 RNA를 조제하였다. DNA의 혼입을 배제하기 위해 DNaseI(다카라슈조사 제품)으로 37℃로 30분 동안 처리하고 다시 Qiagen RNeasy Mini Kit(QIAGEN사 제품)를 사용하여, 사용 설명서에 따라 정제하였다. 수득한 전체 RNA 30㎍의 용액에 토끼 글로불린 mRNA(50ng/㎕, 라이프테크놀로지사제)를 0.6㎕, 랜덤 6mer 프라이머(500ng/㎕, 다카라슈조사 제품)를 l㎕ 가하여 65℃로 10분 동안 변성시킨 다음, 빙상에서 급냉하였다. 이것에 SuperScriptII(라이프테크놀로지사 제품) 첨부된 완충액 6㎕, 0.1mol/ℓ DTT 3㎕, dNTPs(25mmol/ℓ dATP, 25mmol/ℓ dCTP, 25mmol/ℓ dGTP, 10mmol/ℓ dTTP) 1.5㎕, Cy-dUTP(NEN사 제품) 1.5㎕, SuperScriptII 2㎕를 가하여 25℃에서 10분 동안 유지한 다음, 42℃로 110분 동안 유지하였다. 탄소원으로서 글루코스를 사용하는 균체로부터 추출한 RNA는 Cy5-dUTP에서 아세트산 암모늄을 사용한 균체로부터 추출한 RNA는 Cy3-dUTP로 표지하였다. 형광 표지 반응 후, 1mol/ℓ 수산화나트륨-20mmol/ℓ EDTA 용액 및 1.5㎕, 10% SDS 용액을 3.0㎕ 가하여 65℃로 10분 동안 정치하여 RNA를 분해하였다. 표지 후, 2개의 cDNA 용액을 혼합하여 Qiagen PCR purification Kit(QIAGEN사 제품)를 사용하여, 사용 설명서에 따라 정제하여 10㎕로 조제하였다.
(3) 하이브리드화
UltraHyb(Ambion사 제품) 110㎕와 형광 표지한 DNA 용액 10㎕를 혼합하고 GeneTAC Hybridization Station(Genomic So1utions사 제품)를 사용하여 사용 설명서에 따라 하이브리드화하고 이후의 슬라이드 글라스의 세정까지 수행하였다. 하이브리드화는 50℃, 세정은 25℃에서 행하였다.
(4) 형광분석
형광 표지한 cDNA를 하이브리드화시킨 DNA 마이크로어레이에 관해서 ScanArray 4000(GSI Lumonics사 제품)를 사용하여 형광량을 측정하였다.
표 5에 각 유전자의 Cy3, Cy5의 시그널 강도를 내부 표준의 토끼 글로불린 유전자의 값에 의해 보정한 수치와 Cy3/Cy5의 비를 나타낸다.
서열번호 Cy3 강도 Cy5 강도 Cy3/Cy5

207
3433
281
3435
3439
765
3445
1226
1229
3448
3451
3453
3455
1743
3470
2132
3476
3477
3485
3488
3489
3494
3496
3497
5248
2239
2370
2566
5597
6134
1169
1301
1168
1187
2845
3498
1491
1972
4752
1173
1847
1284
4539
34289
43645
3199
3428
3848
3240
2694
2695
2515
6944
4943
1284
1493
1131
1594
3859
1705
1144
1841
3764
1085
1420
1164
8014
1398
1497
2503
2364
3358
1.62
0.83
0.91
1.02
0.81
1.24
0.91
0.87
1.03
0.74
0.74
2.05
1.30
1.07
1.26
1.08
1.30
1.10
0.57
24.52
29.16
1.28
1.45
1.15
Cy3의 시그널이 현저히 강한 서열 3488 및 3489에 관해서 소프트웨어로부터 예측된 ORF의 기능 정보를 검색한 바, 서열 3488은 말레산 신타제 유전자, 서열 3489는 이소시트르산 리아제 유전자였다. 이들 유전자는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 아세트산에 의해 전사 유도되는 것이 보고되어 있다[Archives of Microbiology 168, 262-269(1997)].
이상과 같이 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032주의 전체 게놈 염기 서열로부터 소프트웨어에 의해 예측된 ORF의 염기 서열 정보를 바탕으로 적절한 올리고 DNA 프라이머를 합성하여 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈 DNA를 주형으로서 상기 유전자의 염기 서열을 PCR 반응에 의해 증폭하여 DNA 마이크로어레이를 작제, 이용하는 점에서 발현이 변동하고 있는 유전자를 찾아내는 것이 가능하였다.
본 실시예로서는 24개의 유전자에 관해서 DNA 마이크로어레이를 사용하여 발현량의 해석을 할 수 있는 것을 나타낸다. 한편, 현재의 DNA 마이크로어레이 기술로서는 한번에 수 천 종류의 유전자의 프로브를 실은 DNA 마이크로어레이의 작제도 가능하다. 따라서, 본 발명에 의해 명백하게 한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032주의 전체 게놈 염기 서열을 바탕으로 소프트웨어에 의해 예측된 모든 ORF의 유전자 프로브를 실은 DNA 마이크로어레이를 작제하고, 이것을 사용하여 코리네박테리움 글루타미쿰의 전체 유전자 수준에서의 발현 프로필을 해석하는 것도 가능하다는 것으로 나타났다.
실시예 5
코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 서열을 사용하는 상동체 검색
(1) 아데노신 데아미나제의 검색
Swiss-prot 데이터 베이스로부터 아데노신 데아미나제(Adenosine Deaminase; EC3.5.4.4)로서의 기능이 확인되어 있는 단백질의 아미노산 서열로서 에스케리치아 콜라이 아데노신 데아미나제의 서열(ADD_EC0LI)을 입수하였다. 이 아미노산 서열의 전체 길이를 조회(query)로서, 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈 서열로 이루어진 염기 서열 데이터 베이스에 대하여 또는 게놈 서열로부터 예측한 ORF 영역의 아미노산 서열로 이루어진 데이터 베이스에 대하여 FASTA 프로그램[Proc. Natl. Acad, Sci. USA 85, 2444-2448(1988)]을 사용하여 상동성 검색을 행하였다. E-값이 Ie-10 이하인 것을 갖고 유의한 상동성을 갖는다고 판정하였다. 그 결과, 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈 서열로 이루어진 염기 서열 데이터 베이스 또는 게놈 서열로부터 예측한 ORF 영역의 아미노산 서열로 이루어진 데이터 베이스내에는 에스케리치아 콜라이 아데노신 데아미나제에 대해 유의한 상동성을 나타내는 서열이 발견되지 않았다. 이 점에서 코리네박테리움 글루타미쿰에는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는 ORF가 존재하지 않고 아데노신으로부터 이노신으로의 변환 활성이 존재하지 않는 것이 추정되었다.
(2) 글리신 절단(Glycine cleavage) 효소의 검색
Swiss-prot 데이터 베이스로부터 글리신 절단 효소(Glycine cleavage enzyme; EC2.1.2.10)로서의 기능이 확인되어 있는 단백질의 아미노산 서열로서 에스케리치아 콜라이 글리신 절단 효소의 구성 요소인 글리신 디카복실라제, 아미노메틸트랜스페라제 및 아미노메틸기 캐리어의 각 서열(GCSP_EC0LI, GCST_EC0LT 및 GCSH_EC0LI)을 입수하였다. 이들 아미노산 서열의 전체 길이를 조회로서 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈 서열로 이루어진 염기 서열 데이터 베이스에 대하여 또는 게놈 서열로부터 예측한 ORF 영역의 아미노산 서열로 이루어진 데이터 베이스에 대하여 FASTA 프로그램을 사용하여 상동성 검색을 행하였다. E-값이 le-10 이하인 것을 갖고 유의한 상동성을 갖는다고 판정하였다. 그 결과 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈 서열로 이루어진 염기 서열 데이터 베이스 또는 게놈 서열로부터 예측한 ORF 영역의 아미노산 서열로 이루어진 데이터 베이스내에는, 에스케리치아 콜라이 글리신 절단 효소의 구성 요소인 글리신 디카복실라제, 아미노메틸트랜스페라제 및 아미노메틸기 캐리어에 유의한 상동성을 나타내는 서열은 발견되지 않았다. 이 점에서 코리네박테리움 글루타미쿰에는 글리신 디카복실라제, 아미노메틸트랜스페라제 및 아미노메틸기 캐리어의 각 활성을 갖는 ORF가 존재하지 않고 글리신 절단 효소 활성은 존재하지 않는 것이 추정되었다.
(3) IMP 데하이드로게나제(IMP dehydrogenase)의 검색
Swiss-prot 데이터 베이스로부터 IMP 데하이드로게나제(IMP dehydrogenas; EC1.1.1.205)에서의 기능이 확인되어 있는 단백질의 아미노산 서열로서 에스케리치아 콜라이 IMP 데하이드로게나제의 서열(IMDH_ECOLI)을 입수하였다. 이 아미노산 서열의 전체 길이를 조회로서, 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈 서열로 이루어진 염기 서열 데이터 베이스에 대하여 또는 게놈 서열로부터 예측한 ORF 영역의 아미노산 서열로 이루어진 데이터 베이스에 대하여 FASTA 프로그램을 사용하여 상동성 검색을 행하였다. E-값이 le-10 이하인 것을 갖고 유의한 상동성을 갖는다고 판정하였다. 그 결과, 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈 서열로 이루어진 염기 서열 데이터 베이스 또는 게놈 서열로부터 측정한 ORF 영역의 아미노산 서열로 이루어진 데이터 베이스내에서 서열 1의 염기 서열에서 염기 서열 615336 내지 616853의 영역에 존재하는 ORF(또는 서열 672의 염기 서열을 갖는 ORF), 염기 서열 616973 내지 618094의 영역에 존재하는 ORF(또는 서열 674의 염기 서열을 갖는 ORF)의 2개의 ORF의 의하여 암호화되는 아미노산 서열에 대장균 IMP 데하이드로게나제의 ORF와의 유의한 상동성이 발견됐다. 이들 ORF로 암호화되는 아미노산 서열과 다른 생물종의 IMP 데하이드로게나제와의 유사성을 보다 상세히 조사하기 위해 이들 아미노산 서열을 조회로서 GenBank(http://www. ncbi. nlm. nih. gcv/)nr-aa 데이터 베이스(GenBankCDS의 해독 산물, PDB 데이터 베이스, Swiss-prot 데이터 베이스, PIR 데이터 베이스, PRF 데이터 베이스에 등록되어 있는 것으로부터 중복을 제외하고 작성된 아미노산 서열 데이터 베이스)에 대하여 BLAST 프로그램을 사용하여 검색을 행하였다. 그 결과, 이들 2개의 아미노산 서열의 어느 것이나 타생물종의 IMP 데하이드로게나제에 대하여 유의한 상동성을 나타내고, 또한 타단백질의 아미노산 서열과의 상동성과 비교하여 분명히 IMP 데하이드로게나제에 대한 상동성이 높기 때문에 이들 2개의 ORF가 암호화하는 아미노산 서열을 갖는 단백질은 IMP 데하이드로게나제로서 기능하고 있는 것으로 추정되었다. 이들의 점에서 코리네박테리움 글루타미쿰에는 IMP 데하이드로게나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 ORF가 2개 존재하는 것이 추정되었다.
실시예 6
코리네박테리움 글루타미쿰 균체 유래 단백질의 프로테옴 해석
(1) 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032주, FERM BP-7134주, FERM BP-158주의 균체 유래 단백질의 조제
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032주(야생형주), FERM BP-7134주(코리네박테리움 글루타미쿰의 라이신 생산주) 및 FERM BP-158주(코리네박테리움 글루타미쿰의 라이신 고생산주)를 실시예 2(3) 방법에 준하여 5리터 자르 발효기에 의한 배양 시험을 실시한 결과를 표 6에 나타낸다.
균주 L-라이신 염산염 (g/ℓ)
ATCC 13032 0
FERM BP-7134 45
FERM BP-158 60
배양 후, 원심 분리에 의해 균체를 각각 회수하였다. 이들 균체를 트리스-HCl 완충액[10mmo1/l 트리스-HCl pH 6.5, 1.6㎎/㎖ 프로테아제 억제제(COMPLETE; Boehringer Mannheim사 제품)]로 3회 세정하여 세정 균체를 취득하였다. 당해 세정 균체는 -80℃로 동결 보존 가능하였다. 상기 동결 보존 균체는 사용전에 융해하여 세정 균체로서 사용하였다.
상기 세정 균체를 파쇄 완충액[10mmol/ℓ 트리스-HCl pH7.4, 5mmol/ℓ 염화마그네슘, 50㎎/ℓ RNase, 1.6㎎/㎖ 프로테아제 억제제(COMPLETE; Boehringer Mannheim사 제품)]에 현탁하여 브라운제 파쇄 장치를 사용하여 냉각하면서 균체를 파쇄하였다. 수득된 파쇄액에 50㎎/ℓ가 되도록 DNase를 첨가하여 얼음상에 10분 동안 방치한 다음, 원심 분리(5,000 ×g, 15분 동안, 4℃)에 의해 미파괴 균체를 침전 구분으로서 제거하여 상청액 분획을 회수하였다.
상기 상청분획에 9mol/ℓ가 되도록 요소를 첨가하고 등량의 용해 완충액[9.5mol/ℓ 요소, 2% NP-40, 2% 암폴린, 5% 머캅토에탄올, 1.6㎎/㎖ 프로테아제 억제제(COMPLETE; Boehringer Mannheim사 제품)]을 가하여 실온에서 충분하게 교반하여 용해시켰다.
용해한 다음, 12.000 ×g에서 15분 동안 원심 분리하여 상청액 분획을 분리하여 취하였다.
상기 상청액 분획에 80% 포화가 되도록 황산암모늄을 첨가하여 충분히 교반하여 용해시켰다.
용해한 다음, 원심분리(16,000 ×g, 20분 동안, 4℃)하여 침전 분획을 회수하였다. 상기 침전 분획을 재차 용해 완충액에 용해하여 단백질 시료로서 이후의 실험에 사용하였다. 상기 단백질 시료의 단백질 농도는 브래드포드(Bradford)의 단백질 정량법에 준한 방법에 의해 구하였다.
(2) 2차원 전기영동법에 의한 단백질의 분리
등전점 전기영동법을 사용하여 1차원째의 전기영동을 아래와 같이 수행하였다.
성형 완료된 건조형 IPG 스트립겔(pH 4-7, 13cm; Immobi1ine DryStrips; Amersham Pharmacia Biotech사 제품)을 Mu1tiphor II 또는 IPGphor(Amersham Pharmacia Biotech사 제품) 전기영동 장치에 세팅하고 팽윤액(8mol/ℓ 요소, 0.5% 트리톤 X-100, 0.6% 디티오트레이톨, 0.5% 안포라인 pH3-10)을 충전하여 12시간 내지 16시간 정치하여 겔을 팽윤시켰다.
상기에서 조제한 단백질 시료를 샘플 용액(9mol/ℓ 요소, 2% CHAPS, 1% 디티오트레이톨, 2% 암폴린, pH 3 내지 l0)에 용해한 다음, 단백질량으로서 약 100 내지 500㎍을 분취하고 팽윤한 IPG 스트립겔에 첨가하였다.
등전점 전기영동은 20℃의 정온 조절하에서, 하기 4단계의 조건으로 수행하였다.
제1단계: 0 내지 500 V의 그래디언트로 1시간;
제2단계: 500 내지 1000 V의 그래디언트로 1시간;
제3단계: 1000 V 내지 8000 V의 그래디언트 모드(gradient mode)로 4시간;
제4단계: 8000 V의 정 전압으로 1시간.
등전점 전기영동 후, IPG 스트립겔을 홀더로부터 취득하고, 평형화 완충액 A (50mmol/ℓ 트리스-HCl pH 6.8, 30% 글리세롤, 1% SDS, 0.25% 디티오트레이톨)에 15분 동안, 평형화 완충액 B(50mmol/ℓ 트리스-HCl pH 6.8, 6mol/ℓ 요소, 30% 글리세롤, 1% SDS, 0.45% 요오드아세트아미드)에 15분 동안 담구어 충분히 겔을 평형화하였다.
평형화 후, IPG 스트립겔을 SDS 영동용 완충액(1.4% 글리신, 0.1% SDS, 0.3% 트리스-HCl pH 8.5)에서 가볍게 헹구어 분자량에 의한 2차원째의 전기영동을 하기와 같이 실시하여 단백질을 분리하였다.
즉, 전기영동 장치에 세팅한 14% 폴리아크릴아미드·슬러브 겔(14% 폴리아크릴아미드, 0.37% 비스아크릴아미드, 37.5mmol/ℓ 트리스-HCl pH 8.8, 0.1% SDS, 0.1% TEMED, 0.1% 과황산암모늄)상에 상기 IPG 스트립겔을 밀착하도록 싣고 30mA의 정전류하에서, 20℃로 3시간 전기영동하여 단백질을 분리하였다.
(3) 단백질 스폿의 검출
2차원째의 전기영동이 종료한 슬러브 겔을 사용하고, 고르그 등의 방법[Gorg et al., E1octrophoresis, 9, 531-546(1988)]에 준하여 쿠마시 염색을 수행하였다. 즉, 25℃에서 약 3시간 진탕하면서 슬러브 겔을 염색하여 지나친 염색을 탈색액으로 탈색시킨 후, 충분히 증류수로 세정하였다.
결과를 도 2에 나타내었다. ATCC 13032주(도 2의 A), FERM BP-7134주(도 2의 B) 및 FERM BP-158주(도 2의 C)의 균체 유래 단백질은 분리되며 스폿으로서 검출할 수 있었다.
(4) 검출한 단백질 스폿의 겔내 절단
검출한 스폿을 겔로부터 잘라내어 실리콘화 튜브에 옮기고 100mmol/ℓ 중탄산암모늄:아세트니트릴(1:1, v/v) 액을 400㎕ 가하여 밤새 진탕한 다음, 그대로 동결 건조를 수행하였다. 건조시킨 당해 겔에 10㎕의 리실엔도펩티다제(LysC) 액(WAK0사 제품; 100ng/㎕의 농도가 되도록 0.1% SDS 함유 50mmol/ℓ 중탄산 암모늄액으로 조제)을 첨가하여 0℃에서 45분 동안 팽창시킨 다음, 37℃에서 16시간 동안 방치하였다. LysC 액을 제거한 후, 추출액(60% 아세트니트릴과 5% 포름산 혼합액)을 20㎕ 첨가하여 실온에서 5분 동안 초음파 처리하여 겔을 파쇄하였다. 파쇄시킨 후, 원심 분리(12,000rpm, 5분 동안, 실온)에 의해 추출액을 회수하였다. 이러한 조작을 2회 반복하여 모든 추출액을 회수하였다. 진공에서 원심 분리를 실시하여 당해 회수액의 액량이 반 이하가 될 때까지 농축하였다. 상기 농축액에 0.1%의 트리플루오로아세트산을 20㎕ 가하여 충분히 교반시킨 후, ZipTip(Millipore사 제품)를 사용하여 탈염 처리하였다. ZipTip의 담체에 흡착시킨 단백질은 5㎕의 알파-시아노-4하이드록시신나믹산(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid)을 사용하여 용출시켜 해석용 샘플액으로 사용하였다.
(5) 질량 분광계의 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 시간(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight Mass Spectrometer, MALDI-TOFMS)에 의한 단백질 스폿의 질량 분석 및 아미노산 서열분석
해석용 샘플액과 질량 교정용 펩타이드 혼합물액(300nmol/ℓ 안지오텐신 II, 300nmol/ℓ 뉴로텐신, 150nmol/ℓ ACTHclip 18-39, 2.3μmol/ℓ 소 인슐린 B 쇄)을 등속 혼합한 후, 상기 혼합액 1㎕를 스테인레스 재질의 프로브에 스폿하여 자연건조에 의해 결정화하였다.
측정용 기종으로서 REFLEX MALDI-TOF 질량 분광계(Bruker사 제품)를 N2 레이저(337nm)와 조합시켜 사용하였다.
PMF(펩타이드-질량 핑거 프린팅; Peptide-mass finger printing)에 의한 해석은 가속 전압 19.0kV, 검출기 전압 1.50kV, 리플렉터 모드의 조건하에 30회 측정한 결과의 적산 스펙트럼을 사용하여 행하였다. 질량의 교정에는 내부 표준법을 사용하였다.
PSD(post-source decay)에 의한 해석은 가속 전압 27.5kV에서 반사 전압과 검출기 전압을 순차로 바꿔 수득한 적산 스펙트럼을 사용하여 행하였다.
상기 해석에 의해 단백질 스폿에 유래하는 절단후의 펩타이드 단편의 질량 및 아미노산 서열을 결정하였다.
(6) 단백질 스폿의 동정
상기 (5)에서 얻어진 단백질 스폿에 유래하는 절단후의 펩타이드 단편의 아미노산 서열 정보로부터 실시예 1에서 구축한 코리네박테리움 글루타이쿰 ATCC 13032주의 게놈 서열 데이터 베이스로부터 상기 단백질에 상응하는 ORF를 검색하여 상기 단백질을 동정하였다.
단백질의 동정에는 인트라넷 프로테인 프로스텍터(intranet protein prospector)의 MS-Fit 프로그램과 MS-Tag 프로그램을 사용하였다.
(a) 고발현 단백질을 암호화하는 유전자의 검색과 동정
도 2의 A에 나타낸, CBB 염색에 의해 발현량이 높다고 확인된, 코리네박테리움 글루타이쿰 ATCC 13032주의 균체 유래의 단백질에서 스폿-1, 스폿-2, 스폿-3, 스폿-4, 스폿-5에 대응하는 단백질에 관해서 상기 방법으로 이들 단백질을 동정하였다.
그 결과, 스폿-1은 서열 4585의 아미노산 서열을 갖는 단백질인 에놀라제, 스폿-2은 서열 5254의 아미노산 서열을 갖는 단백질인 포스포글리세레이트 키나제, 스폿-3은 서열 5255의 아미노산 서열을 갖는 단백질인 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 스폿-4는 서열 6543으로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질인 프럭토스 비스-포스페이트 알돌라제, 스폿-5는 서열 5252의 아미노산 서열을 갖는 단백질인 트리오스 포스페이트 이소머라제였다.
이들 공지된 단백질을 암호화하는 유전자는 각각 스폿-1의 단백질을 암호화하는 서열 1085에 기재된 염기 서열을 갖는 유전자, 스폿-2의 단백질을 암호화하는 서열 1754에 기재된 염기 서열을 갖는 유전자, 스폿-3의 단백질을 암호화하는 서열 1775에 기재된 염기 서열을 갖는 유전자, 스폿-4의 단백질을 암호화하는 서열 3043에 기재된 염기 서열을 갖는 유전자, 스폿-5의 단백질을 암호화하는 서열 1752에 기재된 염기 서열을 갖는 유전자이며, 미생물 생명을 유지하는데 중요한 중앙 대사 경로의 유전자이고, 특히 스폿-2, 스폿-3, 스폿-5의 단백질을 암호화하는 유전자는 오페론을 형성하고 게다가 상류 영역에는 고발현 프로모터가 암호화되어 있는 것이 시사되어 있다[J. of Bacteriol., 174, 6067-6086(1992)].
또한, 상기와 같은 수법을 사용하여 도 2의 스폿-9에 상응하는 단백질을 동정한 바, 당해 스폿은 서열 6937의 아미노산 서열을 갖는 단백질인 신장 인자 Tu이며, 당해 단백질은 서열 3437의 염기 서열을 갖는 DNA에 암호화되어 있는 것으로 판명됐다.
이들 결과로부터, 실시예 1에서 구축한 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 서열 데이터 베이스를 사용하여 발현 수준이 높은 단백질을 프로테옴 해석에 의해 동정함으로써 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 염기 서열과 그 상류 영역의 염기 서열도 동시에 검색할 수 있게 되며, 고발현 프로모터로서의 기능을 갖는 염기 서열을 효율적으로 선택할 수 있는 것으로 나타났다.
(b) 변형된 단백질의 검색과 동정
도 2의 B에 나타낸, 코리네박테리움 글루타미쿰 BP-7134주의 균체 유래 단백질 중에서 스폿-6, 스폿-7, 스폿-8을 상기와 동일한 방법으로 동정한 결과, 이들 3개 스폿은 모두 서열 3785로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질인 카탈라제였다.
즉, 등전점에서의 이동도가 다른 스폿으로서 검출된 스폿-6, 스폿-7, 스폿-8은 모두 동일한 서열 285로 나타내는 염기 서열로 이루어진 카탈라제 유전자에 유래하는 산물이라고 생각되었다. 따라서, 코리네박테리움 글루타이쿰 FERM BP-7134주 유래의 카탈라제는 해독후에 변형을 받고 있는 것이 나타났다.
이 결과로부터 실시예 1에서 구축한 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈 서열의 데이터 베이스를 사용하고 프로테옴 해석함으로써 각종의 다른 변형을 받은 단백질을 효율적으로 검색할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
(c) 라이신 생산성에 효과적인 발현 단백질의 검색과 동정
도 2의 A(ATCC 13032주: 야생주), 도 2의 B(FERM BP-7134주: 라이신 생산주) 및 도 2의 C(FERM BP-158주: 라이신 고생산주)에서 상기로 동정된 스폿-8에 상응하는 카타라제와 스폿-9에 상응하는 신장 인자 Tu는 라이신 생산능이 높은 균주일수록 발현 수준이 높아지는 것을 알았다.
이러한 결과로부터, 실시예 1에서 구축한 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈 서열의 데이터 베이스를 사용하고 프로테옴 해석함으로써 목적 산물의 생산 능력의 강화를 목적하는 육종에서 유망한 변이 단백질을 효율적으로 검색하거나 동정할 수 있다는 것을 밝혀내었다.
또한, 동정된 당해 단백질에 관계하는 염기 서열(프로모터, ORF 등의 염기 서열)을 상기 데이터 베이스로부터 검색하여 당해 서열을 기초로 설계한 프라이머를 사용함으로써 용이하게 유용 변이주가 갖는 유용한 변이점을 특정할 수 있다. 당해 변이점이 특정됨에 의해 용이하게 당해 유용 변이 또는 유용 변이로부터 유도되는 유용 변이를 갖는 산업상 유용한 변이주를 육종할 수 있다.
본 발명이 이의 특정 양태를 참고로 상세히 기술되었지만, 당해 분야의 숙련자에게 있어서 이의 정신 및 범위로부터 이탈함이 없이 다양한 변화 및 변형이 수행될 수 있음은 명백할 것이다. 본원에 인용된 모든 참고 문헌은 전체로서 본원에서 도입된다.
도 1은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032주의 게놈상의 대표적인 유전자의 위치를 나타내는 지도를 도시한 도면이다.
도 2는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032주(A), FERM BP-7134주(B) 및 FERM BP-158주(C) 유래의 단백질을 사용하는 프로테옴 해석의 결과를 나타내는 전기영동도이다.
도 3은 본 발명에 따른 컴퓨터 기록매체를 사용하는 시스템의 예에 대한 플로우 차트이다.
도 4는 본 발명에 따른 컴퓨터 기록매체를 사용하는 시스템의 예에 대한 플로우 차트이다.

Claims (31)

  1. 서열 4265에 기재된 아미노산 서열의 458번째의 Pro 잔기가 Ser 잔기로 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 유래의 폴리펩타이드.
  4. 제1항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA.
  5. 제4항에 따른 DNA를 함유하는 재조합 DNA.
  6. 제5항에 따른 재조합 DNA를 포함하는 형질전환체.
  7. 제4항에 따른 DNA가 염색체에 편입된 형질전환체.
  8. 제6항에 있어서, 코리네형 세균인 형질전환체.
  9. 제8항에 있어서, 코리네형 세균이 코리네박테리움 글루타미쿰인 형질전환체.
  10. 제6항에 따른 형질전환체를 배지에 배양하여 배양물 중에 L-라이신을 생성 축적시켜 당해 배양물로부터 L-라이신을 채취함을 특징으로 하는, L-라이신의 제조 방법.
  11. 제3항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA.
  12. 제11항에 따른 DNA를 포함하는 재조합 DNA.
  13. 제12항에 따른 재조합 DNA를 포함하는 형질전환체.
  14. 제11항에 따른 DNA가 염색체에 편입된 형질전환체.
  15. 제7항에 있어서, 코리네형 세균인 형질전환체.
  16. 제13항에 있어서, 코리네형 세균인 형질전환체.
  17. 제14항에 있어서, 코리네형 세균인 형질전환체.
  18. 제15항에 있어서, 코리네형 세균이 코리네박테리움 글루타미쿰인 형질전환체.
  19. 제16항에 있어서, 코리네형 세균이 코리네박테리움 글루타미쿰인 형질전환체.
  20. 제17항에 있어서, 코리네형 세균이 코리네박테리움 글루타미쿰인 형질전환체.
  21. 제7항에 따른 형질전환체를 배지에 배양하여 배양물 중에 L-라이신을 생성 축적시켜 당해 배양물로부터 L-라이신을 채취함을 특징으로 하는, L-라이신의 제조방법.
  22. 제8항에 따르는 형질전환체를 배지에 배양하여 배양물 중에 L-라이신을 생성 축적시켜 당해 배양물로부터 L-라이신을 채취함을 특징으로 하는, L-라이신의 제조방법.
  23. 제9항에 따른 형질전환체를 배지에 배양하여 배양물 중에 L-라이신을 생성 축적시켜 당해 배양물로부터 L-라이신을 채취함을 특징으로 하는, L-라이신의 제조 방법.
  24. 제13항에 따르는 형질전환체를 배지에 배양하여 배양물 중에 L-라이신을 생성 축적시켜 당해 배양물로부터 L-라이신을 채취함을 특징으로 하는, L-라이신의 제조방법.
  25. 제14항에 따른 형질전환체를 배지에 배양하여 배양물 중에 L-라이신을 생성 축적시켜 당해 배양물로부터 L-라이신을 채취함을 특징으로 하는, L-라이신의 제조방법.
  26. 제15항에 따르는 형질전환체를 배지에 배양하여 배양물 중에 L-라이신을 생성 축적시켜 당해 배양물로부터 L-라이신을 채취함을 특징으로 하는, L-라이신의 제조방법.
  27. 제16항에 따른 형질전환체를 배지에 배양하여 배양물 중에 L-라이신을 생성 축적시켜 당해 배양물로부터 L-라이신을 채취함을 특징으로 하는, L-라이신의 제조방법.
  28. 제17항에 따르는 형질전환체를 배지에 배양하여 배양물 중에 L-라이신을 생성 축적시켜 당해 배양물로부터 L-라이신을 채취함을 특징으로 하는, L-라이신의 제조방법.
  29. 제18항에 따른 형질전환체를 배지에 배양하여 배양물 중에 L-라이신을 생성 축적시켜 당해 배양물로부터 L-라이신을 채취함을 특징으로 하는, L-라이신의 제조방법.
  30. 제19항에 따르는 형질전환체를 배지에 배양하여 배양물 중에 L-라이신을 생성 축적시켜 당해 배양물로부터 L-라이신을 채취함을 특징으로 하는, L-라이신의 제조방법.
  31. 제20항에 따른 형질전환체를 배지에 배양하여 배양물 중에 L-라이신을 생성 축적시켜 당해 배양물로부터 L-라이신을 채취함을 특징으로 하는, L-라이신의 제조방법.
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