DE10023400A1 - Neue für das acp-Gen kodierende Nukleotidsequenzen - Google Patents
Neue für das acp-Gen kodierende NukleotidsequenzenInfo
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- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
Abstract
Die Erfindung betrifft ein isoliertes Polynukeotid, enthaltend eine Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe DOLLAR A a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No.2 enthält, DOLLAR A b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No.2, DOLLAR A c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a) oder b), und DOLLAR A d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b) oder c), DOLLAR A ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verstärkung des acp-Gens und die Verwendung des Polynukleotids als Primer oder Hybridisierungssonde.
Description
Gegenstand der Erfindung sind für das acp-Gen kodierende
Nukleotidsequenzen und Verfahren zur fermentativen
Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, unter
Verwendung von coryneformen Bakterien, in denen das acp-Gen
verstärkt wird. Das acp-Gen kodiert für das Acyl-Carrier-Pro
tein.
Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, finden in der
Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie,
insbesondere aber in der Tierernährung, Anwendung.
Es ist bekannt, daß Aminosäuren durch Fermentation von
Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere
Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der
großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der
Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen
können fermentationstechnische Maßnahmen wie z. B. Rührung
und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der
Nährmedien wie z. B. die Zuckerkonzentration während der
Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch
z. B. Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen
Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst
betreffen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser
Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion
und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man
Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie z. B. das
Lysin-Analogon S-(2-Aminoethyl)-Cystein oder auxotroph für
regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäuren
wie z. B. L-Lysin produzieren.
Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der
rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung Aminosäure
produzierender Stämme von Corynebacterium eingesetzt, indem
man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und
die Auswirkung auf die Aminosäure-Produktion untersucht.
Übersichtsartikel hierzu findet man unter anderem bei
Kinoshita ("Glutamic Acid Bacteria", in: Biology of
Industrial Microorganisms, Demain and Solomon (Eds.),
Benjamin Cummings, London, UK, 1985, 115-142), Hilliger
(BioTec 2, 40-44 (1991)), Eggeling (Amino Acids 6: 261-272
(1994)), Jetten und Sinskey (Critical Reviews in
Biotechnology 15, 73-103 (1995)) und Sahm et al. (Annuals
of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)).
Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue
Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von
Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, bereitzustellen.
Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, finden in der
Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie und
insbesondere in der Tierernährung Anwendung. Es besteht
daher ein allgemeines Interesse daran, neue verbesserte
Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin,
bereitzustellen.
Wenn im folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt wird, sind
damit nicht nur die Base, sondern auch die Salze wie z. B.
Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat gemeint.
Gegenstand der Erfindung ist ein isoliertes Polynukleotid
aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine
Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe
- a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält,
- b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
- c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a) oder b), und
- d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b) oder c).
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls das Polynukleotid
gemäß Anspruch 1, wobei es sich bevorzugt um eine
replizierbare DNA handelt, enthaltend:
- a) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1, oder
- b) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes entspricht, oder
- c) mindestens eine Sequenz, die mit der zur Sequenz (i) oder (ii) komplementären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
- d) funktionsneutralen Sinnmutationen in (i).
Weitere Gegenstände sind
ein Polynukleotid gemäß Anspruch 4, enthaltend die Nukleo tidsequenz wie in SEQ ID No. 1 dargestellt,
ein Polynukleotid gemäß Anspruch 6, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID No. 2 dargestellt, enthält,
ein Vektor, enthaltend die für das acp-Gen kodierende DNA-Sequenz von C. glutamicum, enthalten in dem Vektor pJC1acp, hinterlegt in Corynebacterium glutamicum unter der Nummer DSM 13247,
und als Wirtszelle dienende coryneforme Bakterien, die den Vektor enthalten oder in denen das acp-Gen verstärkt wird.
ein Polynukleotid gemäß Anspruch 4, enthaltend die Nukleo tidsequenz wie in SEQ ID No. 1 dargestellt,
ein Polynukleotid gemäß Anspruch 6, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID No. 2 dargestellt, enthält,
ein Vektor, enthaltend die für das acp-Gen kodierende DNA-Sequenz von C. glutamicum, enthalten in dem Vektor pJC1acp, hinterlegt in Corynebacterium glutamicum unter der Nummer DSM 13247,
und als Wirtszelle dienende coryneforme Bakterien, die den Vektor enthalten oder in denen das acp-Gen verstärkt wird.
Gegenstand der Erfindung sind ebenso Polynukleotide, die im
wesentlichen aus einer Polynukleotidsequenz bestehen, die
erhältlich sind durch Screening mittels Hybridisierung
einer entsprechenden Genbank, die das vollständige Gen mit
der Polynukleotidsequenz entsprechend SEQ ID No. 1
enthalten, mit einer Sonde, die die Sequenz des genannten
Polynukleotids gemäß SEQ ID No. 1 oder ein Fragment davon
enthält und Isolierung der genannten DNA-Sequenz.
Polynukleotidsequenzen gemäß der Erfindung sind als
Hybridisierungs-Sonden für RNA, cDNA und DNA geeignet, um
cDNA in voller Länge zu isolieren, die für das Acyl-Carrier-Protein
kodieren und solche cDNA oder Gene zu
isolieren, die eine hohe Ähnlichkeit der mit der Sequenz
des Acyl-Carrier-Protein-Gens aufweisen.
Polynukleotidsequenzen gemäß der Erfindung sind weiterhin
geeignet als Primer zur Herstellung von DNA von Genen, die
für Acyl-Carrier-Proteine kodieren, durch die Polymerase-Ketten
reaktion (PCR).
Solche als Sonden oder Primer dienende Oligonukleotide
enthalten mindestens 30, bevorzugt mindestens 20, ganz
besonders bevorzugt mindestens 15 aufeinanderfolgende
Nukleotide. Geeignet sind ebenfalls Oligonukleotide mit
einer Länge von mindestens 40 oder 50 Nukleotiden.
"Isoliert" bedeutet aus seinem natürlichen Umfeld
herausgetrennt.
"Polynukleotid" bezieht sich im allgemeinen auf
Polyribonukleotide und Polydeoxyribonukleotide, wobei es
sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte
RNA oder DNA handeln kann.
Unter "Polypeptiden" versteht man Peptide oder Proteine,
die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene
Aminosäuren enthalten.
Die Polypeptide gemäß Erfindung schließen ein Polypeptid
gemäß SEQ ID No. 2 ein, insbesondere solche mit der
biologischen Aktivität des Acyl-Carrier-Proteins und auch
solche, die zu wenigstens 70% identisch sind mit dem
Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2, bevorzugt zu wenigstens 80%
und besonders die zu wenigstens 90% bis 95% Identität mit
dem Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2 und die genannte
Aktivität aufweisen.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur
fermentativen Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin,
unter Verwendung von coryneformen Bakterien, die
insbesondere bereits eine Aminosäure produzieren, und in
denen die für das acp-Gen kodierenden Nukleotidsequenzen
verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.
Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang
die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder
mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die
entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise
die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken
Promotor verwendet oder ein Gen verwendet, das für ein
entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität kodiert und
gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden
Erfindung sind, können L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin,
aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose,
Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol
herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer
Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln.
Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art
Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt
für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu
produzieren.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere
der Art Corynebacterium glutamicum, sind die zum Beispiel
bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Lysin produzierende Mutanten bzw. Stämme, wie beispielsweise
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 und
Corynebacterium glutamicum DSM5715.
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Lysin produzierende Mutanten bzw. Stämme, wie beispielsweise
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 und
Corynebacterium glutamicum DSM5715.
Den Erfindern gelang es, das neue, für das Acyl-Carrier-Protein
kodierende acp-Gen von C. glutamicum zu isolieren.
Zur Isolierung des acp-Gens oder auch anderer Gene von C.
glutamicum wird zunächst eine Genbank dieses
Mikroorganismus in E. coli angelegt. Das Anlegen von
Genbanken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und
Handbüchern niedergeschrieben. Als Beispiel seien das
Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in
die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland,
1990) oder das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular
Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989) genannt. Eine sehr bekannte Genbank ist die
des E. coli K-12 Stammes W3110, die von Kohara et al. (Cell
50, 495-508 (1987)) in λ-Vektoren angelegt wurde. Bathe et
al. (Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 1996)
beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032, die
mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987,
Proceedings of the National Academy of Sciences USA,
84: 2160-2164) im E. coli K-12 Stamm NM554 (Raleigh et al.,
1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575) angelegt wurde.
Börmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326
(1992)) wiederum beschreiben eine Genbank von C. glutamicum
ATCC13032 unter Verwendung des Cosmids pHC79 (Hohn und
Collins, Gene 11, 291-298 (1980)). Zur Herstellung einer
Genbank von C. glutamicum in E. coli können auch Plasmide
wie pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)
oder pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259-268) verwendet
werden. Als Wirte eignen sich besonders solche E. coli-
Stämme, die restriktions- und rekombinationsdefekt sind.
Ein Beispiel hierfür ist der Stamm DHSamcr, der von Grant
et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences
USA, 87 (1990) 4645-4649) beschrieben wurde. Die mit Hilfe
von Cosmiden klonierten langen DNA-Fragmente können
anschließend wiederum in gängige, für die Sequenzierung
geeignete Vektoren subkloniert und anschließend sequenziert
werden, so wie es z. B. bei Sanger et al. (Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of
America, 74: 5463-5467, 1977) beschrieben ist.
Auf diese Weise wurde die neue für das Gen acp kodierende
DNA-Sequenz von C. glutamicum erhalten, die als SEQ ID No.
1 Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist. Weiterhin
wurde aus der vorliegenden DNA-Sequenz mit den oben
beschriebenen Methoden die Aminosäuresequenz des
entsprechenden Proteins abgeleitet. In SEQ ID No. 2 ist die
sich ergebende Aminosäuresequenz des acp-Genproduktes
dargestellt.
Kodierende DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID No. 1 durch
die Degeneriertheit des genetischen Kodes ergeben, sind
ebenfalls Bestandteil der Erfindung. In gleicher Weise sind
DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder Teilen von SEQ ID
No. 1 hybridisieren, Bestandteil der Erfindung. In der
Fachwelt sind weiterhin konservative Aminosäureaustausche
wie z. B. Austausch von Glycin gegen Alanin oder von
Asparaginsäure gegen Glutaminsäure in Proteinen als
"Sinnmutationen" (sense mutations) bekannt, die zu keiner
grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins
führen, d. h. funktionsneutral sind. Weiterhin ist bekannt,
daß Änderungen am N- und/oder C-Terminus eines Proteins
dessen Funktion nicht wesentlich beeinträchtigen oder sogar
stabilisieren können. Angaben hierzu findet der Fachmann
unter anderem bei Ben-Bassat et al. (Journal of
Bacteriology 169: 751-757 (1987)), bei O'Regan et al. (Gene
77: 237-251 (1989)), bei Sahin-Toth et al. (Protein Sciences
3: 240-247 (1994)), bei Hochuli et al. (Bio/Technology
6: 1321-1325 (1988)) und in bekannten Lehrbüchern der
Genetik und Molekularbiologie. Aminosäuresequenzen, die
sich in entsprechender Weise aus SEQ ID No. 2 ergeben, sind
ebenfalls Bestandteil der Erfindung.
In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1
oder Teilen von SEQ ID No. 1 hybridisieren, Bestandteil der
Erfindung. Schließlich sind DNA-Sequenzen Bestandteil der
Erfindung, die durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
unter Verwendung von Primern hergestellt werden, die sich
aus SEQ ID NO. 1 ergeben. Derartige Oligonukleotide haben
typischerweise eine Länge von mindestens 15 Nukleotiden.
Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels
Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im
Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter
Hybridization" der Firma Roche Diagnostics GmbH (Mannheim,
Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. (International
Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260).
Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe
der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann
unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonukleotide
synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, UK,
1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer
Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).
Die Erfinder fanden heraus, daß coryneforme Bakterien nach
Verstärkung des acp-Gens in verbesserter Weise Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin, produzieren.
Zur Erzielung einer Verstärkung, insbesondere einer
Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene
erhöht werden, oder es kann die Promotor- und
Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die
sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert
werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die
stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch
induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die
Expression im Verlaufe der fermentativen L-Lysin-Produktion
zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der
Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression
verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus
des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt.
Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden
mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im
Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann
weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch
Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung
erreicht werden.
Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei
Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), bei
Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und
Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns
et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), in der Europäischen
Patentschrift EPS 0 472 869, im US Patent 4,601,893, bei
Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), bei
Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology
60, 126-132 (1994)), bei Laßarre et al. (Journal of
Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), in der Patentanmeldung
WO 96/15246, bei Malumbres et al. (Gene 134, 15-24
(1993)), in der japanischen Offenlegungsschrift JP-A-10-229891,
bei Jensen und Hammer (Biotechnology and
Bioengineering 58, 191-195 (1998)), bei Makrides
(Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)) und in
bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
Beispielhaft wurde das erfindungsgemäße acp-Gen mit Hilfe
von Plasmiden überexprimiert.
Als Plasmide eignen sich solche, die in coryneformen
Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte
Plasmidvektoren wie z. B. pZ1 (Menkel et al., Applied and
Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKEx1
(Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)) oder pHS2-1
(Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)) beruhen auf den
kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere
Plasmidvektoren wie z. B. solche, die auf pCG4 (US-A 4,489,160),
oder pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS
Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)), oder pAG1 (US-A 5,158,891)
beruhen, können in gleicher Weise verwendet
werden.
Ein Beispiel für ein Plasmid, mit Hilfe dessen das acp-Gen
überexprimiert werden kann, ist pJC1acp (Fig. 1), welches
auf dem E. coli - C. glutamicum Shuttle-Vektor pJCI (Cremer
et al., 1990, Molecular and General Genetics 220: 478-480)
basiert und die für das acp-Gen kodierende DNA-Sequenz
von C. glutamicum enthält. Es ist in dem Stamm
DSM5715/pJC1acp enthalten.
Weiterhin eignen sich solche Plasmidvektoren, mit Hilfe
derer man das Verfahren der Genamplifikation durch
Integration in das Chromosom anwenden kann, so wie es
beispielsweise von Remscheid et al. (Applied and
Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) zur
Duplikation bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons
beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige
Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt
(typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum
replizieren kann. Als Vektoren kommen bespielsweise pSUP301
(Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob
oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)),
pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO
(Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84;
US-A 5,487,993), pCR®Blunt (Firma Invitrogen,
Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of
Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) oder pEM1 (Schrumpf
et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) in
Frage. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen
enthält, wird anschließend durch Konjugation oder
Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum
überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise
bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology
60, 756-759 (1994)) beschrieben. Methoden zur
Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al.
(Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362
(1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070
(1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123,
343-347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination
mittels eines "cross over"-Ereignisses enthält der
resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden
Gens.
Zusätzlich kann es für die Produktion von Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin vorteilhaft sein, neben dem acp-Gen
eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges,
der Glykolyse, der Anaplerotik oder des Aminosäure-Exports
zu verstärken oder zu überexprimieren.
So kann beispielsweise für die Herstellung von L-Lysin
gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus
der Gruppe
- - das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende dapA-Gen (EP-B 0 197 335), oder
- - gleichzeitig das für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase kodierende mqo-Gen (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)), oder
- - das für die Succinyldiaminopimelat-Desuccinylase kodierende dapE-Gen (Accession No. Q59284).
- - das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende gap-Gen (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), oder
- - das für die Triosephosphat Isomerase kodierende tpi-Gen (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), oder
- - das für eine feed back resistente Aspartatkinase kodierende lysC-Gen (Accession No. P26512)
- - das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende pgk-Gen (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), oder
- - das für die Pyruvat Carboxylase kodierende pyc-Gen (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), oder
- - das für den Lysin-Export kodierende lysE-Gen (DE-A-195 48 222)
gleichzeitig verstärkt, insbesondere überexprimiert oder
amplifiziert werden.
Weiterhin kann es für die Produktion von Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin, vorteilhaft sein, neben der
Verstärkung des acp-Gen gleichzeitig
- - das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pck-Gen (DE 199 50 409.1 DSM 13047) und/oder
- - das für die Glucose-6-Phosphat Isomerase kodierende pgi-Gen (US 09/396,478, DSM 12969) und/oder
- - das für die Pyruvat-Oxidase kodierende poxB-Gen (DE: 199 51 975.7)
abzuschwächen.
Weiterhin kann es für die Produktion von Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin, vorteilhaft sein, neben der
Überexpression des acp-Gens unerwünschte Nebenreaktionen
auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing
Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products,
Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London,
UK, 1982).
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können
kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch - Verfahren
(Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder
repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren)
zum Zwecke der Produktion von Aminosäuren, insbesondere
L-Lysin kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über
bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel
(Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik
(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch
von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen
(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den
Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen
von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im
Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der
American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA,
1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und
Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose,
Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und
Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und
Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure
und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und
organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden.
Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet
werden. Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige
Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt,
Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser,
Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen
wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat,
Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die
Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung
verwendet werden. Als Phosphorquelle können Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder
die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden.
Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten
wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das
Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle
Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den
oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium
können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die
genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines
einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise
während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen
wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw.
Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure
oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur
Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie
z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur
Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem
Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B.
Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen
aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff
haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur
eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise
bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die
Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an
Lysin gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise
innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die Analyse von L-Lysin kann durch
Anionenaustauschchromatographie mit anschließender
Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, so wie bei Spackman et
al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben.
Folgender Mikroorganismus wurde bei der Deutschen Sammlung
für Mikrorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig,
Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:
- - Corynebacterium glutamicum Stamm DSM5715/pJC1acp als DSM 13247
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen
Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von
Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Chromosomale DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
wurde wie bei Tauch et al. (1995, Plasmid 33: 168-179)
beschrieben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI
(Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung Sau3AI, Code No. 27-0913-02) partiell
gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit shrimp alkalischer
Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland,
Produktbeschreibung SAP, Code No. 1758250)
dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCos1
(Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of
Sciences USA 84: 2160-2164), bezogen von der Firma
Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCos1
Cosmid Vektor Kit, Code No. 251301) wurde mit dem
Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code No. 27-0948-02)
gespalten und ebenfalls mit shrimp alkalischer Phosphatase
dephosphoryliert. Anschließend wurde die Cosmid-DNA mit dem
Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code No. 27-0868-04)
gespalten. Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA
wurde mit der behandelten ATCC 13032-DNA gemischt und der
Ansatz mit T4-DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code No. 27-0870-04)
behandelt. Das Ligationsgemisch wurde anschließend
mit Hilfe des Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene,
La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing
Extract, Code No. 200217) in Phagen verpackt. Zur Infektion
des E, coli Stammes NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic
Acid Research 16: 1563-1575) wurden die Zellen in 10 mM
MgSO4 aufgenommen und mit einem Aliquot der
Phagensuspension vermischt. Infektion und Titerung der
Cosmidbank wurden wie bei Sambrook et al. (1989, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor)
beschrieben durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar
(Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 100 mg/l Ampicillin
ausplattiert wurden. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C
wurden rekombinante Einzelklone selektioniert.
Die Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wurde mit dem Qiaprep
Spin Miniprep Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden,
Germany) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem
Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Product No. 27-0913-02)
partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit
shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH,
Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Product No.
1758250) dephosphoryliert. Nach gelelektrophoretischer
Auftrennung erfolgte die Isolierung der Cosmidfragmente im
Größenbereich von 1500 bis 2000 bp mit dem QiaExII Gel
Extraction Kit (Product No. 20021, Qiagen, Hilden,
Germany). Die DNA des Sequenziervektors pZero-1 bezogen von
der Firma Invitrogen (Groningen, Niederlande,
Produktbeschreibung Zero Background Cloning Kit, Product
No. K2500-01) wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI
(Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung BamHI, Product No. 27-0868-04)
gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in den
Sequenziervektor pZero-1 wurde wie von Sambrook et al.
(1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring
Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit
T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über
Nacht inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde
anschließend in den E. coli Stamm DH5αMCR (Grant, 1990,
Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A.,
87: 4645-4649) elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS
Microbiol Letters, 123: 343-7) und auf LB-Agar (Lennox,
1955, Virology, 1: 190) mit 50 mg/l Zeocin ausplattiert. Die
Plasmidpräparation der rekombinanten Klone erfolgte mit dem
Biorobot 9600 (Product No. 900200, Qiagen, Hilden,
Deutschland). Die Sequenzierung erfolgte nach der Dideoxy-Ketten
abbruch-Methode von Sanger et al. (1977, Proceedings
of the National Academy of Sciences U. S. A., 74: 5463-5467)
mit Modifikationen nach Zimmermann et al. (1990, Nucleic
Acids Research, 18: 1067). Es wurde der "RR dRhodamin
Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE Applied Biosystems
(Product No. 403044, Weiterstadt, Deutschland) verwendet.
Die gelelektrophoretische Auftrennung und Analyse der
Sequenzierreaktion erfolgte in einem "Rotiphorese NF
Acrylamid/Bisacrylamid" Gel (29: 1) (Product No. A124.1,
Roth, Karlsruhe, Germany) mit dem "ABI Prism 377"
Sequenziergerät von PE Applied Biosystems (Weiterstadt,
Deutschland).
Die erhaltenen Roh-Sequenzdaten wurden anschließend unter
Anwendung des Staden-Programpakets (1986, Nucleic Acids
Research, 14: 217-231) Version 97-0 prozessiert. Die
Einzelsequenzen der pZero1-Derivate wurden zu einem
zusammenhängenden Contig assembliert. Die computergestützte
Kodierbereichsanalyse wurde mit dem Programm XNIP (Staden,
1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) angefertigt.
Weitere Analysen wurden mit den "BLAST search programs"
(Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25: 3389-3402),
gegen die non-redundant Datenbank des "National
Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD,
USA) durchgeführt.
Die erhaltene Nukleotidsequenz ist in SEQ ID No. 1
dargestellt. Die Analyse der Nukleotidsequenz ergab ein
offenes Leseraster von 291 Basenpaaren, welches als acp-Gen
bezeichnet wurde. Das acp-Gen kodiert für ein Protein von
97 Aminosäuren.
Chromosomale DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
wurde wie bei Tauch et al. (1995, Plasmid 33: 168-179)
beschrieben isoliert. Mit Hilfe der
Polymerasekettenreaktion wurde ein DNA Fragment
amplifiziert, das das acp-Gen trägt. Dazu wurden die
folgenden Primer verwendet:
5'-TCG GGG TGA AAA TGG AGT TGT-3'
5'-AAG CGC TTT GAG GTA GTT TG-3'
5'-TCG GGG TGA AAA TGG AGT TGT-3'
5'-AAG CGC TTT GAG GTA GTT TG-3'
Die dargestellten Primer wurden von der Firma MWG Biotech
(Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und nach der
Standard-PCR-Methode von Innis et al., (PCR protocol. A
guide to methods and applications, 1990, Academic Press)
die PCR Reaktion durchgeführt. Die Primer ermöglichen die
Amplifizierung eines 510 bp großen DNA-Fragmentes, welches
das acp-Gen aus Corynebacterium glutamicum trägt.
Nach gelelektrophoretischer Auftrennung erfolgte die
Isolierung des PCR-Fragmentes aus dem Agarososegel mit dem
QiaExII Gel Extraction Kit (Product No. 20021, Qiagen,
Hilden, Germany).
Der Vektor pUC18 (Norrander et al., Gene (26) 101-106
(1983)) wurde mit der Restriktionsendonuklease SmaI
vollständig gespalten und mit shrimp alkalischer
Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland,
Produktbeschreibung SAP, Product No. 1758250)
dephosphoryliert.
Das auf diese Weise gewonnene PCR Fragment wurde mit dem
vorbereiteten Vektor pUC18 gemischt und der Ansatz mit T4-DNA-Ligase
(Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code No. 27-0870-04)
behandelt. Der Ligationsansatz wurde in den E. coli Stamm
DHSα (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol.
I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA) transformiert.
Die Selektion von Plasmid-tragenden Zellen erfolgte durch
Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB-Agar
(Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 100 mg/l Ampicillin.
Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden rekombinante
Einzelklone selektioniert. Plasmid-DNA wurde aus einer
Transformante mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Product
No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany) nach Herstellerangaben
isoliert und mit dem Restriktionsenzym HindII gespalten, um
das Plasmid durch anschließende Agarosegel-Elektrophorese
zu überprüfen. Man erhält ein Fragment von ca. 3600 bp.
Das erhaltene Plasmid wurde pUC18acp genannt.
Aus dem in Beispiel 3 beschriebenen Plasmid pUC18acp wurde
das acp-Gen durch vollständige Spaltung mit dem Enzym PvuII
isoliert. Das 877 bp große acp-Fragment wurde aus dem
Agarosegel mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Product No.
20021, Qiagen, Hilden, Germany) isoliert.
Als Vektor wurde der E. coli - C. glutamicum Shuttle-Vektor
pJC1 (Cremer et al., 1990, Molecular and General Genetics
220: 478-480) verwendet. Dieses Plasmid wurde mit dem
Restriktionsenzym BamHI vollständig gespalten, mit Klenow
Polymerase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland)
behandelt und anschließend mit shrimp alkalischer
Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland,
Produktbeschreibung SAP, Product No. 1758250)
dephosphoryliert.
Das auf diese Weise gewonnene acp-Fragment wurde mit dem
vorbereiteten Vektor pJC1 gemischt und der Ansatz mit T4-DNA-Ligase
(Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code No. 27-0870-04)
behandelt. Der Ligationsansatz wurde in den E. coli Stamm
DHSα (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol.
I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA) transformiert.
Die Selektion von Plasmid-tragenden Zellen erfolgte durch
Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB-Agar
(Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 50 mg/l Kanamycin. Nach
Inkubation über Nacht bei 37°C wurden rekombinante
Einzelklone selektioniert. Plasmid DNA wurde aus einer
Transformante mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Product
No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany) nach Herstellerangaben
isoliert und mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespalten, um
das Plasmid durch anschließende Agarosegel-Elektrophorese
zu überprüfen. Das erhaltene Plasmid wurde pJC1acp genannt.
Der Stamm DSM5715 wurde mit dem Plasmid pJC1acp unter
Anwendung der von Liebl et al., (FEMS Microbiology Letters,
53: 299-303 (1989)) beschriebenen Elektroporationsmethode
transformiert. Die Selektion der Transformanten erfolgte auf
LBHIS Agar bestehend aus 18,5 g/l Brain-Heart Infusion
Boullion, 0,5 M Sorbitol, 5 g/l Bacto-Trypton, 2,5 g/l
Bacto-Yeast-Extract, 5 g/l NaCl und 18 g/l Bacto-Agar, der
mit 15 mg/l Kanamycin supplementiert worden war. Die
Inkubation erfolgte für 2 Tage bei 33°C.
Plasmid DNA wurde aus einer Transformante nach den üblichen
Methoden isoliert (Peters-Wendisch et al., 1998,
Microbiology, 144, 915-927), mit der
Restriktionsendonuklease EcoRI geschnitten und das Plasmid
durch anschließende Agarosegel-Elektrophorese überprüft.
Der erhaltene Stamm wurde DSM5715/pJC1acp genannt.
Dieser Mikroorganismus wurde bei der Deutschen Sammlung für
Mikrorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig,
Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:
- - Corynebacterium glutamicum/pJC1acp als DSM 13247
Der in Beispiel 5 erhaltene C. glutamicum Stamm
DSM5715/pJC1acp wurde in einem zur Produktion von Lysin
geeigneten Nährmedium kultiviert und der Lysingehalt im
Kulturüberstand bestimmt.
Dazu wurde der Stamm zunächst auf einer Agarplatte mit dem
entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz Agar mit Kanamycin
(50 mg/l)) für 24 Stunden bei 33°C inkubiert. Ausgehend von
dieser Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur angeimpft (10 ml
Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben). Als Medium für die
Vorkultur wurde das Vollmedium CgIII verwendet.
| NaCl | 2,5 g/l |
| Bacto-Pepton | 10 g/l |
| Bacto-Yeast-Extrakt | 10 g/l |
| Glucose (getrennt autoklaviert) | 2% (w/v) |
Der pH-Wert wurde auf pH 7.4
eingestellt.
Diesem Medium wurde Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die
Vorkultur wurde 24 Stunden bei 33°C bei 240 rpm auf dem
Schüttler inkubiert. Von dieser Vorkultur wurde eine
Hauptkultur angeimpft, so daß die Anfangs-OD (660 nm) der
Hauptkultur 0,1 betrug. Für die Hauptkultur wurde das
Medium mm verwendet.
| CSL (Corn Steep Liquor) | 5 g/l |
| MOPS (Morpholinopropansulfonsäure) | 20 g/l |
| Glucose (getrennt autoklaviert) | 50 g/l |
| AL=L<(NH4 | |
| )2 | |
| SO4 | |
| KH2PO4 | 25 g/l |
| MgSO4 . 7 H2O | 0,1 g/l |
| CaCl2 . 2 H2O | 1,0 g/l |
| FeSO4 . 7 H2O | 10 mg/l |
| MnSO4 . H2O | 10 mg/l |
| Biotin (sterilfiltriert) | 0,3 mg/l |
| Thiamin . HCl (sterilfiltriert) | 0,2 mg/l |
| L-Leucin (sterilfiltriert) | 0,1 g/l |
| CaCO3 | 25 g/l |
CSL, MOPS und die Salzlösung wurden mit Ammoniakwasser auf
pH 7 eingestellt und autoklaviert. Anschließend wurden die
sterilen Substrat- und Vitaminlösungen zugesetzt, sowie das
trocken autoklavierte CaCO3.
Die Kultivierung erfolgt in 10 ml Volumen in einem 100 ml
Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Es wurde Kanamycin (25
mg/l) zugesetzt. Die Kultivierung erfolgte bei 33°C und 80%
Luftfeuchte.
Nach 48 Stunden wurde die OD bei einer Meßwellenlänge von
660 nm mit dem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH,
München) ermittelt. Die gebildete Lysinmenge wurde mit
einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik
(Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie
und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion
bestimmt.
In Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt.
Das in Beispiel 4 erhaltene Plasmid pJC1acp wurde zur
Transformation von C. glutamicum Stamm ATCC 13032 benutzt.
Dieser Stamm wurde wie in Beispiel 5 beschrieben
transformiert und durch Restriktionsverdau und Agarose-Gelelektrophorese
wie in Beispiel 5 beschrieben überprüft.
Der erhaltene Stamm ATCC 13032/pJC1acp wurde in einem zur
Wachstumsbestimmung geeigneten Nährmedium kultiviert und
das Wachstum bei verschiedenen Temperaturen bestimmt.
Dazu wurde der Stamm wie in Beispiel 6 beschrieben zunächst
auf Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz
Agar mit Kanamycin (50 mg/l) für 24 Stunden bei 30°C
inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde
eine Vorkultur angeimpft (10 ml Medium im 100 ml
Erlenmeyerkolben). Als Medium für die Vorkultur wurde das
in Beispiel 6 angegebene Vollmedium CgIII verwendet. Diesem
wurde Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Vorkultur wurde 16
Stunden bei 30°C bei 240 rpm auf dem Schüttler inkubiert.
Von dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur angeimpft, so
daß die Anfangs-OD (600 nm) der Hauptkultur 0,7 betrug. Für
die Hauptkultur wurde das Medium mm verwendet.
| MOPS (Morpholinopropansulfonsäure) | 42 g/l |
| Glucose(getrennt autoklaviert) | 40 g/l |
| (NH4)2SO4 | 20 g/l |
| KH2PO4 | 1,0 g/l |
| K2HPO4 | 1,0 g/l |
| MgSO4 . 7 H2O | 0,25 g/l |
| CaCl2 . 2 H2O | 10 mg/l |
| FeSO4 . 7 H2O | 10 mg/l |
| MnSO4 . H2O | 10 mg/l |
| ZnSO4 . H2O | 1 mg/l |
| CuSO4 | 0,2 mg/l |
| NiCl2 . 6 H2O | 0,02 mg/l |
| Biotin (sterilfiltriert) | 0,2 mg/l |
| Protokatechusäure (sterilfiltriert) | 30 mg/l |
MOPS und die Salzlösung wurden mit Ammoniakwasser auf pH 7
eingestellt und autoklaviert. Anschließend wurden die
sterilen Substrat- und Vitaminlösungen zugesetzt.
Die Kultivierung erfolgte in 60 ml Volumen in einem 500 ml
Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Es wurde Kanamycin (25 mg/l)
zugesetzt. Die Kultivierung erfolgte bei 40°C. Die OD
wurde bei einer Meßwellenlänge von 600 nm mit dem Ultrospec
3000 (Pharmacia Biotech, Upsala, Schweden) ermittelt. Das
Ergebnis des Versuchs ist in Fig. 2 gezeigt.
Abbildungen:
Folgende Abbildungen sind beigefügt:
Folgende Abbildungen sind beigefügt:
- - Abb. 1: Plasmid pJC1acp
- - Abb. 2: Wachstum von C. glutamicum ATCC 13032 und ATCC 13032/pJCacp bei 40°C.
Die in den Abbildungen verwendeten Abkürzungen haben
folgende Bedeutung:
ori Cg: plasmidkodierter Replikationsursprung aus C. glutamicum (von pHM1519)
Kan: Resistenzgen für Kanamycin aus pHM1519
Amp: Resistenzgen für Ampicillin
acp: Acyl-Carrier-Protein von C. glutamicum
OD: optische Dichte
BamHI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BamHI
EcoRI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
HindIII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms HindIII
ori Cg: plasmidkodierter Replikationsursprung aus C. glutamicum (von pHM1519)
Kan: Resistenzgen für Kanamycin aus pHM1519
Amp: Resistenzgen für Ampicillin
acp: Acyl-Carrier-Protein von C. glutamicum
OD: optische Dichte
BamHI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BamHI
EcoRI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
HindIII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms HindIII
Claims (16)
1. Isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien,
enthaltend eine Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus
der Gruppe
- a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält,
- b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
- c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a) oder b), und
- d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b) oder c).
2. Polynukleotid gemäß Anspruch 1,
wobei das Polynukleotid eine in coryneformen Bakterien
replizierbare, bevorzugt rekombinante DNA ist.
3. Polynukleotid gemäß Anspruch 1,
wobei das Polynukleotid eine RNA ist.
4. Polynukleotid gemäß Anspruch 2,
enthaltend die Nukleinsäuresequenz wie in SEQ ID No. 1
dargestellt.
5. Replizierbare DNA gemäß Anspruch 2,
enthaltend
- a) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1, oder
- b) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (1) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes entspricht, oder
- c) mindestens eine Sequenz, die mit der zur - Sequenz (i) oder (ii) komplementären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
- d) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i).
6. Polynukleotidsequenz gemäß Anspruch 2, das
für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz
in SEQ ID No. 2 darstellt, enthält.
7. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin,
dadurch gekennzeichnet,
daß man folgende Schritte durchführt:
- a) Fermentation der die L-Aminosäure produzierenden coryneformen Bakterien, in denen man zumindest das acp-Gen oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen verstärkt, insbesondere überexprimiert,
- b) Anreicherung der L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien und
- c) Isolieren von der L-Aminosäure.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet,
daß man Bakterien einsetzt, in denen man zusätzlich
weitere Gene des Biosyntheseweges der gewünschten L-
Aminosäure verstärkt.
9. Verfahren gemäß Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet,
daß man Bakterien einsetzt, in denen die
Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet
sind, die die Bildung des L-Lysins verringern.
10. Verfahren gemäß Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet,
daß man einen mit einem Plasmidvektor transformierten
Stamm einsetzt, und der Plasmidvektor die für das acp-
Gen kodierende Nukleotidsequenz trägt.
11. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 7
bis 10,
dadurch gekennzeichnet,
daß man coryneforme Bakterien verwendet, die L-Lysin
herstellen.
12. Verfahren gemäß Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet,
daß man für die Herstellung von Lysin Bakterien
fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder
mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- 1. 12.1 das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende dapA-Gen,
- 2. 12.2 das für eine feed back resistente Aspartatkinase kodierende lysC-Gen,
- 3. 12.3 das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc-Gen,
- 4. 12.4 das für die Triosephosphat Isomerase kodierende tpi-Gen,
- 5. 12.5 das Gen für die Succinyldiaminopimelat-Desuccinylase kodierende dapE-Gen,
- 6. 12.6 das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende gap-Gen,
- 7. 12.7 das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende pgk-Gen,
- 8. 12.8 das für den Lysin-Export kodierende lysE-Gen, gleichzeitig verstärkt, insbesondere überexprimiert oder amplifiziert.
13. Verfahren gemäß Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet,
daß man für die Herstellung von L-Lysin Bakterien
fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder
mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- 1. 13.1 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pck-Gen,
- 2. 13.2 das für die Glucose-6-Phosphat Isomerase kodierende pgi-Gen abschwächt.
14. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß man Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium
glutamicum einsetzt.
15. Verwendung von Polynukleotidsequenzen oder Teilen davon
gemäß Anspruch 1 als Primer zur Herstellung der DNA von
Genen, die für die für das Acyl-Carrier-Protein
kodieren, durch die Polymerase-Kettenreaktion.
16. Verwendung von Polynukleotidsequenzen gemäß Anspruch 1
als Hybridisierungssonden zur Isolierung von cDNA oder
Genen, die eine hohe Ähnlichkeit mit der Sequenz des
acp-Gens aufweisen.
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10023400A DE10023400A1 (de) | 2000-05-12 | 2000-05-12 | Neue für das acp-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
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