DE10021828A1 - Neue für das cdsA-Gen kodierende Nukleotidsequenzen - Google Patents
Neue für das cdsA-Gen kodierende NukleotidsequenzenInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein gentechnisch modifiziertes coryneformes Bakterium, dessen cdsA-Gen verstärkt ist, sowie ein isoliertes Polynukleotid, das für die Phosphatidat-Cytidylyltransferase aus coryneformen Bakterien kodiert, wie auch ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verstärkung des cdsA-Gens in den Bakterien und die Verwendung des Polynukleotids als Primer oder Hybridisierungssonde.
Description
Gegenstand der Erfindung sind gentechnisch veränderte
coryneforme Bakterien, für die Phosphatidat-
Cytidylyltransferase kodierende Nukleotidsequenzen und
Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin, unter Verwendung von coryneformen
Bakterien, in denen das cdsA-Gen, das für die Phosphatidat-
Cytidylyltransferase kodiert, verstärkt wird.
Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, finden in der
Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie,
insbesondere aber in der Tierernährung, Anwendung.
Es ist bekannt, daß Aminosäuren durch Fermentation von
Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere
Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der
großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der
Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen
können fermentationstechnische Maßnahmen wie z. B. Rühren
und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der
Nährmedien wie z. B. die Zuckerkonzentration während der
Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch
z. B. Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen
Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst
betreffen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser
Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion
und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man
Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie z. B. das
Lysin-Analogon S-(2-Aminoethyl)-Cystein oder auxotroph für
regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäuren
wie z. B. L-Lysin produzieren.
Seit einigen Jahren werden außerdem Methoden der
rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung Aminosäure
produzierender Stämme von Corynebacterium eingesetzt, indem
man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und
die Auswirkung auf die Aminosäure-Produktion untersucht.
Übersichtsartikel hierzu findet man unter anderem bei
Kinoshita ("Glutamic Acid Bacteria", in: Biology of
Industrial Microorganisms, Demain and Solomon (EdsT),
Benjamin Cummings, London, OK, 1985, 115-142), Hilliger
(BioTec 2, 40-44 (1991)), Eggeling (Amino Acids 6: 261-272
(1994)), Jetten und Sinskey (Critical Reviews in
Biotechnology 15, 73-103 (1995)) und Sahm et al. (Annuals
of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, neue Hilfsmittel
zur verbesserten fermentativen Herstellung von Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin, bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein gentechnisch
verändertes coryneformes Bakterium, dessen Gen cdsA, das
für die Phosphatidat-Cytidylyltransferase kodiert,
verstärkt ist.
Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, finden in der
Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie und
insbesondere in der Tierernährung Anwendung. Es besteht
daher ein allgemeines Interesse daran, neue verbesserte
Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-
Lysin, bereitzustellen.
Wenn im folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt werden, sind
damit nicht nur die Base, sondern auch die Salze wie z. B.
Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat gemeint.
Gegenstand der Erfindung ist ein gentechnisch verändertes
coryneformes Bakterium, in dem dessen Gen cdsA, das die
Phosphatidat-Cytidylyltransferase kodiert, verstärkt ist.
Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang
die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder
mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die
entsprechende DNA kodiert werden.
Die Verstärkung kann mit Hilfe verschiedener Manipulationen
der Bakterienzelle erreicht werden.
Zur Erzielung einer Verstärkung, insbesondere einer
Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene
erhöht werden, man kann einen starken Promotor verwenden,
oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die
Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des
Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise
wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des
Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare
Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im
Verlaufe der fermentativen L-Lysin-Produktion zu steigern.
Es kann auch ein Gen verwendet werden, das für ein
entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität kodiert.
Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA
wird ebenfalls die Expression verbessert. Außerdem wird
durch Verhinderung des Abbaus des Enzyms ebenfalls die
Enzymaktivität insgesamt erhöht. Gegebenenfalls können
diese Maßnahmen auch beliebig kombiniert werden.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden
Erfindung sind, können L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin,
aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose,
Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol
herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer
Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln.
Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art
Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt
für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu
produzieren.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere
der Art Corynebacterium glutamicum, sind die zum Beispiel
bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Lysin produzierende Mutanten bzw. Stämme, wie beispielsweise
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 und
Corynebacterium glutamicum DSM5715.
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Lysin produzierende Mutanten bzw. Stämme, wie beispielsweise
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 und
Corynebacterium glutamicum DSM5715.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein
isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien,
enthaltend eine Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der
Gruppe
- a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% homolog ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält,
- b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% homolog ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
- c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a) oder b), und
- d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b) oder c).
"Homolog" im Rahmen der vorliegenden Anmeldung ist eine
Polynukleotidsequenz zu der erfindungsgemäßen Sequenz dann,
wenn sie in ihrer Basenzusammensetzung und -sequenz
wenigstens zu 70%, bevorzugt wenigstens 80%, besonders
bevorzugt wenigstens 90% mit der erfindungsgemäßen Sequenz
übereinstimmt. Unter einem "homologen Protein" sollen gemäß
der vorliegenden Erfindung Proteine verstanden werden, die
eine Aminosäuresequenz aufweisen, die mit der
Aminosäuresequenz, die durch das Gen cdsA (SEQ ID Nr. 1)
kodiert wird zu wenigstens 70%, bevorzugt wenigstens 80%,
besonders bevorzugt wenigstens 90% übereinstimmen, wobei
"übereinstimmen" so zu verstehen ist, daß die sich
entsprechenden Aminosäuren entweder identisch sind, oder es
sich um zueinander homologe Aminosäuren handelt. Als
"homologe Aminosäuren" werden solche bezeichnet, die sich
in ihren Eigenschaften, insbesondere hinsichtlich Ladung,
Hydrophobizität, sterischen Eigenschaften usw. entsprechen.
Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein wie oben
beschriebenes Polynukleotid, wobei es sich bevorzugt um
eine replizierbare DNA handelt, enthaltend:
- a) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1, oder
- b) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) im Rahmen der Degeneration des genetischen Kodes entspricht, oder
- c) mindestens eine Sequenz, die mit der zur Sequenz (i) oder (ii) komplementären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
- d) funktionsneutrale Mutationen in (i), die zu derselben oder einer homologen Aminosäure führen.
Weitere Gegenstände sind
ein in coryneformen Bakterien replizierbares, bevorzugt rekombinantes Polynukleotid, das die Nukleotidsequenz SEQ ID No. 1 umfaßt,
ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz SEQ ID No. 2 umfaßt,
ein Vektor, enthaltend die für das cdsA-Gen kodierende DNA- Sequenz von C. glutamicum, enthalten in dem Vektor pJC1cdsA, hinterlegt in Corynebacterium glutamicum unter der Nummer 13252,
und als Wirtszelle dienende coryneforme Bakterien, die den Vektor enthalten oder in denen das cdsA-Gen verstärkt wird.
ein in coryneformen Bakterien replizierbares, bevorzugt rekombinantes Polynukleotid, das die Nukleotidsequenz SEQ ID No. 1 umfaßt,
ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz SEQ ID No. 2 umfaßt,
ein Vektor, enthaltend die für das cdsA-Gen kodierende DNA- Sequenz von C. glutamicum, enthalten in dem Vektor pJC1cdsA, hinterlegt in Corynebacterium glutamicum unter der Nummer 13252,
und als Wirtszelle dienende coryneforme Bakterien, die den Vektor enthalten oder in denen das cdsA-Gen verstärkt wird.
Gegenstand der Erfindung sind ebenso Polynukleotide, die
das vollständige Gen mit der Polynukleotidsequenz
entsprechend SEQ ID No. 1 oder Fragmente davon enthalten,
und die durch Screening mittels Hybridisierung einer
entsprechenden Genbank mit einer Sonde, die die Sequenz des
genannten Polynukleotids gemäß SEQ ID No. 1 oder ein
Fragment davon enthält, und Isolierung der genannten DNA-
Sequenz erhältlich sind.
Polynukleotidsequenzen gemäß der Erfindung sind auch als
Hybridisierungs-Sonden für RNA, cDNA und DNA geeignet, um
cDNA in voller Länge zu isolieren, die für die
Phosphatidat-Cytidylyltransferase kodieren und solche cDNA
oder Gene zu isolieren, die eine hohe Ähnlichkeit mit der
Sequenz der Phosphatidat-Cytidylyltransferase aufweisen.
Polynukleotidsequenzen gemäß der Erfindung sind außerdem
geeignet als Primer für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
zur Herstellung von DNA, die für die Phosphatidat-
Cytidylyltransferase kodiert.
Solche als Sonden oder Primer dienende Oligonukleotide
können mehr als 30, bevorzugt bis zu 30, besonders
bevorzugt bis zu 20, ganz besonders bevorzugt mindestens 15
aufeinanderfolgende Nukleotide enthalten. Geeignet sind
ebenfalls Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 40
oder 50 Nukleotiden.
"Isoliert" bedeutet aus seinem natürlichen Umfeld
herausgetrennt.
"Polynukleotid" bezieht sich im allgemeinen auf
Polyribonukleotide und Polydeoxyribonukleotide, wobei es
sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte
RNA oder DNA handeln kann.
Unter "Polypeptiden" versteht man Peptide oder Proteine,
die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene
Aminosäuren enthalten.
Die Polypeptide gemäß Erfindung schließen ein Polypeptid
gemäß SEQ ID No. 2 ein, insbesondere solche mit der
biologischen Aktivität der Phosphatidat-
Cytidylyltransferase und auch solche, die zu wenigstens 70%
homolog sind mit dem Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2,
bevorzugt zu wenigstens 80% und besonders die zu wenigstens
90% bis 95% Homologie mit dem Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2
und die genannte Aktivität aufweisen.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur
fermentativen Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-
Lysin, unter Verwendung von coryneformen Bakterien, die
insbesondere bereits eine Aminosäure produzieren, und in
denen die für das cdsA-Gen kodierenden Nukleotidsequenzen
verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.
In der vorliegenden Erfindung wird erstmals das für die
Phosphatidat-Cytidylyltransferase kodierende cdsA-Gen von
C. glutamicum gezeigt.
Zur Isolierung des cdsA-Gens oder auch anderer Gene von C. gluta
micum wird zunächst eine Genbank dieses
Mikroorganismus in E. coli angelegt. Das Anlegen von
Genbanken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und
Handbüchern niedergeschrieben. Als Beispiel seien das
Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in
die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland,
1990) oder das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular
Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989) genannt. Eine sehr bekannte Genbank ist die
des E. coli K-12 Stammes W3110, die von Kohara et al. (Cell
50, 495-508 (1987)) in λ-Vektoren angelegt wurde. Bathe et
al. (Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 1996)
beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032, die
mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987,
Proceedings of the National Academy of Sciences USA,
84: 2160-2164) im E. coli K-12 Stamm NM554 (Raleigh et al.,
1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575) angelegt wurde.
Börmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326
(1992)) wiederum beschreiben eine Genbank von C. glutamicum
ATCC13032 unter Verwendung des Cosmids pHC79 (Hohn und
Collins, Gene 11, 291-298 (1980)). Zur Herstellung einer
Genbank von C. glutamicum in E. coli können auch Plasmide
wie pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979))
oder pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259-268) verwendet
werden. Als Wirte eignen sich besonders solche E. coli-
Stämme, die restriktions- und rekombinationsdefekt sind.
Ein Beispiel hierfür ist der Stamm DH5αmcr, der von Grant
et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences
USA, 87 (1990) 4645-4649) beschrieben wurde. Die mit Hilfe
von Cosmiden klonierten langen DNA-Fragmente können
anschließend wiederum in gängige, für die Sequenzierung
geeignete Vektoren subkloniert und anschließend sequenziert
werden, so wie es z. B. bei Sanger et al. (Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of
America, 74: 5463-5467, 1977) beschrieben ist.
Auf diese Weise wurde die neue für das Gen cdsA kodierende
DNA-Sequenz von C. glutamicum erhalten, die als SEQ ID No. 1
Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist. Außerdem
wurde aus der vorliegenden DNA-Sequenz mit den oben
beschriebenen Methoden die Aminosäuresequenz des
entsprechenden Proteins abgeleitet. In SEQ ID No. 2 ist die
sich ergebende Aminosäuresequenz des cdsA-Genproduktes
dargestellt.
Kodierende DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID No. 1 durch
die Degeneriertheit des genetischen Kodes ergeben, sind
ebenfalls Bestandteil der Erfindung. In gleicher Weise sind
DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder Teilen von SEQ ID
No. 1 hybridisieren, Bestandteil der Erfindung. In der
Fachwelt sind außerdem konservative Aminosäureaustausche
wie z. B. Austausch von Glycin gegen Alanin oder von
Asparaginsäure gegen Glutaminsäure in Proteinen als
"Sinnmutationen" (sense mutations) bekannt, die zu keiner
grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins
führen, d. h. funktionsneutral sind. Außerdem ist bekannt,
daß Änderungen am N- und/oder C-Terminus eines Proteins
dessen Funktion nicht wesentlich beeinträchtigen oder diese
sogar stabilisieren können. Angaben hierzu findet der
Fachmann unter anderem bei Ben-Bassat et al. (Journal of
Bacteriology 169: 751-757 (1987)), bei O'Regan et al. (Gene
77: 237-251 (1989)), bei Sahin-Toth et al. (Protein Sciences
3: 240-247 (1994)), bei Hochuli et al. (Bio/Technology
6: 1321-1325 (1988)) und in bekannten Lehrbüchern der
Genetik und Molekularbiologie. Aminosäuresequenzen, die
sich in entsprechender Weise aus SEQ ID No. 2 ergeben, sind
ebenfalls Bestandteil der Erfindung.
In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1
oder Teilen von SEQ ID No. 1 hybridisieren, Bestandteil der
Erfindung. Schließlich sind DNA-Sequenzen Bestandteil der
Erfindung, die durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern hergestellt
werden, die sich aus SEQ ID No. 1 ergeben. Derartige
Oligonukleotide haben typischerweise eine Länge von
mindestens 15 Nukleotiden.
Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels
Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im
Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter
Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH
(Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al.
(International Journal of Systematic Bacteriology (1991)
41: 255-260). Anleitungen zur Amplifikation von DNA-
Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait:
Oligonukleotide synthesis: a practical approach (IRL Press,
Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum
Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).
Bei der Arbeit an der vorliegenden Erfindung konnte
festgestellt werden, daß coryneforme Bakterien nach
Verstärkung des cdsA-Gens in verbesserter Weise
Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, produzieren.
Die betrachteten Gene oder Genkonstrukte können entweder in
Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder
im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ
kann außerdem eine Überexpression der betreffenden Gene
durch Veränderung der Medienzusammensetzung und
Kulturführung erreicht werden.
Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei
Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), bei
Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und
Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns
et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), in der Europäischen
Patentschrift EPS 0 472 869, im US Patent 4,601,893, bei
Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), bei
Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology
60, 126-132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of
Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), in der Patentanmeldung
WO 96/15246, bei Malumbres et al. (Gene 134, 15-24
(1993)), in der japanischen Offenlegungsschrift JP-A-10-229891,
bei Jensen und Hammer (Biotechnology and
Bioengineering 58, 191-195 (1998)), bei Makrides
(Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)) und in
bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
Beispielhaft wurde das erfindungsgemäße cdsA-Gen mit Hilfe
von Plasmiden überexprimiert.
Als Plasmide eignen sich solche, die in coryneformen
Bakterien repliziert und exprimiert werden. Zahlreiche
bekannte Plasmidvektoren wie z. B. pZ1 (Menkel et al.,
Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554),
pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)) oder pHS2-1
(Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)) beruhen auf den
kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere
Plasmidvektoren wie z. B. solche, die auf pCG4 (US-A 4,489,160),
oder pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS
Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)), oder pAG1 (US-A 5,158,891)
beruhen, können in gleicher Weise verwendet
werden.
Ein Beispiel für ein Plasmid, mit Hilfe dessen das cdsA-Gen
überexprimiert werden kann, ist pJC1cdsA (Fig. 1), welches
auf dem E. coli - C. glutamicum Shuttle-Vektor pJC1 (Cremer
et al., 1990, Molecular and General Genetics 220: 478-480)
basiert und die für das cdsA-Gen kodierende DNA-
Sequenz von C. glutamicum enthält. Es ist in dem Stamm
DSM5715/pJC1cdsA enthalten.
Außerdem eignen sich solche Plasmidvektoren, mit Hilfe
derer man das Verfahren der Genamplifikation durch
Integration in das Chromosom anwenden kann, so wie es
beispielsweise von Remscheid et al. (Applied and
Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) zur
Duplikation bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons
beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige
Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt
(typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum
replizieren kann. Als Vektoren kommen bespielsweise pSUP301
(Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob
oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)),
pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO
(Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84;
US-A 5,487,993), pCR®Blunt (Firma Invitrogen,
Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of
Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) oder pEM1 (Schrumpf
et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) in
Frage. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen
enthält, wird anschließend durch Konjugation oder
Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum
überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise
bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology
60, 756-759 (1994)) beschrieben. Methoden zur
Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al.
(Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362
(1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070
(1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123,
343-347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination
mittels eines "cross over"-Ereignisses enthält der
resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden
Gens.
Zusätzlich kann es für die Produktion von Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin vorteilhaft sein, neben dem cdsA-Gen
eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges,
der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus
oder des Aminosäure-Exports zu verstärken oder zu
überexprimieren.
So kann beispielsweise für die Herstellung von L-Lysin
gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus
der Gruppe
- - das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende dapA- Gen (EP-B 0 197 335), oder
- - das für die Succinyldiaminopimelat-Desuccinylase kodierende dapE-Gen, oder
- - das für eine feed back resistente Aspartatkinase kodierende lysC-Gen (Kalinowski et al. (1990), Molecular and General Genetics 224, 317-324), oder
- - das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende gap-Gen (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), oder
- - das für die Triosephosphat Isomerase kodierende tpi-Gen (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), oder
- - das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende pgk-Gen (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), oder
- - das für die Pyruvat Carboxylase kodierende pyc-Gen (DE-A-198 31 609), oder
- - das für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase kodierende mqo- Gen (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)), oder
- - das für den Lysin-Export kodierende lysE-Gen (DE-A-195 48 222)
verstärkt, insbesondere überexprimiert oder amplifiziert
werden.
Außerdem kann es für die Produktion von Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin, vorteilhaft sein, neben der
Verstärkung des cdsA-Gens gleichzeitig
- - das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pck-Gen (DE 199 50 409.1, DSM13047) und/oder
- - das für die Glucose-6-Phosphat Isomerase kodierende pgi- Gen (US 09/396,478, DSM12969) und/oder
- - das für die Pyruvat-Oxidase kodierende poxB-Gen (DE 199 51 975.7)
abzuschwächen.
Außerdem kann es für die Produktion von Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin, vorteilhaft sein, neben der
Überexpression des cdsA-Gens unerwünschte Nebenreaktionen
auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing
Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products,
Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London,
UK, 1982).
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können
kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren
(Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder
repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren)
zum Zwecke der Produktion von Aminosäuren, insbesondere
L-Lysin kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über
bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel
(Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik
(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch
von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen
(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den
Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen
von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im
Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der
American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA,
1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und
Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose,
Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und
Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und
Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure
und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und
organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden.
Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet
werden. Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff
haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt,
Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser,
Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen
wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat,
Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die
Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung
verwendet werden. Als Phosphorquelle können Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder
die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden.
Das Kulturmedium muß außerdem Salze von Metallen enthalten
wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das
Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle
Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den
oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium
können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die
genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines
einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise
während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen
wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw.
Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure
oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur
Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie
z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur
Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem
Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B.
Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen
aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-
haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur
eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise
bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die
Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an
Lysin gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise
innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die Analyse von L-Lysin kann durch
Anionenaustauschchromatographie mit anschließender
Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, so wie bei Spackman et
al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben.
Folgender Mikroorganismus wurde bei der Deutschen Sammlung
für Mikrorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig,
Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:
- - Corynebacterium glutamicum Stamm DSM5715/pJC1cdsA als DSM13252
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen
Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin.
Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben
folgende Bedeutung.
Orf2,rep: Plasmidkodierter Replikationsursprung C. gluta micum (von pHM1519)
cdsA: cdsA (Phosphatidat-Cytidylyltransferase) Gen aus C. glutamicum ATCC13032
Kan: Kanamycin-Resistenzgen
NarI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms NarI
SalI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SalI
SgrAI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SgrAI
Bst1107: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Bst1107
NheI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms NheI
XhoI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms XhoI
ClaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms ClaI
BstEII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BstEII
EcoRI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
Orf2,rep: Plasmidkodierter Replikationsursprung C. gluta micum (von pHM1519)
cdsA: cdsA (Phosphatidat-Cytidylyltransferase) Gen aus C. glutamicum ATCC13032
Kan: Kanamycin-Resistenzgen
NarI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms NarI
SalI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SalI
SgrAI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SgrAI
Bst1107: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Bst1107
NheI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms NheI
XhoI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms XhoI
ClaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms ClaI
BstEII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BstEII
EcoRI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
Wachstum von C. glutamicum ATCC 13032 und ATCC
13032/pJCcdsA bei 40°C.
OD: optische Dichte
OD: optische Dichte
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von
Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Chromosomale DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
wurde wie bei Tauch et al. (1995, Plasmid 33: 168-179)
beschrieben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI
(Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung Sau3AI, Code no. 27-0913-02) partiell
gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit Shrimp alkalischer
Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim,
Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Code no. 1758250)
dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCos1
(Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of
Sciences USA 84: 2160-2164), bezogen von der Firma
Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCos1
Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301) wurde mit dem
Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code no. 27-0948-02)
gespalten und ebenfalls mit Shrimp alkalischer Phosphatase
dephosphoryliert. Anschließend wurde die Cosmid-DNA mit dem
Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code no. 27-0868-04)
gespalten. Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA
wurde mit der behandelten ATCC 13032-DNA gemischt und der
Ansatz mit T4-DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code no. 27-0870-04)
behandelt. Das Ligationsgemisch wurde anschließend
mit Hilfe des Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene,
La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing
Extract, Code no. 200217) in Phagen verpackt. Zur Infektion
des E. coli Stammes NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic
Acid Research 16: 1563-1575) wurden die Zellen in 10 mM
MgSO4 aufgenommen und mit einem Aliquot der
Phagensuspension vermischt. Infektion und Titerung der
Cosmidbank wurden wie bei Sambrook et al. (1989, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor)
beschrieben durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar
(Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 100 mg/l Ampicillin
ausplattiert wurden. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C
wurden rekombinante Einzelklone selektiert.
Die Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wurde mit dem Qiaprep
Spin Miniprep Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden,
Germany) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem
Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Product No. 27-0913-02)
partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit
Shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Molecular
Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung
SAP, Product No. 1758250) dephosphoryliert. Nach
gelelektrophoretischer Auftrennung erfolgte die Isolierung
der Cosmidfragmente im Größenbereich von 1500 bis 2000 bp
mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Product No. 20021,
Qiagen, Hilden, Germany). Die DNA des Sequenziervektors
pZero-1 bezogen von der Firma Invitrogen (Groningen,
Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning
Kit, Product No. K2500-01) wurde mit dem Restriktionsenzym
BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung BamHI, Product No. 27-0868-04)
gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in den
Sequenziervektor pZero-1 wurde wie von Sambrook et al.
(1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring
Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit
T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über
Nacht inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde
anschließend in den E. coli Stamm DH5αMCR (Grant, 1990,
Proceedings of the National Academy of Sciences USA,
87: 4645-4649) mittels Elektroporation transformiert (Tauch
et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343-7) und auf LB-
Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 50 mg/l Zeocin
ausplattiert. Die Plasmidpräparation der rekombinanten
Klone erfolgte mit dem Biorobot 9600 (Product No. 900200,
Qiagen, Hilden, Deutschland). Die Sequenzierung erfolgte
nach der Didesoxy-Kettenabbruch-Methode von Sanger et al.
(1977, Proceedings of the National Academy of Sciences
USA, 74: 5463-5467) mit Modifikationen nach Zimmermann et
al. (1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067). Es wurde der
"RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE
Applied Biosystems (Product No. 403044, Weiterstadt,
Deutschland) verwendet. Die gelelektrophoretische
Auftrennung und Analyse der Sequenzierreaktion erfolgte in
einem "Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid" Gel (29: 1)
(Product No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany) mit dem "ABI
Prism 377" Sequenziergerät von PE Applied Biosystems
(Weiterstadt, Deutschland).
Die erhaltenen Roh-Sequenzdaten wurden anschließend unter
Anwendung des Staden-Programmpakets (1986, Nucleic Acids
Research, 14: 217-231) Version 97-0 prozessiert. Die
Einzelsequenzen der pZero1-Derivate wurden zu einem
zusammenhängenden Contig assembliert. Die computergestützte
Kodierbereichsanalyse wurde mit dem Programm XNIP (Staden,
1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) angefertigt.
Weitere Analysen wurden mit den "BLAST search programs"
(Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25: 3389-3402),
gegen die non-redundant Datenbank des "National
Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD,
USA) durchgeführt.
Die erhaltene Nukleotidsequenz ist in SEQ ID No. 1
dargestellt. Die Analyse der Nukleotidsequenz ergab ein
offenes Leseraster von 891 Basenpaaren, welches als cdsA-
Gen bezeichnet wurde. Das cdsA-Gen kodiert für ein Protein
von 297 Aminosäuren.
Chromosomale DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
wurde wie bei Tauch et al. (1995, Plasmid 33: 168-179)
beschrieben isoliert. Mit Hilfe der
Polymerasekettenreaktion wurde ein DNA Fragment
amplifiziert, das das cdsA Gen trägt. Dazu wurden die
folgenden Primer verwendet:
5'-CGC GGA TCC GTG GCC CAA GCT TTA CGA CGG ATA C-3'
5'-CGC GGA TCC GGC TCG CAA GGA AAA GGA ACT GAT-3'
5'-CGC GGA TCC GTG GCC CAA GCT TTA CGA CGG ATA C-3'
5'-CGC GGA TCC GGC TCG CAA GGA AAA GGA ACT GAT-3'
Beide Oligonukleotide tragen die Sequenz für die
Spaltungsstelle des Restriktionsenzyms BamHI
(unterstrichene Nukleotide). Die dargestellten Primer
wurden von der Firma MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland)
synthetisiert und damit nach der Standard-PCR-Methode von
Innis et al., (PCR protocol. A guide to methods and
applications, 1990, Academic Press) die PCR Reaktion
durchgeführt. Die Primer ermöglichen die Amplifizierung
eines 1095 bp großen DNA-Fragmentes, welches das cdsA Gen
aus Corynebacterium glutamicum trägt.
Nach gelelektrophoretischer Auftrennung erfolgte die
Isolierung des PCR-Fragmentes aus dem Agarosegel mit dem
QiaExII Gel Extraction Kit (Product No. 20021, Qiagen,
Hilden, Germany).
Das auf diese Weise gewonnene PCR Fragment wurde mit dem
Restriktionsenzym BamHI vollständig gespalten. Das 1087 bp
große cdsA Fragment wurde aus dem Agarosegel mit dem
QiaExII Gel Extraction Kit (Product No. 20021, Qiagen,
Hilden, Germany) isoliert.
Als Vektor wurde der E. coli - C. glutamicum Shuttle-Vektor
pJC1 (Cremer et al., 1990, Molecular and General Genetics
220: 478-480) verwendet. Dieses Plasmid wurde ebenfalls
mit dem Restriktionsenzym BamHI vollständig gespalten und
anschließend mit Shrimp alkalischer Phosphatase (Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland,
Produktbeschreibung SAP, Product No. 1758250)
dephosphoryliert.
Das auf diese Weise gewonnene cdsA-Fragment wurde mit dem
vorbereiteten Vektor pJC1 gemischt und der Ansatz mit T4-
DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code no. 27-0870-04)
behandelt. Der Ligationsansatz wurde in den E. coli Stamm
DH5α (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol.
I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA) transformiert.
Die Selektion von Plasmid-tragenden Zellen erfolgte durch
Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB-Agar
(Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 50 mg/l Kanamycin. Nach
Inkubation über Nacht bei 37°C wurden rekombinante
Einzelklone selektiert. Plasmid DNA wurde aus einer
Transformante mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Product
No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany) nach Herstellerangaben
isoliert und mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten, um
das Plasmid durch anschließende Agarosegel-Elektrophorese
zu überprüfen. Das erhaltene Plasmid wurde pJC1cdsA
genannt.
Der Stamm DSM5715 wurde mit dem Plasmid pJC1cdsA unter
Anwendung der von Liebl et al., (FEMS Microbiology Letters,
53: 299-303 (1989)) beschriebenen Elektroporationsmethode
transformiert. Die Selektion der Transformanten erfolgte
auf LBHIS Agar bestehend aus 18,5 g/l Brain-Heart Infusion
Boullion, 0,5 M Sorbitol, 5 g/l Bacto-Trypton, 2,5 g/l
Bacto-Yeast-Extract, 5 g/l NaCl und 18 g/l Bacto-Agar, der
mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert worden war. Die
Inkubation erfolgte für 2 Tage bei 33°C.
Plasmid DNA wurde aus einer Transformante nach den üblichen
Methoden isoliert (Peters-Wendisch et al., 1998,
Microbiology, 144, 915-927), mit der
Restriktionsendonuklease BamHI geschnitten, um das Plasmid
durch anschließende Agarosegel-Elektrophorese zu
überprüfen. Der erhaltene Stamm wurde DSM5715/pJC1cdsA
genannt und bei der Deutschen Sammlung für Mikrorganismen
und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß
Budapester Vertrag als DSM13252 hinterlegt.
Der in Beispiel 5 erhaltene C. glutamicum Stamm
DSM5715/pJC1cdsA wurde in einem zur Produktion von L-Lysin
geeigneten Nährmedium kultiviert und der L-Lysingehalt im
Kulturüberstand bestimmt.
Dazu wurde der Stamm zunächst auf Agarplatte mit dem
entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz Agar mit Kanamycin
(50 mg/l)) für 24 Stunden bei 33°C inkubiert. Ausgehend
von dieser Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur angeimpft
(10 ml Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben). Als Medium für
die Vorkultur wurde das Vollmedium CgIII verwendet.
NaCl | 2,5 g/l |
Bacto-Pepton | 10 g/l |
Bacto-Yeast-Extrakt | 10 g/l |
Glucose (getrennt autoklaviert) | 2% (w/v) |
Der pH-Wert wurde auf pH 7.4
eingestellt.
Diesem wurde Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Vorkultur
wurde 16 Stunden bei 33°C bei 240 rpm auf dem Schüttler
inkubiert. Von dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur
angeimpft, so daß die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur
0,1 betrug. Für die Hauptkultur wurde das Medium MM
verwendet.
CSL (Corn Steep Liquor) | 5 g/l |
MOPS (Morpholinopropansulfonsäure) | 20 g/l |
Glucose (getrennt autoklaviert) | 50 g/l |
(NH4)2SO4 | 25 g/l |
KH2PO4 | 0,1 g/l |
MgSO4.7 H2O | 1,0 g/l |
CaCl2.2 H2O | 10 mg/l |
FeSO4.7 H2O | 10 mg/l |
MnSO4.H2O | 5,0 mg/l |
Biotin (sterilfiltriert) | 0,3 mg/l |
Thiamin.HCl (sterilfiltriert) | 0,2 mg/l |
L-Leucin | 0,1 g/l |
CaCO3 | 25 g/l |
CSL, MOPS und die Salzlösung wurden mit Ammoniakwasser auf
pH 7 eingestellt und autoklaviert. Anschließend wurden die
sterilen Substrat- und Vitaminlösungen zugesetzt, sowie das
trocken autoklavierte CaCO3.
Die Kultivierung erfolgte in 10 ml Volumen in einem 100 ml
Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Es wurde Kanamycin (25 mg/l)
zugesetzt. Die Kultivierung erfolgte bei 33°C und 80%
Luftfeuchte.
Nach 48 Stunden wurde die OD bei einer Meßwellenlänge von
660 nm mit dem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH,
München) ermittelt. Die gebildete Lysinmenge wurde mit
einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik
(Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie
und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion
bestimmt.
In Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt.
Das in Beispiel 3 erhaltene Plasmid pJCcdsA wurde zur
Transformation von C. glutamicum Stamm ATCC 13032 benutzt.
Dieser Stamm wurde wie in Beispiel 4 beschrieben
transformiert und durch Restriktionsverdau und Agarose-
Gelelektrophorese wie in Beispiel 4 beschrieben überprüft.
Der Stamm erhaltene ATCC 13032/pJCcdsA wurde in einem zur
Wachstumsbestimmung geeigneten Nährmedium kultiviert und
das Wachstum bei verschiedenen Temperaturen bestimmt.
Dazu wurde der Stamm wie in Beispiel 5 beschrieben zunächst
auf Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-
Herz Agar mit Kanamycin (50 mg/l)) für 24 Stunden bei 30°C
inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde
eine Vorkultur angeimpft (10 ml Medium im 100 ml
Erlenmeyerkolben). Als Medium für die Vorkultur wurde das
in Beispiel 5 angegebene Vollmedium CgIII verwendet. Diesem
wurde Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Vorkultur wurde 16
Stunden bei 30°C bei 240 rpm auf dem Schüttler inkubiert.
Von dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur angeimpft, so
daß die Anfangs-OD (600 nm) der Hauptkultur 0,7 betrug. Für
die Hauptkultur wurde das Medium MM verwendet.
MOPS (Morpholinopropansulfonsäure) | 42 g/l |
Glucose(getrennt autoklaviert) | 40 g/l |
(NH4)2SO4 | 20 g/l |
KH2PO4 | 1,0 g/l |
K2HPO4 | 1,0 g/l |
MgSO4.7 H2O | 0,25 g/l |
CaCl2.2 H2O | 10 mg/l |
FeSO4.7 H2O | 10 mg/l |
MnSO4.H2O | 10 mg/l |
ZnSO4.H2O | 1 mg/l |
CuSO4 | 0,2 mg/l |
NiCl2.6 H2O | 0,02 mg/l |
Biotin (sterilfiltriert) | 0,2 mg/l |
Protokatechusäure (sterilfiltriert) | 30 mg/l |
MOPS und die Salzlösung wurden mit Ammoniakwasser auf pH 7
eingestellt und autoklaviert. Anschließend wurden die
sterilen Substrat- und Vitaminlösungen zugesetzt.
Die Kultivierung erfolgte in 60 ml Volumen in einem 500 ml
Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Es wurde Kanamycin (25 mg/l)
zugesetzt. Die Kultivierung erfolgte bei 40°C. Die OD
wurde bei einer Meßwellenlänge von 600 nm mit dem Ultrospec
3000 (Pharmacia Biotech, Upsala, Schweden) ermittelt. Das
Ergebnis des Versuchs ist in Fig. 2 gezeigt.
Claims (19)
1. Gentechnisch verändertes coryneformes Bakterium,
dadurch gekennzeichnet, daß dessen Gen cdsA, das für
die Phosphatidat-Cytidylyltransferase kodiert,
verstärkt ist.
2. Gentechnisch verändertes coryneformes Bakterium nach
Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Ausgangs-
Bakterium (Wildtyp) ausgewählt ist aus der Gruppe
Corynebacterium glutamicum (ATCC13032),
Corynebacterium acetoglutamicum (ATCC15806),
Corynebacterium acetoacidophilum (ATCC13870),
Corynebacterium thermoaminogenes (FERM BP-1539),
Corynebacterium melassecola (ATCC17965),
Brevibacterium flavum (ATCC14067), Brevibacterium
lactofermentum (ATCC13869) und Brevibacterium
divaricatum (ATCC14020), oder ausgewählt ist aus der
Gruppe Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709,
Brevibacterium flavum FERM-P 1708, Brevibacterium
lactofermentum FERM-P 1712, Corynebacterium glutamicum
FERM-P 6463, Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464
und Corynebacterium glutamicum DSM5715.
3. Gentechnisch verändertes coryneformes Bakterium nach
Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Verstärkung des cdsA-Gens durch Überexpression des
Gens, insbesondere durch Erhöhung der Kopienzahl des
Gens, durch Auswahl eines starken Promotors oder einer
Regulationsregion oberhalb des Leserasters, durch
Mutation des Promotors, der Regulationsregion oder der
Ribosomenbindungsstelle, durch Einbau einer geeigneten
Expressionskassette oberhalb des Strukturgens oder
durch Einbau von induzierbaren Promotoren, durch die
Verlängerung der Lebensdauer der entsprechenden mRNA,
durch einen verminderten Abbau der exprimierten
Proteine, oder durch die Kombination mehrerer dieser
Möglichkeiten erfolgt.
4. Gentechnisch verändertes coryneformes Bakterium nach
einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,
daß der Stamm mit einem Plasmidvektor transformiert
ist und der Plasmidvektor die für das cdsA-Gen
kodierende Nukleotidsequenz trägt.
5. Gentechnisch verändertes coryneformes Bakterium nach
einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet,
daß es genotypisch dem Stamm Corynebacterium
glutamicum DSM13252 entspricht.
6. Isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien,
enthaltend eine Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus
der Gruppe
- a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% homolog ist zu einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 umfaßt, oder aus dieser besteht,
- b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die zu mindestens 70% homolog ist zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
- c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a) oder b), und
- d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b) oder c).
7. Polynukleotid gemäß Anspruch 6,
wobei das Polynukleotid eine in coryneformen Bakterien
replizierbare, bevorzugt rekombinante DNA ist.
8. Polynukleotid gemäß Anspruch 6,
wobei das Polynukleotid eine RNA ist.
9. Replizierbare DNA gemäß Anspruch 7,
enthaltend
- a) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1, oder
- b) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) im Rahmen der Degeneration des genetischen Kodes entspricht, oder
- c) mindestens eine Sequenz, die mit der zur Sequenz (i) oder (ii) komplementären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
- d) funktionsneutrale Mutationen in (i), die zu homologen Aminosäuren führen.
10. Polynukleotidsequenz gemäß Anspruch 7, 8 oder 9, das
für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz
SEQ ID No. 2 hat, umfaßt.
11. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-
Aminosäuren,
dadurch gekennzeichnet,
daß man folgende Schritte durchführt:
- a) Fermentation von L-Aminosäure produzierenden coryneformen Bakterien, in denen zumindest das cdsA-Gen oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen verstärkt, insbesondere überexprimiert ist,
- b) Anreicherung der L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien und
- c) Isolieren von der L-Aminosäure.
12. Verfahren gemäß Anspruch 11,
dadurch gekennzeichnet,
daß man einen Stamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5
einsetzt.
13. Verfahren gemäß Anspruch 11 oder 12,
dadurch gekennzeichnet,
daß zusätzlich weitere Gene, die ein Protein des
Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure
kodieren, in den Bakterien verstärkt sind.
14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13,
dadurch gekennzeichnet,
daß Stoffwechselwege, die die Bildung der gewünschten
Aminosäure verringern, in den Bakterien zumindest
teilweise ausgeschaltet sind.
15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14,
dadurch gekennzeichnet,
daß es sich bei der hergestellten Aminosäure um L-
Lysin handelt.
16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 15,
dadurch gekennzeichnet,
daß man für die Herstellung von Lysin Bakterien
fermentiert, in denen gleichzeitig eines oder mehrere
der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- a) das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende dapA-Gen,
- b) das Gen für die Succinyldiaminopimelat- Desuccinylase kodierende dapE-Gen,
- c) das für eine feed back resistente Aspartatkinase kodierende lysC-Gen,
- d) das für die Triosephosphat Isomerase kodierende tpi-Gen,
- e) das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende gap-Gen,
- f) das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende pgk-Gen,
- g) das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc-Gen,
- h) das für die Malat : Chinon Oxidoreduktase kodierende mqo-Gen,
- i) das für den Lysin-Export kodierende lysE-Gen,
17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 17,
dadurch gekennzeichnet,
daß für die Herstellung von L-Lysin Bakterien
fermentiert werden, in denen gleichzeitig eines oder
mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- a) das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pck-Gen,
- b) das für die Glucose-6-Phosphat Isomerase kodierende pgi-Gen,
- c) das für die Pyruvat-Oxidase kodierende poxB-Gen
18. Verwendung von Polynukleotidsequenzen oder Teilen
davon gemäß Anspruch 6 als Primer zur Herstellung der
DNA von Genen, die für Phosphatidat-
Cytidylyltransferase kodieren, durch die Polymerase-
Kettenreaktion.
19. Verwendung von Polynukleotidsequenzen gemäß Anspruch 6
als Hybridisierungssonden zur Isolierung von cDNA oder
Genen, die eine hohe Homologie mit der Sequenz des
cdsA-Gens aufweisen.
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