JP3716427B2 - α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−リジンの発酵生産に用いられるコリネ型細菌の育種と利用に関する。更に詳しくは、本発明は、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（α−ＫＧＤＨ）活性が欠失したコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌、該菌を用いたＬ−グルタミン酸の製造法、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌由来のα−ＫＧＤＨ活性を有する酵素をコードする遺伝子（α−ＫＧＤＨ遺伝子）、該遺伝子を含む組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡを保有するコリネ型細菌、及び該組換えＤＮＡを保有し、Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型細菌を用いたＬ−リジンの製造法に関する。
背景技術
従来よりＬ−グルタミン酸はブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属に属するコリネ型細菌を用いた発酵法により工業的に生産されている。
近年、α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下し、かつＬ−グルタミン酸分解活性が低下した大腸菌変異株が、高いＬ−グルタミン酸生産能を持つことが明らかとなった（特開平５−２４４９７０公報）。
これに対し、ブレビバクテリウム属の細菌においては、α−ＫＧＤＨ活性の低下した変異株のＬ−グルタミン酸生産能は親株とほぼ同じであったとの報告があり（Agric. Biol. Chem., 44, 1897（1980)、Agric. Biol. Chem., 46, 493（1982)）、コリネ型細菌では、α−ＫＧＤＨ活性のレベルはＬ−グルタミン酸の生産に重要ではないものと考えられていた。
一方、α−ＫＧＤＨ活性が低下し、かつＬ−グルタミン酸生産能を有する変異株をビオチン過剰原料を炭素源とする培地中で培養すると、ペニシリン類や界面活性剤等のビオチン作用抑制物質を培地に添加することなく、高収率でＬ−グルタミン酸が生産されることが見い出されている（最大収率５３％）（特開平６−２３７７９号公報）。しかしながら、上述したようにコリネ型細菌では、α−ＫＧＤＨ活性のレベルはＬ−グルタミン酸の生産に重要ではないものと考えられていたため、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌のα−ＫＧＤＨ遺伝子をクローニングし解析した例はなかった。また、α−ＫＧＤＨを欠失したコリネホルム細菌の変異株も知られていなかった。
発明の開示
本発明の目的は、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌由来のα−ＫＧＤＨ遺伝子を取得し、該遺伝子を含む組換えＤＮＡを作製し、該組換えＤＮＡで形質転換した微生物を用いてα−ＫＧＤＨ活性のレベルがＬ−グルタミン酸の発酵生産に及ぼす影響を明らかにし、もってコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌の育種において新たな方法論を提供することにある。より具体的には、本発明の目的は、染色体上に存在するα−ＫＧＤＨ遺伝子を破壊することによりα−ＫＧＤＨ活性を欠失させたコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌を取得し、該菌を用いたＬ−グルタミン酸の製造法を提供することにある。また、本発明は、α−ＫＧＤＨ遺伝子を含む組換えＤＮＡを保有するコリネ型細菌、及び該組換えＤＮＡを保有し、Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型細菌を用いたＬ−リジンの製造法を提供することにある。
本発明者らは、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌由来のα−ＫＧＤＨ遺伝子を取得しその構造を明らかにするとともに、該遺伝子を組み込んだ組換え体プラスミドでコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌を形質転換し、得られた形質転換体のα−ＫＧＤＨ活性のレベルとＬ−グルタミン酸の生産能を調べた結果、α−ＫＧＤＨ活性がＬ−グルタミン酸の生産に顕著な影響を及ぼすことを見いだした。また、本発明者らは、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌において染色体上に存在するα−ＫＧＤＨ遺伝子を破壊することによりα−ＫＧＤＨ活性を欠失させた株が、過剰量のビオチンを含有する培地に培養する際、界面活性剤やペニシリンのようなビオチン作用抑制物質を培地に添加することなく著量のＬ−グルタミン酸を生成蓄積することを見いだした。更に、本発明者らは、α−ＫＧＤＨ遺伝子を含む組換えＤＮＡをＬ−リジン生産能を有するコリネ型細菌に導入した結果、得られた組換え体のＬ−リジン生産能が顕著に向上することを見いだし、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
(1)染色体上に存在するα−ＫＧＤＨ活性を有する酵素をコードする遺伝子又はそのプロモーターの塩基配列中に１又は２以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位が生じたことにより、α−ＫＧＤＨ活性が欠損したコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌、
(2)上記(1)記載のコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌を液体培地中に培養し、培養液中にＬ−グルタミン酸を生産蓄積させ、これを採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法、
(3)コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌由来のα−ＫＧＤＨ遺伝子、
(4)コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌由来のα−ＫＧＤＨ遺伝子とコリネ型細菌で機能するベクターが連結されて得られる組換えＤＮＡ、
(5)上記(4)記載の組換えＤＮＡを保有するコリネ型細菌、及び
(6)上記(5)記載の組換えＤＮＡを保有し、かつＬ−リジン生産能を有するコリネ型細菌を液体培地に培養し、培養液中にＬ−リジンを生成蓄積させ、これを採取することを特徴とするＬ−リジンの製造法、
を提供するものである。
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明でいうコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌とは、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属に統合された細菌を含み（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255（1981)）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌の例として以下のものが挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
コリネバクテリウム・メラセコーラ
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ１３８７０
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ＡＴＣＣ１５８０６
コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５９９１
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０２０
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１５９９０
コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６５
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１４０２０
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１４０６７
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ＡＴＣＣ１４０６８
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３８６９
ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ１３８２５
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ＡＴＣＣ１４０６６
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２４０
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス ＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９）
本発明のα−ＫＧＤＨ遺伝子は、上記のようなコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌の野生株又はこれらから誘導される変異株の染色体ＤＮＡから、以下のようにして得ることができる。
大腸菌のα−ＫＧＤＨ複合体は、Ｅ１（α-ketoglutarate dehydrogenase:EC 1.2.4.2）、Ｅ２（dihydrolipoamide succinyltransferase:EC 2.3.1.61）、Ｅ３（lipoamide dehydrogenase:1.6.4.3）の３つのサブユニットで構成され、Ｅ１、Ｅ２遺伝子はオペロン構造を成し、Ｅ３はピルビン酸脱水素酵素（pyruvate dehydrogenase:EC 1.2.4.1）と共有していることが知られている。大腸菌のＥ１、Ｅ２遺伝子のヌクレオチド配列は明らかにされている（Eur. J. Biochem., 141, 351（1984)、Eur. J. Biochem., 141, 361（1984)）。
また、枯草菌についても同様に、Ｅ１、Ｅ２遺伝子のヌクレオチド配列が明らかにされている（J. Bacteriol., 171, 3667（1989)、Gene, 61, 217（1987)等）。
そこで、大腸菌と枯草菌のＥ１遺伝子の塩基配列との相同性を利用して、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌由来のα−ＫＧＤＨ遺伝子の単離及びクローン化に本発明者らは成功した。その工程は以下の通りである。
まず、大腸菌と枯草菌のα−ＫＧＤＨ・Ｅ１サブユニット遺伝子間で相同性の高い領域を選び両端の配列からプライマーを合成する。プライマーとしては、塩基組成がランダムでＧ＋Ｃ含量が５０％付近であり、特殊な２次構造を形成せず、互いに相補的でない、との条件を満たすものであればどのような配列でもよい。長さは通常２０ないし３０塩基のものがよく用いられる。具体的に例示すると、配列表配列番号３及び４に示すようなものが挙げられる。
ついで、本プライマーと枯草菌染色体ＤＮＡからポリメラーゼ・チェイン・リアクション法（ＰＣＲ法）により枯草菌α−ＫＧＤＨ遺伝子の一部分から成るプローブを作成する。プローブとしては、２０塩基程度以上の長さであれば用いることが可能であるが、１００塩基程度以上の長さのものであることが望ましい。また、プローブの塩基配列は、目的とする遺伝子の配列と相補的であることが望ましいが、高い相同性を有しているものであれば用いることができる。
一方、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌の染色体ＤＮＡを抽出し、制限酵素により消化して得られたＤＮＡ断片をベクターに連結して組換え体ＤＮＡを作成し、該組換え体ＤＮＡで大腸菌を形質転換する。制限酵素としては、例えば、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ等が用いられ、また、ベクターとしては大腸菌由来のベクター、例えば、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２等が用いられる。作成した組換え体ＤＮＡの受容菌としては、ベクターの複製に好適なものであればいずれの菌株でもよく、例えばＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＤＨ５等の大腸菌菌株が用いられる。
かくして得られる形質転換体の中からコロニー・ハイブリダイゼーションによりプローブＤＮＡとハイブリダイズする株を選択し、当該形質転換体より組換え体ＤＮＡを回収し、ベクターに連結されているコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌染色体ＤＮＡの制限酵素断片の構造を解析する。
得られたＤＮＡ断片は、必ずしも目的とする酵素をコードする遺伝子の全長を含んでいるとは限らない。この場合、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌の染色体ＤＮＡを別の制限酵素で切断し、ベクターに連結して組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡにより形質転換を行い、上記と同様にコロニー・ハイブリダイゼーションによる選択と制限酵素断片の解析を行うことによりα−ＫＧＤＨ遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片を取得することができる。この時、プローブとして初めに取得したＤＮＡ断片を用いることにより、コロニーハイブリダイゼーションをより容易に行うことができる。
α−ＫＧＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、他の適当なベクターに再度組換えてコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌に導入することができる。用いられるベクターは、例えばコリネバクテリウム属細菌で自律複製できるプラスミドである。具体的に例示すれば、ｐＡＭ３３０（特開昭５８−６７６９９号公報）、ｐＨＭ１５１９（特開昭５８−７７８９５号公報）、ｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１、ｐＡＪ１８４４（以上、特開昭５８−１９２９００号公報）、ｐＣＧ１（特開昭５７−１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（特開昭５８−３５１９７号公報）、ｐＣＧ４、ｐＣＧ１１（特開昭５７−１８３７９９号公報）、ｐＨＫ４（特開平５−７４９１号公報）等が挙げられる。
上記ベクターと、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌のα−ＫＧＤＨ遺伝子とを連結して組換え体ＤＮＡを調製するには、あらかじめ制限酵素を用いてベクターを切断する。染色体ＤＮＡを切断するときに用いる制限酵素と同じものにより切断し、又は染色体ＤＮＡ断片の切断面に相補する切断面を生じる制限酵素を用いて切断する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。
各種組換えＤＮＡを受容菌に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行う。例えば、エシェリヒア・コリＫ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（J. Mol. Biol., 53, 159（1970)）があり、枯草菌について報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（C. H. Gene, 1, 153（1977)）がある。あるいは、枯草菌、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラスト又はスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Molec. Gen. Genet., 168, 111（1979)、Nature, 274, 398（1978)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929（1978)）も応用できる。
プロトプラスト法では上記の枯草菌において使用されている方法でも充分高い頻度を得ることができるが、特開昭５７−１８３７９９号公報に開示されるように、コリネバクテリウム属細菌細胞のプロトプラストをポリエチレングリコール又はポリビニルアルコールの一方及び二価金属イオンに接触させた状態でＤＮＡをとり込ませる方法も利用できる。ポリエチレングリコール又はポリビニルアルコールの代りに、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、フィコール、ブルロニックＦ６８（セルバ社製）などの添加によってもＤＮＡのとり込みを促進させることができる。本発明の実施例で用いて形質転換の方法は、電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）である。
このようにして得たコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌由来のα−ＫＧＤＨ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを導入した菌株は、炭素源、窒素源、無機塩類、さらに必要に応じて有機微量栄養素を含有する通常の培地に培養することによりα−ＫＧＤＨ活性を有する酵素を高レベルで菌体内に生成させることができる。
炭素源としては、グルコース、シュクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物などの糖類の他、酢酸、クエン酸などの有機酸類、エタノールなどのアルコール類が使用され、窒素源としては、尿素、アンモニウム塩、アンモニア水、アンモニアガスなどが使用される。無機塩類としては、リン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、マンガン塩などが使用される。有機微量栄養素としては、アミノ酸類、ビタミン類、脂肪酸類、核酸類、その他これらのものを含有するペプトン、酵母エキス、大豆蛋白加水分解物などが使用される。
培養は、温度２５ないし３７℃にてｐＨを５ないし９に制御しつつ、１０ないし４０時間好気的条件下にて行う。
培養終了後、培養液中に生成蓄積したＬ−グルタミン酸を定量するとともに、菌体のα−ＫＧＤＨ活性のレベルを測定する。活性測定は、遠心分離などの操作により培養物から回収した菌体を、超音波処理、フレンチプレス処理などにより破砕した後遠心分離して菌体残渣を除去し、ゲル濾過にて低分子物質を除いたものを用いて、Agric. Biol. Chem., 44, 1897（1980)記載の方法等により行うことができる。
かくして遺伝子が増幅されたコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌と増幅されていない菌について、α−ＫＧＤＨ活性のレベルとＬ−グルタミン酸の生産能の関係を調べた結果、後述の参考例１に示すとおり、遺伝子の増幅によりα−ＫＧＤＨ活性のレベルが上昇した菌ではＬ−グルタミン酸生産能が低下していることが明らかとなった。
本遺伝子の利用としては、薬剤遺伝子の挿入等によるα−ＫＧＤＨ活性欠失株の取得、in vitro変異による活性弱化株の取得、プロモーターの改変による発現低下株の取得等により、従来のコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌と比較してさらにＬ−グルタミン酸生産能が向上した菌株を効率よく育種することが可能となる。
α−ＫＧＤＨ活性が欠失した株の取得は、化学薬剤を用いて変異を誘導する方法でも、遺伝子組換えによる方法でも取得可能である。しかし、化学薬剤による変異誘導法ではα−ＫＧＤＨ活性が低下した株を得ることは比較的容易であるが該活性が完全に欠失した株の取得は困難であり、このような株を取得するには上記のようにして明らかとなったα−ＫＧＤＨ遺伝子の構造を基に、遺伝子相同組換え法により染色体上に存在するα−ＫＧＤＨ遺伝子を改変又は破壊する方法が有利である。相同組換えによる遺伝子破壊は既に確立しており直鎖ＤＮＡを用いる方法や温度感受性プラスミドを用いる方法などが利用できる。
具体的には、部位特異的変異法（Kramer, W. and Frits, H. J., Methods in Enzymology, 154, 350（1987)）や次亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン等の化学薬剤による処理（Shortle, D. and Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 270(1978)）によって、α−ＫＧＤＨ遺伝子のコーディング領域又はプロモーター領域の塩基配列の中に１つ又は複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を起こさせ、このようにして改変又は破壊した遺伝子を染色体上の正常な遺伝子と置換することにより遺伝子産物であるα−ＫＧＤＨの活性を欠失させるかα−ＫＧＤＨ遺伝子の転写を消失させることができる。
部位特異的変異法は、合成オリゴヌクレオチドを用いる方法であり、任意の限定された塩基対だけに、任意の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を導入できる手法である。この方法を利用するには、まず、クローン化され、ＤＮＡ塩基配列が決定されている目的遺伝子を持つプラスミドを変性させて一本鎖を調製する。次に、変異を起こさせたい部分に相補的な合成オリゴヌクレオチドを合成するが、この時合成オリゴヌクレオチドを完全に相補的な配列にせず、任意の塩基置換、欠失、挿入、付加又は逆位を持つようにしておく。この後一本鎖ＤＮＡと任意の塩基置換、欠失、挿入、付加又は逆位を持つ合成オリゴヌクレオチドをアニールさせ、さらにＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントとＴ４リガーゼを用いて完全な２本鎖プラスミドを合成し、これをエシェリヒア・コリのコンピテントセルに導入する。このようにして得られた形質転換体の幾つかは、任意の塩基置換、欠失、挿入、付加又は逆位が固定された遺伝子を含むプラスミドを持っている。遺伝子の変異を導入し、改変又は破壊することができる同様な手法には、リコビナントＰＣＲ法（PCR Technology, Stockton press（1989)）がある。
また、化学薬剤処理を用いる方法は、目的の遺伝子を含むＤＮＡ断片を直接次亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン等で処理することによりＤＮＡ断片中にランダムに塩基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を持つ変異を導入する方法である。
このようにして取得した変異が導入されて改変又は破壊された遺伝子をコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌の染色体上の正常な遺伝子と置換する方法としては、相同性組換えを利用した方法（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press（1972);Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196(1985)）がある。相同性組換えは、染色体上の配列と相同性を有する配列を持つプラスミド等が菌体内に導入されると、ある頻度で相同性を有する配列の箇所で組換えを起こし、導入されたプラスミド全体を染色体上に組み込む。この後さらに染色体上の相同性を有する配列の箇所で組換えを起こすと、再びプラスミドが染色体上から抜け落ちるが、この時組換えを起こす位置により変異が導入された遺伝子の方が染色体上に固定され、元の正常な遺伝子がプラスミドと一緒に染色体上から抜け落ちることもある。このような菌株を選択することにより、塩基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を持つ変異が導入されて改変又は破壊された遺伝子が染色体上の正常な遺伝子と置換された菌株を取得することができる。
かくして得られるα−ＫＧＤＨ活性が欠失したコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌は、α−ＫＧＤＨ活性が部分的に低下した株に比べて特に過剰量のビオチンを含有する培地においてＬ−グルタミン酸生産能が顕著に優れている。
α−ＫＧＤＨ活性が欠失したコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌を用いてＬ−グルタミン酸を生成蓄積させるには、炭素源、窒素源、無機イオン及びその他の栄養素を含有する液体培地に培養する。従来、ビオチンを過剰に含む液体培地中に培養を行う場合にはビオチン作用抑制物質、すなわちペニシリンＧ、Ｆ、Ｋ、Ｏ、Ｖ、Ｘ等のペニシリン類又はシュークロースモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート等の高級脂肪酸もしくはその誘導体より成る界面活性剤を培地に添加することがＬ−グルタミン酸を高収率で生産するために必要であったが、α−ＫＧＤＨ活性が欠失した本発明のコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌を使用する場合、１０乃至１０００μｇ／ｌの高濃度のビオチンを含む液体栄養培地で培養する際においても上記のようなビオチン作用抑制物質の添加を行うことなく高収率、高蓄積でＬ−グルタミン酸を生成蓄積させることができる。
即ち、炭素源としては、グルコース、フラクトース、澱粉糖化液、酢酸等の他、甘藷、甜菜からの糖汁あるいは廃糖蜜等のビオチンを過剰に含有する原料も使用することができる。窒素源としては、通常のＬ−グルタミン酸発酵に用いられるアンモニウム塩、アンモニア水、アンモニアガス、尿素等が用いられ、その他リン酸塩、マグネシウム塩等の無機イオンが必要に応じて適宜使用される。また、必要により、サイアミン等の微量栄養素が適宜培地に添加される。
培養は好気的条件下で行うのがよく、培養温度２４〜４２℃、培養中ｐＨは５〜９に制御するのがよく、ｐＨの調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガス等を使用することができる。
培養液からのＬ−グルタミン酸を採取する方法は、イオン交換樹脂処理、晶析等公知の方法を適宜組み合わせることにより行われる。
なお、Ｌ−グルタミン酸生産性を向上させるには、グルタミン酸生合成系遺伝子を強化することが有利である。グルタミン酸生合成系遺伝子を強化した例としては、解糖系のホスフォフルクトキナーゼ（ＰＦＫ、特開昭６３−１０２６９２号）、アナプレロティック経路のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ、特開昭６０−８７７８８号、特開昭６２−５５０８９号）、ＴＣＡ回路のクエン酸合成酵素（ＣＳ、特開昭６２−２０１５８５号、特開昭６３−１１９６８８号）、アコニット酸ヒドラターゼ（ＡＣＯ、特開昭６２−２９４０８６号）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ、特開昭６２−１６６８９０号、特開昭６３−２１４１８９号）、アミノ化反応としてはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ、特開昭６１−２６８１８５号）等がある。
上記の遺伝子を取得するためには以下に示す様な方法が考えられる。
(1)目的遺伝子に変異が起こり特徴的な形質を示す変異株で、目的遺伝子を導入することによりその形質が消失するような変異株を取得し、その変異株の形質を相補するような遺伝子をコリネ型細菌の染色体から取得する方法。
(2)目的遺伝子が他の生物において既に取得され塩基配列が明らかになっている場合、相同性の高い領域のＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーションの手法により目的の遺伝子を取得する方法。
(3)目的遺伝子の塩基配列がかなり詳細に判明している場合は目的遺伝子を含む遺伝子断片をコリネ型細菌の染色体を鋳型としＰＣＲ法（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション法）により取得する方法。
ここで用いる染色体の取得方法は上記の方法を用いることができる。また、宿主−ベクター系としては、コリネ型細菌で利用可能なものであればよく、上記で述べたものが用いられる。本発明の実施例においては塩基配列が既に明らかになっている場合に有効である上記(3)の方法を用いた。
また、上記(2)及び(3)の方法で遺伝子を取得する場合、目的遺伝子が独自のプロモーターを持たない時にはコリネ型細菌でプロモーター活性を持つＤＮＡ断片を目的遺伝子の上流に挿入することにより目的遺伝子を発現させることができる。目的遺伝子の発現を強化するには、強力なプロモーターの下流に目的遺伝子を連結することが考えられる。コリネ型細菌の細胞内で機能するプロモーターのうち強力なものとしては、大腸菌のｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター等がある（Y.Morinaga,M.Tsuchiya,K.Miwa and K.Sano,J.Biotech.,5,305-312(1987)）。また、コリネバクテリウム属細菌のｔｒｐプロモーターも好適なプロモーターである（特開昭６２−１９５２９４号公報）。本発明の実施例においては、ＰＥＰＣ遺伝子の発現にコリネ型細菌のｔｒｐプロモーターを用いた。
また、本発明のα−ＫＧＤＨ遺伝子の増幅は、Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型細菌において、その生産能を向上させる上で有用である。
従来より種々の人工変異株がＬ−リジン生産菌として用いられており、これらを宿主として本発明の組換えＤＮＡを保有させることによりそのＬ−リジン生産能を向上させることができる。このような人工変異株としては次のようなものがある。Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン（以下、「ＡＥＣ」と略記する）耐性変異株、その生育にＬ−ホモセリンのようなアミノ酸を必要とする変異株（特公昭４８−２８０７８号、特公昭５６−６４９９号）、ＡＥＣに耐性を示し、更にＬ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン等のアミノ酸を要求する変異株（米国特許第３７０８３９５号及び第３８２５４７２号）、ＤＬ−α−アミノ−εカプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸アナログ、サルファ剤、キノイド、Ｎ−ラウロイルロイシンに耐性を示すＬ−リジン生産変異株、オキザロ酢酸脱炭酸酵素または呼吸系酵素阻害剤に耐性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭５０−５３５８８号、特開昭５０−３１０９３号、特開昭５２−１０２４９８号、特開昭５３−９３９４号、特開昭５３−８６０８９号、特開昭５５−９７８３号、特開昭５５−９７５９号、特開昭５６−３２９９５号、特開昭５６−３９７７８号、特公昭５３−４３５９１号、特公昭５３−１８３３号）、イノシトールまたは酢酸を要求するＬ−リジン生産変異株（特開昭５５−９７８４号、特開昭５６−８６９２号）、フルオロピルビン酸または３４℃以上の温度に対して感受性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭５５−９７８３号、特開昭５３−８６０９０号）、エチレングリコールに耐性を示し、Ｌ−リジンを生産するブレビバクテリウムまたはコリネバクテリウムの変異株（米国特許第４４１１９９７号参照）等。
具体的には、以下のような株を例示することができる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１２０３１（ＦＥＲＭ−ＢＰ２７７、特開昭６０−６２９９４号公報）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ３９１３４（特開昭６０−６２９９４号公報）
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＪ３４６３（ＦＥＲＭ−Ｐ１９８７、特公昭５１−３４４７７号公報）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１２４３５（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２９４、米国特許第5,304,476号）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１２５９２（ＦＥＲＭ ＢＰ−３２３９、米国特許第5,304,476号）
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＪ１２５９６（ＦＥＲＭ ＢＰ−３２４２、米国特許第5,304,476号）
このようなＬ−リジン生産菌にα−ＫＧＤＨ遺伝子を導入するには、既に述べたように適当なベクターと連結して行えばよい。
使用するＬ−リジン生産用の培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培地である。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースや澱粉加水分解物などの糖類、エタノールやイノシトールなどのアルコール類、酢酸、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。有機微量栄養素としては、ビタミンＢ1などの要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有させることが望ましい。
培養は好気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培養温度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜８．５に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
発酵液からのＬ−リジンの採取は通常イオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【図面の簡単な説明】
図１は、α−ＫＧＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵素地図である。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。なお、制限酵素は市販品（宝酒造社製）を用いた。
実施例１ α−ＫＧＤＨ遺伝子の単離及び構造決定
（１）プローブの調製
大腸菌と枯草菌のα−ＫＧＤＨ・Ｅ１サブユニット遺伝子間で相同性の高い領域を選び、配列表配列番号３及び４に示すオリゴヌクレオチドをホスホアミダイド法によりＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシステム社製モデル３９４）を用いて合成した。
プライマーとして該オリゴヌクレオチド０．２５μｍｏｌｅ、鋳型として常法によって調製したバチルス ズブチリス ＮＡ６４（同株はバチルス・ジェネテイック・ストック・センター（米国オハイオ州立大学）より入手した）の染色体ＤＮＡ０．１μｇ及びタックＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）２．５ユニットをｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各２００μＭ、塩化カリウム５０ｍＭ、塩化マグネシウム１．５ｍＭ及びゼラチン０．０００１％を含有する１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）０．１ｍｌに添加し、９４℃を１分、５５℃を２分、７２℃を３分のサイクルを３０回繰り返すＰＣＲ法を行った。反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、目的とするＤＮＡ断片をグラスパウダー（宝酒造社製）を用いて回収した。このＤＮＡ断片をクレノウフラグメント（アマシャム社製）と[α−32Ｐ]ｄＣＴＰ（アマシャム社製）を用いたラベル化の常法に従って標識し、プローブとして用いた。
（２）ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡ断片の調製
バクト・トリプトン（ディフコ社製）１％、バクト・イーストエキストラクト（ディフコ社製）０．５％及び塩化ナトリウム０．５％から成るＴ−Ｙ培地（ｐＨ７．２）５００ｍｌに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９を接種し、３１．５℃で６時間培養し培養物を得た。この培養物を５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離処理し沈澱物として湿菌体２ｇを得た。
該菌体から斉藤、三浦の方法（Biochem. Biophys. Acta., 72, 619,（1963)）により染色体ＤＮＡを抽出した。この染色体ＤＮＡ２μｇ及び制限酵素ＥｃｏＲＩ２００ユニットを１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び１ｍＭジチオスレイトールを含有する５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）におのおの混合し、温度３７℃で１５時間反応させた。反応終了液を常法によりフェノール抽出処理し、エタノール沈澱処理してＥｃｏＲＩで消化されたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡ断片を得た。
（３）ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９のα−ＫＧＤＨ遺伝子の単離
プラスミドベクターｐＵＣ１８（宝酒造社製）１μｇ及び制限酵素ＥｃｏＲＩ２０ユニットを１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び１ｍＭジチオスレイトールを含有する５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に混合し、温度３７℃で２時間反応させて消化液を得、該液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱した。この後、プラスミドベクター由来のＤＮＡ断片が再結合するのを防止するため、Molecular Cloning 2nd edition（J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, pl.60（1989)）の方法でバクテリアル・アルカリフォスファターゼ処理によりＤＮＡ断片の脱リン酸化を行い、常法によりフェノール抽出処理し、エタノール沈澱を行なった。
このＥｃｏＲＩで消化されたｐＵＣ１８を０．１μｇ、（２）で得られたＥｃｏＲＩで消化されたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡ断片１μｇ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ユニット（宝酒造社製）を６．６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール及び１０ｍＭアデノシン三リン酸を含有する６６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加し、温度１６℃で８時間反応し、ＤＮＡを連結させた。次いで該ＤＮＡ混合物で、常法によりエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換し、これを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ寒天培地上にまき、約１０，０００個の形質転換体を得た。
得られた形質転換体から、Molecular Cloning 2nd edition（J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, pl.90（1989)）の方法により、（１）で得られたプローブＤＮＡとハイブリダイズする形質転換体を選択した。
（４）ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９のα−ＫＧＤＨ遺伝子の塩基配列の決定
（３）により得られた形質転換体からMolecular Cloning 2nd edition（J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, pl.25(1989)）記載のアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製した。該プラスミドＤＮＡはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡ由来の約６キロベースのＤＮＡ断片を含んでいた。該プラスミドを（３）の反応組成で制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで切断し、常法に従いアガロースゲル電気泳動を行い（３）と同様にしてサザンハイブリダイゼーションを行いプローブＤＮＡとハイブリダイズする断片を同定した。その結果、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩに切断された約３キロベースの切断断片がハイブリダイズすることが判明した。該ＤＮＡ断片を（３）で行ったようにＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで切断したプラスミドベクターｐＨＳＧ３９７（宝酒造社製）に連結しクローン化した。得られたプラスミドＤＮＡを用いて該ＤＮＡ断片の塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定は、Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオケミカル社製）を用いSangerの方法（J. Mol. Biol., 143, 161（1980)）に従って行った。
得られたＤＮＡ断片は完全なオープン・リーデイング・フレームを含んでいなかったため、（３）で行ったようにブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡをＸｈｏＩで切断しｐＨＳＧ３９７に連結した組換え体プラスミドで形質転換を行い、（２）で得られたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡ由来の約３キロベースのＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ切断断片を（１）の方法に従いラベル化したものをプローブとしてハイブリダイズする形質転換体を選択した。得られた形質転換体の有するプラスミドは約９キロベースのＤＮＡ断片を含んでいた。このＤＮＡ断片を含む遺伝子の制限酵素地図を図１に示した。該プラスミドを（３）の反応組成で制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩで切断し、常法に従いアガロースゲル電気泳動を行い（３）の方法によりハイブリダイズする断片を同定した結果、約４．４キロベースの断片であることが判明した。該ＤＮＡ断片を（３）で行ったようにＳａｌＩ及びＸｈｏＩで切断したプラスミドベクターｐＨＳＧ３９７に連結しクローン化した。このプラスミドをｐＳＨＧＳ−Ｘと命名した。該プラスミドが含むＳａｌＩ及びＸｈｏＩ切断断片中ＳａｌＩ切断点からＥｃｏＲＩ切断点までの約１．４キロベースのＤＮＡ断片の塩基配列の決定を上記と同様にして行った。
こうして得られたＳａｌＩ及びＸｈｏＩ切断遺伝子断片の塩基配列は配列表配列番号１に示す通りである。オープン・リーデイング・フレームを推定し、その塩基配列より推定される産物のアミノ酸配列を配列表配列番号１及び配列番号２に示した。すなわち、配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列から成る蛋白質をコードする遺伝子が、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９のα−ＫＧＤＨ遺伝子である。なお、蛋白質のＮ末端にあるメチオニン残基は開始コドンであるＡＴＧに由来するため蛋白質本来の機能とは無関係であることが多く、翻訳後ペプチダーゼの働きにより除去されることがよく知られており、上記蛋白質の場合にもメチオニン残基の除去が生じている可能性がある。
塩基配列、アミノ酸配列おのおのについて既知の配列との相同性比較を行った。用いたデータベースはＥＭＢＬ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴである。その結果、配列表配列番号１に示されるＤＮＡ及びそれにコードされる蛋白質は、既に報告済みの大腸菌及び枯草菌のα−ＫＧＤＨ・Ｅ１サブユニット遺伝子等と相同性を持つコリネ型細菌では新規な遺伝子及び蛋白質であることが判明した。
本遺伝子のコードする蛋白質は、Ｎ末端のメチオニン残基を含めて１，２５７個のアミノ酸から成り、既に報告のあるα−ＫＧＤＨとは大きく異なる特徴を有していた。すなわち、Ｃ末端側の約９００アミノ酸は種々のＥ１サブユニットと高い相同性を示したが、Ｎ末端側の３００アミノ酸は他種α−ＫＧＤＨには見られないものであり、本蛋白質が特殊な機能を持つことを示唆するものである。このＮ末端側３００アミノ酸部分を既知の配列との相同性比較を行うと大腸菌やアゾトバクター属細菌のＥ２サブユニットとの相同性が認められた。これは、本蛋白質が他種α−ＫＧＤＨとは異なり、Ｅ１、Ｅ２両方の活性を持つ可能性を示唆するものである。
また、本遺伝子オープン・リーデイング・フレーム上流には大腸菌に見られるプロモーター共通配列に類似した配列（281-286及び307-312）及びコリネ型細菌のリボゾーム結合配列と類似した配列（422-428）が見いだされた。本遺伝子オープン・リーデイング・フレーム下流には、転写の終結シグナルと類似したステム＆ループ構造（4243-4281）がみられた。これらの配列は本遺伝子が独立して転写、翻訳を受けており、他種α−ＫＧＤＨとは異なった遺伝子構造を持っていることを示唆するものである。
実施例２ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９由来のα−ＫＧＤＨ遺伝子の発現によるα−ＫＧＤＨ活性の増幅
（１）α−ＫＧＤＨ遺伝子のブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９及びＡＪ１１０６０への導入
実施例１で得られたｐＨＳＧＳ−ＸプラスミドＤＮＡ１μｇ、制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩそれぞれ２０ユニットを実施例１（３）に記載した緩衝液中で混合し、温度３７℃で３時間反応した。一方、ブレビバクテリウム属細菌内で自律複製可能なプラスミドｐＰＫ４（特開平５−７４９１号公報参照）ＤＮＡ１μｇと２０ユニットのＳａｌＩを実施例１（３）に記載した緩衝液中で混合し、温度３７℃で３時間反応した。両反応液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱した。この後、プラスミドベクター由来のＤＮＡ断片が再結合するのを防止するため、実施例１（３）の方法でバクテリアル・アルカリフォスファターゼ処理によりＤＮＡ断片の脱リン酸化を行い、常法によりフェノール抽出処理し、エタノール沈澱を行なった。このＳａｌＩで消化されたｐＰＫ４を０．１μｇ、上記で得られたＳａｌＩ及びＸｈｏＩで消化されたｐＨＳＧＳ−ＸプラスミドＤＮＡ０．５μｇ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）１ユニットを実施例１（３）記載の緩衝液中で混合し、温度１６℃で８時間反応し、ＤＮＡを連結させた。次いで該ＤＮＡ混合物を電気パルス法を用いた形質転換の常法（特開平２−２０７７９１号公報）に従い、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１１０６０（特公昭５９−１０７９７号公報）に導入した。これをポリペプトン１％、酵母エキス１％、塩化ナトリウム０．５％、グルコース０．５％及びカナマイシン２５μｇ／ｍｌから成る寒天培地上にまき、形質転換体ＡＪ１１０６０／ｐＰＫＳ−Ｘを得た。本形質転換体は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１２９９９と命名され、平成６年６月３日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４３４９で寄託され、平成７年６月２日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５１２３が付与されている。
得られた形質転換体から実施例１（４）に従ってプラスミドＤＮＡを抽出し、常法に従ってアガロースゲル電気泳動を行うことにより、プラスミドｐＰＫ４にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９由来のＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片が結合した組換え体ＤＮＡを選択した。該プラスミドをｐＰＫＳ−Ｘと命名した。
また、同様にしてブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９を宿主として形質転換体ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＰＫＳ−Ｘを取得した。
（２）α−ＫＧＤＨ遺伝子増幅株の酵素活性
（１）で得られたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１１０６０／ｐＰＫＳ−Ｘ及びＡＴＣＣ１３８６９／ｐＰＫＳ−Ｘをグルコース８％、リン酸２水素カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．００４％、硫酸アンモニウム３％、硫酸第一鉄０．００１％、硫酸マンガン０．００１％、大豆加水分解液０．０５％、ビタミンＢ1２００μｇ／ｌ、ビチオン３００μｇ／ｌ、炭酸カルシウム５％及びカナマイシン２５ｍｇ／ｌから成る培地（ｐＨ８．０）５０ｍｌに接種し、３１．５℃で１８時間培養した。該培養液を常法に従って遠心分離し、菌体を集めた。
この菌体を０．２％塩化カリウム水溶液で懸濁し、遠心分離する操作を２回繰り返し菌体を洗浄した。該菌体を３０％グリセロールを含むＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルフォン酸（以下ＴＥＳ）０．１Ｍ緩衝液（ｐＨ７．７）に懸濁し、超音波処理した後、１５，０００ｒｐｍ、３０分遠心分離して上清を得た。この細胞破砕液をセファデクスＧ−２５（Pharmacia社製）カラムクロマトグラフィーに供し、低分子量物質を除いたものを粗酵素液とした。
得られた粗酵素液のα−ＫＧＤＨ活性をAgric. Biol. Chem., 44. 1897（1980）記載の反応組成物を用いて３−アセチルピリジン・アデニン・ジヌクレオチドの３６５ｎｍの吸光度の上昇を測定した。また、粗酵素液の蛋白質濃度はウシ血清アルブミンを標準としてバイオ・ラッド社製キットを用いて測定し、酵素の比活性を算出した。対照として、プラスミドｐＰＫ４で同様に形質転換して得たＡＪ１１０６０／ｐＰＫ４及びＡＴＣＣ１３８６９／ｐＰＫ４の比活性を求めた。その結果を表１に示した。ＡＪ１１０６０／ｐＰＫＳ−ＸとＡＴＣＣ１３８６９／ｐＰＫＳ−ＸはそれぞれＡＪ１１０６０／ｐＰＫ４とＡＴＣＣ１３８６９／ｐＰＫ４の２倍もしくはそれ以上の比活性を有しており、この結果から取得した遺伝子断片がα−ＫＧＤＨ活性を有する酵素をコードしていることが示された。
また、粗酵素液をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した結果、取得された遺伝子から予想される酵素の分子量１３９キロダルトンに見合った約１３５キロダルトンのバンドの増幅が観察された。これは取得した遺伝子が形質転換株において実際に発現していることを示すものである。
参考例１ α−ＫＧＤＨ活性とＬ−グルタミン酸生産能との関係
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１１０６０／ｐＰＫ４及びＡＪ１１０６０／ｐＰＫＳ−ＸをＬ−グルタミン酸生産培地に培養し、培養液中に生成蓄積したＬ−グルタミン酸を測定した。培養は界面活性剤を添加する方法で以下の様に行った。
グルコース８％、リン酸２水素カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０４％、硫酸アンモニウム３％、硫酸第一鉄０．００１％、硫酸マンガン０．００１％、大豆加水分解液１．５％、サイアミン塩酸塩２００μｇ／ｌ、ビオチン３００μｇ／ｌ、カナマイシン２５ｍｇ／ｌ及びＣａＣＯ3（別殺菌）５％から成る生産培地（ｐＨ８．０）２０ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに分注し加熱殺菌した。これにあらかじめＡＪ１１０６０／ｐＰＫ４及びＡＪ１１０６０／ｐＰＫＳ−Ｘのそれぞれをポリペプトン（日本製薬社製）１％、バクト・イーストエキストラクト（ディフコ社製）１％、塩化ナトリウム０．５％、グルコース０．５％及びカナマイシン２５ｍｇ／ｌから成る平板培地（ｐＨ７．２）にて培養して得た菌体を接種し、３１．５℃にて１８時間振とう培養し、種培養を得た。
ついで、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ４０：シグマ社製）を３ｇ／ｌ添加した生産培地又は添加していない生産培地に得られた種培養をそれぞれ５％量接種し、同様にして３１．５℃にて約２０時間振とう培養した。
培養終了後、培養液中のＬ−グルタミン酸蓄積量及び残グルコース濃度を旭化成社製バイオテックアナライザーＡＳ−２１０を用いて測定した。菌体増殖量は、０．０２規定塩酸で培養物を５１倍希釈した液の６２０ｎｍにおける吸光度を測定することにより求めた。その結果を表２に示す。
いずれの菌株も界面活性剤を添加しない培地では、Ｌ−グルタミン酸の生成は全く認められず、界面活性剤を添加した場合のみグルタミン酸は培養液中に生成蓄積した。この際、α−ＫＧＤＨ遺伝子を含むプラスミドｐＰＫＳ−Ｘを導入した株では、対照となるｐＰＫ４導入株に対して著しいＬ−グルタミン酸収率の低下を起こした。このことはα−ＫＧＤＨ活性のレベルが界面活性剤添加によるＬ−グルタミン酸生産に大きな影響を及ぼすことを示すものである。
参考例２ ペニシリン添加法によるＬ−グルタミン酸生産能の比較
α−ＫＧＤＨ遺伝子増幅のＬ−グルタミン酸生成に及ぼす効果をペニシリン添加法により調べた。
参考例１と同様に種培養を調製し、０．４ユニット／ｍｌのペニシリンを添加した生産培地又は添加しない生産培地に、菌体乾燥重量で約２％になる様に種培養をそれぞれ接種し、３１．５℃にて約２５時間振とう培養を行った。
培養終了後、培養液中のＬ−グルタミン酸蓄積量及び残グルコース濃度を参考例１と同様に測定した。結果を表３に示した。この結果は、α−ＫＧＤＨ活性のレベルがペニシリン添加によるＬ−グルタミン酸生産においても大きな影響を及ぼすことを示すものである。
実施例３ α−ＫＧＤＨ遺伝子欠損株の作製
α−ＫＧＤＨ遺伝子増幅によりＬ−グルタミン酸生成が抑制されたことから、逆にα−ＫＧＤＨ遺伝子を破壊する事によりグルタミン酸収率を向上させることが期待された。遺伝子破壊株は、特開平５−７４９１号に示される温度感受性プラスミドを用いた相同組換え法により取得した。具体的には、α−ＫＧＤＨ遺伝子内には配列表配列番号１の1340番目と3266番目の２箇所にＫｐｎＩで消化される部位が存在する。そこで、実施例１で得られたｐＨＳＧＳ−ＸをＫｐｎＩで部分消化したのち自己結合させ、ＫｐｎＩ断片の1926塩基対を欠失したプラスミドｐＨＳＧＳ−Ｘ△Ｋを作成した。ｐＨＳＧＳ−Ｘ△Ｋ上のα−ＫＧＤＨ遺伝子は中央部分を欠失した構造になっている。次にｐＨＳＧＳ−Ｘ△ＫのＢａｍＨＩ認識部位に、コリネ型細菌で自己複製可能なプラスミドから取得した自己複製能が温度感受性になった変異型の複製起点を導入し、プラスミドｐＢＴＳ−ＸΔＫを作成した。具体的には、コリネ型細菌で自己複製可能なプラスミドから取得した自己複製能が温度感受性になった変異型の複製起点を持つプラスミドｐＨＳＣ４（特開平５−７４９１号）を制限酵素ＫｐｎＩで消化し、ＤＮＡ平滑末端化キット（宝酒造社製、Blunting kit）を用い平滑末端化した後、ＢａｍＨＩリンカー（宝酒造社製）を結合させた後自己結合させて得たプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、自己複製能が温度感受性になった変異型の複製起点を含む遺伝子断片を取得し、これをｐＨＳＧＳ−Ｘ△ＫのＢａｍＨＩ部位に挿入しプラスミドpＢＴＳ−ＸΔＫを取得した。
このプラスミドをコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌の野生株であるブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９に電気パルス法（特開平２−２０７７９１号）を用いて導入し、特開平５−７４９１号の方法で染色体上のα−ＫＧＤＨ遺伝子を欠失型に置換した。具体的には、プラスミドが導入されたＡＴＣＣ１３８６９／ｐＢＴＳ−ＸΔＫをＣＭ２Ｇ（ポリペプトン１％、酵母エキス１％、塩化ナトリウム０．５％、グルコース０．５％、ｐＨ７．２）液体培地で２５℃にて６時間振とう培養した後、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｇ寒天培地上に撒き、３４℃で培養して形成したコロニーをプラスミド組み込み株として取得した。次に、この株から３４℃でクロラムフェニコールに対して感受性になった株をレプリカ法により取得した。この感受性株から染色体上のα−ＫＧＤＨ遺伝子の塩基配列を調べ、α−ＫＧＤＨ遺伝子が欠失型に置換されていることを確認し、これをΔＳ株と命名した。ΔＳ株のα−ＫＧＤＨ活性を実施例２に記した方法により測定したところ、活性は全く検出されなかった。
実施例４ ｇｄｈ、ｇｌｔＡ及びｉｃｄ遺伝子増幅用プラスミドの作製
（１）ｇｄｈ、ｇｌｔＡ及びｉｃｄ遺伝子のクローニング
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのｇｄｈ、ｇｌｔＡ及びｉｃｄ遺伝子をＰＣＲ法でクローニングした。ＰＣＲ法に用いるプライマーは、既に報告されているコリネバクテリウム・グルタミカムのｇｄｈ遺伝子（Molecular Microbiology, 6(3), 317-326（1992)）、ｇｌｔＡ遺伝子（Miclobiology, 140, 1817-1828（1994)）及びｉｃｄ遺伝子（J. Bacteriol.（1995),177,774-782）の配列をもとに合成した。ｇｄｈ遺伝子の増幅用のプライマーとしては、配列表配列番号５（５′側）と配列番号６（３′側）に示すオリゴヌクレオチド、ｇｌｔＡ遺伝子増幅用プライマーとしては、配列番号７（５′側）と配列番号８（３′側）に示すオリゴヌクレオチド、ｉｃｄ遺伝子増幅用プライマーとしては、配列番号９（５′側）と配列番号１０（３′側）に示すオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成し使用した。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９から実施例１の方法により染色体ＤＮＡを調製し、これを鋳型とし上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いＰＣＲ法を行った。得られた増幅産物の両末端を市販のＤＮＡ末端平滑化キット（宝酒造社製、Blunting kit）を用い平滑末端化した後、ベクタープラスミドpＨＳＧ３９９（宝酒造社製）のＳｍａＩ部位にそれぞれクローニングし、プラスミドpＨＳＧ−ｇｄｈ、pＨＳＧ−ｇｌｔＡ及びpＨＳＧ−ｉｃｄを得た。
（２）ｐｐｃ遺伝子のクローニングと発現
実施例１の方法によりブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを調製し、これを鋳型としてＰＥＰＣをコードするｐｐｃ遺伝子を含む約3.4KbpのＤＮＡ断片をＰＣＲ法を用いて取得した。ＰＣＲ法に用いるプライマーは、既に報告されているコリネバクテリウム・グルタミカムのｐｐｃ遺伝子の配列（Gene, 77, 237-251（1989)）をもとに合成し、ＰＣＲ反応は上記と同様にして行った。プライマーの配列を配列番号１１（５′側）と配列番号１２（３′側）に示す。
ＰＣＲ反応の増幅産物を制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造社製）を用いて消化し、プラスミドｐＨＳＧ３９９のＳａｌＩ部位に挿入したプラスミドｐＨＳＧ−ｐｐｃ′を取得した。ｐＨＳＧ−ｐｐｃ′のＰＥＰＣ遺伝子はｐＨＳＧ３９９のｌａｃプロモーターと逆向きに挿入されている。
次に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムで機能するプロモーターとして知られているトリプトファンオペロンのプロモーター（Gene, 53, 191-200（1987)）をｐＨＳＧ−ｐｐｃ′上のｐｐｃ遺伝子の上流に挿入した。このプロモーターは配列表配列番号１３に示す51塩基からなる配列で活性を示すことが知られている。このプロモーター活性を持つ51塩基対を含み、かつ両端が制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｂａＩによる切断断片と一致するような２本鎖ＤＮＡが得られる様に、配列番号１３に示す配列を持つヌクレオチド鎖及びこれの相補鎖となる配列番号１４の配列を持つヌクレオチド鎖を合成した。
合成した両ＤＮＡを約10pmol/μlずつの濃度になるように混合し、100℃、10分加熱した後、室温で放冷しアニーリングさせた。ｐＨＳＧ−ｐｐｃ′を制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｂａＩ（宝酒造社製）により消化し、上記のプロモーターと結合させた。結合反応は宝酒造社製ライゲーションキットを用いて行った。これにより、ｐｐｃ遺伝子の上流にトリプトファンオペロンのプロモーターが１コピー挿入されたプラスミドｐＨＳＧ−ｐｐｃを得た。
（３）ｇｄｈ、ｇｌｔＡ及びｉｃｄの３種類の遺伝子を連結したプラスミドの作製
ｇｄｈ、ｇｌｔＡ及びｉｃｄの３種類の遺伝子を連結したプラスミドを作製した。具体的には、プラスミドpＨＳＧ−ｇｄｈを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、市販のＤＮＡ末端平滑化キット（宝酒造社製、Blunting kit）を用い平滑末端化したものに上記の両末端を平滑末端化したｇｌｔＡ遺伝子のＰＣＲ増幅産物を連結し、プラスミドｐＨＳＧ−ｇｄｈ＋ｇｌｔＡを取得した。更に、プラスミドｐＨＳＧ−ｇｄｈ＋ｇｌｔＡを制限酵素ＫｐｎＩで消化し、同様にして平滑末端化したものに上記の両末端を平滑末端化したｉｃｄ遺伝子のＰＣＲ増幅産物を連結し、プラスミドｐＨＳＧ−ｇｄｈ＋ｇｌｔＡ＋ｉｃｄを取得した。
（４）ｇｄｈ、ｇｌｔＡ及びｐｐｃの３種類の遺伝子を連結したプラスミドの作製
ｇｄｈ、ｇｌｔＡ及びｐｐｃの３種類の遺伝子を連結したプラスミドを作製した。具体的にはプラスミドｐＨＳＧ−ｇｄｈ＋ｇｌｔＡを制限酵素ＫｐｎＩで消化し、プラスミドｐＨＳＧ−ｐｐｃを制限酵素ＫｐｎＩ及びＳａｌＩで消化し、上流にトリプトファンオペロンのプロモーターを持つｐｐｃ遺伝子断片を取得し、得られた断片をＤＮＡ平滑末端化キット（宝酒造社製、Blunting kit）を用い平滑末端化した後、ＫｐｎＩリンカー（宝酒造社製）を用いてプラスミドｐＨＳＧ−ｇｄｈ＋ｇｌｔＡのＫｐｎＩ部位に挿入し、プラスミドｐＨＳＧ−ｇｄｈ＋ｇｌｔＡ＋ｐｐｃを取得した。
（５）上記プラスミドへのコリネバクテリウムでの複製起点の導入
pＨＳＧ−ｇｄｈ、pＨＳＧ−ｇｌｔＡ、pＨＳＧ−ｐｐｃ、pＨＳＧ−ｉｃｄ、ｐＨＳＧ−ｇｄｈ＋ｇｌｔＡ＋ｉｃｄ及びｐＨＳＧ−ｇｄｈ＋ｇｌｔＡ＋ｐｐｃをコリネ型細菌細胞内で自律複製可能にするために、既に取得されているコリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドｐＨＭ１５１９（Agric. Biol. Chem., 48 2901-2903（1984)）由来の複製起点（特開平５−７４９１号）をpＨＳＧ−ｇｄｈ、pＨＳＧ−ｇｌｔＡ、pＨＳＧ−ｐｐｃ、pＨＳＧ−ｉｃｄ、ｐＨＳＧ−ｇｄｈ＋ｇｌｔＡ＋ｉｃｄ及びｐＨＳＧ−ｇｄｈ＋ｇｌｔＡ＋ｐｐｃに導入した。具体的には、ｐＨＭ１５１９由来の複製起点を持つプラスミドｐＨＫ４（特開平５−７４９１号）を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで消化し、複製起点を含む遺伝子断片を取得し、得られた断片をＤＮＡ平滑末端化キット（宝酒造社製、Blunting kit）を用い平滑末端化した後、ＫｐｎＩリンカー（宝酒造社製）を用いてpＨＳＧ−ｇｄｈ、pＨＳＧ−ｇｌｔＡ、pＨＳＧ−ｐｐｃ及びpＨＳＧ−ｉｃｄのＫｐｎＩ部位にそれぞれ挿入し、ｐＧＤＨ、ｐＧＬＴＡ、ｐＰＰＣ及びｐＩＣＤを取得した。また、ｐＨＳＧ−ｇｄｈ＋ｇｌｔＡ＋ｉｃｄ及びｐＨＳＧ−ｇｄｈ＋ｇｌｔＡ＋ｐｐｃには、そのＳａｌＩ部位に同様にＳａｌＩリンカー（宝酒造社製）を用い、ｐＨＭ１５１９由来の複製起点をそれぞれ挿入し、ｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＩＣＤ及びｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＰＰＣを取得した。更に、対照として、これらの遺伝子を持たないプラスミドｐＨＳＧ３９９を用い、そのＳａｌＩ部位に同様にＳａｌlリンカー（宝酒造社製）を用い、pHM1519由来の複製起点を挿入したｐＳＡＣ４も作成した。
実施例７ ｐＧＤＨ、ｐＧＬＴＡ、ｐＰＰＣ、ｐＩＣＤ、ｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＩＣＤ及びｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＰＰＣ上の各遺伝子の発現の確認
ｐＧＤＨ、ｐＧＬＴＡ、ｐＰＰＣ、ｐＩＣＤ、ｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＩＣＤ及びｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＰＰＣ上の各遺伝子がブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの細胞内で発現し、これらのプラスミドが遺伝子増幅の機能を果たしていることの確認を行った。具体的には、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９に、電気パルス法（特開平２−２０７７９１号）によりそれぞれのプラスミドを導入した。得られた形質転換体は４μg/mlのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｇプレート培地（ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、グルコー５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ及び寒天１５ｇを純水１ｌに含む。ｐＨ７．２）にて選択した。得られた形質転換体をＣＭ２Ｇ寒天培地上にて培養し、グルコース８０ｇ、ＫＨ2ＰＯ4１ｇ、ＭｇＳＯ4０．４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4３０ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ、大豆加水分解液１５ｍｌ、サイアミン塩酸塩２００μｇ、ビオチン３００μｇ及びＣａＣＯ3５０ｇを純水１ｌ中に含む培地（ＫＯＨを用いてｐＨは８．０に調整されている）に接種し、３１．５℃にて１６時間培養した。該培養液を常法に従って遠心分離し、菌体を集めた。
菌体を破砕して得た粗抽出液を用いて、ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＧＤＨ、ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＩＣＤ及びＡＴＣＣ１３８６９／ｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＰＰＣのＧＤＨ活性をMolecular Microbiology, 6(3), 317-326（1992）記載の方法に従い測定したところ、これらの形質転換体では、各々、対照のＡＴＣＣ１３８６９／ｐＳＡＣ４に比べて約１３倍のＧＤＨ活性を有することが分かった（表４）。また、ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＧＬＴＡ及びＡＴＣＣ１３８６９／ＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＩＣＤ及びＡＴＣＣ１３８６９／ｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＰＰＣのＣＳ活性は、Miclobiology, 140, 1817-1828（1994)に、ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＩＣＤ及びＡＴＣＣ１３８６９／ＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＩＣＤのＩＣＤＨ活性は、J.Bacteriol., 177, 774-782（1995)に、ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＰＰＣ及びＡＴＣＣ１３８６９／ｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＰＰＣのＰＥＰＣ活性はGene, 77, 237-251（1989)に記載された方法に従って測定した。測定結果を表５〜７に示す。いずれの形質転換体も目的の酵素について、対照のＡＴＣＣ１３８６９／ｐＳＡＣ４に比べて約２〜２０倍の活性を有することが分かった。このことから、ｐＧＤＨ、ｐＧＬＴＡ、ｐＰＰＣ、ｐＩＣＤ、ｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＩＣＤ及びｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＰＰＣ上の各遺伝子はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム細胞内で発現しその機能を果たしていることが確認された。
実施例８ ΔＳ株と、ｇｄｈ、ｇｌｔＡ、ｐｐｃ及びｉｃｄ遺伝子を増幅したΔＳ株のＬ−グルタミン酸生産
（１）ΔＳ株のジャーファーメンターを用いたＬ−グルタミン酸生産評価
グルコース６０ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4 ０．４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ３０ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ、大豆加水分解液１５ｍｌ、サイアミン塩酸塩２００μｇ及びビオチン４５０μｇを純水１ｌ中に含む培地３００ｍｌを１ｌ容ジャーファーメンターに入れ加熱殺菌した。これにＣＭ２Ｇ寒天培地上にて培養して得たΔＳ株の菌体を接種し、３１．５℃にて、ｐＨをアンモニアガスで７．０、７．２又は７．５に制御しながら３０時間培養した。
培養終了後、菌体濃度及び培地中に蓄積されたＬ−グルタミン酸の量を測定した。Ｌ−グルタミン酸の定量には、旭化成（株）製バイオテックアナライザーＡＳ−２１０を使用し、菌体濃度は、純水で５１倍に希釈した培養液の６６０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ660）により測定した。結果を表８に示す。
過剰量のビオチンを含有する培地で培養したにもかかわらず、△Ｓ株は高い収率でＬ−グルタミン酸を生産蓄積することが確認された。
（２）ΔＳ株と、ｇｄｈ、ｇｌｔＡ、ｐｐｃ及びｉｃｄ遺伝子を増幅したΔＳ株のＬ−グルタミン酸生産のジャーファーメンターを用いた培養による評価
ΔＳ株に上記の様にして作製したｐＧＤＨ、ｐＧＬＴＡ、ｐＰＰＣ、ｐＩＣＤ、ｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＩＣＤ又はｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＰＰＣを導入し、それぞれのプラスミドが導入された形質転換体のＬ−グルタミン酸生産性を評価した。ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム細胞へのプラスミドの導入は電気パルス法（特開平２−２０７７９１号）により行った。得られた形質転換体は４μg/mlのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｇプレート培地（ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、グルコース５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ及び寒天１５ｇを純水１ｌに含む。ｐＨ７．２）にて選択した。
ΔＳ株と、得られた形質転換体のＬ−グルタミン酸の生産性の評価は、上記（１）と同様にして行った。培養後の菌体濃度、及び培地中に蓄積されたＬ−グルタミン酸の量を上記と同様に測定した。結果を表９に示す。
実施例９ α−ＫＧＤＨ遺伝子を増幅したＬ−リジン生産菌によるＬ−リジンの生産
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９から変異誘導されたＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システインに耐性を示し、Ｌ−リジン生成能を有するブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１２４３５（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２９４）に上記の様にして作成したｐＰＫＳ−ＸとｐＰＫ４とをそれぞれ導入しそのＬ−リジン生産性を評価した。プラスミドの導入は電気パルス法（特開平２−２０７７９１号）を用いた。形質転換体は２５mg/ｌのカナマイシンを含むＣＭ２Ｇプレート培地（ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、グルコース５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、寒天１５ｇを純水１ｌに含む。ｐＨ７．２）にて選択した。
Ｌ−リジンの生産性の評価は以下の様にして行った。グルコース１００ｇ、ＫＨ2ＰＯ4１ｇ、ＭｇＳＯ4 ０．４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ３０ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ、大豆加水分解液１５ｍｌ、サイアミン塩酸塩２００μｇ、ビオチン３００μｇ、カナマイシン２５ｍｇ及びＣａＣＯ3 ５０ｇを純水１ｌ中に含む培地（ＫＯＨを用いてｐＨは７．０に調整されている）を５００ｍｌ容フラスコに２０ｍｌずつ分注し、加熱殺菌した。これに２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＣＭ２Ｇプレート培地にて培養して得たＡＪ１２４３５／ｐＰＫ４及びＡＪ１２４３５／ｐＰＫＳ−Ｘの菌体を接種し、３７℃にて２０時間培養した。培養終了後、培養液中に生成蓄積したＬ−リジンの量及び菌体濃度を測定した。この結果を表１０に示す。
産業上の利用性
コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌のα−ＫＧＤＨ活性のレベルがＬ−グルタミン酸の発酵生産に影響を及ぼすことが明らかとなった。従って、薬剤遺伝子の挿入等によるα−ＫＧＤＨ遺伝子活性欠失株の取得、in vitro変異による活性弱化株の取得、プロモーターの改変による発現低下株の取得等により、従来のコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌と比較してさらにＬ−グルタミン酸生産能が向上した菌株を効率よく育種することが可能となる。
配列表
(1)一般情報
(i)出願人：味の素株式会社
(ii)発明の名称：α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子
(iii)配列数：14
(iv)連絡先：
(A)宛名：
(B)番地：
(C)市：
(D)州：
(E)国：
(F)ZIP：
(v)コンピュータ読取り可能形式
(A)媒体：フロッピーディスク
(B)コンピュータ：IBM PC互換
(C)操作システム：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア：FastSEQ Version 1.5
(vi)現行出願データ
(A)出願番号
(B)出願日
(C)分類
(viii)代理人／事務所情報
(A)名前：
(B)登録番号：
(C)整理番号：
(ix)通信情報
(A)電話番号：
(B)ファクシミリ番号：
(2)配列番号１の配列の情報：
(i)配列の性質：
(A)配列の長さ：4394 base pairs
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：２本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：Genomic DNA
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(vi)起源：
(A)生物名：ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
(B)株名：ATCC13869
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：443..4213
(C)特徴を決定した方法：E
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：-35 signal
(B)存在位置：281..287
(C)特徴を決定した方法：S
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：-10 signal
(B)存在位置：307..312
(C)特徴を決定した方法：S
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：RBS
(B)存在位置：421..428
(C)特徴を決定した方法：S
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：terminator
(B)存在位置：4243.4281
(C)特徴を決定した方法：S
(xi)配列：SEQ ID NO:1：
(2)配列番号２の配列の情報：
(i)配列の性質：
(A)配列の長さ：1257アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：SEQ ID NO:2：
(2)配列番号３の配列の情報：
(i)配列の性質：
(A)配列の長さ：20 base pairs
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(xi)配列：SEQ ID NO:3：
(2)配列番号４の配列の情報：
(i)配列の性質：
(A)配列の長さ：29 base pairs
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：YES
(xi)配列：SEQ ID NO:4：
(2)配列番号５の配列の情報：
(i)配列の性質：
(A)配列の長さ：20 base pairs
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(xi)配列：SEQ ID NO:5：
(2)配列番号６の配列の情報：
(i)配列の性質：
(A)配列の長さ：20 base pairs
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：YES
(xi)配列：SEQ ID NO:6：
(2)配列番号７の配列の情報：
(i)配列の性質：
(A)配列の長さ：20 base pairs
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(xi)配列：SEQ ID NO:7：
(2)配列番号８の配列の情報：
(i)配列の性質：
(A)配列の長さ：20 base pairs
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：YES
(xi)配列：SEQ ID NO:8：
(2)配列番号９の配列の情報：
(i)配列の性質：
(A)配列の長さ：20 base pairs
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(xi)配列：SEQ ID NO:9：
(2)配列番号10の配列の情報：
(i)配列の性質：
(A)配列の長さ：20 base pairs
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：YES
(xi)配列：SEQ ID NO:10：
(2)配列番号11の配列の情報：
(i)配列の性質：
(A)配列の長さ：20 base pairs
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(xi)配列：SEQ ID NO:11：
(2)配列番号12の配列の情報：
(i)配列の性質：
(A)配列の長さ：20 base pairs
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：YES
(xi)配列：SEQ ID NO:12：
(2)配列番号13の配列の情報：
(i)配列の性質：
(A)配列の長さ：51 base pairs
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(xi)配列：SEQ ID NO:13：
(2)配列番号14の配列の情報：
(i)配列の性質：
(A)配列の長さ：59 base pairs
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：YES
(xi)配列：SEQ ID NO:14：
本発明は、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−リジンの発酵生産に用いられるコリネ型細菌の育種と利用に関する。更に詳しくは、本発明は、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（α−ＫＧＤＨ）活性が欠失したコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌、該菌を用いたＬ−グルタミン酸の製造法、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌由来のα−ＫＧＤＨ活性を有する酵素をコードする遺伝子（α−ＫＧＤＨ遺伝子）、該遺伝子を含む組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡを保有するコリネ型細菌、及び該組換えＤＮＡを保有し、Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型細菌を用いたＬ−リジンの製造法に関する。
背景技術
従来よりＬ−グルタミン酸はブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属に属するコリネ型細菌を用いた発酵法により工業的に生産されている。
近年、α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下し、かつＬ−グルタミン酸分解活性が低下した大腸菌変異株が、高いＬ−グルタミン酸生産能を持つことが明らかとなった（特開平５−２４４９７０公報）。
これに対し、ブレビバクテリウム属の細菌においては、α−ＫＧＤＨ活性の低下した変異株のＬ−グルタミン酸生産能は親株とほぼ同じであったとの報告があり（Agric. Biol. Chem., 44, 1897（1980)、Agric. Biol. Chem., 46, 493（1982)）、コリネ型細菌では、α−ＫＧＤＨ活性のレベルはＬ−グルタミン酸の生産に重要ではないものと考えられていた。
一方、α−ＫＧＤＨ活性が低下し、かつＬ−グルタミン酸生産能を有する変異株をビオチン過剰原料を炭素源とする培地中で培養すると、ペニシリン類や界面活性剤等のビオチン作用抑制物質を培地に添加することなく、高収率でＬ−グルタミン酸が生産されることが見い出されている（最大収率５３％）（特開平６−２３７７９号公報）。しかしながら、上述したようにコリネ型細菌では、α−ＫＧＤＨ活性のレベルはＬ−グルタミン酸の生産に重要ではないものと考えられていたため、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌のα−ＫＧＤＨ遺伝子をクローニングし解析した例はなかった。また、α−ＫＧＤＨを欠失したコリネホルム細菌の変異株も知られていなかった。
発明の開示
本発明の目的は、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌由来のα−ＫＧＤＨ遺伝子を取得し、該遺伝子を含む組換えＤＮＡを作製し、該組換えＤＮＡで形質転換した微生物を用いてα−ＫＧＤＨ活性のレベルがＬ−グルタミン酸の発酵生産に及ぼす影響を明らかにし、もってコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌の育種において新たな方法論を提供することにある。より具体的には、本発明の目的は、染色体上に存在するα−ＫＧＤＨ遺伝子を破壊することによりα−ＫＧＤＨ活性を欠失させたコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌を取得し、該菌を用いたＬ−グルタミン酸の製造法を提供することにある。また、本発明は、α−ＫＧＤＨ遺伝子を含む組換えＤＮＡを保有するコリネ型細菌、及び該組換えＤＮＡを保有し、Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型細菌を用いたＬ−リジンの製造法を提供することにある。
本発明者らは、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌由来のα−ＫＧＤＨ遺伝子を取得しその構造を明らかにするとともに、該遺伝子を組み込んだ組換え体プラスミドでコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌を形質転換し、得られた形質転換体のα−ＫＧＤＨ活性のレベルとＬ−グルタミン酸の生産能を調べた結果、α−ＫＧＤＨ活性がＬ−グルタミン酸の生産に顕著な影響を及ぼすことを見いだした。また、本発明者らは、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌において染色体上に存在するα−ＫＧＤＨ遺伝子を破壊することによりα−ＫＧＤＨ活性を欠失させた株が、過剰量のビオチンを含有する培地に培養する際、界面活性剤やペニシリンのようなビオチン作用抑制物質を培地に添加することなく著量のＬ−グルタミン酸を生成蓄積することを見いだした。更に、本発明者らは、α−ＫＧＤＨ遺伝子を含む組換えＤＮＡをＬ−リジン生産能を有するコリネ型細菌に導入した結果、得られた組換え体のＬ−リジン生産能が顕著に向上することを見いだし、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
(1)染色体上に存在するα−ＫＧＤＨ活性を有する酵素をコードする遺伝子又はそのプロモーターの塩基配列中に１又は２以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位が生じたことにより、α−ＫＧＤＨ活性が欠損したコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌、
(2)上記(1)記載のコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌を液体培地中に培養し、培養液中にＬ−グルタミン酸を生産蓄積させ、これを採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法、
(3)コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌由来のα−ＫＧＤＨ遺伝子、
(4)コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌由来のα−ＫＧＤＨ遺伝子とコリネ型細菌で機能するベクターが連結されて得られる組換えＤＮＡ、
(5)上記(4)記載の組換えＤＮＡを保有するコリネ型細菌、及び
(6)上記(5)記載の組換えＤＮＡを保有し、かつＬ−リジン生産能を有するコリネ型細菌を液体培地に培養し、培養液中にＬ−リジンを生成蓄積させ、これを採取することを特徴とするＬ−リジンの製造法、
を提供するものである。
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明でいうコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌とは、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属に統合された細菌を含み（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255（1981)）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌の例として以下のものが挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
コリネバクテリウム・メラセコーラ
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ１３８７０
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ＡＴＣＣ１５８０６
コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５９９１
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０２０
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１５９９０
コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６５
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１４０２０
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１４０６７
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ＡＴＣＣ１４０６８
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３８６９
ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ１３８２５
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ＡＴＣＣ１４０６６
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２４０
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス ＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９）
本発明のα−ＫＧＤＨ遺伝子は、上記のようなコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌の野生株又はこれらから誘導される変異株の染色体ＤＮＡから、以下のようにして得ることができる。
大腸菌のα−ＫＧＤＨ複合体は、Ｅ１（α-ketoglutarate dehydrogenase:EC 1.2.4.2）、Ｅ２（dihydrolipoamide succinyltransferase:EC 2.3.1.61）、Ｅ３（lipoamide dehydrogenase:1.6.4.3）の３つのサブユニットで構成され、Ｅ１、Ｅ２遺伝子はオペロン構造を成し、Ｅ３はピルビン酸脱水素酵素（pyruvate dehydrogenase:EC 1.2.4.1）と共有していることが知られている。大腸菌のＥ１、Ｅ２遺伝子のヌクレオチド配列は明らかにされている（Eur. J. Biochem., 141, 351（1984)、Eur. J. Biochem., 141, 361（1984)）。
また、枯草菌についても同様に、Ｅ１、Ｅ２遺伝子のヌクレオチド配列が明らかにされている（J. Bacteriol., 171, 3667（1989)、Gene, 61, 217（1987)等）。
そこで、大腸菌と枯草菌のＥ１遺伝子の塩基配列との相同性を利用して、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌由来のα−ＫＧＤＨ遺伝子の単離及びクローン化に本発明者らは成功した。その工程は以下の通りである。
まず、大腸菌と枯草菌のα−ＫＧＤＨ・Ｅ１サブユニット遺伝子間で相同性の高い領域を選び両端の配列からプライマーを合成する。プライマーとしては、塩基組成がランダムでＧ＋Ｃ含量が５０％付近であり、特殊な２次構造を形成せず、互いに相補的でない、との条件を満たすものであればどのような配列でもよい。長さは通常２０ないし３０塩基のものがよく用いられる。具体的に例示すると、配列表配列番号３及び４に示すようなものが挙げられる。
ついで、本プライマーと枯草菌染色体ＤＮＡからポリメラーゼ・チェイン・リアクション法（ＰＣＲ法）により枯草菌α−ＫＧＤＨ遺伝子の一部分から成るプローブを作成する。プローブとしては、２０塩基程度以上の長さであれば用いることが可能であるが、１００塩基程度以上の長さのものであることが望ましい。また、プローブの塩基配列は、目的とする遺伝子の配列と相補的であることが望ましいが、高い相同性を有しているものであれば用いることができる。
一方、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌の染色体ＤＮＡを抽出し、制限酵素により消化して得られたＤＮＡ断片をベクターに連結して組換え体ＤＮＡを作成し、該組換え体ＤＮＡで大腸菌を形質転換する。制限酵素としては、例えば、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ等が用いられ、また、ベクターとしては大腸菌由来のベクター、例えば、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２等が用いられる。作成した組換え体ＤＮＡの受容菌としては、ベクターの複製に好適なものであればいずれの菌株でもよく、例えばＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＤＨ５等の大腸菌菌株が用いられる。
かくして得られる形質転換体の中からコロニー・ハイブリダイゼーションによりプローブＤＮＡとハイブリダイズする株を選択し、当該形質転換体より組換え体ＤＮＡを回収し、ベクターに連結されているコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌染色体ＤＮＡの制限酵素断片の構造を解析する。
得られたＤＮＡ断片は、必ずしも目的とする酵素をコードする遺伝子の全長を含んでいるとは限らない。この場合、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌の染色体ＤＮＡを別の制限酵素で切断し、ベクターに連結して組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡにより形質転換を行い、上記と同様にコロニー・ハイブリダイゼーションによる選択と制限酵素断片の解析を行うことによりα−ＫＧＤＨ遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片を取得することができる。この時、プローブとして初めに取得したＤＮＡ断片を用いることにより、コロニーハイブリダイゼーションをより容易に行うことができる。
α−ＫＧＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、他の適当なベクターに再度組換えてコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌に導入することができる。用いられるベクターは、例えばコリネバクテリウム属細菌で自律複製できるプラスミドである。具体的に例示すれば、ｐＡＭ３３０（特開昭５８−６７６９９号公報）、ｐＨＭ１５１９（特開昭５８−７７８９５号公報）、ｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１、ｐＡＪ１８４４（以上、特開昭５８−１９２９００号公報）、ｐＣＧ１（特開昭５７−１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（特開昭５８−３５１９７号公報）、ｐＣＧ４、ｐＣＧ１１（特開昭５７−１８３７９９号公報）、ｐＨＫ４（特開平５−７４９１号公報）等が挙げられる。
上記ベクターと、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌のα−ＫＧＤＨ遺伝子とを連結して組換え体ＤＮＡを調製するには、あらかじめ制限酵素を用いてベクターを切断する。染色体ＤＮＡを切断するときに用いる制限酵素と同じものにより切断し、又は染色体ＤＮＡ断片の切断面に相補する切断面を生じる制限酵素を用いて切断する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。
各種組換えＤＮＡを受容菌に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行う。例えば、エシェリヒア・コリＫ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（J. Mol. Biol., 53, 159（1970)）があり、枯草菌について報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（C. H. Gene, 1, 153（1977)）がある。あるいは、枯草菌、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラスト又はスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Molec. Gen. Genet., 168, 111（1979)、Nature, 274, 398（1978)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929（1978)）も応用できる。
プロトプラスト法では上記の枯草菌において使用されている方法でも充分高い頻度を得ることができるが、特開昭５７−１８３７９９号公報に開示されるように、コリネバクテリウム属細菌細胞のプロトプラストをポリエチレングリコール又はポリビニルアルコールの一方及び二価金属イオンに接触させた状態でＤＮＡをとり込ませる方法も利用できる。ポリエチレングリコール又はポリビニルアルコールの代りに、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、フィコール、ブルロニックＦ６８（セルバ社製）などの添加によってもＤＮＡのとり込みを促進させることができる。本発明の実施例で用いて形質転換の方法は、電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）である。
このようにして得たコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌由来のα−ＫＧＤＨ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを導入した菌株は、炭素源、窒素源、無機塩類、さらに必要に応じて有機微量栄養素を含有する通常の培地に培養することによりα−ＫＧＤＨ活性を有する酵素を高レベルで菌体内に生成させることができる。
炭素源としては、グルコース、シュクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物などの糖類の他、酢酸、クエン酸などの有機酸類、エタノールなどのアルコール類が使用され、窒素源としては、尿素、アンモニウム塩、アンモニア水、アンモニアガスなどが使用される。無機塩類としては、リン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、マンガン塩などが使用される。有機微量栄養素としては、アミノ酸類、ビタミン類、脂肪酸類、核酸類、その他これらのものを含有するペプトン、酵母エキス、大豆蛋白加水分解物などが使用される。
培養は、温度２５ないし３７℃にてｐＨを５ないし９に制御しつつ、１０ないし４０時間好気的条件下にて行う。
培養終了後、培養液中に生成蓄積したＬ−グルタミン酸を定量するとともに、菌体のα−ＫＧＤＨ活性のレベルを測定する。活性測定は、遠心分離などの操作により培養物から回収した菌体を、超音波処理、フレンチプレス処理などにより破砕した後遠心分離して菌体残渣を除去し、ゲル濾過にて低分子物質を除いたものを用いて、Agric. Biol. Chem., 44, 1897（1980)記載の方法等により行うことができる。
かくして遺伝子が増幅されたコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌と増幅されていない菌について、α−ＫＧＤＨ活性のレベルとＬ−グルタミン酸の生産能の関係を調べた結果、後述の参考例１に示すとおり、遺伝子の増幅によりα−ＫＧＤＨ活性のレベルが上昇した菌ではＬ−グルタミン酸生産能が低下していることが明らかとなった。
本遺伝子の利用としては、薬剤遺伝子の挿入等によるα−ＫＧＤＨ活性欠失株の取得、in vitro変異による活性弱化株の取得、プロモーターの改変による発現低下株の取得等により、従来のコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌と比較してさらにＬ−グルタミン酸生産能が向上した菌株を効率よく育種することが可能となる。
α−ＫＧＤＨ活性が欠失した株の取得は、化学薬剤を用いて変異を誘導する方法でも、遺伝子組換えによる方法でも取得可能である。しかし、化学薬剤による変異誘導法ではα−ＫＧＤＨ活性が低下した株を得ることは比較的容易であるが該活性が完全に欠失した株の取得は困難であり、このような株を取得するには上記のようにして明らかとなったα−ＫＧＤＨ遺伝子の構造を基に、遺伝子相同組換え法により染色体上に存在するα−ＫＧＤＨ遺伝子を改変又は破壊する方法が有利である。相同組換えによる遺伝子破壊は既に確立しており直鎖ＤＮＡを用いる方法や温度感受性プラスミドを用いる方法などが利用できる。
具体的には、部位特異的変異法（Kramer, W. and Frits, H. J., Methods in Enzymology, 154, 350（1987)）や次亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン等の化学薬剤による処理（Shortle, D. and Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 270(1978)）によって、α−ＫＧＤＨ遺伝子のコーディング領域又はプロモーター領域の塩基配列の中に１つ又は複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を起こさせ、このようにして改変又は破壊した遺伝子を染色体上の正常な遺伝子と置換することにより遺伝子産物であるα−ＫＧＤＨの活性を欠失させるかα−ＫＧＤＨ遺伝子の転写を消失させることができる。
部位特異的変異法は、合成オリゴヌクレオチドを用いる方法であり、任意の限定された塩基対だけに、任意の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を導入できる手法である。この方法を利用するには、まず、クローン化され、ＤＮＡ塩基配列が決定されている目的遺伝子を持つプラスミドを変性させて一本鎖を調製する。次に、変異を起こさせたい部分に相補的な合成オリゴヌクレオチドを合成するが、この時合成オリゴヌクレオチドを完全に相補的な配列にせず、任意の塩基置換、欠失、挿入、付加又は逆位を持つようにしておく。この後一本鎖ＤＮＡと任意の塩基置換、欠失、挿入、付加又は逆位を持つ合成オリゴヌクレオチドをアニールさせ、さらにＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントとＴ４リガーゼを用いて完全な２本鎖プラスミドを合成し、これをエシェリヒア・コリのコンピテントセルに導入する。このようにして得られた形質転換体の幾つかは、任意の塩基置換、欠失、挿入、付加又は逆位が固定された遺伝子を含むプラスミドを持っている。遺伝子の変異を導入し、改変又は破壊することができる同様な手法には、リコビナントＰＣＲ法（PCR Technology, Stockton press（1989)）がある。
また、化学薬剤処理を用いる方法は、目的の遺伝子を含むＤＮＡ断片を直接次亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン等で処理することによりＤＮＡ断片中にランダムに塩基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を持つ変異を導入する方法である。
このようにして取得した変異が導入されて改変又は破壊された遺伝子をコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌の染色体上の正常な遺伝子と置換する方法としては、相同性組換えを利用した方法（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press（1972);Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196(1985)）がある。相同性組換えは、染色体上の配列と相同性を有する配列を持つプラスミド等が菌体内に導入されると、ある頻度で相同性を有する配列の箇所で組換えを起こし、導入されたプラスミド全体を染色体上に組み込む。この後さらに染色体上の相同性を有する配列の箇所で組換えを起こすと、再びプラスミドが染色体上から抜け落ちるが、この時組換えを起こす位置により変異が導入された遺伝子の方が染色体上に固定され、元の正常な遺伝子がプラスミドと一緒に染色体上から抜け落ちることもある。このような菌株を選択することにより、塩基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を持つ変異が導入されて改変又は破壊された遺伝子が染色体上の正常な遺伝子と置換された菌株を取得することができる。
かくして得られるα−ＫＧＤＨ活性が欠失したコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌は、α−ＫＧＤＨ活性が部分的に低下した株に比べて特に過剰量のビオチンを含有する培地においてＬ−グルタミン酸生産能が顕著に優れている。
α−ＫＧＤＨ活性が欠失したコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌を用いてＬ−グルタミン酸を生成蓄積させるには、炭素源、窒素源、無機イオン及びその他の栄養素を含有する液体培地に培養する。従来、ビオチンを過剰に含む液体培地中に培養を行う場合にはビオチン作用抑制物質、すなわちペニシリンＧ、Ｆ、Ｋ、Ｏ、Ｖ、Ｘ等のペニシリン類又はシュークロースモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート等の高級脂肪酸もしくはその誘導体より成る界面活性剤を培地に添加することがＬ−グルタミン酸を高収率で生産するために必要であったが、α−ＫＧＤＨ活性が欠失した本発明のコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌を使用する場合、１０乃至１０００μｇ／ｌの高濃度のビオチンを含む液体栄養培地で培養する際においても上記のようなビオチン作用抑制物質の添加を行うことなく高収率、高蓄積でＬ−グルタミン酸を生成蓄積させることができる。
即ち、炭素源としては、グルコース、フラクトース、澱粉糖化液、酢酸等の他、甘藷、甜菜からの糖汁あるいは廃糖蜜等のビオチンを過剰に含有する原料も使用することができる。窒素源としては、通常のＬ−グルタミン酸発酵に用いられるアンモニウム塩、アンモニア水、アンモニアガス、尿素等が用いられ、その他リン酸塩、マグネシウム塩等の無機イオンが必要に応じて適宜使用される。また、必要により、サイアミン等の微量栄養素が適宜培地に添加される。
培養は好気的条件下で行うのがよく、培養温度２４〜４２℃、培養中ｐＨは５〜９に制御するのがよく、ｐＨの調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガス等を使用することができる。
培養液からのＬ−グルタミン酸を採取する方法は、イオン交換樹脂処理、晶析等公知の方法を適宜組み合わせることにより行われる。
なお、Ｌ−グルタミン酸生産性を向上させるには、グルタミン酸生合成系遺伝子を強化することが有利である。グルタミン酸生合成系遺伝子を強化した例としては、解糖系のホスフォフルクトキナーゼ（ＰＦＫ、特開昭６３−１０２６９２号）、アナプレロティック経路のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ、特開昭６０−８７７８８号、特開昭６２−５５０８９号）、ＴＣＡ回路のクエン酸合成酵素（ＣＳ、特開昭６２−２０１５８５号、特開昭６３−１１９６８８号）、アコニット酸ヒドラターゼ（ＡＣＯ、特開昭６２−２９４０８６号）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ、特開昭６２−１６６８９０号、特開昭６３−２１４１８９号）、アミノ化反応としてはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ、特開昭６１−２６８１８５号）等がある。
上記の遺伝子を取得するためには以下に示す様な方法が考えられる。
(1)目的遺伝子に変異が起こり特徴的な形質を示す変異株で、目的遺伝子を導入することによりその形質が消失するような変異株を取得し、その変異株の形質を相補するような遺伝子をコリネ型細菌の染色体から取得する方法。
(2)目的遺伝子が他の生物において既に取得され塩基配列が明らかになっている場合、相同性の高い領域のＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーションの手法により目的の遺伝子を取得する方法。
(3)目的遺伝子の塩基配列がかなり詳細に判明している場合は目的遺伝子を含む遺伝子断片をコリネ型細菌の染色体を鋳型としＰＣＲ法（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション法）により取得する方法。
ここで用いる染色体の取得方法は上記の方法を用いることができる。また、宿主−ベクター系としては、コリネ型細菌で利用可能なものであればよく、上記で述べたものが用いられる。本発明の実施例においては塩基配列が既に明らかになっている場合に有効である上記(3)の方法を用いた。
また、上記(2)及び(3)の方法で遺伝子を取得する場合、目的遺伝子が独自のプロモーターを持たない時にはコリネ型細菌でプロモーター活性を持つＤＮＡ断片を目的遺伝子の上流に挿入することにより目的遺伝子を発現させることができる。目的遺伝子の発現を強化するには、強力なプロモーターの下流に目的遺伝子を連結することが考えられる。コリネ型細菌の細胞内で機能するプロモーターのうち強力なものとしては、大腸菌のｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター等がある（Y.Morinaga,M.Tsuchiya,K.Miwa and K.Sano,J.Biotech.,5,305-312(1987)）。また、コリネバクテリウム属細菌のｔｒｐプロモーターも好適なプロモーターである（特開昭６２−１９５２９４号公報）。本発明の実施例においては、ＰＥＰＣ遺伝子の発現にコリネ型細菌のｔｒｐプロモーターを用いた。
また、本発明のα−ＫＧＤＨ遺伝子の増幅は、Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型細菌において、その生産能を向上させる上で有用である。
従来より種々の人工変異株がＬ−リジン生産菌として用いられており、これらを宿主として本発明の組換えＤＮＡを保有させることによりそのＬ−リジン生産能を向上させることができる。このような人工変異株としては次のようなものがある。Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン（以下、「ＡＥＣ」と略記する）耐性変異株、その生育にＬ−ホモセリンのようなアミノ酸を必要とする変異株（特公昭４８−２８０７８号、特公昭５６−６４９９号）、ＡＥＣに耐性を示し、更にＬ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン等のアミノ酸を要求する変異株（米国特許第３７０８３９５号及び第３８２５４７２号）、ＤＬ−α−アミノ−εカプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸アナログ、サルファ剤、キノイド、Ｎ−ラウロイルロイシンに耐性を示すＬ−リジン生産変異株、オキザロ酢酸脱炭酸酵素または呼吸系酵素阻害剤に耐性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭５０−５３５８８号、特開昭５０−３１０９３号、特開昭５２−１０２４９８号、特開昭５３−９３９４号、特開昭５３−８６０８９号、特開昭５５−９７８３号、特開昭５５−９７５９号、特開昭５６−３２９９５号、特開昭５６−３９７７８号、特公昭５３−４３５９１号、特公昭５３−１８３３号）、イノシトールまたは酢酸を要求するＬ−リジン生産変異株（特開昭５５−９７８４号、特開昭５６−８６９２号）、フルオロピルビン酸または３４℃以上の温度に対して感受性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭５５−９７８３号、特開昭５３−８６０９０号）、エチレングリコールに耐性を示し、Ｌ−リジンを生産するブレビバクテリウムまたはコリネバクテリウムの変異株（米国特許第４４１１９９７号参照）等。
具体的には、以下のような株を例示することができる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１２０３１（ＦＥＲＭ−ＢＰ２７７、特開昭６０−６２９９４号公報）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ３９１３４（特開昭６０−６２９９４号公報）
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＪ３４６３（ＦＥＲＭ−Ｐ１９８７、特公昭５１−３４４７７号公報）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１２４３５（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２９４、米国特許第5,304,476号）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１２５９２（ＦＥＲＭ ＢＰ−３２３９、米国特許第5,304,476号）
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＪ１２５９６（ＦＥＲＭ ＢＰ−３２４２、米国特許第5,304,476号）
このようなＬ−リジン生産菌にα−ＫＧＤＨ遺伝子を導入するには、既に述べたように適当なベクターと連結して行えばよい。
使用するＬ−リジン生産用の培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培地である。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースや澱粉加水分解物などの糖類、エタノールやイノシトールなどのアルコール類、酢酸、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。有機微量栄養素としては、ビタミンＢ1などの要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有させることが望ましい。
培養は好気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培養温度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜８．５に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
発酵液からのＬ−リジンの採取は通常イオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【図面の簡単な説明】
図１は、α−ＫＧＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵素地図である。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。なお、制限酵素は市販品（宝酒造社製）を用いた。
実施例１ α−ＫＧＤＨ遺伝子の単離及び構造決定
（１）プローブの調製
大腸菌と枯草菌のα−ＫＧＤＨ・Ｅ１サブユニット遺伝子間で相同性の高い領域を選び、配列表配列番号３及び４に示すオリゴヌクレオチドをホスホアミダイド法によりＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシステム社製モデル３９４）を用いて合成した。
プライマーとして該オリゴヌクレオチド０．２５μｍｏｌｅ、鋳型として常法によって調製したバチルス ズブチリス ＮＡ６４（同株はバチルス・ジェネテイック・ストック・センター（米国オハイオ州立大学）より入手した）の染色体ＤＮＡ０．１μｇ及びタックＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）２．５ユニットをｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各２００μＭ、塩化カリウム５０ｍＭ、塩化マグネシウム１．５ｍＭ及びゼラチン０．０００１％を含有する１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）０．１ｍｌに添加し、９４℃を１分、５５℃を２分、７２℃を３分のサイクルを３０回繰り返すＰＣＲ法を行った。反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、目的とするＤＮＡ断片をグラスパウダー（宝酒造社製）を用いて回収した。このＤＮＡ断片をクレノウフラグメント（アマシャム社製）と[α−32Ｐ]ｄＣＴＰ（アマシャム社製）を用いたラベル化の常法に従って標識し、プローブとして用いた。
（２）ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡ断片の調製
バクト・トリプトン（ディフコ社製）１％、バクト・イーストエキストラクト（ディフコ社製）０．５％及び塩化ナトリウム０．５％から成るＴ−Ｙ培地（ｐＨ７．２）５００ｍｌに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９を接種し、３１．５℃で６時間培養し培養物を得た。この培養物を５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離処理し沈澱物として湿菌体２ｇを得た。
該菌体から斉藤、三浦の方法（Biochem. Biophys. Acta., 72, 619,（1963)）により染色体ＤＮＡを抽出した。この染色体ＤＮＡ２μｇ及び制限酵素ＥｃｏＲＩ２００ユニットを１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び１ｍＭジチオスレイトールを含有する５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）におのおの混合し、温度３７℃で１５時間反応させた。反応終了液を常法によりフェノール抽出処理し、エタノール沈澱処理してＥｃｏＲＩで消化されたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡ断片を得た。
（３）ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９のα−ＫＧＤＨ遺伝子の単離
プラスミドベクターｐＵＣ１８（宝酒造社製）１μｇ及び制限酵素ＥｃｏＲＩ２０ユニットを１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び１ｍＭジチオスレイトールを含有する５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に混合し、温度３７℃で２時間反応させて消化液を得、該液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱した。この後、プラスミドベクター由来のＤＮＡ断片が再結合するのを防止するため、Molecular Cloning 2nd edition（J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, pl.60（1989)）の方法でバクテリアル・アルカリフォスファターゼ処理によりＤＮＡ断片の脱リン酸化を行い、常法によりフェノール抽出処理し、エタノール沈澱を行なった。
このＥｃｏＲＩで消化されたｐＵＣ１８を０．１μｇ、（２）で得られたＥｃｏＲＩで消化されたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡ断片１μｇ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ユニット（宝酒造社製）を６．６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール及び１０ｍＭアデノシン三リン酸を含有する６６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加し、温度１６℃で８時間反応し、ＤＮＡを連結させた。次いで該ＤＮＡ混合物で、常法によりエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換し、これを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ寒天培地上にまき、約１０，０００個の形質転換体を得た。
得られた形質転換体から、Molecular Cloning 2nd edition（J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, pl.90（1989)）の方法により、（１）で得られたプローブＤＮＡとハイブリダイズする形質転換体を選択した。
（４）ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９のα−ＫＧＤＨ遺伝子の塩基配列の決定
（３）により得られた形質転換体からMolecular Cloning 2nd edition（J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, pl.25(1989)）記載のアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製した。該プラスミドＤＮＡはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡ由来の約６キロベースのＤＮＡ断片を含んでいた。該プラスミドを（３）の反応組成で制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで切断し、常法に従いアガロースゲル電気泳動を行い（３）と同様にしてサザンハイブリダイゼーションを行いプローブＤＮＡとハイブリダイズする断片を同定した。その結果、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩに切断された約３キロベースの切断断片がハイブリダイズすることが判明した。該ＤＮＡ断片を（３）で行ったようにＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで切断したプラスミドベクターｐＨＳＧ３９７（宝酒造社製）に連結しクローン化した。得られたプラスミドＤＮＡを用いて該ＤＮＡ断片の塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定は、Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオケミカル社製）を用いSangerの方法（J. Mol. Biol., 143, 161（1980)）に従って行った。
得られたＤＮＡ断片は完全なオープン・リーデイング・フレームを含んでいなかったため、（３）で行ったようにブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡをＸｈｏＩで切断しｐＨＳＧ３９７に連結した組換え体プラスミドで形質転換を行い、（２）で得られたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡ由来の約３キロベースのＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ切断断片を（１）の方法に従いラベル化したものをプローブとしてハイブリダイズする形質転換体を選択した。得られた形質転換体の有するプラスミドは約９キロベースのＤＮＡ断片を含んでいた。このＤＮＡ断片を含む遺伝子の制限酵素地図を図１に示した。該プラスミドを（３）の反応組成で制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩで切断し、常法に従いアガロースゲル電気泳動を行い（３）の方法によりハイブリダイズする断片を同定した結果、約４．４キロベースの断片であることが判明した。該ＤＮＡ断片を（３）で行ったようにＳａｌＩ及びＸｈｏＩで切断したプラスミドベクターｐＨＳＧ３９７に連結しクローン化した。このプラスミドをｐＳＨＧＳ−Ｘと命名した。該プラスミドが含むＳａｌＩ及びＸｈｏＩ切断断片中ＳａｌＩ切断点からＥｃｏＲＩ切断点までの約１．４キロベースのＤＮＡ断片の塩基配列の決定を上記と同様にして行った。
こうして得られたＳａｌＩ及びＸｈｏＩ切断遺伝子断片の塩基配列は配列表配列番号１に示す通りである。オープン・リーデイング・フレームを推定し、その塩基配列より推定される産物のアミノ酸配列を配列表配列番号１及び配列番号２に示した。すなわち、配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列から成る蛋白質をコードする遺伝子が、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９のα−ＫＧＤＨ遺伝子である。なお、蛋白質のＮ末端にあるメチオニン残基は開始コドンであるＡＴＧに由来するため蛋白質本来の機能とは無関係であることが多く、翻訳後ペプチダーゼの働きにより除去されることがよく知られており、上記蛋白質の場合にもメチオニン残基の除去が生じている可能性がある。
塩基配列、アミノ酸配列おのおのについて既知の配列との相同性比較を行った。用いたデータベースはＥＭＢＬ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴである。その結果、配列表配列番号１に示されるＤＮＡ及びそれにコードされる蛋白質は、既に報告済みの大腸菌及び枯草菌のα−ＫＧＤＨ・Ｅ１サブユニット遺伝子等と相同性を持つコリネ型細菌では新規な遺伝子及び蛋白質であることが判明した。
本遺伝子のコードする蛋白質は、Ｎ末端のメチオニン残基を含めて１，２５７個のアミノ酸から成り、既に報告のあるα−ＫＧＤＨとは大きく異なる特徴を有していた。すなわち、Ｃ末端側の約９００アミノ酸は種々のＥ１サブユニットと高い相同性を示したが、Ｎ末端側の３００アミノ酸は他種α−ＫＧＤＨには見られないものであり、本蛋白質が特殊な機能を持つことを示唆するものである。このＮ末端側３００アミノ酸部分を既知の配列との相同性比較を行うと大腸菌やアゾトバクター属細菌のＥ２サブユニットとの相同性が認められた。これは、本蛋白質が他種α−ＫＧＤＨとは異なり、Ｅ１、Ｅ２両方の活性を持つ可能性を示唆するものである。
また、本遺伝子オープン・リーデイング・フレーム上流には大腸菌に見られるプロモーター共通配列に類似した配列（281-286及び307-312）及びコリネ型細菌のリボゾーム結合配列と類似した配列（422-428）が見いだされた。本遺伝子オープン・リーデイング・フレーム下流には、転写の終結シグナルと類似したステム＆ループ構造（4243-4281）がみられた。これらの配列は本遺伝子が独立して転写、翻訳を受けており、他種α−ＫＧＤＨとは異なった遺伝子構造を持っていることを示唆するものである。
実施例２ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９由来のα−ＫＧＤＨ遺伝子の発現によるα−ＫＧＤＨ活性の増幅
（１）α−ＫＧＤＨ遺伝子のブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９及びＡＪ１１０６０への導入
実施例１で得られたｐＨＳＧＳ−ＸプラスミドＤＮＡ１μｇ、制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩそれぞれ２０ユニットを実施例１（３）に記載した緩衝液中で混合し、温度３７℃で３時間反応した。一方、ブレビバクテリウム属細菌内で自律複製可能なプラスミドｐＰＫ４（特開平５−７４９１号公報参照）ＤＮＡ１μｇと２０ユニットのＳａｌＩを実施例１（３）に記載した緩衝液中で混合し、温度３７℃で３時間反応した。両反応液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱した。この後、プラスミドベクター由来のＤＮＡ断片が再結合するのを防止するため、実施例１（３）の方法でバクテリアル・アルカリフォスファターゼ処理によりＤＮＡ断片の脱リン酸化を行い、常法によりフェノール抽出処理し、エタノール沈澱を行なった。このＳａｌＩで消化されたｐＰＫ４を０．１μｇ、上記で得られたＳａｌＩ及びＸｈｏＩで消化されたｐＨＳＧＳ−ＸプラスミドＤＮＡ０．５μｇ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）１ユニットを実施例１（３）記載の緩衝液中で混合し、温度１６℃で８時間反応し、ＤＮＡを連結させた。次いで該ＤＮＡ混合物を電気パルス法を用いた形質転換の常法（特開平２−２０７７９１号公報）に従い、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１１０６０（特公昭５９−１０７９７号公報）に導入した。これをポリペプトン１％、酵母エキス１％、塩化ナトリウム０．５％、グルコース０．５％及びカナマイシン２５μｇ／ｍｌから成る寒天培地上にまき、形質転換体ＡＪ１１０６０／ｐＰＫＳ−Ｘを得た。本形質転換体は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１２９９９と命名され、平成６年６月３日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４３４９で寄託され、平成７年６月２日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５１２３が付与されている。
得られた形質転換体から実施例１（４）に従ってプラスミドＤＮＡを抽出し、常法に従ってアガロースゲル電気泳動を行うことにより、プラスミドｐＰＫ４にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９由来のＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片が結合した組換え体ＤＮＡを選択した。該プラスミドをｐＰＫＳ−Ｘと命名した。
また、同様にしてブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９を宿主として形質転換体ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＰＫＳ−Ｘを取得した。
（２）α−ＫＧＤＨ遺伝子増幅株の酵素活性
（１）で得られたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１１０６０／ｐＰＫＳ−Ｘ及びＡＴＣＣ１３８６９／ｐＰＫＳ−Ｘをグルコース８％、リン酸２水素カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．００４％、硫酸アンモニウム３％、硫酸第一鉄０．００１％、硫酸マンガン０．００１％、大豆加水分解液０．０５％、ビタミンＢ1２００μｇ／ｌ、ビチオン３００μｇ／ｌ、炭酸カルシウム５％及びカナマイシン２５ｍｇ／ｌから成る培地（ｐＨ８．０）５０ｍｌに接種し、３１．５℃で１８時間培養した。該培養液を常法に従って遠心分離し、菌体を集めた。
この菌体を０．２％塩化カリウム水溶液で懸濁し、遠心分離する操作を２回繰り返し菌体を洗浄した。該菌体を３０％グリセロールを含むＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルフォン酸（以下ＴＥＳ）０．１Ｍ緩衝液（ｐＨ７．７）に懸濁し、超音波処理した後、１５，０００ｒｐｍ、３０分遠心分離して上清を得た。この細胞破砕液をセファデクスＧ−２５（Pharmacia社製）カラムクロマトグラフィーに供し、低分子量物質を除いたものを粗酵素液とした。
得られた粗酵素液のα−ＫＧＤＨ活性をAgric. Biol. Chem., 44. 1897（1980）記載の反応組成物を用いて３−アセチルピリジン・アデニン・ジヌクレオチドの３６５ｎｍの吸光度の上昇を測定した。また、粗酵素液の蛋白質濃度はウシ血清アルブミンを標準としてバイオ・ラッド社製キットを用いて測定し、酵素の比活性を算出した。対照として、プラスミドｐＰＫ４で同様に形質転換して得たＡＪ１１０６０／ｐＰＫ４及びＡＴＣＣ１３８６９／ｐＰＫ４の比活性を求めた。その結果を表１に示した。ＡＪ１１０６０／ｐＰＫＳ−ＸとＡＴＣＣ１３８６９／ｐＰＫＳ−ＸはそれぞれＡＪ１１０６０／ｐＰＫ４とＡＴＣＣ１３８６９／ｐＰＫ４の２倍もしくはそれ以上の比活性を有しており、この結果から取得した遺伝子断片がα−ＫＧＤＨ活性を有する酵素をコードしていることが示された。
参考例１ α−ＫＧＤＨ活性とＬ−グルタミン酸生産能との関係
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１１０６０／ｐＰＫ４及びＡＪ１１０６０／ｐＰＫＳ−ＸをＬ−グルタミン酸生産培地に培養し、培養液中に生成蓄積したＬ−グルタミン酸を測定した。培養は界面活性剤を添加する方法で以下の様に行った。
グルコース８％、リン酸２水素カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０４％、硫酸アンモニウム３％、硫酸第一鉄０．００１％、硫酸マンガン０．００１％、大豆加水分解液１．５％、サイアミン塩酸塩２００μｇ／ｌ、ビオチン３００μｇ／ｌ、カナマイシン２５ｍｇ／ｌ及びＣａＣＯ3（別殺菌）５％から成る生産培地（ｐＨ８．０）２０ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに分注し加熱殺菌した。これにあらかじめＡＪ１１０６０／ｐＰＫ４及びＡＪ１１０６０／ｐＰＫＳ−Ｘのそれぞれをポリペプトン（日本製薬社製）１％、バクト・イーストエキストラクト（ディフコ社製）１％、塩化ナトリウム０．５％、グルコース０．５％及びカナマイシン２５ｍｇ／ｌから成る平板培地（ｐＨ７．２）にて培養して得た菌体を接種し、３１．５℃にて１８時間振とう培養し、種培養を得た。
ついで、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ４０：シグマ社製）を３ｇ／ｌ添加した生産培地又は添加していない生産培地に得られた種培養をそれぞれ５％量接種し、同様にして３１．５℃にて約２０時間振とう培養した。
培養終了後、培養液中のＬ−グルタミン酸蓄積量及び残グルコース濃度を旭化成社製バイオテックアナライザーＡＳ−２１０を用いて測定した。菌体増殖量は、０．０２規定塩酸で培養物を５１倍希釈した液の６２０ｎｍにおける吸光度を測定することにより求めた。その結果を表２に示す。
参考例２ ペニシリン添加法によるＬ−グルタミン酸生産能の比較
α−ＫＧＤＨ遺伝子増幅のＬ−グルタミン酸生成に及ぼす効果をペニシリン添加法により調べた。
参考例１と同様に種培養を調製し、０．４ユニット／ｍｌのペニシリンを添加した生産培地又は添加しない生産培地に、菌体乾燥重量で約２％になる様に種培養をそれぞれ接種し、３１．５℃にて約２５時間振とう培養を行った。
培養終了後、培養液中のＬ−グルタミン酸蓄積量及び残グルコース濃度を参考例１と同様に測定した。結果を表３に示した。この結果は、α−ＫＧＤＨ活性のレベルがペニシリン添加によるＬ−グルタミン酸生産においても大きな影響を及ぼすことを示すものである。
α−ＫＧＤＨ遺伝子増幅によりＬ−グルタミン酸生成が抑制されたことから、逆にα−ＫＧＤＨ遺伝子を破壊する事によりグルタミン酸収率を向上させることが期待された。遺伝子破壊株は、特開平５−７４９１号に示される温度感受性プラスミドを用いた相同組換え法により取得した。具体的には、α−ＫＧＤＨ遺伝子内には配列表配列番号１の1340番目と3266番目の２箇所にＫｐｎＩで消化される部位が存在する。そこで、実施例１で得られたｐＨＳＧＳ−ＸをＫｐｎＩで部分消化したのち自己結合させ、ＫｐｎＩ断片の1926塩基対を欠失したプラスミドｐＨＳＧＳ−Ｘ△Ｋを作成した。ｐＨＳＧＳ−Ｘ△Ｋ上のα−ＫＧＤＨ遺伝子は中央部分を欠失した構造になっている。次にｐＨＳＧＳ−Ｘ△ＫのＢａｍＨＩ認識部位に、コリネ型細菌で自己複製可能なプラスミドから取得した自己複製能が温度感受性になった変異型の複製起点を導入し、プラスミドｐＢＴＳ−ＸΔＫを作成した。具体的には、コリネ型細菌で自己複製可能なプラスミドから取得した自己複製能が温度感受性になった変異型の複製起点を持つプラスミドｐＨＳＣ４（特開平５−７４９１号）を制限酵素ＫｐｎＩで消化し、ＤＮＡ平滑末端化キット（宝酒造社製、Blunting kit）を用い平滑末端化した後、ＢａｍＨＩリンカー（宝酒造社製）を結合させた後自己結合させて得たプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、自己複製能が温度感受性になった変異型の複製起点を含む遺伝子断片を取得し、これをｐＨＳＧＳ−Ｘ△ＫのＢａｍＨＩ部位に挿入しプラスミドpＢＴＳ−ＸΔＫを取得した。
このプラスミドをコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌の野生株であるブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９に電気パルス法（特開平２−２０７７９１号）を用いて導入し、特開平５−７４９１号の方法で染色体上のα−ＫＧＤＨ遺伝子を欠失型に置換した。具体的には、プラスミドが導入されたＡＴＣＣ１３８６９／ｐＢＴＳ−ＸΔＫをＣＭ２Ｇ（ポリペプトン１％、酵母エキス１％、塩化ナトリウム０．５％、グルコース０．５％、ｐＨ７．２）液体培地で２５℃にて６時間振とう培養した後、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｇ寒天培地上に撒き、３４℃で培養して形成したコロニーをプラスミド組み込み株として取得した。次に、この株から３４℃でクロラムフェニコールに対して感受性になった株をレプリカ法により取得した。この感受性株から染色体上のα−ＫＧＤＨ遺伝子の塩基配列を調べ、α−ＫＧＤＨ遺伝子が欠失型に置換されていることを確認し、これをΔＳ株と命名した。ΔＳ株のα−ＫＧＤＨ活性を実施例２に記した方法により測定したところ、活性は全く検出されなかった。
実施例４ ｇｄｈ、ｇｌｔＡ及びｉｃｄ遺伝子増幅用プラスミドの作製
（１）ｇｄｈ、ｇｌｔＡ及びｉｃｄ遺伝子のクローニング
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのｇｄｈ、ｇｌｔＡ及びｉｃｄ遺伝子をＰＣＲ法でクローニングした。ＰＣＲ法に用いるプライマーは、既に報告されているコリネバクテリウム・グルタミカムのｇｄｈ遺伝子（Molecular Microbiology, 6(3), 317-326（1992)）、ｇｌｔＡ遺伝子（Miclobiology, 140, 1817-1828（1994)）及びｉｃｄ遺伝子（J. Bacteriol.（1995),177,774-782）の配列をもとに合成した。ｇｄｈ遺伝子の増幅用のプライマーとしては、配列表配列番号５（５′側）と配列番号６（３′側）に示すオリゴヌクレオチド、ｇｌｔＡ遺伝子増幅用プライマーとしては、配列番号７（５′側）と配列番号８（３′側）に示すオリゴヌクレオチド、ｉｃｄ遺伝子増幅用プライマーとしては、配列番号９（５′側）と配列番号１０（３′側）に示すオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成し使用した。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９から実施例１の方法により染色体ＤＮＡを調製し、これを鋳型とし上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いＰＣＲ法を行った。得られた増幅産物の両末端を市販のＤＮＡ末端平滑化キット（宝酒造社製、Blunting kit）を用い平滑末端化した後、ベクタープラスミドpＨＳＧ３９９（宝酒造社製）のＳｍａＩ部位にそれぞれクローニングし、プラスミドpＨＳＧ−ｇｄｈ、pＨＳＧ−ｇｌｔＡ及びpＨＳＧ−ｉｃｄを得た。
（２）ｐｐｃ遺伝子のクローニングと発現
実施例１の方法によりブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを調製し、これを鋳型としてＰＥＰＣをコードするｐｐｃ遺伝子を含む約3.4KbpのＤＮＡ断片をＰＣＲ法を用いて取得した。ＰＣＲ法に用いるプライマーは、既に報告されているコリネバクテリウム・グルタミカムのｐｐｃ遺伝子の配列（Gene, 77, 237-251（1989)）をもとに合成し、ＰＣＲ反応は上記と同様にして行った。プライマーの配列を配列番号１１（５′側）と配列番号１２（３′側）に示す。
ＰＣＲ反応の増幅産物を制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造社製）を用いて消化し、プラスミドｐＨＳＧ３９９のＳａｌＩ部位に挿入したプラスミドｐＨＳＧ−ｐｐｃ′を取得した。ｐＨＳＧ−ｐｐｃ′のＰＥＰＣ遺伝子はｐＨＳＧ３９９のｌａｃプロモーターと逆向きに挿入されている。
次に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムで機能するプロモーターとして知られているトリプトファンオペロンのプロモーター（Gene, 53, 191-200（1987)）をｐＨＳＧ−ｐｐｃ′上のｐｐｃ遺伝子の上流に挿入した。このプロモーターは配列表配列番号１３に示す51塩基からなる配列で活性を示すことが知られている。このプロモーター活性を持つ51塩基対を含み、かつ両端が制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｂａＩによる切断断片と一致するような２本鎖ＤＮＡが得られる様に、配列番号１３に示す配列を持つヌクレオチド鎖及びこれの相補鎖となる配列番号１４の配列を持つヌクレオチド鎖を合成した。
合成した両ＤＮＡを約10pmol/μlずつの濃度になるように混合し、100℃、10分加熱した後、室温で放冷しアニーリングさせた。ｐＨＳＧ−ｐｐｃ′を制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｂａＩ（宝酒造社製）により消化し、上記のプロモーターと結合させた。結合反応は宝酒造社製ライゲーションキットを用いて行った。これにより、ｐｐｃ遺伝子の上流にトリプトファンオペロンのプロモーターが１コピー挿入されたプラスミドｐＨＳＧ−ｐｐｃを得た。
（３）ｇｄｈ、ｇｌｔＡ及びｉｃｄの３種類の遺伝子を連結したプラスミドの作製
ｇｄｈ、ｇｌｔＡ及びｉｃｄの３種類の遺伝子を連結したプラスミドを作製した。具体的には、プラスミドpＨＳＧ−ｇｄｈを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、市販のＤＮＡ末端平滑化キット（宝酒造社製、Blunting kit）を用い平滑末端化したものに上記の両末端を平滑末端化したｇｌｔＡ遺伝子のＰＣＲ増幅産物を連結し、プラスミドｐＨＳＧ−ｇｄｈ＋ｇｌｔＡを取得した。更に、プラスミドｐＨＳＧ−ｇｄｈ＋ｇｌｔＡを制限酵素ＫｐｎＩで消化し、同様にして平滑末端化したものに上記の両末端を平滑末端化したｉｃｄ遺伝子のＰＣＲ増幅産物を連結し、プラスミドｐＨＳＧ−ｇｄｈ＋ｇｌｔＡ＋ｉｃｄを取得した。
（４）ｇｄｈ、ｇｌｔＡ及びｐｐｃの３種類の遺伝子を連結したプラスミドの作製
ｇｄｈ、ｇｌｔＡ及びｐｐｃの３種類の遺伝子を連結したプラスミドを作製した。具体的にはプラスミドｐＨＳＧ−ｇｄｈ＋ｇｌｔＡを制限酵素ＫｐｎＩで消化し、プラスミドｐＨＳＧ−ｐｐｃを制限酵素ＫｐｎＩ及びＳａｌＩで消化し、上流にトリプトファンオペロンのプロモーターを持つｐｐｃ遺伝子断片を取得し、得られた断片をＤＮＡ平滑末端化キット（宝酒造社製、Blunting kit）を用い平滑末端化した後、ＫｐｎＩリンカー（宝酒造社製）を用いてプラスミドｐＨＳＧ−ｇｄｈ＋ｇｌｔＡのＫｐｎＩ部位に挿入し、プラスミドｐＨＳＧ−ｇｄｈ＋ｇｌｔＡ＋ｐｐｃを取得した。
（５）上記プラスミドへのコリネバクテリウムでの複製起点の導入
pＨＳＧ−ｇｄｈ、pＨＳＧ−ｇｌｔＡ、pＨＳＧ−ｐｐｃ、pＨＳＧ−ｉｃｄ、ｐＨＳＧ−ｇｄｈ＋ｇｌｔＡ＋ｉｃｄ及びｐＨＳＧ−ｇｄｈ＋ｇｌｔＡ＋ｐｐｃをコリネ型細菌細胞内で自律複製可能にするために、既に取得されているコリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドｐＨＭ１５１９（Agric. Biol. Chem., 48 2901-2903（1984)）由来の複製起点（特開平５−７４９１号）をpＨＳＧ−ｇｄｈ、pＨＳＧ−ｇｌｔＡ、pＨＳＧ−ｐｐｃ、pＨＳＧ−ｉｃｄ、ｐＨＳＧ−ｇｄｈ＋ｇｌｔＡ＋ｉｃｄ及びｐＨＳＧ−ｇｄｈ＋ｇｌｔＡ＋ｐｐｃに導入した。具体的には、ｐＨＭ１５１９由来の複製起点を持つプラスミドｐＨＫ４（特開平５−７４９１号）を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで消化し、複製起点を含む遺伝子断片を取得し、得られた断片をＤＮＡ平滑末端化キット（宝酒造社製、Blunting kit）を用い平滑末端化した後、ＫｐｎＩリンカー（宝酒造社製）を用いてpＨＳＧ−ｇｄｈ、pＨＳＧ−ｇｌｔＡ、pＨＳＧ−ｐｐｃ及びpＨＳＧ−ｉｃｄのＫｐｎＩ部位にそれぞれ挿入し、ｐＧＤＨ、ｐＧＬＴＡ、ｐＰＰＣ及びｐＩＣＤを取得した。また、ｐＨＳＧ−ｇｄｈ＋ｇｌｔＡ＋ｉｃｄ及びｐＨＳＧ−ｇｄｈ＋ｇｌｔＡ＋ｐｐｃには、そのＳａｌＩ部位に同様にＳａｌＩリンカー（宝酒造社製）を用い、ｐＨＭ１５１９由来の複製起点をそれぞれ挿入し、ｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＩＣＤ及びｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＰＰＣを取得した。更に、対照として、これらの遺伝子を持たないプラスミドｐＨＳＧ３９９を用い、そのＳａｌＩ部位に同様にＳａｌlリンカー（宝酒造社製）を用い、pHM1519由来の複製起点を挿入したｐＳＡＣ４も作成した。
実施例７ ｐＧＤＨ、ｐＧＬＴＡ、ｐＰＰＣ、ｐＩＣＤ、ｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＩＣＤ及びｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＰＰＣ上の各遺伝子の発現の確認
ｐＧＤＨ、ｐＧＬＴＡ、ｐＰＰＣ、ｐＩＣＤ、ｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＩＣＤ及びｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＰＰＣ上の各遺伝子がブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの細胞内で発現し、これらのプラスミドが遺伝子増幅の機能を果たしていることの確認を行った。具体的には、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９に、電気パルス法（特開平２−２０７７９１号）によりそれぞれのプラスミドを導入した。得られた形質転換体は４μg/mlのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｇプレート培地（ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、グルコー５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ及び寒天１５ｇを純水１ｌに含む。ｐＨ７．２）にて選択した。得られた形質転換体をＣＭ２Ｇ寒天培地上にて培養し、グルコース８０ｇ、ＫＨ2ＰＯ4１ｇ、ＭｇＳＯ4０．４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4３０ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ、大豆加水分解液１５ｍｌ、サイアミン塩酸塩２００μｇ、ビオチン３００μｇ及びＣａＣＯ3５０ｇを純水１ｌ中に含む培地（ＫＯＨを用いてｐＨは８．０に調整されている）に接種し、３１．５℃にて１６時間培養した。該培養液を常法に従って遠心分離し、菌体を集めた。
菌体を破砕して得た粗抽出液を用いて、ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＧＤＨ、ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＩＣＤ及びＡＴＣＣ１３８６９／ｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＰＰＣのＧＤＨ活性をMolecular Microbiology, 6(3), 317-326（1992）記載の方法に従い測定したところ、これらの形質転換体では、各々、対照のＡＴＣＣ１３８６９／ｐＳＡＣ４に比べて約１３倍のＧＤＨ活性を有することが分かった（表４）。また、ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＧＬＴＡ及びＡＴＣＣ１３８６９／ＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＩＣＤ及びＡＴＣＣ１３８６９／ｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＰＰＣのＣＳ活性は、Miclobiology, 140, 1817-1828（1994)に、ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＩＣＤ及びＡＴＣＣ１３８６９／ＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＩＣＤのＩＣＤＨ活性は、J.Bacteriol., 177, 774-782（1995)に、ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＰＰＣ及びＡＴＣＣ１３８６９／ｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＰＰＣのＰＥＰＣ活性はGene, 77, 237-251（1989)に記載された方法に従って測定した。測定結果を表５〜７に示す。いずれの形質転換体も目的の酵素について、対照のＡＴＣＣ１３８６９／ｐＳＡＣ４に比べて約２〜２０倍の活性を有することが分かった。このことから、ｐＧＤＨ、ｐＧＬＴＡ、ｐＰＰＣ、ｐＩＣＤ、ｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＩＣＤ及びｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＰＰＣ上の各遺伝子はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム細胞内で発現しその機能を果たしていることが確認された。
（１）ΔＳ株のジャーファーメンターを用いたＬ−グルタミン酸生産評価
グルコース６０ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4 ０．４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ３０ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ、大豆加水分解液１５ｍｌ、サイアミン塩酸塩２００μｇ及びビオチン４５０μｇを純水１ｌ中に含む培地３００ｍｌを１ｌ容ジャーファーメンターに入れ加熱殺菌した。これにＣＭ２Ｇ寒天培地上にて培養して得たΔＳ株の菌体を接種し、３１．５℃にて、ｐＨをアンモニアガスで７．０、７．２又は７．５に制御しながら３０時間培養した。
培養終了後、菌体濃度及び培地中に蓄積されたＬ−グルタミン酸の量を測定した。Ｌ−グルタミン酸の定量には、旭化成（株）製バイオテックアナライザーＡＳ−２１０を使用し、菌体濃度は、純水で５１倍に希釈した培養液の６６０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ660）により測定した。結果を表８に示す。
（２）ΔＳ株と、ｇｄｈ、ｇｌｔＡ、ｐｐｃ及びｉｃｄ遺伝子を増幅したΔＳ株のＬ−グルタミン酸生産のジャーファーメンターを用いた培養による評価
ΔＳ株に上記の様にして作製したｐＧＤＨ、ｐＧＬＴＡ、ｐＰＰＣ、ｐＩＣＤ、ｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＩＣＤ又はｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＰＰＣを導入し、それぞれのプラスミドが導入された形質転換体のＬ−グルタミン酸生産性を評価した。ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム細胞へのプラスミドの導入は電気パルス法（特開平２−２０７７９１号）により行った。得られた形質転換体は４μg/mlのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｇプレート培地（ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、グルコース５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ及び寒天１５ｇを純水１ｌに含む。ｐＨ７．２）にて選択した。
ΔＳ株と、得られた形質転換体のＬ−グルタミン酸の生産性の評価は、上記（１）と同様にして行った。培養後の菌体濃度、及び培地中に蓄積されたＬ−グルタミン酸の量を上記と同様に測定した。結果を表９に示す。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９から変異誘導されたＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システインに耐性を示し、Ｌ−リジン生成能を有するブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１２４３５（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２９４）に上記の様にして作成したｐＰＫＳ−ＸとｐＰＫ４とをそれぞれ導入しそのＬ−リジン生産性を評価した。プラスミドの導入は電気パルス法（特開平２−２０７７９１号）を用いた。形質転換体は２５mg/ｌのカナマイシンを含むＣＭ２Ｇプレート培地（ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、グルコース５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、寒天１５ｇを純水１ｌに含む。ｐＨ７．２）にて選択した。
Ｌ−リジンの生産性の評価は以下の様にして行った。グルコース１００ｇ、ＫＨ2ＰＯ4１ｇ、ＭｇＳＯ4 ０．４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ３０ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ、大豆加水分解液１５ｍｌ、サイアミン塩酸塩２００μｇ、ビオチン３００μｇ、カナマイシン２５ｍｇ及びＣａＣＯ3 ５０ｇを純水１ｌ中に含む培地（ＫＯＨを用いてｐＨは７．０に調整されている）を５００ｍｌ容フラスコに２０ｍｌずつ分注し、加熱殺菌した。これに２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＣＭ２Ｇプレート培地にて培養して得たＡＪ１２４３５／ｐＰＫ４及びＡＪ１２４３５／ｐＰＫＳ−Ｘの菌体を接種し、３７℃にて２０時間培養した。培養終了後、培養液中に生成蓄積したＬ−リジンの量及び菌体濃度を測定した。この結果を表１０に示す。
コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌のα−ＫＧＤＨ活性のレベルがＬ−グルタミン酸の発酵生産に影響を及ぼすことが明らかとなった。従って、薬剤遺伝子の挿入等によるα−ＫＧＤＨ遺伝子活性欠失株の取得、in vitro変異による活性弱化株の取得、プロモーターの改変による発現低下株の取得等により、従来のコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌と比較してさらにＬ−グルタミン酸生産能が向上した菌株を効率よく育種することが可能となる。
配列表
(1)一般情報
(i)出願人：味の素株式会社
(ii)発明の名称：α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子
(iii)配列数：14
(iv)連絡先：
(A)宛名：
(B)番地：
(C)市：
(D)州：
(E)国：
(F)ZIP：
(v)コンピュータ読取り可能形式
(A)媒体：フロッピーディスク
(B)コンピュータ：IBM PC互換
(C)操作システム：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア：FastSEQ Version 1.5
(vi)現行出願データ
(A)出願番号
(B)出願日
(C)分類
(viii)代理人／事務所情報
(A)名前：
(B)登録番号：
(C)整理番号：
(ix)通信情報
(A)電話番号：
(B)ファクシミリ番号：
(2)配列番号１の配列の情報：
(i)配列の性質：
(A)配列の長さ：4394 base pairs
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：２本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：Genomic DNA
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(vi)起源：
(A)生物名：ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
(B)株名：ATCC13869
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：443..4213
(C)特徴を決定した方法：E
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：-35 signal
(B)存在位置：281..287
(C)特徴を決定した方法：S
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：-10 signal
(B)存在位置：307..312
(C)特徴を決定した方法：S
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：RBS
(B)存在位置：421..428
(C)特徴を決定した方法：S
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：terminator
(B)存在位置：4243.4281
(C)特徴を決定した方法：S
(xi)配列：SEQ ID NO:1：
(i)配列の性質：
(A)配列の長さ：1257アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：SEQ ID NO:2：
(i)配列の性質：
(A)配列の長さ：20 base pairs
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(xi)配列：SEQ ID NO:3：
(i)配列の性質：
(A)配列の長さ：29 base pairs
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：YES
(xi)配列：SEQ ID NO:4：
(i)配列の性質：
(A)配列の長さ：20 base pairs
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(xi)配列：SEQ ID NO:5：
(i)配列の性質：
(A)配列の長さ：20 base pairs
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：YES
(xi)配列：SEQ ID NO:6：
(i)配列の性質：
(A)配列の長さ：20 base pairs
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(xi)配列：SEQ ID NO:7：
(i)配列の性質：
(A)配列の長さ：20 base pairs
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：YES
(xi)配列：SEQ ID NO:8：
(i)配列の性質：
(A)配列の長さ：20 base pairs
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(xi)配列：SEQ ID NO:9：
(i)配列の性質：
(A)配列の長さ：20 base pairs
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：YES
(xi)配列：SEQ ID NO:10：
(i)配列の性質：
(A)配列の長さ：20 base pairs
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(xi)配列：SEQ ID NO:11：
(i)配列の性質：
(A)配列の長さ：20 base pairs
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：YES
(xi)配列：SEQ ID NO:12：
(i)配列の性質：
(A)配列の長さ：51 base pairs
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(xi)配列：SEQ ID NO:13：
(i)配列の性質：
(A)配列の長さ：59 base pairs
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：YES
(xi)配列：SEQ ID NO:14：
Claims (6)
- Ｌ−グルタミン酸生産能を有し、かつ、配列番号２に示されるアミノ酸配列又はこのアミノ酸配列においてα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性に影響を与えない１個又は２個のアミノ酸残基の置換、欠失あるいは挿入を有するアミノ酸配列を有するα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、相同組換え法により破壊されたことにより、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損したブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属に属する細菌。
- 請求項１記載の細菌を液体培地中に培養し、培養液中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積させ、これを採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。
- 配列番号２に示されるアミノ酸配列又はこのアミノ酸配列においてα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性に影響を与えない１個又は２個のアミノ酸残基の置換、欠失あるいは挿入を有するアミノ酸配列を有するα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子。
- 配列番号１に示される塩基配列を有する請求項３に記載の遺伝子。
- 請求項３又は４に記載の遺伝子を含む組換えＤＮＡを保有するブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属に属する細菌。
- 請求項３又は４に記載の遺伝子を含む組換えＤＮＡを保有し、かつＬ−リジン生産能を有するブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属に属する細菌を液体培地に培養し、培養液中にＬ−リジンを生成蓄積させ、これを採取することを特徴とするＬ−リジンの製造法。
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