CN112384629B - 使用肠杆菌科细菌对醇和胺进行酶促磺酰化的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了底物的酶促磺酰化的方法，该方法包括以下步骤：使底物与3’‑磷酸腺苷‑5’‑磷酰硫酸(PAPS)在含有属于肠杆菌科的细菌的培养基中反应以产生底物的硫酸化衍生物以及从培养基中收集硫酸化衍生物，其中细菌已经经修饰以至少产生具有磺基转移酶活性的蛋白质，并减弱aphA基因、cysQ基因或cpdB基因，或者这些的组合的表达。

Description

使用肠杆菌科细菌对醇和胺进行酶促磺酰化的方法
发明背景
发明领域
本发明涉及微生物产业，并具体涉及在含有属于肠杆菌科的细菌的培养基中对醇和胺进行酶促磺酰化以产生醇和胺的O-和N-硫酸化衍生物的方法。该方法可以用于产生例如肝素和硫酸乙酰肝素。
相关技术的描述
含有一个或多个硫酸基团的无机和有机分子是已知的。其中，已知存在含有硫酸基团，并在生物过程中起重要作用的生物分子，并且这些包括，例如，肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸胆碱和硫酸皮肤素(dermatan)。肝素和硫酸乙酰肝素特别令人感兴趣，因为它们可以用于制药业中，用于例如治疗性处理。
肝素和硫酸乙酰肝素(缩写为“HS”)是具有可变硫酸化重复二糖单元的线性多糖。肝素主要由动物的肥大细胞产生，而HS则由几乎所有类型的细胞产生。肝素和HS可以与多种蛋白质相互作用并调节各种生物学过程，诸如例如，细胞周期、细胞生长、细胞分化、细胞粘附、运动、脂质代谢、血管生成、血液凝固、消除GrB(粒酶B)的脱离活性和肿瘤转移。已知肝素治疗和预防深静脉血栓形成、肺栓塞和动脉血栓栓塞的用途。肝素还用于治疗心脏病发作和不稳定型心绞痛。
化学结构，即构成肝素和HS分子的基本多糖组分的种类和数量，可以根据组织和发育阶段而变化。因此，没有共有的肝素和HS结构。尽管如此，重复的二糖单元的主要结构基序(-4GlcA1β-4GlcNAcα1-)和(-4)-α-L-IdoA2S-(1-4)-D-GlcNS6S-(1-)存在于肝素和HS的糖基氨基聚糖(glycosylaminoglycan)主链中(Kuberan B.et al.,Chemoenzymaticsynthesis of classical and non-classical anticoagulant heparan sulfatepolysaccharides,J.Biol.Chem.,2003,278(52):52613-52621；Mulloy B.et al.,Pharmacology of heparin and related drugs,Pharmacol.Rev.,2016,68(1):76-141)。肝素和HS分子结构的基本差异是已知的，并且这些包括分子量、硫酸化率和艾杜糖醛酸(缩写为“IdoA”)残基的含量(参见例如，Gallagher J.T.and Walker A.,Moleculardistinctions between heparan sulphate and heparin.Analysis of sulphationpatterns indicates that heparan sulphate and heparin are separate families ofN-sulphated polysaccharides,Biochem J.,1985,230(3):665-674；Shriver Z.et al.,Heparin and heparan sulfate:analyzing structure and microheterogeneity,Handb.Exp.Pharmacol.,2012,207:159-176)。此外，肝素的抗凝活性比HS的相同活性高约100倍。
已经详细研究了从葡糖醛酸(缩写为“GlcA”)和N-乙酰化葡萄糖(缩写为“GlcNAc”)单元生物合成肝素和硫酸乙酰肝素(参见例如，Mulloy B.et al.,2016；Sugahara K.and Kitagawa H.,Heparin and heparan sulfate biosynthesis,IUBMBLife,2002,54(4):163-175)。具体而言，描述了用于修饰糖基氨基聚糖主链(所谓的肝素前体(heparosan))以产生肝素和HS的生物合成事件。肝素和HS的生物合成包括以下步骤：i)由HS/肝素GlcNAc N-脱乙酰基酶/N-磺基转移酶(缩写为“NDNST”)催化的GlcNAc残基的N-脱乙酰化和N-硫酸化，ii)由将葡糖醛酸(缩写为“GlcA”)残基转化为IdoA残基的肝素前体-N-硫酸-葡糖醛酸C5-差向异构酶(缩写为“HNSG-5epi”，“C5-epi”)催化的葡糖醛酸基C5异构化，iii)分别由硫酸乙酰肝素2-O-磺基转移酶(缩写为“HS 2-OST”)、硫酸乙酰肝素6-O-磺基转移酶(缩写为“HS 6-OST”)，和硫酸乙酰肝素3-O-磺基转移酶(缩写为“HS 3-OST”)催化的位于IdoA残基的C2位置和N-磺葡糖胺(缩写为“GlcNS”)的C6和C3位置处的羟基基团的连续O-硫酸化。N-和O-硫酸化发生在存在磺基基团3’-磷酸腺苷5’-磷酰硫酸(缩写为“PAPS”)的供体的情况下。硫酸化的比率可以取决于待硫酸化的官能团的位置和种类(图1)。此外，从肝素前体到肝素和HS的生物合成事件并不一致，并且它们可以导致各种各样的一批化学结构。肝素的化学结构的实例在图2A中显示(PubChem CID：772，PubChem数据库，国家生物技术信息中心(NCBI)，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)，并且HS的化学结构的实例在图2B中显示(PubChem CID：53477714)。
用于制造肝素和HS的方法是已知的，并且这些方法包括例如从哺乳动物和非哺乳动物来源分离和纯化肝素，化学技术，化学酶技术和生物技术。从动物分离肝素的产业方法始于1922年，并且其仍被认为是生产肝素的主要方法。猪、牛、犬和羊(绵羊)可以用作肝素的来源(van der Meer J.-Y.et al.,From farm to pharma:an overview of industrialheparin manufacturing methods,Molecules,2017,22(6):1025)。然而，当使用从哺乳动物来源分离的肝素时，存在宗教和健康问题。通过使用单峰骆驼(Camelus dromedaries)作为肝素来源，这些问题得到了一定程度的解决。尽管从动物来源分离的肝素具有不期望的副作用，诸如例如出血和肝素诱导的血小板减少(HIT)伴动脉血栓形成，但其仍被用于治疗中风和心脏病发作后的人的组合疗法。
通过从家禽，诸如例如鸡和火鸡；鱼，诸如例如鲑鱼(Salmo salar)；以及其他来源分离来生产肝素的方法也是已知的(van der Meer J.-Y.et al,2017，及其中的参考文献)。公开了从动物和海洋来源生产肝素的方法的专利文件已得以公开。例如，已知一种在环境温度下使用原料的酶促水解步骤从动物粘膜组织提取肝素的简化方法(US6232093B1)。在另一种方法中，使用色谱技术从鱼来源分离出非常低分子量的肝素(缩写为“VLMWH”)(WO2006120425A1)。
由于处于生物安全水平的肝素和硫酸乙酰肝素(HS)具有治疗重要性，因此需要从非动物来源廉价且大规模商业生产此类物质的方法。因此，已经开发了生产肝素和HS的替代方法。例如，已表明使用一组参与HS的生物合成的克隆酶可以快速并容易地合成HS(Kuberan B.et al.,2003)。然而，该方法费力且昂贵，因为它需要纯化的人葡糖醛酸基C5-差向异构酶和硫酸乙酰肝素2-，3-和6-O-磺基转移酶，以及PAPS作为磺基基团的供体。在另一个实例中，使用化学酶方法从肝素前体获得生物工程化肝素，所述方法包括用以下处理肝素前体的步骤：i)碱的水溶液，以实现肝素前体的单步部分解聚和氨基基团的N-脱乙酰化，ii)三甲胺-三氧化硫配合物，以进行选择性N-硫酸化，iii)C5-差向异构酶和2-O-磺基转移酶的混合物，以实现GlcA残基的C5-原子处羧基基团的异构化和IdoA残基的2-O-硫酸化，iv)6-O-磺基转移酶的混合物，以实现GlcNS残基的6-O-硫酸化，和v)3-O-磺基转移酶，以实现GlcNS(6S)残基的3-O硫酸化(WO2012116048A1)。就N-乙酰葡糖胺和N-磺葡糖胺的含量、数均分子量(MN)、重均分子量(MW)和多分散指数(PDI)而言，通过该方法生产的生物工程化肝素基本上等同于药物肝素。在所述方法中，由于其成本非常高，所以使用再生系统来恢复磺基基团的供体(PAPS)(Zhang Z.et al.,Solution structures ofchemoenzymatically synthesized heparin and its precursors,J.Am.Chem.Soc.,2008,130(39):12998-13007)。
但是，尚不知道使底物酶促磺酰化以产生其硫酸化衍生物的方法，该方法通过在含有属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌的培养基中使底物与磺基基团的供体反应来进行，该细菌已经进行了修饰以至少产生具有磺基转移酶活性的蛋白质并减弱aphA基因、cysQ基因或cpdB基因，或这些的组合的表达。
发明概述
根据本公开的主题，本文提供了用于将具有至少一个羟基基团，或至少一个氨基基团的底物酶促磺酰化以产生其硫酸化衍生物的新方法，如分别为底物的O-硫酸化衍生物或N-硫酸化衍生物。在如本文所述的方法的示例性实施方案中，可以将肝素前体N-硫酸盐磺酰化以产生其O-硫酸化衍生物，诸如例如与初始的肝素前体N-硫酸盐相比具有至少一个另外的O-磺基基团的肝素和硫酸乙酰肝素。因此，根据本公开的主题，可以不使用动物来源来生产肝素前体N-硫酸盐的O-硫酸化衍生物。
如本文所述的方法可以包括在含有属于肠杆菌科的细菌的培养基中使底物与磺基基团的供体(其可以是例如3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸(PAPS))反应的步骤，该细菌已经进行了修饰以至少产生具有磺基转移酶活性的蛋白质并减弱aphA基因、cysQ基因或cpdB基因，或这些的组合的表达。该方法的优点是细菌的细胞的粗裂解物含有具有所期望活性的蛋白质，诸如例如具有磺基转移酶活性的蛋白质，因此该粗裂解物可以成功地用于本文所述的方法中。也就是说，在本文所述的方法中，可以使用具有所期望活性的一种或多种蛋白质而无需事先分离和/或纯化。因此，当使用如本文所述的方法时，可以简化用于醇和胺的磺酰化的方法，并且可以降低方法的成本。
可以通过如下进一步改善该方法：修饰可以用于如本文所述方法中的细菌，使得该细菌还可以产生具有3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸-磺基转移酶活性的蛋白质，使得昂贵且不稳定的PAPS可以容易地在该方法中进行再生和重复使用。或者，可以通过如下进一步改善该方法：使用可以用于如本文所述方法中的培养基，使得该培养基含有如本文所述的细菌和具有3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸-磺基转移酶活性的蛋白质，使得PAPS可以在该培养基中再生。因此，根据本公开的主题，可以以低得多的价格以高产率生产底物的O-和N-硫酸化衍生物。
本发明的一个方面是提供用于底物的酶促磺酰化的方法，其包括：
(i)在含有属于肠杆菌科的细菌的培养基中使底物与3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸反应以产生所述底物的硫酸化衍生物，和
(ii)从培养基收集硫酸化衍生物，
其中所述细菌已经进行了修饰：
(A)以至少产生具有磺基转移酶活性的蛋白质，和
(B)以减弱aphA基因或cysQ基因的表达。
本发明的另一个方面是提供了如上所述的方法，其中所述进行了修饰以减弱aphA基因的表达的细菌已经进行了进一步修饰以减弱cysQ基因或cpdB基因或它们的组合的表达。
本发明的另一个方面是提供了如上所述的方法，其中所述进行了修饰以减弱cysQ基因的表达的细菌已经进行了进一步修饰以减弱aphA基因或cpdB基因或它们的组合的表达。
本发明的另一个方面是提供了如上所述的方法，其中所述具有磺基转移酶活性的蛋白质选自由以下组成的组：具有O-磺基转移酶活性的蛋白质、具有N-磺基转移酶活性的蛋白质和具有N-脱乙酰基酶/N-磺基转移酶活性的蛋白质。
本发明的另一个方面是提供了如上所述的方法，其中所述具有O-磺基转移酶活性的蛋白质选自由以下组成的组：具有硫酸乙酰肝素2-O-磺基转移酶活性的蛋白质、具有硫酸乙酰肝素3-O-磺基转移酶活性的蛋白质、具有硫酸乙酰肝素6-O-磺基转移酶活性的蛋白质，及它们的组合。
本发明的另一个方面是提供了如上所述的方法，其中所述细菌已经进行了进一步修饰以产生具有肝素前体(heparosan)-N-硫酸-葡糖醛酸5-差向异构酶活性的蛋白质。
本发明的另一个方面是提供了如上所述的方法，其中所述细菌已经进行了进一步修饰以产生具有3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸-磺基转移酶活性的蛋白质。
本发明的另一个方面是提供了如上所述的方法，其中所述培养基含有具有3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸-磺基转移酶活性的蛋白质。
本发明的另一个方面是提供了如上所述的方法，其中所述底物至少具有一个选自羟基基团和氨基基团的化学基团。
本发明的另一个方面是提供了如上所述的方法，其中所述底物选自由以下组成的组：肝素前体、硫酸乙酰肝素和肝素。
本发明的另一个方面是提供了如上所述的方法，其中所述硫酸化衍生物选自由以下组成的组：肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸胆碱和硫酸皮肤素。
本发明的另一个方面是提供了如上所述的方法，其中所述细菌属于埃希氏菌属(Escherichia)或泛菌属(Pantoea)。
本发明的另一个方面是提供了如上所述的方法，其中所述细菌是大肠杆菌(Escherichia coli)或菠萝泛菌(Pantoea ananatis)。
本发明的另一个方面是提供了用于产生底物的硫酸化衍生物的方法，其包括：
(i)在含有属于肠杆菌科的细菌的培养基中使所述底物与3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸反应以产生底物的硫酸化衍生物，和
(ii)从培养基收集硫酸化衍生物，
其中所述细菌已经进行了修饰：
(A)以至少产生具有磺基转移酶活性的蛋白质，和
(B)以减弱aphA基因或cysQ基因的表达。
本发明的另一个方面是提供了如上所述的方法，其中所述进行了修饰以减弱aphA基因的表达的细菌已经进行了进一步修饰以减弱cysQ基因或cpdB基因或它们的组合的表达。
本发明的另一个方面是提供了如上所述的方法，其中所述进行了修饰以减弱cysQ基因的表达的细菌已经进行了进一步修饰以减弱aphA基因或cpdB基因或它们的组合的表达。
通过阅读结合附图采用的根据本文解释的实施方案的以下详细描述，本发明的其他目的、特征、等同方案和伴随的优点对于本领域技术人员将变得显而易见。
现在将参考仅以示例的方式给出的示例性实施方案并参考附图来更详细地描述本申请的发明。
附图简述
图1显示了使用N-和O-磺基转移酶，具有(-4GlcA1β-4GlcNAcα1-)结构的糖基氨基聚糖单元的羟基基团和氨基基团的硫酸化比率。括号中示出了硫酸化比率(以％计)，且圆圈中示出了易于被硫酸化的羟基基团的位置。葡糖醛酸(GlcA)残基C5位置处的羧基基团的异构化以弯曲的箭头所示。
图2A显示了肝素的示例性化学结构。
图2B显示了硫酸乙酰肝素的示例性化学结构。
图3A和3B显示了具有pACYC184-MBP*-2OSTY94A(D69-N356)和pSUMO-dreGlce(G70-N585)质粒的Δ2-5-菌株的粗细胞裂解物的可溶和不可溶级分的SDS-PAGE分析结果。图A-可溶级分，图B-不可溶级分；泳道：M–指示的分子量的标志物，1和2–Δ2-菌株，3和4–Δ3-菌株，5和6–Δ4-菌株，7和8–Δ5-菌株；HS 2-OST–与MPB*N标签融合的硫酸乙酰肝素2-O-磺基转移酶，HNSG-5epi–与SUMO N标签融合的肝素前体-N-硫酸-葡糖醛酸5-差向异构酶。
图4显示了在使用Δ2-Δ5/pST1A1菌株的粗细胞裂解物和pNPS作为磺基基团的供体对PAP进行磺酰化后，反应混合物中pNP积累的动力学曲线。
发明详述
1.细菌
可以在如本文所述的方法中使用的细菌可以是属于肠杆菌科的细菌，其已经进行了修饰以至少产生具有磺基转移酶活性的蛋白质。可以进一步修饰细菌以产生具有肝素前体-N-硫酸-葡糖醛酸5-差向异构酶活性的蛋白质和/或具有3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸-磺基转移酶活性的蛋白质。可以用于如本文所述方法的细菌也已经进行了修饰以减弱aphA基因、cysQ基因或cpdB基因或这些的组合的表达。
在如本文所述的方法中，属于肠杆菌科的细菌可以来自肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、摩根氏菌属(Morganella)、泛菌属(Pantoea)、发光杆菌属(Photorhabdus)、普罗威登斯菌属(Providencia)、沙门氏菌属(Salmonella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)等，只要细菌可以能够至少产生具有磺基转移酶活性的蛋白质，以及可以进行修饰以减弱至少一个选自aphA基因、cysQ基因和cpdB基因或它们的组合的表达。具体而言，可以使用根据NCBI(国家生物技术信息中心)数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？id＝543)中使用的分类法分类为肠杆菌科的那些。可以修饰的来自肠杆菌科的菌株的实例包括埃希氏菌属、肠杆菌属或泛菌属的细菌。
可以经修饰以获得根据本公开的主题的埃希氏菌属细菌的埃希氏菌属细菌的菌株没有特别限制，并且具体而言，可以使用Neidhardt等人的工作中描述的那些(Bachmann,B.J.,Derivations and genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coliK-12,p.2460-2488.In F.C.Neidhardt et al.(ed.),Escherichia coli andSalmonella:cellular and molecular biology,2nd ed.ASM Press,Washington,D.C.,1996)。物种大肠杆菌(E.coli)是一个具体实例。大肠杆菌的具体实例包括源自原型野生型菌株大肠杆菌K-12菌株的大肠杆菌W3110(ATCC 27325)、大肠杆菌MG1655(ATCC 47076)等。这些菌株可以从例如美国典型培养物保藏中心(ATCC；地址:P.O.Box 1549,Manassas,VA20108,United States of America)获得。也就是说，将登录号分配给相应的菌株，并且可以通过使用这些登录号来订购菌株(参见http://www.atcc.org/)。美国典型培养物保藏中心的目录中列出了菌株的登录号。
肠杆菌属细菌的实例包括成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等。泛菌属细菌的实例包括例如菠萝泛菌(Pantoea ananatis，P.ananatis)等。最近基于16S rRNA的核苷酸序列分析等将一些成团肠杆菌的菌株重新分类为成团泛菌(Pantoea agglomerans)、菠萝泛菌或斯氏泛菌(Pantoea stewartii)。可以使用属于肠杆菌属或泛菌属的细菌，只要它是分类为肠杆菌科的细菌即可。当通过基因工程技术培育菠萝泛菌时，可以使用菠萝泛菌AJ13355菌株(FERM BP-6614)、AJ13356菌株(FERM BP-6615)、AJ13601菌株(FERM BP-7207)及其衍生物。这些菌株当它们分离时被鉴定为成团肠杆菌，并且作为成团肠杆菌保藏。然而，最近基于如上所述的16S rRNA的核苷酸序列分析等将它们重新分类为菠萝泛菌。
可以在如本文所述的方法中使用的细菌是指其中可以确定具有期望活性的蛋白质的活性的细菌。例如，可以经修饰以产生具有磺基转移酶活性的蛋白质的细菌可以指其中可以确定具有磺基转移酶活性的蛋白质的活性的细菌。本文对“可以经修饰以产生具有磺基转移酶活性的蛋白质的细菌”给出的解释也可以比照适用于可以用于如本文所述方法中的任何细菌，特别是可以经修饰以产生具有所期望活性的蛋白质的细菌，诸如例如“可以经修饰以产生具有肝素前体-N-硫酸-葡糖醛酸5-差向异构酶活性的蛋白质的细菌”和“可以经修饰以产生具有3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸-磺基转移酶活性的蛋白质的细菌”。
短语“具有磺基转移酶活性的蛋白质”可以意指在称为磺酰化(其也可以称为硫酸化或磺化)的过程中引起催化磺基基团(-SO3H)从供体分子(也称为磺基基团的供体)转移至底物(其可以是醇、胺或氨基醇)的反应的蛋白质(酶学委员会(EC)编号：2.8.2-.；Chapman E.et al.,Sulfotransferases:structure,mechanism,biological activity,inhibition,and synthetic utility；Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,2004,43(27):3526-3548)。具有磺基转移酶活性的蛋白质可以称为磺基转移酶(缩写为“ST”)。由于可以在如本文所述的方法中使用的磺基转移酶可以是O-磺基转移酶或N-磺基转移酶(如将在下面所解释)，短语“具有磺基转移酶活性的蛋白质”可以包括短语“具有O-磺基转移酶活性的蛋白质”和“具有N-磺基转移酶活性的蛋白质”。因此，短语“具有O-磺基转移酶活性的蛋白质”可以意指在O-磺酰化过程中引起催化磺基基团从供体分子转移至底物(其可以是醇或氨基醇)的反应的蛋白质；且短语“具有N-磺基转移酶活性的蛋白质”可以意指在N-磺酰化过程中引起催化磺基基团从供体分子转移至底物(其可以是胺或氨基醇)的反应的蛋白质。关于过程，O-磺酰化和N-磺酰化可以统称为磺酰化过程。
能够使底物的羟基基团磺酰化以产生其硫酸化衍生物的磺基转移酶可以统称为O-磺基转移酶(缩写为“O-ST”或“OST”)。具体而言，O-磺基转移酶是可以引起催化磺基基团转移至底物的羟基基团(-OH)的反应以产生其硫酸化衍生物的酶，该硫酸化衍生物也称为硫酸盐/酯，其具有R-OSO3H或R-OSO3 -的化学式，其中“R”可以指化学基团，诸如例如本领域普通技术人员众所周知的有机基团。能够将底物的氨基基团磺酰化以产生其硫酸化衍生物的磺基转移酶可以统称为N-磺基转移酶(缩写为“N-ST”或“NST”)。具体而言，N-磺基转移酶是可以引起催化磺基基团转移至底物的伯和/或仲氨基基团(-NH2，-NHR’)的反应以产生其硫酸化衍生物的酶，该硫酸化衍生物也称为氨基磺酸盐/酯，其具有R-NH-SO3H或R-NH-SO3 -，和/或R-NR’-SO3H或R-NR’-SO3 -的化学式，其中R和R’是指如上文所述的化学基团R，并且其中R和R’可以指相同或不同种类的化学基团。
各种种类的OST和NST是已知的，并且这些包括但不限于芳基磺基转移酶(EC2.8.2.1)、醇磺基转移酶(EC 2.8.2.2)、胺磺基转移酶(EC 2.8.2.3)、[硫酸乙酰肝素]-葡糖胺N-磺基转移酶(EC 2.8.2.8，缩写为“N-HSST”)、软骨素6-磺基转移酶(EC 2.8.2.17)、角质素磺基转移酶(2.8.2.21)、[硫酸乙酰肝素]-葡糖胺3-磺基转移酶同等型1、2和3(相应地，EC 2.8.2.23、2.8.2.29和2.8.2.30；缩写为“3-OST-1”、“3-OST-2”和“3-OST-3”)等，其可以例如在UniProtKB数据库(https://enzyme.expasy.org/EC/2.8.2.-)中进行分类。
对各种生物体(诸如例如哺乳动物，包括人，鱼，昆虫，蠕虫等)天然存在的磺基转移酶是已知的，并且这些可以用于如本文所述的方法中。OST的具体实例包括但不限于硫酸乙酰肝素2-O-磺基转移酶(HS 2-OST)、硫酸乙酰肝素3-O-磺基转移酶(HS 3-OST)和硫酸乙酰肝素6-O-磺基转移酶(HS3-OST)，其能够分别将位于己糖醛酸残基(特别是L-艾杜糖醛酸(IdoA)残基)的C2位置和乙酰肝素N-硫酸盐中N-磺基葡糖胺(GlcNS)残基的C3和C6位置处的羟基基团进行O-磺酰化(或者O-硫酸化，O-磺化)。
例如，可以使用对人(智人(Homo sapiens)；UniProtKB数据库，条目号Q7LGA3)，小鼠(小家鼠(Mus musculus)；条目号Q8R3H7)，鸡(原鸡(Gallus gallus)；条目号Q76KB1)，蛙(例如，非洲爪蟾(Xenopus laevis)；条目号O93336)，斑马鱼(斑马鱼(Danio rerio)；条目号A1L1P8)，蛔虫(例如，伪旋毛虫(Trichinella pseudospiralis)；条目号A0A0V1JLD7)，昆虫(例如，豆荚草盲蝽(Lygus hesperus)；条目号A0A146LU86)等天然的HS 2-OST。
在另一个实例中，可以使用对人(智人；UniProtKB数据库，条目号Q9Y663)，小鼠(小家鼠；条目号O35310)，大鼠(褐家鼠(Rattus norvegicus)；条目号Q80W66))，果蝇(黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)；条目号Q9VWJ7)，水螅(水螅(Hydra vulgaris,Hydraattenuata)；条目号T2MJ19)，线虫(例如，米氏旋毛虫(Trichinella murrelli)；条目号A0A0V0UDE4)等天然的HS 3-OST。
在另一个实例中，可以使用对人(智人；UniProtKB数据库，条目号O60243)，小鼠(小家鼠；条目号Q9QYK5)，鸡(原鸡；条目号Q76KB2)，牛(牛(Bos taurus)；条目号1BNW3)，猴(例如，恒河猴(猕猴(Macaca mulatta))；条目号F7DP42)，蝙蝠(小棕蝠(Myotislucifugus)；条目号G1PY33)，果蝇(黑腹果蝇；条目号B4GL90)，线虫(例如，双桅隐杆线虫(Caenorhabditis briggsae)；条目号A8XKD5)等天然的HS 6-OST。
NST的具体实例包括但不限于胺磺基转移酶和芳基胺磺基转移酶，其能够对含氨基基团的底物的伯和仲氨基基团进行N-磺酰化(或者N-硫酸化，N-磺化)，该底物诸如例如，苯胺(aniline)、苯胺(phenylamine)、苯胺(benzenamine)、芳基胺、2-萘胺等。例如，可以使用对大型溞(Daphnia magna)(UniProtKB数据库，条目号A0A0P5VC43)，果蝇(例如，瓜实蝇(Zeugodacus cucurbitae)；条目号A0A0A1X0U6)，例如在KEGG(京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库(http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget？ec:2.8.2.3)中列出的那些等天然的NST。
已知具有N-磺基转移酶活性的蛋白质除具有该特性外，还可以具有N-脱乙酰化活性。因此，在特定情况下，具有N-磺基转移酶活性的蛋白质也可以称为具有N-脱乙酰基酶/N-磺基转移酶活性的蛋白质，并且其也可以用于如本文所述的方法中。短语“具有N-脱乙酰基酶/N-磺基转移酶活性的蛋白质”可以意指引起催化硫酸乙酰肝素中的糖胺聚糖的葡糖胺(GlcNAc)残基的N-脱乙酰化和N-硫酸化反应的蛋白质(硫酸乙酰肝素N-脱乙酰基酶，EC3.-.-.-；硫酸乙酰肝素N-磺基转移酶，EC 2.8.2.-)。具有N-脱乙酰基酶/N-磺基转移酶活性的蛋白质可以称为双功能N-脱乙酰基酶/N-磺基转移酶(缩写为“NDST”)。
NDST的具体实例包括但不限于对人(智人；UniProtKB数据库，条目号P52848)，小鼠(小家鼠；条目号Q3UHN9)，猪(野猪(Sus scrofa)；条目号F6XY50)，绵羊(绵羊(Ovisaries)；条目号UPI00072F9665)，马(野马(Equus caballus)；条目号F6SHQ3)，鸟(例如，日鳽(sunbittern，Eurypyga helias)；条目号UPI0005288C4A)等天然的NDST，并且这些蛋白质可以在如本文所述的方法中使用。
可以通过使用[35S]3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸盐和闪烁计数的放射性同位素法(Habuchi H.et al.,Biosynthesis of heparan sulphate with diverse structuresand functions:two alternatively spliced forms of human heparan sulphate6-O-sulphotransferase-2having different expression patterns and properties,Biochem.J.,2003,371(Pt 1):131-142)或使用芳基磺基转移酶和对硝基苯硫酸盐/酯(缩写为“pNPS”)作为磺基基团的供体的偶联双酶比色测定法(Sterner E.et al.,Assays fordetermining heparan sulfate and heparin O-sulfotransferase activity andspecificity,Anal.Bioanal.Chem.,2014,406(2):525-536)来确定具有磺基转移酶活性的蛋白质的活性。可以通过Bradford蛋白质测定法或Lowry的方法，使用牛血清白蛋白(BSA)为标准品和考马斯染料来确定蛋白质浓度(Bradford M.M.,Anal.Biochem.,1976,72:248-254；Lowry O.H.et al.,J.Biol.Chem.,1951,193:265-275)。
可以用于如本文所述方法的底物可以是具有至少一个羟基基团或至少一个氨基基团或这些的组合的任何底物(即任何分子)，只要可以使用OST或NST或这些的组合对该底物进行磺酰化以产生底物的硫酸化衍生物。还可以接受的是，底物可以单独地或除一个或多个羟基基团和/或一个或多个氨基基团外，还具有至少一个经N-乙酰化的氨基基团，只要可以使用NDST对该底物进行磺酰化。底物可以是但不限于例如在Chapman E.et al.,2004中描述的底物，并且这些底物包括酚，包括4-硝基酚(也称为对硝苯酚，缩写为“pNP”)，儿茶酚胺，芳基羟胺，羟基类固醇，多巴胺，酪胺，minoxidol，孕烯醇酮，脱氢表雄酮(缩写为“DHEA”)，寡糖，诸如例如肝素前体，肝素前体的硫酸化衍生物，诸如例如具有N-乙酰化葡糖胺(GlcNAc)残基的硫酸乙酰肝素，硫酸乙酰肝素糖胺聚糖(缩写为“HSGAG”)，N-硫酸化肝素前体(缩写为“NS-肝素前体”)，硫酸角质素等。肝素前体是底物的具体实例，其制备方法是已知的(参见例如，US 2016201103A1)。
作为可以用于如本文所述方法中的磺基基团供体，可以使用任何分子，只要该分子可以将磺基基团提供给磺基转移酶，使得可以确定磺基转移酶的磺基转移酶活性。实际上，可以使用能向O-磺基转移酶、N-磺基转移酶和/或N-脱乙酰基酶/N-磺基转移酶贡献磺基基团，使得所述磺基转移酶可以是具有磺基转移酶活性的蛋白质的任何分子。例如，3’-磷酸腺苷5’-磷酰硫酸(PAPS；PubChem CID：10214)，也称为3’-磷酸-5’-腺苷硫酸，或其盐，诸如例如钠盐或锂盐可以用作磺基基团的供体(参见例如，Chapman E.et al.,2004中的方案1)。可以以外源方式使用PAPS，也就是说，可以将其添加到含有可以用于如本文所述方法中的细菌的培养基中；和/或它可以以与磺基转移酶天然结合的内源形式使用，因为已知存在在生物体中催化PAPS形成的酶(ATP磺酰化酶和5’-磷酰硫酸腺苷激酶)，其然后作为辅因子由磺基转移酶募集并与磺基转移酶结合。由于PAPS是昂贵且不稳定的化合物，因此优选使用由生物体内源合成的并因此天然与磺基转移酶结合的PAPS。在这种情况下，开发了用于在其中发生磺酰化的培养基中再生或再循环PAPS的系统(参见例如，Sterner E.et al.,2014中的图1；Gregory J.D.and Lipmann F.,The transfer of sulfate among phenoliccompounds with 3’,5’-diphosphoadenosine as coenzyme,J.Biol.Chem.,1957,229(2):1081-1090)。在该系统中，磺基转移酶将PAPS转化为3’-磷酸腺苷-5’-磷酸盐(缩写为“PAP”)，并对底物进行磺酰化。然后使用可以利用对硝基苯硫酸盐/酯(pNPS)作为PAP的磺基基团供体的具有3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸-磺基转移酶活性的蛋白质将PAP再循环为PAPS。
短语“具有肝素前体-N-硫酸-葡糖醛酸5-差向异构酶活性的蛋白质”可以意指引起催化与N-硫酸化肝素前体中N-硫酸糖残基相邻的D-葡糖醛酸(GlcA)残基转化为艾杜糖醛酸(IdoA)残基的反应的蛋白质(EC 5.1.3.17；Mochizuki H.et al.,Heparosan-glucuronate 5-epimerase:Molecular cloning and characterization of a novelenzyme,Glycobiology,2015,25(7):735-744)。可以通过使用[5-3H]肝素前体为底物的放射性同位素方法确定具有肝素前体-N-硫酸-葡糖醛酸5-差向异构酶活性的蛋白质的活性(Mochizuki H.et al.,2015)。
具有肝素前体-N-硫酸-葡糖醛酸5-差向异构酶活性的蛋白质可以称为肝素前体-N-硫酸-葡糖醛酸5-差向异构酶(HNSG-5epi)。HNSG-5epi的具体实例包括但不限于对人(智人；UniProtKB数据库，条目号O94923)，小鼠(小家鼠；条目号Q9EPS3)，牛(牛；条目号O18756)，斑马鱼(斑马鱼；条目号Q6TS33)，仓鼠(例如，灰仓鼠(Cricetulus griseus)；条目号A0A061I8R4)，绵羊(绵羊；条目号W5QB79)，象(例如，非洲草原象(Loxodonta africana)；条目号G3T4X0)等天然的HNSG-5epi，并且这些蛋白质可以用于如本文所述的方法中。
由于pNPS可以用作再生PAPS的系统中磺基基团的供体，因此短语“具有3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸-磺基转移酶活性的蛋白质”就可以用于如本文所述的方法中的具有此类活性的蛋白质而言从广义上可以意指具有芳基磺基转移酶活性的蛋白质(EC 2.8.2.1)，其为具有O-磺基转移酶活性的蛋白质(EC2.8.2.-)的一个实例。因此，对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，本文中对具有O-磺基转移酶活性的蛋白质给出的解释也可以比照适用于具有芳基磺基转移酶活性的蛋白质，其继而可以比照适用于具有3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸-磺基转移酶活性的蛋白质。现在明显的是，可以使用可以用于确定具有磺基转移酶活性的蛋白质的活性的方法来确定具有3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸-磺基转移酶活性的蛋白质的活性，并且这些方法包括例如，其中使用PAP作为底物，且pNPS作为磺基基团的供体的方法(Sterner E.et al.,2014)。
具有3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸-磺基转移酶活性的蛋白质可以称为3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸-磺基转移酶(缩写为“PAPS ST”)，并且其在广义上可以意指芳基磺基转移酶。可以用于再生PAPS的芳基磺基转移酶的具体实例包括但不限于对人(智人；ST1A3，UniProtKB数据库，条目号P0DMM9)，大鼠(褐家鼠；ST1A1，条目号P17988；NCBI(国家生物技术信息中心，https://www.ncbi.nlm.nih.gov)基因条目号NP_114022.1)，小鼠(小家鼠；ST1A1，条目号P52840)等天然的芳基磺基转移酶。
已知OST、NST、NDST、HNSG-5epi和PAPS ST可以以不同的蛋白质同等型存在，它们是编码OST、NST、NDST、HNSG-5epi和PAPS ST的基因的可变剪接的结果，并且这些蛋白质同等型也可以用于如本文所述的方法中，只要它们可以是根据如本文所解释的方法的具有所期望活性的蛋白质即可。
关于对特定物种(诸如例如，细菌或哺乳动物物种)天然的蛋白质或核酸的短语“对……天然”可以指对该物种天然的蛋白质或核酸。也就是说，对特定物种天然的蛋白质或核酸可以分别意指在该物种中天然存在，并且可以从该物种中分离并使用本领域普通技术人员已知的方法进行测序的蛋白质或核酸。此外，由于可以容易地分别确定从其中存在蛋白质或核酸的物种中分离的蛋白质或核酸的氨基酸序列或核苷酸序列，因此短语“对……天然”就蛋白质或核酸而言也可以指可以使用例如基因工程技术(包括重组DNA技术)或化学合成方法等获得的蛋白质或核酸，只要如此获得的蛋白质的氨基酸序列或核酸的核苷酸序列相应地与物种中天然存在的蛋白质的氨基酸序列或核酸的核苷酸序列相同即可。对特定物种天然的氨基酸序列的实例包括但不限于肽、寡肽、多肽，包括蛋白质，特别是酶等。对特定物种天然的核苷酸序列的实例包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，并且这些不限于调节序列，包括启动子、弱化子、终止子等，基因，基因间序列，编码信号肽的序列，蛋白质的前部分(pro-moieties)，人工氨基酸序列等。本文描述了对各种物种天然的氨基酸序列和核苷酸序列及其同源物的实例，并且这些实例包括但不限于对长尾侏儒仓鼠(长尾仓鼠(Cricetulus longicaudatus)；UniProtKB，登录号O0889.1)天然，并由相应的mRNA(GeneBank，登录号D88811.1)编码的硫酸乙酰肝素2-O-磺基转移酶(HS 2-OST)；对斑马鱼(斑马鱼；NCBI参考序列，登录号NP_998014.1)天然，并由相应的mRNA(NCBI参考序列，登录号NM_212849.1)编码的肝素前体-N-硫酸-葡糖醛酸5-差向异构酶(HNSG-5epi)；具有对大鼠(褐家鼠；NCBI参考序列，NP_114022.1)天然，并由相应的mRNA(NCBI参考序列，登录号NM_031834.1)编码的芳基磺基转移酶1A1。
下面给出的具有磺基转移酶活性的蛋白质的解释就用该蛋白质修饰细菌的方法(其中该细菌可以用于如本文所述的方法中)而言也可以比照适用于具有所期望活性并可以在该方法中使用的任何蛋白质。具有所期望活性的蛋白质的实例包括但不限于具有肝素前体-N-硫酸-葡糖醛酸5-差向异构酶活性的蛋白质和具有3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸-磺基转移酶活性的蛋白质等，因为该细菌可能具有除本文所述的特性之外的其他特性。
可以在如本文所述的方法中使用的细菌已经进行了修饰以产生具有磺基转移酶活性的蛋白质。由于蛋白质由基因编码，因此对本领域普通技术人员显而易见的是，可以修饰细菌以表达编码具有磺基转移酶活性的蛋白质的基因。
短语“经修饰以表达编码具有磺基转移酶活性的蛋白质的基因的细菌”可以意指天然或自然不具有编码具有磺基转移酶活性的蛋白质的基因的细菌已经进行了修饰，使得该细菌含有编码具有磺基转移酶活性的蛋白质的基因(称为宿主细菌)，其中该基因天然或自然存在于与宿主细菌不同的生物体(称为供体生物体)中，或者对该生物体是天然的。对供体生物体天然的并且被引入宿主细菌中的基因可以称为相对于宿主细菌的异源基因，对于该宿主细菌而言，所述基因不是天然的或自然的。
短语“经修饰以表达编码具有磺基转移酶活性的蛋白质的基因的细菌”也可以意指已经引入编码具有磺基转移酶活性的蛋白质的基因的宿主细菌由于此类修饰而能够产生具有磺基转移酶活性的蛋白质。
可以通过引入编码具有磺基转移酶活性的蛋白质的基因来获得已经进行了修饰以产生具有磺基转移酶活性的蛋白质的细菌。用于将重组DNA引入受体细菌的方法可以是已报道的常规方法，并且是本领域普通技术人员众所周知的。此类方法包括例如转化、转染、感染、接合和动员(mobilization)。用含有编码具有磺基转移酶活性的蛋白质的基因的重组DNA对细菌进行转化、转染、感染、接合或动员，可以赋予细菌以表达该基因和合成该基因编码的蛋白质的能力。例如，已经报道了一种用氯化钙处理受体细胞以增加大肠杆菌K-12细胞对DNA的通透性的方法，用于有效的DNA转化和转染(Mandel M.and Higa A.,Calcium-dependent bacteriophage DNA infection,J.Mol.Biol.,1970,53:159-162)。描述了特化和/或泛化转导的方法(Morse M.L.et al.,Transduction in Escherichia coliK-12,Genetics,1956,41(1):142-156；Miller J.H.,Experiments in MolecularGenetics.Cold Spring Harbor,N.Y.:Cold Spring Harbor Lab.Press,1972)。可以应用将DNA随机和/或靶向整合到受体生物体的基因组中的其他方法，诸如例如“Mu驱动的整合/扩增”(参见例如，Akhverdyan V.Z.et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2011,91:857-871)，“Red/ET驱动的整合”或“λRed/ET介导的整合”(Datsenko K.A.and Wanner B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(12):6640-6645；Zhang Y.,et al.,Nature Genet.,1998,20:123-128)。此外，对于所期望基因的多重插入，除了Mu驱动的复制性转座(Akhverdyan V.Z.et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2011,91:857-871)和基于recA依赖性同源重组的化学诱导的染色体进化外，导致所期望基因的扩增(Tyo K.E.J.et al.,Nature Biotechnol.,2009,27:760-765)，可以使用利用转座、位点特异性和/或同源性Red/ET介导的重组和/或P1介导的泛化转导的不同组合的其他方法(参见例如，MinaevaN.I.et al.,BMC Biotechnol.,2008,8:63；Koma D.et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2012,93(2):815-829)。
可以通过用稀有密码子(对于宿主细菌而言所谓的低选择密码子(low-usagecodon))取代同义的中或高选择密码子来改善宿主细菌中基因的表达，其中密码子选择可以定义为宿主细菌细胞中每单位时间的密码子翻译频率或宿主细菌测序蛋白质编码阅读框的平均密码子频率(Zhang S.P.et al.,Low-usage codons in Escherichia coli,yeast,fruit fly and primates,Gene,1991,105(1):61-72)。可以在密码子选择数据库(Codon Usage Database)中找到每个生物体的密码子选择，该数据库是CUTG(Codon UsageTabulated from GenBank,http://www.kazusa.or.jp/codon/；Nakamura Y.et al.,Codonusage tabulated from the international DNA sequence databases:status for theyear2000,Nucleic Acids Res.,2000,28(1):292)的扩展网络版本。在大肠杆菌中，此类突变可以包括但不限于将稀有Arg密码子AGA、AGG、CGG、CGA取代CGT或CGC；稀有Ile密码子ATA取代ATC或ATT；稀有Leu密码子CTA取代CTG、CTC、CTT、TTA或TTG；稀有Pro密码子CCC取代CCG或CCA；稀有Ser密码子TCG取代TCT、TCA、TCC、AGC或AGT；稀有Gly密码子GGA、GGG取代GGT或GGC；等。可以优选低选择密码子取代同义的高选择密码子。可以将稀有和/或低选择密码子取代同义的中或高选择密码子与编码识别稀有密码子的tRNA的基因的共表达组合。可以使用例如位点特异性突变方法来替换密码子，以将目标突变引入DNA的目标位置。位点特异性突变方法的实例包括利用聚合酶链反应(PCR)的方法(Higuchi R.,Using PCR toengineer DNA,61-70.In:PCR Technology,Erlich H.A.(ed.),Stockton Press,New York(1989)；Carter,P.,Methods Enzymol.,1987,154:382-403)，以及利用噬菌体的方法(Kramer W.and Frits H.J.,Methods Enzymol.,1987,154:350-367；Kunkel T.A.et al.,Methods Enzymol.,1987,154:367-382)。
当将基因引入宿主细菌中时，该基因被经修饰的细菌所携带以使该基因在细菌中表达可以是足够的。具体而言，引入基因以使其在宿主细菌中起作用的启动子序列(也称为启动子)的控制下表达可以是足够的。该启动子可以是对宿主细菌天然的启动子，或者是对供体生物体甚至另一种生物体天然的异源启动子。启动子可以是待引入基因的天然启动子，也可以是另一个基因的启动子。作为启动子，例如，也可以使用本文所解释的强启动子。
用于终止基因转录的终止子序列(也称为终止子)可以位于基因的下游。终止子没有特别限制，只要其在宿主细菌中起作用即可。该终止子可以是对宿主细菌天然的终止子，或者是对供体生物体甚至另一种生物体天然的异源终止子。终止子可以是待引入基因的天然终止子，也可以是另一个基因的终止子。
此外，当引入两个或更多个基因拷贝时，每个基因被经修饰的细菌所携带以使基因可以在细菌中表达是足够的。例如，所有待引入的基因可以存在于单个表达载体中，或存在于染色体中。或者，基因可以存在于两个或更多个表达载体中，或者可以分别存在于一个或多个表达载体和染色体中。当基因存在于不同的核酸分子中或存在于单个核酸分子中时，基因可以以可以实现引入的所有基因的表达的方式存在于核酸分子中。实际上，可以选择将基因引入宿主细菌的任何方式，只要可以在细菌中实现基因的表达即可。短语“可以实现表达”可以指当可以发生从DNA的转录，使得可以合成与作为模板的DNA互补的RNA时。短语“可以实现表达”也可以指当可以发生从DNA的转录，使得可以合成与作为模板的DNA互补的RNA，并且可以发生从RNA的翻译，使得可以产生肽(诸如例如具有期望活性的蛋白质)，从而可以确定该蛋白质的活性时。
《Fundamental Microbiology,vol.8,Genetic Engineering》,Kyoritsu ShuppanCo.,Ltd(1987)中详细公开了对各种微生物天然的载体、启动子和终止子，并且可以使用那些。
优选地，将基因引入宿主细菌中，以使其在该细菌中起作用的强启动子的控制下表达，该启动子比该基因的天然启动子或对该宿主细菌天然的启动子强。可以使用在属于肠杆菌科的细菌中提供高水平基因表达的强启动子。可以用于肠杆菌科细菌的强启动子的实例包括lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子以及lambda噬菌体的PR和PL启动子。此外，作为强启动子，还可以通过使用各种报告基因获得高活性类型的现有启动子。例如，通过使启动子区域中的-35和-10区域更接近共有序列，可以增强启动子的活性(WO00/18935)。高活性型启动子的实例包括各种tac样启动子(Katashkina J.I.et al.,俄罗斯联邦专利申请号2006134574A)。描述了用于评估启动子强度的方法和强启动子的实例(Goldstein M.A.and Doi R.H.,Prokaryotic promoters in biotechnology,Biotechnol.Annu.Rev.,1995,1:105-128)，等。
基因的转录效率可以进一步改善。这可以通过如下来实现：例如将突变引入基因的启动子区域以获得更强的启动子功能，从而导致位于启动子下游的基因的转录水平提高。此外，已知在Shine-Dalgarno(SD)序列中，和/或在SD序列与起始密码子之间的间隔区中，和/或紧邻核糖体结合位点中起始密码子上游和/或下游的序列中的若干核苷酸的取代显著影响mRNA的翻译效率。例如，取决于起始密码子之前的三个核苷酸的性质，发现表达水平的20倍范围(Gold L.et al.,Annu.Rev.Microbiol.,1981,35:365-403；Hui A.et al.,EMBO J.,1984,3:623-629)。
另外，可以进一步改善基因的翻译效率。这可以通过例如用更强的核糖体结合位点(RBS)代替染色体上基因的RBS来实现。短语“更强的RBS”可以意指与基因的天然或野生型RBS相比提供改善的mRNA翻译的RBS。作为更强的RBS的实例，可以使用噬菌体T7的基因10的RBS(Olins P.O.et al,Gene,1988,73:227-235)。
作为载体，可以使用可在宿主细菌的细胞中自主复制的载体。载体优选是多拷贝载体，并且优选地，其具有标志物基因，诸如例如用于选择所期望转化体的抗生素抗性基因。另外，载体可以具有用于表达引入的基因的启动子和/或终止子。载体可以是例如源自细菌质粒的载体，源自酵母质粒的载体，源自噬菌体、粘粒、噬粒的载体等。适用于转化属于肠杆菌科的细菌的载体的实例包括但不限于宽宿主范围的质粒，如pMW118/119、pBR322、pUC19等。也可以通过例如同源重组、Mu驱动的整合等将基因的多个拷贝引入细菌的染色体DNA中。同源重组可以使用在染色体DNA中具有多个拷贝的序列进行。染色体DNA中具有多个拷贝的序列包括但不限于在可转座元件的末端存在的重复DNA或反向重复。另外，有可能将基因引入转座子并允许其转移以将基因的多个拷贝引入染色体DNA。通过使用Mu驱动的整合，可以在单个动作期间将超过3个拷贝的基因引入染色体DNA中(Akhverdyan V.Z.etal.,Biotechnol.(Russian),2007,3:3-20)。
可以通过确认待引入的整个基因或一部分的核苷酸序列的存在来确认基因的引入。可以通过例如PCR来确定核苷酸序列的存在(Sambrook J.,et al.:《MolecularCloning:A Laboratory Manual》,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,USA(2001))。也可以通过确认待引入的基因的表达的存在来确认基因的引入。可以通过确认基因的转录量的存在或通过确认该基因编码的蛋白质的存在来确认基因的表达的存在。可以通过确认从该基因转录的mRNA的存在来确认基因的转录量的存在。用于确认mRNA存在的方法的实例包括Northern杂交、RT-PCR等(Sambrook J.,et al.:《Molecular Cloning:ALaboratory Manual》,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,USA(2001))。可以通过例如使用抗体的Western印迹法来确定蛋白质的存在(Sambrook J.,et al.:《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》,3rd ed.,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,USA(2001))。
可以例如通过限制染色体DNA，随后进行使用基于基因序列的探针的Southern印迹法，荧光原位杂交(FISH)等来测量基因的拷贝数，存在或不存在。可以使用各种众所周知的方法，包括Northern印迹法、定量RT-PCR等通过测量从基因转录的mRNA的量来确定基因表达的水平。可以通过已知的方法，包括SDS-PAGE，随后进行免疫印迹测定(Western印迹分析)或蛋白质样品的质谱分析等来测量由基因编码的蛋白质的量。
用重组DNA分子操作和分子克隆的方法，如质粒DNA的制备，DNA的消化、连接和转化，寡核苷酸作为引物的选择，突变的掺入等，可以是本领域普通技术人员众所周知的普通方法。这些方法描述于例如Sambrook J.,Fritsch E.F.and Maniatis T.,“MolecularCloning:A Laboratory Manual”,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)或Green M.R.and Sambrook J.R.,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012)；Bernard R.Glick,Jack J.Pasternakand Cheryl L.Patten,“Molecular Biotechnology:principles and applications ofrecombinant DNA”,4th ed.,Washington,DC,ASM Press(2009)中。
还可以修饰可以用于如本文所述方法中的细菌，以减弱至少一种编码磷酸酶(EC3.1.3-)的基因的表达，其实例在例如UniProtKB数据库(http://enzyme.expasy.org/EC/3.1.3.-)中列出。根据该方法，可以修饰细菌以减弱aphA基因、cysQ基因和cpdB基因的一种或多种的表达。在一个实例中，可以修饰细菌以减弱aphA基因的表达。可以进一步修饰具有aphA基因(其表达被减弱)的细菌以减弱cysQ基因或/和cpdB基因的表达。在另一个实例中，可以修饰细菌以减弱cysQ基因的表达。可以进一步修饰具有cysQ基因(其表达被减弱)的细菌以减弱aphA基因或/和cpdB基因的表达。
以下给出的关于aphA基因表达减弱的解释也可以比照适用于可以在如本文所述方法中使用的细菌中具有减弱的表达的任何基因。此类基因的实例包括但不限于cysQ和cpdB基因。
短语“细菌已经进行了修饰以减弱aphA基因的表达”可以意指该细菌已经以下述方式进行了修饰，使得在经修饰的细菌中aphA基因的表达减弱。示例性地，由于aphA基因的失活，可以减弱aphA基因的表达。
短语“aphA基因失活”可以意指与具有野生型或未修饰的aphA基因的细菌相比，经修饰的基因编码完全无活性或无功能的蛋白质AphA。由于部分基因的缺失或整个基因的缺失，基因的核苷酸序列中一个或多个碱基的替换引起基因编码的蛋白质中的氨基酸取代(错义突变)，终止密码子的引入(无义突变)，一个或两个碱基的缺失导致基因的阅读框移位，药物抗性基因和/或转录终止信号的插入，或基因邻近区域的修饰，包括控制基因表达的序列，如启动子、增强子、弱化子、核糖体结合位点等，经修饰的DNA区域不能自然表达aphA基因也是可以接受。还可以通过例如常规方法进行基因的失活，如使用UV辐照或亚硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)的诱变处理、定点诱变、使用同源重组的基因破坏和/或插入缺失诱变(Yu D.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(11):5978-5983；Datsenko K.A.and Wanner B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(12):6640-6645；Zhang Y.et al.,Nature Genet.,1998,20:123-128)，其基于“Red/ET驱动的整合”或“λRed/ET介导的整合”。
短语“aphA基因的表达减弱”可以意指经修饰的细菌含有与该基因可操作地连接的区域，包括控制基因表达的序列，如启动子、增强子、弱化子和转录终止信号、核糖体结合位点以及其他表达控制元件，其经修饰从而导致aphA基因的表达水平降低；和其他实例(参见例如，WO95/34672；Carrier T.A.and Keasling J.D.,Biotechnol.Prog.,1999,15:58-64)。关于基因的短语“可操作地连接的”可以意指调节区以下述方式与核酸分子或基因的核苷酸序列连接，使得可以发生核苷酸序列的表达(例如，增强，增加，组成型，基础，抗终止，减弱，失调，降低或抑制的表达)，特别是核苷酸序列编码的基因产物的表达。
短语“aphA基因的表达减弱”也可以意指经修饰的细菌(其中aphA基因的表达减弱)中aphA基因的表达产物的量，如该基因的mRNA的量或该基因编码的AphA蛋白质的量减少至例如未修饰细菌中的量的50％或更少，20％或更少，10％或更少，5％或更少，或甚至0％。
短语“细菌已经进行了修饰以减弱aphA基因的表达”也可以意指该细菌已经以下述方式进行了修饰，使得在经修饰的细菌中相应基因蛋白质产物(如AphA蛋白)的总酶活性与未修饰细菌中的活性相比降低。可以对细菌进行修饰，以使每细胞中AphA蛋白的活性降低至，例如，未修饰细菌中的活性的50％或更少，20％或更少，10％或更少，5％或更少，或甚至0％。
用作上述比较的参考的未修饰细菌的实例可以包括属于埃希氏菌属的细菌的野生型菌株，如大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655(ATCC 47076)、大肠杆菌W3110菌株(ATCC27325)或属于泛菌属的细菌，如菠萝泛菌AJ13355菌株(FERM BP-6614)等。
可以通过用较弱的基因的表达控制序列替换该基因的表达控制序列，如染色体DNA中的启动子来减弱aphA基因的表达。例如，如WO0018935 A1中所公开，可以在基因的启动子区域中引入一个或多个核苷酸取代，从而修饰待弱化的启动子。此外，已知在Shine-Dalgarno(SD)序列中，和/或在SD序列与起始密码子之间的间隔区中，和/或紧邻核糖体结合位点中起始密码子上游和/或下游的序列中的若干核苷酸的取代显著影响mRNA的翻译效率。RBS的这种修饰可以与减少aphA基因的转录组合。
通过将转座子或插入序列(IS)插入基因的编码区域(美国专利号5,175,107)或控制基因表达的区域，或通过常规方法，如用紫外线(UV)辐照或亚硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍，NTG)诱变，可以减弱aphA基因的表达。此外，可以通过已知的染色体编辑方法进行位点特异性突变的掺入，例如，基于λRed/ET介导的重组(Datsenko K.A.and WannerB.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(12):6640-6645)。
大肠杆菌的aphA基因(同义词：ECK4047、hobH、JW4015、napA、yjbP)编码B类酸性磷酸酶AphA(EC 3.1.3.2；NCBI，GenBank，登录号NC_000913.3，核苷酸位置：4269414至4270127，基因ID：948562)，并且其位于大肠杆菌菌株K-12的相反链的yjbS基因和相同链的yjbQ基因之间。aphA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)和由对大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655天然的aphA基因编码的AphA蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)是已知的。此外，还已知对属于肠杆菌科的其他细菌物种天然的AphA的氨基酸同源物，诸如例如对物种弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)(与对大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655(SEQ ID NO:2)天然的AphA的同一性：100％)，宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)(同一性：99％)，弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)(同一性：91％)，肠沙门氏菌(Salmonella enterica)(同一性：89％)，栖冷克吕沃尔菌(Kluyvera cryocrescens)和阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)(同一性：84％)，密执安克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)和植生柔武氏菌(Raoultella planticola)(同一性：83％)，泛菌属物种1.19(同一性：75％)等(参见例如，NCBI数据库，国家生物技术信息中心，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)天然的同源物。因此，对大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655天然的AphA蛋白和编码其的aphA基因也可以具有分别作为具有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列和SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列的蛋白质同源物的蛋白质和基因。
大肠杆菌的cysQ基因(同义词：amt、amtA、ECK4210、JW4172)编码3’(2’),5’-双磷酸核苷酸酶，CysQ(EC 3.1.3.7；NCBI，GenBank，登录号NC_000913.3，核苷酸位置：4436755至4437495，基因ID：948728)，并且其位于大肠杆菌菌株K-12的相反链的cpdB基因和相同链的ytfI基因之间。cysQ基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)和由对大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655天然的cysQ基因编码的CysQ蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)是已知的。此外，还已知对属于肠杆菌科的其他细菌物种天然的CysQ的氨基酸同源物，诸如例如对物种宋内志贺氏菌(与对大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655(SEQ ID NO:4)天然的CysQ的同一性：99％)，无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)(同一性：91％)，阴沟肠杆菌(同一性：90％)，肠沙门氏菌和产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)(同一性：88％)，Pluralibacter gergoviae(同一性：87％)，菠萝泛菌(同一性：81％)等(参见例如，NCBI数据库)天然的同源物。因此，对大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655天然的CysQ蛋白和编码其的cysQ基因也可以具有分别与作为SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列和SEQ ID NO:3中所示的核苷酸序列的蛋白质同源物的蛋白质和基因。
大肠杆菌的cdpB基因(同义词：ECK4209；JW4171)编码2’,3’-环核苷酸2’-磷酸二酯酶/3’-核苷酸酶，CpdB(EC 3.1.4.16,3.1.3.6；NCBI，GenBank，登录号NC_000913.3，核苷酸位置：4434622至4436565，互补物)，基因ID：948729)，并且其位于大肠杆菌菌株K-12染色体的cysQ基因和相反链中的ytfH基因之间。cdpB基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:5)和由对大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655天然的cdpB基因编码的CpdB蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)是已知的。此外，还已知对属于肠杆菌科的其他细菌物种天然的CpdB的氨基酸同源物，诸如例如对物种宋内志贺氏菌和弗氏志贺氏菌(与对大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655(SEQ IDNO:6)天然的CpdB的同一性：99％)，弗氏柠檬酸杆菌和肠沙门氏菌(同一性：91％)，抗坏血酸克吕沃尔菌(Kluyvera ascorbata)(同一性：89％)，阴沟肠杆菌(同一性：88％)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)(同一性：87％)，菠萝泛菌(同一性：75％)等(参见例如，NCBI数据库)天然的同源物。因此，对大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655天然的CpdB蛋白和编码其的cdpB基因也可以具有分别作为SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列和SEQ ID NO:5中所示的核苷酸序列的蛋白质同源物的蛋白质和基因。
下文给出的对大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655天然且编码AphA蛋白的aphA基因的变体的解释也可以比照适用于任何基因和由该基因编码的蛋白质，包括可以用于如本文所述方法的对属于肠杆菌科的其他细菌物种天然的基因和蛋白质。
细菌科、属、种或菌株之间的DNA序列可能有所不同。因此，aphA基因不限于SEQ IDNO:1中所示的基因，而是可以包括作为SEQ ID NO:1的变体核苷酸序列或与SEQ ID NO:1同源，且编码AphA蛋白的变体的基因。
短语“变体蛋白质”可以意指与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列相比在序列中具有一个或多个突变的蛋白质，不论它们是一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，但其仍然保持蛋白质的活性或功能，或者变体蛋白质的三维结构相对于未修饰的蛋白质(诸如例如具有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的野生型蛋白质AphA)未显著改变。变体蛋白质的变化数量取决于蛋白质的三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸残基的类型。其可以是但不严格限于SEQ ID NO:2中的1至50，在另一个实例中1至40，在另一个实例中1至30，在另一个实例中1至20，在另一个实例中1至15，在另一个实例中1至10和在另一个实例中1至5。这是可能的，因为氨基酸彼此可以具有高度同源性，从而蛋白质的活性或功能不受此类变化的影响，或者蛋白质的三维结构相对于未修饰的蛋白质(诸如例如野生型蛋白质)未显著改变。因此，由aphA基因的变体核苷酸序列编码的变体蛋白质可以具有相对于SEQ ID NO:2中所示的完整氨基酸序列具有不少于60％，不少于70％，不少于75％，不少于80％，不少于85％，不少于90％，不少于95％，不少于96％，不少于97％，不少于98％，或不少于99％的同源性，其定义为当使用计算机程序blastp时的参数“同一性”，只要保持蛋白质的活性或功能，或者变体蛋白质的三维结构相对于未修饰的蛋白质(诸如例如具有SEQ IDNO:2中所示的氨基酸序列的野生型蛋白质AphA)未显著改变。
在本说明书中，“同源性”可以意指“同一性”，即氨基酸残基或核苷酸的同一性。将两个序列之间的序列同一性计算为当比对两个序列以实现彼此最大比对时两个序列中匹配的残基的比率。
示例性的一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加可以是保守突变。代表性的保守突变可以是保守取代。保守取代可以是但不限于，其中如果取代位点是芳香族氨基酸，取代相互发生在Phe、Trp和Tyr之间；如果取代位点是疏水性氨基酸，在Ala、Leu、Ile和Val之间；如果取代位点是亲水性氨基酸，在Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、His和Thr之间；如果取代位点是极性氨基酸，在Gln和Asn之间；如果取代位点是碱性氨基酸，在Lys、Arg和His之间；如果取代位点是酸性氨基酸，在Asp和Glu之间；并且如果取代位点是具有羟基基团的氨基酸，在Ser和Thr之间的取代。保守取代的实例包括用Ser或Thr取代Ala，用Gln、His或Lys取代Arg，用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn，用Asn、Glu或Gln取代Asp，用Ser或Ala取代Cys，用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln，用Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu，用Pro取代Gly，用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His，用Leu、Met、Val或Phe取代Ile，用Ile、Met、Val或Phe取代Leu，用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys，用Ile、Leu、Val或Phe取代Met，用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe，用Thr或Ala取代Ser，用Ser或Ala取代Thr，用Phe或Tyr取代Trp，用His、Phe或Trp取代Tyr以及用Met、Ile或Leu取代Val。
示例性的一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加也可以是非保守突变，条件是通过氨基酸序列的不同位置中的一个或多个次级突变来补偿突变，使得保持蛋白质的活性或功能，或者变体蛋白质的三维结构相对于未修饰的蛋白质(诸如例如野生型蛋白质)未显著改变。
可以使用算法blastp进行多肽的同一性百分比的计算。更具体地说，可以使用由国家生物技术信息中心(NCBI)提供的算法blastp以得分参数的默认设置(矩阵：BLOSUM62；空位成本：存在＝11延伸＝1；组成调整：条件组成分数矩阵调整)进行多肽的同一性百分比的计算。可以使用算法blastn进行多核苷酸的同一性百分比的计算。更具体地，可以使用由NCBI提供的算法blastn以得分参数的默认设置(匹配/错配得分＝1，-2；空位成本＝线性)进行多核苷酸的同一性百分比的计算。
编码AphA蛋白的aphA基因可以是变体核苷酸序列。短语“变体核苷酸序列”可以意指使用根据标准遗传密码表(参见例如，Lewin B.,“Genes VIII”,2004,PearsonEducation,Inc.,Upper Saddle River,NJ 07458)的任何同义氨基酸密码子，编码变体蛋白质的核苷酸序列。因此，编码AphA蛋白的aphA基因可以是由于遗传密码的简并性的变体核苷酸序列。
短语“变体核苷酸序列”也可以意指但不限于，在严格条件下能够同与SEQ ID NO:1中所示的序列互补的核苷酸序列，或可以从编码具有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列制备的探针杂交的核苷酸序列。严格条件可以包括形成特定杂合物，例如具有不少于60％，不少于70％，不少于75％，不少于80％，不少于85％，不少于90％，不少于95％，不少于96％，不少于97％，不少于98％，或不少于99％的同源性(定义为当使用计算机程序blastn时的参数“同一性”)的杂合物，并且未形成非特异性杂合物，例如具有低于以上的同源性的杂合物的条件。例如，可以通过于60℃在1×SSC(标准柠檬酸钠或标准氯化钠)、0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)，于65℃在0.1×SSC、0.1％SDS，或于65℃在0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度下洗涤一次或多次，或者在另一个实例中两次或三次来例示严格条件。洗涤的持续时间可以取决于用于印迹法的膜的类型，并且一般说来应是制造商推荐的。例如，在严格条件下，Amersham HybondTM-N+带正电荷的尼龙膜(GE Healthcare)的推荐洗涤持续时间为15分钟。洗涤步骤可以进行2至3次。作为探针，也可以使用与SEQ ID NO:1中所示的序列互补的序列的一部分。可以通过使用基于SEQ ID NO:1中所示的序列制备的寡核苷酸作为引物以及含有核苷酸序列的DNA片段作为模板的PCR(聚合酶链反应；参见WhiteT.J.et al.,The polymerase chain reaction,Trends Genet.,1989,5:185-189)生产此类探针。建议探针长度>50bp；它可以根据杂交条件适当选择，并且通常为100bp至1kbp。例如，当使用长度为约300bp的DNA片段作为探针时，杂交后的洗涤条件可以是例如于50℃、60℃或65℃ 2x SSC、0.1％SDS。
由于已经阐明了对物种大肠杆菌天然且编码AphA蛋白的aphA基因(参见上文)，可以通过利用肠杆菌科的细菌和基于对细菌天然的aphA基因的核苷酸序列制备的寡核苷酸引物的PCR；或者通过在体外用例如羟胺处理含有野生型aphA基因的DNA的定点诱变方法，或者用紫外线(UV)辐照或突变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和通常用于此类处理的亚硝酸处理微生物例如具有野生型aphA基因的属于肠杆菌科的细菌的方法；或者化学合成为全长基因结构来获得编码AphA蛋白的变体蛋白质的aphA基因的变体核苷酸序列。
短语“野生型”(其可以等同于本文中关于基因(例如，“野生型基因”)和蛋白质(例如，“野生型蛋白质”)使用的短语“天然”和“自然”)可以分别意指存在于和/或自然表达于和/或产生于野生型细菌，例如属于肠杆菌科的细菌的野生菌株，诸如例如大肠杆菌MG1655菌株(ATCC 47076)，大肠杆菌W3110菌株(ATCC 27325)，菠萝泛菌AJ13355菌株(FERM BP-6614)等的天然基因或天然蛋白质。由于蛋白质由基因编码，因此“野生型蛋白质”可以由野生型细菌的基因组中天然或自然存在的“野生型基因”编码。
可以通过将上述编码具有所期望活性的蛋白质的DNA引入已经进行了修饰以减弱一种或多种上述编码磷酸酶的DNA的表达的细菌中来获得可以用于如本文所述方法中的细菌。或者，可以通过在已经进行了修饰以产生具有所期望活性的蛋白质的细菌中减弱一种或多种上述编码磷酸酶的DNA的表达来获得该细菌。
除了已经提到的特性之外，细菌可以具有其他特定特性，如各种营养需求、药物抗性、药物敏感性和药物依赖性，而不脱离本发明的范围。
2.方法
如本文所述的底物的酶促磺酰化的方法包括以下步骤：在含有属于肠杆菌科的细菌的培养基中使底物与PAPS反应以产生底物的硫酸化衍生物(也可以称为靶标化合物)，并从培养基中收集硫酸化衍生物。该方法可以任选地包括从培养基中纯化硫酸化衍生物，以使得可以以期望的纯度等级获得靶标化合物的步骤，和/或其他所需的步骤。
使用如本文所述的方法使底物反应的步骤可以在适合于具有所期望活性的蛋白质发挥功能的条件下进行，从而可以产生底物的硫酸化衍生物或靶标化合物。可以在该方法中使用的培养基可以是任何培养基，只要可以使用该方法在该培养基中将底物磺酰化以产生其硫酸化衍生物即可。培养基可以含有使用如本文所述的方法进行底物的磺酰化所需的组分，并且这些组分至少包括溶剂、属于肠杆菌科的细菌、PAPS和底物。除了这些组分之外，培养基还可以含有一种或多种其他成分，诸如例如有机和/或无机盐，酸性或碱性物质，表面活性剂，对硝基苯硫酸盐/酯(pNPS)，蛋白质(包括酶)等。关于溶剂，可以使用水基培养基，其中至少具有磺基转移酶活性的蛋白质可以起作用，从而可以确定该蛋白质的活性。例如，可以使用在其中已经培养可以在该方法中使用的细菌的培养基用于底物的酶促磺酰化，条件是该培养基补充有底物的磺酰化所需的组分。此外，可以适当地选择培养基的组成，以使其他蛋白质，例如具有肝素前体-N-硫酸-葡糖醛酸5-差向异构酶活性的蛋白质和/或具有3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸-磺基转移酶活性的蛋白质等也可以起作用。
由于可以在如本文所述的方法中使用的细菌已经进行了修饰以至少产生具有磺基转移酶活性的蛋白质，并且可以对其进行进一步修饰以产生具有肝素前体-N-硫酸-葡糖醛酸5-差向异构酶活性的蛋白质和/或具有3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸-磺基转移酶活性的蛋白质，因此可以在不从细菌细胞和/或其中培养有细菌的培养基中分离和/或纯化的情况下使用具有上述活性的蛋白质。也就是说，可以使用含有如本文所述已经进行了修饰的细菌的培养基，只要可以在培养基中确定具有所期望活性的蛋白质的活性，或者可以使用该方法生产底物的硫酸化衍生物即可。可以使用的培养基可以含有破碎的细菌细胞(所谓的粗细胞裂解物)，从而可以更有效地使用具有期望活性的蛋白质。细胞破碎的方法在本领域中是众所周知的，并且这些包括例如机械破碎，液体匀化(包括弗氏压碎(French press))，高频声波(所谓的超声裂解)，冻融循环，手动研磨等。
可以通过参考可以在该方法中使用的蛋白质的特性来适当地选择和调整使用如本文所述方法进行底物的酶促磺酰化的条件，这些特性是本领域技术人员众所周知的并且可以例如在综合酶信息系统(The Comprehensive Enzyme Information System)(Brenda,https://www.brenda-enzymes.org)和UniProtKB数据库(https://enzyme.expasy.org)中找到。例如，当使用对哺乳动物物种天然的蛋白质时，可以在25至35℃的温度下进行磺酰化24至72小时，并且pH可以保持在6.5至7.5。
可以在如本文所述的方法中使用的属于肠杆菌科的细菌可以在适于培养选择用于该方法的细菌的条件下进行培养。例如，当培养属于埃希氏菌属的细菌时，可以在有氧条件下进行16至72小时，16至24小时或32至48小时的培养，可以将培养期间的培养温度控制在30至45℃内或30至37℃内，并且pH可以在5和8之间或6和7.5之间调整。可以使用无机或有机酸性或碱性物质(如尿素，碳酸钙或氨气)调整pH。
培养基可以是合成的或天然的培养基，如含有碳源、氮源、硫源、磷源、无机离子以及所需的其他有机和无机组分的典型培养基。作为碳源，可以使用糖类如葡萄糖，蔗糖，乳糖，半乳糖，果糖，阿拉伯糖，麦芽糖，木糖，海藻糖，核糖和淀粉的水解产物；醇类如乙醇，甘油，甘露醇和山梨糖醇；有机酸如葡糖酸，富马酸，柠檬酸，苹果酸和琥珀酸；脂肪酸等。作为氮源，可以使用无机铵盐如硫酸铵，氯化铵和磷酸铵；有机氮如大豆水解产物；氨气；氨水；等。此外，也可以利用蛋白胨，酵母提取物，肉提取物，麦芽提取物，玉米浆等。培养基可以含有一种或多种类型的这些氮源。硫源可以包括硫酸铵、硫酸镁，硫酸亚铁，硫酸锰等。除碳源、氮源和硫源外，培养基可以含有磷源。作为磷源，可以利用磷酸二氢钾，磷酸氢二钾、磷酸盐聚合物如焦磷酸等。维生素如维生素B1，维生素B2，维生素B6，烟酸，烟酰胺，维生素B12，所需的物质例如有机营养物如核酸(如腺嘌呤和RNA)，氨基酸，蛋白胨，酪蛋白氨基酸，酵母提取物等可以以适当的量(即使是痕量)存在。除了这些外，如果必要的话，可以添加少量的磷酸钙、铁离子、锰离子等。
可以以游离形式或作为其盐或这些的混合物产生底物的硫酸化衍生物。例如，可以通过该方法产生靶标化合物的钠、钾、铵、钙等盐。这是可能的，因为在典型的酸碱中和反应中，磺基基团(-SO3H)可以在磺酰化条件下与中和剂(诸如例如碱性物质)反应以形成盐，该盐是含磺基的分子的化学特征，这对本领域普通技术人员而言是显而易见的。
在使底物反应的步骤之后，可以使用常规技术从培养基收集底物的硫酸化衍生物，所述常规技术诸如例如，浓缩、沉淀、结晶、离子交换色谱、中压或高压液相色谱或这些的组合，其对本领域普通技术人员是众所周知的。此外，可以纯化从培养基收集的硫酸化衍生物，使得可以以期望的纯度等级，诸如例如不小于30％，不小于40％，不小于50％，不小于60％，不小于70％，不小于80％，不小于90％，不小于95％，不小于96％，不小于97％，不小于98％，不小于99％或不小于99.9％的纯度等级获得靶标化合物。纯度可以例如以重量比重量(w/w)等表示。
例如，当使用本文所述的酶促磺酰化的方法获得肝素作为靶标化合物时，可以使用例如van der Meer J.-Y.et al.,2017以及其中引用的参考文献中所述的规程从培养基收集肝素。特别地，首先，可以使用季铵盐诸如例如1622从培养基沉淀出肝素。然后，可以使用浓缩的NaCl溶液提取沉淀的/>-肝素复合物以获得肝素钠盐。然后可以在温度、pH和盐浓度的控制下对肝素钠盐进行阴离子交换色谱，以回收根据电荷和比活性分级分离的肝素。在这一阶段，通常可以获得处于足够纯度等级的肝素。可以例如作为低分子量肝素(缩写为“LMWH”)获得肝素。低分子量肝素可以意指例如分子量为1000至10000Da的级分(平均分子量为4000至6000Da)。LMWH的优点是与非分级分离的肝素相比，显示更少的出血的不良反应。
任选地，可以通过应用使用有机溶剂诸如例如甲醇、乙醇、丙醇或丙酮进行的沉淀和使用例如高锰酸钾(KMnO4)、过氧化氢(H2O2)、过乙酸(CH3CO3H)、次氯酸钠(NaClO)或臭氧(O3)进行的漂白来进一步纯化肝素。最终可以通过从高百分比的甲醇或乙醇沉淀来纯化肝素。如果需要的话，沉淀的肝素可以在真空下于40至75℃的温度下干燥。
还可接受的是，当使用如本文所述的酶促磺酰化的方法获得肝素作为靶标化合物时，也可以对肝素进行解聚步骤。可以例如通过使用亚硝酸或通过光解方法来进行，或者可以通过应用肝素酶I、II或III或它们的组合来酶促地进行解聚。解聚的程度没有特别限制。可以进行解聚，以获得分子量例如为1000至35000Da的肝素。
实施例
将参考以下非限制性实施例更具体地解释本发明。
实施例1.研究具有缺失的磷酸酶编码基因的大肠杆菌菌株2(ΔptrAΔhslU)的细胞裂解物中PAP和PAPS的稳定性。
1.1.大肠杆菌K-12菌株2(ΔptrAΔhslU)。
在大肠杆菌K-12菌株2(ΔptrAΔhslU)的粗细胞裂解物中研究了PAP和PAPS的稳定性，已对该菌株进行了进一步修饰以缺失一种或多种选自aphA、cysQ和cpdB基因的磷酸酶编码基因。已知细胞中合成的或由细胞产生的蛋白质的酶促活性可以受到蛋白质二硫键的正确形成的影响(参见例如Ke N.and Berkmen M.,Production ofdisulfide-bonded proteins in Escherichia coli,Curr.Protoc.Mol.Biol.,2014,108:16.1B.1-21)。因此，选择具有基因型Δ(ara-leu)7697ΔlacX74ΔphoA PvuII phoRaraD139 ahpC galE galK rpsL F′[lac+lacIq pro]gor522::Tn10 trxB(StrR,TetR)的大肠杆菌K-12菌株/>2(Merck,cat.No.71344-3)用于生产磺基转移酶和肝素前体-N-硫酸-葡糖醛酸5-差向异构酶。该菌株在编码硫氧还蛋白还原酶(trxB)和谷胱甘肽还原酶(gor)的基因中具有突变，从而大大增强了大肠杆菌细胞质中二硫键的形成。
还已知磺基转移酶和肝素前体-N-硫酸-葡糖醛酸5-差向异构酶可以在大肠杆菌细菌中作为麦芽糖结合蛋白(MBP)标记的蛋白质有效地生产(参见例如，Bethea H.N.etal.,Redirecting the substrate specificity of heparan sulfate2-O-sulfotransferase by structurally guided mutagenesis,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2008,105(48):18724-18729；Li K.et al.,Using engineered2-O-sulfotransferase todetermine the activity of heparan sulfate C5-epimerase and its mutants,J.Biol.Chem.,2010,285(15):11106-11113)。但是，可以期望进一步改善在粗细胞裂解物中产生靶蛋白的效率。这可以通过例如减少MBP标记的蛋白质的蛋白水解降解来实现。具体而言，可以在表达蛋白质的细菌中缺失一种或多种蛋白酶编码基因。我们发现通过缺失分别编码HslVU蛋白酶的周质蛋白酶III和ATPase组分的ptrA和hslU基因，可以显著改善大肠杆菌细胞的粗裂解物中MBP标记的蛋白质的稳定性。
因此，选择了大肠杆菌K-12菌株2(ΔptrAΔhslU)作为生产MBP标记的蛋白质以及研究PAP和PAPS在粗细胞裂解物中的稳定性的最佳宿主菌株。
1.2.大肠杆菌Δ2-5-菌株的构建。
ptrA、hslU、cysQ、cpdB和aphA基因在大肠杆菌K-12菌株2的染色体中被一一缺失。使用框内基因缺失方法(也称为Dual-In/Out方法)((Minaeva N.I.et al.,BMC Biotechnol.,2008,8:63))。表1描述了构建的Δ2-5-菌株。
1.3.粗细胞裂解物的制备。
Δ2-5-菌株各自在50mL试管中于37℃在10mL的LB培养基(Sambrook,J.andRussell,D.W.“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,3rd ed.,Cold SpringHarbor Laboratory Press(2001))中生长过夜(约16小时)。然后，通过离心(5000rpm)收获细胞，将其重悬于0.3mL的缓冲液A(100mM Tris-HCl，pH 7.5；10％(v/v)甘油)中，并通过超声处理破坏。通过离心(13000rpm)沉淀不可溶性细胞组分的级分。将粗细胞裂解物的可溶性级分(所谓的上清液)转移到新的小瓶中，并将其用于在PAP(S)稳定性测定法中研究PAP和PAPS的稳定性。
1.4.PAP(S)稳定性测定法。
每个反应混合物(100μL)含有：50mM MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)，pH7.0；1mMMgCl2；Triton x 100，1％(v/v)；和0.4mg/mL的PAP或PAPS。加入粗细胞裂解物的可溶性级分(实施例1.3)，直至反应混合物中的最终蛋白质浓度为2.5mg/mL。作为对照，使用水代替裂解物。将每种反应混合物在30℃下温育表2和表3中所示的时间段，然后使用HPLC方法进行分析。HPLC分析的条件如下：
设备：Alliance Waters，
柱：TSK GEL DEAE-5PW 2x 75mm，10μm，
检测：UV检测器(双吸光度检测器)，对于NS和NS2S在235nm处进行检测，对于PAP和PAPS在254nm处进行检测，其中NS意指α-ΔUA-[1→4]-GlcNS，并且NS2S意指α-ΔUA-2S-[1→4]-GlcNS，其中ΔUA意指4-脱氧-L-苏式-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸(4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid)，并且GlcNS意指N-磺基-D-葡糖胺，
洗脱梯度：0min–0％B，15min–5％B，20min–30％B，30min–100％B，持续30min–至0％B，其中洗脱缓冲液A为2.56mM NaH2PO4(pH 3.0，用H3PO4调节)，5％乙腈；并且洗脱缓冲液B为2.56mM NaH2PO4(pH 3.0，用H3PO4调节)，0.5M LiCl2，
温度：40℃，
洗脱速度：0.2mL/min，
注射体积：10μL，
注射时间：50min，
压力：140-160psi，
校准样品：1-200mg/L，
检出限：0.005mg/L。
洗脱时间：PAP(19.42min)，NS(21.94min)，PAPS(26.02min)，NS2S(28.91min)。
PAP(S)稳定性测定法的结果显示在表2和3中。从表2可以看出，PAP在Δ2-菌株的粗细胞裂解物中特别不稳定，其在22小时内完全降解。Δ2-菌株中cysQ基因缺失以获得Δ3-菌株导致PAP稳定性的改善；但是，整个PAP在22小时内降解。Δ3-菌株中cpdB基因缺失以获得Δ4-菌株导致PAP稳定性的显著改善；温育22小时后，约25％的PAP维持在反应混合物中。Δ4-菌株中aphA基因缺失以获得Δ5-菌株导致PAP稳定性再改善两倍；温育22小时后，约50％的PAP维持在反应混合物中。因此，PAP的稳定性可以通过缺失一种或多种编码AphA、CysQ和CpdB的基因来改善。
从表3可以看出，PAPS在Δ2-菌株的粗细胞裂解物中特别不稳定；其在22小时内完全降解。Δ2-菌株中cysQ基因缺失以获得Δ3-菌株导致在22小时内PAPS稳定性再改善十倍。Δ3-菌株中cpdB基因缺失以获得Δ4-菌株未导致PAPS稳定性的改善。Δ4-菌株中aphA基因缺失以获得Δ5-菌株导致PAPS稳定性再改善两倍。因此，PAPS的稳定性可以通过缺失一种或两种编码AphA和CysQ的基因来改善。
实施例2.使用PAPS作为磺基基团的供体，对低分子量肝素前体N-硫酸盐/酯进行酶促磺酰化。
使用PAPS作为磺基基团的供体和可以产生硫酸肝素前体2-O-磺基转移酶(HS 2-OST)和肝素前体-N-硫酸-葡糖醛酸5-差向异构酶(HNSG-5epi)的Δ2-5-菌株的粗细胞裂解物，对低分子量肝素前体N-硫酸盐/酯(缩写为“LMWHS”)进行酶促磺酰化。
2.1.pACYC184-MBP*-2OSTY94A(D69-N356)质粒的构建。
2.1.1.pMAL*载体的构建。
修饰pMAL-c2X载体(New England BioLabs,cat.No.E8000S)以用编码MBP蛋白的C端的DNA片段替换编码肽接头S3N10LGIEGRISEFGS的DNA片段，其中位置359处的谷氨酸残基被丙氨酸残基替换(E359A)，位置362处的赖氨酸残基被丙氨酸残基替换(K362A)，并且位置363处的天冬氨酸残基被丙氨酸残基替换(D363A)(Rob J.C.et al.,Crystallization ofa trimeric human T cell leukemia virus type 1gp21 ectodomain fragment as achimera with maltose-binding protein,Prot.Science,1998,7:1612-1619)。另外，将限制性位点HindIII-BamHI-SacI-XhoI-NotI引入载体。
使用引物P1(SEQ ID NO:7)和P2(SEQ ID NO:8)，以pMAL-c2X质粒作为模板扩增含有侧翼为5’-BglII和3’-HindIII限制性位点的MBP的C端的部分的PCR片段。将PCR产物连接到pMAL-c2X质粒的BglII/HindIII限制性位点中。由此，构建了pMAL*载体。
2.1.2.pMAL*-2OSTY94A(D69-N356)质粒的构建。
通过定制DNA合成(Thermo Fisher Scientific)以化学方式合成包含编码突变体HS 2-OST的编码序列(CDS)的DNA片段(SEQ ID NO:9)，该突变体HS 2-OST具有SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列，其对应于在对长尾仓鼠(UniProtKB，登录号O0889.1)天然的HS 2-OST中从位置69处的天冬氨酸残基(D69)至位置356处的天冬酰胺残基(N356)的多肽，其中位置94处的酪氨酸残基被丙氨酸残基替换(Y94A)。使用限制酶NotI和XhoI消化该DNA片段，并将其克隆到pMAL*/NotI-XhoI载体中(实施例2.1.1)。因此，构建了pMAL*-2OSTY94A(D69-N356)质粒。
2.1.3.pACYC184-MBP*-2OSTY94A(D69-N356)质粒的构建。
将pMAL*-2OST(D69-N356)质粒的3.6-kbp FspI-HindIII DNA片段亚克隆到pACYC184克隆载体(GenBank/EMBL，登录号X06403)的EcoRV/HindIII限制性位点中。因此，构建了pACYC184-MBP*-2OSTY94A(D69-N356)质粒。
2.2.pSUMO-dreGlce(G70-N585)质粒的构建。
通过定制DNA合成(Thermo Fisher Scientific)以化学方式合成编码源自pETiteTM N-His SUMO Kan载体(Lucigen Corporation,2905Parmenter St,Middleton,WI53562 USA)的N-标记的6xHis-SUMO肽(SEQ ID NO:12)的DNA片段(SEQ IDNO:11)，该肽与具有SEQ ID NO:13中所示氨基酸序列的HNSG-5epi的(G70-N585)片段融合，该氨基酸序列对应于在对斑马鱼天然的HNSG-5epi(NCBI参考序列：NP_998014.1)中从位置70处的甘氨酸残基(G70)至位置585处的天冬酰胺残基(N585)的多肽。使用限制酶NdeI和XhoI消化DNA片段，将其克隆到pMAL*/NdeI-XhoI载体中(实施例2.1.1)。因此，构建了pSUMO-dreGlce(G70-N585)质粒。/>
2.3.包含pACYC184-MBP*-2OSTY94A(D69-N356)和pSUMO-dreGlce(G70-N585)质粒的Δ2-5-菌株的构建。
使用标准电穿孔规程(0.1cm比色杯(Bio-Rad)；电压，2kV；持续时间，5μs)将pACYC184-MBP*-2OSTY94A(D69-N356)和pSUMO-dreGlce(G70-N585)质粒引入Δ2-5-菌株中。首先，引入pSUMO-dreGlce(G70-N585)质粒以构建Δ2-5/pSUMO-dreGlce(G70-N585)菌株。然后，将pACYC184-MBP*-2OSTY94A(D69-N356)质粒引入Δ2-5/pSUMO-dreGlce(G70-N585)菌株中，以构建具有两个质粒的靶标Δ2-5-菌株。具有pACYC184-MBP*-2OSTY94A(D69-N356)和pSUMO-dreGlce(G70-N585)质粒的Δ2-5-菌株称为Δ2-5/pSUMO/pACYC184菌株。
2.4.Δ2-5/pSUMO/pACYC184的粗细胞裂解物的可溶性级分的制备。
将在含有氨苄青霉素(200mg/L)和氯霉素(30mg/L)的LB肉汤中各自以1.25mL的体积生长过夜的具有pACYC184-MBP*-2OSTY94A(D69-N356)和pSUMO-dreGlce(G70-N585)质粒的Δ2-5-菌株的细胞培养物接种到烧瓶中50mL的含有氨苄青霉素(150mg/L)和氯霉素(30mg/L)的LB肉汤中，然后在37℃下培养至OD600约0.8。然后，通过加入IPTG(异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)至0.5mM的终浓度来诱导HS 2-OST和HNSG-5epi的合成。在20℃下继续培养48小时。
通过离心(5000rpm)收获所得的生物质，将其重悬于0.3mL的50mM MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)溶液(pH 7)中，并进行超声处理以破坏细胞。然后通过离心(13000rpm)沉淀出含有不可溶性蛋白质的粗细胞裂解物的不可溶性级分，将其重悬于0.3mL样品缓冲液(20mMTris-HCl，pH 6.8；50mM DTT(1,4-二硫苏糖醇)，0.1％(v/v)SDS，30％(v/v)甘油)中并在95℃下温育10分钟。然后通过离心(13000rpm)再次沉淀不可溶性级分。获得的上清液用作不可溶性蛋白质制剂。将由于上述规程获得的且含有可溶性蛋白质(包括具有硫酸乙酰肝素2-O-磺基转移酶和肝素前体-N-硫酸-葡糖醛酸5-差向异构酶活性的蛋白质)的粗细胞裂解物的可溶性级分(所谓的上清液)转移到新的小瓶中，并在4℃下储存多达3-5小时直到使用。如此制备的粗细胞裂解物的可溶性级分中蛋白质的平均浓度为20mg/mL。
为了分析具有pACYC184-MBP*-2OSTY94A(D69-N356)和pSUMO-dreGlce(G70-N585)质粒的Δ2-5-菌株的粗细胞裂解物的可溶性和不可溶性级分中的蛋白质的含量，对1μL的每种制剂进行SDS-PAGE分析(图3)。从图3可以看出，在所有分析的菌株的粗细胞裂解物中，HS 2-OST和HNSG-5epi的绝对和相对量是相同的。
2.5.使用PAPS作为磺基基团的供体的LMWHS的2-O-磺酰化。
在总体积100μL的反应混合物中进行LMWHS的2-O-磺酰化，所述反应混合物含有：50mM MES，pH 7；1mM MgCl2；1％(v/v)Triton x 100；1mM CaCl2；1.2mM PAPS；1mg/mL LMWHS(辅助实施例)；和83μL的粗细胞裂解物的可溶性级分(实施例2.4)。阴性(对照)反应含有上述组分，除了用水替换裂解物。将反应混合物在30℃下温育48小时。然后，将一部分反应混合物用肝素酶I、II和III(New England BioLabs,cat.No.P0735S,PO736S,P0737S)处理。总体积为100μL的反应混合物含有：温育后获得的30μL的反应混合物，10μL的肝素酶缓冲液(New England BioLabs)，肝素酶I、II和III(每种酶1μL)和60μL的H2O。将反应混合物在30℃下温育24小时，然后使用HPLC方法对其分析二糖NS(α-ΔUA-[1→4]-GlcNS)和NS2S(α-ΔUA-2S-[1→4]-GlcNS)的存在和量。HPLC分析的条件如实施例1.4中所述。
在表4中显示了LMWHS的2-O-磺酰化的结果。从表4可以看出，与Δ2/pSUMO/pACYC184菌株相比，当使用具有缺失的cysQ、cpdB和aphA基因的Δ5/pSUMO/pACYC184菌株的粗细胞裂解物时，使用PAPS作为磺基基团的供体的LMWHS的2-O-磺酰化的效率高约1.4倍。
实施例3.在存在pNPS的情况下低分子量肝素前体N-硫酸盐/酯的酶促磺酰化。
使用PAPS作为磺基基团的供体，还在含有pNPS和芳基磺基转移酶的Δ2-5/pSUMO/pACYC184菌株的粗细胞裂解物中进行了LMWHS的酶促磺酰化。
3.1.褐家鼠芳基磺基转移酶1A1的表达和纯化。
首先，构建了pETDuet-N-Tag6xHis-ST1A1质粒，该质粒具有编码对褐家鼠天然的ST1A1的基因。通过定制DNA合成(Thermo Fisher Scientific)以化学方式合成含有编码对褐家鼠天然的芳基磺基转移酶1A1(缩写为“ST1A1”，也称为“Sult1a1”)的基因的DNA片段(SEQ ID NO:14)。使用限制酶EcoRI和HindIII消化获得的DNA片段，并将其克隆到pETDuet-1/EcoRI-HindIII载体(Novagen)中。因此，获得了与6xHis标签融合的编码对褐家鼠天然的ST1A1的基因。
然后，表达6xHis标记的ST1A1并使用固定化的金属离子亲和色谱(IMAC)在1mLHiTrap柱(GE Healthcare)上纯化。应用制造商推荐的标准规程。
3.2.在存在pNPS的情况下LMWHS的2-O-磺酰化。
在总体积100μL的反应混合物中进行LMWHS的2-O-磺酰化，所述反应混合物含有：50mM MES，pH 7；1mM MgCl2；1％(v/v)Triton x 100；1mM CaCl2；46μM PAP；10mM pNPS；1mg/mL LMWHS(辅助实施例)；4.75μg ST1A1(实施例3.1)；和74μL的粗细胞裂解物的可溶性级分(实施例2.4)。阴性(对照)反应含有上述组分，除了用水替换裂解物。将反应混合物在30℃下温育48小时。用肝素酶处理反应混合物的条件和使用HPLC分析所得混合物的条件与实施例2.5中所述相同。
表5中显示了在存在pHPS的情况下的LMWHS的2-O-磺酰化的结果。从表5可以看出，使用PAPS作为磺基基团的供体，在存在pNPS的情况下，当使用具有缺失的cysQ、cpdB和aphA基因的Δ5/pSUMO/pACYC184菌株的粗细胞裂解物时，LMWHS的磺酰化产率为75％，而当使用Δ2/pSUMO/pACYC184菌株的粗细胞裂解物时未检测到LMWHS的磺酰化产物。而且，分别与具有缺失的cysQ基因的Δ3/pSUMO/pACYC184菌株和具有缺失的cysQ和cpdB基因的Δ4/pSUMO/pACYC184菌株相比，当使用具有缺失的cysQ、cpdB和aphA基因的Δ5/pSUMO/pACYC184菌株的粗细胞裂解物时，使用PAPS作为磺基基团的供体，在存在pNPS的情况下，LMWHS的2-O-磺酰化高约16和15倍。
实施例4.使用pNPS作为磺基基团的供体的PAP的酶促磺酰化。
4.1.pPlac-N-Tag6xHis-ST1A1质粒的构建。
为了构建pPlac-N-Tag6xHis-ST1A1质粒，使用引物P3(SEQ ID NO:15)和P4(SEQID NO:16)以及pETDuet-N-Tag6xHis-ST1A1质粒(实施例3.1)作为模板通过PCR获得了DNA片段。将获得的DNA片段连接到pMAL*质粒的NdeI/HindIII位点(实施例2.1.1)。
4.2.具有pPlac-N-Tag6xHis-ST1A1质粒的Δ2-5-菌株的构建。
使用标准电穿孔规程(0.1cm比色杯(Bio-Rad)；电压2kV；持续时间，5μs)将pPlac-N-Tag6xHis-ST1A1质粒引入Δ2-5-菌株(实施例1.2，表1)。具有pPlac-N-Tag6xHis-ST1A1质粒的Δ2-5-菌株称为Δ2-5/pST1A1菌株。
4.3.Δ2-5/pST1A1菌株的粗细胞裂解物的可溶性级分的制备。
将通过在琼脂平板上过夜生长而新鲜制备的Δ2-5/pST1A1菌株的细胞接种到20mL试管中5mL的含有氨苄青霉素(200mg/L)的LB肉汤中，直至初始OD595为0.1，并在37℃下培养至最终OD595为1.2。然后，通过添加IPTG(异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖糖苷)至1mM的终浓度来诱导N-Tag6xHis-ST1A1的合成。在25℃下继续培养16小时。通过在3.3rcf(相对离心力)下于4℃离心10分钟来收获所得的生物质，用25mL的0.9％NaCl溶液洗涤两次，并于-20℃冷冻直至使用。
解冻的细胞沉淀重悬于0.5mL的缓冲液(100mM Tris-HCl，10％(v/v)甘油，pH7.4)中，并通过超声处理破坏细胞。通过以13000rpm离心约20分钟来去除细胞碎片。所得的粗细胞裂解物用作ST1A1蛋白制剂。
4.4.使用pNPS作为磺基基团的供体的PAP的磺酰化。
每个总体积100μL的反应混合物含有：50mM Tris-HCl，pH 7；230μM PAP；1mMpNPS；10％(v/v)甘油；0.1mg/mL的Δ2-5/pST1A1菌株的粗细胞裂解物。在标准的96孔板中制备混合物。通过添加PAP来起始反应。将反应混合物在MultiskanGo(Thermo Scientific)中于30℃温育3小时。对于所有使用的孔，每5分钟测量OD405，从而获得pNP合成的动力学(图4)。使用OD405对pNP浓度的依赖性获得的校准曲线确定pNP的绝对浓度。鉴于等式：PAP+pNPS＝PAPS+pNP，假定反应混合物中PAPS的累积量(以摩尔比计)等于pNP的累积量。
从获得的实验数据可以看出(图4)，当使用具有缺失的cysQ、cpdB和aphA基因的Δ5/pST1A1菌株的粗细胞裂解物时，观察到PAP的最高磺酰化产率。与不具有缺失的cysQ、cpdB和aphA基因的Δ2/pST1A1菌株的粗细胞裂解物中PAPS的累积产率(以μM计)相比，Δ5/pST1A1菌株的粗细胞裂解物中PAPS的积累产率高约两倍。
辅助实施例。低分子量肝素前体N-硫酸盐/盐(LMWHS)的制备。
(1)肝素前体的制备。
(1.1)肝素前体发酵。
使用产肝素前体细菌(大肠杆菌BL21(DE3)/pVK9-kfiABCD菌株)和WO2015/050184的实施例1中所述的培养条件获得含有肝素前体的培养液。
(1.2)肝素前体的纯化。
通过离心从培养液收集培养上清液。为了除去培养基成分，使用UF膜用Milli-Q水洗涤1mL的培养上清液，并浓缩至250μL。向用UF膜浓缩的250μL的溶液中加入500μL的100％乙醇，并通过离心沉淀肝素前体。将得到的沉淀物在空气中干燥以获得肝素前体。同样从剩余的培养物上清液中，使用相同的规程纯化肝素前体。总共获得10g的肝素前体。
(2)肝素前体的N-脱乙酰化。
A)将61mL的肼·H2O和4.7mL的1N硫酸添加到1.22g的肝素前体中，并且在用氮气替换气相后，将混合物加热至100℃并反应4.75小时。
B)在通过冰冷却终止反应后，添加61mL的16％NaCl水溶液和610mL的MeOH，并将混合物离心。去除上清液。将所得的沉淀物在50mL的H2O中溶解，然后使用Amicon UF膜(3kDa)脱盐并浓缩。
C)将两倍体积的H2O和等体积的1M NaHCO3添加到所得的浓缩溶液中，然后滴加0.2M I2/0.4M KI溶液直至呈黄色。随后，滴加肼·H2O以将过多的碘还原为碘离子，然后再次使用Amicon UF膜(3kDa)脱盐并浓缩溶液。将浓缩的溶液在减压下干燥以获得N-脱乙酰化的肝素前体。在获得的N-脱乙酰化的肝素前体中乙酰基团的残留率为14.9％(稍后描述)。
(3)N-脱乙酰化的肝素前体的解聚
(3.1)肝素酶III的制备
(3.1.1)具有对肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)天然的hepC基因的表达质粒的构建。
将对肝素黄杆菌天然的编码肝素酶III的hepC基因克隆到pMIV-Pnlp0载体(美国专利申请公开号20050196846)中以构建hepC基因表达质粒pMIV-Pnlp0-hepC。pMIV-Pnlp0-ter包括强效的nlp0启动子(Pnlp0)和rrnB终止子，并且可以通过在启动子和终止子之间插入目标基因作为表达单元发挥作用。“Pnlp0”表示对大肠杆菌K-12天然的野生型nlpD基因的启动子。
表达质粒的构建的细节如下所示。通过使用引物P5(SEQ ID NO:17)和引物P6(SEQID NO:18)，用来自大肠杆菌MG1655的染色体DNA作为模板的PCR获得包含约300bp的nlpD基因的启动子区域(Pnlp0)的DNA片段。已经在这些引物的每个5’端设计了限制酶SalI和PaeI的位点。PCR循环如下。首先，95℃3分钟，然后两个循环的95℃60秒、50℃30秒和72℃40秒，随后25个循环的94℃20秒、55℃20秒和72℃15秒，最后72℃5分钟。用SalI和PaeI处理所得的片段，并将其插入到pMIV-5JS(日本专利申请公开号2008-99668)的SalI-PaeI位点中以获得质粒pMIV-Pnlp0。插入到该pMIV-Pnlp0质粒中的Pnlp0启动子的PaeI-SalI片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:19中所示。
随后，通过使用引物P7(SEQ ID NO:21)和引物P8(SEQ ID NO:22)，用来自MG1655的染色体DNA作为模板的PCR获得包含约300bp的rrnB基因的终止子区域的DNA片段(SEQ IDNO:20)。已经在这些引物的每个5’端设计了限制酶XbaI和BamHI的位点。PCR循环如下。首先，95℃3分钟，然后两个循环的95℃60秒、50℃30秒和72℃40秒，随后25个循环的94℃20秒、59℃20秒和72℃15秒，最后72℃5分钟。用XbaI和BamHI处理所得的片段，并将其插入到pMIV-Pnlp0的XbaI-BamHI位点中以获得质粒pMIV-Pnlp0-ter。
随后，人工合成包含对肝素黄杆菌(ATCC 13125；Su H.et.al.,Appl.Environ.Microbiol.,1996,62:2723-2734)天然的hepC基因的ORF的DNA链。通过使用引物P9(SEQ ID NO:23)和引物P10(SEQ ID NO:24)，用该DNA链作为模板的PCR扩增hepC基因的DNA片段。在方案中描述的反应组合物中使用PrimeStar聚合酶(TaKaRa)实施PCR。PCR循环如下：首先，94℃5分钟，然后30个循环的98℃5秒、55℃10秒和72℃8分钟，最后保持在4℃。另外，通过使用引物11(SEQ ID NO:25)和引物12(SEQ ID NO:26)的寡核苷酸作为引物，用pMIV-Pnlp0作为模板DNA的PCR获得pMIV-Pnlp0的DNA片段。使用PrimeStar聚合酶(TaKaRa)和方案中描述的反应组合物来实施PCR。PCR循环如下：首先，94℃5分钟，然后30个循环的98℃5秒、55℃10秒和72℃6分钟，最后保持在4℃。使用In-Fusion(注册商标)HD克隆试剂盒(Clontech)连接所得的两个DNA片段以构建hepC基因表达质粒pMIV-Pnlp0-hepC。克隆的hepC基因的核苷酸序列和由它编码的肝素酶III(HepC)的氨基酸序列分别如SEQ IDNO:27和28中所示。
(3.1.2)表达hepC基因的大肠杆菌BL21(DE3)菌株的构建和肝素酶III酶溶液的制备。
通过电穿孔(Cell；80μL，200Ω，25μF，1.8kV，比色杯；0.1mL)将hepC基因表达质粒pMIV-Pnlp0-hepC导入到大肠杆菌BL21(DE3)菌株(Life Technologies)中以获得大肠杆菌BL21(DE3)/pMIV-Pnlp0-hepC菌株作为肝素酶III生产菌株。该菌株在25μg/mL添加氯霉素的LB培养基中于37℃预培养过夜。随后，将培养液接种到Sakaguchi烧瓶中的300mL LB培养基中，终浓度为2％(v/v)。于37℃实施振荡培养4小时，然后终止培养。离心后，用0.85％NaCl洗涤微生物细胞两次，并在30mL的50mM HEPES缓冲液(pH 7.0)中悬浮。对悬浮液进行超声处理破碎以破碎微生物细胞。将破碎的微生物细胞溶液离心以制备肝素酶III酶溶液，作为上清液(无细胞提取液)。
(3.2)使用肝素酶III的N-脱乙酰化的肝素前体的解聚
将1g的(2)中获得的N-乙酰基团残留率为14.9％的N-脱乙酰化的肝素前体与2mL的31.3mIU/μL肝素酶III溶液溶解于100mL含有100mM NaCl和1.5mM CaCl2的Tris缓冲溶液(pH 8.0)中，并且于37℃反应5.3小时。将100mL的16％NaCl水溶液和900mL的EtOH添加到反应溶液中并混合，离心以去除上清液并获得解聚的N-脱乙酰化的肝素前体。
(4)解聚的N-脱乙酰化的肝素前体的N-硫酸化
A)将1g的(3)中获得的解聚的N-脱乙酰化的肝素前体溶解于50mL的Milli-Q水中，并将50mL的20mg/mL NaHCO3/20mg/mL三甲胺·SO3的水溶液添加到其中，并且混合物于55℃反应过夜。
B)将1L的EtOH添加到混合物中，然后离心以去除上清液以获得N-硫酸化的解聚肝素前体。
C)将获得的N-硫酸化的解聚肝素前体溶解于Milli-Q水中至500μL，并实施二糖分析以计算相对于N-脱乙酰化的肝素前体的产率。另外对它进行GPC以计算分子量分布。下文显示了规程。
<二糖分析>
根据先前报道的条件(T.Imanari et al.,“High-performance liquidchromatographic analysis of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides”,J.Chromatogr.A,1996,720:275-293)实施N-硫酸化的解聚肝素前体的二糖分析。也就是说，通过使用肝素酶II和III将N-硫酸化的解聚肝素前体分解成不饱和二糖并通过HPLC分析各分解产物来定量各成分二糖的量。
同样地，实施N-脱乙酰化的肝素前体的二糖分析。在将N-脱乙酰化的肝素前体进行N-硫酸化后实施N-脱乙酰化的肝素前体的二糖分析。也就是说，通过将N-脱乙酰化的肝素前体进行N-硫酸化，随后使用肝素酶II和III将其分解成不饱和二糖并通过HPLC分析各分解产物来定量各成分二糖的量。以与解聚的N-脱乙酰化的肝素前体的N-硫酸化相同地实施N-脱乙酰化的肝素前体的N-硫酸化。
具体地，通过以下规程实施二糖分析。
1)将0.2U的肝素酶II(Sigma)、0.02至0.03mIU的肝素酶III、5μg的多糖样品和10μL的用于酶促消化的缓冲液(100mM CH3COONa，10mM(CH3COO)2Ca，pH 7.0)混合并用Milli-Q水稀释至100μL的测量体积以用作反应溶液。
2)将反应溶液保持在37℃达16小时或更长，随后于100℃煮沸2分钟以终止反应。
3)通过0.45μm过滤器去除杂质以获得随后用作二糖分析样品的溶液。
4)在50℃的温度、0.25mL/min的流速和230nm的检测波长的条件下使用具有5μm粒径的Inertsil ODS-3 150mm×2.1mm的柱并且使用4％乙腈和1.2mM三丁胺作为溶液A以及4％乙腈和0.1M CsCl作为溶液B的洗脱液组成，其中溶液B的梯度为从1至90％进行分析。
从各多糖样品生产的成分二糖的量的总和计算产率。也就是说，产率计算为从N-硫酸化的解聚肝素前体生产的二糖的总量相对于从N-脱乙酰化的肝素前体生产的二糖的总量的百分比(摩尔比)。另外，此时，证实了在获得的N-硫酸化的解聚肝素前体中，N-乙酰化生产的99％或更多的氨基基团被N-硫酸化。
另外，基于从N-脱乙酰化的肝素前体生产的各成分二糖的量计算N-脱乙酰化的肝素前体中N-乙酰基团的残留率。也就是说，乙酰基团的残留率计算为具有乙酰基团的二糖的量相对于二糖的总量的百分比(摩尔比)。乙酰基团的残留率为14.9％。
<GPC分析>
通过HPLC(GPC分析)对N-硫酸化的解聚肝素前体和硫酸乙酰肝素(在Milli-Q水中以1mg/mL溶解)进行凝胶过滤。使用GS520(Shodex，Asahipak GS-520HQ，7.5mm×300mm，7μm的粒径)作为柱，使用100mM磷酸二氢钾水溶液作为洗脱液，并且以0.6mL/min的流速、以40℃的柱温和以200nm的检测波长实施分析。使用普鲁兰多糖(pullulan)的分子量标志物组(Shodex，STANDARD P-82，分子量范围从5900至708000)作为标准品计算平均分子量(Mn和Mw)。
工业适用性
本发明的方法可用于酶促生产醇和胺的O-和N-硫酸化衍生物。具体而言，该方法适合于生产肝素和硫酸乙酰肝素。
表1.构建的菌株。
表2.PAP的稳定性。
NA：未分析
表3.PAPS的稳定性。
NA：未分析
表4.使用PAPS的LMWHS的2-O-磺酰化。
1)菌株：
Δ2*：Δ2/pSUMO/pACYC184，
Δ3*：Δ3/pSUMO/pACYC184，
Δ4*：Δ4/pSUMO/pACYC184，
Δ5*：Δ5/pSUMO/pACYC184.
2)二糖：
NS：α-ΔUA-[1→4]-GlcNS，
NS2S：α-ΔUA-2S-[1→4]-GlcNS，
其中ΔUA意指4-脱氧-L-苏式-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸并且GlcNS意指N-磺基-D-葡糖胺。
3)总和：NS+NS2S。NS和NS2S的累积量小于初始LMWHS的量，因为使用肝素酶I、II和III切割LMWHS的效率为约30％。
4)磺酰化产率：NS2S/(NS+NS2S)。其不依赖于LMWHS切割的效率。
表5.在存在pNPS的情况下LMWHS的2-O-磺酰化。
1)，2)，3)和4)–参见表4的解释。
序列表
<110> 味之素株式会社
<120> 使用肠杆菌科细菌对醇和胺进行酶促磺酰化的方法
<130> PAMA-19235
<150> RU2018125379
<151> 2018-07-11
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 714
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 1
atgcgcaaga tcacacaggc aatcagtgcc gtttgcttat tgttcgctct aaacagttcc 60
gctgttgccc tggcctcatc tccttcaccg cttaaccctg ggactaacgt tgccaggctt 120
gctgaacagg cacccattca ttgggtttcg gtcgcacaaa ttgaaaatag cctcgcaggg 180
cgtccgccaa tggcggtggg gtttgatatc gatgacacgg tacttttttc cagtccgggc 240
ttctggcgcg gcaaaaaaac cttctcgcca gaaagcgaag attatctgaa aaatcctgtg 300
ttctgggaaa aaatgaacaa tggctgggat gaattcagca ttccaaaaga ggtcgctcgc 360
cagctgattg atatgcatgt acgccgcggt gacgcgatct tctttgtgac tggtcgtagc 420
ccgacgaaaa cagaaacggt ttcaaaaacg ctggcggata attttcatat tcctgccacc 480
aacatgaatc cggtgatctt tgcgggcgat aaaccagggc aaaatacaaa atcgcaatgg 540
ctgcaggata aaaatatccg aattttttat ggcgattctg ataatgatat taccgccgca 600
cgcgatgtcg gcgctcgtgg tatccgcatt ctgcgcgcct ccaactctac ctacaaaccc 660
ttgccacaag cgggtgcgtt tggtgaagag gtgatcgtca attcagaata ctga 714
<210> 2
<211> 237
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 2
Met Arg Lys Ile Thr Gln Ala Ile Ser Ala Val Cys Leu Leu Phe Ala
1 5 10 15
Leu Asn Ser Ser Ala Val Ala Leu Ala Ser Ser Pro Ser Pro Leu Asn
20 25 30
Pro Gly Thr Asn Val Ala Arg Leu Ala Glu Gln Ala Pro Ile His Trp
35 40 45
Val Ser Val Ala Gln Ile Glu Asn Ser Leu Ala Gly Arg Pro Pro Met
50 55 60
Ala Val Gly Phe Asp Ile Asp Asp Thr Val Leu Phe Ser Ser Pro Gly
65 70 75 80
Phe Trp Arg Gly Lys Lys Thr Phe Ser Pro Glu Ser Glu Asp Tyr Leu
85 90 95
Lys Asn Pro Val Phe Trp Glu Lys Met Asn Asn Gly Trp Asp Glu Phe
100 105 110
Ser Ile Pro Lys Glu Val Ala Arg Gln Leu Ile Asp Met His Val Arg
115 120 125
Arg Gly Asp Ala Ile Phe Phe Val Thr Gly Arg Ser Pro Thr Lys Thr
130 135 140
Glu Thr Val Ser Lys Thr Leu Ala Asp Asn Phe His Ile Pro Ala Thr
145 150 155 160
Asn Met Asn Pro Val Ile Phe Ala Gly Asp Lys Pro Gly Gln Asn Thr
165 170 175
Lys Ser Gln Trp Leu Gln Asp Lys Asn Ile Arg Ile Phe Tyr Gly Asp
180 185 190
Ser Asp Asn Asp Ile Thr Ala Ala Arg Asp Val Gly Ala Arg Gly Ile
195 200 205
Arg Ile Leu Arg Ala Ser Asn Ser Thr Tyr Lys Pro Leu Pro Gln Ala
210 215 220
Gly Ala Phe Gly Glu Glu Val Ile Val Asn Ser Glu Tyr
225 230 235
<210> 3
<211> 741
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 3
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gacgggacga aaccgatgga cgtcgtcagc aaagcggaca attctccggt aacggcagcg 120
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acgaatattt gggacaccgc cgctggacat gctgtagctg cagctgccgg agcgcacgtt 660
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<210> 4
<211> 246
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 4
Met Leu Asp Gln Val Cys Gln Leu Ala Arg Asn Ala Gly Asp Ala Ile
1 5 10 15
Met Gln Val Tyr Asp Gly Thr Lys Pro Met Asp Val Val Ser Lys Ala
20 25 30
Asp Asn Ser Pro Val Thr Ala Ala Asp Ile Ala Ala His Thr Val Ile
35 40 45
Met Asp Gly Leu Arg Thr Leu Thr Pro Asp Val Pro Val Leu Ser Glu
50 55 60
Glu Asp Pro Pro Gly Trp Glu Val Arg Gln His Trp Gln Arg Tyr Trp
65 70 75 80
Leu Val Asp Pro Leu Asp Gly Thr Lys Glu Phe Ile Lys Arg Asn Gly
85 90 95
Glu Phe Thr Val Asn Ile Ala Leu Ile Asp His Gly Lys Pro Ile Leu
100 105 110
Gly Val Val Tyr Ala Pro Val Met Asn Val Met Tyr Ser Ala Ala Glu
115 120 125
Gly Lys Ala Trp Lys Glu Glu Cys Gly Val Arg Lys Gln Ile Gln Val
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Arg Asp Ala Arg Pro Pro Leu Val Val Ile Ser Arg Ser His Ala Asp
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Ala Glu Leu Lys Glu Tyr Leu Gln Gln Leu Gly Glu His Gln Thr Thr
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Ser Ile Gly Ser Ser Leu Lys Phe Cys Leu Val Ala Glu Gly Gln Ala
180 185 190
Gln Leu Tyr Pro Arg Phe Gly Pro Thr Asn Ile Trp Asp Thr Ala Ala
195 200 205
Gly His Ala Val Ala Ala Ala Ala Gly Ala His Val His Asp Trp Gln
210 215 220
Gly Lys Pro Leu Asp Tyr Thr Pro Arg Glu Ser Phe Leu Asn Pro Gly
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Phe Arg Val Ser Ile Tyr
245
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<211> 1944
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 5
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<211> 647
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
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Met Ile Lys Phe Ser Ala Thr Leu Leu Ala Thr Leu Ile Ala Ala Ser
1 5 10 15
Val Asn Ala Ala Thr Val Asp Leu Arg Ile Met Glu Thr Thr Asp Leu
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His Ser Asn Met Met Asp Phe Asp Tyr Tyr Lys Asp Thr Ala Thr Glu
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Glu Val Val Asp Lys Asp Gly Lys Lys Gln Thr Leu Lys Ile Gly Tyr
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305 310 315 320
Ile Tyr Asp Ile Ala Asn Lys Lys Ser Leu Ala Ala Glu Asp Ser Lys
325 330 335
Leu Val Glu Thr Leu Lys Ala Asp His Asp Ala Thr Arg Gln Phe Val
340 345 350
Ser Lys Pro Ile Gly Lys Ser Ala Asp Asn Met Tyr Ser Tyr Leu Ala
355 360 365
Leu Val Gln Asp Asp Pro Thr Val Gln Val Val Asn Asn Ala Gln Lys
370 375 380
Ala Tyr Val Glu His Tyr Ile Gln Gly Asp Pro Asp Leu Ala Lys Leu
385 390 395 400
Pro Val Leu Ser Ala Ala Ala Pro Phe Lys Val Gly Gly Arg Lys Asn
405 410 415
Asp Pro Ala Ser Tyr Val Glu Val Glu Lys Gly Gln Leu Thr Phe Arg
420 425 430
Asn Ala Ala Asp Leu Tyr Leu Tyr Pro Asn Thr Leu Ile Val Val Lys
435 440 445
Ala Ser Gly Lys Glu Val Lys Glu Trp Leu Glu Cys Ser Ala Gly Gln
450 455 460
Phe Asn Gln Ile Asp Pro Asn Ser Thr Lys Pro Gln Ser Leu Ile Asn
465 470 475 480
Trp Asp Gly Phe Arg Thr Tyr Asn Phe Asp Val Ile Asp Gly Val Asn
485 490 495
Tyr Gln Ile Asp Val Thr Gln Pro Ala Arg Tyr Asp Gly Glu Cys Gln
500 505 510
Met Ile Asn Ala Asn Ala Glu Arg Ile Lys Asn Leu Thr Phe Asn Gly
515 520 525
Lys Pro Ile Asp Pro Asn Ala Met Phe Leu Val Ala Thr Asn Asn Tyr
530 535 540
Arg Ala Tyr Gly Gly Lys Phe Ala Gly Thr Gly Asp Ser His Ile Ala
545 550 555 560
Phe Ala Ser Pro Asp Glu Asn Arg Ser Val Leu Ala Ala Trp Ile Ala
565 570 575
Asp Glu Ser Lys Arg Ala Gly Glu Ile His Pro Ala Ala Asp Asn Asn
580 585 590
Trp Arg Leu Ala Pro Ile Ala Gly Asp Lys Lys Leu Asp Ile Arg Phe
595 600 605
Glu Thr Ser Pro Ser Asp Lys Ala Ala Ala Phe Ile Lys Glu Lys Gly
610 615 620
Gln Tyr Pro Met Asn Lys Val Ala Thr Asp Asp Ile Gly Phe Ala Ile
625 630 635 640
Tyr Gln Val Asp Leu Ser Lys
645
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P1
<400> 7
ataagatctg ctgccgaacc cgccaa 26
<210> 8
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P2
<400> 8
ataaagcttg gatccgagct cgaggcggcc gccagggctg catcgacagt ctgacgacc 59
<210> 9
<211> 900
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA片段，其具有编码突变体2-O-磺基转移酶(Y94A)的(D69-N356)片段的CDS
<400> 9
gcggccgcgc agactaatgc agcagcggat gaagaagaag atatcgtcat tatctataac 60
cgtgttccga aaaccgcaag caccagcttt accaatattg cagcagatct gtgcgccaaa 120
aatcgctatc atgtgctgca tattaacacc accaaaaata acccggttat gagcctgcag 180
gatcaggttc gttttgttaa aaacattacc acctggaacg aaatgaaacc gggtttttat 240
catggccata tcagctatct ggattttgcg aaatttggcg tgaaaaaaaa accgatctac 300
atcaacgtta ttcgcgatcc gattgaacgt ctggttagct attattactt tctgcgcttc 360
ggtgatgatt atcgtccggg tctgcgtcgt cgtaaacagg gcgacaaaaa aacctttgat 420
gaatgtgttg ccgaaggtgg tagcgattgt gcaccggaaa aactgtggct gcagattccg 480
tttttttgcg gtcatagcag cgaatgttgg aatgttggta gccgttgggc aatggatcag 540
gccaaatata acctgatcaa cgaatatttt ctggtgggtg tgaccgaaga actggaagat 600
ttcattatgc tgctggaagc agcactgcct cgtttttttc gtggtgcaac cgatctgtat 660
cgtaccggta aaaaaagcca tctgcgtaaa acgacggaaa aaaaactgcc gaccaaacag 720
accattgcaa aactgcagca gagcgatatt tggaaaatgg aaaacgagtt ttatgaattt 780
gccctggaac agtttcagtt tattcgtgca catgcagttc gtgaaaaaga tggtgatctg 840
tatattctgg cccagaactt cttctacgaa aaaatctatc cgaaaagcaa ttaactcgag 900
<210> 10
<211> 288
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体2-O-磺基转移酶(Y94A)的(D69-N356)片段
<400> 10
Asp Glu Glu Glu Asp Ile Val Ile Ile Tyr Asn Arg Val Pro Lys Thr
1 5 10 15
Ala Ser Thr Ser Phe Thr Asn Ile Ala Ala Asp Leu Cys Ala Lys Asn
20 25 30
Arg Tyr His Val Leu His Ile Asn Thr Thr Lys Asn Asn Pro Val Met
35 40 45
Ser Leu Gln Asp Gln Val Arg Phe Val Lys Asn Ile Thr Thr Trp Asn
50 55 60
Glu Met Lys Pro Gly Phe Tyr His Gly His Ile Ser Tyr Leu Asp Phe
65 70 75 80
Ala Lys Phe Gly Val Lys Lys Lys Pro Ile Tyr Ile Asn Val Ile Arg
85 90 95
Asp Pro Ile Glu Arg Leu Val Ser Tyr Tyr Tyr Phe Leu Arg Phe Gly
100 105 110
Asp Asp Tyr Arg Pro Gly Leu Arg Arg Arg Lys Gln Gly Asp Lys Lys
115 120 125
Thr Phe Asp Glu Cys Val Ala Glu Gly Gly Ser Asp Cys Ala Pro Glu
130 135 140
Lys Leu Trp Leu Gln Ile Pro Phe Phe Cys Gly His Ser Ser Glu Cys
145 150 155 160
Trp Asn Val Gly Ser Arg Trp Ala Met Asp Gln Ala Lys Tyr Asn Leu
165 170 175
Ile Asn Glu Tyr Phe Leu Val Gly Val Thr Glu Glu Leu Glu Asp Phe
180 185 190
Ile Met Leu Leu Glu Ala Ala Leu Pro Arg Phe Phe Arg Gly Ala Thr
195 200 205
Asp Leu Tyr Arg Thr Gly Lys Lys Ser His Leu Arg Lys Thr Thr Glu
210 215 220
Lys Lys Leu Pro Thr Lys Gln Thr Ile Ala Lys Leu Gln Gln Ser Asp
225 230 235 240
Ile Trp Lys Met Glu Asn Glu Phe Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Gln Phe
245 250 255
Gln Phe Ile Arg Ala His Ala Val Arg Glu Lys Asp Gly Asp Leu Tyr
260 265 270
Ile Leu Ala Gln Asn Phe Phe Tyr Glu Lys Ile Tyr Pro Lys Ser Asn
275 280 285
<210> 11
<211> 1881
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA片段，其编码与对斑马鱼天然的HNSG-5epi的(G70-N585)片段融合的N-标记6xHis-SUMO肽
<400> 11
catatgcatc atcaccacca tcacgggtcc ctgcaggact cagaagtcaa tcaagaagct 60
aagccagagg tcaagccaga agtcaagcct gagactcaca tcaatttaaa ggtgtccgat 120
ggatcttcag agatcttctt caagatcaaa aagaccactc ctttaagaag gctgatggaa 180
gcgttcgcta aaagacaggg taaggaaatg gactccttaa cgttcttgta cgacggtatt 240
gaaattcaag ctgatcagac ccctgaagat ttggacatgg aggataacga tattattgag 300
gctcaccgcg aacagattgg aggtggcgtt cggtatgaag aaatcgactg cttgattaac 360
gacgatgcaa ccatcaaagg gcgccgcgaa ggctctgagg tgtacatgcc gtttagctgg 420
atggaaaagt atttcgaagt gtacggcaaa gttgtgcaat acgatggcta tgatcgcttt 480
gaattctctc attcatacag caaagtgtat gcgcagcgcg agcagtatca tccgaatggt 540
gtctttatga gctttgaggg gtataacgta gaagtgcgcg atcgtgtcaa atgtatctcc 600
ggtgttgaag gtgttccgct tagcacccag tggggtccac agggctactt ttatgcgatt 660
cagattgccc agtacggtct gtcgcactat tcgaagaact taaccgaacg tccgccgcat 720
gtggaggtgt atgatacggc ggaagaacgc gacagtcgta gttctgcctg gaccgttcca 780
aaaggatgct cactgacccg cgtttacgac aaaacccgcg cgacaagcgt ccgcgaattt 840
agcgctccgg aaaatagcga aggagttagc ttaccacttg gtaacaccaa agatttcatt 900
atctcctttg acctgaaatt cacaagtaat gggtcagtct ctgtgatttt ggagactact 960
gaaaagggac cgccgtttgt gatccactat gtcaccacga cgcagttgat ccttctgaaa 1020
gatcgtgaca ttacctacgg gattggtcca cgcacgacct ggacaactgt aacccgggat 1080
ctgctgacgg acttacgcaa aggtatcggc cttagcaaca cgaaggcagt aaaagcaacc 1140
aaaaccatgc cgcgccgtgt ggtaaaactg gtcgtacatg gcacgggtac cattgacaac 1200
atcaccatta gcaccacgtc ccatatggcc gccttttatg ccgcgtctga ttggttggtg 1260
cgcaatcagg atgaacgtgg tggctggccg attatggtca cccgcaaatt aggcgagggc 1320
ttccgtgcct tggaaccggg ctggtattcc gcgatggcgc agggccaagc gatgtccact 1380
ctggtgcgtg cctatctcat gacgaaagac gatcgttatc tgaaagcggc gctgcgtgca 1440
actggccctt ttaagctgcc gtcagaacag cacggagtga aagcggtgtt tatgaacaaa 1500
tacgattggt acgaagagta tccgacaatc cctagttcct ttgtcctgaa cggtttcatc 1560
tattcactta ttggcctgtt tgatctggca cagactgctg gcgagaaact gggccgtgat 1620
gcgggtcagc tctacagcaa ggggatggag tctctgaaag ttatgttacc gctctacgat 1680
acagggtcgg ggaccatcta tgatctccgc cacttcattc tgggaacagc tcccaatctg 1740
gcacgttggg attaccacac cacgcatatt aatcagctgc aactgctggg tactatcgat 1800
aatagtccga ttttccgcga ctcggtcaaa cgctggaaat cgtacctgaa aggcggtcgc 1860
gcaaagcata attaactcga g 1881
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N标记的6xHis-SUMO肽
<400> 12
Met His His His His His His Gly Ser Leu Gln Asp Ser Glu Val Asn
1 5 10 15
Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His
20 25 30
Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile
35 40 45
Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg
50 55 60
Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Thr Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Glu
65 70 75 80
Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp
85 90 95
Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly
100 105
<210> 13
<211> 516
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 对斑马鱼天然的HNSG-5epi的(G70-N585)片段
<400> 13
Gly Val Arg Tyr Glu Glu Ile Asp Cys Leu Ile Asn Asp Asp Ala Thr
1 5 10 15
Ile Lys Gly Arg Arg Glu Gly Ser Glu Val Tyr Met Pro Phe Ser Trp
20 25 30
Met Glu Lys Tyr Phe Glu Val Tyr Gly Lys Val Val Gln Tyr Asp Gly
35 40 45
Tyr Asp Arg Phe Glu Phe Ser His Ser Tyr Ser Lys Val Tyr Ala Gln
50 55 60
Arg Glu Gln Tyr His Pro Asn Gly Val Phe Met Ser Phe Glu Gly Tyr
65 70 75 80
Asn Val Glu Val Arg Asp Arg Val Lys Cys Ile Ser Gly Val Glu Gly
85 90 95
Val Pro Leu Ser Thr Gln Trp Gly Pro Gln Gly Tyr Phe Tyr Ala Ile
100 105 110
Gln Ile Ala Gln Tyr Gly Leu Ser His Tyr Ser Lys Asn Leu Thr Glu
115 120 125
Arg Pro Pro His Val Glu Val Tyr Asp Thr Ala Glu Glu Arg Asp Ser
130 135 140
Arg Ser Ser Ala Trp Thr Val Pro Lys Gly Cys Ser Leu Thr Arg Val
145 150 155 160
Tyr Asp Lys Thr Arg Ala Thr Ser Val Arg Glu Phe Ser Ala Pro Glu
165 170 175
Asn Ser Glu Gly Val Ser Leu Pro Leu Gly Asn Thr Lys Asp Phe Ile
180 185 190
Ile Ser Phe Asp Leu Lys Phe Thr Ser Asn Gly Ser Val Ser Val Ile
195 200 205
Leu Glu Thr Thr Glu Lys Gly Pro Pro Phe Val Ile His Tyr Val Thr
210 215 220
Thr Thr Gln Leu Ile Leu Leu Lys Asp Arg Asp Ile Thr Tyr Gly Ile
225 230 235 240
Gly Pro Arg Thr Thr Trp Thr Thr Val Thr Arg Asp Leu Leu Thr Asp
245 250 255
Leu Arg Lys Gly Ile Gly Leu Ser Asn Thr Lys Ala Val Lys Ala Thr
260 265 270
Lys Thr Met Pro Arg Arg Val Val Lys Leu Val Val His Gly Thr Gly
275 280 285
Thr Ile Asp Asn Ile Thr Ile Ser Thr Thr Ser His Met Ala Ala Phe
290 295 300
Tyr Ala Ala Ser Asp Trp Leu Val Arg Asn Gln Asp Glu Arg Gly Gly
305 310 315 320
Trp Pro Ile Met Val Thr Arg Lys Leu Gly Glu Gly Phe Arg Ala Leu
325 330 335
Glu Pro Gly Trp Tyr Ser Ala Met Ala Gln Gly Gln Ala Met Ser Thr
340 345 350
Leu Val Arg Ala Tyr Leu Met Thr Lys Asp Asp Arg Tyr Leu Lys Ala
355 360 365
Ala Leu Arg Ala Thr Gly Pro Phe Lys Leu Pro Ser Glu Gln His Gly
370 375 380
Val Lys Ala Val Phe Met Asn Lys Tyr Asp Trp Tyr Glu Glu Tyr Pro
385 390 395 400
Thr Ile Pro Ser Ser Phe Val Leu Asn Gly Phe Ile Tyr Ser Leu Ile
405 410 415
Gly Leu Phe Asp Leu Ala Gln Thr Ala Gly Glu Lys Leu Gly Arg Asp
420 425 430
Ala Gly Gln Leu Tyr Ser Lys Gly Met Glu Ser Leu Lys Val Met Leu
435 440 445
Pro Leu Tyr Asp Thr Gly Ser Gly Thr Ile Tyr Asp Leu Arg His Phe
450 455 460
Ile Leu Gly Thr Ala Pro Asn Leu Ala Arg Trp Asp Tyr His Thr Thr
465 470 475 480
His Ile Asn Gln Leu Gln Leu Leu Gly Thr Ile Asp Asn Ser Pro Ile
485 490 495
Phe Arg Asp Ser Val Lys Arg Trp Lys Ser Tyr Leu Lys Gly Gly Arg
500 505 510
Ala Lys His Asn
515
<210> 14
<211> 895
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA片段，其编码与对褐家鼠天然的ST1A1融合的N-标记6xHis前导物
<400> 14
gaattcgatg gaattttcac gtccgcctct ggttcatgtt aaaggtattc cgctgattaa 60
atacttcgcc gaaaccattg gtccgctgca gaattttacc gcatggcctg atgatctgct 120
gattagcacc tatccgaaaa gcggcaccac ctggatgagc gaaattctgg atatgattta 180
tcagggtggc aaactggaaa aatgtggtcg tgcaccgatt tatgcacgtg ttccgtttct 240
ggaatttaaa tgtccgggtg ttccgagcgg tctggaaacc ctggaagaaa caccggcacc 300
gcgtctgctg aaaacccatc tgccgctgag cctgctgccg cagtcactgc tggatcagaa 360
agttaaagtt atctatattg cccgtaacgc caaagatgtt gtggtgagct attataactt 420
ctataacatg gcaaaactgc atccggatcc tggcacctgg gatagctttc tggaaaactt 480
tatggatggt gaagttagct atggtagctg gtatcagcat gtgaaagaat ggtgggaact 540
gcgtcatacc catccggttc tgtacctgtt ttatgaagat atcaaagaga acccgaaacg 600
cgaaatcaaa aaaatcctgg aatttctggg tcgtagcctg ccggaagaaa ccgttgatag 660
cattgttcat cataccagct tcaaaaaaat gaaagaaaac tgcatgacca actacaccac 720
cattccgacc gaaattatgg atcacaatgt tagcccgttt atgcgtaaag gcaccaccgg 780
tgattggaaa aatacattta ccgttgcaca gaacgaacgc tttgatgcac attatgcaaa 840
aaccatgacc gactgcgatt tcaaatttcg ttgtgaactg taagtcgaca agctt 895
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P3
<400> 15
aatatcatat gggcagcagc catcaccatc a 31
<210> 16
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P4
<400> 16
aatataagct tgtcgactta cagttcacaa cgaa 34
<210> 17
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P5
<400> 17
agctgagtcg acccccagga aaaattggtt aataac 36
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P6
<400> 18
agctgagcat gcttccaact gcgctaatga cgc 33
<210> 19
<211> 313
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pnlp0启动子的DNA片段
<400> 19
gcatgcttcc aactgcgcta atgacgcagc tggacgaagg cgggattctc gtcttacccg 60
taggggagga gcaccagtat ttgaaacggg tgcgtcgtcg gggaggcgaa tttattatcg 120
ataccgtgga ggccgtgcgc tttgtccctt tagtgaaggg tgagctggct taaaacgtga 180
ggaaatacct ggatttttcc tggttatttt gccgcaggtc agcgtatcgt gaacatcttt 240
tccagtgttc agtagggtgc cttgcacggt aattatgtca ctggttatta accaattttt 300
cctgggggtc gac 313
<210> 20
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA片段
<400> 20
tctagaaaca gaatttgcct ggcggcagta gcgcggtggt cccacctgac cccatgccga 60
actcagaagt gaaacgccgt agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat gcgagagtag 120
ggaactgcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt 180
atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg agcggatttg 240
aacgttgcga agcaacggcc cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata aactgccagg 300
catcaaatta agcagaaggc catcctgacg gatggccttt ttgcgtttct acaaactctt 360
cctggatcc 369
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P7
<400> 21
agctgatcta gaaaacagaa tttgcctggc ggc 33
<210> 22
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P8
<400> 22
agctgaggat ccaggaagag tttgtagaaa cgc 33
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P9
<400> 23
ttcctggggg tcgacatgac tacgaaaatt tttaa 35
<210> 24
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P10
<400> 24
attctgtttt ctagactaag gaaccaacac aagct 35
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P11
<400> 25
gtcgaccccc aggaaaaatt ggttaataac 30
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P12
<400> 26
tctagaaaac agaatttgcc tggcggcagt 30
<210> 27
<211> 1980
<212> DNA
<213> 肝素黄杆菌
<400> 27
atgactacga aaatttttaa aaggatcatt gtatttgctg taattgccct atcgtcggga 60
aatatacttg cacaaagctc ttccattacc aggaaagatt ttgaccacat caaccttgag 120
tattccggac tggaaaaggt taataaagca gttgctgccg gcaactatga cgatgcggcc 180
aaagcattac tggcatacta cagggaaaaa agtaaggcca gggaacctga tttcagtaat 240
gcagaaaagc ctgccgatat acgccagccc atagataagg ttacgcgtga aatggccgac 300
aaggctttgg tccaccagtt tcaaccgcac aaaggctacg gctattttga ttatggtaaa 360
gacatcaact ggcagatgtg gccggtaaaa gacaatgaag tacgctggca gttgcaccgt 420
gtaaaatggt ggcaggctat ggccctggtt tatcacgcta cgggcgatga aaaatatgca 480
agagaatggg tatatcagta cagcgattgg gccagaaaaa acccattggg cctgtcgcag 540
gataatgata aatttgtgtg gcggcccctt gaagtgtcgg acagggtaca aagtcttccc 600
ccaaccttca gcttatttgt aaactcgcca gcctttaccc cagccttttt aatggaattt 660
ttaaacagtt accaccaaca ggccgattat ttatctacgc attatgccga acagggaaac 720
caccgtttat ttgaagccca acgcaacttg tttgcagggg tatctttccc tgaatttaaa 780
gattcaccaa gatggaggca aaccggcata tcggtgctga acaccgagat caaaaaacag 840
gtttatgccg atgggatgca gtttgaactt tcaccaattt accatgtagc tgccatcgat 900
atcttcttaa aggcctatgg ttctgcaaaa cgagttaacc ttgaaaaaga atttccgcaa 960
tcttatgtac aaactgtaga aaatatgatt atggcgctga tcagtatttc actgccagat 1020
tataacaccc ctatgtttgg agattcatgg attacagata aaaatttcag gatggcacag 1080
tttgccagct gggcccgggt tttcccggca aaccaggcca taaaatattt tgctacagat 1140
ggcaaacaag gtaaggcgcc taacttttta tccaaagcat tgagcaatgc aggcttttat 1200
acgtttagaa gcggatggga taaaaatgca accgttatgg tattaaaagc cagtcctccc 1260
ggagaatttc atgcccagcc ggataacggg acttttgaac tttttataaa gggcagaaac 1320
tttaccccag acgccggggt atttgtgtat agcggcgacg aagccatcat gaaactgcgg 1380
aactggtacc gtcaaacccg catacacagc acgcttacac tcgacaatca aaatatggtc 1440
attaccaaag cccggcaaaa caaatgggaa acaggaaata accttgatgt gcttacctat 1500
accaacccaa gctatccgaa tctggaccat cagcgcagtg tacttttcat caacaaaaaa 1560
tactttctgg tcatcgatag ggcaataggc gaagctaccg gaaacctggg cgtacactgg 1620
cagcttaaag aagacagcaa ccctgttttc gataagacaa agaaccgggt ttacaccact 1680
tacagagatg gtaacaacct gatgatccaa tcgttgaatg cggacaggac cagcctcaat 1740
gaagaagaag gaaaggtatc ttatgtttac aataaggagc tgaaaagacc tgctttcgta 1800
tttgaaaagc ctaaaaagaa tgccggcaca caaaattttg tcagtatagt ttatccatac 1860
gacggccaga aggctccaga gatcagcata cgggaaaaca agggcaatga ttttgagaaa 1920
ggcaagctta atctaaccct taccattaac ggaaaacaac agcttgtgtt ggttccttag 1980
<210> 28
<211> 659
<212> PRT
<213> 肝素黄杆菌
<400> 28
Met Thr Thr Lys Ile Phe Lys Arg Ile Ile Val Phe Ala Val Ile Ala
1 5 10 15
Leu Ser Ser Gly Asn Ile Leu Ala Gln Ser Ser Ser Ile Thr Arg Lys
20 25 30
Asp Phe Asp His Ile Asn Leu Glu Tyr Ser Gly Leu Glu Lys Val Asn
35 40 45
Lys Ala Val Ala Ala Gly Asn Tyr Asp Asp Ala Ala Lys Ala Leu Leu
50 55 60
Ala Tyr Tyr Arg Glu Lys Ser Lys Ala Arg Glu Pro Asp Phe Ser Asn
65 70 75 80
Ala Glu Lys Pro Ala Asp Ile Arg Gln Pro Ile Asp Lys Val Thr Arg
85 90 95
Glu Met Ala Asp Lys Ala Leu Val His Gln Phe Gln Pro His Lys Gly
100 105 110
Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr Gly Lys Asp Ile Asn Trp Gln Met Trp Pro
115 120 125
Val Lys Asp Asn Glu Val Arg Trp Gln Leu His Arg Val Lys Trp Trp
130 135 140
Gln Ala Met Ala Leu Val Tyr His Ala Thr Gly Asp Glu Lys Tyr Ala
145 150 155 160
Arg Glu Trp Val Tyr Gln Tyr Ser Asp Trp Ala Arg Lys Asn Pro Leu
165 170 175
Gly Leu Ser Gln Asp Asn Asp Lys Phe Val Trp Arg Pro Leu Glu Val
180 185 190
Ser Asp Arg Val Gln Ser Leu Pro Pro Thr Phe Ser Leu Phe Val Asn
195 200 205
Ser Pro Ala Phe Thr Pro Ala Phe Leu Met Glu Phe Leu Asn Ser Tyr
210 215 220
His Gln Gln Ala Asp Tyr Leu Ser Thr His Tyr Ala Glu Gln Gly Asn
225 230 235 240
His Arg Leu Phe Glu Ala Gln Arg Asn Leu Phe Ala Gly Val Ser Phe
245 250 255
Pro Glu Phe Lys Asp Ser Pro Arg Trp Arg Gln Thr Gly Ile Ser Val
260 265 270
Leu Asn Thr Glu Ile Lys Lys Gln Val Tyr Ala Asp Gly Met Gln Phe
275 280 285
Glu Leu Ser Pro Ile Tyr His Val Ala Ala Ile Asp Ile Phe Leu Lys
290 295 300
Ala Tyr Gly Ser Ala Lys Arg Val Asn Leu Glu Lys Glu Phe Pro Gln
305 310 315 320
Ser Tyr Val Gln Thr Val Glu Asn Met Ile Met Ala Leu Ile Ser Ile
325 330 335
Ser Leu Pro Asp Tyr Asn Thr Pro Met Phe Gly Asp Ser Trp Ile Thr
340 345 350
Asp Lys Asn Phe Arg Met Ala Gln Phe Ala Ser Trp Ala Arg Val Phe
355 360 365
Pro Ala Asn Gln Ala Ile Lys Tyr Phe Ala Thr Asp Gly Lys Gln Gly
370 375 380
Lys Ala Pro Asn Phe Leu Ser Lys Ala Leu Ser Asn Ala Gly Phe Tyr
385 390 395 400
Thr Phe Arg Ser Gly Trp Asp Lys Asn Ala Thr Val Met Val Leu Lys
405 410 415
Ala Ser Pro Pro Gly Glu Phe His Ala Gln Pro Asp Asn Gly Thr Phe
420 425 430
Glu Leu Phe Ile Lys Gly Arg Asn Phe Thr Pro Asp Ala Gly Val Phe
435 440 445
Val Tyr Ser Gly Asp Glu Ala Ile Met Lys Leu Arg Asn Trp Tyr Arg
450 455 460
Gln Thr Arg Ile His Ser Thr Leu Thr Leu Asp Asn Gln Asn Met Val
465 470 475 480
Ile Thr Lys Ala Arg Gln Asn Lys Trp Glu Thr Gly Asn Asn Leu Asp
485 490 495
Val Leu Thr Tyr Thr Asn Pro Ser Tyr Pro Asn Leu Asp His Gln Arg
500 505 510
Ser Val Leu Phe Ile Asn Lys Lys Tyr Phe Leu Val Ile Asp Arg Ala
515 520 525
Ile Gly Glu Ala Thr Gly Asn Leu Gly Val His Trp Gln Leu Lys Glu
530 535 540
Asp Ser Asn Pro Val Phe Asp Lys Thr Lys Asn Arg Val Tyr Thr Thr
545 550 555 560
Tyr Arg Asp Gly Asn Asn Leu Met Ile Gln Ser Leu Asn Ala Asp Arg
565 570 575
Thr Ser Leu Asn Glu Glu Glu Gly Lys Val Ser Tyr Val Tyr Asn Lys
580 585 590
Glu Leu Lys Arg Pro Ala Phe Val Phe Glu Lys Pro Lys Lys Asn Ala
595 600 605
Gly Thr Gln Asn Phe Val Ser Ile Val Tyr Pro Tyr Asp Gly Gln Lys
610 615 620
Ala Pro Glu Ile Ser Ile Arg Glu Asn Lys Gly Asn Asp Phe Glu Lys
625 630 635 640
Gly Lys Leu Asn Leu Thr Leu Thr Ile Asn Gly Lys Gln Gln Leu Val
645 650 655
Leu Val Pro

Claims (26)

1.用于底物的酶促磺酰化的方法，所述方法包括：
(i)在含有属于肠杆菌科的细菌的培养基中使所述底物与3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸反应以产生所述底物的硫酸化衍生物，和
(ii)从所述培养基收集所述硫酸化衍生物，
其中所述细菌已经进行了修饰：
(A)以至少产生具有磺基转移酶活性的蛋白质，和
(B)以减弱aphA基因或cysQ基因的表达。
2.根据权利要求1的方法，其中所述进行了修饰以减弱所述aphA基因的表达的细菌已经进行了进一步修饰以减弱所述cysQ基因或cpdB基因或它们的组合的表达。
3.根据权利要求1的方法，其中所述进行了修饰以减弱所述cysQ基因的表达的细菌已经进行了进一步修饰以减弱所述aphA基因或所述cpdB基因或它们的组合的表达。
4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述具有磺基转移酶活性的蛋白质选自由以下组成的组：具有O-磺基转移酶活性的蛋白质、具有N-磺基转移酶活性的蛋白质和具有N-脱乙酰基酶/N-磺基转移酶活性的蛋白质。
5.根据权利要求4的方法，其中所述具有O-磺基转移酶活性的蛋白质选自由以下组成的组：具有硫酸乙酰肝素2-O-磺基转移酶活性的蛋白质、具有硫酸乙酰肝素3-O-磺基转移酶活性的蛋白质、具有硫酸乙酰肝素6-O-磺基转移酶活性的蛋白质，及它们的组合。
6.根据权利要求1的方法，其中所述细菌已经进行了进一步修饰以产生具有肝素前体(heparosan)-N-硫酸-葡糖醛酸5-差向异构酶活性的蛋白质。
7.根据权利要求1的方法，其中所述细菌已经进行了进一步修饰以产生具有3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸-磺基转移酶活性的蛋白质。
8.根据权利要求1的方法，其中所述培养基含有所述具有3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸-磺基转移酶活性的蛋白质。
9.根据权利要求1的方法，其中所述底物至少具有一个选自羟基基团和氨基基团的化学基团。
10.根据权利要求1的方法，其中所述底物选自由以下组成的组：肝素前体、硫酸乙酰肝素和肝素。
11.根据权利要求1的方法，其中所述硫酸化衍生物选自由以下组成的组：肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸胆碱和硫酸皮肤素。
12.根据权利要求1的方法，其中所述细菌属于埃希氏菌属或泛菌属。
13.根据权利要求12的方法，其中所述细菌是大肠杆菌或菠萝泛菌。
14.用于产生底物的硫酸化衍生物的方法，所述方法包括：
(i)在含有属于肠杆菌科的细菌的培养基中使所述底物与3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸反应以产生所述底物的硫酸化衍生物，和
(ii)从所述培养基收集所述硫酸化衍生物，
其中所述细菌已经进行了修饰：
(A)以至少产生具有磺基转移酶活性的蛋白质，和
(B)以减弱aphA基因或cysQ基因的表达。
15.根据权利要求14的方法，其中所述进行了修饰以减弱所述aphA基因的表达的细菌已经进行了进一步修饰以减弱所述cysQ基因或cpdB基因或它们的组合的表达。
16.根据权利要求14的方法，其中所述进行了修饰以减弱所述cysQ基因的表达的细菌已经进行了进一步修饰以减弱所述aphA基因或所述cpdB基因或它们的组合的表达。
17.根据权利要求14至16中任一项的方法，其中所述具有磺基转移酶活性的蛋白质选自由以下组成的组：具有O-磺基转移酶活性的蛋白质、具有N-磺基转移酶活性的蛋白质、和具有N-脱乙酰基酶/N-磺基转移酶活性的蛋白质。
18.根据权利要求17的方法，其中所述具有O-磺基转移酶活性的蛋白质选自由以下组成的组：具有硫酸乙酰肝素2-O-磺基转移酶活性的蛋白质、具有硫酸乙酰肝素3-O-磺基转移酶活性的蛋白质、具有硫酸乙酰肝素6-O-磺基转移酶活性的蛋白质以及其组合。
19.根据权利要求14的方法，其中所述细菌已经进行了进一步修饰以产生具有肝素前体-N-硫酸-葡糖醛酸C5-差向异构酶活性的蛋白质。
20.根据权利要求14的方法，其中所述细菌已经进行了进一步修饰以产生具有3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸-磺基转移酶活性的蛋白质。
21.根据权利要求14的方法，其中所述培养基含有具有3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸-磺基转移酶活性的蛋白质。
22.根据权利要求14的方法，其中所述底物至少具有一种选自羟基基团和氨基基团的化学基团。
23.根据权利要求14的方法，其中所述底物选自由以下组成的组：肝素前体、硫酸乙酰肝素和肝素。
24.根据权利要求14的方法，其中所述硫酸化衍生物选自由以下组成的组：肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸胆碱和硫酸皮肤素。
25.根据权利要求14的方法，其中所述细菌属于埃希氏菌属或泛菌属。
26.根据权利要求25的方法，其中所述细菌是大肠杆菌或菠萝泛菌。
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