JP2003265194A

JP2003265194A - 新規変異原性試験法

Info

Publication number: JP2003265194A
Application number: JP2002077385A
Authority: JP
Inventors: Masahito Suiko; 正仁水光
Original assignee: Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2002-03-19
Filing date: 2002-03-19
Publication date: 2003-09-24

Abstract

(57)【要約】【課題】安全性試験方法の一つとして化学物質、医
薬、食品、飼料などの分野で遍く利用されているエイム
ス試験のような微生物を用いたインビトロの変異原性
試験において、より確度の高い変異原性物質の変異原性
の検出及び／又は測定法を提供すること。【解決手段】エイムス試験のような微生物を用いた変
異原性試験において、試験物質を硫酸化反応処理するこ
とによって、試験物質を代謝活性化することにより、変
異原性物質に生体内で代謝活性化されると同様の条件を
付与し、確度の高い変異原性物質の変異原性の検出及び
／又は測定を可能とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試験物質の突然変
異原性を検出及び／又は測定する変異原性試験方法、特
に、安全性試験方法の一つとして化学物質、医薬、食
品、飼料などの分野で遍く利用されている、試験物質の
突然変異原性を検出及び／又は測定するインビトロ変異
原性試験方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】我々は日ごろの生活の中で、多くの変異
原性物質にさらされている。その中でも食品やタバコ等
において、特に問題が指摘されている。変異原性物質と
は自然突然変異よりも高い頻度で突然変異を誘発する化
学物質のことで、我々の日常に深いかかわりのある食
品、糞便、大気など自然の中から、続々と見いだされて
いる（菅沼雅美著「発がん Bioscience Series 生命現
象への化学的アプローチ」化学同人、（１９８５年１月
１０日発行））。

【０００３】日本人の３大死因に数えられる脳溢血、が
ん、心臓病の中で、最近特にがんによる死亡率が増加を
続け、日本人の死因の第一位を占めている。がんの原因
はわずかな遺伝的なものもあるが、７０〜８０％が外部
の環境要因によるものである。中でもタバコや食事に起
因するものが大半を占めており、米食や塩分を多く摂取
する日本人の食習慣や、日常普通に行われている魚や肉
類の調理の際の加熱生成物、保存・着色のための食品添
加物などによる遺伝子や染色体の突然変異の誘発が、が
んの発生に大きな影響をもっているといわれる。例え
ば、食品を加熱することによって生じる発がん物質は変
異原性物質を指標にすることにより多くのものが同定さ
れてきた。１９７７年にトリプトファンの加熱分解生成
物の中から強い変異原性を持つTrp-P-1、Trp-P-2が単離
同定された。つづいてグルタミン酸の加熱分解物からGl
u-P-1、Glu-P-2が単離同定された。他のアミノ酸やタン
パク質についてもその加熱分解物から変異原性物質が精
製されている。

【０００４】そもそも化学物質の発がん性の研究の歴史
においては、１９１５年、わが国の山極と市川がウサギ
の耳に繰り返しコールタールを塗ることにより、世界に
先駆けてがんを人工的に発生させることに成功した。コ
ールタールに含まれるどういう物質が、どういうメカニ
ズムでがんを引き起こすのかの第一の疑問はKennawayを
リーダーとする英国王立がん病院のチームによるベンツ
ピレンの発見により解明された。このとき実験にこの難
問に取り組んだのはＣｏｏｋらの有機化学者であった。
彼らはマウスの皮膚に対する発がんテストおよび蛍光ス
ペクトルを手がかりにして発がん物質の精製を繰り返
し、２トンのピッチから最終的に７ｇの黄色い結晶を分
離した。そしてその主成分が当時の未知物質であったベ
ンゾ〔α〕ピレン（通称ベンツピレン）であることを化
学合成により確認した。

【０００５】人類にとって発ガンのメカニズムを完全に
解明し、ガンの予防法あるいは治療を開発することは長
年の大きな課題であるが、ヒトのガンの約８０％は環境
中に存在する発ガン化学物質によって体細胞遺伝子が損
傷を受けるために発生すると考えられている。発ガン化
学物質はそのほとんどが変異原性物質である。発ガン化
学物質による発ガン過程は複雑であるが、遺伝子の損傷
過程であるイニシエーション、異常増殖に伴う腫瘍の顕
在化過程であるプロモーション、そして腫瘍の転移、浸
潤を招く悪性化過程のプログレッションと大きく３段階
を経ると考えられている（篠原和毅著「食品機能研究
法」光琳社（２０００年５月）。このうち、変異原物質
による発ガン過程はイニシエーションである（図１）。

【０００６】このように、食品中等に見いだされた生理
活性物質の変異原性は、しばしば発ガン性等の関連で問
題になってきた。このような変異原性、発ガン性の可能
性のあるものを網羅的にスクリーニングする試験が変異
原性試験である。変異原性試験には、下等な細菌細胞を
用いたインビトロの試験から、高等な動物細胞を用い
た試験まで、種々の試験が開発されている。近年、高等
な動物細胞や下等な細菌細胞を用いた変異原性試験につ
いて、いくつかの方法が開示されている。例えば、高等
動物細胞を用いた変異原性試験に関して、遺伝子突然変
異検出用トランスジェニックマウスを用いた方法（特開
平７−２７４７７０号公報）、高感受性マウスを用いた
方法（特開平１０−２７４６４９号公報）が開示されて
いる。

【０００７】また、下等な細菌細胞を用いた変異原性試
験に関して、チミジンキナーゼの作用によって生育阻害
する核酸誘導体を加えた後、生育する細胞に取り込まれ
た色素を測定して変異原性を決定する方法（特開平８−
１１６９９０号公報）、核酸を色素又は蛍光色素で標識
したバクテリオファージを用いて細菌に核酸を注入し、
これを用いて光学的に変異を検出する方法（特開平１１
−３２７６１号公報）、ルシフェリン−ルシフェラーゼ
発光反応を用いたＡＴＰ測定法により細胞数又は細胞増
殖率を測定し、変異原性を検出する方法（特開平２００
０−１２５８９７号公報）、などの方法が開示されてい
る。

【０００８】生体内で変異性を惹起する物質を検出する
ことが狙いである変異原性試験の目的からすれば、高等
動物細胞を用いるのが合理的であるが、簡便性や経済性
などの理由で、原核細胞である細菌を用いて、インビ
トロで第1次のスクリーニングを行うことが多い。細菌
を用いて、変異原性、発ガン性の可能性のある変異原性
物質を検出す試験法として、国際的によく用いられてい
るのが、エイムス試験（Ames test）である。また、同
じく細菌を用いて変異原性を検出する方法としてレック
・アッセイ（rec-assay）がある。該方法は、試験化学
物質によるＤＮＡの損傷に対する修復能の一部が欠損し
ているために増殖阻害が起こるのを利用する方法の一つ
であり、枯草菌Bacillus subtilisの野生株と組換え修
復欠損株との増殖の差を寒天平板上で測定する方法であ
る。

【０００９】エイムス試験（Ames test）は、１９７１
年、カリフォルニア大学のＡｍｅｓらがSalmonella typ
himurium TAシリーズを用いて突然変異原物質を検出す
る方法を考案し、発ガン性を予測できる方法として開発
したものである（Mutation Research., 113, 173-215,
1983）。アミノ酸の一種であるヒスチジンの生合成系に
欠損のあるサルモネラ変異株を用いて、ヒスチジン要求
性から非要求性になる復帰突然変異を効率よく簡便にプ
レート上で検出する方法で、突然変異原性物質やがん原
性物質の可能性のある物質の第一次スクリーニング法と
して優れており、広く世界中で用いられ、既知発ガン物
質の大部分がこの方法で陽性の結果を示している。

【００１０】この試験法の特徴は、１）突然変異誘発物
質に対してこの目的のために開発された感受性の高いテ
スト菌株を用いることによって、精度よくかつ再現性よ
く突然変異誘発物質を検出できること、２）がん原性物
質の多くが動物体内で代謝されて初めて生物活性を示す
ようになる代謝活性化を必要とする化合物であるから、
肝臓ホモジネートの９０００×ｇ、１０分間遠沈上清
（Ｓ−９）に補酵素を添加したＳ−９ｍｉｘを併用した
ことである。この結果、従来の方法で陰性を示していた
代謝活性化を必要とする多くの前駆発ガン物質(procarc
inogen)が変異原性を示した。Salmonella typhimurium
TAシリーズには、ＴＡ１５３５、ＴＡ１００の塩基対置
換型の突然変異原物質を検出する変異株と、ＴＡ１５３
６、ＴＡ１５３７、ＴＡ１５３８、ＴＡ９８のフレーム
シフト型の突然変異原物質を検出する変異株がある。

【００１１】ただ、フレームシフト変異はグアニンとシ
トシンの塩基が反復している部位で起こるため、アデニ
ンとチミンが反復している部位のフレームシフト変異を
起こす化合物は検出されないと予想されている（矢作多
貴江、蛋白質・核酸・酵素、１１７８頁〜１１８８頁、
１９７５年）。これらのサルモネラ菌には、菌膜表面の
リポ多糖欠損(rfa mutation)、除去修復システム欠損(u
vrB mutation)などの突然変異の導入により、ある程度
大きな化学物質が菌膜を透過しやすく、またＤＮＡ損傷
が修復されにくいように工夫されている。ＴＡ１００、
ＴＡ９８は薬剤耐性因子プラスミドｐＫＭ１０１の導入
によりさらに検出感度を高めた。

【００１２】前述したが、エイムス試験はあくまで環境
中の発ガン物質の第一次スクリーニング法であることを
考慮しておく必要がある。発ガン物質の９０％以上がこ
の試験で陽性を示すといわれるが、変異原性の強さと発
ガン性の強さはかなりのばらつきがあることも事実であ
る（Mutation Research., 113, 173-215, 1983）。微生
物を用いるエイムス試験は哺乳動物培養細胞やラット、
マウスなどの哺乳類動物を用いる実験よりもはるかに容
易で、短時間にかつ安価に変異原性物質を検出できる方
法である。しかし、変異原性物質＝発ガン物質は完全に
は成り立たない。例えば、プロフラビンや亜硫酸ナトリ
ウムなどは突然変異誘起物質だが発ガン物質だという証
明はなされてない。微生物を用いた発ガン物質の試験に
おいてはこのような、所謂擬陽性のものを拾う可能性も
ある（矢作多貴江、蛋白質・核酸・酵素、１１７８頁〜
１１８８頁、１９７５年）。しかし第一次スクリーニン
グ法として危険性のあるものを網羅的に試験できる点が
優れている。当然、最終的には発ガン性を動物実験で確
認する必要がある。以上のように、エイムス試験は、実
験の容易さ、費用、時間などの点で優れており、環境中
の発がん物質の第一次スクリーニング法として現在最も
広く用いられている（丹羽章著「細胞培養の技術［応用
編］」朝倉書店）。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、試験
物質の突然変異原性を検出及び／又は測定する新規変異
原性試験法、特に安全性試験方法の一つとして化学物
質、医薬、食品、飼料などの分野で遍く利用されている
エイムス試験のような微生物を用いたインビトロの変
異原性試験において、変異原性物質が生体内で代謝活性
化されると同様の条件を付与することにより、確度の高
い変異原性物質の変異原性の検出及び／又は測定を可能
とした試験法を提供することにある。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究の結果、エイムス試験のような微
生物を用いた変異原性試験において、従来の方法では、
生体内で硫酸化反応により活性化される変異原性物質が
検出できないことを確認した。そこで、該エイムス試験
のような微生物を用いた変異原性試験物質の突然変異原
性を検出及び／又は測定するに際して、試験物質を硫酸
化反応処理することによって、試験物質を代謝活性化す
ることにより、変異原性物質に生体内で代謝活性化され
ると同様の条件を付与することが出来、確度の高い変異
原性物質の変異原性の検出及び／又は測定が可能である
ことを見出し、本発明を完成するに至った。

【００１５】即ち、良く知られているようにエイムス
（Ａｍｅｓ）法とは、「必須アミノ酸のヒスチジン要求
性変異株のサルモネラ菌を化学物質と一緒に培養する
と、化学物質に変異原性があれば、菌が分裂する過程で
復帰突然変異が起こりヒスチジン非要求性（Ｈｉｓ＋）
になる。その結果、菌はヒスチジンを自己生産し増殖を
続けるためコロニーを形成するので、このコロニー数を
計測することにより、「容易にテストした物質が突然変
異を起こすか否かを知ることが出来る」という原理を利
用した変異原性物質検出法である。ところで、変異原物
質の多くは生体内で代謝されることで変異原性が活性化
されることが知られている。

【００１６】例えば、ベンツピレンの場合、その変異原
性によりＤＮＡに傷をつける本体はベンツピレンそのも
のではなく、究極発がん物質（ultimate carcinogen）
と呼ばれる反応性に富む代謝産物、ベンツピレンジオー
ルエポキシドであることが判明している。究極発がん物
質はたいてい求電子体（electrophile）であり、またＤ
ＮＡは求核体（nucleophile）とみなすことができる。
したがって細胞のがん化はelectrophile‐nucleophile
間の化学反応により引き金が引かれることになる。それ
は生物にとってまったくの予期しなかった出来事であ
る。もともとベンツピレンなどの多環芳香族化合物の生
体内の酵素的酸化反応は、疎水性の異物を水溶性なもの
へ変えて早く体外へ排出するための解毒機構の一部とし
ての反応なのである。皮肉にもこの解毒のために代謝過
程で究極発がん物質が生じてしまい、それがＤＮＡのよ
うな生体にとって最も重要な物質に傷をつけてしまうの
である。近年、さまざまな発がん物質について生体内の
ＤＮＡと反応して生じた付加体（adduct）の構造が研究
され、多くの知見が得られている。そしてほとんど例外
なく発がん物質は直接に、また近接発がん物質、究極発
がん物質へと代謝活性化されたあとに、ＤＮＡと直接共
有結合することが分かっている。

【００１７】このように、がん原性物質の多くが動物体
内で代謝されて初めて生物活性を示すようになる代謝活
性化を必要とする化合物であることから、従来のエイム
ス試験法では、哺乳類の異化代謝経路を補う目的で、肝
臓ホモジネートの９０００×ｇ、１０分間遠沈上清（Ｓ
−９）に補酵素（ＮＡＤＰＨ−産生系）を添加したＳ９
ｍｉｘを併用し、生体内におけるがん原性物質の代謝活
性化を想定した変異原性の試験を行っていた。しかし、
この方法では生体内における重要な解毒代謝反応の一つ
である硫酸化により活性化される変異原物質は検出され
ないので、変異原物質の検出方法としては不完全という
不都合があった。

【００１８】そこで、本発明においては、この問題を解
決すべく、例えば、既存のエイムス試験法に硫酸転移酵
素と活性硫酸（ＰＡＰＳ）を応用し、硫酸化による変異
原代謝活性化を特異的に検出できる新規な変異原性試験
法を開発した。通常、人類を含めた哺乳動物には、環境
中から取り込まれた生体外異物を体外に効率よく排泄す
るための解毒代謝機能が備わっている。解毒作用とは、
分かり易く言えば肝臓内であまり水と馴染まない化学物
質が体内で脂肪組織などに蓄積してしまうのを防ぐため
に、水と馴染み易い物質に変換して尿中へ排泄を促すと
いう、進化の過程でつくりあげられた巧妙な防御機構で
ある。

【００１９】このような解毒代謝機能として、２つの異
化代謝経路が知られている。第一相反応：酵素シトクロームＰ４５０群が関与して
極性官能基を生ずる酸化反応、還元反応、及び加水分解
反応、第二相反応：極性の高い物質との抱合反応（硫酸反
応、グルクロン酸抱合、アセチル化抱合、メチル化抱
合、グリシン抱合、グルタチオン抱合）前記のように、従来のエイムス試験法ではこの第二相反
応の一つで硫酸化反応により活性化される変異原性物質
が検出されない。したがって、本発明は、具体的には試
験物質の代謝活性に用いるＳ９混合物のようなものとし
て、デヒドロエピアンドステロン硫酸転移酵素（ＤＨＥ
ＡＳＴ）と活性硫酸（ＰＡＰＳ）を用い、試験物質に
該ＤＨＥＡＳＴとＰＡＰＳを作用させることにより、
硫酸化反応により活性化される変異原性物質が検出する
ことを可能とした。

【００２０】本発明の、変異原性物質を硫酸化反応によ
り活性化させ、変異原性を試験する方法は、検出試験物
質に該ＤＨＥＡＳＴとＰＡＰＳを作用させ、サルモネ
ラ菌を接種後、浸とう培養し、更にソフト寒天を混和
後、最少グルコース寒天培地に重層し、倒置培養し、復
帰突然変異コロニーを計測することにより、実施するこ
とができる。本発明の試験法により、例えば従来のエイ
ムス試験法では検出されない変異原性物質でも検出で
き、安全性試験方法としてより確実な方法として用いる
ことができる。

【００２１】すなわち本発明は、試験物質の突然変異原
性を検出及び／又は測定する変異原性試験において、試
験物質を硫酸化反応処理することによって、試験物質を
代謝活性化することを特徴とする変異原性試験法(請求
項１)や、試験物質の硫酸化反応処理を、活性硫酸ＰＡ
ＰＳを硫酸基供与体として、硫酸転移酵素の触媒作用に
よって行うことを特徴とする請求項１記載の変異原性試
験法（請求項２）や、硫酸転移酵素として、リコンビナ
ント硫酸転移酵素を用いることを特徴とする請求項１又
は２記載の変異原性試験法(請求項３)や、試験物質の代
謝活性化を、動物の肝臓ホモジネートＳ９画分に補酵素
類を加えたＳ９ｍｉｘによる代謝活性化と併合して行う
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の変異原
性試験法（請求項４）よりなる。

【００２２】また本発明は、試験物質の突然変異原性を
検出及び／又は測定する変異原性試験が、微生物変異株
を用いた試験であることを特徴とする請求項１〜４のい
ずれか記載の変異原性試験法(請求項５)や、微生物変異
株が、サルモネラ菌変異株であることを特徴とする請求
項５記載の変異原性試験法（請求項６）や、サルモネラ
菌変異株を用いた試験が、ヒスチジン要求性株を用いた
エイムス試験であることを特徴とする請求項６記載の変
異原性試験法(請求項７)や、活性硫酸ＰＡＰＳ及び硫酸
転移酵素を具備することを特徴とする請求項１〜７記載
の変異原性試験法に用いるためのキット（請求項８）よ
りなる。

【００２３】

【発明の実施の形態】本発明は、特に、細菌のような微
生物を用いてインビトロで試験物質の突然変異原性を
検出及び／又は測定する変異原性試験において、試験物
質を硫酸化反応処理することによって、試験物質を代謝
活性化することにより、変異原性物質が生体内で代謝さ
れ活性化される条件で、試験物質の変異原性試験を行う
ことよりなる。

【００２４】硫酸化反応は、そもそも多環芳香族化合物
の酵素的酸化反応により、疎水性の異物を水溶性なもの
に変えて、早く対外へ排出するための解毒機構の一部で
あり、この機構が前駆変異原性物質を代謝活性化するこ
とになるものである。解毒機構には、シトクロムＰ４５
０酵素群の行う第１相反応（従来のエイムス試験では、
Ｓ９ｍｉｘを添加することにより、この第１相反応は考
慮されている）と、グルクロン酸抱合やグリコシド抱
合、メチル抱合、アセチル抱合、アミノ酸抱合、グルタ
チオン抱合、脂肪酸抱合などとして知られている第２相
反応とがあり、硫酸化反応は、この第２相反応として知
られている解毒機構である。硫酸化反応の研究は、１９
５７年にLipmann等の補基質である硫酸基供与体ＰＡＰ
Ｓの発見によって行われてきた（J.Biol.Chem., 229, 8
37-851, 1957）。硫酸化は下記のような反応で起こる。
この硫酸化反応は、１８７６年、Baumannらによって初
めて確認された反応であり、化合物の水酸基に対して活
性硫酸ＰＡＰＳを硫酸供与体として硫酸転移酵素の触媒
作用によって行われるエステル化反応である（Ber. Dts
ch. Chem. Ges pp.54）。

【００２５】

【化１】

【００２６】本発明において、試験物質の硫酸化反応処
理を行うには、図２に示される硫酸化反応のように、活
性硫酸ＰＡＰＳを硫酸基供与体として、硫酸転移酵素の
触媒作用によって行う。硫酸転移酵素としては、公知の
酵素を用いることができる。１９８０年代の後半以降、
遺伝子のクローニング技術により多くの硫酸転移酵素ｃ
ＤＮＡの取得が報告されており、これらのｃＤＮＡを用
いて製造したリコンビナント硫酸転移酵素を利用するこ
とができる。例えば、１９８７年に初めて最初のｃＤＮ
Ａ配列が報告されて依頼、多くのｃＤＮＡ配列が報告さ
れている。硫酸転移酵素の遺伝子ファミリーはフェノー
ル硫酸転移酵素（ＰＳＴ）、ヒドロキシステロイド硫酸
転移酵素（ＨＳＳＴ）、フラボノール硫酸転移酵素（Ｆ
ＳＴ）の３つのファミリーについて研究されている。Ｐ
ＳＴはさらにフェノール硫酸転移酵素（ＰＳＴ）とエス
トロゲン硫酸転移酵素（ＥＳＴ）、ヒドロキシアリルア
ミン硫酸転移酵素（ＨＡＳＴ）、ドーパ／チロシン硫酸
転移酵素があり、今後さらに増えていくものと予想され
る。硫酸転移酵素のｃＤＮＡ配列や、遺伝子の解明によ
り、リコンビナント硫酸転移酵素としての硫酸転移酵素
の調製が可能であり、該酵素を本発明の硫酸化反応処理
に用いることができる。

【００２７】本発明の変異原性試験法において、硫酸基
供与体として用いられる活性硫酸ＰＡＰＳ（３′−ホス
ホ−５′−アデニリル硫酸）は、通常、硫酸転移酵素の
基質として各種硫酸エステルの生合成に使用されている
ものを用いることができる。本発明の、試験物質の硫酸
化反応処理による試験物質の代謝活性化は、微生物を用
いたインビトロの変異原性試験における変異原性物質
の代謝活性化に用いることができる。特に、変異原性試
験方法として、広く利用されているサルモネラ菌変異株
を用いたエイムス試験に有利に用いることができる。エ
イムス試験に用いるサルモネラ菌変異株としては、従来
より該試験に用いられているヒスチジン要求性の変異株
を用いることができる。即ち、従来、エイムス試験に用
いられる該サルモネラ菌変異株としてSalmonella typhi
murium TAシリーズが作成されている。

【００２８】Salmonella typhimurium TAシリーズに
は、ＴＡ１５３５、ＴＡ１００があり、該変異株は塩基
対置換型の変異株で、塩基置換型の突然変異原物質によ
って復帰されやすい。また、ＴＡ１５３６、ＴＡ１５３
７、ＴＡ１５３８、ＴＡ９８があり、該変異株はフレー
ムシフト型の変異株で、事実フレームシフト型の突然変
異を起こす物質によって復帰しやすい。これらのサルモ
ネラ菌は、菌膜表面のリポ多糖欠損、除去修復システム
欠損などの突然変異の導入により化学物質が菌膜を透過
しやすく、またＤＮＡ損傷が修復されにくいように工夫
されている。エイムスらはさらにＴＡ１５３５、ＴＡ１
５３８に薬剤耐性因子であるプラスミドｐＫＭ１０１の
導入によってそれぞれＴＡ１００とＴＡ９８という新し
い株を改良し、検出感度を高めている。

【００２９】本発明においては試験物質の代謝活性化
を、上記のような硫酸化反応処理と、従来、エイムス試
験で用いられていた、動物の肝臓ホモジネートＳ９画分
に補酵素類を加えたＳ９ｍｉｘによる代謝活性化と併合
して行うことができる。肝臓ホモジネートＳ９画分の調
製は、フェノバルビタール（ＰＢ）、３-メチルコラン
トレン（ＭＣ）、ポリ塩化ビフェニルなどの誘導物質
（inducer）をラットに投与することによって誘導し、
調製する。さらにＮＡＤＰＨ−産生系と肝臓ホモジネー
トＳ９画分をあわせ、Ｓ９ｍｉｘを調製する。このＳ９
ｍｉｘは、生体内薬物代謝における第一相反応を触媒す
るシトクロムＰ４５０群（一酸化炭素と結合させると４
５０ｎｍに吸収極大を示すことに由来する）と呼ばれる
一群の酵素を多量に含む。シトクロムＰ４５０は小胞体
中の電子伝達系末端の酸化酵素であり、多くの薬物の酸
化反応にかかわる。この酵素は小胞体の膜中に埋まって
おり、分子量は約４５，０００〜５５，０００Ｄａで多
数のアイソザイムが存在し、多くの研究がなされてい
る。

【００３０】本発明の変異原性試験法に用いられる菌株
の培地や酵素、及び基質は、活性硫酸ＰＡＰＳ及び硫酸
転移酵素を具備するキットとして調製することができ
る。現在、安全衛生法、化審法、薬事法、動物用医薬、
飼料添加物、及び農薬取締法などでは、安全性規格基準
の一つとして変異原性試験（Ａｍｅｓ法）をクリアーす
る事が必要とされている。本発明の変異原性試験法は、
より確度の高い変異原性試験法として、これらの試験法
に利用することが期待される。

【００３１】

【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定さ
れるものではない。本実施例では、リコンビナント硫酸
転移酵素を用いた本発明の変異原性試験法の検討及び本
発明の変異原性試験法を用いた緑茶カテキン類の抗変異
原作用の確認を行った。

【００３２】実施例１リコンビナント硫酸転移酵素を
用いた本発明の変異原性試験法の検討［実験材料］（変異原性物質）多くの変異原物質は一般に脂溶性であ
るため有機溶媒であるDMSO（和光純薬工業株式会社）に
溶解させた。この実施例では、試験変異原性物質として
9-hydroxymetylanthracene（Fluka Chemika社製）を用
いた。9-hydroxymethylanthracene は環境中で見いださ
れており、特に汚泥や魚類などから発見されている。9-
hydroxymethylanthraceneは哺乳動物において次のよう
に代謝をうけると予想される。

【００３３】

【化２】

【００３４】また陽性対照試験（ポジティブ・コントロ
ール）として4-nitroquinoline 1-oxide（４ＮＱＯ）を
用いて試験を行った。

【００３５】

【化３】

【００３６】（菌株）ヒスチジン要求性突然変異株Salm
onella typhimurium TA98株を用いた。ＴＡ９８株はFra
meshift型突然変異を起こす突然変異誘起物質を検出す
ることができる。ＴＡ９８株はＴＡ１５３８株にＲ因子
をもつ薬剤耐性遺伝子であるプラスミドｐＬＭ１０１を
導入し、検出の感度を高めた改良株である。これらの株
はヒスチジン合成酵素遺伝子の変異のほかに別の二つの
突然変異が加えられて感度がよくなっているため、突然
変異の誘起が高まっている。第一に除去修復のシステム
（uvrB）を欠損しているため、突然変異の誘起が高まっ
ている。第二に細菌の表面構成分子であるリポ多糖類が
欠損している（rfa（deep rough）mutation）ため、比
較的大きな分子も細胞内に透過する（Mutation Researc
h., 113, 173-215, 1983）。

【００３７】（培地）（１）Ｖｏｇｅｌ−Ｂｏｎｎｅｒの最少培地Ｅ（１０倍濃度）特級ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（和光純薬工業株式会社製）２ｇ特級Ｃｉｔｒｉｃａｃｉｄ（和光純薬工業株式会社製）２０ｇ特級Ｋ₂ＨＰＯ₄（和光純薬工業株式会社製）１００ｇ特級ＮａＮＨ₄ＨＰＯ₄・４Ｈ₂Ｏ（和光純薬工業株式会社製）３５ｇＤ．Ｗ total １０００ｍｌＤ．Ｗ．で１０００ｍｌまでフィルアップし、溶解させ
オートクレーブで高圧滅菌後、冷蔵庫に保存した。

【００３８】（２）２０％特級Ｄ（＋）−Ｇｌｕｃｏｓｅ溶液特級Ｄ（＋）−Ｇｌｕｃｏｓｅ（和光純薬工業株式会社製）２００ｇＤ．Ｗ． total １０００ｍｌＤ．Ｗ．で１０００ｍｌまでフィルアップし、溶解させ
オートクレーブで高圧滅菌後、冷蔵庫に保存した。

【００３９】（３）最少グルコース寒天培地（minimal-
glucose-agar-medium）Ｂａｃｔｏａｇａｒ（Difco社製）１５ｇを８００ｍ
ｌのＤ．Ｗ．に溶解させ、オートクレーブで高圧滅菌
後、Ｖｏｇｅｌ−Ｂｏｎｎｅｒの最少培地Ｅ（１０倍濃
度）を１００ｍｌ、２０％特級Ｄ（＋）−Ｇｌｕｃｏｓ
ｅ溶液を１００ｍｌ加え、ｔｏｔａｌ１０００ｍｌと
した。滅菌シャーレ（９０×１５ｍｍ）に約１０ｍｌず
つ分注し、冷蔵庫に保存した。糖や寒天は無機塩と混合
して高圧滅菌するとアミノカルボニル反応がおこり、変
異原物質が生成する（矢作多貴江、蛋白質・核酸・酵
素、１１７８頁〜１１８８頁、１９７５年）。

【００４０】（４）Ｌ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｂｉｏｔ
ｉｎｅ溶液０．５ｍＭＬ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ（和光純薬工業株
式会社製）０．５ｍＭ −ｂｉｏｔｉｎｅ（和光純薬工業株式会社
製）上記のモル濃度の溶液を調整した。

【００４１】（５）トップアガーＢａｃｔｏａｇａｒ（和光純薬工業株式会社製）０．８ｇ特級ＮａＣｌ（和光純薬工業株式会社製）０．６ｇＤ．Ｗ．１００ｍｌ上記にＬ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｂｉｏｔｉｎｅ溶液を
１／１０量（１０ｍｌ）加え、オートクレーブで高圧滅
菌後、４５℃で保温して実験に用いた。Ｌ−ｈｉｓｔｉ
ｄｉｎｅ−ｂｉｏｔｉｎｅ溶液はろ過滅菌でもオートク
レーブによる高圧滅菌でも変質の心配はない（Mutation
Res., 103, 133-140, 1982）。

【００４２】（６）Ｓ９ｍｉｘＳ−９（ICN Pharmaceuticals, Inc）１００μｌ特級ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ（和光純薬工業株式会社製）０．４Ｍ２０μｌ特級ＫＣｌ（和光純薬工業株式会社製）１．６５Ｍ２０μｌグルコース−６−リン酸（ナカライテクス株式会社製）０．５Ｍ１０μｌＮＡＤＨ（KOHJIN.,Co.Ltd.社製）０．１Ｍ４０μｌＮＡＤＰＨ（KOHJIN.,Co.Ltd.社製）０．１Ｍ４０μｌＡＴＰ（オリエンタル酵母工業株式会社製）０．１Ｍ５０μｌリン酸バッファー（ｐＨ７．４）０．２Ｍ５００μｌＤ．Ｗ．２２０μｌ total １ｍｌＳ−９は１００μｌずつエッペンドルフチューブに分注
し、超冷凍（−８０℃）保存した。特級ＭｇＣｌ₂・６
Ｈ₂Ｏ、特級ＫＣｌは調製後高圧滅菌して常温に保存
し、グルコース−６−リン酸、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨは
調製後ミリポアフィルターでろ過滅菌して冷蔵保存し
た。またＳ−９ｍｉｘは操作直前に調製した。

【００４３】（菌株の保存、前培養）（１）前培養用ブロス培地Ｎｕｔｒｉｅｎｔｂｒｏｔｈ（Difco社製）８．０ｇ特級ＮａＣｌ（和光純薬工業株式会社製）５．０ｇＤ．Ｗ．１０００ｍｌ溶解させオートクレーブで高圧滅菌後、５０ｍｌ用ファ
ルコンチューブに２０ｍｌずつ分注した。これを前培養
ブロス培地とした。

【００４４】（２）菌株の培養前培養ブロス培地２０ｍｌを５０ｍｌ用三角フラスコに
無菌的に加え、それに超冷凍（−８０℃）保存したヒス
チジン要求生株（Ｈｉｓ^-）ＴＡ９８を白金耳で掻きと
り接種した。菌株は紫外線に対して感受性が高いためフ
ラスコをアルミホイルで覆い、３７℃で振とう培養（６
０〜７０／分）を約１４〜１６時間行った。（３）菌株の保存前培養した菌懸濁液２０ｍｌに対し１．７５ｍｌのＤＭ
ＳＯを加え攪拌し、凍結チューブに０．７ｍｌずつ分注
し、超冷凍（‐８０℃）保存した。

【００４５】（菌株のチェック）Salmonella typhhimur
iumの菌株の性能を調べるために以下の3つのテストを行
った。（１）R因子（Resistant factor）ＴＡ培地前培養ブロス培地３０ｍｌ Bacto agar（Difco製）０．４５ｇオートクレーブで高圧滅菌後、プレートに１０ｍｌずつ
分注し、ＴＡ培地とした。ＴＡ培地にアンピシリン（８
ｍｇ／ｍｌ）を１０μｌスプレッドし、そこに一白金地
の菌懸濁液をストリークした。３７℃で４８±２時間培
養後のプレートを示した（図２）。アンピシリンを塗っ
たプレート上でもサルモネラ菌が生えてきたことから、
Ｒ因子をもっていることが分かった。

【００４６】（２）rfa特性トップアガー３０ｍｌに３０ｍＭ histidine-1mM biot
ineを１．５ｍｌ加え、さらに菌懸濁液を１．５ｍｌ加
えてよく攪拌した。これを最少グルコース寒天培地に２
ｍｌまいた。寒天が固まった後、ペーパーディスクにク
リスタルバイオレット溶液（２００μｇ／ｍｌ）を５０
μｌ染み込ませプレートの中央において２４時間倒置培
養した（図３）。ペーパーディスクの周りに約１ｃｍの
生育阻止帯が観察された。（３）Ｈｉｓ^-試験試験管に菌懸濁液１００μ加える。それに４５℃に保温
したトップアガー２ｍｌを加え、よく混合して素早く最
少グルコース寒天培地にまいた（図４）。プレートには
５個の自然復帰コロニーが観察された。

【００４７】（バッファー）（１）ＢｕｆｆｅｒＢ特級ＫＣｌ（和光純薬工業株式会社製）１５０ｍＭＮａ₂ＳＯ₄（和光純薬工業株式会社製）１５ｍＭ特級ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ（和光純薬工業株式会社製）１５ｍＭＰＡＰＳ（Sigma社製）９０μＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）１０ｍＭ最終濃度が上記となるように溶液を調整し濾過滅菌後、
１ｍｌずつエッペンドルフチューブに分注し、冷凍保存
（−２０℃）した。

【００４８】（２）ＢｕｆｆｅｒＣＫＣｌ（和光純薬工業株式会社製）１５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）１０ｍＭＡｌｂｕｍｉｎ，Ｂｏｖｉｎｅ（Sigma社製）０．５ｍｇ／ｍｌ最終濃度が上記となるように溶液を調整し、濾過滅菌
後、冷蔵保存した（EuropeanJournal of Pharmacolog
y., 293, 173-181, 1995）。

【００４９】（リコンビナント酵素（ＤＨＥＡＳＴ）
の調製）（１）ＤＨＥＡＳＴ粗酵素ＤＨＥＡＳＴ−pGEX-2TKが導入された大腸菌ＢＬ２１
（Epicurian coli BL21 competent cell）をプレートか
ら爪楊枝で掻き取り、ＬＢ培地（アンピシリン最終濃度
５０μｇ／ｍｌ入り）１ｍｌで３〜５時間、３７℃で培
養した。その後薗培養液を１００ｍｌＬＢ培地（アン
ピシリン最終濃度５０μｇ／ｍｌ）に加え、３７℃で
１．５〜２時間培養した。その後、誘導物質ＩＰＴＧを
１００μｌ加え、９〜１０時間、２５℃で誘導した。菌
懸濁液をファルコンチューブに移し、超遠心機（スウィ
ングローター）で３，０００ｒｐｍ、１０分遠心した。
その後上清を捨て、沈殿した菌体にＢｕｆｆｅｒＣを約
１５ｍｌ加え、よくｖｏｒｔｅｘし、菌体を完全に溶解
させた。ＢｕｆｆｅｒＣに溶解させた菌液１５ｍｌをフ
レンチプレスで１２００ｋｇ／ｃｍ²の圧力をかけ、細
胞破砕した。フレンチプレスは２回行った。その後、細
胞破砕液を超遠心機（アングルローター）で４℃、１
０，０００ｒｐｍ、２０分遠心を２回行い、未破砕細
胞、細胞膜などを沈殿させ、その上清をＤＨＥＡＳＴ
粗酵素とした。

【００５０】（２）ＤＨＥＡＳＴ精製酵素上記の手順で調製したＤＨＥＡＳＴ粗酵素をＬｙｓｉ
ｓＢｕｆｆｅｒ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ
８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ）
約１０ｍｌで平衡化したGlutathion Sepharose^TM48（Am
ersham Pharmacia Biotech社製）５００μｌに加え、約
３０分ローテートし、超遠心機で３，０００ｒｐｍ、１
０分遠心した。沈殿した樹脂にＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅ
ｒ８ｍｌを加え５分間洗浄し、超遠心機で３，０００
ｒｐｍ、１０分遠心を３回繰り返した。次に沈殿した樹
脂をＴｈｒｏｍｂｉｎＢｕｆｆｅｒ（５０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、
２．５ｍＭＣａＣｌ₂）８ｍｌを加え５分間洗浄し、
超遠心機で３，０００ｒｐｍ、１０分遠心を３回繰り返
した。沈殿した樹脂５００μｌにＴｈｒｏｍｂｉｎＢ
ｕｆｆｅｒ１ｍｌを加え、エッペンドルフチューブに
移した。そのうち２０μｌを別のエッペンドルフチュー
ブに取り、サンプル化した（融合タンパク質）。樹脂の
入ったエッペンドルフチューブにＴｈｒｏｍｂｉｎ（Si
gma社製）３μｌを加え、４０〜５０分ローテートし
た。その後遠心機で７０００ｒｐｍ、５分遠心し、上清
を別のエッペンドルフチューブに取り、Ａｐｒｏｔｉｎ
ｉｎ（和光純薬工業株式会社製）５μｌを加えてＴｈｒ
ｏｍｂｉｎの反応を止めた。また、そのうち２０μｌを
別のエッペンドルフチューブに取り、サンプル化した
（精製酵素）。また沈殿した樹脂２０μｌを別のエッペ
ンドルフチューブに取りサンプル化した（ＧＳＴ）。

【００５１】（３）タンパク質濃度の測定ＤＣプロテインスタンダードアッセイ（Bio-Rad社製）
を用いた。反応はＬｏｗｌｙ法（J.Biol.Chem., 193, 2
65, 1951）に基づいている。標準液としてアルブミンを
希釈し（粗酵素の時はＢｕｆｆｅｒＣ、精製酵素の時は
ＴｈｒｏｎｂｉｎＢｕｆｆｅｒで希釈した）、１．
０、０．７５、０．５、０．２５、０．１、０ｍｇ／ｍ
ｌの溶液をつくった。ｒｅａｇｅｎｔＡ１ｍｌにｒ
ｅａｇｅｎｔｓを２０μｌ加え、ｒｅａｇｅｎｔＡ
ｓとした。標準液、またブランクとして試料を希釈した
Ｂｕｆｆｅｒ、試料を２０μｌとり、それにｒｅａｇｅ
ｎｔＡｓ１００μｌを加え、よくｖｏｒｔｅｘし、
その後素早くｒｅａｇｅｎｔＢ８００μｌを加え、
再びよくｖｏｒｔｅｘした後、１５分〜１時間静置し
て、比色計で波長７５０ｎｍにおける吸光度を測定し
た。アルブミン標準溶液のタンパク濃度をもとに検量線
を作成し、試料のタンパク濃度を求めた。

【００５２】［実験方法］（リコンビナント硫酸転移酵素を用いた変異原性試験法
の概略）本発明の、リコンビナント硫酸転移酵素と硫酸
供与体PAPSを用いて前駆変異原物質を硫酸化により代謝
活性化させる変異原試験を、図式的に表示すると、図５
のようになる。この実施例では、変異原物質に、硫酸化
されることで変異原性を示すと報告されている9-Hydrox
ymethylantracene（９ＨＭＡ）を用いた（Biochemical
and Biophysical research communications.,251,239-2
43,1998）。菌株には、既存のエイムス試験で用いられ
ているヒスチジン要求株の特徴を持つSalmonella typhi
murium TA98を用いた。酵素には、human Dehydroepiand
rosterone sulfotranceferase（ｈＤＨＥＡＳＴ）を
用いた。この酵素は大腸菌に組み込んであるものを発現
させ精製したものを用いた。これらを用いて前記図５の
ように実験を行った。菌が復帰するまでの機構を図６に
示す。変異原物質は有機溶媒であるＤＭＳＯに溶かし
た。陽性対照実験として直接変異原物質である4-nitroq
uinoline 1-oxide（４ＮＱＯ）を用いた。

【００５３】（変異原性試験手順の概略）１．S.typhimuriumTA98をＢｒｏｔｈ培地２０ｍｌで３
７℃、１４時間培養する２．試験管を用意しＢｕｆｆｅｒＢ（ＰＡＰＳ１
６．７μＭ）を加える３．６０μｇ／ｍｌになるように調製した酵素液（Ｂｕ
ｆｆｅｒＣ希釈）を加える４．培養した菌液を１００μｌ加える（ＯＤ₆₆₀＝１．
５）５．９ＨＭＡ（２５０μＭ）を２μｌ加える６．３７℃で２０分incubationし、その間、プレートを
温めておき、あらかじめ作っておいたトップアガーを４
５℃に保温する７．反応後、反応液にトップアガーを２ｍｌ加えよく混
和しプレート（最少グルコース寒天培地）にまく９．３７℃で４８±２時間倒置培養し、復帰してきたコ
ロニーをカウントする

【００５４】（変異原性試験法の操作方法）（１）ＤＨＥＡＳＴ粗酵素を組み込んだエイムス法試験管にＤＨＥＡＳＴ粗酵素（ＢｕｆｆｅｒＣで希
釈）液を６０μｌ、ＢｕｆｆｅｒＢ（ＰＡＰＳ入り）
を４２μｌ、菌縣濁液を１００μｌの順に加えた。最後
に9-hydroxymethylanthraceneを２μｌ加え（最終濃度
２４０μＭ）、３７℃、２０分間水浴中で振とう培養
（６０〜７０／分）した。試験管に４５℃に保温したト
ップアガー２ｍｌを試験管に加え、反応液と混和後、素
早く最少グルコース寒天培地に重層した。トップアガー
が固まった後、３７℃、４８±２時間倒置培養し、復帰
突然変異コロニー数を数えた。実験はコントロール（Ｂ
〜Ｆ）も含め、下（表１）のＡ〜Ｆの系で行った。また
全ての実験は５連で行った。

【００５５】

【表１】

【００５６】ＤＨＥＡＳＴ粗酵素（１０ｍｇ／ｍｌ）
はＢｕｆｆｅｒＣで希釈を行い、１０、５、２、１、
０．６、０．３、０ｍｇ／ｍｌＢｕｆｆｅｒＣになる
ように調整した。最終的に、ＤＨＥＡＳＴ粗酵素の反
応液中（total volume ２０４μｌ）の最終濃度がそれ
ぞれ２．９、１．５、０．６、０．３、０．２、０．１
ｍｇ／ｍｌとなった。

【００５７】（２）ＤＨＥＡＳＴ精製酵素を組み込ん
だエイムス法試験管にＤＨＥＡＳＴ精製酵素（ＢｕｆｆｅｒＣで
希釈）液を６０μｌ、ＢｕｆｆｅｒＢ（ＰＡＰＳ入
り）を４２μｌ、菌縣濁液を１００μｌの順に加えた。
最後に9-hydroxymethylanthraceneを２μｌ加え（最終
濃度２４０μＭ）、３７℃、２０分間水浴中で振とう培
養（６０〜７０／分）した。試験管に４５℃に保温した
トップアガー２ｍｌを試験管に加え、反応液と混和後、
素早く最少グルコース寒天培地に重層した。トップアガ
ーが固まった後、３７℃、４８±２時間倒置培養し、復
帰突然変異コロニー数を数えた。実験はコントロール
（Ｂ〜Ｅ）も含め、下（表２）のＡ〜Ｅの系で行った。
また全ての実験は５連で行った。

【００５８】

【表２】

【００５９】ＤＨＥＡＳＴ精製酵素（０．１９８６ｍ
ｇ／ｍｌ）はＢｕｆｆｅｒＣで希釈を行い、４０、２
０、１０、５、０μｇ／ｍｌＢｕｆｆｅｒＣになる
ように調整した。最終的にＤＨＥＡＳＴ粗酵素の反応
液中（total volume ２０４μｌ）の最終濃度がそれぞ
れ１１．８、５．９、２．９、１．５、０μｇ／ｍｌと
なった。

【００６０】（３）自然復帰突然変異自然復帰コロニーを調べるために、菌懸濁液100μlのみ
にトップアガーを加え、最少グルコース寒天培地に重層
した。この系は、毎回コントロールとして実験を行っ
た。

【００６１】（４）陽性対照試験陽性対照（ポジティブ・コントロール）試験として４Ｎ
ＱＯを用いた。陽性対照試験とはある物質について行わ
れた変異原性試験の結果が適正な菌かどうか、また、適
切に実施されたかどうかを評価するために立てるコント
ロールのことである。４ＮＱＯは１０ｍｇ／ｍｌとなる
ようにＤＭＳＯで調整し、これを菌懸濁液１００μｌに
対し２０μｌ加え、０．２μｇ／ｐｌａｔｅとなるよう
にした。

【００６２】［実験結果］（ＤＨＥＡＳＴ粗酵素を組み込んだエイムス法の結
果）ＤＨＥＡＳＴ粗酵素濃度依存的に復帰突然変異コ
ロニー数の増加が見られた（実験系Ａ）。これに対し実
験系Ｂの硫酸供与体ＰＡＰＳなしにおいては復帰突然変
異のコロニー数の増加は見られなかった（図７、表
３）。また、粗酵素を加えなかった系（実験系Ｃ）、菌
に9-hydroxymethylanthraceneのみを作用させた系（実
験系D）では、復帰突然変異コロニー数とほぼかわらな
かった（表４，５，６）。

【００６３】

【表３】

【００６４】

【表４】

【００６５】

【表５】

【００６６】

【表６】

【００６７】（ＤＨＥＡＳＴの精製）精製したＤＨＥ
ＡＳＴをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した（図８）。サン
プルとして、融合タンパク質（Lane 2）、ＤＨＥＡＳ
Ｔ（Lane 3）、ＧＳＴ（Lane 4）を泳動した。またprot
ein marker（Lane 1）を同時に泳動した。結果約３３Ｋ
Ｄａ付近にＤＨＥＡＳＴのバンドがでた。また同時に
精製酵素のタンパク濃度を測定した結果、約０．２ｍｇ
／ｍｌであった。

【００６８】（ＤＨＥＡＳＴ精製酵素を組み込んだエ
イムス法の結果）ＤＨＥＡＳＴ精製酵素濃度依存的に
復帰突然変異コロニー数の増加が見られた（実験系
Ａ）。これに対し実験系Ｂの硫酸供与体ＰＡＰＳなしに
おいては復帰突然変異のコロニー数の増加は見られなか
った（図９、表７）。また、精製酵素を加えなかった系
（実験系Ｃ）、菌に9-hydroxymethylanthraceneのみを
作用させた系（実験系Ｄ）では、復帰突然変異コロニー
数とほぼかわらなかった（表８、９、１０）。

【００６９】

【表７】

【００７０】

【表８】

【００７１】

【表９】

【００７２】

【表１０】

【００７３】［評価］本実施例の実験結果より、硫酸供
与体ＰＡＰＳを加えない系においては復帰突然変異のコ
ロニー数の増加は見られなかったのに対し、ＤＨＥＡ
ＳＴ粗酵素または精製酵素濃度依存的に復帰突然変異コ
ロニー数が増加した。また9-hydroxymethylanthracene
のみを菌に作用させた系では、自然復帰突然変異コロニ
ー数とほぼ同じであったことより、9-hydroxymethylant
hracene自体の変異原性は認められないといえる。これ
らのことより言えることはＤＨＥＡＳＴ濃度依存的に
9-hydroxymethylanthraceneの硫酸体が生成し、その硫
酸体が変異原性を持つと考えられる。このことは9-hydr
oxymethylanthraceneが硫酸化により代謝活性化される
ということが確認できた。この実験により、硫酸化を組
み込んだエイムス法を樹立することができた。

【００７４】実施例２本発明変異原性試験法を用いた
緑茶カテキン類の抗変異原作用の確認発ガン過程は一般
的に、遺伝子の損傷過程であるイニシエーション、異常
増殖に伴う腫瘍の顕在化過程であるプロモーション、そ
して腫瘍の転移、浸潤を招く悪性化過程のプログレッシ
ョンと大きく３段階を経ると考えられている。Ａｍｅｓ
試験では、イニシエーション段階に限り試験できる。変
異原物質によって受ける変異はイニシエーション段階で
あり、食品機能性成分である緑茶カテキン類などの抗変
異原物質による抗変異原作用は変異原不活化因子として
働いていると考えられる。現在、植物性成分であるフラ
ボノイド(flavonoids)の研究が多く行われている。植物
性成分は大きく１０群に分けられ（表１１）、酸素複素
環化合物(oxygen heterocyclic compounds)にフラボノ
イドは分類される。本実験ではフラボノイドにも多く種
類がある中で、食品機能性成分である緑茶カテキン類を
用いて新規変異原試験法において抗変異原性が確認され
るか、またその作用機構を解明する目的で行った。今回
使用した全８種類のカテキン構造を下記化学式４に示
す。

【００７５】

【表１１】

【００７６】

【化４】

【００７７】［実験］実験１緑茶成分であるカテキン
類を用いた新規変異原試験法による抗変異原性の確認（方法）実施例１の変異原試験法において、試験物質と
して、それぞれのカテキン類（終濃度５００μＭ）を加
え、以下同様に行った。尚、ＥＣＧが非常に水に溶けに
くいため若干の有機溶媒ＧＭＳＯと滅菌水で他のカテキ
ン類も同様に溶かした。ＧＭＳＯ含量は予備実験として
行った結果、反応液中の２％を越えるとデータがばらつ
くため２％になるように調製した。硫酸転移酵素、ＰＡ
ＰＳ、変異原物質濃度はそれぞれ「変異原試験法」に記
載したとおりである。コントロールとして、抗変異原物
質を加えない系を行った。実験は５連で行った。

【００７８】（結果）結果を、図１０に示す。実験か
ら、硫酸化という第２相反応を考慮した変異原試験法で
新規となる抗変異原性が確認された。結果から、ｇａｌ
ｌｉｃａｃｉｄ（没食子酸）を持つＧＣＧ、ＥＣＧ、Ｅ
ＧＣＧが最も強い抗変異原活性を示した。実験は、３連
で４回、５連で２回行っており、いずれも同じような傾
向が確認された。図１１は、新規変異原試験における緑
茶カテキン類の新規抗変異原作用を示す写真である。図
１１−Ａの写真は、ｃｏｎｔｒｏｌとして抗変異原物質
を加えなかった時のもので、図１１−Ｂの写真は、緑茶
カテキンであるＥＧＣＧ（５００μＭ）を加えた時のも
のである。明らかに復帰コロニーの数が違い、強く抗変
異原性を示しているのが分かる。

【００７９】実験２カテキン類の抗変異原作用機構の
解明この実験では、カテキン類の抗変異原作用機構の解明を
行う。まずいくつかその作用機構が考えられる中で、前
駆物質の硫酸化阻害の可能性を探る。（方法）この実験
では変異原試験法は用いず、ＰＡＰＳの硫酸基を³⁵Ｓに
放射ラベルしたＰＡＰ³⁵Ｓを用いてRadio isotope cent
erで硫酸化を行った。組成は次の通りである。 Tris-HCl Buffer（ｐＨ７．５）５０ｍＭＤＨＥＡＳＴ８．３２μｇ／ｍｌＤＨＥＡ１．０μＭＰＡＰ³⁵Ｓ０．２μＭカテキン類２００μＭ基質にＤＨＥＡを用いた。変異原試験のように９ＨＭＡ
を用いたかったがその硫酸体が不安定なためかスポット
が検出されなかったため、ＤＨＥＡを用いた。これらの
反応液を３７℃、４０分反応させ、セルロースプレート
に１．５μｌずつスポットした。展開溶媒（ブタノー
ル：プロパノール：ギ酸：水＝３：１：１：１）で展開
後、イメージングプレートに６時間以上はり、ＦＬＡ３
０００で解析を行った。結果は比活性（ｐｍｏｌ／ｍｉ
ｎ／ｍｇ）で表してある。

【００８０】（結果）結果を図１２に示す。結果から分
かるようにｇａｌｌｉｃａｃｉｄ（没食子酸）を持
つ、ＣＧ、ＧＣＧ、ＥＣＧ、ＥＧＣＧが非常に強く硫酸
化を阻害しているのが確認される。実験３による緑茶カ
テキン類による抗変異原性と本実験の硫酸化阻害傾向が
似ているため、新規抗変異原性作用は前駆変異原性物質
の硫酸化による活性化の段階を阻害している可能性が示
唆された。

【００８１】実験３新規抗変異原性作用機構の確認新規抗変異原性作用機構で前駆変異原物質を硫酸化して
活性化する段階を阻害している可能性をさらに裏付ける
ために次の実験を行った。（方法）変異原試験法にプレインキュベーション法とい
われる方法がある。この実験の場合、前駆変異原物質の
硫酸化反応を行った後で菌液を加えるという方法を行っ
た。この方法を用いて、表１２の様に実験を行った。
尚、硫酸転移酵素、ＰＡＰＳ、変異原物質濃度は「変異
原試験法」で記載したとおり一定濃度で行った。

【００８２】

【表１２】

【００８３】（結果）プレインキュベーション法による
緑茶カテキン類の抗変異原作用の結果を、図１３に示
す。ＡとＣを比べると、ＥＧＣＧが抗変異原性を示した
ことが分かる。Ｃは自然復帰と考える。ＡとＢを比べる
と、先に述べたように９ＨＭＡの硫酸体が不安定なせい
かどうかはわからないが、菌を後から加えると非常に効
率が悪く、復帰コロニーが減少する。ＤとＥを比べる
と、ＤはＥＧＣＧを加えて反応を行い、ＥはＥＧＣＧを
後から加えている。その結果、ＥはＥＧＣＧを加えてい
るにもかかわらず、加えていないＢの復帰コロニーの数
と変わらなかった。つまりこれらの結果からまとめると
ＥＧＣＧを一緒に加えて反応させると自然復帰程度で、
後から加えると、加えてなくても同じ結果になるという
ことから、緑茶カテキン類の新規抗変異原作用が前駆変
異原物質の硫酸化による活性化の段階で作用している可
能性が強く示唆された。

【００８４】実験４第１相反応による代謝活性化の確
認９ＨＭＡが報告通りに硫酸化によって代謝活性化してい
ることは確認したが、第１相反応によっては代謝活性化
されないことを確認する。それは既存のＡｍｅｓ試験で
は認められなかった化合物が、新規変異原試験法によっ
て陽性反応を示したということになる。（方法）第１相反応を行うシトクロムＰ４５０酵素群を
多く含むラット肝臓遠沈上清画分であるＳ９を酵素に用
いる。基質に９ＨＭＡを終濃度２．５ｍＭ〜０．０２５
ｍＭを用いた。試験法は「変異原試験法」の酵素がＳ９
に代わりそれを１００μｌ添加した。ＰＡＰＳは加える
ものと、加えないものとを行った。

【００８５】（結果）Ｓ９を用いたＰＡＰＳ有無による
代謝活性化の状況を図１４に示す。９ＨＭＡ濃度が０．
５〜０．２５ｍＭ付近で自然復帰よりもやや多い復帰コ
ロニーが見られた。０．５〜０．２５ｍＭ付近でやや多
い復帰コロニーが確認できた。without ＰＡＰＳにおい
てもやや自然復帰よりもやや多い復帰コロニーが見られ
るのはＳ−９中に含まれるＰＡＰＳの影響だと考えられ
る。ＰＡＰＳを加えるとさらに多くなることから、Ｓ−
９中に含まれる何らかの硫酸転移酵素の影響でやや多い
復帰コロニーが確認されたと推測する。

【００８６】実験５Ｓ９中の硫酸転移酵素の基質の確
認Ｓ９を用いて変異原性が確認されたことから、Ｓ９中の
硫酸転移酵素が何を基質にするかを確認する。（方法）実験２で行ったRadio isotope centerで実験を
行う。表１３に従い、酵素にＳ９を用いて基質にＤＨＥ
Ａとp-nitrophenol（ＰＮＰ）を使用して実施した。ま
た、その反応液にEGCGを加え、硫酸化を阻害しているか
を確認した。

【００８７】

【表１３】

【００８８】（結果）結果を、図１５に示す。ＤＨＥＡ
ならびにＰＮＰ、ＥＧＣＧの硫酸体が確認された。ＥＧ
ＣＧを加えたときでも、硫酸化阻害とＥＧＣＧの硫酸体
が確認された。考察：ＤＨＥＡとＰＮＰの硫酸体が見られたことから何
らかの硫酸転移酵素が含まれていることが分かる。ＤＨ
ＥＡＳＴを用いると確認できなかったＥＧＣＧの硫酸
体も確認できたが、それがある硫酸転移酵素によって直
接硫酸化されたとは一概にはいえない。というのは、Ｓ
９中には知っての通り様々な酵素が含まれているため、
直接硫酸転移酵素の作用を受けず、他の酵素によって反
応が起きた後に、硫酸化反応が起きている可能性も考え
られるからである。しかし次のこともいえる。ラット肝
臓遠沈上清画分Ｓ９という状態ではあるが、少なくとも
他の何らかの酵素の作用を受けたにせよ、結果的には緑
茶成分ＥＧＣＧによってそれらの硫酸化を若干なりとも
阻害する。しかしこのことが必ず、動物体内において成
り立っているかは分からない。前述したように、Ｓ９は
Phenobarbitalと5,6-Benzoflavoneによって誘導がかけ
てあり、それによって発現してきた薬物代謝系の酵素が
働いているからである。

【００８９】［考察］硫酸化という新規変異原試験法を
用いて食品機能性成分である、かつてビタミンPと呼ば
れていたフラボノイドを始めとする物質から、緑茶成分
であるカテキン類を用いてその新規抗変異原性を確認す
ることもできた。その中で最も強い効果を示したのがＥ
ＧＣＧであった。ＥＧＣＧについては様々な報告があ
り、血管内皮細胞の増殖抑制、血管新生の阻害、癌細胞
のテロメラーゼ阻害など広く使用されているフラボノイ
ドである。またカテキン類は動物の血中で存在する比率
において遊離型が多く、生理活性が強い原因の一つでも
ある。このＤＨＥＡＳＴを用いた実験では、前駆変異
原物質が硫酸化によって代謝活性化される段階を阻害し
ている可能性が強く示唆された。また、Ｓ９を用いた実
験においては、カテキン類が結果的に自ら硫酸化される
ことにより基質の硫酸化を阻害している可能性が示唆さ
れた。

【００９０】

【発明の効果】本発明は、安全性試験方法の一つとして
化学物質、医薬、食品、飼料などの分野で遍く利用され
ているエイムス試験のような微生物等を用いた変異原性
試験において、生体内におけるような試験物質の代謝活
性化を付与することにより、簡便で、なおかつ、より確
実な試験方法として利用することを可能とする。したが
って、本発明の変異原性試験法は、安全衛生法、化審
法、薬事法、動物用医薬、飼料添加物、及び農薬取締法
などの安全性規格基準の一つとしての変異原性試験法と
しての利用が期待されるものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明において、変異原性物質による発ガン過
程を模式的に示した図である。

【図２】本発明の実施例において、使用するサルモネラ
変異株のＲ因子の存在を確認したテストの結果の写真を
示す図である。

【図３】本発明の実施例において、使用するサルモネラ
変異株のｒｆａ特性の有無を確認したテストの結果の写
真を示す図である。

【図４】本発明の実施例において、使用するサルモネラ
変異株のＨｉｓ^-試験の結果の写真を示す図である。

【図５】本発明の変異原試験法を、概略的に示す図であ
る。

【図６】本発明の変異原試験法の機作を、概略的に示す
図である。

【図７】本発明の実施例において、ＤＨＥＡＳＴ粗酵
素を組み込んだエイムス試験における復帰突然変異コロ
ニーの測定結果を示す図である。

【図８】本発明の実施例において、精製ＤＨＥＡＳＴ
の電気泳動の結果を示す図である。

【図９】本発明の実施例において、ＤＨＥＡＳＴ精製
酵素を組み込んだエイムス試験における復帰突然変異コ
ロニーの測定結果を示す図である。

【図１０】本発明の実施例において、緑茶カテキン類を
用いた新規変異原性試験による抗変異原性の確認結果を
示す図である。

【図１１】本発明の実施例において、緑茶カテキン類の
抗変異原作用の試験結果を示す写真である。

【図１２】本発明の実施例において、緑茶カテキン類の
硫酸化阻害活性の試験結果を示す図である。

【図１３】本発明の実施例において、プレインキュベー
ション法による緑茶カテキン類の抗変異原作用の試験結
果を示す図である。

【図１４】本発明の実施例において、Ｓ９を用いたＰＡ
ＰＳ有無による代謝活性化の測定結果を示す図である。

【図１５】本発明の実施例において、Ｓ９中の硫酸転移
酵素が利用する基質についての試験における硫酸化の状
況を示す薄層クロマトグラムの結果を示す図である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１４年４月２日（２００２．４．２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正内容】

【書類名】明細書

【発明の名称】新規変異原性試験法

【特許請求の範囲】

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【０００２】

【００１３】

【００１４】

【００２３】

【００２５】

【化１】

【００３１】

【００３２】実施例１リコンビナント硫酸転移酵素を
用いた本発明の変異原性試験法の検討［実験材料］（変異原性物質）多くの変異原物質は一般に脂溶性であ
るため有機溶媒であるＤＭＳＯ（和光純薬工業株式会
社）に溶解させた。この実施例では、試験変異原性物質
として9-hydroxymetylanthracene（Fluka Chemika社
製）を用いた。9-hydroxymethylanthracene は環境中で
見いだされており、特に汚泥や魚類などから発見されて
いる。9-hydroxymethylanthraceneは哺乳動物において
次のように代謝をうけると予想される。

【００３３】

【化２】

【００３５】

【化３】

【００３６】（菌株）ヒスチジン要求性突然変異株Salm
onella typhimurium TA98株を用いた。ＴＡ９８株はFra
meshift型突然変異を起こす突然変異誘起物質を検出す
ることができる。ＴＡ９８株はＴＡ１５３８株にＲ因子
をもつ薬剤耐性遺伝子であるプラスミドｐＬＭ１０１を
導入し、検出の感度を高めた改良株である。これらの株
はヒスチジン合成酵素遺伝子の変異のほかに別の二つの
突然変異が加えられて感度がよくなっているため、突然
変異の誘起が高まっている。第一に除去修復のシステム
（uvrB）を欠損しているため、突然変異の誘起が高まっ
ている。第二に細菌の表面構成分子であるリポ多糖類が
欠損している（rfa（deep rough）mutation）ため、比
較的大きな分子も細胞内に透過する（Mutation Researc
h., 113,173-215,1983）。

【００３７】（培地）（１）Ｖｏｇｅｌ−Ｂｏｎｎｅｒの最少培地Ｅ（１０倍濃度）特級ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（和光純薬工業株式会社製）２ｇ特級Ｃｉｔｒｉｃａｃｉｄ（和光純薬工業株式会社製）２０ｇ特級Ｋ₂ＨＰＯ₄（和光純薬工業株式会社製）１００ｇ特級ＮａＮＨ₄ＨＰＯ₄・４Ｈ₂Ｏ（和光純薬工業株式会社製）３５ｇＤ．Ｗ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ total １０００ｍｌＤ．Ｗ．で１０００ｍｌまでフィルアップし、溶解させオートクレーブで高圧滅菌後、冷蔵庫に保存した。

【００３８】（２）２０％特級Ｄ（＋）−Ｇｌｕｃｏｓｅ溶液特級Ｄ（＋）−Ｇｌｕｃｏｓｅ（和光純薬工業株式会社製）２００ｇＤ．Ｗ．＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ total １０００ｍｌＤ．Ｗ．で１０００ｍｌまでフィルアップし、溶解させ
オートクレーブで高圧滅菌後、冷蔵庫に保存した。

【００４２】（６）Ｓ９ｍｉｘＳ−９（ICN Pharmaceuticals, Inc）１００μｌ特級ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ（和光純薬工業株式会社製）０．４Ｍ２０μｌ特級ＫＣｌ（和光純薬工業株式会社製）１．６５Ｍ２０μｌグルコース−６−リン酸（ナカライテクス株式会社製）０．５Ｍ１０μｌＮＡＤＨ（KOHJIN.,Co.Ltd.社製）０．１Ｍ４０μｌＮＡＤＰＨ（KOHJIN.,Co.Ltd.社製）０．１Ｍ４０μｌＡＴＰ（オリエンタル酵母工業株式会社製）０．１Ｍ５０μｌリン酸バッファー（ｐＨ７．４）０．２Ｍ５００μｌＤ．Ｗ．２２０μｌ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ total １ｍｌＳ−９は１００μｌずつエッペンドルフチューブに分注
し、超冷凍（−８０℃）保存した。特級ＭｇＣｌ₂・６
Ｈ₂Ｏ、特級ＫＣｌは調製後高圧滅菌して常温に保存
し、グルコース−６−リン酸、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨは
調製後ミリポアフィルターでろ過滅菌して冷蔵保存し
た。またＳ−９ｍｉｘは操作直前に調製した。

【００４４】（２）菌株の培養前培養ブロス培地２０ｍｌを５０ｍｌ用三角フラスコに
無菌的に加え、それに超冷凍（−８０℃）保存したヒス
チジン要求生株（Ｈｉｓ^-）ＴＡ９８を白金耳で掻きと
り接種した。菌株は紫外線に対して感受性が高いためフ
ラスコをアルミホイルで覆い、３７℃で振とう培養（６
０〜７０／分）を約１４〜１６時間行った。（３）菌株の保存前培養した菌懸濁液２０ｍｌに対し１．７５ｍｌのＤＭ
ＳＯを加え攪拌し、凍結チューブに０．７ｍｌずつ分注
し、超冷凍（−８０℃）保存した。

【００４５】（菌株のチェック）Salmonella typhhimur
iumの菌株の性能を調べるために以下の３つのテストを
行った。（１）Ｒ因子（Resistant factor）ＴＡ培地前培養ブロス培地３０ｍｌ Bacto agar（Difco製）０．４５ｇオートクレーブで高圧滅菌後、プレートに１０ｍｌずつ
分注し、ＴＡ培地とした。ＴＡ培地にアンピシリン（８
ｍｇ／ｍｌ）を１０μｌスプレッドし、そこに一白金地
の菌懸濁液をストリークした。３７℃で４８±２時間培
養後のプレートを示した（図２）。アンピシリンを塗っ
たプレート上でもサルモネラ菌が生えてきたことから、
Ｒ因子をもっていることが分かった。

【００４６】（２）ｒｆａ特性トップアガー３０ｍｌに３０ｍＭ histidine-1mM biot
ineを１．５ｍｌ加え、さらに菌懸濁液を１．５ｍｌ加
えてよく攪拌した。これを最少グルコース寒天培地に２
ｍｌまいた。寒天が固まった後、ペーパーディスクにク
リスタルバイオレット溶液（２００μｇ／ｍｌ）を５０
μｌ染み込ませプレートの中央において２４時間倒置培
養した（図３）。ペーパーディスクの周りに約１ｃｍの
生育阻止帯が観察された。（３）Ｈｉｓ^-試験試験管に菌懸濁液１００μ加える。それに４５℃に保温
したトップアガー２ｍｌを加え、よく混合して素早く最
少グルコース寒天培地にまいた（図４）。プレートには
５個の自然復帰コロニーが観察された。

【００４９】（リコンビナント酵素（ＤＨＥＡＳＴ）の調製）（１）ＤＨＥＡＳＴ粗酵素ＤＨＥＡＳＴ−pGEX-2TKが導入された大腸菌ＢＬ２１
（Epicurian coli BL21 competent cell）をプレートか
ら爪楊枝で掻き取り、ＬＢ培地（アンピシリン最終濃度
５０μｇ／ｍｌ入り）１ｍｌで３〜５時間、３７℃で培
養した。その後薗培養液を１００ｍｌＬＢ培地（アン
ピシリン最終濃度５０μｇ／ｍｌ）に加え、３７℃で
１．５〜２時間培養した。その後、誘導物質ＩＰＴＧを
１００μｌ加え、９〜１０時間、２５℃で誘導した。菌
懸濁液をファルコンチューブに移し、超遠心機（スウィ
ングローター）で３，０００ｒｐｍ、１０分遠心した。
その後上清を捨て、沈殿した菌体にＢｕｆｆｅｒＣを
約１５ｍｌ加え、よくｖｏｒｔｅｘし、菌体を完全に溶
解させた。ＢｕｆｆｅｒＣに溶解させた菌液１５ｍｌ
をフレンチプレスで１２００ｋｇ／ｃｍ²の圧力をか
け、細胞破砕した。フレンチプレスは２回行った。その
後、細胞破砕液を超遠心機（アングルローター）で４
℃、１０，０００ｒｐｍ、２０分遠心を２回行い、未破
砕細胞、細胞膜などを沈殿させ、その上清をＤＨＥＡＳ
Ｔ粗酵素とした。

【００５５】

【表１】

【００５８】

【表２】

【００６０】（３）自然復帰突然変異自然復帰コロニーを調べるために、菌懸濁液１００μl
のみにトップアガーを加え、最少グルコース寒天培地に
重層した。この系は、毎回コントロールとして実験を行
った。

【００６２】［実験結果］（ＤＨＥＡＳＴ粗酵素を組み込んだエイムス法の結
果）ＤＨＥＡＳＴ粗酵素濃度依存的に復帰突然変異コ
ロニー数の増加が見られた（実験系Ａ）。これに対し実
験系Ｂの硫酸供与体ＰＡＰＳなしにおいては復帰突然変
異のコロニー数の増加は見られなかった（図７、表
３）。また、粗酵素を加えなかった系（実験系Ｃ）、菌
に9-hydroxymethylanthraceneのみを作用させた系（実
験系Ｄ）では、復帰突然変異コロニー数とほぼかわらな
かった（表４，５，６）。

【００６３】

【表３】

【００６４】

【表４】

【００６５】

【表５】

【００６６】

【表６】

【００６９】

【表７】

【００７０】

【表８】

【００７１】

【表９】

【００７２】

【表１０】

【００７５】

【表１１】

【００７６】

【化４】

【００７７】［実験］実験１緑茶成分であるカテキン類を用いた新規変異原
試験法による抗変異原性の確認（方法）実施例１の変異原試験法において、試験物質と
して、それぞれのカテキン類（終濃度５００μＭ）を加
え、以下同様に行った。尚、ＥＣＧが非常に水に溶けに
くいため若干の有機溶媒ＧＭＳＯと滅菌水で他のカテキ
ン類も同様に溶かした。ＧＭＳＯ含量は予備実験として
行った結果、反応液中の２％を越えるとデータがばらつ
くため２％になるように調製した。硫酸転移酵素、ＰＡ
ＰＳ、変異原物質濃度はそれぞれ「変異原試験法」に記
載したとおりである。コントロールとして、抗変異原物
質を加えない系を行った。実験は５連で行った。

【００８１】実験３新規抗変異原性作用機構の確認新規抗変異原性作用機構で前駆変異原物質を硫酸化して
活性化する段階を阻害している可能性をさらに裏付ける
ために次の実験を行った。（方法）変異原試験法にプレ
インキュベーション法といわれる方法がある。この実験
の場合、前駆変異原物質の硫酸化反応を行った後で菌液
を加えるという方法を行った。この方法を用いて、表１
２の様に実験を行った。尚、硫酸転移酵素、ＰＡＰＳ、
変異原物質濃度は「変異原試験法」で記載したとおり一
定濃度で行った。

【００８２】

【表１２】

【００８７】

【表１３】

【００８９】［考察］硫酸化という新規変異原試験法を
用いて食品機能性成分である、かつてビタミンＰと呼ば
れていたフラボノイドを始めとする物質から、緑茶成分
であるカテキン類を用いてその新規抗変異原性を確認す
ることもできた。その中で最も強い効果を示したのがＥ
ＧＣＧであった。ＥＧＣＧについては様々な報告があ
り、血管内皮細胞の増殖抑制、血管新生の阻害、癌細胞
のテロメラーゼ阻害など広く使用されているフラボノイ
ドである。またカテキン類は動物の血中で存在する比率
において遊離型が多く、生理活性が強い原因の一つでも
ある。このＤＨＥＡＳＴを用いた実験では、前駆変異
原物質が硫酸化によって代謝活性化される段階を阻害し
ている可能性が強く示唆された。また、Ｓ９を用いた実
験においては、カテキン類が結果的に自ら硫酸化される
ことにより基質の硫酸化を阻害している可能性が示唆さ
れた。

【００９０】

【図面の簡単な説明】

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試験物質の突然変異原性を検出及び／又
は測定する変異原性試験において、試験物質を硫酸化反
応処理することによって、試験物質を代謝活性化するこ
とを特徴とする変異原性試験法。
【請求項２】試験物質の硫酸化反応処理を、活性硫酸
ＰＡＰＳを硫酸基供与体として、硫酸転移酵素の触媒作
用によって行うことを特徴とする請求項１記載の変異原
性試験法。
【請求項３】硫酸転移酵素として、リコンビナント硫
酸転移酵素を用いることを特徴とする請求項１又は２記
載の変異原性試験法。
【請求項４】試験物質の代謝活性化を、動物の肝臓ホ
モジネートＳ９画分に補酵素類を加えたＳ９ｍｉｘによ
る代謝活性化と併合して行うことを特徴とする請求項１
〜３のいずれか記載の変異原性試験法。
【請求項５】試験物質の突然変異原性を検出及び／又
は測定する変異原性試験が、微生物変異株を用いた試験
であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の
変異原性試験法。
【請求項６】微生物変異株が、サルモネラ菌変異株で
あることを特徴とする請求項５記載の変異原性試験法。
【請求項７】サルモネラ菌変異株を用いた試験が、ヒ
スチジン要求性株を用いたエイムス試験であることを特
徴とする請求項６記載の変異原性試験法。
【請求項８】活性硫酸ＰＡＰＳ及び硫酸転移酵素を具
備することを特徴とする請求項１〜７記載の変異原性試
験法に用いるためのキット。