JP2021529511A - 腸内細菌科の細菌を用いてアルコール類およびアミン類を酵素によりスルフリル化する方法 - Google Patents
腸内細菌科の細菌を用いてアルコール類およびアミン類を酵素によりスルフリル化する方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
(i)腸内細菌科に属する細菌を含む培地中で、前記基質と3’−ホスホアデノシン−5’−ホスホ硫酸とを反応させて、前記基質の硫酸化誘導体を生成することと、
(ii)前記培地から前記硫酸化誘導体を回収することと、
を含み、
この細菌は、
(A)少なくとも、スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を産生し、かつ、
(B)aphA遺伝子またはcysQ遺伝子の発現を減弱させる
ように改変されている。
(i)腸内細菌科に属する細菌を含む培地中で、上記基質と3’−ホスホアデノシン−5’−ホスホ硫酸とを反応させて、上記基質の硫酸化誘導体を生成することと、
(ii)上記培地から上記硫酸化誘導体を回収することと、
を含み、
この細菌は、
(A)少なくとも、スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を産生し、かつ、
(B)aphA遺伝子またはcysQ遺伝子の発現を減弱させる
ように改変されている。
本明細書に記載の方法において使用できる細菌は、少なくとも、スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を産生するように改変されている、腸内細菌科に属する細菌でありうる。ヘパロサンN−硫酸−グルクロン酸−5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質、および/または、3’−ホスホアデノシン−5’−ホスホ硫酸−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を産生するように、細菌をさらに改変してもよい。また、本明細書に記載の方法において使用できる細菌は、aphA遺伝子、cysQ遺伝子、もしくはcpdB遺伝子、またはこれらの組み合わせの発現を減弱させるように改変されている。
本明細書に記載するように基質を酵素によりスルフリル化する方法は、腸内細菌科に属する細菌を含む培地中で基質をPAPSと反応させて、基質の硫酸化誘導体(標的化合物と称することもできる)を生成し、培地から硫酸化誘導体を回収するステップを含む。上記方法は、標的化合物を所望の純度で得ることができるように培地から硫酸化誘導体を精製するステップと、および/または他の必要なステップとを、任意で含んでもよい。
PAPとPAPSの安定性について、大腸菌K−12株Origami(登録商標)2(ΔptrA ΔhslU)の粗細胞ライセートにおいて検討した。大腸菌K−12株Origami(登録商標)2は、aphA、cysQ、およびcpdB遺伝子から選択された、ホスファターゼをコードする1つ以上の遺伝子を欠失するようにさらに改変されている。細胞内で合成または産生されるタンパク質の酵素活性は、タンパク質のジスルフィド結合の適切な形成に影響されうることが知られている(例えば、Ke N.およびBerkmen M.,Production of disulfide−bonded proteins in Escherichia coli,Curr.Protoc.Mol.Biol.,2014,108:16.1B.1−21参照)。したがって、遺伝子型Δ(ara−leu)7697 ΔlacX74 ΔphoA PvuII phoR araD139 ahpC galE galK rpsL F’[lac+ lacIq pro] gor522::Tn10 trxB(StrR,TetR)を有する大腸菌K−12株Origami(登録商標)2(Merck社、カタログ番号71344−3)を、スルホトランスフェラーゼおよびヘパロサン−N−硫酸−グルクロン酸−5−エピメラーゼを生成するために選択した。上記株は、チオレドキシンレダクターゼ(trxB)およびグルタチオンレダクターゼ(gor)をコードする遺伝子に変異を有しており、これによって、大腸菌細胞質におけるジスルフィド結合の形成がかなり向上する。
大腸菌K−12株Origami(登録商標)2の染色体において、ptrA、hslU、cysQ、cpdB、およびaphA遺伝子を、一つずつ欠失した。インフレーム遺伝子欠失法(Dual−In/Out法としても知られている)を用いた(Minaeva N.I.ら,BMC Biotechnol.,2008,8:63)。表1に、構築したΔ2−5株を示す。
各Δ2−5株を、50mL試験管内で、37℃で一晩(約16時間)、10mLのLB培地(Sambrook,J.およびRussell,D.W.「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2001年)において増殖させた。その後、細胞を、遠心分離(5000rpm)によって収集し、0.3mLの緩衝液A(100mM、Tris−HCl、pH7.5、10%(v/v)グリセロール)に再懸濁し、超音波処理によって破砕した。不溶性細胞成分の画分を遠心分離(13000rpm)によって沈殿させた。粗細胞ライセート(いわゆる上清)の可溶性画分を新しいバイアルに移し、PAPおよびPAPSの安定性をPAP(S)の安定性アッセイで検討するのに使用した。
各反応混合物(100μL)は、pH7.0の50mMのMES(2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸)と、1mmのMgCl2と、1%(v/v)のTriton X−100と、0.4mg/mLのPAPまたはPAPSとを含んでいた。粗細胞ライセートの可溶性画分(実施例1.3)を、反応混合物中のタンパク質終濃度が2.5mg/mLになるまで添加した。対照として、ライセートの代わりに水を使用した。各反応混合物を、30℃で、表2および表3に示す時間、培養し、その後、HPLC法を用いて分析した。HPLC解析の条件は以下のとおりとした。
装置:Alliance Waters
カラム:TSK GEL DEAE−5PW 2×75mm、10μm
検出:UV検出器(デュアル吸光検出器)を用いて、NSおよびNS2Sに対しては235nmで、PAPおよびPAPSに対しては254nmで検出。NSは、α−ΔUA−[1→4]−GlcNSを意味し、NS2Sは、α−ΔUA−2S−[1→4]−GlcNSを意味する。ΔUAは、4−デオキシ−L−スレオ−ヘキシ−4−エノピラノシルウロン酸(4−deoxy−L−threo−hex−4−enopyranosyluronic acid)を意味し、GlcNSは、N−スルホ−D−グルコサミンを意味する。
溶出液のグラジエント:30分−0%Bに対して、0分−0%B、15分−5%B、20分−30%B、30分−100%B。このとき、溶出緩衝液Aは、2.56mMのNaH2PO4(pH3.0、H3PO4で調節)、5%アセトニトリルであり、溶出緩衝液Bは、2.56mMのNaH2PO4(pH3.0、H3PO4で調節)、0.5MのLiCl2である。
温度:40℃
溶出速度:0.2mL/分
注入量:10μL
注入時間:50分
圧力:140〜160psi
較正試料:1〜200mg/L
検出限界:0.005mg/L
溶出時間:PAP(19.42分)、NS(21.94分)、PAPS(26.02分)、NS2S(28.91分)
スルホ基のドナーとしてのPAPSと、ヘパロサン硫酸2−O−スルホトランスフェラーゼ(HS 2−OST)およびヘパロサン−N−硫酸−グルクロン酸−5−エピメラーゼ(HNSG−5epi)を産生することができるΔ2−5株の粗細胞ライセートとを用いて、低分子量ヘパロサンN−硫酸塩(「LMWHS」と略称する)の酵素によるスルフリル化を行った。
2.1.1.pMAL*ベクターの構築
pMAL−c2Xベクター(New England BioLabs社、カタログ番号E8000S)を改変して、ペプチドリンカーS3N10LGIEGRISEFGSをコードするDNA断片を、MBPタンパク質のC末端をコードするDNA断片で置換した。このとき、359位にあるグルタミン酸残基をアラニン残基で置換(E359A)し、362位にあるリジン残基をアラニン残基で置換(K362A)し、363位にあるアスパラギン酸残基をアラニン残基で置換(D363A)する(Rob J. C.ら,Crystallization of a trimeric human T cell leukemia virus type 1 gp21 ectodomain fragment as a chimera with maltose−binding protein,Prot.Science,1998,7:1612−1619)。さらに、制限酵素部位HindIII−BamHI−SacI−XhoI−NotIをベクターに導入した。
配列番号10のアミノ酸配列を有する変異HS 2−OSTをコードするコード配列(CDS)を保持するDNA断片(配列番号9)を、GeneArt(登録商標)カスタムDNA合成(Thermo Fisher Scientific社)によって化学的に合成した。ここにおいて、上記アミノ酸配列は、オナガキヌゲネズミ(Cricetulus longicaudatus)(UniProtKB、アクセッション番号O0889.1)に固有のHS 2−OSTにおいて、69位にあるアスパラギン酸残基(D69)から356位にあるアスパラギン残基(N356)までのポリペプチドに対応する。また、94位にあるチロシン残基は、アラニン残基で置換(Y94A)されている。このDNA断片を、制限酵素NotIおよびXhoIを用いて消化し、pMAL*/NotI−XhoIベクター(実施例2.1.1)にクローニングした。このようにして、pMAL*−2OSTY94A(D69−N356)プラスミドを構築した。
pMAL*−2OST(D69−N356)プラスミドの3.6−kbp FspI−HindIII DNA断片を、pACYC184クローニングベクター(GenBank/EMBL、アクセッション番号X06403)のEcoRV/HindIII制限酵素部位にサブクローニングした。このようにして、pACYC184−MBP*−2OSTY94A(D69−N356)プラスミドを構築した。
pETite(商標)N−His SUMO Kan Vector(Lucigen Corporation社、2905 Parmenter St,Middleton、WI53562 USA)由来のN末端タグ6xHis−SUMOペプチド(配列番号12)をコードするDNA断片(配列番号11)を、GeneArt(登録商標)カスタムDNA合成(Thermo Fisher Scientific社)によって化学的に合成した。ここにおいて、上記ペプチドは、配列番号13のアミノ酸配列を有するHNSG−5epiの(G70−N585)断片と融合しており、上記アミノ酸配列は、ダニオレリオ(Danio rerio)(NCBI Reference Sequence:NP_998014.1)に固有のHNSG−5epiにおいて、70位にあるグリシン残基(G70)から585位にあるアスパラギン残基(N585)までのポリペプチドに対応する。このDNA断片を、制限酵素NdeIおよびXhoIを用いて消化し、pMAL*/NdeI−XhoIベクター(実施例2.1.1)にクローニングした。このようにして、pSUMO−dreGlce(G70−N585)プラスミドを構築した。
pACYC184−MBP*−2OSTY94A(D69−N356)およびpSUMO−dreGlce(G70−N585)プラスミドを、標準エレクトロポレーション手順(0.1cmキュベット(Bio−Rad社)、電圧2kV、時間5μ秒)を用いて、Δ2−5株に導入した。まず、pSUMO−dreGlce(G70−N585)プラスミドを導入して、Δ2−5/pSUMO−dreGlce(G70−N585)株を構築した。その後、pACYC184−MBP*−2OSTY94A(D69−N356)プラスミドをΔ2−5/pSUMO−dreGlce(G70−N585)株に導入して、2つのプラスミドを保持する標的Δ2−5株を構築した。pACYC184−MBP*−2OSTY94A(D69−N356)およびpSUMO−dreGlce(G70−N585)プラスミドを保持するΔ2−5株を、Δ2−5/pSUMO/pACYC184株と称した。
アンピシリン(200mg/L)とクロラムフェニコール(30mg/L)とを含むLBブロスで一晩増殖させた、pACYC184−MBP*−2OSTY94A(D69−N356)およびpSUMO−dreGlce(G70−N585)プラスミドを保持するΔ2−5株の細胞培養液各1.25mLを、フラスコ内で、アンピシリン(150mg/L)およびクロラムフェニコール(30mg/L)を含むLBブロス50mLに接種し、その後、37℃で培養してOD600約0.8に到達させた。その後、終濃度0.5mMに達するまでIPTG(イソプロピル−β−D−1−チオガラクトピラノシド)を添加して、HS 2−OSTとHNSG−5epiの合成を誘導した。20℃で48時間、培養を行った。
LMWHSの2−Oスルフリル化を、pH7の50mMのMESと、1mMのMgCl2と、1%(v/v)のTriton X−100と、1mMのCaCl2と、1.2mMのPAPSと、1mg/mLのLMWHS(参考例)と、83μLの粗細胞ライセートの可溶性画分(実施例2.4)とを含む、総量100μLの反応混合物において実施した。ネガティブ(コントロール)反応は、水で置換されたライセートを除いて、上記成分を含んでいた。反応混合物を30℃で48時間培養した。その後、反応混合物の一部をヘパリナーゼI、II、およびIIIで処理した(New England BioLabs社、カタログ番号P0735S、PO736S、P0737S)。総量100μLの反応混合物は、培養後に得られた30μLの反応混合物と、10μLのヘパリナーゼ緩衝液(New England BioLabs社)と、ヘパリナーゼI、II、およびIII(各酵素1μL)と、60μLのH2Oとを含んでいた。反応混合物を、30℃で24時間培養し、その後、二糖類NS (α−ΔUA−[1→4]−GlcNS)およびNS2S(α−ΔUA−2S−[1→4]−GlcNS)の有無と量を分析するためにHPLC法を用いて分析した。HPLC分析の条件は、実施例1.4に記載したとおりであった。
スルホ基のドナーとしてPAPSを用いて、pNPSとアリールスルホトランスフェラーゼとを含むΔ2−5/pSUMO/pACYC184株の粗細胞ライセートにおいて、LMWHSの酵素によるスルフリル化を行った。
まず、ラットに固有のST1A1をコードする遺伝子を保持するpETDuet−N−Tag6xHis−ST1A1プラスミドを構築した。ラット(NCBI参照配列:NP_114022.1)に固有のアリールスルホトランスフェラーゼ1A1(略して「ST1A1」。「Sult1a1」としても知られる)をコードする遺伝子を含むDNA断片(配列番号14)を、GeneArt(登録商標)カスタムDNA合成(Thermo Fisher Scientific社)によって化学的に合成した。得られたDNA断片を、制限酵素EcoRIおよびHindIIIを用いて消化し、pETDuet−1/EcoRI−HindIIIベクター(Novagen)にクローニングした。このようにして、6xHisタグと融合したラットに固有のST1A1をコードする遺伝子を得た。
LMWHSの2−O−スルフリル化を、pH7の50mMのMESと、1mMのMgCl2と、1%(v/v)のTriton X−100と、1mMのCaCl2と、46μMのPAPと、10mMのpNPSと、1mg/mLのLMWHS(参考例)と、4.75μgのST1A1(実施例3.1)と、74μLの粗細胞ライセートの可溶性画分(実施例2.4)とを含む、総量100μLの反応混合物において、実施した。ネガティブ(コントロール)反応は、水で置換されたライセートを除いて、上記成分を含んでいた。反応混合物を30℃で48時間培養した。ヘパリナーゼで反応混合物を処理する際の条件、および得られた混合物をHPLCを用いて分析する際の条件は、実施例2.5に記載した条件と同じであった。
4.1.pPlac−N−Tag6xHis−ST1A1プラスミドの構築
pPlac−N−Tag6xHis−ST1A1プラスミドを構築するために、プライマーP3(配列番号15)およびP4(配列番号16)、ならびに鋳型としてpETDuet−N−Tag6xHis−ST1A1プラスミド(実施例3.1)を用いて、PCRによってDNA断片を得た。得られたDNA断片を、pMAL*プラスミド(実施例2.1.1)のNdeI/HindIII部位に連結した。
pPlac−N−Tag6xHis−ST1A1プラスミドを、標準エレクトロポレーション手順(0.1cmキュベット(Bio−Rad社)、電圧2kV、時間5μ秒)を用いて、Δ2−5株(実施例1.2、表1)に導入した。pPlac−N−Tag6xHis−ST1A1プラスミドを保持するΔ2−5株を、Δ2−5/pST1A1株と称した。
寒天平板上で一晩増殖することによって新たに生成したΔ2−5/pST1A1株の細胞を、初期OD5950.1に達するまで、20mLの試験管内でアンピシリン(200mg/L)を含有する5mLのLBブロスに接種し、37℃で、最終OD5951.2に達するまで培養した。その後、終濃度1mMになるまでイソプロピル−β−D−1−チオガラクトピラノシド(Isopropyl β−D−1−Thiogalactopyranoside:IPTG)を添加して、N−Tag6xHis−ST1A1の合成を誘導した。25℃で16時間、培養を行った。結果として生じたバイオマスを、4℃で10分間、3.3rcf(相対遠心力)で遠心分離により収集し、25mLの0.9%NaCl溶液で2回洗浄し、使用するまで−20℃で凍結した。
総量100μLの各反応混合物は、pH7の50mMのTris−HClと、230μMのPAPと、1mMのpNPSと、10%(v/v)グリセロールと、Δ2−5/pST1A1株の粗細胞ライセート0.1mg/mLとを含んでいた。混合物は、標準96ウェルプレートで調製した。PAPを添加することによって、反応を開始した。反応混合物を、MultiskanGo(Thermo Scientific社)で、30℃で3時間培養した。使用したすべてのウェルに対して、5分毎にOD405を測定し、その結果、pNP合成の反応速度が得られた(図4)。pNP濃度へのOD405の依存として得られた検量線を用いて、絶対pNP濃度を求めた。反応混合物中のPAPSの蓄積量(モル比)は、下記式から考慮して、pNPの蓄積量と等しいとみなした。
PAP+pNPS=PAPS+pNP
(1)ヘパロサンの調製
(1.1)ヘパロサン発酵
国際公開第2015/050184号の実施例1に記載のヘパロサンを生成する細菌(大腸菌BL21(DE3)/pVK9−kfiABCD株)および培養条件を用いて、ヘパロサンを含む培養液を得た。
遠心分離によって、培養液から培養液の上清を回収した。培地成分を除去するために、UF膜を用いてミリQ水で培養液の上清1mLを洗浄し、250μLまで濃縮した。UF膜を用いて濃縮した250μLの溶液に、500μLの100%エタノールを添加し、ヘパロサンを遠心分離によって沈殿させた。結果として生じた沈殿物を空気中で乾燥させて、ヘパロサンを得た。残りの培養液の上清からも、同じ手順によりヘパロサンを精製した。合計10gのヘパロサンを得た。
A)1.22gのヘパロサンに、61mLのヒドラジン水和物と4.7mLの1N硫酸とを添加し、気相を窒素で置換した後、得られた混合物を100℃に加熱し、4.75時間反応させた。
B)氷冷却によって反応を停止した後、61mLの16%NaCl水溶液と610mLのMeOHとを添加し、得られた混合物を遠心分離機にかけた。上清を除去した。結果として生じた沈殿物を、50mLのH2Oに溶解し、その後、Amicon UF膜(3kDa)を用いて、脱塩かつ濃縮した。
C)結果として生じた濃縮液に、2倍の量のH2Oと等量の1M−NaHCO3とを添加し、その後、0.2M−I2/0.4M−KI溶液を、黄色になるまで滴下した。次に、ヒドラジン水和物を滴下して過剰なヨウ素をヨウ素イオンに還元し、その後、上記溶液を、Amicon UF膜(3kDa)を用いて、再度、脱塩かつ濃縮した。濃縮溶液を減圧下で乾燥してN−脱アセチル化ヘパロサンを得た。得られたN−脱アセチル化ヘパロサン中のアセチル基の残留率は、14.9%であった(後述する)。
(3.1)ヘパリナーゼIIIの調製
(3.1.1)フラボバクテリウム・ヘパリナム(Flavobacterium heparinum)に固有のhepC遺伝子を保持する発現プラスミドの構築
フラボバクテリウム・ヘパリナムに固有のヘパリナーゼIIIをコードするhepC遺伝子を、pMIV−Pnlp0ベクターにクローニングして(米国特許出願公開番号20050196846)、hepC遺伝子発現プラスミドpMIV−Pnlp0−hepCを構築した。pMIV−Pnlp0−terは、強力なnlp0プロモーター(Pnlp0)とrrnBターミネーターとを含み、プロモーターとターミネーターの間に目的遺伝子を挿入することによって、発現ユニットとして機能することができる。「Pnlp0」は、大腸菌K12株に固有の野生型nlpD遺伝子のプロモーターを表す。
hepC遺伝子発現プラスミドpMIV−Pnlp0−hepCを、エレクトロポレーション(細胞80μL、200Ω、25μF、1.8kV、キュベット0.1mL)により、大腸菌BL21(DE3)株(Life Technologies社)に導入して、ヘパリナーゼIIIを産生する株としての大腸菌BL21(DE3)/pMIV−Pnlp0−hepC株を得た。この株を、25μg/mLのクロラムフェニコール付加LB培地において、37℃で一晩、予備培養した。次に、培養液を、終濃度2%(v/v)で、坂口フラスコ内の300mLのLB培地に接種した。37℃で4時間、振とう培養を実施し、その後、培養を停止した。遠心分離の後、微生物細胞を、0.85%NaClで2回洗浄し、30mLの50mMのHEPES緩衝液(pH7.0)に懸濁した。懸濁液に超音波破砕を施し、微生物細胞を破砕した。破砕した微生物細胞液を遠心分離機にかけ、上清(無細胞抽出液)としてヘパリナーゼIII酵素液を調製した。
(2)で得られたN−アセチル基残留率14.9%のN−脱アセチル化ヘパロサン1gと、31.3mIU/μLヘパリナーゼIII溶液2mLとを、100mMのNaClと1.5mMのCaCl2とを含むTris緩衝液(pH8.0)100mLに溶解し、37℃で5.3時間反応させた。反応液に、100mLの16%NaCl水溶液と900mLのEtOHとを添加かつ混合し、遠心分離機にかけて上清を除去し、かつ脱重合したN−脱アセチル化ヘパロサンを得た。
A)(3)で得られた脱重合したN−脱アセチル化ヘパロサン1gを、50mLのミリQ水に溶解し、得られた溶液に、20mg/mLのNaHCO3/20mg/mLのトリメチルアミンSO3の水溶液50mLを添加し、得られた混合物を55℃で一晩反応させた。
B)混合物に、1LのEtOHを添加し、その後、遠心分離機にかけて上清を除去してN−硫酸化脱重合ヘパロサンを得た。
C)得られたN−硫酸化脱重合ヘパロサンを、500μLになるまでミリQ水に溶解し、二糖類分析を行ってN−脱アセチル化ヘパロサンに対する収率を算出した。また、GPCにかけて、分子量分布を算出した。その手順を以下に示す。
これまでに報告された条件(T. Imanariら,“High−performance liquid chromatographic analysis of glycosaminoglycan−derived oligosaccharides”,J.Chromatogr.A,1996,720:275−293)にしたがって、N−硫酸化脱重合ヘパロサンの二糖類分析を実施した。つまり、ヘパリナーゼIIおよびIIIを用いてN−硫酸化脱重合ヘパロサンを不飽和二糖類に分解し、各分解生成物をHPLCで分析することによって、各二糖類構成要素の量を定量化した。
1)0.2UのヘパリナーゼII(Sigma社)、0.02〜0.03mIUのヘパリナーゼIII、5μgの多糖類試料、および10μLの酵素消化用緩衝液(100mMのCH3COONa、10mMの(CH3COO)2Ca、pH7.0)を混合して、測定量100μLになるまでミリQ水で希釈し、反応液として使用した。
2)反応液を16時間以上37℃で維持し、次に、2分間100℃で沸騰させ、反応を停止した。
3)不純物を0.45μmフィルタにより除去して溶液を得、その後、得られた溶液を二糖類分析用試料として使用した。
4)温度50℃、流量0.25mL/分、および検知波長230nmの条件下で、粒径5μm、150mm×2.1mmのInertsil ODS−3のカラムを用い、また、溶液Aとして4%アセトニトリルおよび1.2mMのトリブチルアミン、ならびに溶液Bとして4%アセトニトリルおよび0.1MのCsClからなる溶出液組成物を用い、溶液Bのグラジエント1%〜90%で、分析を実施した。
(ミリQ水に1mg/mLで溶解されている)N−硫酸化脱重合ヘパロサンおよびヘパラン硫酸を、HPLC(GPC分析)によってゲルろ過した。GS520(Shodex、Asahipak GS−520HQ、7.5mm×300mm、粒径7μm)をカラムとして使用し、100mMのリン酸二水素カリウムの水溶液を溶出液として使用し、流量0.6mL/分、カラム温度40℃、および検知波長200nmで、分析を実施した。標準としてプルランの分子量マーカーセット(Shodex社、STANDARD P−82、分子量5900〜708000)を用いて、平均分子量(MnおよびMw)を算出した。
本発明の方法は、アルコール類およびアミン類のO−およびN−硫酸化誘導体の酵素製造に有用である。特に、上記方法は、ヘパリンおよびヘパラン硫酸の製造に好適である。
Claims (16)
- 基質を酵素によりスルフリル化する方法であって、
(i)腸内細菌科に属する細菌を含む培地中で、前記基質と3’−ホスホアデノシン−5’−ホスホ硫酸とを反応させて、前記基質の硫酸化誘導体を生成することと、
(ii)前記培地から前記硫酸化誘導体を回収することと、
を含み、
前記細菌は、
(A)少なくとも、スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を産生し、かつ、
(B)aphA遺伝子またはcysQ遺伝子の発現を減弱させる
ように改変されている、方法。 - 前記aphA遺伝子の発現を減弱させるように改変された前記細菌は、前記cysQ遺伝子、もしくはcpdB遺伝子、またはこれらの組み合わせの発現を減弱させるように、さらに改変されている、請求項1に記載の方法。
- 前記cysQ遺伝子の発現を減弱させるように改変された前記細菌は、aphA遺伝子、もしくはcpdB遺伝子、またはこれらの組み合わせの発現を減弱させるように、さらに改変されている、請求項1に記載の方法。
- スルホトランスフェラーゼ活性を有する前記タンパク質は、O−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質、N−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質、およびN−デアセチラーゼ/N−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質からなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- O−スルホトランスフェラーゼ活性を有する前記タンパク質は、ヘパラン硫酸2−O−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質、ヘパラン硫酸3−O−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質、ヘパラン硫酸6−O−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
- 前記細菌は、ヘパロサン−N−硫酸−グルクロン酸−5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を産生するように、さらに改変されている、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細菌は、3’−ホスホアデノシン−5’−ホスホ硫酸−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を産生するように、さらに改変されている、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記培地は、3’−ホスホアデノシン−5’−ホスホ硫酸−スルホトランスフェラーゼ活性を有する前記タンパク質を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記基質は、ヒドロキシ基およびアミノ基から選択される少なくとも1つの化学基を有する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記基質は、ヘパロサン、ヘパラン硫酸、およびヘパリンからなる群から選択される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記硫酸化誘導体は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、コリン硫酸、およびデルマタン硫酸からなる群から選択される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細菌は、エシェリヒア属またはパントエア属に属する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細菌は、大腸菌またはパントエア・アナナティスである、請求項12に記載の方法。
- 基質の硫酸化誘導体を生成する方法であって、
(i)腸内細菌科に属する細菌を含む培地中で、前記基質と3’−ホスホアデノシン−5’−ホスホ硫酸とを反応させて、前記基質の前記硫酸化誘導体を生成することと、
(ii)前記培地から前記硫酸化誘導体を回収することと、
を含み、
前記細菌は、
(A)少なくとも、スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を産生し、かつ、
(B)aphA遺伝子またはcysQ遺伝子の発現を減弱させる
ように改変されている、方法。 - 前記aphA遺伝子の発現を減弱させるように改変された前記細菌は、cysQ遺伝子、もしくはcpdB遺伝子、またはこれらの組み合わせの発現を減弱させるように、さらに改変されている、請求項14に記載の方法。
- 前記cysQ遺伝子の発現を減弱させるように改変された前記細菌は、aphA遺伝子、もしくはcpdB遺伝子、またはこれらの組み合わせの発現を減弱させるように、さらに改変されている、請求項14に記載の方法。
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