ES2256954T3 - Procedimiento de preparacion de heparina. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un procedimiento simplificado para la extracción de heparina del tejido de la mucosa animal. el procedimiento consta de una etapa de hidrólisis enzimática de la materia prima a temperatura ambiente, seguida de una hidrólisis que dura hasta 6 horas a una temperatura comprendida entre 50 y 75{sup,0}C. La elevación de temperaturas se obtiene de manera fácil. La mezcla de la digestión puede además incubarse mientras se enfría a temperatura ambiente. La heparina se recupera de un intercambiador aniónico presente en el hidrolizado de las proteínas.

Description

Procedimiento de preparación de heparina.

La presente invención se refiere a la preparación de heparina. Más particularmente, se refiere a un procedimiento simplificado para la eliminación de proteínas presentes en un tejido animal fuente de heparina.

La heparina es un glicosaminoglicano muy complicado compuesto por secuencias alternas de diferentes residuos sulfatados de ácido urónico y \alpha-D-glucosamina unidas por enlaces \alpha y \beta (1-4). Debido a la complejidad de su estructura primaria, la heparina es un heteropolisacárico polidisperso que es fuertemente heterogéneo en términos de peso molecular, propiedades físico-químicas y actividades biológicas.

La heparina se ha usado ya durante mucho tiempo como un agente anticoagulante y antitrombótico en el tratamiento y prevención de la trombosis venosa. Está presente en distintos tejidos animales y se puede obtener aislándola de ellos. Actualmente, una gran parte de la heparina que se usa para estos propósitos se aísla de la mucosa intestinal porcina. El procedimiento de aislamiento implica la hidrólisis de la mucosa seguida por extracción de la heparina.

La patente de EE.UU. 4.216.293 describe un procedimiento enzimolítico para la extracción de los inhibidores de proteasas de los tejidos animales. Este procedimiento comprende primero calentar la mezcla acuosa del (de los) tejido(s) y al menos una enzima proteolítica a aproximadamente 40ºC, después opcionalmente a 60ºC y posteriormente a 90ºC. Aunque el procedimiento se dirige a la producción de inhibidores de proteasas, tal procedimiento también permite la extracción de heparina procedente de una fracción intermedia

La patente de EE.UU. 5.607.840, incluida en la presente memoria como referencia, describe un procedimiento para la hidrólisis del tejido de la mucosa. El método implica la hidrólisis de una mezcla acuosa que contiene mucosa de mamíferos con una enzima proteolítica a una temperatura de aproximadamente 55ºC, adsorción de los polianiones en una resina de intercambio aniónico y recuperación posterior de los aniones de la resina y del hidrolizado de proteínas de la disolución acuosa digerida. Con el fin de estabilizar el material de mucosa bruto y evitar el crecimiento bacteriano, se introducen en la disolución sales en forma de un eliminador de oxígeno o bacte-
ricidas.

El contenido de heparina en el medio acuoso que contiene la mucosa es muy bajo y, consecuentemente, se tienen que procesar grandes cantidades de tejido de mucosa. Por lo tanto, por razones económicas, el procedimiento de hidrólisis se lleva a cabo en recipientes de reacción de más de 50 m^{3}. Durante el tiempo de reacción, la temperatura se mantiene a un nivel constante durante más de 24 horas y la mezcla se agita vigorosamente usando equipamiento avanzado.

Normalmente las plantas de extracción de heparina no se localizan a una distancia corta de los mataderos en los que se recoge la mucosa, y se requiere transporte para distancias largas. Especialmente en áreas remotas, esto da lugar al suministro de bajas cantidades de material en la planta de producción y a un aumento de los costes.

La presente invención proporciona un camino nuevo y fácil de aislar heparina del tejido de mucosa. Se ha encontrado que también se puede digerir la proteína en una mezcla acuosa que comprende tejido de mucosa de mamífero con una enzima proteolítica a una temperatura entre 50 - 75ºC durante aproximadamente un máximo de 6 horas. Se incluye una simple etapa de "prehidrólisis" a temperatura ambiente. Esto mostró que mejoraba significativamente la eficacia de la proteolisis. Después de aumentar la temperatura, se puede continuar la hidrólisis preferiblemente en presencia de material adsorbente de polianiones a una temperatura por debajo de 50ºC. La digestión se puede llevar a cabo en recipientes con capacidad

\hbox{intermedia.}

De este modo, el procedimiento según la invención comprende la etapa de aumentar la temperatura de la mucosa a aproximadamente 50 - 75ºC e incubar la mucosa en ese intervalo de temperaturas durante aproximadamente 6 horas en presencia de una enzima proteolítica.

El procedimiento tiene la ventaja de que puede llevarse a cabo a una escala relativamente pequeña. El procedimiento es muy apropiado para llevarse a cabo en lugares en los que se produce el material de mucosa bruto y de este modo no es necesario el transporte del material bruto. Además, no se requiere ninguna destreza especial.

Según la presente invención, también se incluyen las siguientes etapas de incubación en el método:

-

incubar la mezcla en un recipiente durante aproximadamente un máximo de 8 horas a temperatura ambiente antes de aumentar la temperatura.

-

incubar adicionalmente después del au- mento de temperatura mientras la disolución se deja enfriar hasta temperatura ambiente.

El tiempo de incubación a 50 - 75ºC preferiblemente es menor que 4 horas. Preferiblemente, el tiempo de incubación es más de 1 hora. La temperatura se aumenta preferiblemente a aproximadamente
60 - 70ºC.

La temperatura se puede aumentar fácilmente por calentamiento directo del recipiente que contiene la disolución acuosa de mucosa. Por ejemplo, una temperatura de aproximadamente 60 - 70ºC se puede alcanzar rápidamente con una llama de gas ordinaria pero también, por ejemplo, por la adición de vapor de agua. La temperatura así obtenida se puede mantener por calentamiento moderado durante varias horas. Alternativamente, se puede detener la adición externa de calor tan pronto como se alcance la temperatura deseada, dejando que la mezcla en el recipiente se enfríe gradualmente. Debido a la disminución gradual de temperatura, la mezcla retendrá su temperatura por encima de 50ºC durante varias horas. De ese modo, inicialmente tiene lugar la hidrólisis de la proteína a una temperatura por encima de 50ºC. Después de retirar la fuente de calor externo, la temperatura disminuye y continua la hidrólisis a una temperatura más baja. No hay limitación a la extensión del tiempo de incubación a la temperatura reducida, sin embargo, se prefieren tiempos de incubación de menos de 24 horas, más preferiblemente la incubación se lleva a cabo durante toda la noche. La continuación de una incubación prolongada a temperatura ambiente no es un prerrequisito pero ha mostrado que tiene influencia en el rendimiento de heparina. De manera parecida, la etapa de "pre-incubación" a temperatura ambiente mostró que mejora los rendimientos de heparina.

El recipiente de reacción puede ser, por ejemplo, un recipiente de acero, pero no se necesitan requerimientos específicos.

Alternativamente, la temperatura se puede aumentar por adición de 1-3 volúmenes de una disolución acuosa con una temperatura entre 80 y 100ºC. Preferiblemente se usa agua, pero también se pueden usar disoluciones salinas diluidas. Preferiblemente, la temperatura del agua es la temperatura de ebullición. Debido al aumento de volumen, aumenta la capacidad calorífica. Por lo tanto, la temperatura se puede mantener a la temperatura deseada durante un periodo de tiempo suficientemente largo mientras que simultáneamente progresa lentamente el proceso de enfriamiento. Una ventaja adicional de la adición de agua es que se reduce la viscosidad de la disolución dando lugar a una mejor capacidad de tamizado del complejo adsorbente-heparina, lo cual es importante en la extracción de la heparina. Como no se requiere calentamiento directo, se pueden usar recipientes de diferentes materiales, por ejemplo, plástico.

Un método conveniente de llevar a cabo el procedimiento según la invención es recoger la mucosa durante una jornada laboral y comenzar con la hidrólisis por adición de la enzima proteolítica durante el almacenamiento del material bruto en un recipiente. Al final del día se puede aumentar la temperatura a 50 - 75ºC, mantenerla opcionalmente a un nivel constante durante una pocas horas, y después incubar adicionalmente durante toda la noche mientras la temperatura disminuye gradualmente hasta temperatura ambiente.

Es preferible que durante el procedimiento de hidrólisis la mezcla se agite con el fin de obtener una disolución homogénea y para que haya un buen contacto entre el adsorbente y la disolución que contiene la heparina.

La disolución que contiene la mucosa se puede obtener dispersando tejidos animales en agua. Los tejidos se pueden obtener de, por ejemplo, carne de ternera, perro, cerdo y oveja. Los tejidos tienen componentes endoteliales o mucosos. La heparina está presente, por ejemplo, en pulmón, intestino, piel e hígado de distintos animales. Preferiblemente, se usa mucosa intestinal de origen porcino.

Se pueden emplear una gran variedad de enzimas en el procedimiento, a condición de que posean una actividad proteolítica. Son bien conocidas en la técnica las enzimas adecuadas, por ejemplo, proteasa microbiana, tripsina, quimotripsina. Una enzima adecuada para usar en la hidrólisis alcalina esta comercialmente disponible con la marca comercial maxatasa®. La relación enzima a sustrato normalmente es aproximadamente 0,02 - 0,2%. El agente conservante presente normalmente en la disolución de tejido de mucosa también se puede añadir en el procedimiento según la presente invención. Preferiblemente, se usa metabisulfito sódico como un agente conservante pero también serán suficientes otros agentes conservantes tales como, por ejemplo, propionato cálcico o fenol. La cantidad de bisulfito que se ha de añadir es aproximadamente 0,5 - 5 kg/100 litros de mucosa. El agente conservante se añade mejor durante la recogida del tejido de mucosa.

El pH se puede ajustar a pH 7 - 9 con un reactivo alcalino. Normalmente se añade hidróxido sódico en una cantidad de aproximadamente 0,8 - 1,2 kg/100 litros de mucosa. Las enzimas proteolíticas normalmente más usadas ejercen su actividad óptima a este pH. El ajuste puede tener lugar durante la etapa de "prehidrólisis", así como durante la etapa de incubación a la temperatura más alta.

También es un objetivo de la presente invención proporcionar un procedimiento para el aislamiento de la heparina. El procedimiento de hidrólisis de la presente invención es importante en el aislamiento de la heparina. La heparina se puede extraer del hidrolizado si se añade el adsorbente a la mezcla durante una o más de las etapas de incubación para ligar la heparina presente en la disolución de hidrólisis. Preferiblemente se añade el adsorbente al comienzo de la incubación a la temperatura más alta.

Preferiblemente, el adsorbente es una resina de intercambio aniónica que se añade en una cantidad suficiente para ligar los polianiones presentes en la disolución de mucosa. Tales resinas de intercambio aniónicas están disponibles comercialmente. Normalmente se añade una cantidad de 2 litros por 100 litros de mucosa. También se puede usar un agente adsorbente por afinidad específico para la heparina para extraer la heparina de la disolución de digestión.

Se debería seleccionar la concentración salina total del hidrolizado en un intervalo que asegure la captación casi cuantitativa por la resina, que es importante para la eficacia de la unión de los polianiones a la resina de intercambio iónico, y que normalmente varía entre 0.1 y 0,5 molar. Además de las sales presentes en la mucosa, normalmente también se añaden agentes conservantes y sales de metales alcalinos o sales amónicas durante el procedimiento de hidrólisis.

Después del procedimiento de hidrólisis el adsorbente se separa por tamizado. La heparina adsorbida se eluye después mediante una disolución muy salina y la heparina se procesa adicionalmente. De este modo, también es un objetivo de la presente invención proporcionar un procedimiento para el aislamiento de la heparina, que comprende las etapas adicionales de separar por tamizado el adsorbente con la heparina y la elución de la heparina del adsorbente.

Para asegurar la recuperación óptima de la heparina, es deseable que la disolución salina usada para la elución sea de fuerza iónica suficientemente alta para asegurar la liberación sustancialmente completa de la heparina del adsorbente. Una forma de recuperación de la heparina del complejo intercambio aniónico-heparina es la elución con NaCl a una concentración 2 - 4 molar.

Queda claro que el procedimiento según la invención hace posible procesar el material no adsorbido, es decir, la mucosa, en el sitio en el que se produce ya que el procedimiento es fácil de llevar a cabo y sólo se requiere un equipamiento mínimo para realizar la hidrólisis. Por lo tanto, el procedimiento según la presente invención se puede llevar a cabo incluso en un ambiente de baja tecnología con infraestructura pobre.

Los siguientes ejemplos son ilustrativos de la invención y no deberían interpretarse de ningún modo como limitantes del alcance de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1

A 250 kg de mucosa porcina, estabilizada con 0,5% de metabisulfito sódico, se añadieron 200 gramos de maxatasa® y la mezcla se agitó a temperatura ambiente. Después de 4 horas, se calentó la mucosa a 69ºC con un calentador por llama de gas en aproximadamente 70 minutos. Se añadió NaOH (1.500 gramos) dando lugar a un pH de 7,3, y se añadieron 3,5 litros de intercambiador aniónico. Después, la mezcla se dejó enfriar durante toda la noche mientras se agitaba. Para facilitar la separación del intercambiador iónico, la mezcla se calentó al día siguiente antes de separar por tamizado el intercambiador iónico. El intercambiador iónico se lavó con una disolución salina al 3,5% y se eluyó con una sal de elución al 14%. La heparina eluida se precipitó con metanol. El rendimiento de heparina fue 36.100 U/kg de mucosa en el eluato y 34.300 U/kg en el precipitado. La actividad y calidad fueron comparables con las de heparina bruta procedente de un procedimiento estándar.

Ejemplo 2

A 100 kg de mucosa porcina, estabilizada con 1% de metabisulfito sódico, se añadieron 80 gramos de maxatasa® y la mezcla se agitó a temperatura ambiente. Después de 2 horas, se calentó la mucosa a 65ºC por adición de 120 litros de agua hirviendo en aproximadamente 10 minutos. Se cambió el pH añadiendo 630 ml de una disolución de NaOH al 33% (valor medido 7,3), y se añadieron 3,5 litros de intercambiador aniónico. La temperatura de comienzo fue 65ºC, después de una hora ésta fue 61ºC, después de dos horas 56ºC y después de tres horas 52ºC. La mezcla se dejó enfriar durante toda la noche. El intercambiador aniónico se separó por tamizado a una temperatura de 28ºC y se eluyó el intercambiador iónico lavado. El rendimiento de heparina fue 30.500 U/kg de mucosa en el eluato y 26.400 U/kg en el precipitado. La actividad y calidad fueron comparables con las de heparina bruta procedente de un procedimiento estándar.

Ejemplo 3

A 47,5 kg de mucosa estabilizada con 0,5% de metabisulfito sódico, se añadieron 80 gramos de maxatasa® a una temperatura de 30ºC mientras se agitaba. Después de 4 horas, se añadieron otros 55,5 kg de mucosa y la mezcla se agitó durante otras 2 horas a temperatura ambiente (26ºC). Después la mezcla se calentó en 40 minutos a 65ºC introduciendo vapor de agua en la mezcla. Se cambió el pH a 7,2 con 550 gramos de NaOH y después de agitar durante una hora se añadió un litro de intercambiador iónico. La temperatura de comienzo fue 65ºC, después de una hora esta fue 62ºC y después de dos horas 53ºC. La mezcla se dejó enfriar durante toda la noche, la temperatura fue 27ºC. El rendimiento de heparina fue 40.000 U/kg en el eluato y 38.700 U/kg en el precipitado.

Ejemplo 4

A 3 kg de mucosa porcina en un matraz aislado, estabilizada con 0,5% de metabisulfito sódico, se añadieron 2,3 gramos de maxatasa® y la mezcla se agitó a temperatura ambiente. Después de 5,5 horas a 30ºC, se calentó la mucosa a 64ºC por adición de 5,4 litros de agua hirviendo. Se añadieron 35 ml de una disolución de NaOH al 33% dando lugar a un pH de 7,6, y se añadieron 110 ml de intercambiador aniónico. Después la mezcla se dejó enfriar. Después de aproximadamente 16 h la temperatura era 41ºC y se separó por tamizado el intercambiador de iones. El rendimiento de heparina en el eluato fue 32.200 U/kg de mucosa. La actividad y calidad fueron comparables con las de heparina bruta procedente de un procedimiento estándar.

Ejemplo 5

A 115 kg de mucosa porcina, estabilizada con 1% de metabisulfito sódico, se añadieron 88 gramos de maxatasa® y la mezcla se agitó a temperatura ambiente. Después de 2 horas, se calentó la mucosa a 65ºC por adición de 133 litros de agua hirviendo en aproximadamente 10 minutos. Se cambió el pH añadiendo 880 gramos de NaOH (pH 7,75), y se añadieron 4 litros de intercambiador aniónico. Posteriormente se añadieron 108 g de maxatasa®. La temperatura de comienzo fue 65ºC, después de una hora esta fue 60ºC, después de dos horas 57ºC y después de tres horas 54ºC. Después de 3 horas se separó por tamizado el intercambiador de iones. Se eluyó el intercambiador iónico lavado y se precipitó la heparina. El eluato de heparina contenía 20.500 U/kg de mucosa y el precipitado 17.565 U/kg. La actividad y calidad fueron comparables con las de heparina bruta procedente de un procedimiento estándar.

Ejemplo 6

A 100 kg de mucosa porcina, estabilizada con 1% de metabisulfito sódico, se añadió maxatasa® y la mezcla se agitó a temperatura ambiente. Después la mucosa se calentó a 68ºC con un calentador por llama de gas en 60 minutos. Se añadió NaOH dando lugar a un pH de 7,2. Después de esto, se añadieron 2,1 litros de intercambiador aniónico. La mezcla se dejó después enfriar hasta que la temperatura cayó por debajo de 60ºC, después se aplicó calentamiento adicional para mantener la temperatura por encima de 60ºC. Después de tres horas, se separó por tamizado el intercambiador de iones. Se lavó el intercambiador de iones y se almacenó a 5ºC para transporte a la planta de procesado.

Claims (8)

1. Un procedimiento para la producción de heparina usando un método para la hidrólisis enzimática de proteína procedente de tejido de mucosa de mamíferos, que comprende las etapas:

(a)

añadir la enzima proteolítica al tejido de mucosa;

(b)

incubar la mezcla obtenida en la etapa (a) en un recipiente a temperatura ambiente hasta 8 horas;

(c)

aumentar la temperatura a 50 - 75ºC e incubar la mezcla a la temperatura elevada durante 1 a 6 horas;

en el que se añade un agente adsorbente a la mezcla durante al menos una de las etapas (b) o (c) en una cantidad suficiente para ligar la heparina presente en la mezcla.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa (c) se lleva a cabo durante 1 a 4 horas.

3. El procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la temperatura en la etapa (c) es 60 - 70ºC.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende una etapa de incubación prolongada después de la etapa (c) mientras que la disolución se deja enfriar hasta temperatura ambiente.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el aumento de la temperatura se obtiene por transferencia directa de calor.

6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el aumento de la temperatura en la etapa (c) se obtiene por adición a la mezcla de 1 - 3 volúmenes de un disolvente acuoso con temperatura entre 80 - 100ºC.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el disolvente acuoso es agua hirviendo.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende separar por tamizado el adsorbente con la heparina y recuperar la heparina del adsorbente.