MXPA00000579A - Proceso para la produccion de heparina - Google Patents

Abstract

La presemte invención se refiere a un proceso simplificado para laextracción de heparina a partir de tejido de mucosa animal. El método consiste de un paso de hidrólisis enzimática del material crudo a temperatura ambiente, seguido por hidrólisis durante hasta 6 horas a una temperatura de 50-75ºC. La elevación en temperatura se obtiene mediante medios fáciles. La mezcla de digestión puede ser incubada adicionalmente mientras se enfría a temperatura ambiente. La heparina se recupera a partir del intercambiador aniónico presente en el hidrolizado de proteína.

Description

PROCESO PARA LA PRODUCCIÓN DE HEPARI NA La presente invención se refiere a la preparación de heparina. Más particularmente, se refiere a un proceso simplificado para la remoción de proteínas presentes en una fuente de heparina de tejido animal. La heparina es un glicosaminoglican muy complicado compuesto de secuencias alternantes de residuos de ácido urónico sulfatados de manera diferente y a-D-glucosamina unidos mediante ligaduras a y ß (1-4). Debido a la complejidad de su estructura primaria, la heparina es un heteropolisacárido polidisperso el cual es fuertemente heterogéneo en términos de peso molecular, propiedades físico-químicas y actividades biológicas. La heparina ya se ha usado durante un largo tiempo como un agente anticoagulante y antitrombótico en el tratamiento y prevención de trombosis venosa. Esta presente en una variedad de tejidos animales y puede obtenerse mediante aislamiento a partir de los mismos. Actualmente una gran parte de la heparina usada para estos propósitos se aisla de la mucosa intestinal porcina. El proceso de aislamiento involucra la hidrólisis de la mucosa seguida por la extracción de la heparina. La Patente de E. U. No. 5,607,840, incluida a la presente por referencia, describe un proceso para la hidrólisis del tejido de la mucosa.

El método involucra la hidrólisis de una mezcla acuosa que contiene mucosa de mamífero con una enzima proteolítica a una temperatura de aproximadamente 55° C, la adsorción de polianiones a una resina de intercambio de iones y la recuperación subsecuente de los aniones a partir de la resina y del hidrolisado de proteína a partir de la solución acuosa digerida. Con el fin de estabilizar el material de mucosa cruda y evitar crecimiento bacteriano, se introducen a la solución sales en la forma de un secuestrante de oxígeno o bactericidas. El contenido de heparina en el medio acuoso que contiene mucosa es muy bajo y consecuentemente tienen que procesarse grandes cantidades de tejido de mucosa. Por lo tanto, por razones económicas, el proceso de hidrólisis se lleva a cabo en recipientes de reacción de más de 50 m3. Durante el tiempo de reacción la temperatura se mantiene a un nivel constante durante más de 24 horas y la mezcla se agita vigorosamente usando equipo moderno. Usualmente las plantas de extracción de heparina no están localizadas a una corta distancia de los rastros o mataderos donde se recoge la mucosa y se requiere su transportación sobre largas distancias. Especialmente en áreas remotas esto resulta en una entrega de material de baja calidad a la planta de producción y en un incremento de costos. La presente invención proporciona un modo nuevo y fácil para aislar heparina del tejido de la mucosa. Se ha encontrado que la proteína en una mezcla acuosa que comprende tejido de mucosa de mamífero puede ser digerida también con una enzima proteolítica a una temperatura entre 50-75° C durante hasta aproximadamente 6 horas. Se puede incluir opcionalmente un paso de "pre-hidrólisis" simple a temperatura ambiente. Esto mostró que mejora la eficiencia de la proteolisis significativamente. Después del aumento en temperatura la hidrólisis puede continuarse de preferencia en la presencia de material adsorbente de polianión a una temperatura por debajo de 50° C. La digestión puede llevarse a cabo en contenedores con capacidad intermedia. Así, el proceso de acuerdo con la invención comprende el paso de elevar la temperatura de la mucosa hasta aproximadamente 50-75° C e incubar la mucosa dentro de ese rango de temperatura durante hasta aproximadamente 6 horas en la presencia de una enzima proteolítica. El proceso tiene la ventaja de que puede llevarse a cabo en una escala relativamente pequeña. El proceso está muy bien adecuado para llevarse a cabo en lugares donde se produce el material de mucosa cruda y así no se necesita el transporte del material crudo. Además, no se requieren habilidades especiales. De acuerdo con la presente invención se pueden incluir en ei método uno o ambos de los siguientes pasos de incubación: a) incubar la mezcla en un contenedor durante hasta aproximadamente 8 horas a temperatura ambiente antes de la elevación de temperatura. b) incubar adicionalmente después de la elevación de temperatura mientras que la solución se deja enfriar a temperatura ambiente.

El tiempo de incubación a 50-75° C es de preferencia menor de 4 horas. De preferencia el tiempo de incubación es más de 1 hora. La temperatura se eleva de preferencia hasta aproximadamente 60-70° C. La temperatura puede ser elevada fácilmente mediante calentamiento directo del contenedor que contiene la solución acuosa de mucosa. Por ejemplo, se puede alcanzar rápidamente una temperatura de aproximadamente 60-70° C con una flama de gas ordinario, pero también v. g. , por la adición de vapor. La temperatura así obtenida puede mantenerse mediante calentamiento moderado durante varias horas. Alternativamente, la adición externa de calor puede detenerse tan pronto como se alcanza la temperatura deseada permitiendo a la mezcla en el contenedor enfriarse gradualmente. Debido a la disminución gradual de temperatura, la mezcla retendrá su temperatura por encima de 50° C durante varias horas. Así, la hidrólisis de proteína ocurre inicialmente a una temperatura por encima de 50° C. Después de la eliminación de la fuente externa de calor, la temperatura disminuye y la hidrólisis continúa a una temperatura menor. No hay limitación para la extensión del tiempo de incubación en la temperatura disminuida, sin embargo, se van a preferir tiempos de incubación de menos de 24 horas, más preferiblemente la incubación se lleva a cabo durante la noche. La continuación de una incubación prolongada a temperatura ambiente no es un pre-requisito, pero mostró tener influencia en el rendimiento de heparina. De manera similar, el paso de "pre-incubación" a temperatura ambiente mostró que mejora los rendimientos de heparina. El recipiente de reacción puede ser, v. g. , un contenedor de acero, pero no se necesitan requerimientos específicos. Alternativamente, la temperatura puede elevarse mediante la adición de 1 -3 volúmenes de una solución acuosa con una temperatura entre 80 y 100° C. Se usa agua de preferencia, pero también pueden usarse soluciones diluidas de sal. De preferencia, la temperatura del agua es la temperatura de ebullición. Debido al aumento de volumen la capacidad calorífica aumenta. Por lo tanto, la temperatura puede mantenerse a la temperatura deseada durante un periodo de tiempo suficientemente largo mientras que simultáneamente progresa lentamente el proceso de enfriamiento. Una ventaja adicional de la adición de agua es que la viscosidad de la solución se reduce resultando en una mejor facilidad para colar el complejo adsorbente-heparina el cual es importante en la extracción de heparina. Como no se requiere calentamiento directo se pueden usar contenedores de diferentes materiales, v. g. , plástico. Una manera conveniente de llevar a cabo el procedimiento de acuerdo con la invención es recolectar la mucosa durante 1 día de trabajo y comenzar con la hidrólisis mediante la adición de enzima proteolítica durante el almacenaje del material crudo en un contenedor. Al final del día la temperatura puede incrementarse hasta 50-75° C, mantenerla opcionalmente en un nivel constante durante unas pocas horas, y entonces incubar posteriormente durante la noche mientras la temperatura disminuye gradualmente hasta la temperatura ambiente. Se va a preferir que durante el proceso de hidrólisis la mezcla se agite con el fin de obtener una solución homogénea y de tener un buen contacto entre el adsorbente y la solución que contiene heparina. La solución que contiene mucosa se puede obtener dispersando tejidos animales en agua. Los tejidos pueden obtenerse a partir de v. g. , de carne de res, perro, cerdo y oveja. Los tejidos tienen componentes endoteliales o de mucosa. La heparina está presente, v. g. , en pulmones, intestino, piel e hígado de una variedad de animales. De preferencia, se usa mucosa intestinal de origen porcino. Se pueden emplear una gran variedad de enzimas en el proceso siempre que tengan una actividad proteolítica. Las enzimas adecuadas son bien conocidas en la técnica, v. g., proteasas microbianas, tripcina, quimotripcina. Una enzima adecuada para uso en hidrólisis alcalina está disponible comercialmente bajo la marca comercial Maxatase®. La relación de enzima a substrato usualmente es aproximadamente 0.02- 0.2%. El conservador presente normalmente en la solución de tejido de mucosa puede agregarse también en el proceso de acuerdo con la presente invención. De preferencia, se usa como un conservador metabisulfito de sodio, pero bastarán también otros conservadores tales como v. g. , propionato de calcio o fenol. La cantidad de bisulfito a ser agregada es aproximadamente 0.5-5 kg/100 litros de mucosa. El conservador se agrega mejor durante la recolección del tejido de mucosa.

El pH puede ajustarse a un pH de 7-9 con un reactivo alcalino.

Usualmente se agrega hidróxido de sodio en una cantidad de aproximadamente 0.8-1 .2 kg/100 litros de mucosa. Las enzimas proteolíticas más comúnmente usadas ejercen su actividad óptima en este pH. El ajuste puede ocurrir durante el paso de "pre-hidrólisis" así como también durante el paso de incubación a la mayor temperatura. Es también un objetivo de la presente invención proporcionar un proceso para el aislamiento de heparina. El proceso de hidrólisis de la presente invención es importante en el aislamiento de la heparina. La heparina puede extraerse del hidrolizado si se agrega adsorbente a la mezcla durante uno o más de los pasos de incubación para aglutinar la heparina presente en la solución hidrolizante. De preferencia el adsorbente se agrega al comienzo de la incubación a la temperatura más alta. El adsorbente es, de preferencia, una resina de intercambio de aniones la cual se agrega en una cantidad suficiente para aglutinar los polianiones presentes en la solución de mucosa. Tales resinas de intercambio aniónico están disponibles comercialmente. Usualmente se agrega una cantidad de 2 litros por 100 litros de mucosa. También podría usarse un adsorbente de afinidad específica para la heparina para extraer la heparina a partir de la solución de digestión. La concentración total de sal del hidrolizado debe seleccionarse dentro de un rango para asegurar la recolección casi cuantitativa por la resina importante para la eficiencia de aglutinación de los polianiones para la resina de intercambio de iones y varía usualmente entre 0.1 y 0.5 molar. Además de las sales presentes de la mucosa, pueden agregarse usualmente también conservadores y sales de metal alcalino o sales de amonio durante el proceso de hidrólisis. Después del proceso de hidrólisis se cierne el adsorbente. La heparina adsorbida se extrae entonces mediante una solución alta en sal y la heparina se procesa posteriormente. Así, es también un objetivo de la presente invención proporcionar un proceso para el aislamiento de la heparina que comprende los pasos adicionales de colar el adsorbente con la heparina y la elución de la heparina a partir del adsorbente.

Para asegurar la recuperación óptima de la heparina, es deseable que la solución de sal usada para la elución sea de fuerza iónica suficientemente alta para asegurar la liberación de heparina substancialmente completa a partir del adsorbente. Una manera de recuperar la heparina a partir del complejo de intercambio heparina-anión es la elución con NaCI a una concentración de 2-4 molar. Será claro que el procedimiento de acuerdo con la invención hace posible procesar el material no adsorbente, es decir, la mucosa en el lugar donde se produce puesto que el procedimiento es fácil de realizar y se requiere solamente un mínimo de equipo para realizar la hidrólisis. Por lo tanto, el proceso de acuerdo con la presente invención puede efectuarse en un entorno de baja tecnología con pobre infraestructura. Los siguientes ejemplos son ilustrativos para la invención y no deben ser interpretados de ningún modo como limitativos del alcance de la invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Se agregaron 200 gramos de Maxatase® a 250 kg de mucosa porcina, estabilizada con metabisulfito de sodio al 0.5%, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente. Después de 4 horas la mucosa se calentó a 69° C con un calentador de flama de gas en aproximadamente 70 minutos. Se agregó NaOH (1 ,500 gramos) lo que resultó en un pH de 7.3 y se agregaron 3.5 litros de intercambiador aniónico.

La mezcla se dejó enfriar entonces durante una noche mientras se agitó. Para facilitar la separación del intercambiador de iones, la mezcla se calentó el día siguiente antes de colar el intercambiador de iones. El intercambiador de iones se lavó con una solución de sal al 3.5% y se eluyó con una solución de sal al 14%. La heparina eluída se precipitó con metanol. La producción de heparina fue de 36, 100 U/ g de mucosa en el eluído y 34,300 U/kg en el precipitado. La actividad y calidad fueron comparables con heparina cruda derivada de un proceso estándar.

Ejemplo 2 Se agregaron 80 gramos de Maxatase® a 100 kg de mucosa porcina, estabilizada con metabisulfito de sodio al 1 % , y la mezcla se agitó a temperatura ambiente. Después de 2 horas la mucosa se calentó a 65° C mediante la adición de 120 litros de agua caliente hirviendo en aproximadamente 10 minutos. El pH se cambió agregando 360 mi de una solución de NaOH al 33% (valor medido 7.3) y se agregaron 3.5 litros de intercambiador aniónico. La temperatura de partida fue de 65° C, después de 1 hora ésta fue de 61 ° C, después de 2 horas 56 y después de 3 horas 52° C. La mezcla se dejó enfriar durante una noche. El intercambiador de iones se coló a una temperatura de 28° C y el intercambiador de iones lavado se eluyó. La producción de heparina fue de 30,500 U/kg de mucosa en el eluído y 26,400 U/kg en el precipitado. La actividad y calidad fueron comparables con heparina cruda derivada de un proceso estándar.

Ejemplo 3 Se agregaron 80 gramos de Maxatase® a 47.5 kg de mucosa estabilizada con metabisulfito de sodio al 0.5%, a una temperatura de 30° C mientras se agitó. Después de 4 horas se agregaron otros 55.5 kg de mucosa y la mezcla se agitó durante otras 2 hr. a temperatura ambiente (26° C). Entonces la mezcla se calentó en 40 minutos a 65° C introduciendo vapor caliente a la mezcla. El pH se cambió a 7.2 con 550 gramos de NaOH y después de agitar durante una hora se agregó un litro de intercambiador de iones. La temperatura de partida fue de 65° C, después de una hora ésta fue de 62° C, y después de dos horas 53° C. La mezcla se dejó enfriar durante una noche, la temperatura fue de 27° C. La producción de heparina fue de 40,000 U/kg en el eluído y 38,700 U/kg en el precipitado.

Ejemplo 4 Se agregaron 2.3 gramos de Maxatase® a 3 kg de mucosa porcina en un frasco aislado, estabilizada con metabisulfito de sodio al 0.5%, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente. Después de 5.5 horas a 30° C la mucosa se calentó a 64° C mediante la adición de 5.4 litros de agua caliente hirviendo. Se agregaron 35 ml de una solución de NaOH al 33% lo que resultó en un pH de 7.6 y se agregaron 1 10 ml de intercambiador aniónico. La mezcla se dejó enfriar entonces. Después de aproximadamente 16 hr. la temperatura fue de 41 ° C y el intercambiador de iones se coló. La producción de heparina en el eluído fue de 32,200 U/kg de mucosa. La actividad y calidad fueron comparables con heparina cruda derivada de un proceso estándar.

Ejemplo 5 Se agregaron 88 gramos de Maxatase® a 1 15 kg de mucosa porcina, estabilizada con metabisulfito de sodio al 1 % , y la mezcla se agitó a temperatura ambiente. Después de 2 horas la mucosa se calentó a 65° C mediante la adición de 133 litros de agua caliente hirviendo en aproximadamente 10 minutos. El pH se cambió agregando 880 gramos de NaOH (pH 7.75) y se agregaron 4 litros de intercambiador aniónico. Subsecuentemente se agregaron 108 gramos de Maxatase®. La temperatura de partida fue de 65° C, después de 1 hora ésta fue de 60° C, después de 2 horas 57 y después de 3 horas 54° C. Después de 3 horas se coló el intercambiador de iones. El intercambiador de iones lavado se eluyó y la heparina de precipitó. La heparina eluída contenía 20,500 U/kg de mucosa y el precipitado 17,565 U/kg. La actividad y calidad fueron comparables con heparina cruda derivada de un proceso estándar.

Ejemplo 6 Se agregó Maxatase® a 100 kg de mucosa porcina, estabilizada con metabisulfito de sodio al 1 %, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente. Después la mucosa se calentó a 68° C con un calentador de flama de gas en 60 minutos. Se agregó NaOH lo que resultó en un pH de 7.2. Después se agregaron 2.1 litros de intercambiador aniónico. La mezcla se dejó enfriar entonces hasta que la temperatura quedó por debajo de 60° C, después se aplicó calentamiento adicional para mantener la temperatura por encima de 60° C. Después de 3 horas el intercambiador de iones se coló. El intercambiador de iones se lavó y almacenó a 5° C para transporte a la planta de procesamiento.

Claims (10)

1. REIVI N DICACIONES 1. Un método para hidrólisis enzimática de proteína de tejido de mucosa de mamífero en una mezcla acuosa dicho método que comprende el paso de: elevar la temperatura hasta aproximadamente 50-75° C e incubar dicha mezcla dentro de dicho rango de temperatura durante hasta aproximadamente 6 horas en la presencia de una enzima proteolítica.
2. 2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 en donde el tiempo de incubación es menor que 4 horas.
3. 3. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 en donde la temperatura es elevada hasta aproximadamente 60-70° C.
4. 4. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 -3 dicho método que comprende opcionalmente uno o ambos de los pasos de: a) incubar dicha mezcla antes de la elevación de temperatura en un contenedor a temperatura ambiente hasta 8 horas. b) incubar adicionalmente después de la elevación de temperatura mientras que la solución se deja enfriar a temperatura ambiente.
5. 5. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 -4 en donde la elevación en temperatura se obtiene mediante transferencia directa de calor.
6. 6. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 -4 en donde la elevación en temperatura se obtiene mediante la adición de 1 -3 volúmenes de un solvente acuosa con una temperatura de entre 80-100° C a la mezcla acuosa que comprende el tejido de mucosa.
7. 7. El método de acuerdo con la reivindicación 6 en donde el solvente acuoso es agua hirviendo.
8. 8. Un método para la adsorción de fase sólida de heparina que comprende la hidrólisis de proteína de acuerdo con la reivindicación 1 -7 en donde se agrega adsorbente en una cantidad suficiente para aglutinar la heparina presente en la solución hidrolizante a la mezcla durante la hidrólisis.
9. 9. Un método para la extracción de heparina de acuerdo con la reivindicación 8 el cual comprende los pasos adicionales de colar el adsorbente con la heparina y recuperar la heparina a partir del adsorbente.
10. 10. Heparina preparada de acuerdo con el método de la reivindicación 9.