FI65073B - Foerfarande foer framstaellning av heparin - Google Patents

Description

ESr^l γβΊ ««kuulutusjulkaiso ,ςηπ,

Ma 11 utlAggn INGSSKRI FT obU/0 ^ ^ Patent aeddolat ^ ^ ^ (51) Kv.ikP/jntci3 C 08 B 37/10 SUOM I —Fl N LAN D (21) P»»fittlh«k*mu« —P»t*ntaiuöknln| 70390^ (22) HaVamlspitvt — Ancöfcnlnpdtg 19.12.78 (23) AlkupUvft— GlKifhatadtg 19.12.78 (41) Tullut JulklMkal — Blhrlt off«ntll| 07. 07. 79

Patentti- ja rekisteri hai Utu* . wiNwauipwco ja kuul+illutaun pvm. _

Patent- och registentyrelMn ' ' AmBtan uth|d odi utiskriftMt publkand 30.11.83 (32)(33)(31) Pyyd·**/ utuolkmi»—Bujlrd prlorlttc 06.01.78

Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) P 20009^3.0 Toteennäytetty-Styrkt (71) Schering Aktiengesellschaft, Berlin/Bergkamen, DE; Mullerstrasse 170-178, 1 Berlin 65, Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (72) Hans-Jörg Vidic, Berlin, Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken lyskland(DE) (7*0 Oy Kolster Ab (5*0 Menetelmä hepariinin valmistamiseksi - Förfarande för framställning av heparin

Keksintö koskee menetelmää hepariinin saamiseksi suolaliuoksesta, joka muodostuu eläinten suolien työstämisen yhteydessä (suolen suolaliuos).

Hepariini on jo kauan ollut lääketieteen käytettävissä luonnossa esiintyvänä veren hyytymistä estävänä aineena, joka on nykyaikaiselle lääketieteellekin tarpeellinen ja jota käytetään yhä laajemmalti.

Viime vuosina on opittu tuntemaan useita menetelmiä, joilla kaikilla on päämääränä eristää vaikuttava aine hepariini yhä enemmän säästävällä tavalla hepariinia sisältävistä eläinten kudoksista kuten keuhkoista, maksasta ja uudemmalla ajalla ennen kaikkea sikojen, nautakarjan ja lampaiden suolen limasta (Mucosa) GB-patenttijulkaisu 754 885, DE-patenttijulkaisu 1 228 241, US-patenttijulkaisu 3 058 884, DE-patentti-julkaisu 1 253 868). Tällaiset raaka-aineet pilaantuvat helposti, mikä rajoittaa niiden varastoimista, jota tosin voi- 2 65073 daan parantaa jäädyttämällä. Tämä johtaa kuitenkin huomattavaan kustannusten nousuun. Edelleen käsittelyn takia aiheutuu sekä tehtaan työntekijöille että myös ympäristöseudun asukkaille usein vaikeita ongelmia käsittelystä aiheutuvan hajun johdosta. DE-patenttijulkaisussa 1 253 868 kuvataan hepariinin talteenottoa joidenkin tavanomaisten menetelmien yhteydessä. Tämän mukaan eläinkudos saatetaan alkuvaiheessa kosketuksiin kuuman vesipitoisen suolaliuoksen kanssa, jotta hepariini saataisiin liuotettua soluista erilleen. Tällöin muodostuvan väliaineen hepariinimäärä on erittäin vähäinen.

Nyt todettiin, että teurastomoissa liman puhdistuksen yhteydessä muodostuva suolaliuos sisältää hepariinia. Tämä suolaliuos muodostuu, kun eläinten suolet, joista on etukäteen poistettu suolen lima, asetetaan säilöntää ja veden poistoa varten keittosuolaliuokseen.

Kun otetaan huomioon DE-patenttijulkaisu 1 253 868, voidaan pitää yllättävänä, että suolaliuos, joka muodostuu pidettäessä eläinten suolia keittosuolaliuoksessa, sisältää suurehkoja määriä hepariinia. Ei myöskään ollut odotettavissa, että tämä hepariini oli melkein täysin vapaa kemiallisesti sukua olevista sivutuotteista, joten suolaliuos, joka tähän mennessä tunnetaan ainoastaan ympäristöä rasittavana jäte-tuotteena, muodostaa uuden raaka-ainelähteen raaka-aineiden puutteen johdosta jo hyvin vähäiselle hepariinille. Koska epäpuhtauksia on vain vähän, voidaan edelleenkäsittely raaka-hepariiniksi suorittaa erityisen säästäen ja tällöin vältetään tähänastisen tekniikan tason mukaiset tunnetut hankalat eristysmenetelmät (katso US-patenttijulkaisu 3 451 996 ja GB-patenttijulkaisu 1 221 784). Lisäksi saadaan sellaisia hepa-riinilaatuja, jollaisia ei ole vielä likimainkaan tavattu markkinoilla käytettävissä olevien hepariinivalmisteiden joukosta. Tunnettujen edelleenkäsittelymenetelmien mukaan keksinnön mukaisesti käytetystä suolen liotukseen käytetystä suolaliuoksesta eristetyn raakahepariinin puhtausaste on jo sellainen, että lopullinen puhdistaminen hepariiniksi johtaa tuotteisiin, jotka sisältävät yli 200 USP-yksikköä/mg.

65073 3 Tähän mennessä kaupan olevat hepariinivalmisteet sisältävät yleensä 150 USP-yksikköä/mg, joissakin harvoissa tapauksissa myös 155 USP-yksikköä/mg. Tällöin tarkoitetaan yhdellä USP-yksikköllä/mg sitä spesifistä aktiviteettia, joka saadaan tulokseksi U.S.P. määrityksestä, jolla mitataan säilötyn lampaan plasman hyytymien muodostumista. 1 USP-yksikköä vastaa noin 1,1 kansainvälistä yksikköä (UI). Koska kaupan olevien hepariinivalmisteiden aktiivisuusarvot ovat lukuisista menetelmän parannuksista huolimatta yhä edelleen epätyydyttäviä, määrää esimerkiksi USP, että hepariinivalmisteiden (suolen-limasta peräisin olevien) täytyy sisältää vähintään 140 USP-yksikköä. L.W. Kananagh'in ja L.B. Jaques’in /Arzneimittel-forschung (Drug Res.) 24, nr 12, 1942 (1974)_7 onnistui tähän mennessä ainoastaan laboratoriossa eristää hepariini korkeintaan 175 USP/mg aktiivisena kiteyttämällä useita kertoja bariumsuolana.

Eläinten suolien säilömiseen ja veden poistoon soveltuvat erityisesti keittosuolaliuokset, joiden keittosuolapitoi-suus on 3-molaarisesta kyllästysnoolimäärään. Kyllästysmooli-määrällä tarkoitetaan sitä moolimäärää, jonka kyllästetty keittosuolan vesiliuos sisältää teurastamon lämpötilassa. (Kyllästetty NaCl-vesiliuos on noin 26,4 %:sta).

Yleensä käsitellään eläinten suolia, joista lima on poistettu, 2 tunnin - 3 päivän ajan keittosuolaliuoksella. Useimmiten on eläinten suolien käsittely päättynyt kuitenkin jo 3-24 tunnin kuluttua. Sen jälkeen kun säilötyt eläinten suolet, joista vesi on poistettu kokonaan, poistetaan keittosuolaliuoksesta, saadaan suolaliuos, joka sisältää yllättävän paljon hepariinia.

Käyttämällä keksinnön mukaisesti tällaisia suolenkäsit-telyn suolaliuoksia raaka-aineena onnistuttiin eristämään hepariini myös tekniikan mittapuun mukaan niin puhtaana, että se esiintyi lähes värittömänä aineena. Kaikista tähän mennessä, muista raaka-aineista saatavista raakahepriineista täytyy sitävastoin poistaa ensiksi väri hankalilla ja epäedullisilla menetelmillä (US-patenttijulkaisu 3 179 566).

4 65073

Suolenkäsittelyn suolaliuos on lisäksi varastointikel-poinen, melkein hajuton raaka-aine, jonka laatu ei kärsi pätkänkään varastoinnin aikana. Tällöin jäävät pois kemialliset ja muut säilöntämenetelmät.

Keksinnön kohteena on siten menetelmä hepariinin tal-teenottamiseksi eläinkudoksen käsittelystä saadusta suolaliuoksesta, joka laimennetaan vedellä siten, että suolaliuoksen ja veden suhde on 1:3-1:5, ja josta hepariini erotetaan sinänsä tunnetulla tavalla, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että lähtöaineena käytetään suolaliuosta, joka saadaan liottamalla teurastomossa vallitsevassa lämpötilassa keitto-suolaliuoksessa, jonka konsentraatio on 3-molaarisen ja kyllästetyn välillä, eläinten suolia, joista suolen lima on poistettu.

Esimerkki 1 600 litraan suolaliuosta lisättiin 1 500 litran sekoit-timessa huoneen lämpötilassa sekoittaen puolen tunnin sisällä 600 litraa metanolia. Sekoitettiin edelleen puolen tunnin ajan, minkä jälkeen seoksen annettiin seistä noin 1 tunnin ajan.

Päällä oleva samea liuos dekantoitiin toiseen astiaan, jäljelle jäi saostunut suolakakku. Saadun suspension annettiin nyt seistä kahden päivän ajan. Sen jälkeen dekantoitiin jälleen, päällä oleva liuos hyljättiin ja sakka eristettiin sentrifugoimalla. Sakka kuivattiin vakuumissa, jolloin saatiin 1,44 kg tuotetta, joka sisälsi noin 10 USP-yksikköä/mg. Tuote koostuu vielä noin 45 %:sesti keittosuolasta. Näin saadun raa-kahepariinin tasamäärä, joka vastasi noin 425 000 USP-yksikköä tai 42,5 g uutettiin kolme kertaa kulloinkin 200 ml:11a 2-m keittosuolaliuosta, jolloin kulloinkin sekoitettiin 1 tunnin ajan 60°C:ssa. Yhdistetyt uutteet laimennettiin vedellä, kunnes liuos sisälsi noin 0,9 moolia/1 kloridi-ioneja. Nyt lisättiin 200 ml anioninvaihtajaa (Lewatit CA 9 249) kloridi -muodossa ja sekoitettiin 1 tunnin ajan. Lopuksi imusuodatet-tiin ja pestiin noin 200 ml :11a 0,9-m keittosuolaliuosta. Ioninvaihtajaa sekoitettiin sitten 5 tunnin ajan 2-m keitto- 5 65073 suolaliuoksen kanssa 40°C:ssa ja sen jälkeen imusuodatettiin ja pestiin 2-m keittosuolaliuoksella. Eluutioliuos yhdistettiin pesuliuokseen ja saostettiin 1,5-kertaisella tilavuus-määrällä metanolia. Sakka sentrifugoitiin, pestiin ensiksi noin 50 ml:11a vesi-maetanolia (1 + 1,5 tilavuusosaa), sitten noin 50 ml:11a metanolia ja kuivattiin.

Saatiin 198 g Na- heparinaattia, joka sisälsi 195 USP-yksikköä/mg. 15,5 g edellä kuvatulla tavalla saatua natrium-heparinaattia, joka sisälsi noin 200 USP-yksikköä/mg, liuotettiin 200 ml:aan 2-m keittosuolaliuosta. Liuos imusuodatettiin ja jäännös pestiin ensiksi 30 ml:11a 2-m keittosuola-liuosta, sitten noin 200 ml:11a vettä, josta suola oli poistettu täysin. Yhdistettyjen liuosten kloridi-molaarisuus saatettiin täysin suolavapaan veden avulla 0,9:ksi. Sitten suoritettiin puhdistaminen kuten edellä kuvattiin 1 litralla Lewatit CA 9 249:ää.

Yhdistettyä eluutio- ja pesuliuosta käsiteltiin edelleen kuten edellä kuvattiin. Sen jälkeen kun sakka oli pesty ja kuivattu saatiin 11,2 g natriumheparinaattia, jonka aktiivisuus oli 251 USP-yksikköä/mg.

Esimerkki 2 GB-patenttijulkaisussa 754 885 kuvatulla tavalla 3 litraa suolaliuosta säädettiin etikkahapolla (noin 50 ml) pH-arvoon 3,1-3,2. Joidenkin tuntien kuluttua dekantoitiin ja jäännös sentrifugoitiin. Sakka heitettiin pois, yhdistetyt liuokset neutraloitiin NaOH-liuoksella.

Nyt lisättiin sekoittaen hitaasti sama tilvuusmäärä metanolia. 45 minuutin kuluttua dekantoitiin saostuneen keittosuolan päällä oleva suspensio. Suspension annettiin seistä usean tunnin ajan, päällä oleva neste dekantoitiin ja jäännös sentrifugoitiin. Sakka kuivattiin vakuumissa. Saatiin 3,43 g tuotetta, joka sisälsi 21 USP-yksikköä/mg. Näin saadun raakahepariinin tasamäärä, joka vastasi noin 425 000 USP-yksikköä eli 20,2 g puhdistettiin samoin kuin esimerkissä 1 kuvattiin. Saatiin 10,65 g natriumheparinaattia, jonka aktiivisuus oli 262 USP-yksikköä/mg.

65073 e

Esimerkki 3 3 litraa suolaliuosta laimennettiin 12 litralla vettä kunnes saavutettiin kloridi-molaarisuus 0,85-m. Sitten lisättiin 50 g piimaata sekä liuos, jossa oli 6 g bentsetonium-kloridia ("Hyamiini 1 622", Rohm & Haas) 100 ml:ssa vettä. Muutamien tuntien kuluttua dekanoitiin ja jäännös imusuodatet-tiin. Sakka pestiin vedellä uutettiin vielä kosteana kolme kertaa DE-patenttijulkaisun 1 227 241 mukaisella menetelmällä kulloinkin 200 ml:11a 2-m keittosuolaliuosta. Yhdistetyt uutteet saostettiin 2 tilavuusosalla metanolia. Eristetty ja kuivattu sakka painoi 465 mg, ja sen aktiivisuus oli 155 USP-yksikköä/mg.

Esimerkki 4 30 litraa suolaliuosta laimennettiin 120 litralla vettä, kunnes saavutettiin kloridi-molaarisuus noin 0,85-m (vrt. DE-patentti julkaisu 1 156 938) . Liuos tehtiin happameksi etikka-hapolla (noin 50 ml) pH-arvoon 3,2. Muutamien tuntien kuluttua oli saostunut sakka, k kas liuos dekantoitiin ja sakka sentri-fugoitiin. Kuivattamisen jälkeen saatiin 111 g raakaheparii-nia, joka sisälsi 6,5 USP-yksikköä/mg. Näin saadun raakahepa-riinin tasamäärä, joka vastasi noin 425 000 USP-yksikköä tai 65,5 g, puhdistettiin ensiksi samoin kuin esimerkissä 1. Ensimmäisen, ioninvaihtajalla suoritetun puhdistusvaiheen jälkeen saatiin 196 g Na- heparinaattia, joka sisälsi 198 USP-yksikköä/mg.

15 g edelläkuvatulla tavalla saatua natriumheparinaattia, joka sisälsi noin 200 USP-yksikköä/mg, liuotettiin 200 ml:aan 2-n kalsiumkloridiliuosta. Liuos imusuodatettiin, ja jäännös pestiin ensiksi 30 ml:11a 2-n kalsiumkloridiliuosta, sitten noin 200 ml:11a täysin suolavapaata vettä. Yhdistettyjen liuosten kloridi-molaarisuus saatettiin nyt täysin suolattomalla vedellä arvoon 0,9. Nyt sekoitettiin edellä mainittua seosta Lewatit CA 9 249:n (1 litra) kanssa. Eluointi ja pesu suoritettiin 2-n kalsiumkloridiliuoksella keittosuolaliuoksen sijasta .

65073 7

Yhdistettyä eluaatio- ja pesuliuosta käsiteltiin edelleen kuten edellä kuvattiin. Sakka pestiin ja kuivattiin, jolloin saatiin 10,7 g kalsiumheparinaattia, jonka aktiivisuus oli 260 USP-yksikköä/mg.

Esimerkki 5 10 litraa suolaliuosta laimennettiin 40 litralla vettä, kunnes saavutettiin kloridi-molaarisuus 0,85-m. Tämä liuos pumpattiin suodattimen lävitse ioninvahtajapylvään kautta, jonka halkaisija oli 26 mm ja pituus 380 mm (noin 3 litraa/ tunnissa). Tällöin käytettiin keskivahvasti emäksistä suuri-huokoista anioninvaihtajahartsia Cl-muodossa (Lewatit CA 9 249). Voidaan myös käyttää muita anioninvaihtohartseja, kuten esimerkiksi DE-patenttijulkaisussa 1 253 868 kuvattua Dowex 1-X-1:tä.

Lopuksi hartsi poistettiin pylväästä, pestiin kaksi kertaa 500 ml:11a 0,9-m keittosuolaliuosta ja eluoitiin 400 ml:11a 2-m keittosuolaliuosta 5 tunnin ajan 40°C:ssa sekoittaen. Tämä liuos saostettiin 1,5 tilavuusosalla metanolia. Eristetty ja kuivattu sakka painoi 1,2 g ja se sisälsi 149 USP-yksikköä/mg.