CS216189B2 - Method of gaining the heparin - Google Patents

Description

(54) Způsob získávání heparinu

Vynález se týká způsobu získávání heparinu ze solného láku, který odpadá při zpracování zvířecích střev (střevní solný lák).

Heparin je v lékařství již dlouhou dobu k dispozici jako přirozený antikoaguláční materiál, je i v moderním lékařství právě tak jako dříve nepostradatelný a nachází stále větší použití.

Z posledních let je známa řada způsobů, které všechny mají za cíl izolovat účinnou látku heparin šetrným způsobem ze zvířecích tkání, jakli plic, jater a v poslední době především ze střevního hlenu (mukózy) vepřů, skotu a ovcí (patentový spis GB 754 885, patentový spis DE 1 228 241, . patentový spis US 3 058 884, patentový . Spis DE 1 253 868). Takovéto suroviny mají vzhledem k tomu, že se snadno kazí, ten nedostatek, že se dají jen omezeně skladovat, tato omezená skladovatelnost se sice dá . /prodloužit zmrazením, což však vedle zvýšeného technického nákladu vede i ke zvýšení finančních nákladů. Při zpracování jsou jak provozní personál, tak i obyvatelé okolí nezřídka stavěny s ohledem na zatěžování zápachem, spojeným s touto izolací před neočekávané problémy.

V patentovém spisu DE 1 253 8Θ8 je popsáno souhrnně získávání heparinu několika obvyklými způsoby. Podle něho se zví2 řečí tkáň přivede v počátečním stupni do styku s horkým vodným roztokem soli, aby se uvolnil heparin z buněk. Podíl heparinu v takto získávaném médiu je minimální.

Nyní bylo zjištěno, že solný lák, odpadající na jatkách a v podnicích pro zpracování sliznice střev, obsahuje heparin. Tento solný lák vzniká, když se zvířecí střeva, která byla předem zbaveno hlenu, se pro konzervování a odvodnění vloží do roztoku kuchyňské soli.

Lze tedy s ohledem na patentový spis DE 1 253 868 označit jako vysloveně překvapující to, že solný lák, vznikající při vložení zvířecích střev do roztoku kuchyňské soli, obsahuje větší množství heparinu. Nebylo možné také očekávat, že tento heparin je zde přítomen téměř úplně zbavený chemicky příbuzných vedlejších produktů, takže solný lák, který byl až dosud znám pouze jako odpadní produkt zatěžující okolí, představuje nový zdroj surovin pro heparin, -získatelný s ohledem na úzký profil surovin jen ve velmi skrovném množství. Vzhledem k tomu, že je přítomno minimální množství znečíštěnin, lze provádět zpracování surového heparinu obzvláště šetrně a tím odpadnou nákladné izolační metody, známé ze současného stavu techniky (viz patentové spisy US č. 3 451 996 a GB č. 1221 784).

Konečně se dospěje ke kvalitám heparinu, kterých není ani zdaleka dosaženo u heparinových preparátů, které jsou na trhu k dispozici. Surové hepariny izolované známými metodami zpracování ze -solného láku střev, použitého podle vynálezu jako suroviny, jsou předkládány již v takové čistotě, že následující čištění vede k heparlnům převyšujícím daleko 200 USP jednotek/mg. Heparinové preparáty, které lze až dosud v obchodě získat, mají zpravidla kvalitu heparínu 150 USP - jednotek/mg, v několika málo případech i 155 USP jednotek/ /mg.

Přitom se jako USP jednotka/mg rozumí specifická aktivita, která vyplývá z U. S. P. zkoušky, jíž se měří brzdění tvorby hrudek konzervované ovčí plazmy. 1 USP jednotka odpovídá asi 1,1 mezinárodní jednotky (UI). Vzhledem k tomu, že hodnota aktivity heparinových preparátů nacházejících se v obchodě je přes četná zlepšení postupů neuspokojivá, předpisuje například USP, že heparinové preparáty (ze střevního hlenu) musí obsahovat minimálně 140 USP jednotek. Dosud se pouze v laboratoři podařilo L. W. Kananaghovi a L. B. Jaquesovi [Azneimittelforschung (Drug. Res.) 24, Nr. 1942 (1974)] izolovat heparin opakovanou krystalizací jako barnatou sůl o účinnosti maximálně 175 USP-jednotek/mg.

Podle vynálezu byl výše diskutovaný problém vyřešen zdokonalením způsobu získávání heparínu ze solných roztoků zvířecí tkáně, které se - zřeďují vodou v poměru solného láku k vodě 1 : 3 až '1 : 10, a ze kterého se heparin získává pomocí o sobě známých metod. Zdokonalení spočívá v tom, že - se - jako ' výchozího ' materiálu používá střevního solného láku, který vzniká naložením zvířecích střev, zbavených střevního hlenu, v roztocích jedlé (kuchyňské) soli při teplotě od 0 do 30 °C.

Z důvodů hospodárnosti se zpravidla používá chloridu sodného v jakosti ' vhodné pro potravinářské účely. Proto se v popise tohoto - vynálezu používá pro označení chloridu sodného triviálního názvu kuchyňská sůl nebo jemu odpovídajícího- normalizovaného názvu jedlá sůl, aby se tím vyjádřilo, že pro velkoprovozní praktické využití vynálezu, například v jatečných provozech, postačí tato běžná jakost - chloridu sodného, i když samozřejmě by bylo možno použít i chloridu sodného nejvyšších stupňů čistoty.

Příprava střevního solného láku se v jatečných provozech provádí obvykle například takto:

Nejprve se střeva zbaví střevního hlenu (slizu), properou se vodou a vloží se do lísky. Nakládání střev do - roztoku jedlé (kuchyňské) soli se normálně provádí tak, že se do lísky naplněné střevy lije roztok jedlé - soli, ' - až je - líska naplněna. Po dvou hodinách až - dvou - dnech se vytvří žádaný střevní solný lák.

Ke konzervování a odvodňování zvířecích střev se hodí zejména roztoky jedlé (kuchyňské) soli, jejichž obsah soli činí 0,5 M až molární množství při nasycení.

Obzvláště výhodné jsou takové roztoky jedlé (kuchyňské] soli, jejichž obsah kuchyňské soli činí 3 M až molární množství při nasycení. Jako molární množství při nasycení se rozumí molární množství, které obsahuje koncentrovaný - vodný- roztok při teplotě místnosti jatek, vztaženo na rozpuštěnou jedlou (kuchyňskou) sůl (koncentrovaný vodný roztok chloridu sodného je asi 26,4 %).

Zpravidla se zpracovávají zvířecí střeva, zbavená hlenu, roztoky jedlé (kuchyňské) soli - - 2 hodiny až 3 dny. Nejčastěji je zpracování zvířecích střev ukončeno již po 3 až 24 hodinách. Po odstranění konzervovaných - a odvodněných zvířecích střev z roztoku jedlé (kuchyňské) soli se získá solný .- střevní lák, který má překvapivě vysoký obsah heparínu.

Použitím takovýchto střevních solných láků jako suroviny se podle vynálezu podařilo - - izolovat heparin i v provozním měřítku - v takové čistotě, že je k dispozici jako téměř bezbarvá látka. Všechny surové hepariny, které až dosud bylo možno získat z jiných - surovin, se naproti tomu musí teprve - nákladným a ztrátovým způsobem odbarvovat (patentový spis US č. 3 179 566).

Střevní solný lák je nadto skladovatelná surovina, téměř prostá zápachu, u které nedochází dlouhým skladováním ke snížení kvality. Tím odpadjí chemické a jiné konzervační metody.

Vynález se tedy týká použití střevního solného láku, který byl získán vložením zvířecích střev, zbavených sliznice, do roztoků - kuchyňské soli, pro výrobu čistého heparinu, jakož i způsob izolace čistého heparinu ze solných roztoků zvířecích tkání o - sobě známými způsoby, vyznačující se tím, že se jako výchozí materiál použije střevní solný lák, který byl získán vložením zvířecích střev zbavených sliznice do roztoků kuchyňské soli - při teplotě - 0 až 30 °C.

Příklad 1

600 1 solného láku bylo doplněno v míchačce o obsahu 1500 1 při teplotě místnosti za míchání během - půl hodiny 600 1 metanolu. Bylo mícháno -dále stejnou dobu, - - načež se směs nechala stát asi jednu hodinu.

Nyní se dekantovala zakalená horní část roztoku směsi do - druhé nádoby - a odstranil se vyloučený solný koláč. Získaná suspenze zůstala nyní stát dva dny. Potom byla opět dekantována, - horní část se zahodila a sraženina se izolovala odstředěním. - Po - sušení ve vakuu se získalo 1,44 kg produktu, který má asi 10 USP jednotek/mg. Sestává ještě asi ze 45 % - kuchyňské- soli. Alikvotní část takto získaného surového heparínu, odpovídající asi 425 000 USP E, popřípadě 42,5

21В189 gramu, byla třikrát extrahována vždy 200 ml dvoumolárního roztoku kuchyňské soli, přičemž právě nyní byla míchána jednu hodinu při 60 °C. Spojené extrakty byly zřeďovány vodou až roztok obsahoval asi 0,9 molu chloridových iontů na litr. Nyní bylo přidáno 200 ml aniontoměniče (Lewatitu CA 9249) v chloridové formě a míchalo se jednu hodinu.

Potom se odsálo a dodatečně promylo asi 200 ml 0,9 molárního roztoku kuchyňské soli. lontoměnič byl potom míchán pět hodin s dvoumolárním roztokem kuchyňské soli při 40 °C a potom odsát a dodatečně promyt dvoumolárním roztokem kuchyňské so- li. EluČní roztok byl spojen s promývacím roztokem a vysrážen l,5násobným objemem metanolu. Sraženina byla odstředěna, nejdříve promyta asi 50 ml směsi vody s metanolem (1-(-1,5 objemového dílu) potom asi s 50 ml metanolu a usušena.

Získalo se 198 g heparinátu sodného se 195 USP jednotkami na mg.

15,5 g natriumheparinátu, získaného vpředu popsaným způsobem s asi 200 USP jednotkami na mg, bylo rozpuštěno ve 200 ml dvoumolárního roztoku kuchyňské soli. Roztok byl odsát přes nuč a zbytek byl promyt nejprve 30 ml dvoumolárního roztoku kuchyňské soli, potom s asi 250 ml dokonale deionizované vody. Spojené roztoky byly nyní upraveny pomocí dokonale deionizované vody na molaritu chloridu 0,9 M. Nyní se jako předtím opakovalo čištění litrem Lewatitu CA 9249.

Spojený eluční a promývací roztok byly zpracovány dále stejným postupem, jaký byl popsán shora. Po promytí a usušení sraženiny se získalo 11,2 g natriumheparinátu, který měl aktivitu 251 USP jednotek na mg.

Příklad 2

Podobně jako v britském patentu 754 885 byly 3 1 solného láku za míchání okyseleny kyselinou octovou na pH 3,1 až 3,2 (asi 50 ml). Po několika hodinách se zdekantovalo a zbytek se odstředil. Sraženina se zahodila, spojené roztoky byly neutralizovány louhem sodným.

Nyní se za míchání doplnily roztoky stejným objemem metanolu. Po 45 minutách se zdekantovalo od vyloučené kuchyňské soli. Tato suspenze se nechala stát více hodin, horní část se zdekantovala a zbytek se odstředil. Sraženina se usušila ve vakuu. Získalo se 3,43 g sloučeniny se 21 USP jednotkami na mg. Alikvotní část takto získaného surového heparinu, odpovídající asi 425 000 USP -E, popřípadě 20,2 g, byla čištěna analogicky jako v příkladu 1. Získalo se 10,65 g natriumheparinátu s aktivitou 262 USP jednotek na mg.

P г í к 1 a d 3

1 solného láku byly zředěny 12 1 vody na molaritu chloridů asi 0,85 m. Potom bylo přidáno 50 g křemeliny, jakož i roztok 6 g benzethoniumchloridu (= Hyamin 1622, Rohm a. Hass) ve 100 ml vody. Po několika hodinách se zdekantovalo a zbytek se odsál. Po promytí vodou se ještě vlhká sraženina extrahovala třikrát způsobem popsaným v DE patentovém spise 1 228 241 vždy 200 ml 2 molárního roztoku kuchyňské soli. Spojené extrakty byly vysráženy 2 objemovými díly metanolu. Izolovaná a usušená sraženina vážila 465 mg a měla aktivitu 155 USP jednotek/mg.

Příklad 4

1 solného láku bylo zředěno 120 1 vody na molaritu chloridů asi 0,85 ш (srovn. DE patentový spis 1 156 938). Potom byl okyselen kyselinou octovou (asi 50 ml) na pH 3,2. Po několika hodinách sraženina sedimentovala, tato byla po zdekantování horní části odstředěna. Po usušení se získalo 111 g surového heparinu se 6,5 USP jednotek/mg. Alikvotní část takto získaného surového heparinu s asi 425 000 USP jednotkami, popřípadě 65,5 g byla nejdříve čištěno analogicky jako v příkladu 1. Po prvním čisticím stupni přes iontoměnič se získalo 196 g natriumheparinátu se 198 USP -E na mg.

g natriumheparinátu, získaného vpředu popsaným způsobem s asi 200 USP jednotkami na mg, bylo rozpuštěno ve 200 ml dvoumolárního roztoku chloridu vápenatého. Roztok byl odsát přes nuč a zbytek byl promyt nejdříve 30 ml dvoumolárního roztoku chloridu vápenatého, potom asi 250 ml dokonale deionizované vody. Spojené roztoky byly nyní nastaveny pomocí dokonale deionizované vody na molaritu chloridu 0,9. Nyní se smíchaly, jak bylo vpředu uvedeno, s jedním litrem Lewatitu CA 9249. Eluce a dodatečné promytí byly provedeny dvoumolárním roztokem chloridu vápenatého místo roztoku kuchyňské soli.

Spojený eluční roztok a promývací roztok byly dále zpracovány shora popsaným způsobem. Po promytí a usušení sraženiny se získalo 10,7 g heparinátu vápenatého s aktivitou 260 USP — jednotek na mg.

Příklad 5

1 solného láku bylo zředěno 40 1 vody na molaritu chloridu asi 0,85 M. Tento roztok byl čerpán filtrem přes sloupec iontoměniče o průměru 26 nm a délce 380 mm (asi 3 I/h). Byla použita středně bazická makroporézní aniontoměničová pryskyřice v Cl-formě (Lewatit CA 9249). Lze použít i jiné aniontoměničové pryskyřice, jako na příklad Dowéx 1—X—1, popsaným v německém patentovém spisu 1, 253 868.

Potom byla pryskyřice ze sloupce odstraněna, dvakrát promyta 500 ml 0,9 molárního roztoku kuchyňské soli a eluována 400 ml 2molármho roztoku kuchyňské soli hodin při 40 °C | za míchání. Tento roztok byl vysrážen 1,5 objemovými díly metanolu. Izolovaná a usušená sraženina vážila 1,2 gramu a měla aktivitu 149 USP--ednotek/ /mg.

Claims (1)

1. pRedmEt vynalezu

   Způsob získávání heparinu ze solných roztoků zvířecí tkáně, které se zřeďují vodou v poměru solného láku k vodě 1 : 3 až 1: 10 a z něhož se heparin získává metodami o sobě známými, vyznačující se tím, že se jako výchozího materiálu používá střevního solného láku, který vzniká naložením zvířecích střev, zbavených střevního hlenu, v roztocích jedlé soli při teplotě 0 až 30 stupňů Celsia.