KR900007953B1 - 엘라스타제의 정제방법(Elastase의 精製 方法) - Google Patents

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내용 없음.

Description

엘라스타제의 정제방법(Elastase의 精製 方法)

제1도는 폴리에틸렌 글리콜의 중합도에 따른 엘라스타제 잔존율의 변화를 나타낸 것이다.

제2도는 중합도가 낮은 폴리에틸렌 글리콜의 농도를 80%로 높엿을때의 엘라스타제 잔존율의 변화를 나타낸 것이다.

제3도는 폴리에틸렌 글리콜의 농도변화에 따른 엘라스타제 잔존율의 번화를 나타낸 것이다.

본 발명은 엘라스타제의 정제법에 관한 것이다. 의약품으로서 엘라스타제는 지질성분의 이행을 조절하고 혈청지질의 이상을 개선하며 (中村治雄 : 日本老年醫學會維誌 8,225(1971)) 동맥벽탄성선유(動脈壁彈性線維)인 엘라스틴의 변성을 억제하는 한편 신생(新生)을 촉진한다.

(竹內重雄 : 動脈硬化 8,411(1980)). 또한 동맥경화소(動脈硬化巢)에서의 콜레스테롤과 칼슘의 침착을 억제하고 제거를 촉진(村野後一 : 動脈硬化 14,565(1986))하는 등 전반적인 혈청지질의 이상을 개선하는데 (谷富夫 : 動脈硬化 6,101(1978))유용하다. 엘라스타제의 정제법으로서는, 일반적으로 돼지췌장에 함유되어있는 엘라스타제 전계물을 우선 분리하고, 적당한 방법으로 활성화 시킨다음 황산암모늄 부분 분리법(염석)(U.J.Lewis,et al ; J.Biol. chem., 222, 705, 1956)이나 유기 용제에(特開昭 58-51892)의한 처리를 함으로써 조(組) 엘라스타제 함유 생성물(生成物)을 얻은후 이와같은 조생성물 내의 엘라스타제를 인산염 완층액이나 이에 상당하는 물질을 가하여 추출하고, 이와 같이 추출된 엘라스타제를 황산암모늄 부분분리 조작을 한 다음 결정화(特開昭 52-61287)하거나 투석(U.J.Lewis, et al; J.Biol.chem.,222,705,1956)을 거쳐서 엘라스타제를 침전시킨다.

그러나 이와같은 종래의 방법은 특히 엘라스타제 함유 조생성물에 함유된 엘라스타제를 정제하는 단계에 있어서 여러가지 문제점을 갖고있다.

예를들면 이 단계에서 다량의 황산암모늄을 사용하여야 하고, 소량의 황산암모늄을 사용하면 황산암모늄부분분리 생성물의 엘라스타제 활성이 낮게되며, 이점은 다량의 불순물로 오염된 엘라스타제가 침전내에 그대로 잔류하게 됨을 의미한다. 그리고 인산염 완층액으로 추출한 후 황산암모늄 부분분리 조작이나 결정화과정을 거쳐야 하므로 제조공정이 복잡하고 최종산물이 나올 때까지는 오랜시간이 걸린다. 반면 아세톤 침전법이나 에탄올 침전법을 사용할경우 필연적으로 시료의 부피가 2배이상 증가되는 단점을 감수하여야 한다. 또한 한국특허출원번호 제 82-5414호에 기재되어 있는 방법에 의할 경우에도 아세톤 침전과정을 거쳐야 하며 전기전도도를 조절하기 위하여 한외여과와 물에 의한 희석과정을 거치게 되는데 필요한 범위까지 전기전도도를 맞춰주기 위하여 단백질농도가 400mg/ml 이상이 될때까지 한외여과를 하여야하고 이를 물로 희석한 후 결정화 과정에 3일이상의 시일을 요하는등 대량으로 정제할 경우 적용이 어렵다.

따라서 엘라스타제의 정제기술로는 간단하고 용이한 조작으로 엘라스타제 분(Elastase分)을 얻는 방법이 계속 추구되어 왔다.

본 발명은 엘라스타제 함유수용액에 폴리에틸렌 글리콜-6000을 가하여 엘라스타제 침전을 얻으므로써 침전이후의 조작을 간소화하고 고활성의 엘라스타제 분(Elastase分)을 얻는 것이다.

즉, 엘라스타제 결정이 이온농도가 낮은 수용액에서 불용성이며(D.M.Shotten et al; Methods Enzymol,19,113,1970) 폴리에틸렌 글리콜은 비이온성 중합체로서 수용액의 이온농도를 증가시키지 않으면서 단백질을 침전시킨다는(M.Fried et al; Methods Enzymol,22,238,1971)성질을 이용하므로써 이루어진 것이다.

이하 본 발명을 좀더 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서 출발물질로서 사용되는 엘라스타제 함유수용액은 엘라스타제 전계물, 예컨대 포유동물의 췌장에 함유된 엘라스타제 전계물이 활성화되어 엘라스타제로 전환된 후 어떠한 단계에서 얻어진 수용액이라도 가능하다.

예를들면 이와 같은 용액은, 판크레아틴에서 추출하여 얻은 수용액을 비롯하여 엘라스타제를 활성화한 후 조엘라스타제를 추출한 다음 조추출물을 유기용제로 처리하여 얻어진 조엘라스타제 함유생성물을 물이나 인산염완충액에 용해시킴으로써 얻거나, 또는 이와같은 엘라스타제 함유수용액을 청정여과하여 얻은 여액으로도 될 수 있다.

더욱 구체적으로 설명하면, 본 발명의 바람직한 방법은, 활성화가 끝난 엘라스타제 함유수용액을 청정여과하고 중합도가 600∼20,000인 폴리에틸렌 글리콜을 10∼60%(무게/부피)되게 하여 얻은 침전물 물로 세척한 후 남아 있는 고활성의 엘라스타제 침전을 얻게 하는 방법이다.

본 발명 방법에 따라 얻어진 엘라스타제 생성물을 진공건조하면 엘라스타제를 건조생성물로서 얻을 수 있다. 더욱 정제된 엘라스타제가 요구되는 경우에는 엘라스타제 건조 생성물을 인산완충용액으로 추출한 후 한외여과하여 100,000 이상의 분자량을 갖는 성분을 제거한다.

실험예 1

실험 및 방법

판크레아틴 추출액을 청정여과하고 중합도가 각각 600/1,000/1,500/2,000/4,000/6,000/20,000인 폴리에틸렌 글리콜을 40% 되게 가한다.

상기한 바와같이 폴리에틸렌 글리콜을 용해시킨후 상기 시료들과 출발수용액을 1시간동안 방치한 다음 10,000g에서 30분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 침전으로 남아있는 엘라스타제 활성을 측정하여 각시료에 대한 활성 잔존율을 결정하였다.

결과

결과는 도표 1에 나타나 있는바, 이 도표는 각 시료의 폴리에틸렌 글리콜의 중합도와 엘라스타제의 활성잔존율(%)과의 관계를 나타내는 것이다.

도표 1에서 X의 표시를 갖는 실측지정의 곡선은 각각 중합도가 600/ 1,000/ 1,500/ 2,000/ 4,000/ 6,000/ 20,000인 폴리에틸렌 글리콜 농도가 40%인 시료의 활성 잔존율을 나타내는 것이다.

도표1에서 알 수 있는 바와 같이 폴리에틸렌의 중합도가 6,000일때 시료 수용액내의 옐라스타제는 60%가 침전으로 되고 중합도가 20,000으로 증가 하더라도 침전효과의 증가는 나타나지 않으므로 6,000을 엘라스타제 침전의 적정 중합도로 정하였다.

실험예 2

실험 및 방법

판크레아틴 추출액을 청정여과하고 중합도가 각각 600/1,000/1,5Q0/2,000/4,000인 폴리에틸렌 글리콜을 80%가 되게 가한다.

상기한 바와같이 폴리에틸렌 글리콜을 용해시킨후 상기 시료들과 출발 수용액을 1시간 동안 방치한 다음 10,000g에서 30분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 침전으로 남아있는 엘라스타졔 활성을 측정하여 각시료에 대한 활성잔존율을 결정하였다.

결과

결과는 도표2에 나타나 있는바, 이 도표는 중합도가 6,000미만인 폴리에틸렌 글리콜의 농도를 80%까지 높였을 경우 폴리에틸렌 글리콜의 중합도와 활성잔존율(%)과의 관계를 나타내는 것이다.

도표2에서 *의 표시를 갖는 실측지침의 곡선을 각각 중합도가 600/1,000/1,500/2,000/4,000인 폴리에틸렌 글리콜의 농도가 80%인 시료의 활성잔존율을 나타내는 것이다. 도표2에서 알수 있는 바와같이 폴리에틸렌 글리콜의 중합도가 6,000미만일 경우에는 폴리에틸렌 글리콜의 농도를 80%까지 높여도 엘라스타제 활성잔존율은 50% 이하를 보였다.

실험예 3

실험 및 방법

판크레아틴 추출액을 청청여과하고 폴리에틸렌 글리콜-6,000의 농도가 각각 10,20,30,40,50 및 60%가 되게한다.

상기한 바와 같이 폴리에틸렌 글리콜의 농도를 조정한 후 상기 시료들과 출발수용액을 1시간동안 방치한다음 원심분리하여 상등액을 제거하고, 침전으로 남아있는 엘라스타제 활성을 측정하여 각 시료에 대한 활성잔존율을 결정하였다.

결과

결과는 도표3에 나타나 있는 바, 이 도표는 각 시료의 폴리에틸렌 글리콜의 농도와 활성잔존율(%)과의 관계를 나타내는 것이다.

도표3에서 0,0 표시를 갖는 실측지점의 곡선은 각각 10,20,30,40,50 및 60%의 폴리에틸렌 글리콜 6,000의 농도를 갖는 시료를 나타내는 것이다.

도표2에서 알 수 있는 바와 같이 폴리에틸렌 글리콜의 농도가 40%일때 시료수용액 내의 엘라스타제는 60%가 침전으로 되고 이후 폴리에틸렌 글리콜의 농도를 증가시키더라도 더 이상의 뚜렷한 침전효과의 증가는 나타나지 않으므로 이를 엘라스타제 침전의 적정 폴리에틸렌 글리콜 6,000의 농도로 정하였다.

본 발명을 다음의 실시예에서 더욱 상세히 설명하고저 한다.

본 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

실시예 1

얇게 썬 돼지췌장 1kg에 에테르와 아세톤이 1 : 1인 -20℃의 용액 1L를 가하여 격렬히 교반한 후 4℃, 10,000g에서 15분간 원심분리하여 침전을 얻는다. 이 침전물을 -20℃의 아세톤 500ml로 세척한 후 건조하여 250g의 건조물을 얻는다. 이 건조물에 1L의 물을 가하고 용액을 형성시킨 후 40%의 수산화나트륨 수용액으로 pH 8.0이 되게하고 25℃에서 2시간 방치하여 혼합물의 엘라스타제를 활성화시켰다. 활성화된 혼합물을 청전여과하고 이후의 모든 공정을 4℃에서 진행하였다. 청정여과액에 400g의 폴리에틸렌 글리콜 6,000을 가하여 40%가 되게 한 후 1시간 동안 교반하고 10,000g에서 30분간 원심분리하여 침전물로서 조엘라스타제 함유 생성물을 얻었다.

상기 침전물에 물 1L를 가하고 혼탁시킨후 10,000g에서 30분간 원심분리하여 침전을 얻어내는 과정을 5회 되풀이하여 세척과정을 마친 침전물을 동결건조시켜 160단위/mg인 엘라스타제 결정 1 .5g을 얻었다.

실시예 2

100g의 판크레아틴을 1L의 물로 추출한후 청정여과한 청정여과액에 폴리에틸렌 글리콜 6,000을 가하여 그 농도가 40%되게하고 1시간 동안 교반한 후 10,000g에서 30분간 원심분리하여 침전물로서 조엘라스타제함유생성물을 얻었다.

상기의 침전물에 물 1L을 가하고 혼탁시킨 후 10,000g에서 30분간 원심분리하여 침전을 얻어내는 과정을 5회 되풀이하여 세척과정을 마친 침전물을 동결건조시켜 160단위/mg인 엘라스타제 결정 1 .2g을 얻었다. 상기의 모든 공정은 4℃에서 진행하였다.

Claims (7)

1. 엘라스타제 함유수용액을 폴리에틸렌 글리콜로 처리하여 그 농도를 조절함으로써 엘라스타제를 침전시키고, 침전물을 세척하는 것을 특징으로 하는 엘라스타제의 정제방법.
2. 제1항에 있어서 중합도가 600∼20,000인 폴리에틸렌 글리콜을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제2항에 있어서 중합도가 6,000인 폴리에틸렌 글리콜을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서 폴리에틸렌 글리콜로 처리하여 그 농도가 10∼60%가 되게하는 것을 특징으로 하는방법.
5. 제4항에 있어서 폴리에틸렌 글리콜로 처리하여 그 농도가 40%가 되게하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항에 있어서 침전물을 물로 세척하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항에 있어서 엘라스타제 함유수용액이 돼지췌장으로 부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.

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