KR0184260B1 - 항트롬보 활성을 지닌 황산화 글리코스아미노글리큐로난 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하기 사항을 특징으로 하는 데르마탄 설페이트, 콘드로이틴 설페이트 및 헤파란 설페이트로 구성되는 항트롬보활성을 지닌 설페이트화 글리코사미노클로난에 관한 것이다.

a) 4,000 내지 3,000 달톤의 평균 분자량

b) 2.4 내지 3.0 %의 질소 함량

c) 7.5 내지 9.5 %의 황 함량

d) 9 내지 11 %의 나트륨 함량

e) 5 내지 25 %의 데르마탄 설페이트

f) 9%이하의 콘드로이틴 설페이트 함량

g) 11 내지 20 1μ/mg 의 항-Xa 활성

h) 1 μ/mg 이하의 항트롬빈III 의존 항트롬빈 활성

Description

항트롬보 활성을 지닌 황산화 글리코스아미노글리큐로난

본 발명은 항트롬보 활성을 지닌 황산화 글리코스아미노글리큐로난 및 이것의 제조 방법 및 이것을 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

항트롬보 활성을 지닌 황산화 글리코스아미노글리큐로난은 미국 특허 제 4,438,108 호로부터 공지되어 있다. 상기 특허에서 현재 청구된 생성물은 최소의 출혈작용을 지니는 것으로 가정되는데, 출혈 작용은 그러한 제품들을 인체에 부적합하게 만들기 때문에 상기 생성물은 매우 중요하다. 이 생성물의 출혈 작용은 쥐에서의 근육 출혈 시험 및 모세혈관의 출혈 시험에 의해 측정되었다.

그러나, 이들 시험은 인간에게 있어서 출혈 작용을 예견하기에는 너무 민감도가 떨어지며, 실제로 임상 안전성 연구에서 미국 특허 제 4,438,108 호의 대부분의 생성물은 출혈을 증가시켰으며, 특히 연장된 출혈 시간을 보여주는데, 이는 추가적인 임상개발을 억제할 정도로 충분히 심각하다는 것을 발견하였다. 본 발명가는 한외여과에 의해 헤파린과 본 발명의 생성물을 예비 분리하고, 이온 교환제로부터의 분별 용출 및 메탄올 분별에 의해 본 발명의 생성물을 추가로 정제하면 다른 화학적 조성을 가지며, 또한 출혈 증가 성질에 대해 상당히 개선된 약리학적 및 임상적 프로필을 나타내는 신규의 생성물인 황산화 글리코스아미노글리큐로난의 신규한 제조 방법을 발견하였다.

종래 기술의 생성물과 본 발명의 신규 생성물의 대조되는 주요 물리-화학적인 차이점은 종래 기술의 생성물의 함량에 비해 크게 높아진 7.5 내지 9.5 % 바람직하게는 8.0 내지 8.5 % 의 황함량에 있다. 놀랍게도, 예상되는 것과는 달리 황함량이 높을 수록 출혈의 위험이 감소하였다. 일반적으로, 높은 황함량은 이러한 형태의 화합물의 출혈 위험을 증가시키는 것으로 생각되어왔다(참조예: J.Van Ryn-Mckenna 등의 상이한 황산화도를 갖는 글리코스아미노글리칸의 항트롬보 효과 및 출혈 효과, Br.J.Haem, (1989), 71, 265-269).

더욱이, 신규 생성물은 종래 화합물보다 적은 전신계 부작용을 나타내었다.

본 발명은 데르마탄 설페이트, 콘드로이틴 설페이트 및 헤파란 설페이트의 염류, 바람직하게는 나트륨염으로 구성되는 항트롬보 활성을 지닌 황산화 글리코스아미노글리큐로난에 관한 것으로서 상기 화합물은

a) 평균 분자량이 4000 내지 8000 달톤이고;

b) 질소 함량이 2.4 내지 3.0 %이고;

c) 황함량이 7.5 내지 9.5 %이고;

d) 나트륨 함량이 9 내지 11 %이고;

e) 데르마탄 설페이트 함량이 5 내지 25 %이고;

f) 콘드로이틴 설페이트 함량이 9 %이하이고;

g) 항-Xa 활성이 11 내지 20 μ/mg 이고;

h) 항트롬빈 Ⅲ 의존성 항트롬빈 활성이 1 μ/mg 이하인 것을 특징으로 한다.

상기 생성물의 헤파란 설페이트 성분은 항트롬빈 Ⅲ 에 대해 친화성이 있는 또는 없는 헤파란 설페이트 뿐만아니라 낮은 친화성을 갖는 헤파란 설페이트와 높은 친화성을 갖는 헤파란 설페이트의 혼합물일 수 있다. 10,000 달톤 이상의 분자량을 갖는 황산화 글리코스아미노글리큐로난이 극소량 존재할 수 있다. 신규 생성물을 건강한 젊은 남자에게 단일 투여량을 볼러스형으로 정맥내 주사한 후에 그 출혈위험을 다른 연구에서 개시된 종래의 화합물과 비교하였다. 조사된 주요한 안전성의 파라미터는 Simplate^RⅡ 장치를 사용하되, Simplate^RⅡ 장치를 전완에 압착하여 피부/절단날 접촉을 최대로 하는 것을 포함하는 다소 변경된 기술을 사용하여 얻은 출혈시간의 증가치(△BT)이다. 표 1 에 도시한 결과는 종래 기술 제품의 뱃치와 신규 생성물의 뱃치 사이의 차이점을 보여주는데, 분리 절차를 변경한 결과, 상대적인 글리코스아미노글리큐로난 조성에 따라 평행한 변화를 보인다.

표 1 에서 입증된 바와 같이 임상적 차이 또한 민감한 피하 출혈 시험에 의해 약리학적으로 나타낼 수 있다. 출혈은 임의의 블록 디자인에 대한 분석법을 사용하여 헤모글로빈 농도를 평가함으로써 측정되며, 퍼센트로서, 화합물 투여후의 헤모글로빈 농도의 기하학적 평균 농도 : 담체 투여후의 헤모글로빈 농도의 기하학적 평균 농도 X 100 으로 표시한다. 헤모글로빈 농도는 혈액 손실에 대한 측정치로서, 100, 200, 400 및 800 μ/kg 의 상기 화합물을 쥐에 정맥내 투여함으로써 측정된다. 그 결과를 투여량에 대한 상기 퍼센트의 곡선으로서 나타내었으며, 이후에, 곡선 아래의 면적(AUC)를 계산할 수 있다. 헤파린 USP(참고용), 종래 기술의 생성물인 5 개의 뱃치(A 내지 E) 및 신규 생성물 4 개의 뱃치(Ⅰ 내지 Ⅳ) [실시예 참조]에 대한 AUC 값을 표 2에 나타내었다.

출혈 위험이 크게 감소되었기 때문에 신규의 생성물은 정맥 혈전증, 트롬보-색전증 및 심부 정맥 혈전증의 예방 및 치료에 특히 적합하다. 더욱이, 상기 생성물은 항-알레르기성, 항 염증 및 항-아테롬성 동맥경화 활성을 갖는다.

신규 생성물은 폐, 췌장 또는 장과 같은 포유동물 조직의 자기 분해 또는 단백질 분해(예 : 돼지 췌장으로부터 나온 효소 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 나온 프로테아제와 같은 박테리아 효소)에 의해 얻을 수 있다. 특히 유용한 것은 돼지 흉골간 점막으로, 단백질 분해후 이온 교환제로 처리되고, 이후에 그 이온 교환제를 염수용액, 바람직하게는 염화나트륨 수용액으로 용출시킨다. 헤파란으로부터 생성물을 예비 분리시키기 위하여, 용출액을 상대 분자 질량이 10,000 바람직하게는 약 5,500 달톤인 공칭 컷오프를 지닌 장치에서 염수용액에 대해 한외여과한다. 이후, 수득한 생성물을 이온 교환제에 결합시킨 후, 그 이온 교환제를 염 수용액으로 용출한 뒤, 유기 용매, 통상적으로 알콜(바람직하게는 메탄올)과 같은 물과 혼화 가능한 용매로 침전시킨다. 필요에 따라, 예를 들어 표백, 수산화 나트륨 처리, RNAse 처리, 이염화 망간 처리 및/또는 침전등에 의해 핵산으로 부터 추가 정제한 후, 임의로 과망간산 칼륨 용액으로 처리한다. 침전은 물중에서 메탄올의 양을 점차 증가시키면서 분별 방법으로 실시하는 것이 바람직하다.

신규 생성물은 헤파린 또는 헤파린 분획을 함유하고 있지 않지만, 헤파린을 약학적 투여형태로 가공하는 통상의 방법, 예를 들면 주사하기에 적합하도록 물에 용해하는 방법으로 가공할 수 있으며, 여기에 필요에 따라 약학적 허용 보조제가 첨가된다.

임상 적용은 피하내 또는 정맥내 주사 또는 주입에 의해 행해진다. 다른 투여 방식 예를 들면, 분무 흡입을 통한 폐내의 적용 방법 또는 좌약식 투여 방법 또한 가능하다.

다음 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이다.

[실시예 1]

뱃치 I 의 제법

1. 미정제 생성물의 분리

안정화된 점막을 승온 및 알카리성 pH 에서 단백질 분해 효소에 의해 소화시킨다. 소화시킨 혼합물을, 음이온 교환제로 12-16 시간 동안 처리하며, 음이온 교환제에 활성물질이 결합된다. 결합된 활성 물질을 지닌 이온 교환제를 수도물중의 NaCl 용액으로 용출시킨다. 용출액을 약 10 배로 농축한 뒤, 상대분자 질량이 약 5500 달콘인 공칭 중량 컷오프를 지닌 막이 정착된 한외여과 장치에서 수도물중의 NaCl 5 부피(약2%)에 대해 한외여과시킨다.

이 투과물 및 여과액은 최종 생성물을 함유하며, 분리 절차를 위한 출발물질이다.

투과액 및 여과액을 혼합한 뒤, 수도물로 희석하여 생성물이 이온 교환제에 재흡착하도록 한다. 결합된 활성물질을 지니는 이온 교환제를 수도물로 세척한다. 이온 교환제를 11% NaCl 용액으로 용출시킨다.

소정의 생성물은 메탄올로 분별 침전시킴으로써 얻어지며, 60% 메탄올 및 75% 메탄올 사이에서 침전된다.

세척된 잔류물을 40±5℃에서 감압하에 건조시킨다.

미정제 생성물을 표백시키므로서 핵산을 제거한 후, 60% 내지 75% 메탄올 사이에서 분별 침전시킨다.

2. KMnO정제

수득한 부분적으로 정제된 생성물을 증류수에 용해시킨다.

회수한 수용액을 60℃로 급속 가열한 후, pH 를 9.5로 조절하낟. 과망간산 나트륨용액(40%, w/v)을 상기 뜨거운 용액에 가한후, 그용액을 60℃ 로 1시간 유지시킨다. 이어서, 용액을 20℃ 로 냉각시킨다. 생성된 이산화 망간을 멸균여과기를 사용하여 여과하여 제거한 뒤, 그 여과액의 pH 를 6.0 으로 조절한다. 생성물을 2%(w/w) NaCl 로 침전시킨 후, 75% 및 90% 메탄올로 연속 침전시킨다.

물질을 타이트하게 밀폐시킨 알루미늄 용기에 저장한다.

내역 :

[실시예 2]

돼지 장 점막을 돼지 췌장에서 얻은 단백질 분해 효소로 처리한다. pH 8.5에서 15 시간경과후, 용액을 여과하고, 강 알카리성 이온 교환제와 15 시간 접촉시킨다. 다음에, 이온 교환제를 상기 액체로부터 분리하고, 흡수된 글리코스아미노글리칸을 염화 나트륨 수용액(200g/l)으로 용출시킨다.

용출액을 농축한 후, 5500 달톤에서 공칭 분자량 컷 오프를 지닌 한외여과기를 사용하여 한외여과한다.

투과물-여과액 분획을 합친후, 미정제 글리코스아미노글리칸 혼합물을 강한 염기성 이온 교환제에 재흡착시킨다. 상기 수지를 세척한 후에, 글리코스아미노글리칸을 11% 염화 나트룸으로 용출시킨뒤, 50% 및 75% 의 메탄올을 사용하는 분별 침전에 의해 미정제 생성물을 얻는다. 추가 정제는 메탄올에 의한 분별 침전을 반복하여 실행한 후, pH 10 에서 1% 과산화 수소로의 산화 단계 및 75% 메탄올에 의한 침전에 의해 이루어진다.

[실시예 3]

돼지 장 점막을 35℃ 및 pH 8.2 에서 24 시간 동안 바실러스 서브틸리스로부터의 단백질 분해 효소로 소화시킨다. 여과후, 염기성 이온 교환제에 흡착하고, 20% 염화나트륨 수용액으로 용출한 뒤 50% 내지 75% 사이의 메탄올로 분별 침전하여 미정제 분말을 수득한다. 상기물질을 2% 의 염화 나트륨을 함유하는 물에 재용해시킨 뒤, 공칭 분자량 5500 달톤인 컷 오프를 구비한 여과기를 통하여 한외여과시킨다. 침투물 및 여과액을 합친 뒤, 글리코스아미노글리칸을 음이온 교환제에 흡착시킨다. 세착후, 수지를 11% 염화 나트륨으로 용출시킨다. 이 용출액의 글리코스아미노글리칸 분획을 75% 메탄올로 침전시킨뒤, 실시예 1에 기술한 대로 추가 처리한다.

[실시예 4]

실시예 1에 기술한 방법과 유사한 방법으로 뱃치 Ⅱ 내지 Ⅵ 를 돼지 장 점막의 각기 다른 부분으로부터 제조하였다.

Claims (4)

1. a) 평균 분자량이 4,000 내지 8,000 달톤이고; b) 질소 함량이 2.4 내지 3.0 %이고; c) 황함량이 7.5 내지 9.5 %이고; d) 나트륨 함량이 9 내지 11 %이고; e) 데르마탄 설페이트 함량이 5 내지 25 %이고; f) 콘드로이틴 설페이트 함량이 9 %이하이고; g) 헤파란 설페이트 함량이 66 내지 95% 이고; h) 항-Xa 활성이 11 내지 20 μ/mg 이고; i) 항트롬빈 Ⅲ 의존성 항트롬빈 활성이 1 μ/mg 이하인 것을 특징으로 하는, 데르마탄 설페이트, 콘드로이틴 설페이트 및 헤파란 설페이트의 염을 주성분으로 하는 항 트롬보 활성을 지닌 황산화 글리코스아미노글리큐로난.
2. 인간을 제외한 포유동물의 조직을 효소 분해한뒤 음이온교환제로 처리하고, 이것을 염화 나트륨 수용액으로 용출시킨 후, 그 용출액을 염화 나트륨 수용액에 대해 한외여과하여, 수득한 생성물을 음이온 교환제에 결합시킨 후 이를 염화 나트륨 수용액으로 용출시킨 후 이를 물과 혼화될 수 있는 유기 용매로 침전시키는 것을 특징으로 하는 제1항의 황산화 글리코스아미노글리큐로난의 제조방법.
3. 제2항에 있어서, 돼지 장 점막을 단백질 분해 효소에 의해 소화시키고, 한외여과는 약 5500 달톤의 상대 분자질량의 공칭 컷 오프를 갖는 장치중에서 수행하며, 침전은 물중의 메탄올 함량을 점차 증가시키면서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 약학적 허용 보조제와 제1항의 황산화 글리코스아미노글리큐로난으로 이루어지는 항트롬보 활성을 갖는 약학 조성물.