KR20220147996A - 고순도 헤파린나트륨의 제조방법 - Google Patents
고순도 헤파린나트륨의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 개시는 고순도 헤파린나트륨의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 개시는 식용동물, 바람직하게는 돼지의 장 점막에서 추출한 조품 헤파린에 여러 과정을 거쳐 의약품으로 사용이 가능할 정도의 고순도 헤파린나트륨을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 개시의 제조방법에 따라 제조된 헤파린나트륨은 함량이 180 IU/mg 이상이며, 핵산, 단백질, 더마탄황산, 콘드로이틴황산, 과황산화 콘드로이틴황산 (OSCS, oversulfated chondroitin sulfate), 및 엔도톡신 등의 불순물을 실질적으로 포함하지 않는, 유럽약전 (European Pharmacopeia)에 등재된 규격의 고순도 헤파린나트륨을 제공한다.
Description
본 발명은 헤파린나트륨의 제조방법에 관한 것이다. 특히, 고순도의 헤파린나트륨을 제조하는 방법에 관한 것이다.
헤파린은 동물의 간, 장, 폐, 피부 등에 존재하는 점액성 다당류로 황산화된 D-글루코사민, D-글루쿠론산, L-이두론산 등을 함유하고 있다. 헤파린은 강력한 항 응고 활성을 가지고 있어 범발성 혈관내 응고증 (DIC)의 치료, 다양한 혈전 색전증 (정맥 혈전증, 심근 경색증, 폐색전증, 뇌색전증, 상지 및 하지의 혈전 색전증, 수술 전/후의 색전증)의 치료 및/또는 예방에 사용된다. 헤파린은 또한 혈액 투석, 인공 심장 및 폐 등에 대한 체외 순환 장치 사용, 혈관 카테터 삽입, 수혈, 혈액검사 시에 혈액 응고 방지의 목적으로 사용한다. 상기의 용도 외에도 암, 이식 및 천식과 같은 면역 관련 질환에서 헤파린 유도체가 (잠재적) 약물로 개발되고 있다.
헤파린은 일반적으로 포유류의 동물 조직, 보다 구체적으로는 가축의 도축 부산물인 장점막 조직에서 얻어진다. 다만, BSE (소 해면상 뇌병증) 발병 이후 의약품으로 사용되는 헤파린의 공급원은 돼지 유래의 장점막 조직이 유일하다. 장점막에는 약 0.01% 수준의 헤파린이 포함된 것으로 알려져 있다.
통상 돼지의 소장 점막을 별도로 수집하여 알칼리 또는 산 분해, 가열, 단백질 효소 분해 등의 과정을 통해 장점막에 포함된 헤파린을 분리해 내고, 이온교환 수지 등의 흡착제를 첨가하여 헤파린을 포함한 점액성 다당류 (헤파란황산, 더마탄황산, 콘드로이틴황산)의 복합체로서 추출하여 조품 헤파린 원료를 얻는다. 그 후 추가적인 정제를 통해 의약품으로 사용이 가능한 고순도의 헤파린나트륨을 생산한다.
조품 헤파린은 헤파린 이외에 점액성 다당류, 핵산 불순물 등의 다량의 불순물들이 포함되어 있는데, 원재료 (장점막) 또는 제조방법에 따라 그 함량과 비율이 달라진다.
따라서 본 개시가 해결하고자 하는 과제는 조품 헤파린을 추가적으로 정제하여 불순물이 제거된 고순도 헤파린나트륨, 바람직하게는 의약품용 고순도 헤파린나트륨을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구한 결과, 본 발명자들은 조품 헤파린에 포함된 점액성 다당류 불순물, 핵산 불순물 등을 제거하는 방법으로, 유럽약전 (European Pharmacopeia)에서 정의한 헤파린나트륨(Heparin Sodium)의 규격에 부합하는 원료의약품을 제조하는 발명을 완성하였다.
본 개시에 따른 헤파린나트륨은 통상 포유류 동물 유래, 예를 들면 돼지, 소, 양, 염소 등의 식용동물 소장에서 유래된 점액성 다당류 (Mucopolysaccharide)로부터 유래할 수 있다. 통상 시판되는 조품 헤파린은 돼지의 소장으로부터 점막 세포를 별도로 수집하여 알칼리 또는 산 분해, 가열, 단백질 효소 분해 등의 과정을 통해 장점막에 포함된 헤파린나트륨을 분리해 내고, 이온교환 수지 등의 흡착제를 첨가하여 헤파린을 포함한 점액성 다당류들의 복합체로서 추출하여 건조한 형태이다. 예를 들어, 조품(crude) 헤파린은 특허등록 제10-1447123호에 개시된 방법으로 제조될 수 있다.
이렇게 제조된 조품 헤파린에는 헤파린나트륨 이외에도 헤파란황산 (Heparan sulfate), 더마탄황산 (Dermatan sulfate), 콘드로이틴황산 (Chondroitin sulfate) 등과 같은 점액성 다당류들과 핵산 불순물들 (Nucleotidic impurities)이 다량으로 포함되어 있어 순도가 높지 않고, 결과적으로 의약품으로 사용하기에는 적합하지 않다.
따라서, 본 개시의 일 양태는
(S1) 조품 헤파린에 하나 이상의 셀룰레이즈 계열 효소를 처리하여 점액성 불순물을 분해하는 단계;
(S2) 염을 가하고, 불용성 불순물을 뎁스필터(depth filter)로 여과하여 제거하는 단계;
(S3) 한외여과 공정을 통해 고분자 불순물을 분리하여 제거하는 단계;
(S4) 과산화수소를 처리하여 탈색하는 단계;
(S5) 유기용매를 첨가하여 헤파린을 침전시키고 상층액을 제거하는 방법으로 상층액에 불순물들을 제거하는 단계; 및
(S6) 침전된 헤파린을 회수하는 단계를 포함하는, 헤파린나트륨의 순도를 높이는 제조방법을 제공한다.
본 개시의 제조방법은 선택적으로 (S6) 단계의 결과물을 건조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 개시의 일 양태에 따른 제조방법에 있어, 상기 셀룰레이즈 계열 효소를 처리하는 단계는, 조품 헤파린의 상태에 따라, 조품 헤파린을 염화나트륨 용액에 용해시킨 후 수행될 수 있다.
본 개시의 일 양태에 따른 제조방법에 있어, 상기 셀룰레이즈 계열 효소로는 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 펙티나아제, 및 베타글루코시다제로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상이 단독으로 또는 혼합되어 사용될 수 있다. 이러한 셀룰레이즈 계열 효소를 처리하여 점액성 불순물을 분해할 수 있을 것으로 생각되나, 본 발명은 이러한 이론적 기전에 한정되는 것은 아니다.
본 개시의 일 양태에 따른 제조방법에 있어, 상기 (S2) 단계의 염은 불순물의 용해도를 낮추기 위해 사용된다. 이러한 염으로는 염화칼슘, 탄산나트륨, 아세트산칼슘, 인산나트륨 등이 단독으로 또는 혼합하여 사용될 수 있으며, 본 발명의 여러 목적상 염화칼슘, 탄산나트륨, 또는 이들의 혼합물이 바람직하며, 염화칼슘 및 탄산나트륨을 한꺼번에 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
본 개시의 일 양태에 따른 제조방법에 있어, 상기 뎁스필터 여과의 여과방식 종류는 필터프레스 여과, 진동막필터 여과, 또는 카트리지필터 여과 중에 선택된 하나일 수 있으며, 여과 막의 기공크기 (Pore size)는 바람직하게 0.2 μm~10 μm 범위에서 선택된다. 바람직하게, 본 개시의 제조방법에 있어 상기 뎁스필터 여과는 필터프레스 여과이다.
본 개시의 일 양태에 따른 제조방법에 있어, 상기 뎁스필터 여과 시 여과 필터의 막힘을 방지하기 위해서 규조토, 펄라이트, 석면분 등의 여과보조제, 바람직하게는 규조토를 추가하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 바람직하게, 본 개시의 제조방법에 있어, 상기 뎁스필터 여과는 효소 첨가 전 조품 헤파린 용액 부피의 2-4%(W/V), 바람직하게는 3%(W/V) 규조토를 첨가하여 필터프레스로 여과하는 방식이다.
본 개시의 일 양태에 따른 제조방법에 있어, 상기 한외여과 공정에 사용되는 막의 형태는 판틀형 (Plate-and-frame type), 실관형 (Hollow-fiber type), 나권형 (Sprial-wound type), 관형 (Tubular type) 중에서 선택된 하나일 수 있다. 여과막의 분획분자량 (MWCO, Molecular Weight Cut Off)은 10 kDa ~ 300 kDa일 수 있으며, 바람직하게는 50 kDa ~ 200 kDa일 수 있고, 더욱 바람직하게는 50 kDa ~ 100 kDa의 한외여과 막을 사용할 수 있다.
본 개시의 일 양태에 따른 제조방법에 있어, 상기 과산화수소의 처리는 0.5% ~ 10%(V/V) 농도로 수행될 수 있으며, 바람직한 처리 농도는 1% ~ 5%(V/V)일 수 있다. 더욱 바람직한 농도는 2-4%(V/V)일 수 있다. 과산화수소 처리 시간은 6시간 내지 48시간일 수 있으며, 바람직하게는 12시간 ~ 24시간일 수 있다.
본 개시의 일 양태에 따른 제조방법에 있어, 상기 (S5) 단계에 있어 헤파린을 침전시키기 위해 사용되는 유기용매로는 에탄올, 메탄올, 아세톤 등이 단독으로 또는 혼합되어 사용될 수 있다. 본 개시의 제조방법에 있어, 상기 유기용매로는 에탄올이 바람직하며, 알코올 함량 95%(v/v) 이상인 (발효)주정이 더욱 바람직하다. 또한 헤파린 침전시의 최종 알코올 농도는 20 ~ 60 (v/v)% 범위에서 사용될 수 있으며, 바람직한 알코올 농도는 30 ~ 40 (v/v)%이다.
본 개시의 일 양태에 따른 제조방법에 있어, 상기 건조 방법은 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등에서 선택된 하나일 수 있으며, 바람직하게는 원료의 성분 변화가 적은 동결건조 방법이 사용될 수 있다.
본 개시의 제조방법에 따라 생산된 헤파린나트륨의 함량은 유럽약전 (European Pharmacopeia) ‘헤파린나트륨 (Heparin Sodium)’의 분석법에 따라 Factor IIa 억제역가 (Anti-factor IIa activity)로 측정한다. 본 명세서에서 헤파린나트륨의 함량은 상기 유럽약전의 ‘헤파린나트륨’에서 정의하는 건조물로서 180 IU/mg 이상이며, Factor Xa 억제역가 : Factor IIa 억제역가 비율은 0.9~1.1로 측정된다.
본 개시에 따른 헤파린나트륨 제조방법은 조품 헤파린으로부터 고순도의 원료의약품이 생산될 수 있도록 보장한다. 따라서 본 개시는 헤파린나륨의 함량이 180 IU/mg 이상, 바람직하게는 200(±20) IU/mg의 함량을 갖는 고순도의 원료의약품을 제조하는 방법을 제공한다.
본 개시에 따른 헤파린나트륨은 하기의 표 1의 불순물 항목들에 대해 유럽약전에서 정의한 ‘헤파린나트륨’의 허용 기준을 만족한다.
| 항목 | 시험방법 | 기준 |
| Nucleotidic impurities | 260 nm 흡광도 측정 | 0.15 이하 |
| 단백질 | 단백질 정량법 | 0.5% 이하 |
| 더마탄황산과 콘드로이틴황산의 합 | HPLC 분석 | 2.0% 이하 |
| 미지유연물질 | HPLC 분석 | 더마탄황산과 콘드로이틴황산으로 인한 피크 이외의 피크가 없음 |
| 엔도톡신 | LAL 시험법 | 0.01 IU/Unit 미만 |
본 개시는 고순도 헤파린나트륨을 산업적 수준에서 생산 가능한 헤파린나트륨 제조방법을 제공한다. 본 개시의 제조방법에 따라 제조된 헤파린나트륨은 핵산, 단백질, 더마탄황산, 콘드로이틴황산, 과황산화 콘드로이틴황산 (OSCS, OverSulfated Chondroitin Sulfate), 엔도톡신 등의 불순물을 실질적으로 포함하지 않고, 함량이 180 IU/mg 이상인 고순도이다. 따라서 본 개시의 제조방법으로 제조된 헤파린나트륨은 원료의약품으로 다양한 종류의 헤파린나트륨 제제에 안전하게 사용 가능하다.
본 명세서에 첨부되는 다음의 도면들은 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하는 것이며, 전술한 발명의 내용과 함께 본 발명의 기술사상을 더욱 이해시키는 역할을 하는 것이므로, 본 발명은 그러한 도면에 기재된 사항에만 한정되어 해석되어서는 아니 된다.
도 1은 본 발명의 일 양태에 따른 고순도 헤파린나트륨을 제조하는 방법을 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 2는 헤파린나트륨을 HPLC로 분석한 결과를 나타낸 도면이다. A)는 헤파린나트륨 유럽약전 (European Pharmacopeia) 참조 표준품 (Reference standard)을 HPLC로 분석한 결과이며, B)는 실시예 1에 따라 제조한 헤파린나트륨을 HPLC로 분석한 결과이다. 실험 결과 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 헤파린나트륨이 헤파린나트륨 표준 물질과 동일한 것으로 확인되었다.
도 1은 본 발명의 일 양태에 따른 고순도 헤파린나트륨을 제조하는 방법을 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 2는 헤파린나트륨을 HPLC로 분석한 결과를 나타낸 도면이다. A)는 헤파린나트륨 유럽약전 (European Pharmacopeia) 참조 표준품 (Reference standard)을 HPLC로 분석한 결과이며, B)는 실시예 1에 따라 제조한 헤파린나트륨을 HPLC로 분석한 결과이다. 실험 결과 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 헤파린나트륨이 헤파린나트륨 표준 물질과 동일한 것으로 확인되었다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 본 발명이 속한 분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1 > 헤파린나트륨 제조
1. 효소 분해 단계
본 발명에서 헤파린나트륨 생산에 사용한 조품 헤파린은 국내산 돼지의 장 점막에서 추출한 ㈜우리비앤비 사의 조품 헤파린으로, 하기의 표 2의 규격을 만족하는 원료이었다.
| 항목 | 기준 |
| 건조감량(Loss on drying) | 10% 이하 |
| NMR | 2.15 ppm에서 OSCS로 인한 밴드가 관찰되지 않음 |
| 중금속(Heavy metals) | 50 ppm 이하 |
| 황화회분(Sulphated ash) | 30~50% |
| PCR | 돼지 유전자 검출됨 소 유전자 검출안됨 양 유전자 검출안됨 염소 유전자 검출안됨 |
| 함량(Potency) | 70 IU/mg 이상 |
조품 헤파린 800 g에 정제수 4 L와 염화나트륨 60 g을 가하여 완전히 용해시킨 후, 스미자임 AC(Sumizyme ACTM, 셀룰라아제, 비전바이오켐), 플란타아제 CP(Plantase CPTM, 펙티나아제, 비전바이오켐), 또는 플란타아제 PT(Plantase PTTM, 펙티나아제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제 등 복합효소활성, 비전바이오켐)를 8 g 첨가하고, 염산으로 pH 4.0로 조정한 후, 50±5℃에서 4시간 동안 가열하여 효소 반응을 수행하였다. 상기에서 효소들을 처리하여 조품 헤파린에 포함된 점액성 물질들을 분해시킨 결과, 조품 헤파린 용해액의 600 nm 탁도 변화와 회전점도 변화, 헤파린 함량 변화를 등을 하기의 표 3에 정리하였다.
| 조품 헤파린 용액 | 효소 처리한 조품 헤파린 용액 | |||
| 스미자임 AC | 플란타제 CP | 플란타제 PT | ||
| 탁도 (600 nm) | 2.274 | 1.703 | 1.695 | 1.689 |
| 회전점도 | 52.0 cP | 25.8 cP | 26.9cP | 23.2 cP |
| 헤파린 함량 (Anti-Factor IIa) |
93 IU/mg | 91 IU/mg | 89 IU/mg | 94 IU/mg |
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 효소를 처리한 조품 헤파린 용액은 모두 탁도와 회전점도의 감소가 확인되어 점액성 불순물이 분해된 결과를 확인할 수 있었다. 반면에 헤파린 함량 변화는 거의 없어, 효소 처리로 인한 헤파린 분해 현상은 발생하지 않은 것으로 확인되었다. 본 발명에 사용한 3종의 효소 제품들 중, 플란타아제 PT를 처리한 조품 헤파린 용액의 탁도 개선 정도와 회전점도 감소 효과가 가장 우수하여 이후 실시예에서는 플란타아제 PT를 점액성 불순물을 분해하는 효소로 사용하였다.
2. 불용성 불순물 여과 단계
1 단계에서 수득한 조품 헤파린 용액을 수산화나트륨으로 pH 9.5로 조절하고, 염화칼슘 1.5%(W/V)를 첨가하여 완전히 용해시킨 후, 80℃에서 120분 동안 가열하였다. 이후 온도를 25℃로 낮추고 탄산나트륨 1.5%(W/V)를 첨가하여 완전히 용해시킨 후, 조품 헤파린 용액 부피의 3%(W/V) 규조토를 넣고 뎁스필터를 장착한 필터프레스로 여과하여 불용성 불순물을 제거한 용액을 얻었다.
3. 한외여과 단계
2 단계에서 수득한 조품 헤파린 용액을 분획분자량(MWCO, Molecular weight cut off)이 100 kDa인 한외여과막을 이용하여 1/2 부피까지 농축시키면서 여과막을 통과한 조품 헤파린 용액을 받아내었다. 여기에 정제수를 가하여 일정한 부피를 유지시키면서 한외여과를 실시하여 최초의 조품 헤파린 용액 부피의 2배가 될 때까지 여과막을 통과한 조품 헤파린 용액을 받아내었다.
4. 탈색 및 헤파린 침전 단계
3 단계에서 수득한 조품 헤파린 용액을 수산화나트륨으로 pH 10.2으로 조절한 후, 30% 과산화수소 용액을 이용하여 최종 농도 3%(V/V)가 되도록 과산화수소를 가하고 12~15시간 동안 서서히 교반하며 탈색 반응을 수행하였다. 이후 탈색한 조품 헤파린 용액을 염산으로 pH 6.2로 조절한 후, 서서히 교반하면서 95% 에탄올을 조품 헤파린 용액의 80% 부피로 첨가하고, 교반기를 중지하고 2시간 동안 정치시켰다. 이후, 바닥의 헤파린 침전물이 딸려오지 않도록 조심하여 상층액을 제거하였다. 헤파린 침전물에 정제수 2.5 L와 염화나트륨 30 g을 가하여 완전히 용해시킨 후, 과산화수소를 이용한 탈색 반응과, 95% 에탄올을 이용한 헤파린 침전 단계를 추가로 2회 반복 수행하였다.
5. 건조
4 단계에서 최종적으로 얻어진 헤파린 침전물에 정제수 1.0 L를 가하여 완전히 용해시킨 후, 동결건조기로 건조시켜 헤파린나트륨을 얻었다.
<비교예 1>
실시예 1의 효소를 이용한 점액성 물질 분해 및 한외여과를 제외하고는 모든 공정을 동일하게 수행하여 헤파린나트륨을 얻었다.
<비교예 2>
실시예 1의 한외여과 공정을 수행하지 않았다는 것을 제외하고는 모든 공정을 동일하게 수행하여 헤파린나트륨을 얻었다.
하기 표 4는 실시예 1과 비교예1 및 비교예 2의 제조공정을 통해 수득된 헤파린나트륨을 유럽약전에서 정의한 헤파린나트륨 분석법에 따라 측정한 결과를 비교하고 있다. 표 4의 결과로부터 효소분해와 한외여과를 둘 다 수행하는 것이 조품 헤파린에 포함된 불순물들을 제거하고 헤파린나트륨을 생산하는데 효과적임을 확인할 수 있었다.
| 항목 | 기준 | 실시예 1 | 비교예 1 | 비교예 2 |
| Nucleotidic impurities | 0.15 이하 | 0.060 | 5.380 | 0.075 |
| 단백질 | 0.5% 이하 | 0.1% | 0.1% | 0.1% |
| 더마탄황산과 콘드로이틴황산의 합 | 2.0% 이하 | 1.0% | 48.5% | 2.54 |
| 미지유연물질 | 더마탄황산과 콘드로이틴황산으로 인한 피크 이외의 피크가 없음 | 없음 | 없음 | 없음 |
| 엔도톡신 | 0.01 IU/Unit 미만 | 0.01 IU/Unit 미만 | 0.01 IU/Unit 미만 | 0.01 IU/Unit 미만 |
| 함량 | 180 IU/mg 이상 | 204 IU/mg | 135 IU/mg | 187 IU/mg |
Claims (7)
- (S1) 조품 헤파린에 하나 이상의 셀룰레이즈 계열 효소를 처리하여 점액성 불순물을 분해하는 단계;
(S2) 염을 가하고, 불용성 불순물을 뎁스필터(depth filter)로 여과하여 제거하는 단계;
(S3) 한외여과 공정을 통해 고분자 불순물을 분리하여 제거하는 단계;
(S4) 과산화수소를 처리하여 탈색하는 단계;
(S5) 유기용매를 첨가하여 헤파린을 침전시키고 상층액을 제거하는 방법으로 상층액에 불순물들을 제거하는 단계; 및
(S6) 침전된 헤파린을 회수하는 단계를 포함하는,
헤파린나트륨의 순도를 높이는 제조방법. - 제1항에 있어서, 상기 셀룰레이즈 계열 효소는 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 펙티나아제, 및 베타글루코시다제로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인, 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 염은 염화칼슘 및 탄산나트륨을 포함하는, 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 뎁스필터 여과는 효소 첨가 전 조품 헤파린 용액 부피의 2-4%(W/V) 규조토를 첨가하여 필터프레스로 여과하는 방식인, 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 한외여과 공정은 분획분자량(MWCO, Molecular weight cut off)이 50-100 kDa인, 제조방법.
- 제1항에 있어서, 과산화수소 처리 농도는 2-4%(V/V)인, 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (S5) 단계의 유기용매는 알코올 함량 95% 이상인 발효주정이며, 헤파린 침전 시의 최종 알코올 농도가 30 ~ 40 (v/v)% 범위인, 제조방법.
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|---|---|---|---|---|
| KR101447123B1 (ko) | 2014-02-27 | 2014-10-06 | 박상협 | 헤파린의 추출 방법 |
| KR101847846B1 (ko) | 2010-09-14 | 2018-04-11 | 고쿠리츠 다이가쿠 호징 미야자키 다이가쿠 | 고순도 헤파린 및 그 제조방법 |
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- 2021-04-28 KR KR1020210055197A patent/KR20220147996A/ko active Search and Examination
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