KR102531611B1 - 고순도 dna 단편 혼합물의 제조 방법 - Google Patents
고순도 dna 단편 혼합물의 제조 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102531611B1 KR102531611B1 KR1020220130968A KR20220130968A KR102531611B1 KR 102531611 B1 KR102531611 B1 KR 102531611B1 KR 1020220130968 A KR1020220130968 A KR 1020220130968A KR 20220130968 A KR20220130968 A KR 20220130968A KR 102531611 B1 KR102531611 B1 KR 102531611B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- milt
- dna fragment
- fragment mixture
- solution
- purity
- Prior art date
Links
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 50
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 44
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 9
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 62
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 42
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 29
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 24
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 56
- 101100345609 Drosophila melanogaster milt gene Proteins 0.000 claims description 50
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 40
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 23
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 20
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 19
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 17
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 12
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 claims description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 8
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 claims description 5
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 4
- -1 moisture Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 20
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 17
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 17
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 4
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 239000013585 weight reducing agent Substances 0.000 description 4
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 241000277331 Salmonidae Species 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 241000282461 Canis lupus Species 0.000 description 1
- MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N N-[1-oxo-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propan-2-yl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(C(C)NC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 210000000629 knee joint Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000002346 musculoskeletal system Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000004260 weight control Methods 0.000 description 1
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
본 발명은 이소프로판올 및 염화 마그네슘을 이용하는 고순도 DNA 단편 혼합물의 제조 방법에 관한 것으로, 이소프로판올을 이용하여 수분, 혈액, 지방과 같은 불순물을 효과적으로 제거하고 DNA 단편 혼합물의 순도를 높이고, 염화 마그네슘을 이용하여 비교적 좁은 범위인 1,000 내지 10,000 KDa의 분자량을 갖는 DNA 단편 혼합물을 제조할 수 있다.
Description
본 발명은 DNA 단편 혼합물의 제조 방법에 관한 것으로, 이소프로판올 및 염화 마그네슘을 이용하는 고순도 DNA 단편 혼합물의 제조 방법에 관한 것이다.
뉴클레오타이드(nucleotide)는 DNA와 RNA와 같은 핵산을 구성하는 구조적 단위로, 10 이상의 뉴클레오타이드가 결합되어 중합체를 형성하고 있는 것을 폴리뉴클레오타이드 (polynucleotide, PN)라고 지칭한다. 또한, 뉴클레오타이드는 하나의 5탄당, 하나의 인산, 및 하나의 염기(아데닌, 구아닌, 티민, 또는 사이토신)의 결합으로 구성되어 있는데, 송어 또는 연어의 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드를 구성하는 조합의 균형이 사람과 96.5% 일치한다. 이러한 높은 유사도는 버려지는 핵산 없이 모두 사용될 수 있다는 점에서 큰 의미가 있다.
한편, DNA 단편 혼합물은 DNA가 분자량이 저감된 단편 형태의 상태로 혼합되어 존재하는 것으로, 세포의 필수 구성성분들이므로, 상처부위, 근골격, 또는 관절, 무릎, 관절강 등에 주입함으로써 기계적 마찰과 통증을 완화해 주는 등 상처 부위의 치료 및 개선 등을 목적으로 하는 의료기기와 의약품으로 활용하거나 세포활성과 관련된 주름 개선 등을 목적으로 하는 화장품, 식품첨가물, 생화학 실험재료 등으로 활용하는 등, 그 용도가 다양하여 가치가 높아지고 있다.
종래의 DNA 단편 혼합물 제조 방법으로는, 국내 등록특허 공보 제 10-390529 호에서 한외여과막을 이용하여 핵산을 추출하는 방법을 개시하고 있으나, RNA, 단백질, 지방, 수분 등의 불순물을 효과적으로 제거할 수 없어 순도가 높은 핵산을 추출하기가 어렵다는 단점이 있다. 또한, 국내 공개특허 공보 제 10-2019-0065676 호에서는 pH를 조절하여 DNA 분자량을 저감하는 방법을 개시하고 있으나, 강산 및 강염기를 사용하여 공정이 까다롭고 위험하다는 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 불순물은 효과적으로 제거하면서 안전하게 DNA 분자량 저감하는 고순도 DAN 단편 혼합물의 제조 방법을 연구하던 중, 이소프로판올을 이용하여 이리의 불순물을 제거하고 염화 마그네슘을 이용하여 DNA 단편 혼합하여 제조 시, 수율 및 순도가 높으면서 안전하게 DNA 분자량을 저감할 수 있다는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 고순도 DNA 단편 혼합물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 고순도 DNA 단편 혼합물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
(1 단계) 이리에 이소프로판올을 처리하여, 불순물이 제거된 이리를 얻는 단계;
(2 단계) 상기 불순물이 제거된 이리를 염화 나트륨 수용액에 첨가하여 처리하는 단계;
(3 단계) 이리가 포함된 염화 나트륨 수용액에 로릴 황산 나트륨 수용액을 첨가하여, 세포 분해 및 핵산 추출된 1차 이리 용해액를 얻는 단계;
(4 단계) 상기 1차 이리 용해액을 에탄올로 침전하고, 침전물을 분리하여 2차 이리 용해액을 얻는 단계;
(5 단계) 상기 2차 이리 용해액에 염화 나트륨을 첨가하고, 80 내지 100 ℃의 고온에서 1차 바이러스 불활화 하는 단계;
(6 단계) 1차 바이러스 불활화 된 이리 용해액에 염화 마그네슘을 첨가하여 핵산 분자량이 저감된 DNA 단편 혼합물을 얻는 단계; 및
(7 단계) 상기 핵산 분자량이 저감된 DNA 단편 혼합물에 에탄올 처리하여 2차 바이러스 불활화한 후, 침전물을 얻는 단계;를 포함하는, 고순도 DNA 단편 혼합물의 제조방법을 제공한다.
아울러, 상기의 제조 방법으로 제조된 고순도 DNA 단편 혼합물을 제공한다.
본 발명에 따른 고순도 DNA 단편 혼합물의 제조방법은 이소프로판올을 이용하여 수분, 혈액, 지방과 같은 불순물을 효과적으로 제거하고 DNA 단편 혼합물의 순도를 높이고, 염화 마그네슘을 이용하여 비교적 좁은 범위인 1,000 내지 10,000 KDa의 분자량을 갖는 DNA 단편 혼합물을 제조할 수 있다는 효과를 가진다.
도 1은 전처리 방법에 따라 제조된 DNA 단편 혼합물의 투명도를 비교하여 나타낸 사진이다.
도 2는 핵산 분자량 저감 방법에 따른 분자 저감 효과를 비교하여 나타낸 것이다.
도 3은 염화 마그네슘 처리 시간에 따른 분자 저감 효과를 비교하여 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 1 및 대조군(HTL 사의 PN)의 분자량을 비교하여 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 1 내지 3 및 대조군의 GPC 분석 결과를 비교하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 1 및 대조군의 점탄성을 비교하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 핵산 분자량 저감 방법에 따른 분자 저감 효과를 비교하여 나타낸 것이다.
도 3은 염화 마그네슘 처리 시간에 따른 분자 저감 효과를 비교하여 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 1 및 대조군(HTL 사의 PN)의 분자량을 비교하여 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 1 내지 3 및 대조군의 GPC 분석 결과를 비교하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 1 및 대조군의 점탄성을 비교하여 그래프로 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면은,
(1 단계) 이리에 이소프로판올을 처리하여, 불순물이 제거된 이리를 얻는 단계;
(2 단계) 상기 불순물이 제거된 이리를 염화 나트륨 수용액에 첨가하여 처리하는 단계;
(3 단계) 이리가 포함된 염화 나트륨 수용액에 로릴 황산 나트륨 수용액을 첨가하여, 세포 분해 및 핵산 추출된 1차 이리 용해액를 얻는 단계;
(4 단계) 상기 1차 이리 용해액을 에탄올로 침전하고, 침전물을 분리하여 2차 이리 용해액을 얻는 단계;
(5 단계) 상기 2차 이리 용해액에 염화 나트륨을 첨가하고, 80 내지 100 ℃의 고온에서 1차 바이러스 불활화 하는 단계;
(6 단계) 1차 바이러스 불활화 된 이리 용해액에 염화 마그네슘을 첨가하여 핵산 분자량이 저감된 DNA 단편 혼합물을 얻는 단계; 및
(7 단계) 상기 핵산 분자량이 저감된 DNA 단편 혼합물에 에탄올 처리하여 2차 바이러스 불활화한 후, 침전물을 얻는 단계;를 포함하는, 고순도 DNA 단편 혼합물의 제조방법을 제공한다.
상기 1 단계에서 불순물 제거는 이리에 이소프로판올을 첨가하고 이리 및 이소프로판올 혼합물을 분쇄하여, 5 내지 30분간 방치한 다음, 이리 분쇄물과 이소프로판올을 분리하는 것이다.
상기 이소프로판올은 이리 중량 대비 3 내지 6 배일 수 있고, 바람직하게는 4 내지 5 배이고, 더욱 바람직하게는 5 배이다.
상기 이리는 송어 또는 연어의 이리일 수 있고, 바람직하게는 연어의 이리이다.
상기 2 단계 및 3 단계는 세포의 분해 및 핵산의 추출이 진행되는 단계이다. 본 발명은 2 단계에서 열 처리 방법을 통해 고온으로 세포를 분해하고 염화 나트륨을 이용하여 핵산을 추출한다. 또한, 3 단계에서 로릴 황산 나트륨을 이용하여 2 단계에서 분해 되지 않은 세포를 분해할 뿐만 아니라 지방 및 단백질을 포함하는 불순물을 추가적으로 제거한다.
보다 구체적으로, 상기 2 단계는 불순물이 제거된 이리에 20 내지 50 중량% 농도의 염화 나트륨 수용액을 첨가한 후, 90 내지 100 ℃의 온도에서 1 내지 4시간 동안 처리한 다음, 60 내지 65 ℃의 온도까지 냉각하는 것이다. 바람직하게는, 25 내지 35 중량% 농도의 염화 나트륨 수용액을 첨가한 후, 95 내지 100 ℃의 온도에서 1 내지 2시간 동안 처리하는 것이다.
상기 3 단계는 이리가 포함된 염화 나트륨 수용액에 10 내지 20 중량% 로릴 황산 나트륨 수용액을 최종 농도가 0.5 내지 2 중량% 되도록 첨가하고, 10 내지 30 ℃에서 20 내지 40분 동안 처리하는 것이다. 바람직하게는, 로릴 황산 나트륨 수용액의 최종 농도가 1 내지 1.5 중량% 되도록 첨가하는 것이다.
상기 4 단계는 1차 이리 용해액을 최종 농도가 50 내지 80% 되도록 에탄올을 첨가하여 침전하고, 침전물을 분리하여 2차 이리 용해액을 얻는 것이다.
보다 구체적으로, 1차 이리 용해액을 50 내지 10 μm 포어사이즈 필터로 여과 후, 여과액에 최종 농도가 50 내지 80% 되게끔 에탄올을 첨가하고 20분 방치하여 침전물을 분리한다. 그 다음 상기 침전물을 증류수에 용해하여, 2차 이리 용해액을 얻는다.
상기 5 단계의 1차 바이러스 불활화는 염화 나트륨을 최종 농도가 0.5 내지 2 M이 되도록 첨가하고, 80 내지 100 ℃의 고온에서 12 내지 20시간 동안 처리하는 것이다. 바람직하게는, 염화 나트륨을 최종 농도가 0.7 내지 1.5 M이 되도록 첨가하고, 80 내지 90 ℃의 고온에서 처리할 수 있다.
상기 6 단계는 염화 마그네슘의 최종 농도가 10 내지 30 mM 이 되도록 염화 마그네슘을 첨가하고, 80 내지 100 ℃에서 2 내지 5시간 처리하는 것이다. 바람직하게는, 염화 마그네슘의 최종 농도가 15 내지 35 mM 이 되도록 첨가하고, 80 내지 90 ℃의 고온에서 처리할 수 있다.
상기 6단계에서 염화 마그네슘은 핵산을 분해하여 DNA 단편의 분자량을 저감시킨다.
상기 7 단계는 50 내지 80% 에탄올을 첨가하여 12 내지 20 시간 동안 처리하여 수행하는 것이다.
구체적으로, 최종 농도가 50 ~ 80% 되게끔 에탄올을 첨가한 후 10 내지 30분 동안 방치하여 침전물을 분리한 다음, 상기 침전물에 50 내지 80 % 에탄올을 첨가하여 12 내지 20 시간 동안 처리하여 수행하는 것이다. 바람직하게는, 60 내지 75 % 에탄올을 첨가하여 15 내지 16 시간 동안 처리할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기의 방법으로 제조된 고순도 DNA 단편 혼합물을 제공한다.
상기 DNA 단편은 1,000 내지 10,000 KDa 분자량인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, “DNA 단편 혼합물”는 PN(polynucleotide) 또는 PDRN(polydeoxyribonucleotide)를 의미하며, 바람직하게는 PN이다.
본 발명에 있어서, “불순물”은 이리의 혈액, 수분, 및 세포 분해로 인해 용출되는 단백질, 지방, 엔도톡신(endotoxin) 등을 포함한다.
본 발명에 있어서, “처리”는 침지 또는 교반하는 것을 의미한다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1> 고순도 DNA 단편 혼합물의 제조 1
하기의 단계에 따라 고순도 DNA 단편 혼합물을 제조하였다.
(1 단계) 냉동된 연어 이리 200 g을 해동한 후, 핏줄, 혈액, 알, 기타 내장을 제거하였다. 이리 무개의 5 배에 해당하는 이소프로판올을 첨가하여 믹서기로 분쇄 후, 10 분간 방치하였다. 이후 원심분리 및 필터를 이용하여 이리분쇄물과 이소프로판올을 분리하였다.
(2 단계) 상기 1 단계의 분쇄물에 멸균 증류수를 첨가하여 교반한 후, 30 % 염화나트륨 첨가하고95 ℃에서 1시간 동안 천천히 교반하였다. 그 다음, 60~65 ℃로 냉각하였다.
(3 단계) 이리가 포함된 염화 나트륨 수용액에 로릴 황산 나트륨을 최종 농도가 1 % 되도록 첨가하고 30분동안 천천히 교반하였다.
(4 단계) 상기 3 단계의 용해액을 50 내지 10 마이크로미터 포어사이즈 필터로 여과한 후, 여과액에 최종 농도가 50 내지 80%가 되도록 에탄올을 첨가하고 20분 동안 방치하였다. 방치 후 수득한 침전물에 50 ~ 80% 에탄올을 투입하고 천천히 교반하여 세척한다. 세척 후, 95% 에탄올에서 침전물의 탈수를 진행하고 열풍건조기 (55 ℃) 또는 진공건조기(45 ℃, - 0.09 내지 -0.1 Mpa)를 이용하여 건조하였다. 그 다음, 건조물을 최종 농도가 1 내지 3 %가 되도록 멸균 증류수에 완전 용해하였다.
(5 단계) 상기 4 단계의 용해액을 1~ 0.5 마이크로미터 필터로 여과 후, 염화 나트륨의 최종 농도가 1 M이 되도록 첨가하였고, 85 ℃에서 16시간 천천히 교반하였다.
(6 단계) 상기 5 단계의 용해액에 염화 마그네슘의 최종 농도가 20mM 이 되도록 첨가하였고, 85 ℃에서 3시간 30분 천천히 교반하였다.
(7 단계) 상기 6 단계의 용해액을 0.22 마이크로미터 포어사이즈 필터로 제균 여과하였다. 여과액에 최종 농도가 70 %이 되도록 에탄올을 첨가하고 20분 방치하여, 침전물을 수득하였다. 침전물에 70% 에탄올을 첨가하고 16 시간 동안 천천히 교반하여 세척하였다.
(8 단계) 상기 7단계에서 세척한 침전물에 95 % 에탄올을 첨가 후, 천천히 10분간 교반하여 탈수한 후, 열풍건조기 (55 ℃) 또는 진공건조기(45 ℃, - 0.09 내지 -0.1 Mpa)를 이용하여 건조하여, 1,000 ~ 10,000 KDa 분자량의 고순도 DNA 단편 혼합물을 제조하였다.
<
실시예
2> 고순도 DNA 단편 혼합물의 제조 2
상기 실시예 1의 (6 단계)에서 염화 마그네슘 처리를 85 ℃에서 2시간 동안 수행하는 것 외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 고순도 DNA 단편 혼합물을 제조하였다.
<
실시예
3> 고순도 DNA 단편 혼합물의 제조 3
상기 실시예 1의 (6 단계)에서 염화 마그네슘 처리를 85 ℃에서 1시간 동안 수행하는 것 외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 고순도 DNA 단편 혼합물을 제조하였다.
<
비교예
1>
상기 실시예 1의 (1 단계)에서 이소프로판올 대신 증류수를 첨가한 것 외에는, 상기 실시예와 동일한 방법으로 DNA 단편을 제조하였다.
<
비교예
2>
상기 실시예 1의 (1 단계)에서 이소프로판올을 첨가하지 않는 것 외에는, 상기 실시예와 동일한 방법으로 DNA 단편을 제조하였다.
<
비교예
3>
상기 실시예 1의 (6 단계)에서 염화 마그네슘 첨가 대신 100 ℃에서 열 처리 한 것 외에는, 상기 실시예와 동일한 방법으로 DNA 단편을 제조하였다.
<
비교예
4>
상기 실시예 1의 (6 단계)에서 염화 마그네슘 첨가 대신 0.4 % 농도의 SDS를 첨가한 것 외에는, 상기 실시예와 동일한 방법으로 DNA 단편을 제조하였다.
<
비교예
5>
상기 실시예 1의 (6 단계)에서 염화 마그네슘 첨가 대신 pH를 pH 4로 조절하여 85 ℃에서 20분 동안 처리한 것 외에는, 상기 실시예와 동일한 방법으로 DNA 단편을 제조하였다.
<
실험예
1> 이리의 불순물 제거 방법에 따른 탁도 및 순도 비교
이리의 불순물 제거 방법이 각각 상이한 이소프로판올을 첨가한 실시예, 증류수를 첨가한 비교예 1, 및 아무것도 첨가하지 않은 비교예 2에 대하여, 불순물 제거 방법에 따른 탁도 및 순도를 비교하였다.
각각의 이리의 불순물 제거 방법에 따라 제조된 PN 1 g을 100 ml 멸균 증류수에 수화하여 탁도를 비교한 결과(도 1), 이소프로판올을 첨가한 실시예가 가장 투명하였다. 반면, 증류수를 첨가한 비교예 1 및 아무것도 첨가하지 않은 비교예 2는 불투명한 흰색을 띄었으며, 특히 비교예 2가 가장 불투명하였다. 따라서, 탁도 비교를 통해, 이소프로판올을 이용하는 본 발명의 DNA 단편 혼합물 제조방법이 가장 우수한 이리 불순물 제거 효과를 가짐을 확인하였다.
| absorbance | 실시예 1 | 비교예 1 | 비교예 2 |
| 600nm | 0.0034 | 0.0600 | 0.8300 |
| 280nm | 0.5704 | 0.6704 | 0.3704 |
| 260nm | 1.0340 | 1.1340 | 0.6034 |
| 230nm | 0.4825 | 0.4925 | 0.2925 |
| 260/280 | 1.81 | 1.69 | 1.63 |
| 260/230 | 2.14 | 2.30 | 2.06 |
상기 표 1과 같이, 각각의 이리의 불순물 제거 방법에 따라 제조된 PN 1 g을 100 ml 멸균 증류수에 수화하여 순도를 비교한 결과, 실시예 1의 A260/280 값이 1.8 내지 1.9 이고, A260/230 값이 2.0 내지 2.2 이므로, 순도가 가장 우수한 순도를 가진다는 것을 확인하였다.
<
실험예
2> 이리의 불순물 제거 방법에 따른
PN의
수율 비교
이리의 불순물 제거 방법이 각각 상이한 이소프로판올을 첨가한 실시예, 증류수를 첨가한 비교예 1, 및 아무것도 첨가하지 않은 비교예 2에 대하여, 불순물 제거 방법에 따른 PN의 수율을 비교하였다.
| 최종 PN의 수율 | |
| 실시예 | 6% (12 g) |
| 비교예 1 | 4% (8 g) |
| 비교예 2 | 4% (8 g) |
그 결과, 상기 표 2에서 이리의 불순물 제거 방법에 따른 최종 PN 수율을 나타낸 것과 같이, 이소프로판올을 첨가한 실시예의 PN 수율이 6%로 가장 높다는 것을 확인하였다.
<
실험예
3> 핵산 분자
저감
방법에 따른 분자
저감
효과 비교
핵산 분자 저감 방법이 각각 상이한 염화 마그네슘을 이용한 실시예, 열 처리한 비교예 3, SDS를 이용한 비교예 4, 및 pH 조절 처리한 비교예 5에 대하여, 각각의 방법으로 제조된 PN의 분자량를 전기영동분석법을 이용하여 분자 저감 효과를 비교하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 염화 마그네슘을 이용하였을 때, 가장 우수한 분자 저감 효과가 나타났으며, 비교예 3 내지 5은 분자 저감 효과가 나타나지 않거나 실시예보다 상대적으로 낮은 효과를 나타내었다. 따라서, 염화 마그네슘을 이용하는 본 발명의 DNA 단편 혼합물 제조방법이 가장 우수한 분자 저감 효과를 가지므로, 1,000 내지 10,000 KDa의 분자량을 갖는 DNA 단편 혼합물을 제조하는 데 사용할 수 있음을 확인하였다.
<
실험예
4>
염화 마그네슘
처리 시간에 따른 분자
저감
효과 비교
상기 실험예 3에서, 염화 마그네슘 처리 방법이 가장 우수한 DNA 분자량 저감 효과를 가진다는 것을 확인하였다. 이에, 염화 마그네슘 처리 시간에 따른 DNA 분자량 저감 효과를 추가적으로 확인하였다. 비교를 위해 염화 마그네슘 처리를 각각 1 시간(실시예 3), 2 시간(실시예 2), 및 3시간 30분(실시예 3) 수행하였으며, 대조군으로는 HTL사의 PN을 사용하였다.
그 결과, 도 3 및 도 4에서 나타낸 바와 같이, 염화 마그네슘 처리 시간이 길어질수록, DNA 분자량 저감 효과가 더욱 우수하였으며, 특히 실시예 1의 경우, 325 내지 975 Kda의 DNA 분자량을 가진다는 것으로 분석되어, 대조군의 분자량과 유사한 수준의 DNA 분자량을 보였다.
<
실험예
5>
염화 마그네슘
처리 시간에 따른
GPC
분석 결과
실험예 3에 이어, 더 정확한 분자량 비교를 위해, 염화 마그네슘 처리 시간에 따른 GPC(겔 투과 크로마토그래피)를 분석하였다. 구체적으로, SHODEX OHpak SB-806M HQ 300mm Column 사용하여 조건(40℃ Column 온도, 1.0 mL/min 속도, RI 디텍터, 1.7MPa 압력, 100ul 주입)으로 분석하였다. 시료를 정제수에 용해하여 1%로 하여 이동상A로 25배 희석 후 0.45μm 여과하여 이를 분석하였다. 이때 사용한 Standard는 Dextran standard 1 (2,457,000 MW), Dextran standard 2 (1,150,000MW), Dextran standard 3 (405,700MW) 이다.
| 최소 분자량 | 최대 분자량 | 평균 분자량 | |
| 대조군 | 947 | 4312 | 2291 |
| 실시예 3 | 253 | 6563 | 3959 |
| 실시예 2 | 190 | 4921 | 3116 |
| 실시예 1 | 766 | 4923 | 2014 |
상기 표 3 및 도 5에 나타난 바와 같이, 염화 마그네슘 처리 시간이 증가할수록, DNA의 분자량의 범위가 감소하여, 일정한 분자량의 DNA 단편 혼합물을 제조할 수 있으며, 따라서 PN 정제(purifiacation)이 유도됨을 확인할 수 있었다. 또한, 대조군과 비교하여, 유사한 평균 분자량을 가진다는 것을 확인하였다.
<
실험예
6>
실시예
1과 대조군의
점탄성
비교
실시예 1과 대조군의 점탄성을 비교하였다. 구체적으로, 점탄성 장비(MCR 92, 제조사 : Anton Paar), Spindle (Measuring Plate PP25 D:25mm, 제조사 : Anton Paar), Plunger rod, Spatula를 사용하여 시료의 점탄성을 분석하였다. 이때 Viscosity Standard(Viscosity Standard 1000, Viscosity Standard 5000 - 제조사 : BROOKFIELD AMETE)사용하여 기준점을 확립 후 정제수로 용해한 1% PN(시료) 1ml을 점탄성 장비에 분주 하였다. 그 다음, 총 16 포인트로 측정하며 Angular Frequency ω (rad/s) 가 1일 때 각 시료의 Storage Modulus와 Loss Modulus를 측정 값을 분석하였다.
| Angular Frequency ω (rad/s) |
Storage Modulus G’ (Pa) |
Loss Modulus G’’ (Pa) |
|
| 실시예 1 | 1 | 126.26 | 6.8152 |
| 대조군(HTL 사의 PN) | 1 | 101.48 | 4.0563 |
그 결과, 상기 표 4 및 도6에 나타난 바와 같이, 대조군보다 실시예 1의 저장 탄성계수(storage modulus) 및 손실 탄성계수(loss modulus)가 더 높은 값을 나타내었으므로, 실시예 1의 점탄성이 더 우수하다는 것을 확인하였다.
Claims (11)
- (1 단계) 이리에 이소프로판올을 처리하여, 불순물이 제거된 이리를 얻는 단계;
(2 단계) 상기 불순물이 제거된 이리를 염화 나트륨 수용액에 첨가하여 처리하는 단계;
(3 단계) 이리가 포함된 염화 나트륨 수용액에 로릴 황산 나트륨 수용액을 첨가하여, 세포 분해 및 핵산 추출된 1차 이리 용해액를 얻는 단계;
(4 단계) 상기 1차 이리 용해액을 에탄올로 침전하고, 침전물을 분리하여 2차 이리 용해액을 얻는 단계;
(5 단계) 상기 2차 이리 용해액에 염화 나트륨을 첨가하고, 80 내지 100 ℃의 고온에서 1차 바이러스 불활화 하는 단계;
(6 단계) 1차 바이러스 불활화 된 이리 용해액에 염화 마그네슘을 첨가하여 핵산 분자량이 저감된 DNA 단편 혼합물을 얻는 단계; 및
(7 단계) 상기 핵산 분자량이 저감된 DNA 단편 혼합물에 에탄올 처리하여 2차 바이러스 불활화한 후, 침전물을 얻는 단계;를 포함하는, 고순도 DNA 단편 혼합물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 1 단계의 이소프로판올은 이리 중량 대비 3 내지 6 배인 것을 특징으로 하는, 고순도 DNA 단편 혼합물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 2 단계에서 불순물이 제거된 이리에 20 ~ 50 중량% 농도의 염화 나트륨 수용액을 첨가하고 90 내지 100 ℃의 온도에서 1 내지 4시간 동안 처리한 후, 냉각하는 것을 특징으로 하는, 고순도 DNA 단편 혼합물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 3 단계에서 10 내지 20 중량% 농도의 로릴 황산 나트륨 수용액을 최종 농도가 0.5 내지 2 중량% 되도록 첨가하고, 10 내지 30 ℃에서 20 내지 40분 동안 처리하는 것을 특징으로 하는, 고순도 DNA 단편 혼합물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 4 단계에서 1차 이리 용해액을 최종 농도가 50 내지 80% 되도록 에탄올을 첨가하여 침전하고, 침전물을 분리하여 2차 이리 용해액을 얻는 것을 특징으로 하는, 고순도 DNA 단편 혼합물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 5 단계의 1차 바이러스 불활화는 염화 나트륨을 최종 농도가 0.5 내지 2 M이 되도록 첨가하고, 80 내지 100 ℃의 고온에서 12 내지 20시간 동안 처리하는 것을 특징으로 하는, 고순도 DNA 단편 혼합물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 6 단계에서 염화 마그네슘의 최종 농도가 30 내지 10 mM이 되도록 염화 마그네슘을 첨가하고, 80 내지 100 ℃에서 2 내지 5시간 처리하는 것을 특징으로 하는, 고순도 DNA 단편 혼합물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 7 단계는 50 내지 80% 에탄올을 첨가하여 12 내지 20 시간 동안 처리하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 고순도 DNA 단편 혼합물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 DNA 단편은 1,000 내지 10,000 KDa 분자량인 것을 특징으로 하는, 고순도 DNA 단편 혼합물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 이리는 연어의 이리인 것을 특징으로 하는, 고순도 DNA 단편 혼합물의 제조방법.
- 삭제
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220130968A KR102531611B1 (ko) | 2022-10-12 | 2022-10-12 | 고순도 dna 단편 혼합물의 제조 방법 |
| PCT/KR2022/020742 WO2024080451A1 (ko) | 2022-10-12 | 2022-12-19 | 고순도 dna 단편 혼합물의 제조 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220130968A KR102531611B1 (ko) | 2022-10-12 | 2022-10-12 | 고순도 dna 단편 혼합물의 제조 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102531611B1 true KR102531611B1 (ko) | 2023-05-12 |
Family
ID=86385454
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220130968A KR102531611B1 (ko) | 2022-10-12 | 2022-10-12 | 고순도 dna 단편 혼합물의 제조 방법 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102531611B1 (ko) |
| WO (1) | WO2024080451A1 (ko) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR900004219A (ko) * | 1988-08-12 | 1990-03-27 | 이우에 사또시 | 서라운드 데코더 |
| KR100732066B1 (ko) * | 2006-07-25 | 2007-06-25 | (주)블루오션월드 | 해양심층수로부터 저온진공결정법을 이용한 고순도미네랄의 효율적 추출방법 |
| KR20190065676A (ko) * | 2017-12-04 | 2019-06-12 | 주식회사 비알팜 | 고순도의 dna 단편 혼합물 제조방법 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107287186A (zh) * | 2016-04-05 | 2017-10-24 | 达特珂贝怡股份有限公司 | 从鱼类的精液分离多脱氧核糖核苷酸的方法、由所述方法获得的多脱氧核糖核苷酸及其用途 |
| KR102053221B1 (ko) * | 2018-10-23 | 2019-12-06 | 김석순 | 고순도의 dna 단편 혼합물 제조방법 |
-
2022
- 2022-10-12 KR KR1020220130968A patent/KR102531611B1/ko active IP Right Grant
- 2022-12-19 WO PCT/KR2022/020742 patent/WO2024080451A1/ko unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR900004219A (ko) * | 1988-08-12 | 1990-03-27 | 이우에 사또시 | 서라운드 데코더 |
| KR100732066B1 (ko) * | 2006-07-25 | 2007-06-25 | (주)블루오션월드 | 해양심층수로부터 저온진공결정법을 이용한 고순도미네랄의 효율적 추출방법 |
| KR20190065676A (ko) * | 2017-12-04 | 2019-06-12 | 주식회사 비알팜 | 고순도의 dna 단편 혼합물 제조방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2024080451A1 (ko) | 2024-04-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20170101634A1 (en) | Extracellular hyaluronidase from streptomyces koganeiensis | |
| KR20190139633A (ko) | 어류 정액 및 정소에서 피디알엔을 추출하는 방법 | |
| KR910009342B1 (ko) | 생물학적 활성 추출물의 제조방법 | |
| KR102423569B1 (ko) | 고순도 dna 단편 혼합물 제조방법 | |
| KR20130044195A (ko) | 어류 정소로부터 분리된 디엔에이 단편 혼합물을 포함하는 연골 재생용 조성물 | |
| PL244350B1 (pl) | Sposób otrzymywania hialuronidazy ze zwierzęcych jąder oraz produkt otrzymany tym sposobem | |
| KR102053221B1 (ko) | 고순도의 dna 단편 혼합물 제조방법 | |
| KR102531611B1 (ko) | 고순도 dna 단편 혼합물의 제조 방법 | |
| KR101916759B1 (ko) | 고농도, 고순도의 동종 콜라겐 제조 방법 및 동종 콜라겐 지지체의 제조방법 | |
| CA2035948A1 (en) | Polysaccharides with immunomodulating properties from astragalus membranaceus and pharmaceutical compositions containing them | |
| CN103784935A (zh) | 一种改良的注射用胎盘多肽的制备方法 | |
| CN112457377B (zh) | 美洲大蠊多肽及其应用 | |
| WO2022035334A2 (en) | Method of obtaining aprotinin and product obtained thereby | |
| CN113088549A (zh) | 一种从人胎盘血中提取抗氧化多肽的方法 | |
| WO2007111534A1 (fr) | Procédé de production d'une préparation d'interleukine-2, et préparation obtenue à l'aide dudit procédé | |
| KR20240130842A (ko) | 어류 정소에서 초음파를 이용하여 점탄성을 가진 피디알엔을 추출하는 방법. | |
| US11219843B2 (en) | Extraction of animal-derived pulmonary surfactants | |
| Popova et al. | Technological aspects of deproteinized calf blood hemoderivative preparation | |
| KR20220147996A (ko) | 고순도 헤파린나트륨의 제조방법 | |
| CN106474461B (zh) | 制备冻干人凝血酶的方法 | |
| RU2481113C2 (ru) | Способ получения веществ, влияющих на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека а431 | |
| KR102622003B1 (ko) | 어류 생식세포 유래 dna 단편 중합체의 제조 방법 | |
| CN113563460B (zh) | 一种高纯度胶原蛋白提取工艺 | |
| KR102669196B1 (ko) | 어류 유래 pdrn 또는 pn의 추출 및 정제 방법 | |
| RU2749424C1 (ru) | Способ получения лекарственного средства, обладающего антикоагулянтной активностью |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |