KR20190139633A - 어류 정액 및 정소에서 피디알엔을 추출하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 어류 정액 및 정소에서 피디알엔(PDRN)을 추출하는 방법에 관한 것으로, 더 구체적으로는 연어과 어류의 정액 및 정소로 부터 페놀등의 유기용제의 사용없이 공정 및 비용경제적으로 고 효율의 피디알엔(PDRN)을 추출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 하기 공정으로 구성된다.
1. 어류 정소를 냉동 분쇄 후 lysis buffer를 1: 50 의 비율로 첨가하여 항온처리하는 공정
2. 원심분리하여 침전물 제거하는 공정
3. Sodium acetate 및 Isopropanol을 1:2의 비율로 첨가하여 상온에서 10분간 교반하는 공정
4. 원심분리하여 침전된 DNA획득하는 공정
5.이소프로필 알코올 또는 에탄올을 이용하여 세척 후 건조하는 공정
본 발명에 의한 PDRN 제조방법에 의하면,
송어, 연어 정액 및 정소로 부터 고수율의 PDNR,을 제조할 수 있으며,
뿐만 아니라, 파마리서치의 방법보다, 비용 및 절차 경제적인 방법으로 PDNR을 추출할 수 있다.

Description

어류 정액 및 정소에서 피디알엔을 추출하는 방법{METHOD FOR EXTRACT OF PDRN FROM SPERM OR SPERMARY OF FISH}

본 발명은 어류 정액 및 정소에서 피디알엔(PDRN)을 추출하는 방법에 관한 것으로, 더 구체 적으로는 연어과 어류의 정액 및 정소로 부터 페놀등의 유기용제의 사용없이 고순도 PDNR 추출 공정 및 비용 경제적으로 고 효율의 피디알엔(PDRN)을 추출하는 방법에 관한 것이다.

PDRN(Polydeoxyribonucleotide) 은 세포성장 활성제로서. 조직 재생물질로 인대,힘줄, 피부 등 우리 몸 속 조직의 재생과 염증완화에 특별한 효과를 내고 있다.

이는 사람의 태반 속에 극소량 들어 있는 물질이나 윤리적 문제와 의약품 생산성 등의 어려움이 있어 어류 속 PDRN이 대안으로 나왔다.

핵산 함유량에 있어서 송어, 연어 정액 및 정소는 양적으로 우월함도 있지만, 이보다 더 중요한 것은 질적 우월함이다.

DNA는 5 탄당과 인산 및 네가지 염기 아데닌. 구아닌. 티민. 사이토신이 토함된 뉴클레오타이드로 구성되는데, 송어 및 연어는 이 조합의 균형이 사람의 것과 96.5% 일치한다. 이러한 유사함은 버려지는 핵산없이 모두 사용될 수 있다는 것에 큰 의미가 있다.

하기 표 1은 사람 및 연어의 DNA구성의 비교표이다.

	adenine(%)	guanine(%)	thymine(%)	cytosine(%)
사람의 간장 생성 핵산	30.30	19.50	30.30	19.90
연어의 정소 생성 핵산	29.70	20.80	29.10	20.40

연어과를 포함함 어류로부터 이러한 PDNR을 추출하려는 시도는 중국 특허 출원 201610497384.1 에 설명되어 있다.

이 특허 출원에 의하면,

(1)어류의 정액을 1차 원심 분리한 후

(2)상기 침전물을 세포 용해 완충액에 추가하고, 세포 용해물을 제조한 후

(3)(2) 순서를 통해 세포 용해물을 2차 원심 분리한 것을 하고, 상등액을 분리한 후

(4)(3) 순서에 근거하여 획득한 상등액 중에 포화 염화나트륨 수용액을 혼합한 후 3차 원심 분리하여 DNA의 상등액을 분리하고

(5)(4) 순서에 근거하여 획득한 상등액에 투입 에탄올을 투입한 후 침전된 DNA를 획득 및 건조한다.

는 것을 특징으로 하고 있다.

그러나, 이 발명은 수회의 원심분리에 의하여 DNA를 분리하는 공정에 불과하여, DNA 불순물 또는 RNA를 제거하지 못하여 생성된 PDRN 순도에 있어서 문제점이 있었다.

또한, (주) 파마리서치에서도 어류 정소 등에서 PDRN 추출하는 방법을 내 놓고 있고,

이는 하기와 같은 공정으로 이루어 진다.

1. 어류 정소 해동, 혈액 및 이물질 제거

2. 정제수 첨가 분쇄 (정소 분쇄액 제조)

3. 30~50% 염화나트륨 수용액과 혼합(1:2~2:1) 후 교반(90~110℃, 0.5~2h) 및 냉각

4. 20~40% 수산화나트륨 수용액 첨가하여 pH 조절

(ph10~12) 후 교반(0.5~2h) 및 여과 (여과액 획득)

5. 35% 염산 첨가하여 pH조절

(ph 6.5~8.5, 90~121℃, 5~30min) 후 실온 냉각 및 여과(DNA 단편 혼합물 포함된 여과액 추출)

6. 20~40% 수산화나트륨 수용액 첨가하여 ph 9~12로 조절 후 겔 여과를 통해 분자량 3,000~10,000kDa의 DNA 단편 혼합물의 분획액획득 후, 35% 염산 용액을 사용하여 ph7로 조정

7. 분획액 부피 0.4~3배의 이소프로필 올코올 또는 에탄올을 첨가하여 1~5시간 교반하여 DNA단편 혼합물을 침전

8. 단편 혼합물을 40~80% 이소프로필 알코올 또는 에탄올 및 95~100% 이소프로필 알코올 또는 에탄올로 순차적 세척, 이후 탈수 및 건조

그러나, 이러한 공정은 매우 여러단계를 거치는 공정으로서, 그 공정이 복잡할 뿐만 아니라, GEL 여과 공정은 과도한 비용이 투입되는 등, 절차 및 비용면에서 경제적이지 못한 공정이며, 결과로 얻어진 PDRN의 수율 또한 그다지 높지 못한 문제점이 있었다.

본 발명은 이러한 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 발명된 기술로서

제조공정을 단순하 시킴으로서, 제조공정에 소요되는 비용 및 시간을 줄이고자 하며,

수산화나트륨 이나 염산 등의 독극물의 사용없이 기존의 방법에 비하여 고 수율의 PDRN을 생산하고자 한다.

본 발명은 어류 냉동 정소 및 정액에서 불순물 단백질을 제거하는 공정을 1회 거침으로서, 제조공정 및 비용을 축소하였고, gel 여과과정을 생략하였고, 수산화나트륨, 염산등의 독극물을 사용하지 않은 특징을 갖고 있다.

더욱 구체적으로는 본 발명은 하기의 공정으로 구성된다.

1. 어류 정소를 냉동 분쇄 후 lysis buffer를 1: 50 의 비율로 첨가하여 항온처리하는 공정

2. 원심분리하여 침전물 제거하는 공정

3. Sodium acetate 및 Isopropanol을 1:2의 비율로 첨가하여 상온에서 10분간 교반하는 공정

4. 원심분리하여 침전된 DNA획득하는 공정

5. 이소프로필 알코올 또는 에탄올을 이용하여 세척 후 건조하는 공정

을 포함한다.

이때, LYSIS BUFFER는 55℃에서 한시간 유지하는 것이 바람직하다. 55℃이상인 경우 DNA가 손상되며, 그 이하인 경우 세포막이 깨지지 않는다.

원심분리의 경우, 8000-13,000rpm 으로 5-10 분간 유지하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 어류는 연어과 어류, 즉, 송어,연어등이 바람직하다.

본 발명에 의한 PDRN 제조방법에 의하면,

어류 정액 및 정소로 부터 고수율의 PDNR,을 제조할 수 있다.

뿐만 아니라, 일반적으로 알려진 (주)파마리서치의 방법보다, 비용 및 절차 경제적인 방법으로 PDNR을 추출할 수 있다.

도 1은 연세대 보건과학대학 임상병리학과에서 발급한 송어 정소(testis) 및 정액(sperm) DNA size 에 대한 DNA 전기영동 및 확인 결과이다.

더욱 구체적으로는 본 발명은 하기의 공정으로 구성된다.

송어 정액 처리 및 정소 분말화

송어 정액,정소를 추출 후 이물질 및 혈흔을 제거하고 냉동 보관한다.

냉동 보관된 정액은 Lysis Buffer (1: 50의 비율)와 함께 해동과 세포분리 과정을 동시에 한다.

정소는 분말화하기위해 액화 질소에 의해 다시 냉동시키는 것이 바람직하다.

이때, 냉동된 정소가 분말화하는 과정에서 녹는 것을 방지하기 위해 주기적으로 액화 질소를 분쇄기에 투여하여 정소를 분쇄 시킨다.

이때. lysis buffer는 일반적인 lysis buffer로 Tris-HCL 100mM, EDTA 100mM, Nacl 100mM, SDS 0.5% 및 증류수로 구성된다

송어 DNA 추출 공정

DNA 분리 과정

원심분리로 분리하는데,

송어 정액, 정소의 400~500배에 해당되는 염화나트륨수용액를 분말화 된 정소와 혼합하여 섭씨 50~55도사이에 1시간 가량 항온처리 하는 것이 바람직하다.

염화나트륨 수용액은 정액,정소 세포에 작용하여 DNA는 상층, 단백질을 포함 기타 이물질은 하층에 원심분리 시킨다.

이때, 55℃ 이상인 경우 DNA가 손상되며, 그 온도 이하인 경우, 세포막이 깨지지않는다.

DNA 정화과정

DNA의 순도를 높이기 위해 DNA에 결합돼 있는 단백질을 추가적으로 제거해준다. 상기 원심분리로 분리된 상층액에 초산나트륨과 이소프로필 알코올을 1:2 비율로 첨가하여 상온에서 교반한다. 이때 교반시간은 약 5~10분이 적당하다.

이 공정에 의하여 본 발명은 고 수율의 PDRN을 제조가 가능하다.

DNA 정제 과정

상기 과정에서 얻은 결과물을 원심분리하여 DNA 를 침전시킨다.

획득한 침전물을 이소프로필 알코올 또는 에탄올로 세척한다.위 과정을 필요에 따라 2~3회 반복한다.

이때 원심분리는 13000rpm 에 5분이 적당하다.

DNA 탈수,건조 및 최종 순도/함량 확인

이소프로필 알코올 또는 에탄올로 세척한 결과물을 탈수 및 진공 건조하여 최종적으로 분말화된DNA을 획득한다.

DNA 존재여부 확인

DNA 존재여부는 전기영동을 활용하였으며,최종 DNA순도 및 함량은 UV-spectrophotometer를 사용하였다.위 과정을 통해 얻은 송어 정소 DNA의 순도는 약 260/280 파장에서 1.8~2.0이였으며, 260/230은 2.0~2.3 사이를 나타내었다.

DNA 분절

DNA를 분절화(fragmentation)하는 방법으로는,

1. Restriction digest

2. The transmission of high-frequency acoustic energy

3. Neublization foces

4. Sonication

5. Needle shearing

등이 있으나. Sonication을 이용할 경우 보통 700 bp 까지 분절할 수 있는 것으로 알려져있으므로, DNA 분절 과정이 필요한 실험들은 sonication을 이용하여 분절화하였다.

추출된 DNA의 분자량 분석결과 정액에서 추출한 결과는 300~10,000kDa미만의 DNA조각이 고루 분포하였고, 정소에서 추출한 결과는 14,000kDa정도의 크기로 분포하였다. 약리 효과를 극대화 하기 위한 DNA분자량 조절은 Sonication을 이용하여 원하는 분자량으로 분절 할 수 있음을 확인하였다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명의 상세한 제조방법을 설명하고자 한다.

1. 송어 정액 처리 및 정소 분말화

송어 정소를 추출 후 이물질 및 혈흔을 제거하고 냉동 보관한다.

냉동 보관된 정액은 Tris-HCL 100mM, EDTA 100mM, Tris-HCL 100mM,

Nacl 100mM, SDS 0.5% 및 증류수로 구성된 Lysis Buffer (1: 50의 비율)로 처리한 후 액화질소로 냉동 한 후 분말화 시킨다.

송어 DNA 추출 공정

2. 송어 DNA 분리 과정

송어 정소의 400배에 해당되는 염화나트륨수용액를 분말화 된 정소와 혼합하여 섭씨 50~55도사이에 1시간 가량 항온처리 한후 9000 rpm 에서 7분간 원심분리하여 단백질 포함 이물질을 제거하였다.

3.DNA 정화과정

상기 원심분리로 분리된 상등액에 초산나트륨과 이소프로필 알코올을 1:2 비율로 첨가하여 상온에서 10분간 교반하였다.

.

4. DNA 정제 과정

상기 과정에서 얻은 결과물을 1300rpm 에서 5분간 원심분리하여 DNA 를 침전시켰다.

획득한 침전물을 70% 에탄올로 세척하여 건조시켰다.

5. DNA 탈수,건조 및 최종 순도/함량 확인

이소프로필 알코올 또는 에탄올로 세척한 결과물을 탈수 및 진공 건조하여 최종적으로 분말화 된 DNA을 획득하였다.

6. DNA 존재여부 확인

DNA 존재여부는 전기영동을 활용하였으며, 최종 DNA순도 및 함량은 UV-spectrophotometer를 사용하였다.위 과정을 통해 얻은 송어 정소 DNA의 순도는 약 260/280 파장에서 1.8이였으며, 260/230은 2.0를 나타내었다.

7. DNA 분자량

추출된 DNA의 분자량 분석결과 정액에서 추출한 결과는 300~10,000kDa미만의 DNA조각이 고루 분포하였고, 정소에서 추출한 DNA 분자량은 14,000kDa정도의 크기였다.

도 1은 연세대 보건과학대 임상병리학과에 의뢰하여 실험한 DNA 전기영동 결과로서 송어 정소(testis) 및 정액(sperm) DNA size 확인 할 수 있다.

정액에서 추출한 DNA의 경우, 약 20 kbp 미만의 DNA 조각들이 고루 분포하고 있는 것을 확인할 수 있으며, 반면 정소에서 추출한 DNA의 경우, 약20 kbp 미만의 DNA 조각들이 일부 존재하기는 하나 약 23 kbp 이상의 DNA 조각이 주를 이루고 있는 것으로 확인되었고, .

확인한 dsDNA size를 기반으로 대략적인 분자량을 계산한 결과, 정액 추출 DNA 샘플은 약 10,000 kDa 미만에 해당하는 조각들이 존재하는 것으로 보인다. 정소 추출 DNA 샘플은 약 14,000 kDa 이상에 해당하는 조각들이 주로 존재하는 것으로 보인다.

Claims (6)

1. 하기의 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 어류 정액 및 정소에서 피디알엔을 추출하는 방법:
   어류 정소를 냉동 분쇄 후 lysis buffer 를 1:50 비율로 첨가하여 항온처리하는 공정;
   원심분리하여 침전물 제거하는 공정;
   Sodium acetate 및 Isopropanol을 1:2의 비율로 첨가하여 상온에서 10분간 교반하는 공정;
   원심분리하여 침전된 DNA획득하는 공정; 및
   이소프로필 알코올 또는 에탄올을 이용하여 세척 후 건조하는 공정
   
2. 제 1항에 있어서, LYSIS BUFFER 첨가 후 55℃ 에서 1시간동안 항온처리하는 것을 특징으로 하는 어류 정액 및 정소에서 피디알엔을 추출하는 방법
   
3. 제 1항에 있어서, 원심분리 공정은 8,000-15.000rpm에서 5-10분간 유지하는 것을 특징으로 하는 어류 정액 및 정소에서 피디알엔을 추출하는 방법.
   
4. 제 1항에 있어서, 어류는 연어류인 것을 특징으로 하는 어류 정액 및 정소에서 피디알엔을 추출하는 방법.
   
5. 제 1항에 있어서 lysis buffer는 Tris-HCL 100mM, EDTA 100mM, Nacl 100mM, SDS 0.5% 및 증류수로 이루어진 것을 특징으로 하는 어류 정액 및 정소에서 피디알엔을 추출하는 방법.
   
6. 1항에 있어서, 추출된 PDRN을 SONICATION을 이용하여 원하는 분자량으로 분절하는 것을 포함하는 어류 정액 및 정소에서 피디알엔을 추출하는 방법.

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