RU2781832C1 - Способ получения суммарной рнк из биомассы клеток дрожжей saccharomyces cerevisiae - Google Patents
Способ получения суммарной рнк из биомассы клеток дрожжей saccharomyces cerevisiae Download PDFInfo
- Publication number
- RU2781832C1 RU2781832C1 RU2022122494A RU2022122494A RU2781832C1 RU 2781832 C1 RU2781832 C1 RU 2781832C1 RU 2022122494 A RU2022122494 A RU 2022122494A RU 2022122494 A RU2022122494 A RU 2022122494A RU 2781832 C1 RU2781832 C1 RU 2781832C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- total rna
- biomass
- incubated
- yeast
- saccharomyces cerevisiae
- Prior art date
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 185
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 title claims abstract description 92
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 title claims abstract description 43
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims abstract description 167
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 76
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 75
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 69
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 67
- 230000002147 killing Effects 0.000 claims abstract description 52
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 41
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 37
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 36
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 32
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 29
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 29
- 108010082737 zymolyase Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims abstract description 20
- 235000003534 Saccharomyces carlsbergensis Nutrition 0.000 claims description 58
- 229940081969 Saccharomyces cerevisiae Drugs 0.000 claims description 58
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 25
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 25
- 241000186221 Cellulosimicrobium cellulans Species 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 claims description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 7
- 238000005185 salting out Methods 0.000 claims description 6
- 108020004461 Double-Stranded RNA Proteins 0.000 abstract description 29
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 12
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 230000002519 immonomodulatory Effects 0.000 abstract description 3
- 238000005020 pharmaceutical industry Methods 0.000 abstract description 3
- 230000002924 anti-infective Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 64
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 49
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 35
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N Oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 14
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 14
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K Tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 12
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 10
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 7
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L na2so4 Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 6
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 6
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 6
- 235000019798 tripotassium phosphate Nutrition 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 5
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 5
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M Lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 5
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 5
- 230000002101 lytic Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 4
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N n-butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 4
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 4
- 230000002035 prolonged Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000000840 anti-viral Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 3
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N iso-propanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 3
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propanol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N 2-Ethylhexanoic acid Chemical compound CCCCC(CC)C(O)=O OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001383 5S-rRNA precursor Polymers 0.000 description 2
- ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N Isobutanol Chemical compound CC(C)CO ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BCKXLBQYZLBQEK-KVVVOXFISA-M Sodium oleate Chemical compound [Na+].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC([O-])=O BCKXLBQYZLBQEK-KVVVOXFISA-M 0.000 description 2
- 229920001949 Transfer RNA Polymers 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 2
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating Effects 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 229940041514 Candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 210000002421 Cell Wall Anatomy 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N Ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001221335 Nocardiopsis sp. Species 0.000 description 1
- 206010047461 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 208000001756 Virus Disease Diseases 0.000 description 1
- 229920000392 Zymosan Polymers 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory Effects 0.000 description 1
- 239000002592 antimutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000001571 immunoadjuvant Effects 0.000 description 1
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulators Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229920002973 ribosomal RNA Polymers 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и фармацевтической промышленности и представляет собой способ получения суммарной рибонуклеиновой кислоты (суммарная РНК) из биомассы киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae и может быть использовано в фармацевтике и биотехнологии для производства противоинфекционных и иммуномодулирующих препаратов. Для осуществления способа получения суммарной РНК биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором и ферментным препаратом зимолиазы при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением. Далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют. Затем в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия до достижения его концентрации 1,5-2,5 М в целевом растворе, инкубируют и центрифугируют. После чего к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК. Настоящее изобретение позволяет увеличить выход (примерно в 1,3 раза) и чистоту суммарной РНК из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae, а также количество двухспиральной РНК в составе суммарной РНК. 9 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и фармацевтической промышленности и представляет собой способ получения суммарной рибонуклеиновой кислоты (суммарная РНК) из биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae и может быть использовано в фармацевтике и биотехнологии для производства противоинфекционных и иммуномодулирующих препаратов.
Природные двуспиральные РНК (дсРНК) являются одними из важнейших медиаторов, обеспечивающих индукцию интерферона (IFN) в ответ на вирусную инфекцию в организме, при этом дсРНК вызывают индукцию всех типов интерферона, включая интерферон-дельта, обладают противовирусным действием в отношении различных видов вирусов, стимулируют неспецифическую резистентность, гемопоэз, являются иммуномодуляторами, иммуноадъювантами, антимутагенами. Таким образом, с точки зрения терапевтического потенциала дсРНК являются перспективным объектом для создания на их основе противовирусных, антибактериальных, противовоспалительных и проивоопухолевых препаратов, а также средств для повышения неспецифической защитной реакции и снижения восприимчивости организма к действию патогенных агентов различной природы.
Терапевтическая активность таких препаратов во многом зависит от молекулярно-массового распределения и пространственной конформации нуклеиновых кислот. Наибольшей активностью обладают препараты на основе природных двуспиральных РНК (дсРНК).
Источниками природных РНК, помимо РНК-содержащих вирусов, вызывающих заболевания человека и животных, могут быть вирусы насекомых, растений и микроорганизмов, а также некоторые грибы.
Суммарная дрожжевая РНК является важнейшим биологически активным компонентом, на основе которого возможно дальнейшее получение различных высокополимерных РНК, в том числе индивидуальных РНК (тРНК, рРНК), дсРНК, обладающих противовирусной и интерферон-индуцирующей активностью [1], а также иммуномодулирующим действием [2]. Источниками суммарной дрожжевой РНК являются дрожжи Saccharomyces cerevisiae, в частности, некоторые «киллерные» штаммы [3].
Несмотря на большой интерес к природной суммарной дрожжевой РНК, описанные в уровне техники способы ее получения недостаточно эффективны и требуют совершенствования.
Из уровня техники известен способ получения суммарной РНК из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae, охарактеризованный следующими стадиями: суспендирование биомассы дрожжей в буфере при температуре 25°С, добавление хлороформа до концентрации 25%, центрифугирование, добавление к экстракту клеток SDS (додецилсульфата натрия) до конечной концентрации 2,5% при 0°С, центрифугирование и высаливание посредством 3,5 М раствора NaCl. После осуществляют промывку осадка дважды 3,5 М раствором NaCl и растворяют в воде. Далее проводят центрифугирование, фильтрование и осаждение суммарной РНК этиловым спиртом до концентрации 60 %, промывание осадка этиловым спиртом концентрации 60 % и лиофильное высушивание [4].
Недостатком данного способа является небольшой выход активного целевого продукта (суммарной РНК) вследствие использования исключительно химического способа разрушения клеток дрожжей без дополнительной механической обработки суспензии биомассы.
Также известен способ получения высокополимерной РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, включающий суспендирование дрожжей в водном растворе олеата натрия при температуре суспензии не ниже 98°C, кипячение суспензии при 98-100°C при периодическом перемешивании, центрифугирование охлажденного до комнатной температуры лизата, доведение объема дрожжевого экстракта до стандарта дистиллированной водой с последующим выделением из него высокополимерной РНК с дальнейшим замораживанием и лиофилизацией [5].
Известен способ получения высокополимерной РНК путем суспендирования отработанных пивных дрожжей в водном растворе олеиновой кислоты, оттитрованной щелочью, с последующим продолжительным кипячением суспензии, отстаиванием горячего лизата при комнатной температуре, осаждением высокополимерной РНК из супернатанта хлористым натрием концентрацией 2-3 М, промывкой осадка раствором 2-3 М хлористого натрия и 92-96 % этанолом путем последовательного ресуспендирования - центрифугирования и выделения конечного продукта из полученного шрота экстракцией водой [6].
Известен способ получения высокополимерной РНК из сухих пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae, включающий суспендирование дрожжей в водном растворе олеиновой кислоты, оттитрованном щелочью, при температуре суспензии не ниже 98°C, кипячение суспензии при периодическом перемешивании, добавление через 10, 20 и 30 мин после суспендирования последней порции дрожжей в кипящую суспензию щелочи, добавление по окончании экстракции в суспензию кипяченой воды, перемешивание, отстаивание суспензии при комнатной температуре с последующим замораживанием и лиофилизацией [7].
Известен способ получения высокополимерной РНК из сухих пекарских дрожжей путем суспендирования их в водном растворе олеиновой кислоты, оттитрованной щелочью, в кипящем растворе литического агента с последующим продолжительным кипячением суспензии, центрифугированием охлажденного лизата, осаждением высокополимерной РНК из супернатанта хлористым натрием до концентрации 2-3 М и промывкой осадка раствором хлористого натрия концентрации 2-3 М и 92-97 %-ым этанолом путем последовательного его ресуспендирования-центрифугирования и выделения конечного продукта из полученного шрота экстракцией водой [8].
Известен способ получения высокополимерной РНК из дрожжей путем суспендирования их водном растворе олеиновой кислоты, оттитрованной щелочью, в кипящем растворе литического агента с последующим продолжительным кипячением суспензии, отстаиванием горячего лизата при комнатной температуре, осаждением высокополимерной РНК из супернатанта хлористым натрием до концентрации 3 М в растворе и промывкой осадка двумя порциями 3 М раствора хлористого натрия и пятью порциями 94 %-ым этанолом путем последовательного его ресуспендирования-центрифугирования и выделения конечного продукта из полученного шрота экстракцией водой [9].
Известен способ получения высокополимерной РНК с помощью додецилсульфата натрия (при температуре не ниже 99°С), освобожденной от примесных ассоциатов РНК с белками и полисахаридами из сухих пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae, охарактеризованный высаливанием РНК хлористым натрием и последующими промывками при низкоскоростном центрифугировании без охлаждения [10].
Недостатками указанных способов являются низкая чистоты и выход активного целевого продукта (суммарной РНК), в том числе, вследствие деформации структуры РНК из-за длительного воздействия «жестких» температурных условий (при использовании в технологии получения РНК таких условий, как прогревание при температуре 68-100°С, может приводить к «расплетанию» цепей дсРНК.).
Известен способ получения суммарной РНК и полисахарида зимозана из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae штамма ВКПМ Y-448, характеризующийся тем, что он включает разрушение клеток дрожжей в буфере, путем обработки додецилсульфатом натрия (SDS) в концентрации 1,0% при 20-30°C и хлороформом в концентрации до 25% при 20-30°C; центрифугирование смеси с последующим отделением надосадочной жидкости; добавление раствора SDS до конечной концентрации 2% до выпадения осадка; центрифугирование; осаждение надосадочной жидкости раствором хлористого лития с концентрацией соли 3,5 М; промывание осадка 3,5 М раствором соли хлористого лития и растворение его в воде; осветление раствора центрифугированием, фильтрование; осаждение суммарной РНК этанолом до концентрации 50-55% в растворе, центрифугирование; промывание 60%-ным этанолом и растворение в изотоническом растворе [11].
Недостатком данного способа является сниженный выход целевого продукта вследствие использования исключительно химического способа разрушения клеток дрожжей без дополнительной механической обработки суспензии биомассы.
Также из уровня техники известен способ получения высокополимерной РНК из суммарной РНК дрожжей путем суспендирования их водном 0,3-1,2 М растворе 2-этилгекрановой кислоты, содержащем 0,1-0,5 М раствор NaCl, с последующим нагреванием суспензии до 92-98°С и выдерживания при установленной температуре, центрифугирования и осаждения суммарной РНК этанолом до его концентрации в целевом растворе 50-55 об. % [12].
Данный способ предполагает использование неприродного высокотоксичного литического агента - 2-этилгексановой кислоты, что требует глубокой очистки конечного продукта, вследствие чего этот способ не экономичен и практически не масштабируем. К тому же, при использовании в технологии получения РНК таких условий, как прогревание при температуре 68-100°С, может приводить к «расплетанию» цепей дсРНК.
Также известен способ получения дсРНК, который предусматривает получение суммарной РНК путем обработки клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448 культуральной жидкостью Arthrobacter luteus ATSS 21606 при температуре 30-40°С. Далее гомогенат прогревают в течение 10 мин при температуре 75°С, после чего охлаждают и осветляют центрифугированием. Полученный экстракт подвергают концентрированию и диафильтрации на ультрафильтрационном разделительном аппарате с пределом отсечения 100 КДа [13].
Недостатком данного способа является сниженный выход и чистота целевого продукта вследствие использования исключительно химического способа разрушения клеток дрожжей без какой-либо дополнительной механической обработки суспензии биомассы. При этом использование в технологии получения РНК таких условий, как прогревание при температуре 68-100°С, может приводить к «расплетанию» цепей РНК, а механические воздействия при диафильтрации приводят к деформации структуры РНК и нестабильности ее при хранении.
Задачей настоящего изобретения является получение суммарной РНК из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae с увеличенным выходом и чистотой целевого продукта.
Техническим результатом настоящего изобретения является увеличение выхода (примерно в 1,3 раза) и чистоты суммарной РНК из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae, при этом количество дсРНК в составе суммарной РНК, полученной способом по настоящему изобретению, также существенно возрастает.
Ниже приведены термины, которые используются в описании настоящего изобретения. Если не указано иное, все технические и специальные термины, использованные в описании, имеют общепринятое в данной области техники значение.
Термин «двуспиральная РНК (дсРНК)» в контексте настоящего изобретения характеризует молекулу РНК, состоящую из двух комплементарных цепей.
Термин «высокополимерная РНК» в контексте настоящего изобретения характеризует все возможные отличные от дсРНК виды молекул РНК (например, мРНК, тРНК и др).
Термин «суммарная РНК» в контексте настоящего изобретения характеризует общее количество всей получаемой РНК из клеток киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae, которое может включать, в том числе, не ограничиваясь указанным, как двуспиральную РНК, так и высокополимерную РНК.
Термин «биомасса» в контексте настоящего изобретения относится к совокупной массе клеток киллерного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae, отделенных в процессе центрифугирования от супернатанта культуральной жидкости, полученной в результате культивирования, в том числе, в качалочных колбах или биореакторах (например, при культивировании батарейным способом).
Термин «ферментный препарат» в контексте настоящего изобретения относится к препарату, полученному, например, не ограничиваясь указанным, из культуральной жидкости бактерий Arthrobacter luteus B-2350 путем высаливания. В состав препарата входит фермент зимолиаза. Литическая активность ферментного препарата составляет не менее 500 ед/мл.
Термин «одноатомный спирт» относится к спиртам, в составе молекулы которых содержится одна гидроксильная группа (например, метанол, этанол, пропанол и т.п.).
Термин «об. %» в контексте настоящего изобретения означает объёмную концентрацию (долю) некоторого жидкого вещества в растворителе (т.е. соотношение объема растворенного вещества к объему раствора, выраженное в процентах (об. %)).
Термин «единица активности» (ед. акт.), в контексте настоящего изобретения применяется к характеристике активности ферментного препарата. Одна единица литической активности определяется как количество, например, зимолиазы, которое полностью лизирует 3 мг (в пересчете на сухую массу) дрожжей.
В контексте настоящего изобретения термин «пн» означает количество комплементарных пар нуклеотидов.
Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, который характеризуется тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором и ферментным препаратом при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением, центрифугируют и отделяют супернатант, к которому добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают и инкубируют, затем центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, который характеризуется тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором и ферментным препаратом при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением, центрифугируют и отделяют супернатант, к которому добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают и инкубируют, затем центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается путем реализации способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором и ферментным препаратом зимолиазы, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия до достижения его концентрации 1,5-2,5 М в целевом растворе, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается путем реализации способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором и ферментным препаратом зимолиазы, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия до достижения его концентрации 1,5-2,5 М в целевом растворе, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором и ферментным препаратом зимолиазы, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия до достижения его концентрации 1,5-2,5 М в целевом растворе, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором и ферментным препаратом, содержащим зимолиазу, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором, 1 % раствором SDS (додецилсульфат натрия) и ферментным препаратом, содержащим зимолиазу, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором, 1 % водным раствором SDS (додецилсульфат натрия) и ферментным препаратом, содержащим зимолиазу, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором, содержащим 1 об. % SDS (додецилсульфат натрия), и ферментным препаратом, содержащим зимолиазу, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором и ферментным препаратом, представляющим собой зимолиазу, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором и зимолиазой, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором и ферментным препаратом зимолиазы, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором, 1 % SDS и ферментным препаратом зимолиазы, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором, 1 % раствором SDS и ферментным препаратом зимолиазы, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором, 1 % водным раствором SDS и ферментным препаратом зимолиазы, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором, содержащим SDS, и ферментным препаратом зимолиазы, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором, содержащим 1 об. % SDS, и ферментным препаратом зимолиазы, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей штамма Saccharomyces cerevisiae, выбранного из группы, включающей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448, Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-872 и Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-1047.
Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором используют дрожжи киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448.
Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором в массовом соотношении от 1:4-1:10.
Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, в котором биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором в массовом соотношении от 1:4-1:10.
Более предпочтительно биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором в массовом соотношении от 1:4.
Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором следующего состава: натрий сернокислый; ЭДТА; калий фосфорнокислый однозамещенный; калия хлорид; SDS.
Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, в котором биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором следующего состава: натрий сернокислый; ЭДТА; калий фосфорнокислый однозамещенный; калия хлорид; SDS.
Более предпочтительно буферный раствор имеет следующий состав: натрий сернокислый - 100-150 мМ; ЭДТА - 5-10 мМ; калий фосфорнокислый однозамещенный - 20-80 мМ; калия хлорид - 250-600 мМ; SDS - 3-8 мМ.
Более предпочтительно буферный раствор имеет следующий состав: натрий сернокислый - 100 мМ; ЭДТА - 5 мМ; калий фосфорнокислый однозамещенный - 40 мМ; калия хлорид - 350 мМ; SDS - 5 мМ.
Одним из вариантов исполнения настоящего изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором и 1%-ым раствором SDS.
Одним из вариантов исполнения настоящего изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, в котором биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором и 1%-ым раствором SDS.
Более предпочтительно буферный раствор с 1% раствором SDS используют в соотношении буферный раствор к 1 % раствору SDS 1,0 : 0,004 - 1,0 : 0,01 по объему.
Более предпочтительно в настоящем изобретении используется 1 % водный раствор SDS.
Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором процесс гомогенизации проводят под давлением 600-1400 бар.
Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, в котором процесс гомогенизации проводят под давлением 600-1400 бар.
Более предпочтительно процесс гомогенизации проводят под давлением 1400 бар.
Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором ферментный препарат получают из культуральной жидкости бактерий Arthrobacter luteus B-2350 методом высаливания.
Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, в котором ферментный препарат получают из культуральной жидкости бактерий Arthrobacter luteus B-2350 методом высаливания.
Более предпочтительно ферментный препарат содержит зимолиазу.
Более предпочтительно ферментный препарат представляет собой зимолиазу.
Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором ферментный препарат получают из культуральной жидкости бактерий Nocardiopsis sp.
Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором одноатомный спирт представляет собой метанол, этанол, изопропиловый спирт, пропанол или бутанол.
Более предпочтительно одноатомный спирт представляет собой этанол.
Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором одноатомный спирт добавляют до его концентрации 40-60 % в целевом растворе.
Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором одноатомный спирт добавляют до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе.
Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором одноатомный спирт добавляют до его концентрации 45 об. % в целевом растворе.
Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором одноатомный спирт добавляют до его концентрации 45 % в целевом растворе.
Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, в котором одноатомный спирт добавляют до его концентрации 45 % в целевом растворе.
Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором хлорид натрия добавляют до достижения его концентрации 1,5-2,5 М в целевом растворе.
Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, в котором хлорид натрия добавляют до достижения его концентрации 1,5-2,5 М в целевом растворе.
Более предпочтительно хлорид натрия добавляют до достижения его концентрации 2,5 М в целевом растворе.
Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором полученную суммарную РНК лиофильно высушивают.
Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, в котором полученную суммарную РНК лиофильно высушивают.
Краткое описание чертежей.
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано посредством Фиг. 1, Фиг. 2 и Фиг. 3.
На Фиг.1 изображена электрофореграмма образцов суммарной РНК, полученных путем реализации способа 1, способа 2 и способа 3:
М - маркер молекулярной массы (маркер молекулярного веса ДНК, содержащий 13 фрагментов от 250 до 10000 п.н. (фрагменты: 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000 п.н.);
37, 40 - образцы, полученные способом 1;
38, 42 - образцы, полученные способом 2;
39, 41 - образцы, полученные способом 3.
На Фиг. 2 изображена электрофореграмма образцов суммарной РНК, полученных путем реализации способов 4 - 8:
М - маркер молекулярной массы (маркер молекулярного веса ДНК, содержащий 13 фрагментов от 250 до 10000 п.н. (фрагменты: 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000 п.н.);
1/1 - образец, полученный способом 8;
2/1 - образец, полученный способом 7;
3/1 - образец, полученный способом 5;
4/1 - образец, полученный способом 6;
5/1 - образец, полученный способом 4.
На Фиг. 3 изображена электрофореграмма образца суммарной РНК, полученной способом 4, с отбором проб на разных промежутках времени инкубирования клеток дрожжей при 100 °С:
М - маркер молекулярной массы (маркер молекулярного веса ДНК, содержащий 13 фрагментов от 250 до 10000 п.н. (фрагменты: 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000 п.н.);
6.1. - через 5 минут;
7.1. - через 20 минут;
8.1. - через 40 минут;
9.1. - через 60 минут;
10.1. - через 80 минут;
11.1. -через 100 минут.
Подробное описание изобретения. Раскрытие сущности изобретения.
Предложенный в рамках настоящего изобретения способ экстракции суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae по одному из вариантов исполнения настоящего изобретения предусматривает следующие этапы.
Биомассу киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae, в частном случае исполнения киллерного штамма ВКПМ Y448 или ВКПМ Y-872, или Y-1047, перемешивают с буферным раствором (рН = 7,00±0,05, состав: натрий сернокислый - 100 мМ; ЭДТА - 5 мМ; калий фосфорнокислый однозамещенный - 40 мМ; калия хлорид - 350 мМ; SDS - 5 мМ) в соотношении 1:4-1:10 по массе до гомогенного состояния. При постоянном перемешивании полученную суспензию нагревают до 28-35°С, вносят ферментный препарат зимолиазы, (из расчета 6000-20000 ед. акт на 1 кг. биомассы) и при необходимости 1% раствор SDS (соотношение указанного буферного раствора к SDS составляет 1,0 : 0,004 - 1,0 : 0,01 по объему), и оставляют инкубироваться при температуре 28-35°С в течение 60-180 минут. По окончании инкубации суспензию охлаждают до 18-7°С и механически гомогенизируют (под давлением 600-1400 бар). К полученному гомогенату добавляют отвешенный на весах хлорид натрия до концентрации 1,5-2,5 М в целевом растворе. Смесь перемешивают в течение 15-30 мин. при температуре 23-27°С до полного растворения соли в суспензии.
Затем полученную суспензию охлаждают до 15-19°С и инкубируют при установленной температуре в течение 30,0-60,0 мин. Далее при необходимости проводят этап осветления полученной дрожжевой суспензии. Для этого полученный на предыдущей стадии гомогенат дрожжевой биомассы центрифугируют при оборотах 15000 об/мин. осадок растворяют в воде, в частности, в воде очищенной или воде для инъекций, до гомогенного состояния. В полученный супернатант добавляют одноатомный спирт с концентрацией 96 % до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают 4-6 ч и инкубируют при 0-8°С не менее 12 часов. Полученную после отстаивания суспензию центрифугируют при 15000 об/мин для отделения осадка суммарной РНК. Спиртовой супернатант, полученный в ходе центрифугирования, сливают.
Список литературы.
1. Isaque João da Silva de Faria, Roenick Proveti Olmo, Emanuele Guimarães Silva, and João Trindade Marques.Journal of Interferon & Cytokine Research.May 2013.239-253.http://doi.org/10.1089/jir.2013.0026.
2. Yoneyama, Mitsutoshi and Takashi Fujita. “Recognition of viral nucleic acids in innate immunity.” Reviews in Medical Virology 20 (2010): n. pag.
3. Даниленко, Е. Д., Белкина, А. О., Сысоева, Г. М. (2019). Создание лекарственных препаратов на основе высокополимерных двуспиральных РНК для противовирусной и противоопухолевой терапии. Биомедицинская химия, 65(4), 282.
4. Шевченко З.А., Телегина Ю.В., & Лебедев Л.Р. (2017). Способ получения препаратов на основе рнк. Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук, (8-2), 9-13.
5. Патент РФ № 2522900.
6. Патент РФ № 2435862.
7. Патент РФ № 2510854.
8. Патент РФ № 2403288.
9. Патент РФ № 2392329.
10. Патент РФ № 2430969.
11. Патент РФ № 2722731.
12. Патент SU № 936701.
13. Патент РФ № 2302464.
Далее приводятся примеры осуществления изобретения, которые иллюстрируют изобретение, но не охватывают все возможные варианты его осуществления и не ограничивают изобретение.
Специалисту в данной области очевидно, что возможны и другие частные варианты осуществления изобретения.
Пример 1. Получение суммарной РНК из биомассы дрожжей.
Биомассу киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae штамм ВКПМ Y-448 (в частном случае реализации настоящего изобретения суммарную РНК получали, используя биомассу дрожжей, в том числе, Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-872 или Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-1047) смешивали с буферным раствором (рН = 7,00±0,05, состав: натрий сернокислый - 100 мМ; ЭДТА - 5 мМ; калий фосфорнокислый однозамещенный - 40 мМ; калия хлорид - 350 мМ; SDS - 5 мМ) в соотношении биомасса дрожжей : буферный раствор - 1:4 по массе. Полученную суспензию перемешивали 100±10 об/мин до гомогенного состояния в течение 30 мин, затем нагревали до температуры 30±1°С и вносили ферментный препарат зимолиазы, полученный, например, из культуральной жидкости бактерий Arthrobacter luteus B-2350, из расчета 6000 ед. акт. на 1 кг биомассы. От полученной суспензии отбирали пробу на определение титра на начало инкубации. Суспензию тщательно перемешивали и оставляли инкубироваться при температуре 30±1°С в течение 1 часа. После 1 ч инкубации отбирали пробу на определение титра и для расчета степени разрушения клеток дрожжей, по окончании инкубации суспензию охлаждали до 18±1°С и дезинтегрировали при давлении от 600 до 1400 бар (в частном случае исполнения при 1400 бар).
К полученному гомогенату загружали сухой хлорид натрия до его концентрации 1,5-2,5 М (в частном случае исполнения до 2,5 М) в целевом растворе. Смесь перемешивали в течение 15 мин при температуре 25±1°С до полного растворения соли в суспензии. Затем полученную суспензию охлаждали до 18±1°С и инкубировали при установленной температуре в течение 30 мин, затем центрифугировали при оборотах 15000 об/мин. Осадок утилизировали, а к полученному супернатанту добавляли спирт этиловый 96 % (или другой одноатомный спирт, например, не ограничиваясь указанным, метанол, пропанол, изопропанол, бутанол или изобутанол) до концентрации его в целевом растворе от 40 до 60 об. % и тщательно перемешивали в течение 4,0 ч. Затем полученный раствор охлаждали до 4±1°С и отстаивали при установленной температуре в течение 12 часов. Полученную после отстаивания суспензию центрифугировали при 15000 об/мин. Полученный осадок суммарной РНК лиофильно высушивали.
Идентификацию суммарной РНК проводили методами электрофореза в агарозном геле и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Пример 2. Изучение влияния различных условий в способах получения суммарной РНК из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae на выход суммарной РНК.
Для изучения влияния различных условий в способах получения суммарной РНК из биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, полученной после центрифугирования культуральной жидкости, на выход суммарной РНК авторы изобретения проделали ряд экспериментов по получению суммарной РНК различными способами. Результаты исследований представлены в таблице 1.
В способах получения суммарной РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae согласно таблице 1 анализировали различные способы разрушения клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae и процессы осаждения суммарной РНК.
Для проведения каждого из экспериментов, описанных в таблице 1, использовали по 3 кг биомассы киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448, полученных с одного процесса ферментации. Каждый эксперимент проводили 3 раза. Все целевые продукты, полученные по завершении экспериментов, лиофилизировали при одинаковых условиях. Аналогичные исследования проводили, используя биомассу других штаммов дрожжей, в частности, Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-872 и Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-1047. Статистически значимых различий в количестве выхода суммарной РНК по сравнению с результатами, приведенными в таблице 1, не наблюдалось.
Количественное содержание нуклеиновых кислот в лиофилизатах оценивали спектрофотометрическим методом (по методу Спирина) в пересчете на безводный и свободный от остаточных органических растворителей лиофилизат. Выход суммарной РНК оценивали по содержанию нуклеиновых кислот в лиофилизате за вычетом содержания ДНК (в пересчете на безводный и свободный от остаточных органических растворителей лиофилизат).
Для определения количественного содержания ДНК в лиофилизате (в пересчете на безводный и свободный от остаточных органических растворителей лиофилизат) использовали метод Дише. Для определения количественного содержания примесного белка в лиофилизате (в пересчете на безводный и свободный от остаточных органических растворителей лиофилизат) использовали метод Лоури. Молекулярно-массовое распределение оценивали с помощью электрофоретического разделения в 1% агарозном геле, предварительно проведя пробоподготовку образцов перед нанесением на гель методом фенол-хлороформной экстракции.
Таблица 1. Сравнение выхода суммарной РНК, полученной различными способами. |
||||
№ эксперимента | Условия разрушения клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae |
Условия осаждения суммарной РНК | Способ разрушения клеток дрожжей | Выход суммарной РНК на 100 г биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, мг |
Способ 1 | Ферментный препарат Arthrobacter luteus ATSS 21606, 36°С с последующим прогреванием при 75°С | Диафильтрация | Ферментативный | 760-900 |
Способ 2 | SDS до 2% + 25 об. % хлороформ; 25°С | 3,5М NaCl + этанол (или другой одноатомный спирт) до концентрации 60 об. % в целевом растворе | Химический | 300-400 |
Способ 3 | SDS до 1,0% + хлороформ до 25 % в растворе; 25-30°С; при очистке + SDS до 2,0 % | 3,5 М раствор LiCl; этанол (или другой одноатомный спирт) до концентрации 50-55 об. % в целевом растворе | Химический | 320-440 |
Способ 4 | 2,5% SDS, 100°С, больше или равно 40 мин | до 3,0 М раствор NaCl; промывка 3,0 М раствором NaCl | Химический, физический (температура) | 1260 - 1410 (c полной деструкцией дсРНК) |
Способ 5 | Олеиновая кислота, оттитрованная щелочью + 2,5 М NaOH; 98-102°С | 3,0 М раствор NaCl | Химический, физический | 1104- 1280 (c полной деструкцией дсРНК) |
Способ 6 | Олеиновая кислота, оттитрованная щелочью + 2,5 М NaOH; 98-102°С | отстаивание | Химический, физический | 1160-1368 (c полной деструкцией дсРНК) |
Способ 7 | 0,3-1,2 М раствор 2-этилгексановой кислоты + 92-98°С | этанол (или другой одноатомный спирт) до его концентрации в целевом растворе 50-55 об. % | Химический, физический | 1280- 1400 (c полной деструкцией дсРНК) |
Способ 8 (по настоящему изобретению) |
ферментный препарат, содержащий зимолиазу (например, полученный из культуральной жидкости бактерий Arthrobacter luteus B-2350) , 28-35°С, механическая гомогенизация (под давлением от 600 до 1400 бар) | раствор NaCl до достижения его концентрации 1,5-2,5 М в целевом растворе; этанол до достижения его концентрации (или другой одноатомный спирт) от 40 до 60 об. % в целевом растворе | Ферментативный, химический + механическая гомогенизация |
1930- 2240 |
В результате выделения суммарной РНК из клеток киллерных дрожжей штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448, согласно способу по настоящему изобретению (в таблице 1 способ 8), было получено в серии нескольких экспериментов в среднем от 57,9 г до 67,2 г суммарной РНК после всех этапов выделения и очистки первоначальной биомассы дрожжей, которая составляла 3 кг клеток Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448, полученных после культивирования, гомогенизации, центрифугирования и отделения супернатанта от осадка клеток. Таким образом, выход суммарной РНК после всех этапов выделения и очистки по настоящему изобретению составил от 1,93 до 2,24 г на 100 г биомассы дрожжей.
Дополнительно проводили идентификацию продукт суммарной РНК, полученной способами, указанными в табл. 1, методом электрофоретического разделения в 1% агарозном геле. Пробоподготовку всех образцов перед нанесением на гель проводили методом фенол-хлороформной экстракции. Результаты исследований представлены на Фиг. 1 и 2.
Как видно на Фиг. 1, на электрофореграмме образцов суммарной РНК, полученных способами 1, 2, 3 детектируются полосы, соответствующие различным формам дсРНК, распределенным по молекулярной массе.
На электрофореграмме образцов суммарной РНК, полученных способами 4, 5, 6, 7 полосы, соответствующие формам дсРНК, распределенные по молекулярной массе, не визуализируются (Фиг. 2).
Для оценки времени, за которое происходит разрушение дсРНК при нагревании суспензии клеток в 2,5% SDS при 100°С дополнительно провели эксперимент (способ 4) с отбором образцов на протяжении времени инкубирования суспензии при 100 °С. Образцы суспензии отбирали в следующих временных интервалах после старта инкубирования при 100 °С: через 5 минут, 20 минут, 40 минут, 60 минут, 80 минут и 100 минут.
На электрофореграмме видно (Фиг.3), что дсРНК в образцах начинают разрушаться уже через 5 минут после инкубирования клеток дрожжей при 100 °С. Через 20 минут после начала инкубирования дсРНК на электрофореграмме уже не визуализируются, а молекулярно-массовое распределение нуклеиновых кислот со временем инкубирования при температуре 100°С возрастает.
Анализ электрофореграмм продуктов суммарных РНК, полученных способами 4-7, показал, что диапазон молекулярно- массового распределения впРНК начинался от десятков пн до примерно 1000 пн. Низкая степень интенсивности окрашивания данных участков электрофореграмм говорит о слабом взаимодействии с интеркалирущим агентом (в нашем случае бромистым этидием). Это обстоятельство указывает на относительно низкое количество комплементарно сдвоенных участков молекул рибонуклеиновых кислот.
На электрофореграммах суммарных РНК, полученных способами 1-3, 8, наблюдаются ярко-выраженные полосы разных форм дсРНК.
Продукт суммарной РНК, полученный способом 1, содержал достаточно большое количество примесей, в том числе примесных белков (~ 20%), рибонуклеиновые кислоты (~ 57%), в том числе двуспиральную РНК (~ 10 % от содержания всех рибонуклеиновых кислот).
Продукт суммарной РНК, полученный способом 2, содержал, в том числе, примесные белки (~ 18%), рибонуклеиновые кислоты (~ 45%) (из них всего ~ 10 % дсРНК).
Продукт суммарной РНК, полученный способом 3, содержал, в том числе, дсРНК в количестве ~ 20% от содержания всех рибонуклеиновых кислот, примесные белки (~ 18 %).
Суммарная РНК, полученная способами 4, 5, 6, 7 вообще не содержала дсРНК. Поскольку для разрушения клеточных стенок дрожжей в этих способах дополнительно использовали физический метод (повышение температуры смеси до 98 - 100 °С), двуспиральные структуры разрушились и деградировали до впРНК с молекулярно-массовым распределением от 1000 п.н. и ниже.
Продукт суммарной РНК, полученный способом 4, содержал значительные количества примесных белков (~ 22 %), впРНК агрегатов РНК с полисахаридами и белками, а также олигорибонуклеотидов. Доля впРНК в препарате составила не менее 30%.
Продукты суммарной РНК, полученные способами 5 и 6 в результате применения для лизиса клеток дрожжей олеиновой кислоты/олеата натрия отличались содержанием высокого числа примесей (~ 25 % примесных белков), впРНК, агрегатов РНК с полисахаридами и белками, а также олигорибонуклеотидов.
Продукт суммарной РНК, полученный способом 7, аналогично способам 5 и 6 не отличался высокой чистотой и содержал высокое количество примесных белков (~ 30 %) и впРНК вследствие применения в качестве лизирующего агента 2-этилгексановой кислоты и условий высоких температур от 90°C.
Продукт суммарной РНК, полученный способом 8, содержал порядка 65 % рибонуклеиновых кислот, из которых около 40% составляла дсРНК, что значительно больше, чем в методах 1-3, примесных белков фиксировалось до 14 %.
Исходя из вышесказанного, предложенный способ получения суммарной РНК по настоящему изобретению позволяет значительно увеличить выход суммарной РНК в среднем, не менее, чем примерно в 1,3 раза, при этом количество дсРНК в составе суммарной РНК также существенно возрастает.
Claims (10)
1. Способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, характеризующийся тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором и ферментным препаратом зимолиазы, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия до достижения его концентрации 1,5-2,5 М в целевом растворе, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
2. Способ по п. 1, в котором используют дрожжи киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448.
3. Способ по п. 1, в котором биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором в массовом соотношении от 1:4-1:10.
4. Способ по п. 3, в котором биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором в массовом соотношении от 1:4.
5. Способ по п. 1, в котором процесс гомогенизации проводят под давлением 1400 бар.
6. Способ по п. 1, в котором ферментный препарат получают из культуральной жидкости бактерий Arthrobacter luteus B-2350 путем высаливания.
7. Способ по п. 1, в котором одноатомный спирт добавляют до его концентрации 45 об. % в целевом растворе.
8. Способ по п. 1, в котором одноатомный спирт представляет собой этанол.
9. Способ по п. 1, в котором хлорид натрия добавляют до достижения его концентрации 2,5 М в целевом растворе.
10. Способ по п. 1, в котором полученную суммарную РНК лиофильно высушивают.
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2781832C1 true RU2781832C1 (ru) | 2022-10-18 |
Family
ID=
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH10117794A (ja) * | 1996-10-18 | 1998-05-12 | Asahi Breweries Ltd | 酵母リボ核酸の製造方法 |
RU2302464C2 (ru) * | 2003-11-12 | 2007-07-10 | Николай Борисович Бажутин | Способ получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты |
RU2722731C2 (ru) * | 2018-07-18 | 2020-06-03 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Способ получения биологически активных компонентов из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae и лечебное средство на их основе |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH10117794A (ja) * | 1996-10-18 | 1998-05-12 | Asahi Breweries Ltd | 酵母リボ核酸の製造方法 |
RU2302464C2 (ru) * | 2003-11-12 | 2007-07-10 | Николай Борисович Бажутин | Способ получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты |
RU2722731C2 (ru) * | 2018-07-18 | 2020-06-03 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Способ получения биологически активных компонентов из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae и лечебное средство на их основе |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Левагина Г. М. Автореферат диссертации, Новосибирск, 2006, 28 с. * |
ШЕВЧЕНКО З.А. и др. Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук, 2017, 8-2, с. 9-13. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Möller et al. | A simple and efficient protocol for isolation of high molecular weight DNA from filamentous fungi, fruit bodies, and infected plant tissues. | |
CN107058295B (zh) | 一种全血dna快速提取方法 | |
KR20190139633A (ko) | 어류 정액 및 정소에서 피디알엔을 추출하는 방법 | |
DE2457090C2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen sowie Antibronchialimpfstoff | |
RU2781832C1 (ru) | Способ получения суммарной рнк из биомассы клеток дрожжей saccharomyces cerevisiae | |
KR102402360B1 (ko) | 넙치 정소 조직 유래 고순도 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (Polydeoxyribonucleotide, PDRN)의 추출방법 | |
CN111574598A (zh) | 一种提高amep412蛋白产量的方法及其在激发植物免疫中的应用 | |
US4645667A (en) | Antitumor agent and process for manufacturing said agent | |
JP4996934B2 (ja) | 組換え型リゾチームの製造法 | |
CH651317A5 (de) | Verfahren zur enzymatischen synthese von doppelstrangiger rna, nach diesem verfahren synthetisierte doppelstrangige rna und diese enthaltende interferon-induktoren. | |
RU2781833C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДВУСПИРАЛЬНОЙ РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ Saccharomyces cerevisiae | |
JP3031720B2 (ja) | 酵母からの低分子活性成分エキスおよびその製造方法 | |
CN112961218B (zh) | 具有广谱杀菌活性的肽及其制备方法与应用 | |
RU2722731C2 (ru) | Способ получения биологически активных компонентов из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae и лечебное средство на их основе | |
CN110218717B (zh) | 一种灵芝多糖的制备方法及其对超氧化物歧化酶干燥失活的保护作用 | |
RU2558256C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДВУСПИРАЛЬНОЙ РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ (дсРНК) ИЗ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ Saccharomyces cerevisiae | |
RU2790685C1 (ru) | Новый киллерный штамм дрожжей saccharomyces cerevisiae | |
CN113563488A (zh) | 一种医药级小分子海洋生物多糖的制备方法 | |
Turzhanova et al. | OPTIMIZATION OF DNA EXTRACTION FROM FILAMENTOUS FUNGI ALTERNARIA SP. AND FUSARIUM SP. | |
RU2422532C2 (ru) | Способ выделения низкомолекулярных ядерных рибонуклеопротеидов (рнп) из тканей и органов млекопитающих | |
CN106434570B (zh) | 一种狂犬病病毒裂解液及其应用 | |
RU2237719C2 (ru) | Способ получения липополисахаридов | |
RU2302464C2 (ru) | Способ получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты | |
RU2563816C1 (ru) | Способ получения иммуностимулятора | |
RU2072855C1 (ru) | Способ получения натриевой соли днк из молок рыб |