CN107058295B - 一种全血dna快速提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种全血DNA快速提取方法，步骤包括：S1、将血液样本高速离心后去掉上清液，保留沉淀，加入裂解液后混匀至澄清状态，置于50～60℃水浴40‑60min，冷却后采用有机溶剂抽提，离心后取上清液；S2、向上清液中加入异丙醇和NaAc，混匀后收集沉淀，清洗沉淀后晾干；S3、向沉淀中加入TEN缓冲液和核糖核酸酶，混匀后温育30min，再加入含有蛋白酶K的TEN缓冲液，混匀，水浴30min，冷却后离心，取上清液纯化得到纯净DNA。该方法对样本的处理量大，先通过高速离心去除大部分位于上清液的红细胞，再将沉淀的血细胞(白细胞)用自配的全细胞裂解液一步裂解血细胞，从血液中快速大量的得到适于三代测序的DNA。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及一种提取动物基因组DNA的方法，具体涉及一种用于三代测序的大量全血DNA快速提取方法。
背景技术
核酸测序技术如今已成为生物学研究领域的强大助手，第二代高通量测序技术的应用已取得诸多可喜可贺的成果，但技术原理决定了二代测序存在诸多弊端，如测序读长短、反复PCR扩增造成的扩增偏好性、难以覆盖高GC含量和重复序列区域等。而第三代高通量测序技术的出现，可以完美解决这些问题，其测序读长10～60kb甚至更长，无PCR扩增过程无GC偏向性等，在基因组的组装上对比二代有无与伦比的优势，也因为如此，三代测序对起始DNA样品的要求极高，尤其是在总量(至少8ug/cell)、纯度(A260/280＝1.8～2.0；A260/230＝2.0～2.2等)和完整度(片段大小在10kb以上)上。
DNA提取是分子生物学的基本实验，涉及了基因克隆、基因序列分析、基因重组和基因治疗，以及遗传育种等技术领域。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，提取DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。
大量血液提取流程一般是是先裂解红细胞收集有核血细胞沉淀(主要是白细胞)，或裂解所有细胞膜收集细胞核沉淀(主要是白细胞核)用于DNA提取，这一步骤可去掉血液绝大部分杂质且提高血细胞裂解效率，从而提高血液DNA的得率和纯度。
但此步骤的存在，首先是人力、物力和时间成本的增加；其次血液量越大，操作越复杂；第三是增加多次清洗和离心，血液DNA完整度受影响从而难以满足三代测序要求。
发明内容
鉴于此，本发明为了解决现有从血液中提取DNA存在的工艺繁琐、成本高耗时长、不适应三代测序的问题，采用对大量全血进行高速离心处理，得到血细胞，再用特殊配制的全细胞裂解液一步裂解血细胞，得到的一种适于三代测序的从血液中快速大量提取基因组DNA的方法，该方法最快可在3.5h内拿到合格DNA。
本发明提供了一种全血DNA快速提取方法，步骤包括：
S1、将血液样本在13000～16000rpm转速下离心后去掉上清液，保留沉淀，加入裂解液后混匀至澄清状态，置于50～60℃水浴40-60min，冷却后采用有机溶剂抽提，离心后取上清液；所述裂解液组份包括：0.8～1.2M盐酸胍；pH8.0～8.5、30～100mM Tris-Cl；pH8.0～8.5、30～100mM EDTA，体积百分比4～8％Tween-20，体积百分比0.3～1％Triton X-100，质量体积比0.3～1％SDS和0.3～1mg/ml蛋白酶K；
S2、向步骤S1所得上清液中加入异丙醇和NaAc，混匀后收集沉淀，清洗沉淀后晾干；
S3、向步骤S2所得晾干的沉淀中加入TEN缓冲液和核糖核酸酶，混匀后置于37℃温育30min，再加入含有蛋白酶K的TEN缓冲液，混匀，置于50～60℃下30min，冷却后离心，取上清液纯化得到纯净DNA。
本发明的有益效果是：
(1)能一次处理大量样品，在硬件和试剂保证的情况下，单次处理的血液样品量没有上限，如在本发明的一个实施例中血液样本达到7.5ml，相比于现有一次裂解技术的几百微升的样品量有明显提升；
(2)处理工艺简单；现有技术处理大量样品都是先加红细胞裂解液(温和裂解液)离心去掉红细胞，再加强裂解液裂解白细胞，或者全血加全细胞膜裂解液，得到白细胞核后再裂解细胞核来提取DNA，步骤繁琐复杂，得到的血液DNA完整度低；而本发明提供的方法通过高速离心，去除绝大部分红细胞，再将沉淀的血细胞(主要是有核白细胞等)用全细胞裂解液一次性裂解细胞膜和细胞核，再提取DNA，即仅需加一次特定组份的裂解液即可将白细胞中的DNA裂解出来，裂解充分且操作更加简单，同时减少了清洗和离心步骤，从而有效保证血液DNA的完整度，人力、物力和时间成本明显降低；
(3)采用本发明提供的方法，耗时短且DNA得率和品质好，最快可在3.5h内拿到适用于三代测序的DNA。
附图说明
图1为实施例一中样品的凝胶电泳检测结果图，采用0.7％琼脂糖凝胶，电泳条件为150V，30min；
图2为实施例一中样品的凝胶电泳检测结果图，采用0.7％琼脂糖凝胶，电泳条件为25V，15h；
图3为实施例二中样品的凝胶电泳检测结果图，采用0.7％琼脂糖凝胶，电泳条件为150V，30min；
图4为实施例二中样品的凝胶电泳检测结果图，采用0.7％琼脂糖凝胶，电泳条件为25V，14h。
具体实施方式
本发明提供了一种全血DNA快速提取方法，步骤包括：
S1、将血液样本在13000～16000rpm转速下离心后去掉上清液，保留沉淀，加入裂解液后混匀至澄清状态，置于50～60℃水浴40-60min，冷却后采用有机溶剂抽提，离心后取上清液；所述裂解液组份包括：0.8～1.2M盐酸胍；pH8.0～8.5、30～100mM Tris-Cl；pH8.0～8.5、30～100mM EDTA，体积百分比4～8％Tween-20，体积百分比0.3～1％Triton X-100，质量体积比0.3～1％SDS和0.3～1mg/ml蛋白酶K；
S2、向步骤S1所得上清液中加入异丙醇和NaAc，混匀后收集沉淀，清洗沉淀后晾干；
S3、向步骤S2所得晾干的沉淀中加入TEN缓冲液和核糖核酸酶，混匀后置于37℃温育30min，再加入含有蛋白酶K的TEN缓冲液，混匀，置于50～60℃下30min，冷却后离心，取上清液纯化得到纯净DNA。
其中，所述冷却均为自然冷却至室温15～35℃。
作为优选的，在本发明的一个实施例中，步骤S1中的裂解液为：0.8M盐酸胍，30mMTris-Cl(pH8.0)，30mM EDTA(pH8.0)，5％Tween-20，0.5％Triton-100，0.5％SDS和0.5mg/ml Proteinse K。
因为Triton X-100和Tween-20是非离子的表面活性剂，它们的头端基团是没有极性的亲水基团，可以破坏蛋白质-脂质以及脂质-脂质之间的连接，而红细胞和白细胞中除了蛋白质，另外还有氨基酸、脂肪、碳水化合物等，采用Triton X-100与Tween-20可以较好地分解细胞。盐酸胍是强电解质，因此变性总是伴随着高离子强度，在脲和盐酸胍变性的条件下，大多数的蛋白被变性，形成一种非常接近于无规卷曲的状态；SDS是一种非常高效的表面活性剂，几乎可以使所有的蛋白质溶解，它可以破坏蛋白质的非共价键，从而使蛋白质变性，并丧失天然构象和功能。蛋白酶K在SDS和EDTA存在下保持很高的活性。SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离。EDTA则抑制Dnase的活性；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。而Tris-Cl和EDTA形成的缓冲液利于DNA的稳定和储存。各个组分相互配合协同，只加一次裂解液即可将白细胞中的DNA裂解出来。
优选的，步骤S3所述TEN缓冲液组份为：50～100mM Tris(pH8.0～8.5)、50～100mMEDTA(pH8.0～8.5)、1～1.5M NaCl。
优选的，步骤S1中，裂解液添加量为血液样本体积的1.5～2.5倍，且裂解液预热至20～40℃后再添加至沉淀中。无需裂解红细胞步骤，直接取沉淀后加入裂解液即可，加入预热的裂解液后需充分打散沉淀混匀，保证裂解充分。所述血液样本需解冻完全，具体的，可将血液样本置于室温下解冻，或于37℃水浴解冻，37℃下仅需几十秒钟即可完成解冻，方便快捷。若采用新鲜血液，亦可按照此方案提取，可考虑先冻融一次，否则步骤S1离心时间和转速应适当增加，且务必保证血液没有凝聚。理论上此方案一次性处理的血液并没有上限，但是为保证DNA得率，优选每次2ml以上的血液样本量。1ml血液样本量可得8～10ug DNA，2ml血液样本量可得20～30ug DNA，5mL血液样本量可得至少120ug DNA。
优选的，步骤S1所述有机溶剂为氯仿异戊醇混合液，所述氯仿异戊醇体积比为23～25:1。
更加优选的，步骤S1中，抽提次数为1次。采用最佳的有机溶剂配比，保证抽提效果，只抽提1次，最大限度保证DNA的完整。
优选的，步骤S1中，所述水浴过程中每5～10min混匀1次。混匀操作应轻柔，上下颠倒须动作轻柔防止DNA断裂，定期混匀保证裂解更充分。
优选的，步骤S1中，所述离心时长8～15min，温度4～16℃。常温离心过程离心机易发热，不推荐使用。使用冷冻离心机保持16℃左右的低温可有效保护DNA。
优选的，步骤S2所述异丙醇用量为上清液体积的0.7～1倍，所述NaAc用量为上清液体积的0.1倍。异丙醇、NaAc添加后DNA一般会形成丝状或絮状沉淀，在本发明的实施例中，沉淀收集方式为挑出絮状沉淀，沉淀收集方式还可以是4℃下6000～12000rpm离心5～10min。
优选的，步骤S3所述含有蛋白酶K的TEN缓冲液稀释5～10倍使用，蛋白酶K的浓度为0.5～1mg/mL。
所述TEN缓冲液为100mM Tris，50mM EDTA，1.4M NaCl；pH8.5；TEN缓冲液可有效保护DNA同时高盐溶液可溶解如多糖等杂质，Proteinse K进一步去除残留蛋白。
优选的，步骤S3所述上清液纯化直接采用磁珠纯化，磁珠用比为0.5～1倍待纯化样品体积，快速高效。
下面将结合具体实施例对本发明提供的一种全血DNA快速提取方法予以进一步说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
实施例一
本实施例提供了一种全血DNA快速提取方法，具体步骤包括：
1)取人体血液样品7.5ml，置于室温解冻完全；
2)15000rpm 4℃离心15min，彻底去掉上清，只留下管底沉淀；
3)加入2V的37℃预热的裂解液(0.8M guanidine HCl，30mM Tris-Cl(pH8.0)，30mM EDTA(pH8.0)，5％Tween-20，0.5％Triton-100，0.5％SDS，0.5mg/ml Proteinse K)，用移液器将沉淀彻底打散混匀至澄清状态；
4)置于56℃水浴1h，每隔10min轻柔颠倒混匀一次；
5)冷却至室温后加入等体积氯仿异戊醇(24:1)抽提1次；
6)13000rpm离心10min(16℃)，取上清；
7)加入0.7V冷冻异丙醇和0.1V NaAc(pH5.2)，混匀；
8)挑出絮状沉淀，用75％冷冻乙醇清洗3次；
9)晾干，加入300ul TEN缓冲液(100mM Tris，50mM EDTA，1.4M NaCl；pH8.5)和2ulRNAse(100mg/ml)，混匀后置于37℃温育30min；
10)再加入200ul TEN(含1mg/ml Proteinse K)，混匀，置于56℃水浴30min；
11)冷却至室温后15000rpm离心8min，小心吸取上清到新的离心管，加入磁珠进行纯化，得到纯净DNA，整个提取过程耗时6小时以内，进一步的对所得DNA进行检测，结果如下：
一、质检结果如表1：
表1实施例一所得DNA质检结果表
二、电泳结果如附图1、附图2所示
其中，采用0.7％琼脂糖凝胶电泳检测。胶孔上方标注为样品编号，M1：15kb DNAMarker(15000、10000、7500、5000、2500、1000、250bp)；M2：λDNA/HindIII(23130、9416、6557、4361、2322、2027、564bp)。样品按Qubit浓度上样200ng。
实施例二
取猴子血液样品6ml，置于37℃水浴解冻完全；
2)15000rpm 4℃离心15min，彻底去掉上清，只留下管底沉淀；
3)加入2V的37℃预热的裂解液(0.8M guanidine HCl，30mM Tris-Cl(pH8.0)，30mM EDTA(pH8.0)，5％Tween-20，0.5％Triton-100，0.5％SDS，0.5mg/ml Proteinse K)，用移液器将沉淀彻底打散混匀至澄清状态；
4)置于56℃水浴1h，每隔10min轻柔颠倒混匀一次；
5)冷却至室温后加入等体积氯仿异戊醇(24:1)抽提1次；
6)13000rpm离心10min(16℃)，取上清；
7)加入0.7V冷冻异丙醇和0.1V NaAc(pH5.2)，混匀；
8)挑出絮状沉淀，用75％冷冻乙醇清洗3次；
9)晾干，加入300ul TEN缓冲液(100mM Tris，50mM EDTA，1.4M NaCl；pH8.5)和2ulRNAse(100mg/ml)，混匀后置于37℃温育30min；
10)再加入200ul TEN(含1mg/ml Proteinse K)，混匀，置于56℃水浴30min；
11)冷却至室温后15000rpm离心8min，小心吸取上清到新的离心管，加入1X磁珠进行纯化，得到纯净DNA并对所得DNA进行检测，结果如下：
一、质检结果如表2：
表2实施例二所得DNA质检结果表
二、电泳结果如附图3、附图4所示
其中，采用0.7％琼脂糖凝胶电泳检测。胶孔上方标注为样品编号，M1：15kb DNAMarker(15000、10000、7500、5000、2500、1000、250)；M2：λDNA/HindIII(23130、9416、6557、4361、2322、2027、564)。样品上样约200ng。
从实施例一、二的质检结果表可见，260/280的值均大于1.8，说明无蛋白和酚类物质污染；260/230的值大于2.0，表明无糖类、盐类或有机溶剂等污染。实施例一、二的琼脂糖凝胶电泳图可见，样品DNA条带清晰、明亮、无拖带且单一，说明完整性好，与M1、M2条带对比，样品DNA长度在20kb以上，满足三代测序需求。
实施例三
本实施例提供了一种全血DNA快速提取方法，具体步骤包括：
1)取人体血液样品5ml，置于室温解冻完全；
2)15000rpm 4℃离心15min，彻底去掉上清，只留下管底沉淀；
3)加入2.5V的37℃预热的裂解液(1.2M guanidine HCl，100mM Tris-Cl(pH8.0)，80mM EDTA(pH8.0)，4％Tween-20，0.3％Triton-100，0.3％SDS，0.3mg/ml Proteinse K)，用移液器将沉淀彻底打散混匀至澄清状态；
4)置于50℃水浴50min，每隔5min轻柔颠倒混匀一次；
5)冷却至室温后加入等体积氯仿异戊醇(25:1)抽提1次；
6)16000rpm离心8min(10℃)，取上清；
7)加入1V冷冻异丙醇和0.1V NaAc(pH5.2)，混匀；
8)挑出絮状沉淀，用75％冷冻乙醇清洗3次；
9)晾干，加入300ul TEN缓冲液(100mM Tris，50mM EDTA，1.4M NaCl；pH8.5)和2ulRNAse(100mg/ml)，混匀后置于37℃温育30min；
10)再加入200ul TEN(含0.8mg/ml Proteinse K)，混匀，置于56℃水浴30min；
11)冷却至室温后15000rpm离心8min，小心吸取上清到新的离心管，加入磁珠进行纯化，磁珠用比为1倍待纯化样品体积，得到纯净DNA，整个提取过程耗时5小时以内。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种全血DNA快速提取方法，其特征在于：所述方法用于三代测序DNA的提取，步骤包括：
S1、将血液样本在13000～16000rpm转速下离心后去掉上清液，保留沉淀，加入裂解液后混匀至澄清状态，置于50～60℃水浴40-60min，冷却后采用有机溶剂抽提，离心后取上清液；所述裂解液组份包括：0.8～1.2M盐酸胍；pH8.0～8.5、30～100mM Tris-Cl；pH8.0～8.5、30～100mM EDTA，体积百分比4～8％Tween-20，体积百分比0.3～1％Triton X-100，质量体积比0.3～1％SDS和0.3～1mg/ml蛋白酶K；
S2、向步骤S1所得上清液中加入异丙醇和NaAc，混匀后收集沉淀，清洗沉淀后晾干；
S3、向步骤S2所得晾干的沉淀中加入TEN缓冲液和核糖核酸酶，混匀后置于37℃温育30min，再加入含有蛋白酶K的TEN缓冲液，混匀，置于50～60℃下30min，冷却后离心，取上清液纯化得到纯净DNA；
步骤S1中，所述裂解液添加量为血液样本体积的1.5～2.5倍，且裂解液预热至20～40℃后再添加至沉淀中；所述抽提次数为1次，所述离心时长8～15min，温度4～16℃。
2.如权利要求1所述的全血DNA快速提取方法，其特征在于：步骤S3所述TEN缓冲液组份为：pH8.0～8.5、50～100mM Tris；pH8.0～8.5、50～100mM EDTA；1～1.5M NaCl。
3.如权利要求1所述的全血DNA快速提取方法，其特征在于：步骤S1所述有机溶剂为氯仿异戊醇混合液，所述氯仿异戊醇体积比为23～25:1。
4.如权利要求1所述的全血DNA快速提取方法，其特征在于：步骤S1中，所述水浴过程中每5～10min混匀1次。
5.如权利要求1所述的全血DNA快速提取方法，其特征在于：步骤S2所述异丙醇用量为上清液体积的0.7～1倍，所述NaAc用量为上清液体积的0.1倍。
6.如权利要求1所述的全血DNA快速提取方法，其特征在于：步骤S3所述含有蛋白酶K的TEN缓冲液稀释5～10倍使用，蛋白酶K的浓度为0.5～1mg/mL。
7.如权利要求1所述的全血DNA快速提取方法，其特征在于：步骤S3所述上清液纯化采用磁珠纯化，磁珠用比为0.5～1倍待纯化样品体积。
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