JP5824141B2 - 生体試料よりrnaを分離精製する方法 - Google Patents
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Description
(1)下記の二つの方法のいずれかで、脱水生体試料を準備する。
方法2:単細胞沈殿物を体積比1000:0-1000のホルムアミドと3M-13.5M一価カチオン塩水溶液との混合液に加えて、0〜25℃で懸濁させるか、あるいは、0〜37℃で20s〜20minホモジネートして,脱水生体試料を得る方法であって、前述の単細胞沈殿はグラム陽性菌培養細胞、グラム陰性菌培養細胞、真菌培養細胞、動物培養細胞、植物培養細胞、血液細胞又は精子細胞によるものである;
(2)200:0〜200の体積比で、前述の脱水生体試料を3M-13.5M一価カチオン塩水溶液と混合するか、或いは、体積比160:50:40で、前述の脱水生体試料、3M-13.5M一価カチオン塩水溶液、質量濃度が5%-40%のドデシル硫酸ナトリウムホルムアミドを混合して, 0〜95℃で0.5〜120minインキュベートし、0〜40℃で0〜10min放置する;
(3)200:400〜1000の体積比で工程(2)において得られたものの中に沈殿機能をする3M-13.5M一価カチオン塩水溶液を加えて、ミックスして、4〜25℃で0.15〜30min、2000〜16000gで遠心分離する。上清澄液を別の遠心管に移す;
(4)900:300〜800の体積比で、前述の上清澄液にイソプロパノールを加え、ミックスして、4〜37℃で1〜30min、2000〜16000gで遠心分離する。上相液、下相液及び両相の間の可視残余不純物固体を捨てて、遠心管底にある白いRNA沈殿物を得る。
(1)大腸菌JM109株(北京鼎国昌盛生物技術有限責任会社より購入)を接種したLB培地を37℃でシェーカ(180回転/分)で一晩培養する。1.5ml遠心管に本大腸菌培養菌液を1ml入れて、室温で、8000gで以上1分間遠心してから、液体を除去する。再度前述の遠心分離を行う。その後、マイクロピペットで残液を吸って出して、大腸菌JM109株細胞沈殿を得る。この大腸菌JM109株細胞沈殿に、ホルムアミドを160μl加えて、25℃で15s懸濁させてから、脱水生体試料を得る。大腸菌JM109株細胞沈殿とホルムアミドの比率は5mg:160μlである;
(2)160μl脱水生体試料に、質量パーセント濃度20%のSodium Dodecyl Sulfate(SDS)のホルムアミド溶液40μlを加えて、撹拌後、80℃で10minインキュベートして、細菌細胞を破裂させ、0℃で5min置く;
(3)工程(2)で得られたものに、沈殿機能を有する600μlの3.3M NaCl水溶液を加えて、ボルテックスして、5分間氷浴する。4℃で、8000gで1min遠心分離してから、上清澄液を別の遠心管に移す;
(4)上清澄液の中に600μlのイソプロパノールを加えて、ミックスして、4℃で8000gで2min遠心分離してから、液体を捨てて遠心管底にある白いRNA沈殿物を得る。
電気泳動図譜は図1の第1レーンに示されるように、本大腸菌RNA溶液サンプルの16s rRNA、23s rRNAのエッジが整然している。これにより抽出した大腸菌RNA溶液中のRNA分子が分解されていないことが実証された。
ホルムアミドで懸濁した大腸菌細胞は、80℃で当該細胞をインキュベートしても、ホルムアミド溶液中のRNases活性を有する全ての酵素を完全に抑制でき、RNA分子の分解を防ぐことができる。このことは実施例1の結果で実証された。
(1)-(2)は実施例1と同様である;
(3)工程(2)で得られた200μlの物質に沈殿機能をする3.57M NaCl、1.14M KCl水溶液を700μl加えて、ボルテックスしてミックスする。室温で、16000gで5min遠心する。上清澄液を別の遠心管に移す;
(4)上清澄液にイソプロパノールを500μl加えてミックスする。25℃で、16000gで5 min遠心する。上層液、下層液及び上下両層の間の可視残存不純物を除去して、遠心管底にあるRNA沈殿物を取る。
150μlの注射用水(RNases汚染なし)を注入して沈殿物を溶かす。RNAサンプルを2本の遠心管にそれぞれ50μl入れ、70℃で5分、60分インキュベートする。最後は、この二つの遠心管を室温で冷却する。
実施例1の方法と同じである。
電気泳動図譜は図1の第2レーン及び第3レーンのごとく、RNAサンプルはそれぞれ5分、60分間70℃保温されたものである。本大腸菌RNA溶液に2種のインキュベ―ト処理をしたサンプルは全く同じである。つまりそれらの16s rRNA、23s rRNAのエッジがきちんとしている。これにより抽出した大腸菌RNA溶液中のRNA分子が長時間保温テストをしても分解されていないことが実証された。
イソプロパノールで不純物を抽出し、RNA遠心沈殿方法で抽出した大腸菌RNAで得られたRNA溶液サンプルはRNAを分解させる核酸酵素を一切含まない。
生体試料からRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む:
それぞれ一定質量のSDS固体を量りとって、1.5ml遠心管に入れて、1mlホルムアミド液を注入して、70℃で10分間保温して、SDS固体を溶かす。1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%SDSのホルムアミド溶液を得る。大腸菌JM109株を接種したLB培地を37℃で180回転シェーカーで培養する。一晩培養した菌液を2ml取って、37℃で保温した100mlLB培地に入れて、37℃180回転シェーカーで3〜4時間培養する、その600nmにおける吸光度は0.8に達する。1.5ml遠心管を10個取って、一つずつ1mlの本大腸菌培養菌液を注入して、室温で、8000g以上で1分間遠心する。遠心管から液体を除去する。前記の遠心を再度繰り返して、残余液体を吸って出す。ぞれぞれ、200μlの0.00%(対照群)、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%SDSホルムアミド溶液で本遠心管中の細胞沈殿物を懸濁させる。
実施例1のアガロースシロップ電気泳動方法と同じである。
図2−1で示したように、取得したRNAサンプルの23s rRNA、16s rRNAバンドエッジがはっきりしているので、RNAは分解されていないことがわかる。ほかに、第4レーンのRNAバンドが一番明るい。細胞分離を行う場合、4%SDS−ホルムアミド懸濁液の場合、収率が最も大きいことがわかる。
RNA溶液サンプルを75μl取って、石英キュベットの中の2mlのTE溶液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,PH8.0)に入れてミックスする。そしてTE溶液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,PH8.0)を対照して、UV分光光度計で260nm,280nmにおける吸光度測定を行う。
図2−2で示したように、SDSがない場合でも、RNAが得られる。二価陽イオンSDS濃度が高くなるにしたがって、解離作用がますます強くなるが、4.00%SDSの細胞溶解液の解離効果が一番高い。すべてのRNAサンプルのOD260/OD280が2.1−2.25の間にある。タンパク質汚染なし、DNA汚染なし或いは極微量あることが図2−3で示されている。
本実施例は異なった濃度のSDSホルムアミド溶液による、80℃での大腸菌細胞の分解効果、タンパク質−RNA複合物を分離する効果を説明した。大腸菌を懸濁させるホルムアミド溶液が80℃で大腸菌細胞を分解させ、タンパク質−RNA複合物を分離させること(即ち解離作用)ができるが、SDSは解離作用を促進する働きがある。80℃で10分間解離する場合、4%SDS-ホルムアミド溶液で大腸菌細胞を懸濁させるとき、RNA収率が最大である。
生体試料大腸菌ATCC27853株からRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む:
(1)大腸菌ATCC27853株(北京鼎国昌盛生物技術有限責任会社より購入)を接種したLB培地をシェーカー(37℃180回転/分)で一晩培養する。一晩培養した菌液を2ml取って、37℃保温の100mlLB基地に入れて、37℃180回転/分のシェーカーで3〜4時間培養する。その600 nmにおける吸光度が0.8に達する。1.5ml遠心管を10個取って、一つずつ1mlの本大腸菌培養菌液を注入して、室温で、8000g以上で1分間遠心する。その後液体を除去する。前記の遠心を再度繰り返して、残余液体を吸って出す。大腸菌単細胞沈殿物を得る。
0℃で各単細胞沈殿物のある遠心管にそれぞれ200μlのホルムアミドを入れて懸濁させる。
(2)各遠心管にそれぞれ0μl 5M NaCl(対照群)、5μl 5M NaCl、10μl 5M NaCl、15μl 5M NaCl、20μl 5M NaCl、25μl 5M NaCl、30μl 5M NaCl、40μl 5M NaCl、50μl 5M NaCl、75μl 5M NaClを入れ、ミックスして、80℃で10分間インキュベートして、細菌細胞を破裂させる。その後、遠心管を室温で2分間置く;
(3)工程(2)で得られた物の中に沈殿作用をする3.57M NaCl,1.14M KClを含む水溶液を700μl入れて、ボルテックス混合して、室温で、16000gで1min遠心して、上清澄液を別の遠心管に移す;
(4)上清澄液にイソプロパノールを500μl加えてミックスする。25℃で、12000gで2min遠心分離する。上層液、下層液及び上下両層の間の可視残余不純物固体を除去して、遠心管底にあるRNA沈殿物を得る。
実施例1のアガロースシロップ電気泳動方法と同じである。
図3−1のとおり、200μlホルムアミド溶液と10〜50μl 5M NaCl溶液で細胞沈殿を懸濁させて取れたRNAサンプルの23s rRNA、16s rRNAバンドエッジがはっきりしている。そして、200μlホルムアミド溶液と20〜30μl 5M NaCl溶液で細胞沈殿を懸濁させる場合、RNAの収率が高い。
実施例3の分光光度計測定方法と同じである。
図3−2で示したように、NaClがない場合でも少量のRNAが得られる。5M NaCl水溶液の体積が増えるにしたがって、取れた大腸菌のRNAの産量も大きくなる。200μlホルムアミド溶液と20μl 5M NaCl溶液で細胞沈殿を懸濁する場合の収率は最大である。200μlホルムアミド溶液と10〜50μl 5M NaCl溶液で細胞沈殿物を懸濁する場合、得られたすべてのRNAサンプルのOD260/OD280が2.1−2.25の間にある(図3−3)。タンパク質汚染なし、DNA汚染がなし或いは極微量あることを実証した。
本実施例は200μlホルムアミド溶液と10〜50μl 5M NaCl溶液で細胞沈殿物を懸濁して、80℃でインキュベートして、大腸菌細胞を分解でき、有効的にタンパク質−RNA複合物を分離してネイキッドRNA分子が得られることを実証した。200μlホルムアミド溶液と20μlの5M NaCl溶液で細胞沈殿を懸濁する場合、RNAの収率が最も高く、タンパク質汚染とRNases汚染がない。前記の結果と実施例3とを帰納比較すれば、次のような結論が出る:加熱作用を通して、ホルムアミド中のNa+が有効的に細菌のタンパク質―RNA複合物を分離でき、ネイキッドインタクトなRNA分子が得られる。
生体試料からRNAを分離純化する方法は、次の工程を含む:
(1)氷上ダウンス型ホモジナイザーの中に4℃保存のホルムアミドを3mlと白菜若葉(市場より購入)を300mg入れて、20sホモジネートする;
(2)室温で、1.5ml遠心管を6本取って、1本ずつ200μlの白菜若葉ホルムアミドホモジネート液を入れて、それぞれ20μl、30μl、40μl、50μl、60μl、75μlの5M NaCl水溶液を注入して、ボルテックスミックスする;
遠心管を90℃で10分間インキュベートする。その後遠心管を室温で5分間置く;
(3)〜(4)は実施例2と同じである。
実施例1のアガロースシロップ電気泳動方法と同じである。
図4−1で示したように、200μl白菜若葉のホルムアミドホモジネート液と20−75μl 5M NaCl水溶液で細胞沈殿を懸濁して取れたRNAサンプルの26s rRNA、18s rRNAバンドエッジがはっきりしている。そして両者の輝度比は2:1に近い。そして、200μl白菜若葉ホルムアミドホモジネート液と40〜60μl 5M NaCl溶液をミックスして取れたRNA溶液は18s rRNAと26s rRNA電気泳動帯スペクトルが最も明るい。つまり、RNA収率が最も高い。
実施例3の分光光度計測定方法と同じである。
図4−2で示したように、200μl白菜若葉のホルムアミドホモジネート液に入れた5M NaClが多くなるにつれて、取れた白菜若葉RNAの収率も高くなる。200μlホルムアミドホモジネート液と50μl 5M NaCl溶液で90℃インキュベートする場合、RNAの収率が最大である。すべてのRNAサンプルのOD260/OD280が2.1−2.25の間にある。図4−3はタンパク質汚染なし、DNA汚染なし或いは極微量あることを示した。
本実施例は200μl白菜若葉ホルムアミドホモジネート液と10〜50μl 5M NaCl溶液で細胞沈殿物を懸濁して、90℃でインキュベートすれば、有効的に真核細胞のタンパク質−RNA複合物を分離し、ネイキッドRNA分子が得られることを実証した。200μl白菜若葉ホルムアミドホモジネート液と50μl 5M NaCl水溶液で90℃インキュベートする場合、RNA収量が一番高く、タンパク質汚染もRNases汚染もない。
生体試料よりRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む。
(1)氷上でダウンス型ホモジナイザーの中に2mlの4℃保存されたホルムアミド溶液と200mgの新鮮マウス(京白1号、中国医学科学院血液学研究所より購入)肝臓を入れて、20sホモジネートする;
(2)室温で、1.5ml遠心管に、工程(1)で取れたマウスン肝臓ホルムアミドホモジネート液200μlと5M NaCl水溶液50μlを入れて、ボルテックスミックスする。その後、遠心管を90℃で10分間インキュベートして、遠心管を室温で2分間放置する;
(3)工程(2)で得られたもの200μlに、沈殿機能をする700μlの3.57M NaCl、1.14M KClを含む水溶液を入れて、ボルテックスミックスして、室温で、16000gで5min遠心する。上清澄液を別の遠心管に移す;
(4)上清澄液の中に500μlのイソプロパノールを入れてミックスして、25℃で、16000gで10min遠心する。上層液、下層液と両層の間にある可視残余不純物固体を除去して、遠心管底にあるRNA沈殿物を得る。
実施例1のアガロースシロップ電気泳動方法と同じである。
取れたRNAサンプルの28s rRNAと18s rRNAバンドエッジがはっきりしていて、両者の輝度比が2:1に近い。
実施例3の分光光度計測定方法と同じである。
抽出したマウス肝臓RNAの収率は5.2μg/mg,得られたRNA溶液の260nmにおける吸光度の280nmにおける吸光度に対する比率は2.22である。
本発明の方法で、効率的に動物組織RNAを抽出できる。
生体試料からRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む
(1)〜(4)は実施例6と同じである。
実施例1のアガロースシロップ電気泳動方法と同じである。
取れたRNAサンプルの28s rRNAと18s rRNAのバンドエッジがはっきりしている。そして、両者の輝度比が2:1に近い。この結果は実施例6の分光光度計分析結果に近い。
実施例3の分光光度計測定方法と同じである。
取れたマウス肝臓RNAの収率は5.4μg/mgで、RNA溶液の260nmにおける吸光度の280nmにおける吸光度に対する比率は2.24である。本結果は実施例6の分光光度計分析結果に近い。
本発明の方法で取れたRNA沈殿物は、室温、体積パーセント濃度が95%のエタノール水溶液で浸されても、分離されていない。
生体試料よりRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む。
(1)氷上でダウンス型ホモジナイザーの中に2mlの4℃保存されたホルムアミド溶液と0.5mlの5MNaCl水溶液を入れてミックスして、200mgの新鮮マウス(京白1号)肝臓を入れて、1minホモジネートする;
(2)室温で、1.5ml遠心管に、工程(1)で取れたマウスン肝臓ホルムアミドホモジネート液を250μl入れて、遠心管を90℃で10分間インキュベートして、遠心管を室温で2分間放置する;
(3)〜(4)は実施例6と同様である。
実施例3の分光光度計測定方法と同じである。
取れたマウス肝臓RNAの収率は4.95μg/mgで、RNA溶液の260nmにおける吸光度の280nmにおける吸光度に対する比率は2.15である。本結果は実施例6の分光光度計分析結果に近い。
実施例1のアガロースシロップ電気泳動方法と同じである。
取れたRNAサンプルの28s rRNAと18s rRNAのバンドエッジがはっきりしている。そして、両者の輝度比が2:1に近い。この結果は実施例6の分光光度計分析結果に近い。
ホルムアミドと5M NaCl水溶液を4:1の体積比でマウス肝臓をホモジネートしてRNAを抽出する場合も、高品質で、高収率でRNAサンプルが得られる。
生体試料よりRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む
(1)4℃で保存されたホルムアミドを1ml、100mgの生理食塩水で洗浄したマウス(京白1号)の新鮮小腸を、1.5mlの遠心管に入れて、37℃で電気泳動ホモジナイザーで3回ホモジネートする(20000rpm、20秒ホモジネートする);
(2)実施例6と同じである;
(3)200μlの工程(2)で得られた物の中に沈殿機能をする700μlの3.57 M NaCl、1.14 M KClを含めた水溶液を入れて、ボルテックスミックスして、室温で、2000gで30min遠心して、上清澄液を別の遠心管に移す;
(4)実施例6と同じである。
実施例1のアガロースシロップ電気泳動方法と同じである。
取れたRNAサンプルの28s rRNAと18s rRNAのバンドエッジがはっきりしている。そして、両者の輝度比が2:1に近い。
実施例3の分光光度計測定方法と同じ。
取れたマウス小腸RNAの収率は1.21μg/mgで、RNA溶液の260nmにおける吸光度の280nmにおける吸光度に対する比率は2.22である。
本発明の方法で、高率的にマウス小腸RNAを抽出できる。
生体試料よりRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む。
(1)氷上でダウンス型ホモジナイザーの中に5mlの4℃保存のホルムアミドと500mgの新鮮油菜(Brassica campestris L.)若葉を入れて、十分にホモジネートする。
(2)室温で、7つの1.5ml遠心管に200μlの油菜若葉のホルムアミドホモジネート液と50μl 5M NaClの水溶液を入れて、ボルテックスミックスして、遠心管を1、2、5、10、15、20、30分間で、87.5℃でインキュベートしてから、遠心管を室温で2分間置く;
(3)〜(4)実施例6と同じである。
実施例3の分光光度計測定方法と同じである。
図5で示したように、抽出した油菜若葉のRNAの収率はインキュベート時間の増加に従って増大する。しかし、インキュベート時間が10分のときのRNAの収率は最大に近い。
5M NaCl水溶液を解離剤としてRNAを抽出する場合、インキュベート(解離)時間が10分のとき、取れたRNAの収率は最大収率に近い。
生体試料よりRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む:
(1)氷上でダウンス型ホモジナイザーの中に7mlの4℃保存のホルムアミドと700mgの新鮮サンザシ(Crataegus pinnatifida)若葉を入れて、充分にホモジネートする。
(2)1組9本ずつ、3組の1.5mlの遠心管を用意する;室温で、毎組の9本の遠心管に、それぞれ、200μl のサンザシ若葉のホルムアミドホモジネート液と0、4、7、9、10、11、15、20、25μlの13.5M LiCl水溶液を入れて、ボルテックスミックスする;この3組の遠心管をそれぞれ55、75、85℃で2分間インキュベートしてから、遠心管を室温で2分間放置する;
(3)〜(4)は実施例6と同じである。
実施例3の分光光度計測定方法と同じである。
図6で示したように、違ったインキュベート(解離)温度でサンザシ若葉RNAを抽出する場合、10μlの13.5M LiCl水溶液と200μlの若葉ホモジネート液の混合液を解離作用に使うとき、RNAの収率は最大。
1体積の13.5M LiCl水溶液と20体積のサンザシ若葉ホモジネート液の混合液を使って、ある特定の温度でインキュベート(解離)作用を行うとき、収率が最大である。
(1)氷上でダウンス型ホモジナイザーの中に7mlの4℃保存のホルムアミドと700mgの新鮮サンザシ(Crataegus pinnatifida)若葉を入れて、充分にホモジネートする;
(2)3組の1.5mlの遠心管を用意する;室温で、毎組の6本の1.5ml遠心管に、それぞれ、200μlのサンザシ若葉のホルムアミドホモジネート液と10μlの13.5M LiCl(解離剤)を入れて、ボルテックスミックスしてから、この3組の遠心管をそれぞれ55、75、85℃で0、1、2、5、10、20分間インキュベートする。その後、遠心管を室温で2分間放置する;
(3)〜(4)は実施例6と同じである。
実施例3の分光光度計測定方法と同じである。
図7で示したように、インキュベート(解離)温度が違うと、サンザシ若葉RNAの収率はインキュベート時間の延長に従って大きくなる。インキュベート時間が2分のとき、RNAの収率は最大に近い。
異なったインキュベート(解離)温度で13.5M LiCl水溶液でRNAを抽出する場合、インキュベート(解離)時間が2分間のときから、RNAの収率が最大に近い。
13.5M LiCl水溶液を使う場合の、解離温度とポプラ若葉RNA収率との関係
(1)氷上でダウンス型ホモジナイザーの中に7mlの 4℃保存のホルムアミドと700mgの新鮮ポプラ((Populus bonatii Levl))若葉を入れて、充分にホモジネートする。
(2)室温で、8本の1.5ml遠心管に、200μl のポプラ若葉のホルムアミドホモジネート液と10μl 13.5M LiCl水溶液を入れて、ボルテックスミックスする;遠心管を29、37、45、55、65、75、85、95℃で2分間インキュベートする;
(3)〜(4)は実施例6と同じである。
実施例1のアガロースシロップ電気泳動方法と同じである。
29〜85℃でインキュベート(解離)されたRNAの26s rRNAと18s rRNAのバンドエッジははっきりしており、分解されていない。95℃でインキュベート(解離)作用を受けたRNAの26s rRNAと18s rRNAのバンドエッジがはっきりしていない。RNAサンプルが分解されたことが分かった。
実施例3の分光光度計測定方法と同じである。
図8で示したように、異なったインキュベート(解離)温度でポプラ若葉RNAを抽出する場合、若葉RNAの収率はインキュベート温度が高くなるにしたがって大きくなる。85℃でインキュベート(解離)するとき、RNAの収率が最大に近い。
異なったインキュベート(解離)温度で13.5M LiCl水溶液でRNAを抽出する場合、インキュベート(解離)が85℃のとき、RNAの収率が最大である。そして、分解されていない。
(1)氷上でダウンス型ホモジナイザーの中に7mlの 4℃保存のホルムアミドと700mgの新鮮油菜(Brassica campestris L.)若葉を入れて、充分にホモジネートする。
(2)1.5mlの遠心管を1組4本ずつ、2組用意する。毎組4本の1.5ml遠心管に200μl の油菜若葉のホルムアミドホモジネート液と50μl 5M NaCl水溶液を入れて、ボルテックスミックスする;この2組の遠心管を90℃でインキュベートする;その後、遠心管を室温又は氷浴で0、2、5、10分間置く。
(3)〜(4)は実施例6と同じである。
実施例3の分光光度計測定方法と同じである。
図9で示したように、ホモジネート混合液が解離作用をしてから、あまり長時間置くと、RNAの収率が低くなる。解離作用をしてから5分間以内置く場合、RNA収率の低下がわずかだけである。低温(0℃)で解離してから冷却する場合、RNA収率の低下が起こりやすい。
解離作用を行ってから、ホモジネート混合液が5分間以内に置くのに限る。室温(25℃)で置くほうがいい。
1.実施例6の工程(1)〜(4)のとおり、マウス(京白1号)の肝臓よりRNAを抽出する;1ml体積パーセント濃度が70%のエタノール水溶液で白いRNA沈殿物を洗い、室温で、16000gで10s遠心して、洗浄液を捨てて、沈殿物を乾燥する。50μlの注射用水(RNases汚染なし)で20mgほどのマウス肝臓より取れたRNA沈殿物を溶かす。
2.Invitrogen会社のTrizol説明書のとおり、50mgのマウス肝臓RNAを抽出する。取れたRNA沈殿物を50μlのRNasesに汚染されていない水で溶かす。
3. KaTaRa会社の説明書のとおり、AMV逆転写酵素で前記の2つのRNAサンプルの第一鎖cDNAを合成する。
4. 下の表のとおりに、合成したcDNA溶液と各種の溶液を入れる。その中のprimer f とprimer rはβ-actin のcDNAを増幅させるための一対のプライマーである。それぞれ:
β-actin F 5’atcatgtttgagaccttcaaca 3’
β-actin R5’catctcttgctcgaagtcca 3’
増幅したDNA製品の長さは318bpである。
前記のRT-PCR増幅製品を1μl取って、1.2%の非変性アガロースシロップ(1xTAE電気泳動緩衝液)の中で電気泳動させる。
図10に示したように、本発明方法で約20mgのマウス肝臓より取れたRNAサンプルにβ-actin mRNA増幅をして得られたDNA製品断片を、Trizol試薬方法で50mgのマウス肝臓より取れたRNAサンプルのDNA製品断片と比較した場合、前者の輝度は後者の2倍である。
本発明方法で取れたマウス肝臓RNAは、Trizol試薬法で取れたRNAサンプルと比べて、酵素効果がより良い。
1.実施例14の工程(1)−(4)のとおり、油菜(Brassica campestris L.)若葉のRNAを抽出する;体積パーセント濃度が70%のエタノール水溶液1mlで、白いRNA沈殿物を洗い、室温で、16000gで10s遠心して、洗浄液を捨ててから、沈殿物を乾燥する。50μlの注射用水(RNases汚染なし)で、約20mgの油菜若葉より取れたRNA沈殿物を溶かす;
2.Invitrogen会社の Trizol説明書のとおり、50mgの油菜若葉のRNAを抽出する。取れたRNA沈殿物を50μlのRNasesに汚染されていない水で溶かす。
3. KaTaRa会社の説明書のとおり、AMV逆転写酵素で前記の2つのRNAサンプルの第一鎖cDNAを合成する;
4.下の表のとおりに、合成したcDNA溶液と各種の溶液を入れる。その中のprimer f とprimer rはβ-actinのcDNAを増幅させるための一対のプライマーである。それぞれ:
β-actin F5’ ggaatggtgaaggctggtt 3’
β-actin R5’ tcccgttctgcggtagtg 3’
増幅したDNA製品の長さは578bpである。
前記のRT-PCR増幅製品を1μl取って、1.2%の非変性アガロースシロップ(1xTAE電気泳動緩衝液)の中で電気泳動させる。
図11に示したように、本発明方法で約20mgの油菜若葉より取れたRNAサンプルにβ-actin mRNA増幅をして得られたDNA製品断片を、Trizol試薬方法で50mgの油菜若葉より取れたRNAサンプルのDNA製品断片と比較した場合、前者の輝度は後者の数倍である。
本発明方法で取れた油菜若葉RNAは、Trizol試薬法で取れたRNAサンプルと比べては、酵素効果がより良い。
生体試料よりRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む。
(1)氷上で4つの1.5ml遠心管に4℃保存のホルムアミドを1ml入れて、それぞれ、100mgの新鮮ポプラ成熟葉、マウス(京白1号、中国医学科学院血液学研究所より購入)心臓、マウス肺臓、マウス太もも筋肉を入れて、26500rpmで20s電動ホモジネートをして処理する;
(2)室温で、4つの1.5ml遠心管にみんな50μlの5M NaCl水溶液を入れてから、それぞれ200μlの工程(1)で取れた4つの脱水生体試料を入れて、ボルテックスミックスする;遠心管を90℃で10分間インキュベート(解離)して、室温で2分間置く。
(3)〜(4)は実施例6と同じである;
体積パーセント濃度が70%のエタノール水溶液1mlで、白いRNA沈殿物を洗い、室温で、16000gで10s遠心して、洗浄液を除去して、沈殿物を乾燥する。50μlの注射用水(RNases汚染なし)で沈殿物を溶かす。
実施例1のアガロースシロップ電気泳動方法と同じである。
取れたRNAサンプルの28s rRNA(或いは26s rRNA)と18s rRNAのバンドエッジがはっきりしている。輝度比は2:1に近い。
実施例3の分光光度計測定方法と同じである。
各組織より取れたRNAサンプルの収率と純度分析は表3で示したとおりである。
本発明方法で、よりよく多種類の動植物の組織RNAを抽出できる。
生体試料よりRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む:
(1)氷上で7つの1.5ml遠心管の中に4℃保存のホルムアミド1mlを入れてから、それぞれ、10mg、25mg、50mg、100mg、200mg、400mg、800mgの新鮮マウス(京白1号、中国医学科学院血液学研究所より購入)肝臓組織を入れて、26500rpmで20s電動ホモジネートする。800mgマウス肝臓を処理して得られた液体は粘性が高いので、捨てた;
(2)室温で、6本の1.5ml遠心管にそれぞれ50μlの5M NaCl水溶液を入れてから、それぞれ工程(1)で取れた6つの脱水生体試料を200μl入れる。その後、ボルテックスミックスする;遠心管を90℃で10分間インキュベートして、室温で2分置く。
(3)〜(4)は実施例6と同じである;
実施例1のアガロースシロップ電気泳動方法と同じである。
実施例3の分光光度計測定方法と同じである。
各組織より取れたRNAサンプルの収率分析は図12で示したとおりである。
本発明では、ホルムアミドを1mlとマウス肝臓組織を≦20mgの比率でホモジネートしてRNAを抽出する際、取れたRNAサンプルは分解されなかった。ホルムアミド1mlとマウス肝臓組織5mgの比率でホモジネートするときのRNA収率が一番高い。
生体試料よりRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む:
(1)氷上で10mlの遠心管1本に4mlの4℃保存のホルムアミドと0.4g新鮮ポプラ若葉を入れて、26500rpmで20s電動ホモジネートを3回行う;
(2)室温で、表4、表5のとおり、1.5ml遠心管を15個取って、全ての中に50μl 5M NaCl水溶液と200μlの工程(1)で取れた脱水生体試料を入れてから、ボルテックスミックスする;遠心管を90℃で10分間インキュベートしてから、室温で2分置く;
(3)表4、表5のとおり、工程(2)で得られた250μlの製品の中に沈殿機能をする3.57M NaCl水、1.14M KClを含んでいる水溶液(沈殿剤)を注入して、ボルテックスミックスする。室温で、16000gで5min遠心する。上清澄液を別の遠心管に移す;
(4)表4、表5のとおり、工程(3)で生じた上清澄液の中にイソプロパノールを入れて、ボルテックスミックスして、室温で放置して、遠心管中の液体は上下両層液に分けるかどうか、そして塩粒子が沈殿するかどうかを観察する。結果は表4表5のようである;25℃で、16000gで10 min遠心して、液体と中に懸濁した可視残余不純物固定を捨てると、遠心管底にある白いRNA沈殿物が得られる。
実施例1のアガロースシロップ電気泳動方法とは同じである。
RNAサンプルの電気泳動帯スペクトルの26s rRNAと18s rRNAのバンドエッジがはっきりしているかどうかで、RNAが分解されたかどうかを判断する。その結果は表4、表5のとおりである。
表4、表5からわかるように、イソプロパノールを入れて生じた両層液体を処理して、分解できないRNA製品が得られる;その原因としては、RNase活性のある酵素を含むすべてのタンパク質は両層の間にあるので、除去されたと考えられる。
生体試料よりRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む:
(1)実施例6の工程(1)と同じである;
(2)室温で、5本の1.5ml遠心管にそれぞれ200μlの工程(1)で取れたマウスン肝臓の脱水生体試料及び50μl、100μl、150μl 、200μl、250μlの3M NaCl水溶液を入れて、ボルテックスミックスする;その後、遠心管を90℃で10分間インキュベートして、室温で2分間置く;
(3)-(4)は実施例6の(3)-(4)と同じである;
体積パーセント濃度が70%のエタノール水溶液1mlで、白いRNA沈殿物を洗い、室温で16000gで10s遠心する。洗浄液を捨ててから、沈殿物を乾燥する。150μlの注射用水(RNases汚染なし)を入れて沈殿物を溶かす。
実施例1のアガロースシロップ電気泳動方法と同じである。
50μl-200μlの3M NaCl水溶液と200μlの脱水生体試料とを混合して生じたRNAサンプルの28s rRNAと18s rRNAのバンドエッジがはっきりしている。そして、両者の輝度比は2:1に近い。
本発明方法は動物組織RNAの抽出にとても良い方法である。
生体試料よりRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む:
(1)氷上でダウンス型ホモジナイザーの中に1ml の4℃保存のホルムアミドと新鮮マウス脾臓(京白1号、中国医学科学院血液学研究所より購入)を入れて、20sホモジネートする;
(2)室温で、4つの1.5ml遠心管に160μlの工程(1)で取れたマウスン脾臓脱水生体試料と40μlの質量体積比が10%、20%、30%、40%のドデシル硫酸ナトリウムホルムアミド溶液、50μlの5MNaClス溶液を入れて、ボルテックスミックスする;その後、遠心管を90℃で10分間インキュベート(解離)して、室温で2分間置く。
(3)〜(4)は実施例6の工程(3)−(4)と同じである;
実施例1のアガロースシロップ電気泳動方法とは同じである。
取れた4つのRNAサンプルは、その28s rRNAと18s rRNAのバンドエッジがはっきりしていて、両者の輝度比は2:1に近い。
本発明方法は、動物組織RNAの抽出にとても良い方法である。
生体試料よりRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む:
(1)新鮮マウス脾臓(京白1号、中国医学科学院血液学研究所より購入)を生理食塩水で10mlの遠心管に洗い流す。そして、とれた細胞懸濁液を均一的に5つの1.5ml遠心管に入れて、室温で5000gで10min遠心する。その後、液体を吸い出して、再び遠心する。遠心管の中の残余液体を吸い出して、単細胞沈殿物が得られる;室温で、5本の1.5ml遠心管の中に160μlのホルムアミドを入れて懸濁させる;
(2)室温で、前記の5本の1.5ml遠心管の中に40μlの質量濃度比が5%、10%、20%、30%、40%のドデシル硫酸ナトリウムホルムアミド溶液を注入して、懸濁してから、それぞれ50μlの 5M NaCl水溶液を入れてボルテックスミックスする;その後、遠心管を90℃で10分間インキュベートして、室温で2分間置く;
(3)〜(4)は実施例6の工程(3)−(4)と同じである;
実施例1のアガロースシロップ電気泳動方法とは同じ。
取れた5つのRNAサンプルは、その28s rRNAと18s rRNAのバンドエッジがはっきりしていて、両者の輝度比は2:1に近い。
本発明方法は、動物単細胞RNAの抽出にとても良い方法である。
生体試料よりRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む:
(1)氷上で5つのダウンス型ホモジナイザーの中にそれぞれ2mlの4℃保存のホルムアミド溶液と200mgの新鮮ポプラ若葉を入れて、20s、1min、5min 、10min、20minホモジネートする;
(2)-(4)は実施例6と同じである;
体積パーセント濃度が70%のエタノール水溶液1mlで、白いRNA沈殿物を洗い、室温で、16000gで10s遠心して、洗浄液を除去して、沈殿物を乾燥する。150μlの注射用水(RNases汚染なし)で沈殿物を溶かす。
実施例3の分光光度測定方法と同じである。
20s、1min、5min、10min、20minホモジネートして得られたRNAの収率はそれぞれ1.2μg/mg,2.2μg/mg,2.8μg/mg,3.1μg/mg,3.2μg/mgである。
生体試料よりRNAを分離精製する方法は、次の工程を含む:
(1)氷上で1つのダウンス型ホモジナイザーの中にそれぞれ2mlの4℃保存のホルムアミド溶液と200mgの新鮮ポプラ若葉を入れて、5minホモジネートする;
(2)氷浴中の1.5ml遠心管の中に、30μlの13.5M LiCl水溶液と200μlの工程(1)で取れた脱水生体試料を入れて、ボルテックスミックスする;その後遠心管を0℃氷浴で12時間インキュベートする;
(3)-(4)は実施例6の(3)−(4)と同じである;
体積パーセント濃度が70%のエタノール水溶液1mlで、白いRNA沈殿物を洗い、室温で、16000gで10s遠心して、洗浄液を除去して、沈殿物を乾燥する。150μlの注射用水(RNases汚染なし)で沈殿物を溶かす。
実施例1のアガロースシロップ電気泳動方法とは同じ。
取れたRNAサンプルは、その26ss rRNAと18s rRNAのバンドエッジがはっきりしていて、両者の輝度比は2:1に近い。
低温長時間インキュベートすれば、高品質のRNAが得られる。
Claims (8)
- (1)下記の方法1及び方法2のいずれかで、脱水生体試料を準備する工程と;
方法1:組織器官を、ホルムアミドと3M〜13.5M一価陽イオン塩水溶液との混合液(ホルムアミドと3M〜13.5M一価陽イオン塩水溶液との体積比1000:0〜1000(ただし、体積比1000:0を含まない))に入れて、0〜25℃で5s〜20minホモジネートして、脱水生体試料を得る方法であって、前記組織器官と前記混合液の比率は0.5〜200mg:1mlであり、前記組織器官は動物、植物又は真菌の組織器官である方法;
方法2:単細胞沈殿物を、ホルムアミドと3M〜13.5Mの一価陽イオン塩水溶液との混合液(ホルムアルデヒドとM〜13.5Mの一価陽イオン塩水溶液との体積比1000:0〜1000(ただし、体積比1000:0を含まない))に入れて、0〜25℃で懸濁するか、或いは0〜37℃で20s〜20minホモジネートして、脱水生体試料を得る方法であって、前記単細胞沈殿物はグラム陽性菌培養細胞、グラム陰性菌培養細胞、真菌培養細胞、動物培養細胞、植物培養細胞、血液細胞又は精液細胞によるものである方法;
(2)前記脱水生体試料と3M〜13.5Mの一価陽イオン塩水溶液とを、前記脱水生体試料と前記3M〜13.5Mの一価陽イオン塩水溶液との体積比を200:0〜200として混合するか、或いは、前記脱水生体試料と、3M〜13.5Mの一価陽イオン塩水溶液と、質量濃度が5%〜40%のドデシル硫酸ナトリウムのホルムアミド溶液とを、前記脱水生体試料と、前記3M〜13.5Mの一価陽イオン塩水溶液と、前記ホルムアミド溶液との体積比を160:50:40として混合して、0〜95℃で0.5〜120minインキュベートし、次いで0〜40℃で0〜10min放置する工程と;
(3)前記工程(2)で得られた生成物中に、タンパク質を含む細胞残渣の沈殿機能をする3.3M〜5Mの一価陽イオン塩水溶液を、前記生成物と前記3.3M〜5Mの一価陽イオン塩水溶液との体積比を200:400〜1000として入れてミックスして、4〜25℃で、2000〜16000gで0.15〜30min遠心した後、得られた上清澄液を別の遠心管に移す工程と;
(4)前記上清澄液中にイソプロパノールを、前記上清澄液と前記イソプロパノールの体積比を900:300〜800として入れてミックスして、4〜37℃で、2000〜16000gで1〜30min遠心し、上層液、下層液及び両層間にある可視残余不純物固体を捨て、遠心管底にある白いRNA沈殿物を得る工程と、
を含む、生体試料からRNAを分離精製する方法。 - 体積パーセント濃度が70%〜80%のエタノール水溶液で前記白いRNA沈殿物を洗浄し、4〜37℃で、2000〜16000gで10〜60s遠心し、洗浄液を捨て、前記沈殿物を乾燥する工程を更に含む、請求項1に記載の生体試料からRNAを分離精製する方法。
- 前記組織器官と前記混合液との比率は5〜100mg:1mlである、請求項1に記載の生体試料からRNAを分離精製する方法。
- 前記一価陽イオン塩は、塩化リチウム、塩化ナトリウム、及び、塩化カリウムから選ばれる少なくとも一種である、請求項1に記載の生体試料からRNAを分離精製する方法。
- 前記一価陽イオン塩は、塩化ナトリウム又は塩化リチウムである、請求項4に記載の生体試料からRNAを分離精製する方法。
- 前記沈殿機能をする一価陽イオン塩は、塩化リチウム、塩化ナトリウム、及び、塩化カリウムから選ばれる少なくとも一種である、請求項1に記載の生体試料からRNAを分離精製する方法。
- 前記沈殿機能をする一価陽イオン塩は、塩化ナトリウム又は塩化カリウムである、請求項6に記載の生体試料からRNAを分離精製する方法。
- 前記工程(4)は、前記上清澄液の中にイソプロパノールを、前記上清澄液とイソプロパノールの体積比を700:400〜600として入れて、ミックスし、20〜25℃で、8000〜12000gで2min遠心し、上層液、下層液及び両層間にある可視残余不純物固体を捨て、遠心管底にある白いRNA沈殿物を得る工程である、請求項1に記載の生体試料からRNAを分離精製する方法。
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Family Cites Families (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US5075430A (en) | 1988-12-12 | 1991-12-24 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Process for the purification of DNA on diatomaceous earth |
US5234809A (en) | 1989-03-23 | 1993-08-10 | Akzo N.V. | Process for isolating nucleic acid |
US5155018A (en) | 1991-07-10 | 1992-10-13 | Hahnemann University | Process and kit for isolating and purifying RNA from biological sources |
DE4139664A1 (de) | 1991-12-02 | 1993-06-03 | Diagen Inst Molekularbio | Vorrichtung und verfahren zur isolierung und reinigung von nukleinsaeuren |
JPH06165676A (ja) * | 1992-06-16 | 1994-06-14 | Wako Pure Chem Ind Ltd | マイコバクテリウム属の菌体からの核酸鎖抽出方法 |
JP3615545B2 (ja) * | 1993-02-01 | 2005-02-02 | キアゲン・エヌ・ブイ | 第四級アンモニウム塩界面活性剤及びそのrnaの単離剤 |
US6180778B1 (en) | 1994-02-11 | 2001-01-30 | Qiagen Gmbh | Process for the separation of double-stranded/single-stranded nucleic acid structures |
WO1995034569A1 (de) | 1994-06-14 | 1995-12-21 | Invitek Gmbh | Universelles verfahren zur isolierung und reinigung von nukleinsäuren aus extrem geringen mengen sowie sehr stark verunreinigten unterschiedlichsten ausgangsmaterialien |
US5945515A (en) | 1995-07-31 | 1999-08-31 | Chomczynski; Piotr | Product and process for isolating DNA, RNA and proteins |
US6475388B1 (en) | 1996-11-13 | 2002-11-05 | Transgenomic, Inc. | Method and system for RNA analysis by matched ion polynucleotide chromatography |
US6958392B2 (en) | 1998-10-09 | 2005-10-25 | Whatman, Inc. | Methods for the isolation of nucleic acids and for quantitative DNA extraction and detection for leukocyte evaluation in blood products |
DE19900638C2 (de) | 1999-01-11 | 2002-12-19 | Max Planck Gesellschaft | Methode zur Isolierung von DNA aus biologischen Materialien |
US6310199B1 (en) | 1999-05-14 | 2001-10-30 | Promega Corporation | pH dependent ion exchange matrix and method of use in the isolation of nucleic acids |
US6953686B1 (en) | 1999-05-28 | 2005-10-11 | Cambrex Bio Science Baltimore, Inc. | Methods of DNA purification and purified DNA |
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