CN107475250B - 一种肠道内容物宏基因组dna提取的前处理方法 - Google Patents

一种肠道内容物宏基因组dna提取的前处理方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法。本发明前处理方法是在肠道内容物样品中加入去腐剂清洗2遍，再加入去核酸酶溶液清洗，通过冻融法、裂解法对细胞进行裂解，充分释放其中的DNA，最后加入蛋白酶K、SDS和RNA酶去除细胞里面的蛋白质、纤维和RNA，所得产物经常规方法即可得到肠道内容物宏基因组DNA。本发明前处理方法对于杂食性动物的肠道内容物宏基因组DNA的提取有明显的效果，提取的纯度及提取量都能满足PCR扩增、高通量测序等下游实验，具有很强的实用性。

Description

一种肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法
技术领域
本发明属于基因提取技术领域，更具体地说，涉及一种肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法。
背景技术
鱼肠道微生物在鱼类发育以及健康中起着非常重要的作用，1998年美国科学院第一次提出宏基因组学的概念，通过分析鱼肠道内容物宏基因组能知道鱼类平时的饮食习惯，肠道内益生菌/有害菌以及其他外来入侵菌的组成，从而更好的了解鱼类肠道内环境的平衡以及菌种组成。但由于鱼类在水中环境极为复杂，鱼类的食物来源也多，从而导致在提取过程中出现降解严重或提取不到的情况，最主要是鱼类肠道自身分泌的核酸酶对宏基因组的提取有很大的困难。
目前，对于鱼肠道宏基因组提取的方法有通过粪便试剂盒，基本手提法的方法去提取。但由于存在腐蚀性鱼类这一特殊的鱼种，它们平时的饮食极为复杂，不仅有浮游生物，有海草，还有其他腐类物质，而往往哪些物质是非常容易使提取出来的基因组降解，所以粪便试剂盒在此种鱼类的提取中基本很难提取出适合于宏基因组的研究，而基本手提法也提取不出腐蚀性鱼类的宏基因组。
发明内容
本发明的目的在于：克服现有方法很难在腐蚀性鱼类的肠道物质中提取到宏基因组DNA等问题，提供一种肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法，该方法处理后再经常规DNA提取步骤，可高效提出完整的肠道内容物宏基因组 DNA。
为了实现上述发明目的，本发明提供一种肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法，其包括如下步骤：
(1)在肠道内容物样品中加入去腐剂清洗2遍、离心去上清；
(2)加入去腐剂和1mM的EDTA溶液清洗；
(3)通过冻融法并加入10mg/ml的溶菌酶对细胞进行裂解；
(4)在65℃下加入蛋白酶K、摩尔质量为10％的SDS去除蛋白质和纤维；
(5)加入终浓度为20mg/ml的RNA酶去除RNA；
其中，所述去腐剂包括0.5M的EDTA、1M的Tris-HCl、0.1M的NaH2PO4、 0.1M的Na2HPO4和1.5M的NaCl。
作为本发明肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法的一种优选技术方案，所述过滤除菌是使用0.22μm滤膜过滤。
作为本发明肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法的一种优选技术方案，步骤(1)中，所述肠道内容物样品为0.3～0.5g。可见，本发明前处理方法仅需少量样品即可完成。
作为本发明肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法的一种优选技术方案，步骤(1)中，所述肠道内容物样品为鱼类或人类的前肠道内容物、中肠道内容物和/或后肠道内容物；其中，肠道内容物可包括粪便、泥石、水草、鱼类吞食的水体微生物等。
作为本发明肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法的一种优选技术方案，步骤(3)中，所述冻融法是-80℃冷冻15min，65℃融解5min；更进一步地，所述冻融法重复3次，使细胞更好的裂解，充分释放其中的DNA。
作为本发明肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法的一种优选技术方案，步骤(3)中，所述对细胞进行裂解是在37℃下加热25min，使溶菌酶充分裂解细胞。
作为本发明肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法的一种优选技术方案，步骤(3)中，所述对细胞进行裂解后，将温度升高到95～100℃，持续5～10min 后，待温度下降至65℃时，再进行步骤(4)。这样做的原因是：蛋白酶K在适合的温度可以使细胞内的蛋白质降解，配合SDS溶液可以使附着在DNA上的蛋白质从DNA上脱离下来。本发明经实验发现，在65℃下加热能使蛋白酶K 更好的去除蛋白质而得到纯净的DNA，对于较难获得基因组的物质，可以在加入溶菌酶裂解后把温度提高到95℃或以上的温度(最高不高于100℃)继续裂解细胞5～10min，待温度下降至65℃时，再加入蛋白酶K，可得到分子量更大、纯度更高的DNA。
作为本发明肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法的一种优选技术方案，步骤(4)中，所述加入蛋白酶K和SDS反应的时间为1h。
作为本发明肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法的一种优选技术方案，步骤(5)中，所述加入RNA酶反应的时间为15min。
经本发明上述前处理方法处理样品后，再经常规DNA提取步骤(酚、氯仿、异戊醇抽提等)和DNA回收试剂盒，即可提取回收得到肠道内容物样品中的宏基因组DNA。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过加入去腐剂对样品清洗后，加入EDTA抑制腐蚀性鱼类自身分泌的核酸酶，再通过较为温和的冻融法和溶菌酶对细胞进行刺破裂解，释放出细胞内容物，此时的DNA处于稳定状态，此时加入蛋白酶K和10％SDS更好裂解细胞除去蛋白质，再加入RNA酶除去RNA，然后通过酚、氯仿、异戊醇抽提的方法进一步除去蛋白质，得到纯度更高的DNA基因组，此方法能够处理试剂盒提取不了的鱼类肠道内容物，提取的纯度及提取量都能满足PCR扩增、高通量测序等下游实验，具有很强的实用性。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式，对本发明及有益效果进行详细说明。
图1是本发明方法提取鳙鱼肠道内容物宏基因组DNA的电泳图，其中， Y1～Y3为鳙鱼肠道内容物宏基因组DNA，M为marker。
图2是本发明方法提取草鱼肠道内容物宏基因组DNA的电泳图，其中，M 为marker，C为草鱼肠道内容物宏基因组DNA。
图3是现有方法提取鳙鱼和草鱼肠道内容物宏基因组DNA的电泳图，其中， M为marker，Y为鳙鱼肠道内容物宏基因组DNA，C为草鱼肠道内容物宏基因组DNA。
图4是天根粪便DNA提取试剂盒电泳图，其中，M为marker，Y为鳙鱼肠道内容物宏基因组DNA，C为草鱼肠道内容物宏基因组DNA。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的配方、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。
实施例1
本发明方法提取鳙鱼肠道内容物宏基因组DNA：
(1)取0.25g新鲜鳙鱼肠道内容物样品到15ml离心管，加入去腐剂，充分涡旋，11000g离心10min(可洗2遍)。
(2)弃上清，加入去腐剂+0.5mM EDTA混合液，充分涡旋。
(3)冷冻-80℃，15min，加热65℃，5min(重复3次)。
(4)加入溶菌酶，37℃，25min(之后95℃，5～10min)。
(5)加入蛋白酶K，10摩尔质量％SDS 65℃，1h(每15min上下颠倒)。
(6)加入RNA酶37℃，15min(加入到20mg/ml最终浓度)。
(7)4℃，11000rpm离心10min。
(8)吸取上清液至新的50ml离心管，加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇 (25:24:1)提取2次(蛋白层不见即可)。
(9)吸取上清液至新的50ml离心管，加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)抽提1次(蛋白层不见即可)。
(10)吸取上清液至新的50ml离心管，加入0.6倍体积异丙醇，缓缓上下颠倒20次，室温放置1h。
(11)用OMEGA回收试剂盒进行回收DNA，电泳，结果请见图1和表1。
实施例2
本发明方法提取草鱼肠道内容物宏基因组DNA：
(1)取0.25g新鲜草鱼肠道内容物样品到15ml离心管，加入去腐剂，充分涡旋，11000g离心10min(可洗2遍)。
(2)弃上清，加入去腐剂+1mM EDTA混合液，充分涡旋。
(3)冷冻-80℃，15min，加热65℃，5min(重复3次)。
(4)加入溶菌酶，37℃，25min(之后95℃，5～10min)。
(5)加入蛋白酶K，10摩尔质量％SDS 65℃，1h(每15min上下颠倒)。
(6)加入RNA酶37℃，15min(加入到20mg/ml最终浓度)。
(7)4℃，11000rpm离心10min。
(8)吸取上清液至新的50ml离心管，加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇 (25:24:1)提取2次(蛋白层不见即可)。
(9)吸取上清液至新的50ml离心管，加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)抽提1次(蛋白层不见即可)。
(10)吸取上清液至新的50ml离心管，加入0.6倍体积异丙醇，缓缓上下颠倒20次，室温放置1h。
(11)用OMEGA回收试剂盒进行回收DNA，电泳，结果请见图2和表1。
表1
对比例1
现有技术提取鳙鱼和草鱼肠道内容物宏基因组DNA：
(1)加入PBS缓冲液把鳙鱼肠道内容物样品洗2遍。
(2)去上清，再加入PBS缓冲液，放入-80℃，15min，65℃，5min(重复 3次)。
(3)加入溶菌酶，37℃，1h。
(4)加入蛋白酶K，10摩尔质量％SDS 65℃，1h(每15min上下颠倒)。
(5)加入10ul RNA酶37℃，10min。
(6)4℃，11000rpm离心10min。
(7)吸取上清液至新的50ml离心管，加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇 (25:24:1)提取2次(蛋白层不见即可)。
(8)吸取上清液至新的50ml离心管，加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)抽提1次(蛋白层不见即可)。
(9)吸取上清液至新的50ml离心管，加入0.6倍体积异丙醇，缓缓上下颠倒20次，室温放置1h。
(10)用OMEGA回收试剂盒进行回收DNA。
草鱼肠道内容物宏基因组DNA提取步骤同上，样品改为草鱼肠道内容物即可。电泳结果如图3和表2所示。
表2
对比例2
天根粪便DNA提取试剂盒提取鳙鱼和草鱼肠道内容物宏基因组DNA：
操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。结果如图4和表3。
表3
宏基因组需要的主带较为明亮，主带越清晰，说明里面含有的DNA越多且不被降解，请参见图1、2电泳图，其主带清晰可见；图3主带模糊，或DNA 已经降解掉没有主带；图4主带模糊；因此，对于研究宏基因组来说，只有图1、 2合格，而图3、4则达不到研究的要求，可见本发明前处理方法优于现有技术和现有的试剂盒。
另外，宏基因组的研究还需要DNA具备纯度高、量多2个要求，在吸收峰对比上，260/280吸收峰比值、230/260吸收峰比值初步反映了DNA的纯度，表 1与表3的纯度比表2好，表1的DNA浓度比表2、表3要高，总体来说只有表1的数据达到了研究宏基因组的要求，可见本发明前处理方法优于现有技术和现有的试剂盒。
上列详细说明是针对本发明之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。

Claims (8)

1.一种肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在肠道内容物样品中加入去腐剂清洗2遍、离心去上清；
(2)加入去腐剂和1mM的EDTA溶液清洗；
(3)通过冻融法并加入10mg/ml的溶菌酶对细胞进行裂解；
(4)在65℃下加入蛋白酶K、摩尔质量为10％的SDS去除蛋白质和纤维；
(5)加入终浓度为20mg/ml的RNA酶去除RNA；
其中，所述去腐剂包括0.5M的EDTA、1M的Tris-HCl、0.1M的NaH2PO4、0.1M的Na2HPO4和1.5M的NaCl；
步骤(1)中，所述肠道内容物样品为鱼类的前肠道内容物、中肠道内容物和/或后肠道内容物。
2.根据权利要求1所述的肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法，其特征在于，步骤(1)中，所述肠道内容物样品为0.3～0.5g。
3.根据权利要求1所述的肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法，其特征在于，步骤(3)中，所述冻融法是-80℃冷冻15min，65℃融解5min。
4.根据权利要求3所述的肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法，其特征在于，所述冻融法重复3次。
5.根据权利要求1所述的肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法，其特征在于，步骤(3)中，所述对细胞进行裂解是在37℃下加热25min。
6.根据权利要求5所述的肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法，其特征在于，步骤(3)中，所述对细胞进行裂解后，将温度升高到95～100℃，持续5～10min后，待温度下降至65℃时，再进行步骤(4)。
7.根据权利要求1所述的肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法，其特征在于，步骤(4)中，所述加入蛋白酶K和SDS反应的时间为1h。
8.根据权利要求1所述的肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法，其特征在于，步骤(5)中，所述加入RNA酶反应的时间为15min。
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