CN114369537A - 粪便保存液及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种粪便保存液，包括10mM‑300mM的离子强度维持剂、5mM‑100mM的抗凝剂、30％‑90％的固定剂、0.1％‑2％的裂解剂、0.01％‑4％的去除剂、2mM‑200mM的缓冲剂以及水。该粪便保存液能够在低温、常温状态下使用并有效保持粪便样本中肠道微生物的稳定性，有利于粪便样本的保存，扩展了生物样品采集的能力，同时有利于后续肠道微生物基因的提取，有助于肠道微生物的研究。本申请还提供了粪便保存液的制备方法和应用。

Description

粪便保存液及其制备方法和应用

技术领域

本申请涉及生物技术领域，具体涉及粪便保存液及其制备方法和应用。

背景技术

人体肠道存在大量微生物，与人体组成一个高度复杂的共生体系。肠道微生物与代谢综合征、心血管疾病、癌症、类风湿性关节炎以及中枢神经系统疾病的发生有着密切的关联。因此，肠道微生物的研究是国内外科研的热点研究项目。

肠道微生物样本通常是采集粪便，然而粪便离体后，由于环境的巨大变化其中严格的厌氧微生物不再增殖，甚至死亡，兼性厌氧微生物仍能增殖生长，因此，采集后的粪便样本应当在短时间内合理的保存，保证肠道菌群结构基本不变。目前，粪便样本采集后立即进行超低温冷冻是目前公认的可以保持微生物菌群结构不发生变化的保存方式。然而超低温冷冻保存需要大型冷冻设备，同时采样范围受限。因此，开发了一种可以在日常条件下使用并且有效保持粪便样本中肠道微生物稳定性的保存液是非常有必要的。

发明内容

有鉴于此，本申请提供了一种粪便保存液及其制备方法和应用，该粪便保存液能够在低温、常温状态下使用并有效保持粪便样本中肠道微生物的稳定性，有利于粪便样本的保存，扩展了生物样品采集的能力，同时有利于后续肠道微生物基因的提取，有助于肠道微生物的研究。

第一方面，本申请提供了一种粪便保存液，包括10mM-300mM的离子强度维持剂、5mM-100mM的抗凝剂、30％-90％的固定剂、0.1％-2％的裂解剂、0.01％-4％的去除剂、2mM-200mM的缓冲剂以及水。

可选的，所述裂解剂的含量为0.2％-1.5％。

可选的，所述去除剂的含量为0.1％-2％。

可选的，所述固定剂的含量为40％-80％

可选的，所述粪便保存液包括20mM-200mM的所述离子强度维持剂、10mM-50mM的所述抗凝剂、40％-80％的所述固定剂、0.2％-1.5％的所述裂解剂、0.1％-2％的所述去除剂和10mM-100mM的所述缓冲剂。

可选的，所述离子强度维持剂包括氯化钠、氯化钾和柠檬酸钠中的至少一种。

可选的，所述抗凝剂包括乙二胺四乙酸和柠檬酸钠中的至少一种。

可选的，所述固定剂包括甲醇、乙醇和异丙醇中的至少一种。

可选的，所述裂解剂包括异硫氰酸胍、十六烷基三甲基溴化铵、β-巯基乙醇和苯酚中的至少一种。

可选的，所述去除剂包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯聚吡咯烷酮、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、半胱氨酸和三羟甲基氨基甲烷硼酸盐中的至少一种。

可选的，所述缓冲剂包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、磷酸盐、N,N-二羟乙基甘氨酸和3-环已氨基丙磺酸中的至少一种。

可选的，所述粪便保存液包括10mM-300mM的氯化钠、5mM-100mM的乙二胺四乙酸、30％-90％的乙醇、0.1％-2％的异硫氰酸胍、0.01％-4％的聚乙烯吡咯烷酮和2mM-200mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐。进一步的，所述粪便保存液包括150mM的氯化钠、25mM的乙二胺四乙酸、70％的乙醇、0.5％的异硫氰酸胍、0.75％的聚乙烯吡咯烷酮和100mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐。

可选的，所述粪便保存液的pH值为7-9.2。进一步的，所述粪便保存液的pH值为8-8.5。

本申请第一方面提供的粪便保存液能够稳定粪便样本中微生物的数量、组成和丰度，保证肠道微生物研究的准确性，并且该粪便保存液能够在常温环境中对粪便样本进行保存，适用范围广，同时该粪便保存液还有利于后续肠道微生物基因的提取，有助于肠道微生物的研究。

第二方面，本申请提供了一种粪便保存液的制备方法，包括：将离子强度维持剂、抗凝剂、固定剂、裂解剂、去除剂和缓冲剂与水混合，经灭菌后得到粪便保存液，其中所述粪便保存液包括10mM-300mM的所述离子强度维持剂、5mM-100mM的所述抗凝剂、30％-90％的所述固定剂、0.1％-2％的所述裂解剂、0.01％-4％的所述去除剂，以及2mM-200mM的所述缓冲剂。

本申请第二方面提供的粪便保存液的制备方法简单，操作方便，可用于大规模生产和应用。

第三方面，本申请提供了一种粪便样本保存方法，采用第一方面所述的粪便保存液，或第二方面所述的制备方法制得的粪便保存液保存粪便样本。

本申请第三方面提供粪便样本的保存方法操作简单，可以在常温环境中进行，无需大型仪器，降低保存成本，适用范围广。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

图1为不同粪便保存液保存的粪便样本提取的DNA浓度结果图。

图2为不同粪便保存液保存的粪便样本提取的DNA纯度结果图。

图3为不同粪便保护液对粪便样本中细菌群落的α多样性的影响。

图4为不同粪便保存液保存的粪便样本中细菌菌落结构相对丰度的门水平。

图5为不同粪便保存液保存的粪便样本中细菌菌落结构相对丰度的属水平。

图6为不同粪便保存液保存7天的粪便样本提取的DNA的质量结果，其中图6中A为DNA浓度结果，图6中B为DNA纯度结果。

图7为4℃下不同粪便保存液保存的粪便样本提取的DNA的质量结果，其中图7中A为DNA浓度结果，图7中B为DNA纯度结果。

图8为保存温度和时间对菌群结构的影响结果。

具体实施方式

以下所述是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本申请的保护范围。

本申请提供了一种粪便保存液，包括10mM-300mM的离子强度维持剂、5mM-100mM的抗凝剂、30％-90％的固定剂、0.1％-2％的裂解剂、0.01％-4％的去除剂、2mM-200mM的缓冲剂以及水。

目前粪便样本采集后利用超低温冰箱进行冷冻以保证微生物菌群结构不发生变化，然而超低温冷冻保存使得粪便样本的采集受到了限制，例如对于不具备超低温保存条件的地区无法进行粪便样本的采集，又如采样人自行采集无法保证粪便样本的保存等。有鉴于此，本申请发明人提供了上述粪便保存液，其能够在低温条件使用，更能够在常温条件下使用，在常温条件下仍可以保证粪便样本中微生物结构的稳定性，从而扩大了采样范围，避免了超低温保存的限制；与此同时，本申请提供的粪便保存液还有利于后续粪便样本中肠道微生物基因的提取，有助于肠道微生物的研究。

在本申请中，粪便保存液中包括10mM-300mM的离子强度维持剂，上述含量的离子强度维持剂能够保持微生物细胞的渗透压，维持细胞形态，有利于后续微生物基因的提取以及肠道微生物的研究。在一实施例中，粪便保存液中包括50mM-100mM的离子强度维持剂。在另一实施例中，粪便保存液包括220mM-280mM的离子强度维持剂。在又一实施例中，粪便保存液包括20mM-200mM的离子强度维持剂。具体的，粪便保存液中可以但不限于包括20mM、80mM、100mM、150mM、200mM、240mM、270mM或290mM的离子强度维持剂。在本申请实施方式中，离子强度维持剂包括氯化钠、氯化钾和柠檬酸钠中的至少一种。在一实施例中，粪便保存液中包括10mM-300mM的氯化钠。在另一实施例中，粪便保存液中包括10mM-300mM的氯化钾。在又一实施例中，粪便保存液中包括10mM-300mM的柠檬酸钠。

在本申请中，粪便保存液中包括5mM-100mM的抗凝剂，上述含量的抗凝剂能够去除粪便样本中的金属离子，防止粪便样本中细胞凝结，维持粪便样本中微生物结构的稳定性，有利于后续微生物基因的提取以及肠道微生物的研究。在一实施例中，粪便保存液中包括15mM-90mM的抗凝剂。在另一实施例中，粪便保存液包括55mM-95mM的抗凝剂。在又一实施例中，粪便保存液包括10mM-50mM的抗凝剂。具体的，粪便保存液中可以但不限于包括10mM、20mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM的抗凝剂。在本申请实施方式中，抗凝剂包括乙二胺四乙酸和柠檬酸钠中的至少一种。在一实施例中，粪便保存液中包括5mM-100mM的乙二胺四乙酸。在另一实施例中，粪便保存液中包括5mM-100mM的柠檬酸钠。

在本申请中，粪便保存液中包括30％-90％的固定剂，上述含量的固定剂能够维持粪便样本中DNA的完整性，固定粪便样本中的细胞结构，有利于后续微生物基因的提取以及肠道微生物的研究。可以理解的，固定剂在粪便保存液的占比为体积比。在一实施例中，粪便保存液中包括35％-84％的固定剂。在另一实施例中，粪便保存液包括50％-70％的固定剂。在又一实施例中，粪便保存液包括40％-80％的固定剂。具体的，粪便保存液中可以但不限于包括40％、45％、50％、55％、60％、70％或80％的固定剂。在本申请实施方式中，固定剂包括甲醇、乙醇和异丙醇中的至少一种。在一实施例中，粪便保存液中包括30％-90％的甲醇。在另一实施例中，粪便保存液中包括30％-90％的乙醇。在又一实施例中，粪便保存液中包括30％-90％的异丙醇。

在本申请中，粪便保存液中包括0.1％-2％的裂解剂，裂解剂的含量过高则使得在粪便保存液中微生物的基因扩散至保护液中，容易发生降解，不利于后续基因提取过程中基因浓度的提高，裂解剂的含量过低则对后续基因提取的作用不大，也无法提高提取的基因浓度，因此上述含量的裂解剂有助于后续提取基因过程中基因提取浓度的提高，保证肠道微生物的研究。可以理解的，裂解剂在粪便保存液的占比为1g裂解剂在1mL粪便保存液中的占比。在一实施例中，粪便保存液包括0.2％-1.5％的裂解剂。具体的，粪便保存液中可以但不限于包括0.2％、0.5％、0.7％、0.9％、1％、1.2％或1.5％的裂解剂。在本申请实施方式中，裂解剂包括异硫氰酸胍、十六烷基三甲基溴化铵、β-巯基乙醇和苯酚中的至少一种。在一实施例中，粪便保存液中包括0.1％-2％的异硫氰酸胍。异硫氰酸胍不仅有助于裂解细胞，同时还可以抑制细胞释放出来的核酸酶的活性，防止核酸酶对核酸的降解作用，保证提取的基因浓度。

在本申请中，粪便保存液中包括0.01％-4％的去除剂，上述含量的去除剂能够去除粪便样本的酚类、多糖、色素、脂类等杂质，有利于后续微生物基因的提取。可以理解的，去除剂在粪便保存液的占比为1g去除剂在1mL粪便保存液中的占比。在一实施例中，粪便保存液中包括0.1％-2％的去除剂。具体的，粪便保存液中可以但不限于包括0.1％、0.3％、0.5％、0.6％、0.85％、1％、1.2％、1.4％、1.5％、1.7％或2％的去除剂。在本申请实施方式中，去除剂包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯聚吡咯烷酮、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、半胱氨酸和三羟甲基氨基甲烷硼酸盐中的至少一种。在一实施例中，粪便保存液中包括0.01％-4％的聚乙烯吡咯烷酮。

在本申请中，粪便保存液中包括2mM-200mM的缓冲剂，上述含量的缓冲剂可以调节粪便保存液的pH，尤其调节保存粪便样本后的保存液整体的pH，维持pH稳定，保证微生物细胞形态的稳定性。在一实施例中，粪便保存液中包括20mM-180mM的缓冲剂。在另一实施例中，粪便保存液包括70mM-150mM的缓冲剂。在又一实施例中，粪便保存液包括10mM-100mM的缓冲剂。具体的，粪便保存液中可以但不限于包括10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM的缓冲剂。在本申请实施方式中，缓冲剂包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、磷酸盐、N,N-二羟乙基甘氨酸和3-环已氨基丙磺酸中的至少一种。在一实施例中，粪便保存液中包括2mM-200mM的Tris-HCl。

在本申请实施方式中，粪便保存液的pH值为7-9.2。如此，有利于保证粪便样本中肠道微生物结构的稳定性。进一步的，粪便保存液的pH值为8-8.5。具体的，粪便保存液的pH值可以但不限于为7、7.5、7.7、8、8.3、8.5、9或9.2。

在本申请实施方式中，粪便保存液包括20mM-200mM的离子强度维持剂、10mM-50mM的抗凝剂、40％-80％的固定剂、0.2％-1.5％的裂解剂、0.1％-2％的去除剂和10mM-100mM的缓冲剂。在一具体实施例中，粪便保存液包括150mM的离子强度维持剂、25mM的抗凝剂、70％的固定剂、0.5％的裂解剂、0.75％的去除剂和100mM的缓冲剂。

在本申请实施方式中，粪便保存液包括50mM-100mM的离子强度维持剂、15mM-90mM的抗凝剂、35％-84％的固定剂、0.3％-1.5％的裂解剂、0.2％-1.8％的去除剂和20mM-180mM的缓冲剂。

在本申请实施方式中，粪便保存液包括220mM-280mM的离子强度维持剂、55mM-95mM的抗凝剂、50％-70％的固定剂、0.5％-1.5％的裂解剂、0.4％-1.5％的去除剂和70mM-150mM的缓冲剂。

在本申请实施方式中，粪便保存液包括130mM-180mM的离子强度维持剂、60mM-80mM的抗凝剂、55％-65％的固定剂、0.5％-1％的裂解剂、0.5％-1％的去除剂和80mM-120mM的缓冲剂。

在本申请实施方式中，粪便保存液包括10mM-300mM的氯化钠、5mM-100mM的乙二胺四乙酸、30％-90％的乙醇、0.1％-2％的异硫氰酸胍、0.01％-4％的聚乙烯吡咯烷酮和2mM-200mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐。进一步的，粪便保存液包括20mM-200mM的氯化钠、10mM-50mM的乙二胺四乙酸、40％-80％的乙醇、0.2％-1.5％的异硫氰酸胍、0.1％-2％的聚乙烯吡咯烷酮和10mM-100mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐。在一具体实施例中，粪便保存液包括150mM的氯化钠、25mM的乙二胺四乙酸、70％的乙醇、0.5％的异硫氰酸胍、0.75％的聚乙烯吡咯烷酮和100mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐。

本申请提供的粪便保存液能够在常温环境中使用，例如在不高于30℃的环境中使用，对粪便样本进行保存，稳定粪便样本中微生物的数量、组成和丰度，对粪便样本中微生物菌群结构不产生影响，扩大了采样范围，可以实现异地采样、邮寄样本等，更有利于肠道微生物的研究，保证肠道微生物研究的准确性。

本申请还提供了一种粪便保存液的制备方法，包括将离子强度维持剂、抗凝剂、固定剂、裂解剂、去除剂和缓冲剂与水混合，经灭菌后得到粪便保存液，其中粪便保存液包括10mM-300mM的离子强度维持剂、5mM-100mM的抗凝剂、30％-90％的固定剂、0.1％-2％的裂解剂、0.01％-4％的去除剂，以及2mM-200mM的缓冲剂。

在本申请实施方式中，通过将离子强度维持剂、抗凝剂、裂解剂、去除剂和缓冲剂与水混合，再加入固定剂后进行灭菌，得到粪便保存液。在一实施例中，将离子强度维持剂、抗凝剂、裂解剂、去除剂和缓冲剂与无菌水溶解后，加入固定剂，调节粪便保存液的pH值为7-9.2，然后进行高压灭菌。

在本申请中，灭菌可以但不限于为采用高压灭菌罐进行。

本申请还提供了一种粪便样本保存方法，采用上述任一实施方式提供的粪便保存液保存粪便样本。

可以理解的，本申请提供的粪便保存液可以保存动物或人的粪便样本，还可以保存动物或人的肠道内食糜样本。

在本申请中，混合有粪便样本的粪便保存液可以置于低温中冷冻保存，还可以置于常温中保存，均能够保证粪便样本中微生物菌群的稳定性。具体的，低温可以但不限于为4℃、0℃、-10℃、-25℃、-40℃、-60℃、-80℃等；常温不高于30℃，如10℃、12℃、15℃、18℃、20℃、23℃或25℃等。

在本申请实施方式中，每克粪便样本保存在2mL-5mL粪便保存液中。如此，有利于进一步保证粪便样本中微生物的数量、组成和丰度，保证肠道微生物研究的准确性。具体的，每克粪便样本保存在2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL或5mL粪便保存液中。

以下通过具体实施例对本申请提供的粪便保存液的效果做进一步的说明。

实施例1

粪便保存液S1包括25mM的氯化钠、10mM的乙二胺四乙酸、40％的无水乙醇、0.2％的异硫氰酸胍、0.1％的聚乙烯吡咯烷酮、20mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐以及水，调节粪便保存液的pH值为7，经高压灭菌后室温保存。

实施例2

粪便保存液S2包括50mM的氯化钠、20mM的乙二胺四乙酸、50％的无水乙醇、0.3％的异硫氰酸胍、0.25％的聚乙烯吡咯烷酮、20mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐以及水，调节粪便保存液的pH值为7.5，经高压灭菌后室温保存。

实施例3

粪便保存液S3包括100mM的氯化钠、20mM的乙二胺四乙酸、60％的无水乙醇、0.4％的异硫氰酸胍、0.5％的聚乙烯吡咯烷酮、50mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐以及水，调节粪便保存液的pH值为8，经高压灭菌后室温保存。

实施例4

粪便保存液S4包括150mM的氯化钠、25mM的乙二胺四乙酸、70％的无水乙醇、0.5％的异硫氰酸胍、0.5％的聚乙烯吡咯烷酮、50mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐以及水，调节粪便保存液的pH值为8，经高压灭菌后室温保存。

实施例5

粪便保存液S5包括150mM的氯化钠、25mM的乙二胺四乙酸、70％的无水乙醇、0.5％的异硫氰酸胍、0.75％的聚乙烯吡咯烷酮、100mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐以及水，调节粪便保存液的pH值为8.5，经高压灭菌后室温保存。

实施例6

粪便保存液S6包括200mM的氯化钠、50mM的乙二胺四乙酸、80％的无水乙醇、1％的异硫氰酸胍、1.2％的聚乙烯吡咯烷酮、100mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐以及水，调节粪便保存液的pH值为8.5，经高压灭菌后室温保存。

对比例1

粪便保存液S7包括150mM的氯化钠、25mM的乙二胺四乙酸、70％的无水乙醇、0.75％的聚乙烯吡咯烷酮、100mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐以及水，调节粪便保存液的pH值为8.5，经高压灭菌后室温保存。

对比例2

粪便保存液S8包括150mM的氯化钠、25mM的乙二胺四乙酸、70％的无水乙醇、0.5％的异硫氰酸胍、100mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐以及水，调节粪便保存液的pH值为8.5，经高压灭菌后室温保存。

对比例3

粪便保存液S9包括150mM的氯化钠、25mM的乙二胺四乙酸、70％的无水乙醇、100mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐以及水，调节粪便保存液的pH值为8.5，经高压灭菌后室温保存。

效果实施例1

以一名健康的志愿者为例，粪便中段取样(约10g)放入无菌离心管中，充分震荡均质化，取0.2g均质化的粪便于2mL无菌离心管中，加入1mLpH 8.0的磷酸缓冲液，混匀后放入-80℃冰箱冻存7天，作为实验组S0；同时取9份0.2g均质化的粪便于9个2mL无菌离心管中，9个离心管中分别对应加入1mL上述粪便保存液S1-S9，混匀后放入4℃冰箱冻存7天，作为实验组S1-S9。

采用粪便基因组DNA(天根公司，货号DP328)对实验组S0-S9粪便样本进行基因组DNA的提取，用酶标仪检测DNA浓度和A260/280的比值，并对提取的DNA样本用通用引物V4-515F(GTGYCAGCMGCCGCGGTAA)/V4-806R(GGACTACNVGGGTWTCTAAT)对16s rRNA基因的V3-V4区进行扩增、文库构建及测序处理。

请参阅图1和图2，分别为保存液保存的粪便样本提取的DNA浓度和纯度结果，可以看出，粪便样本保存在S0、S1、S2、S4、S5、S6和S8保存液中提取DNA浓度较高，而粪便样本保存在S3、S7和S9保存液中的DNA提取的浓度相对较低；粪便样本保存在S2、S3、S4、S5、S6和S8保存液中提取DNA纯度(A260/280)较高，而粪便样本保存在S1、S7和S9保存液中的DNA的纯度相对较低。综合起来，样本在实施例1-6提供的保存液中得到的粪便样本的DNA产率和纯度都可以达到满意的要求。

基于Shannon、ACE指数、Chao1指数和Simpson指数评估不同保存液保存的粪便样本中的细菌群落的丰富度和均匀度，请参阅图3，为保护液对粪便样本中细菌群落的α多样性的影响，Shannon、Simpson指数值越大，说明群落多样性越高，ACE和Chao1指数用来估计物种总数，值越大代表物种总数越多。可以看出，不同保护液保存存储下细菌的α多样性差异显著；保护液S2、S3和S7的Shannon和Simpson指数值较高，S1相应的值较低，说明不同保护液储存下影响了细菌多样性的均匀度。保护液S3、S6的ACE和Chao1值相对较高，S2相应的值偏低，说明不同保护液储存下影响了细菌多样性的丰富度。

请参阅图4和图5，分别为保存液保存的粪便样本中细菌菌落结构相对丰度的门水平和属水平，其中，Fusobacteria为梭杆菌门，Synergisteres为Synergisteres菌门，Proteobacteria为变形菌门，Actinobacteria为放线菌门，Bacteroidetes为拟杆菌门，Firmicutes为厚壁菌门；Uncultured_bacterium_f_Peptostreptococcaceae为难培养的消化链球菌科，Lachnospira为毛螺菌属，Lachnoclostridium为Lachnoclostridium菌属，Megasphaera为巨球菌属，Roseburia为罗氏菌属，Bifidobacterium为双歧杆菌属，Phascolarctobacterium为考拉杆菌属，Faecalibacterium为普拉梭菌属，Megamonas为巨单孢菌属，Bacteroides为拟杆菌属，Others为其它菌属。可以看出，不同保护液保存中细菌的菌落结构显著不同(p<0.05)，图4显示在门水平上，厚壁菌门和拟杆菌门变化差异较大；其中S1、S5组表现为门水平的厚壁菌门相对丰度略有增加，而S2、S3、S4、S6、S7、S8和S9组表现为门水平的厚壁菌门相对丰度明显下降；S1、S5组表现为门水平的拟杆菌门相对丰度略有下降，而S2、S3、S4、S6、S7、S8和S9组表现为门水平的拟杆菌门相对丰度明显升高；S2、S3、S4和S6组的放线菌门的相对丰度也明显升高。图5显示在属水平上，S2、S3、S4、S6、S7、S8和S9组拟杆菌属相对丰度明显升高，巨单胞菌属相对丰度明显下降；S1、S5组表现为拟杆菌属相对丰度略有下降，巨单胞菌属相对丰度略有升高；S2、S3和S4组双岐杆菌属的相对丰度明显增加；S4和S6组的粪杆菌属相对丰度明显升高；S1、S5、S6、S7和S8组考拉杆菌属相对丰度也明显增加。与S0相比，S1、S5的肠道菌群结构在门和属水平上相接近，无显著差异(P>0.05)。

效果实施例2

取0.2g已均质化的健康志愿者的粪便样本分别加入1mL粪便保存液S1，混匀后分别保存于4℃和室温25℃，在第0天，第7天，第14天和第30天用相同的方法提取细菌基因组DNA。

请参阅图6，为保存液保存的7天的粪便样本提取的DNA的质量结果，其中图6中A为DNA浓度结果，图6中B为DNA纯度结果；可以看出，随着保存温度的升高，DNA提取的浓度和纯度也下降；在室温条件下样本DNA提取的浓度和纯度受到的较大的影响。

请参阅图7，为4℃下保存液保存的粪便样本提取的DNA的质量结果，其中图7中A为DNA浓度结果，图7中B为DNA纯度结果；可以看出，随着保存时间的延长，DNA的浓度会慢慢下降，DNA提取的纯度也会变低；在4℃下样本保存到30天DNA提取的纯度受到的影响较大。

效果实施例3

取0.2g已均质化的健康志愿者的粪便样本分别加入1mL粪便保存液S1和S5，混匀后分别保存于4℃和室温25℃，在第0天，第7天，第14天和第30天用相同的方法提取细菌基因组DNA，所提取的DNA样本进行16s rRNA测序和后续的生物信息学分析。

请参阅图8，为保存温度和时间对菌群结构的影响结果，其中显示了组间相对丰度的差异，红色和绿色的条目分别表示相对于0天样本在不同保存条件下明显丰富或少丰富的OTU数量，其中每个分组(group)用TaFbDc1、TaFbDc2、TaFbDc3表示三次重复，其中a表示保存温度，a值为4或25；b表示用保存液S1或S5保存，b值为1或5；D表示保存天数，D值为0、7、14或30。与0天的样本相比，不同的保存条件导致一部分的OUT丰度发生了较小程度的变化；25℃保存的样本比4℃的OUT变化数量更多，变化最大的是25℃保存的样本30天的样本，而且大多数改变的OTUs显示丰度增加。保护液S1、S5组不论在4℃还是25℃保存7天的肠菌结构有轻微的变化，随着时间的增加(14天，30天)样品的菌群结构有明显变化，其中25℃保存随着时间的变化大于4℃保存的肠道微生物菌落结构变化。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种粪便保存液，其特征在于，包括10mM-300mM的离子强度维持剂、5mM-100mM的抗凝剂、30％-90％的固定剂、0.1％-2％的裂解剂、0.01％-4％的去除剂、2mM-200mM的缓冲剂以及水。

2.如权利要求1所述的粪便保存液，其特征在于，所述裂解剂的含量为0.2％-1.5％。

3.如权利要求1所述的粪便保存液，其特征在于，所述去除剂的含量为0.1％-2％。

4.如权利要求1所述的粪便保存液，其特征在于，所述固定剂的含量为40％-80％。

5.如权利要求1所述的粪便保存液，其特征在于，所述粪便保存液包括20mM-200mM的所述离子强度维持剂、10mM-50mM的所述抗凝剂、40％-80％的所述固定剂、0.2％-1.5％的所述裂解剂、0.1％-2％的所述去除剂和10mM-100mM的所述缓冲剂。

6.如权利要求1所述的粪便保存液，其特征在于，所述离子强度维持剂包括氯化钠、氯化钾和柠檬酸钠中的至少一种；

所述抗凝剂包括乙二胺四乙酸和柠檬酸钠中的至少一种；

所述固定剂包括甲醇、乙醇和异丙醇中的至少一种；

所述裂解剂包括异硫氰酸胍、十六烷基三甲基溴化铵、β-巯基乙醇和苯酚中的至少一种；

所述去除剂包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯聚吡咯烷酮、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、半胱氨酸和三羟甲基氨基甲烷硼酸盐中的至少一种；

所述缓冲剂包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、磷酸盐、N,N-二羟乙基甘氨酸和3-环已氨基丙磺酸中的至少一种。

7.如权利要求6所述的粪便保存液，其特征在于，所述粪便保存液包括10mM-300mM的氯化钠、5mM-100mM的乙二胺四乙酸、30％-90％的乙醇、0.1％-2％的异硫氰酸胍、0.01％-4％的聚乙烯吡咯烷酮和2mM-200mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐。

8.如权利要求1所述的粪便保存液，其特征在于，所述粪便保存液的pH值为7-9.2。

9.一种粪便保存液的制备方法，其特征在于，包括：

将离子强度维持剂、抗凝剂、固定剂、裂解剂、去除剂和缓冲剂与水混合，经灭菌后得到粪便保存液，其中所述粪便保存液包括10mM-300mM的所述离子强度维持剂、5mM-100mM的所述抗凝剂、30％-90％的所述固定剂、0.1％-2％的所述裂解剂、0.01％-4％的所述去除剂，以及2mM-200mM的所述缓冲剂。

10.一种粪便样本保存方法，其特征在于，采用权利要求1-8任一项所述的粪便保存液，或权利要求9所述的制备方法制得的粪便保存液保存粪便样本。

Images