CN114703173B - 一种λ噬菌体DNA提取试剂盒及提取方法 - Google Patents
一种λ噬菌体DNA提取试剂盒及提取方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114703173B CN114703173B CN202210269803.1A CN202210269803A CN114703173B CN 114703173 B CN114703173 B CN 114703173B CN 202210269803 A CN202210269803 A CN 202210269803A CN 114703173 B CN114703173 B CN 114703173B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- dna
- lambda phage
- lysis buffer
- concentration
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明提供了一种λ噬菌体DNA提取试剂盒及提取方法，属于核酸提取分离技术领域，所述试剂盒包括以下组分：DNase I液、RNase A液、沉淀液、第一裂解缓冲液、第二裂解缓冲液、杂质沉淀液、DNA结合液、漂洗缓冲液和DNA洗脱液；所述第一裂解缓冲液以水为溶剂，包括以下浓度的组分：50～100mM Tris‑HCl，50～100mM NaCl和25～50mM EDTA；所述第二裂解缓冲液为10％～20％的SDS水溶液。利用本发明提供的DNA提取试剂盒和提取方法获得的λ噬菌体DNA纯度好，浓度高，无宿主DNA和RNA污染。
Description
技术领域
本发明属于核酸提取分离技术领域，尤其涉及一种λ噬菌体DNA提取试剂盒及提取方法。
背景技术
λ噬菌体是最早使用的克隆载体，λ噬菌体的基因组是一长度约为50kb的双链DNA分子，它在宿主细胞有两种生活途径，其一是裂解生长，环状DNA分子在细胞内多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌再进行下一次感染；其二是溶源性生长，即感染细胞内λ噬菌体DNA整合到宿主菌染色体DNA中与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不裂解。平板培养时，裂解生长形成噬斑。液体培养时，裂解生长使菌液中宿主菌最后全部被裂解而释放出大量的噬菌体颗粒。经过改造的λ噬菌体克隆位点可插入几到几十kb的外源DNA。许多cDNA和基因组文库是以λ噬菌体作为克隆载体构建的，在经文库筛选得到目的克隆后，经常需要利用λ噬菌体裂解生长的特点，培养获得大量的噬菌体颗粒，并提取λ噬菌体DNA来开展进一步的工作。
λ噬菌体DNA提取方法大致可分为2个步骤，第一步是将λ噬菌体颗粒分离沉淀，第二步是将λ噬菌体颗粒中的DNA提取纯化。目前对于第一步λ噬菌体颗粒分离沉淀主要采取聚乙二醇(PEG)沉淀法和密度梯度离心法，其中密度梯度离心法主要采用CsCl分级梯度离心法和甘油分级梯度离心法，CsCl分级梯度离心法需要两步离心来收集λ噬菌体颗粒，耗费时间较长。而甘油分级梯度离心法虽然只需要一步离心就可以获得噬菌体颗粒，但所得的λ噬菌体颗粒纯度却不高，对于后续λ噬菌体DNA提取会有影响。而且上述两种分离沉淀方法均需要在30000rpm以上的超速离心机上进行操作，一般实验室并不一定具备这样的设备。聚乙二醇(PEG)沉淀法虽只需要在高盐氯化钠存在下加入一定比例的聚乙二醇(PEG)，就可以将λ噬菌体颗粒从裂解物中离心沉淀下来，且不需要超速离心机等昂贵的离心设备，但氯化钠的使用浓度与聚乙二醇(PEG)加入量必须反复摸索，太少会影响λ噬菌体颗粒的产量，太多又会影响λ噬菌体颗粒的纯度。
对于第二步λ噬菌体DNA提取纯化则主要采取蛋白酶K/SDS提取法和甲酰胺提取法，蛋白酶K/SDS提取法在纯化过程中需要多次使用对人体有毒害的酚：氯仿抽提；甲酰胺提取法在纯化过程中则需要使用专门的巴斯德吸管或者Shepherd钩，将λ噬菌体DNA钩取出来，对操作人员的熟练度要求很高，且提取到的λ噬菌体DNA量较少。为了满足文库构建的要求，需要提取到高质量、具有一定浓度并且不受宿主核酸污染的λ噬菌体DNA，上述两种提取纯化方法均不能完全满足要求。
高质量、高浓度且不受宿主核酸污染的λ噬菌体DNA的提取方法，将对基因组文库构建等研究开展起到积极的促进作用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种λ噬菌体DNA提取试剂盒及提取方法；利用本发明提供的DNA提取试剂盒和提取方法获得的λ噬菌体DNA纯度好，浓度高，无宿主DNA和RNA污染，不但适用于小规模λ噬菌体DNA的提取，也适用于大规模λ噬菌体DNA的提取，能够在文库构建等基因工程领域发挥重要作用。
本发明提供了一种λ噬菌体DNA的提取试剂盒，包括以下组分：DNase I液、RNase A液、沉淀液、第一裂解缓冲液、第二裂解缓冲液、杂质沉淀液、DNA结合液、漂洗缓冲液和DNA洗脱液；
所述第一裂解缓冲液以水为溶剂，包括以下浓度的组分：50～100mM Tris-HCl，50～100mM NaCl和25～50mM EDTA；
所述第二裂解缓冲液为质量浓度为10％～20％的SDS水溶液。
优选的，所述DNase I液中DNase I的浓度为40～50mg/mL；所述DNase I液中包括体积分数为45％～55％的甘油。
优选的，所述RNase A液中RNase A的浓度为10～20mg/mL；所述RNase A液中包括体积分数为45％～55％的甘油。
优选的，所述沉淀液以水为溶剂，包括以下浓度的组分：30wt％～40wt％PEG 6000和2.8～3.2M NaCl。
优选的，所述杂质沉淀液为2～2.5M的KAC。
优选的，所述DNA结合液以水为溶剂，包括5～6M盐酸胍和50～100mM Tris-HCl，所述DNA结合液的pH值为6.3～6.5。
优选的，所述漂洗缓冲液包括10～20mM Tris-HCl、80～100mM NaCl和体积分数为75％～85％的无水乙醇。
优选的，所述DNA洗脱液为5～10mM的Tris-HCl，所述DNA洗脱液的pH值7.8～8.2。
本发明提供了利用所述的试剂盒进行λ噬菌体DNA提取的方法，包括以下步骤：
1)将携带λ噬菌体的宿主细菌裂解后，收集上清液；
2)将所述上清液、DNase I液和RNase A液混合、第一温育后，与沉淀液混合沉淀，收集沉淀获得λ噬菌体颗粒；
3)将所述λ噬菌体颗粒、第一裂解缓冲液和第二裂解缓冲液混合，第二温育后，与杂质沉淀液混合去除杂质，收集上清液；
4)将步骤3)中所述的上清液与DNA结合液混合后，进行DNA的吸附、漂洗和洗脱获得λ噬菌体DNA。
优选的，所述第一温育的温度为36～38℃，所述第一温育的时间为25～35min；所述第二温育的温度为68～72℃，所述第二温育的时间为15～25min。
本发明的有益效果：本发明提供的λ噬菌体DNA提取试剂盒，包括DNase I液、RNaseA液、沉淀液、第一裂解缓冲液、第二裂解缓冲液、杂质沉淀液、DNA结合液、漂洗缓冲液和DNA洗脱液；本发明提供的试剂盒提取过程时间短，单个样品最快可以在1.5h内完成提取；本发明提供的试剂盒提取获得的λ噬菌体DNA纯度好，产量高，10mLλ噬菌体裂解培养物上清可以提取约10μgλ噬菌体DNA；本发明提供的试剂盒提取产物不受宿主菌基因组DNA污染，从而消除了宿主基因组DNA对后续试验的干扰。
附图说明
图1为本发明提取的λ噬菌体DNA检测结果图；其中：泳道1为溶原性生长λ噬菌体DNA，泳道2为裂解性生长λ噬菌体DNA，泳道3为溶原性生长λ噬菌体DNA/HindIII酶切，泳4为裂解性生长λ噬菌体DNA/EcoT14 I酶切(见实施例1～3)；
图2为本发明提取的λ噬菌体DNA宿主基因组污染PCR检测结果图；其中：泳道1为大肠杆菌基因组DNA阳性对照，泳道2-3为溶原性生长λ噬菌体DNA，泳道4-5为裂解性生长λ噬菌体DNA，泳道M为DL 2000DNA marker(见实施例3)。
具体实施方式
本发明提供了一种λ噬菌体DNA的提取试剂盒，包括以下组分：DNase I液、RNase A液、沉淀液、第一裂解缓冲液、第二裂解缓冲液、杂质沉淀液、DNA结合液、漂洗缓冲液和DNA洗脱液；所述第一裂解缓冲液以水为溶剂，包括以下浓度的组分：50～100mM Tris-HCl，50～100mM NaCl和25～50mM EDTA；所述第二裂解缓冲液为质量浓度为10％～20％的SDS水溶液。
在本发明中，所述DNase I液中DNase I的浓度优选为40～50mg/mL，更优选为42～48mg/mL，最优选为45mg/mL；在本发明中，所述DNase I液中优选的还包括体积分数为45％～55％的甘油，更优选的还包括体积分数为50％甘油。在本发明中，所述DNase I液的溶剂为水。在本发明中，所述DNase I液的作用是降解宿主自身的DNA。在本发明中，所述DNase I液优选的在-20℃保存。
在本发明中，所述RNase A液中RNase A的浓度优选为10～20mg/mL，更优选为12～18mg/mL，最优选为15mg/mL；在本发明中，所述RNase A液中优选的还包括体积分数为45％～55％的甘油，更优选的还包括体积分数为50％甘油。在本发明中，所述RNase A液的作用是降解宿主自身的RNA。在本发明中，所述RNase A液优选的在-20℃保存。
在本发明中，所述沉淀液以水为溶剂，包括30wt％～40wt％PEG 6000，优选的包括32wt％～38wt％PEG 6000，更优选的包括35wt％PEG 6000；所述沉淀液包括2.8～3.2MNaCl，优选的包括2.9～3.2M NaCl，更优选的包括3.0M NaCl；在本发明中，所述沉淀液中含有高浓度的NaCl和PEG 6000，在低温环境下λ噬菌体颗粒因夺水能力弱而逐渐沉降下来，再次离心收集沉淀即为λ噬菌体颗粒。
在本发明中，所述第一裂解缓冲液以水为溶剂，包括以下浓度的组分：50～100mMTris-HCl，50～100mM NaCl和25～50mM EDTA。在本发明中，所述第一裂解缓冲液优选的包括60～90mM Tris-HCl，更优选的包括70～80mM Tris-HCl；在本发明中，所述第一裂解缓冲液优选的包括60～90mM NaCl，更优选的包括70～80mM NaCl；在本发明中，所述第一裂解缓冲液优选的包括30～45mM EDTA，更优选的包括35～40mM EDTA。在本发明中，所述第一裂解缓冲液的pH值优选为7.4～7.6，更优选为7.5。
在本发明中，所述第二裂解缓冲液为10％～20％的SDS水溶液，更优选为12％～18％，最优选为15％。
在本发明中，所述第一裂解缓冲液和第二裂解缓冲液共同作用，破裂噬菌体颗粒，使噬菌体内部的DNA释放出来。
在本发明中，所述杂质沉淀液优选为2～2.5M的KAC，更优选为2.1～2.4M，最优选为2.2～2.3M。在本发明中，所述杂质沉淀液提供了高浓度KAC环境，有利于残存的各种杂质沉淀。
在本发明中，所述DNA结合液以水为溶剂，优选的包括5～6M盐酸胍，更优选的包括5.2～5.8M的盐酸胍，最优选的为5.5M；所述DNA结合液优选的包括50～100mM Tris-HCl，更优选为60～90mM，最优选为70～80mM；在本发明中所述DNA结合液的pH值优选为6.3～6.5，更优选为6.4。在本发明中，所述DNA结合液是一种高离液盐，DNA在高离液盐状态下可以结合在硅基质的DNA吸附柱上，而蛋白等杂质在高离液盐的环境下则不能吸附。
在本发明中，所述漂洗缓冲液优选的包括10～20mM Tris-HCl，更优选为12～18mM，最优选为15mM；所述漂洗缓冲液优选的包括80～100mM NaCl，更优选为85～95mM，最优选为90mM；所述漂洗缓冲液优选的包括体积分数为75％～85％的无水乙醇，更优选为78％～82％，最优选为80％。在本发明中，所述漂洗缓冲液可以将高盐离子、细胞代谢物和蛋白等杂质通过漂洗快速去除。
在本发明中，所述DNA洗脱液优选为5～10mM的Tris-HCl，更优选为6～9mM，最优选为7～8mM；在本发明中，所述DNA洗脱液的pH值优选为7.8～8.2，更优选为8.0。在本发明中，所述DNA洗脱液能够将λ噬菌体DNA从DNA吸附柱上洗脱下来。
本发明提供了利用所述的试剂盒进行λ噬菌体DNA提取的方法，包括以下步骤：1)将携带λ噬菌体的宿主细菌裂解后，收集上清液；2)将所述上清液、DNase I液和RNase A液混合、第一温育后，与沉淀液混合沉淀，收集沉淀获得λ噬菌体颗粒；3)将所述λ噬菌体颗粒、第一裂解缓冲液和第二裂解缓冲液混合，第二温育后，与杂质沉淀液混合去除杂质，收集上清液；4)将步骤3)中所述的上清液与DNA结合液混合后，进行DNA的吸附、漂洗和洗脱获得λ噬菌体DNA。
在本发明中，将携带λ噬菌体的宿主细菌裂解后，收集上清液。在本发明中，所述裂解优选的采用氯仿进行；所述氯仿的浓度优选为0.5％；在本发明中，所述裂解优选的将氯仿与携带λ噬菌体的宿主细菌的培养液混合后振荡培养至上清液澄清。在本发明中，所述氯仿和携带λ噬菌体的宿主细菌的培养液的体积比优选为(0.5～1)：100。在本发明中，所述振荡培养的温度优选为37℃，本发明对所述振荡培养的时间没有特殊限定，以培养至上清液澄清为准。在本发明中，收集上清液优选的通过离心实现，所述离心的离心力优选为8000～12000g，更优选为10000g；所述离心的时间优选为8～12min，更优选为10min；所述离心的温度优选为4℃。
在本发明中，将所述上清液、DNase I液和RNase A液混合、第一温育后，与沉淀液混合沉淀，收集沉淀获得λ噬菌体颗粒。在本发明中，所述上清液、DNase I液和RNase A液混合的体积比优选为450～550:1:1，更优选为500:1:1。在本发明中，所述第一温育的温度优选为36～38℃，更优选为37℃，所述第一温育的时间优选为25～35min，更优选为30min。在本发明中，所述沉淀液与上清液的体积比优选为2:(8～12)，更优选为1:5。在本发明中，所述混合沉淀优选的在进行轻柔上下混匀后，置于冰上沉淀；所述沉淀的时间优选为30～60min。本发明在所述沉淀后，优选的通过离心收集沉淀；所述离心的离心力优选为8000～12000g，更优选为10000g；所述离心的时间优选为8～12min，更优选为10min；所述离心的温度优选为4℃。本发明在所述离心后，吸去上清，收集沉淀获得λ噬菌体颗粒。
本发明在获得所述λ噬菌体颗粒后，将所述λ噬菌体颗粒、第一裂解缓冲液和第二裂解缓冲液混合，第二温育后，与杂质沉淀液混合去除杂质，收集上清液。在本发明中，所述第一裂解缓冲液和第二裂解缓冲液的体积比优选3.8～4.2:1，更优选为4:1。在本发明中，所述λ噬菌体颗粒、第一裂解缓冲液和第二裂解缓冲液的比例，以将携带λ噬菌体的宿主细菌裂解后收集上清液的体积计，每10mL的携带λ噬菌体的宿主细菌裂解后收集上清液收集到的λ噬菌体颗粒与475～525μL的第一裂解缓冲液和120～130μL的第二裂解缓冲液混合，更优选为每10mL的携带λ噬菌体的宿主细菌裂解后收集上清液收集到的λ噬菌体颗粒与500μL的第一裂解缓冲液和125μL的第二裂解缓冲液混合。在本发明中，所述第二温育的温度优选为68～72℃，更优选为70℃，所述第二温育的时间优选为15～25min，更优选为20min。本发明在所述第二温育后，优选的进行冷却，所述冷却优选为置于冰上冷却。
本发明在所述第二温育后，与杂质沉淀液混合去除杂质，收集上清液。在本发明中，所述杂质沉淀液与第二裂解缓冲液的体积比优选为1:1。在本发明中，所述混合优选为轻柔混匀4～6次。在本发明中，所述收集上清液优选的通过离心实现；所述离心的离心力优选为8000～12000g，更优选为10000g；所述离心的时间优选为8～12min，更优选为10min；所述离心的温度优选为4℃。
在本发明中，将所述的上清液与DNA结合液混合后，进行DNA的吸附、漂洗和洗脱获得λ噬菌体DNA。在本发明中，所述的上清液与DNA结合液混合的体积比优选为1.8～2.2:1，更优选为2:1。在本发明中，所述混合后，优选的将混合液转移至DNA吸附柱上进行吸附；然后离心DNA吸附柱，弃去滤液；所述离心的离心力优选为10000g，所述离心的时间优选为1min。在本发明中，所述漂洗优选的为向所述DNA吸附柱中添加漂洗缓冲液后离心；所述漂洗的次数优选的为两次，第一次漂洗缓冲液的用量优选为650～750μL，更优选为700μL；第一次漂洗缓冲液的用量优选为450～550μL，更优选为500μL；所述离心的离心力优选为10000g，所述离心的时间优选为1min。本发明在所述漂洗结束后，优选的将DNA吸附柱室温放置2min后进行洗脱。在本发明中，所述洗脱优选的将洗脱液加到所述DNA吸附柱的膜中央，放置1-2min后离心收集洗脱液即为λ噬菌体DNA。在本发明中，所述洗脱液的温度优选为65～75℃，更优选为70℃。在本发明中，在加入洗脱液前，优选的将所述DNA吸附柱转移到一支新的离心管中。在本发明中，所述离心的离心力优选为10000g，所述离心的时间优选为1min。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1溶源性生长λ噬菌体DNA的提取
1.λ噬菌体DNA提取试剂配制
(1)试剂A：为含50％甘油的40mg/mL的DNase I，-20℃保存；
(2)试剂B：为含50％甘油的10mg/mL的RNase A，-20℃保存；
(3)试剂C：为沉淀液，含30％PEG 6000，3M NaCl；
(4)试剂D：为裂解缓冲液，50mM Tris-HCl，50mM NaCl，25mM EDTA，pH 7.5；
(5)试剂E：为副裂解缓冲液，10％SDS；
(6)试剂F：为杂质沉淀液，2M KAC；
(7)试剂G：为DNA结合液，含5M盐酸胍和50mM Tris-HCl，pH 6.4；
(8)试剂H：为漂洗缓冲液，含10mM pH 7.5Tris-HCl，80mM NaCl与无水乙醇按1:4的体积比混合而成；
(9)试剂I：为DNA洗脱液，10mM pH 8.0的Tris-HCl；
2.λ噬菌体DNA提取按以下操作步骤进行
(1)溶原性λ噬菌体的宿主细菌前处理：溶原性菌株30℃培养，使菌体扩增，当细菌OD600至0.6时，将培养液置于43℃水浴中震荡培养25min后，继续在37℃培养3-4h，加入终浓度0.5％的氯仿，37℃振荡培养至上清液澄清后，4℃，10000g离心10min；
(2)宿主细菌核酸去除：小心吸取上清，向10mL上清中加入20μL试剂A及20μL试剂B，混匀，37℃温育30min；
(3)λ噬菌体颗粒沉淀：加入2mL试剂C，轻柔上下混合，冰上放置30-60min；10000g，4℃离心10min，小心吸去上清，得λ噬菌体颗粒；
(4)λ噬菌体颗粒裂解：向λ噬菌体颗粒沉淀中加入500μL试剂D悬浮噬菌体颗粒，125μL试剂E，70℃温育20min，置冰上冷却；
(5)杂质去除：加入125μL试剂F，轻柔混匀4-6次，10000g，4℃离心10min，取上清；
(6)λ噬菌体DNA结合：加入步骤(5)所取上清，0.5倍体积的试剂G，上下轻轻颠倒混匀，将上述混合液转移到DNA吸附柱，10000g离心1min，弃去过滤液；
(7)DNA吸附柱清洗：向DNA吸附柱中加入700μL试剂H，10000g离心1min，弃去过滤液；再次加入500μL试剂H，10000g离心1min，弃去过滤液，将DNA吸附柱室温放置2min；
(8)λ噬菌体DNA洗脱：将DNA吸附柱转移到一支新的离心管中，加入70℃预热的100μL试剂I于DNA吸附柱的膜中央，室温放置1-2min；10000g离心1min，吸取洗脱液即为λ噬菌体DNA。取4.0μL DNA提取产物于1.0％琼脂糖凝胶上电泳分析，其余置-20℃保存备用。
3.检测结果
λ噬菌体DNA电泳检测结果如图1所示，溶原性λ噬菌体宿主细菌所提取的DNA片段完整性好，泳道背景干净，点样孔内无白色蛋白污染，无RNA残留(泳道1)。
实施例2裂解性生长λ噬菌体DNA的提取
1.λ噬菌体DNA提取试剂配制
(1)试剂A：为含50％甘油的50mg/mL的DNase I，-20℃保存；
(2)试剂B：为含50％甘油的20mg/mL的RNase A，-20℃保存；
(3)试剂C：为沉淀液，含40％PEG 6000，3M NaCl；
(4)试剂D：为裂解缓冲液，100mM Tris-HCl，100mM NaCl，50mM EDTA，pH 7.5；
(5)试剂E：为副裂解缓冲液，20％SDS；
(6)试剂F：为杂质沉淀液，2.5M KAC；
(7)试剂G：为DNA结合液，含6M盐酸胍和100mM Tris-HCl，pH 6.4；
(8)试剂H：为漂洗缓冲液，含20mM pH 7.5Tris-HCl，100mM NaCl与无水乙醇按1:4的体积比混合而成；
(9)试剂I：为DNA洗脱液，5mM pH 8.0的Tris-HCl；
2.λ噬菌体DNA提取按以下操作步骤进行
(1)裂解性λ噬菌体的宿主细菌前处理：取2ml新鲜培养的宿主菌，离心后加入0.4mL LB培养基重悬，加0.1mL新鲜获得的λ噬菌体，使滴度与宿主菌比约1/500-1/1000。加0.2％麦芽糖，10mM MgSO4，37℃温育20min，使噬菌体颗粒吸附于细菌。加到100ml LB液体培养基中含0.2％麦芽糖，10mM MgSO4，37℃震荡培养9-12h后发生裂解。加入终浓度0.5％的氯仿，37℃振荡培养至上清液澄清后，4℃，10000g离心10min；
(2)宿主细菌核酸去除：小心吸取上清，向10mL上清中加入20μL试剂A及20μL试剂B，混匀，37℃温育30min；
(3)λ噬菌体颗粒沉淀：加入2mL试剂C，轻柔上下混合，冰上放置30-60min；10000g，4℃离心10min，小心吸去上清，得λ噬菌体颗粒；
(4)λ噬菌体颗粒裂解：向λ噬菌体颗粒沉淀中加入500μL试剂D悬浮噬菌体颗粒，125μL试剂E，70℃温育20min，置冰上冷却；
(5)杂质去除：加入125μL试剂F，轻柔混匀4-6次，10000g，4℃离心10min，取上清；
(6)λ噬菌体DNA结合：加入步骤(5)所取上清，0.5倍体积的试剂G，上下轻轻颠倒混匀，将上述混合液转移到DNA吸附柱，10000g离心1min，弃去过滤液；
(7)DNA吸附柱清洗：向DNA吸附柱中加入700μL试剂H，10000g离心1min，弃去过滤液；再次加入500μL试剂H，10000g离心1min，弃去过滤液，将DNA吸附柱室温放置2min；
(8)λ噬菌体DNA洗脱：将DNA吸附柱转移到一支新的离心管中，加入70℃预热的100μL试剂I于DNA吸附柱的膜中央，室温放置1-2min；10000g离心1min，吸取洗脱液即为λ噬菌体DNA。取4.0μL DNA提取产物于1.0％琼脂糖凝胶上电泳分析，其余置-20℃保存备用。
3.检测结果
λ噬菌体DNA电泳检测结果如图1所示，裂解性λ噬菌体宿主细菌所提取的DNA片段完整性好，泳道背景干净，点样孔内无白色蛋白污染，无RNA残留(泳道2)。
实施例3提取的λ噬菌体DNA质量检测
1.提取λ噬菌体DNA浓度及纯度检测
采用NanoDrop 2000(Thermo公司)超微量分光光度计，对实施例1和实施例2中所提取的λ噬菌体DNA产物进行分析，分别测定DNA溶液的OD230nm、OD260nm和OD280nm，计算DNA样品的浓度，并依据OD260nm/OD280nm和OD260nm/OD230nm的比值进行DNA纯度判定，结果见表1。从表1可以看出，实施例1和实施例2中所提取的λ噬菌体DNA浓度分别为160ng/μL和101ng/μL，10mLλ噬菌体裂解培养物上清可以提取约10μg以上的λ噬菌体DNA；OD260nm/OD280nm比值落在1.8～2.0之间，所提取的λ噬菌体DNA样品不存在蛋白质、酚类、RNA污染情况，OD260nm/OD230nm比值>2.0，所提取的λ噬菌体DNA样品不存在多糖、盐等小分子的污染情况。可见本发明试剂盒提取λ噬菌体具有DNA产量高、纯度好的特点。
表1λ噬菌体DNA浓度和纯度检测结果
2.提取λ噬菌体DNA宿主基因组残留检测
为了检测本发明所提取的λ噬菌体DNA宿主基因组残留情况，参考大肠杆菌特异性Alkaline phosphatase(phoA)Gene片段(GenBank:M29670.1)设计一对622bp大小的检测引物
phoAF:5'-TACAGGTGACTGCGGGCTTATC-3'(SEQ ID NO.1)，
phoAR:5'-CTTACCGGGCAATACACTCACTA-3'(SEQ ID NO.2)。
以大肠杆菌W3110菌株DNA为阳性对照，对实施例1和实施例2中所提取λ噬菌体DNA的宿主基因组残留情况进行PCR检测，PCR反应体系为：
加入灭菌蒸馏水补足体积到25μL，混匀后在S1000(Bio-Rad公司)PCR仪上扩增。扩增条件如下：94℃，2min；94℃，25s，55℃，30s，72℃，1min，35Cycles；72℃，1min。反应结束后，取5.0μL PCR产物于1.0％琼脂糖凝胶上电泳分析，其余置4℃保存备用。
PCR检测扩增电泳结果见图2。由图可见，采用大肠杆菌特异性引物对phoAF/phoAR，分别对实施例1和实施例2中所提取的λ噬菌体DNA进行大肠杆菌宿主残留分析，均不能产生预期的622bp条带，而对应的大肠杆菌W3110 DNA阳性对照则出现预期的622bp条带。表明所提取λ噬菌体DNA样品中不存在宿主基因组DNA的污染。
3.提取λ噬菌体DNA限制性内切酶酶切检测
为了检测本发明所提取的λ噬菌体DNA质量是否满足下一步限制性内切酶酶切要求，分别采用限制性内切酶HindIII和EcoT14 I对实施例1和实施例2中所提取的λ噬菌体DNA进行酶切检测。具体酶切反应体系为：
10×Digest Buffer 2.0μL
λDNA 10.0μL(approx.1μg)
Hind III or EcoT14 I 1.0μL(approx.10U)
加入灭菌蒸馏水补足体积到20μL，混匀后37℃酶切30min。反应结束后，取5.0μLPCR产物于1.0％琼脂糖凝胶上电泳分析，其余置4℃保存备用。酶切产物电泳检测结果显示，限制性内切酶HindIII和EcoT14 I分别对实施例1和实施例2中所提取的λ噬菌体DNA进行酶切后，电泳检测发现限制性内切酶Hind III和EcoT14 I均能对实施例1和实施例2中所提取的λ噬菌体DNA进行有效切割，并产生预期大小的片段(图1中泳道3、泳道4)，表明所提取λ噬菌体DNA质量完全可以满足后续限制性酶切、基因文库构建等分子生物学试验的要求。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所
<120> 一种λ噬菌体DNA提取试剂盒及提取方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tacaggtgac tgcgggctta tc 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cttaccgggc aatacactca cta 23
Claims (5)
1.一种大肠杆菌λ噬菌体DNA的提取试剂盒，其特征在于，由以下组分组成：DNase I液、RNaseA液、沉淀液、第一裂解缓冲液、第二裂解缓冲液、杂质沉淀液、DNA结合液、漂洗缓冲液和DNA洗脱液；
所述第一裂解缓冲液以水为溶剂，由以下浓度的组分组成：50～100mM Tris-HCl，50～100mM NaCl和25～50mM EDTA；
所述第二裂解缓冲液为质量浓度为10％～20％的SDS水溶液；
所述沉淀液以水为溶剂，由以下浓度的组分组成：30wt％～40wt％PEG 6000和2.8～3.2M NaCl；
所述杂质沉淀液为2～2.5M的KAC；
所述DNA结合液以水为溶剂，由5～6M盐酸胍和50～100mM Tris-HCl组成，所述DNA结合液的pH值为6.3～6.5；
所述漂洗缓冲液由10～20mM Tris-HCl、80～100mM NaCl和体积分数为75％～85％的无水乙醇组成；
所述DNA洗脱液为5～10mM的Tris-HCl，所述DNA洗脱液的pH值7.8～8.2。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述DNase I液中DNase I的浓度为40～50mg/mL；所述DNase I液中包括体积分数为45％～55％的甘油。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述RNaseA液中RNase A的浓度为10～20mg/mL；所述RNaseA液中包括体积分数为45％～55％的甘油。
4.利用权利要求1～3任意一项所述的试剂盒进行大肠杆菌λ噬菌体DNA提取的方法，包括以下步骤：
1)将携带λ噬菌体的宿主细菌裂解后，收集上清液；
2)将所述上清液、DNaseI液和RNaseA液混合、第一温育后，与沉淀液混合沉淀，收集沉淀获得λ噬菌体颗粒；
3)将所述λ噬菌体颗粒、第一裂解缓冲液和第二裂解缓冲液混合，第二温育后，与杂质沉淀液混合去除杂质，收集上清液；
4)将步骤3)中所述的上清液与DNA结合液混合后，进行DNA的吸附、漂洗和洗脱获得λ噬菌体DNA；所得λ噬菌体DNA纯度高。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一温育的温度为36～38℃，所述第一温育的时间为25～35min；所述第二温育的温度为68～72℃，所述第二温育的时间为15～25min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210269803.1A CN114703173B (zh) | 2022-03-18 | 2022-03-18 | 一种λ噬菌体DNA提取试剂盒及提取方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210269803.1A CN114703173B (zh) | 2022-03-18 | 2022-03-18 | 一种λ噬菌体DNA提取试剂盒及提取方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114703173A CN114703173A (zh) | 2022-07-05 |
| CN114703173B true CN114703173B (zh) | 2023-06-06 |
Family
ID=82169376
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210269803.1A Active CN114703173B (zh) | 2022-03-18 | 2022-03-18 | 一种λ噬菌体DNA提取试剂盒及提取方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114703173B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113186185B (zh) * | 2020-01-14 | 2023-05-26 | 东北林业大学 | 一种从哺乳动物粪便中高效富集宿主dna的方法 |
Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02295484A (ja) * | 1989-05-02 | 1990-12-06 | Kurabo Ind Ltd | Ｄｎａの単離精製法 |
| CN1869218A (zh) * | 2005-05-27 | 2006-11-29 | 中国科学院生态环境研究中心 | 一种简单快捷的适用于多种微生物基因组dna提取的方法 |
| CN101372703A (zh) * | 2007-08-21 | 2009-02-25 | 中国科学院生态环境研究中心 | 植物叶际微生物基因组dna提取方法 |
| CN102676503A (zh) * | 2012-05-16 | 2012-09-19 | 亚能生物技术（深圳）有限公司 | 一种快速提取dna的方法 |
| CN104152436A (zh) * | 2014-08-01 | 2014-11-19 | 杭州新景生物试剂开发有限公司 | Dna分离纯化方法及其试剂盒 |
| CN105567678A (zh) * | 2016-03-18 | 2016-05-11 | 中国科学院南海海洋研究所 | 细菌噬菌体基因组dna提取试剂盒及方法 |
| CN108410858A (zh) * | 2018-04-27 | 2018-08-17 | 四川大学 | 一种粪污噬菌体dna的提取方法、提取粪污噬菌体dna的试剂盒及该试剂盒的应用 |
| CN109371011A (zh) * | 2018-11-26 | 2019-02-22 | 天津科技大学 | 一种新的提取噬菌体基因组dna的方法 |
| CN109468311A (zh) * | 2018-11-27 | 2019-03-15 | 河南普诺易生物制品研究院有限公司 | 一种提取质粒dna的菌体裂解液、试剂盒及提取质粒dna的方法 |
| CN110904057A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-03-24 | 南京农业大学 | 一种土壤中噬菌体提取富集的方法 |
| CN111705053A (zh) * | 2020-06-12 | 2020-09-25 | 河南金泰生物技术股份有限公司 | 一种快速提取细菌dna的试剂盒及提取方法 |
| CN112795623A (zh) * | 2021-03-22 | 2021-05-14 | 武汉纳磁生物科技有限公司 | 一种病毒核酸提取裂解液、试剂盒及方法 |
| EP3956478A1 (en) * | 2019-04-18 | 2022-02-23 | DSM IP Assets B.V. | Phage test kit |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2963904T3 (es) * | 2009-02-06 | 2024-04-03 | Technophage Investig E Desenvolvimento Em Biotecnologia Sa | Fago antibacteriano, péptidos de fago y sus métodos de uso |
| US8962297B2 (en) * | 2010-09-01 | 2015-02-24 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | Bacteriophage lytic enzymes as alternative antimicrobials |
-
2022
- 2022-03-18 CN CN202210269803.1A patent/CN114703173B/zh active Active
Patent Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02295484A (ja) * | 1989-05-02 | 1990-12-06 | Kurabo Ind Ltd | Ｄｎａの単離精製法 |
| CN1869218A (zh) * | 2005-05-27 | 2006-11-29 | 中国科学院生态环境研究中心 | 一种简单快捷的适用于多种微生物基因组dna提取的方法 |
| CN101372703A (zh) * | 2007-08-21 | 2009-02-25 | 中国科学院生态环境研究中心 | 植物叶际微生物基因组dna提取方法 |
| CN102676503A (zh) * | 2012-05-16 | 2012-09-19 | 亚能生物技术（深圳）有限公司 | 一种快速提取dna的方法 |
| CN104152436A (zh) * | 2014-08-01 | 2014-11-19 | 杭州新景生物试剂开发有限公司 | Dna分离纯化方法及其试剂盒 |
| CN105567678A (zh) * | 2016-03-18 | 2016-05-11 | 中国科学院南海海洋研究所 | 细菌噬菌体基因组dna提取试剂盒及方法 |
| CN108410858A (zh) * | 2018-04-27 | 2018-08-17 | 四川大学 | 一种粪污噬菌体dna的提取方法、提取粪污噬菌体dna的试剂盒及该试剂盒的应用 |
| CN109371011A (zh) * | 2018-11-26 | 2019-02-22 | 天津科技大学 | 一种新的提取噬菌体基因组dna的方法 |
| CN109468311A (zh) * | 2018-11-27 | 2019-03-15 | 河南普诺易生物制品研究院有限公司 | 一种提取质粒dna的菌体裂解液、试剂盒及提取质粒dna的方法 |
| EP3956478A1 (en) * | 2019-04-18 | 2022-02-23 | DSM IP Assets B.V. | Phage test kit |
| CN110904057A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-03-24 | 南京农业大学 | 一种土壤中噬菌体提取富集的方法 |
| CN111705053A (zh) * | 2020-06-12 | 2020-09-25 | 河南金泰生物技术股份有限公司 | 一种快速提取细菌dna的试剂盒及提取方法 |
| CN112795623A (zh) * | 2021-03-22 | 2021-05-14 | 武汉纳磁生物科技有限公司 | 一种病毒核酸提取裂解液、试剂盒及方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "不同方法对金黄色葡萄球菌基因组DNA提取效果的比较";冯飞等;《广东农业科学》(第10期);153-155 * |
| 刘秋婷."噬菌体基因组DNA快速提取方法".《热带生物学报》.2017,第8卷(第2期),232-235. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114703173A (zh) | 2022-07-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7893251B2 (en) | Methods for selective isolation of nucleic acids from microbial cells present in samples containing higher eukaryotic cells and/or tissues | |
| JP3761573B2 (ja) | 極度に少量でかつ非常に強く汚染された非常に種々の出発物質から核酸を単離および精製する一般的方法 | |
| JP5576363B2 (ja) | 短鎖核酸を単離する方法 | |
| EP1442045B1 (en) | Isolation and purification of nucleic acids | |
| CN108624651B (zh) | 一种构建Ribo-seq测序文库的方法 | |
| Kotchoni et al. | A home made kit for plasmid DNA mini-preparation | |
| CN107058295B (zh) | 一种全血dna快速提取方法 | |
| CA2220867A1 (en) | A method for large scale plasmid purification | |
| CN105567678B (zh) | 细菌噬菌体基因组dna提取试剂盒及方法 | |
| CN110452903B (zh) | 一种无酶法全核酸提取试剂盒 | |
| EP3135769A1 (en) | Kits and methods for extracting rna | |
| WO1995004140A1 (en) | Process for isolating nucleic acid from gram positive microorganisms | |
| CN114703173B (zh) | 一种λ噬菌体DNA提取试剂盒及提取方法 | |
| EP0745849A2 (en) | Sample processing method for whole blood | |
| CN110904098A (zh) | 一种裂解结合液及粪便磁珠法核酸提取 | |
| CN114107289A (zh) | 粪便样本的核酸提取试剂盒、制备方法及提取方法 | |
| WO2019243536A1 (en) | Mitochondrial nucleic acid depletion and detection | |
| US5096818A (en) | Nucleic acid separation method | |
| CN116218811A (zh) | 利用pcr富集扩增法对抗逆性dna聚合酶的高通量筛选方法 | |
| CN111607591B (zh) | 一种病毒核酸的提取方法及其相关试剂盒 | |
| KR101760726B1 (ko) | 미생물 탈리 및 페놀-클로로포름을 이용한 동물성 식품으로부터 메타게놈 dna의 분리방법 | |
| CN112501156A (zh) | 一种海洋贝类生物沉积物总dna的高效提取方法 | |
| JP5599013B2 (ja) | 血液検体からの微生物核酸の抽出方法 | |
| CN110904096B (zh) | 一种利用抑制剂提取不含dna的rna方法 | |
| CN113621608B (zh) | 一种提取细菌质粒dna的菌体裂解液、试剂盒及方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |