ES2963904T3 - Fago antibacteriano, péptidos de fago y sus métodos de uso - Google Patents

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DE SÃO JOSÉ Carlos Jorge SOUSA
Leandro Clara Isabel Rodrigues
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Abstract

La presente invención está dirigida al campo de la terapia con fagos para el tratamiento y control de infecciones bacterianas. En particular, la presente invención se dirige al nuevo bacteriófago F770/05 que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:3, proteína de cinta métrica de cola aislada o proteína de cola de la misma, composiciones que comprenden el nuevo bacteriófago y/o proteínas aisladas y métodos para el tratamiento y prevención de infecciones bacterianas, ya sea solas o en combinación con otras terapias antibacterianas, por ejemplo, antibióticos u otras terapias con fagos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Fago antibacteriano, péptidos de fago y sus métodos de uso
1. APLICACIONES RELACIONADAS
Esta Solicitud Internacional reclama prioridad respecto a la Solicitud Provisional de EE.UU. Ser. N° 61/150,585, presentada el 6 de febrero de 2009, titulada "Fago Antibacteriano y sus Usos" y respecto a la Solicitud Provisional de EE.UU. Ser. N° 61/218,345, presentada el 18 de junio de 2009, titulada "Fago Antibacteriano, Péptidos de Fago y sus Métodos de Uso".
2. CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se dirige al campo de la terapia con fagos para el tratamiento y control de infecciones bacterianas. En particular, la presente invención se refiere al nuevo bacteriófago F1245/05 y a sus polipéptidos aislados, composiciones que comprenden uno o más de los nuevos bacteriófagos y/o polipéptidos aislados, y métodos para el tratamiento y prevención de infecciones bacterianas causadas porAcinetobacter baumannii,ya sea de forma aislada o en combinación con otras terapias antibacterianas,e.g.,antibióticos u otras terapias con fagos.
3. ANTECEDENTES
Los bacteriófagos (fagos) son virus que infectan y lisan específicamente a las bacterias. La terapia con fagos, un método de uso de virus fagos enteros para el tratamiento de enfermedades infecciosas bacterianas, fue introducida en la década de 1920 por Félix d'Herelle. Inicialmente, se investigó intensamente la terapia con fagos y se llevaron a cabo numerosos estudios para evaluar el potencial de la terapia con fagos para el tratamiento de infecciones bacterianas en humanos y animales. Los primeros éxitos impulsaron el desarrollo de múltiples preparaciones comerciales de fagos. Por ejemplo, en 1940, la compañía Eli Lilly produjo 7 productos de fagos para uso humano, incluidas preparaciones de fagos para tratar diferentes enfermedades causadas porStaphylococcus sp., E. coliy otras bacterias patógenas. Estas preparaciones se utilizaron para tratar infecciones que causan abscesos, heridas purulentas, vaginitis, infecciones agudas crónicas del tracto respiratorio superior e infecciones mastoides.
Sin embargo, con el desarrollo de los antibióticos en la década de 1940, el interés en terapias basadas en fagos disminuyó en el mundo occidental. Uno de los factores más importantes que contribuyó a este declive fue la falta de protocolos de prueba estandarizados y métodos de producción. La falta de desarrollo de estándares industriales para las pruebas de terapias con fagos interfirió con la documentación de los resultados del estudio, lo que llevó a una percepción de falta de eficacia, así como problemas de credibilidad en cuanto al valor de la terapia con fagos. Además, problemas relacionados con la producción de muestras/especímenes de fagos complicaron el estudio y la investigación iniciales. Se utilizaron diversos estabilizadores y conservantes en intentos de aumentar la viabilidad de los terapéuticos con fagos. Sin embargo, debido a que se entendía mal tanto la biología de los fagos como la de los diversos estabilizadores, muchos de los ingredientes añadidos en un intento de prolongar la viabilidad de las preparaciones de fagos resultaron ser tóxicos para los humanos o tener un impacto negativo en el almacenamiento a largo plazo. Otro problema relacionado con la producción de fagos era el grado de pureza de las preparaciones comerciales de estos virus. En aquel momento, las preparaciones de terapia con fagos generalmente consistían en lisados crudos de bacterias huésped que habían sido tratadas con el fago de interés. Por lo tanto, muchas preparaciones contenían componentes bacterianos no deseados,e.g.,endotoxinas. En consecuencia, se asociaron eventos adversos a las preparaciones, particularmente en pacientes que las recibían por vía intravenosa. Sin embargo, en Europa del Este y la antigua Unión Soviética, donde el acceso a los antibióticos era limitado, el desarrollo y uso de la terapia con fagos continuó conjuntamente con, o en lugar de, los antibióticos.
Con el surgimiento de cepas bacterianas resistentes a los antibióticos, sin embargo, el interés en terapias basadas en fagos ha resurgido en el mundo occidental. Aunque se puedan desarrollar nuevas clases de antibióticos, la perspectiva de que las bacterias eventualmente desarrollen resistencia a los nuevos medicamentos ha intensificado la búsqueda de medios no quimioterapéuticos para controlar, prevenir y tratar las infecciones bacterianas. Hay tres estrategias principales basadas en fagos para usar la terapia con fagos en un entorno clínico: 1) la administración de fagos virulentos; 2) el uso de endolisinas o lisinas purificadas codificadas por bacteriófagos; 3) el uso de proteínas estructurales de los fagos identificados como inhibidores metabólicos de enzimas clave para la síntesis de peptidoglicano bacteriano.
El documento de Marta Wróblewska et al. (Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, Birkhaeuser-Verlag, Basilea, CH, abril de 2006) revela terapias novedosas como bacteriófagos para cepas resistentes a múltiples medicamentos deA. baumannii.
Por lo tanto, existe una necesidad de desarrollar bacteriófagos y productos de fagos novedosos como agentes terapéuticos y profilácticos potenciales para usarin vivopara eliminar bacterias patógenas. En particular, existe una necesidad de bacteriófagos capaces de lisar bacterias nosocomiales, incluyendoAcinetobacter baumannii, Enterococcus faecalis, E. faecium, Pseudomonas aeruginosay/oStaphylococcus aureus.Debido a que la mayoría de los fagos y péptidos de fagos estudiados hasta la fecha exhiben una actividad a menudo restringida a las especies relacionadas, o subespecies, de bacterias de las que se aíslan, las terapias basadas en fagos novedosos pueden encontrar un uso particular en el entorno hospitalario, atacando selectivamente a patógenos nosocomiales sin afectar la flora circundante normal.
4. SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Cuando se utiliza la frase "descrito aquí" a continuación, no indica la invención o sus formas de realización. La invención se presenta en las reivindicaciones adjuntas. La presente invención se dirige al bacteriófago aislado F1245/05 y a polipéptidos antibacterianos aislados del origen del bacteriófago F1245/05 para el tratamiento, prevención o gestión de condiciones asociadas con la infección porAcinetobacter baumannii. En particular, el bacteriófago aislado o polipéptidos de la invención pueden ser utilizados en composiciones farmacéuticas para el tratamiento, profilaxis o gestión de la infección porAcinetobacter baumannii.Se describe aquí (sin ser parte de la invención) que las composiciones farmacéuticas de la invención son útiles en el tratamiento de condiciones asociadas con la infección por cepas bacterianas resistentes a antibióticos,e.g.,cepas resistentes a meticilina deStaphylococcus aureus(MRSA). En formas de realización particulares, los bacteriófagos aislados o polipéptidos de la invención se utilizan para el tratamiento tópico de infecciones por patógenos nosocomiales en un sujeto que lo necesite. En otras formas de realización, los bacteriófagos aislados o polipéptidos de la invención se utilizan para el diagnóstico del agente infeccioso en una muestra(e.g.,tejido, sangre, orina, muestra de esputo) derivada de un paciente. En otras formas de realización, los bacteriófagos aislados o polipéptidos de la invención se utilizan como un desinfectante profiláctico o antiinfeccioso para la preparación de superficies sólidas, incluida la piel u otras superficies epidérmicas.
En ciertas formas de realización, la invención proporciona un bacteriófago aislado, Fl245/05, que tiene un genoma que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:760 y muestra actividad antibacteriana contra una o más cepas deAcinetobacter baumannii.
Se describe aquí (sin ser parte de la invención) polipéptidos aislados del bacteriófago Fl245/05, Fl68/08, Fl 70/08, F770/05, Fl97/08, F86/06, F87s/06 y/o F9la/06, los cuales polipéptidos muestran actividad antibacteriana contra una o más especies o cepas de bacterias Gram-positivas o Gram-negativas,e.g., A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosay/o S.aureus.Los polipéptidos aislados o derivados de Fl68/08 o F/170/08 muestran actividad antibacteriana o antimicrobiana,e.g.,actividad lítica, contra al menosE. faecalisy/oE. faecium;aquellos aislados o derivados de F770/05 contra al menosP. aeruginosa;aquellos aislados o derivados de Fl97/08, F86/06, F87s/06 o F9la/06 contra al menos S.aureus;y aquellos aislados o derivados de Fl245/05 contra al menosA. baumannii.
Se describe aquí sin ser parte de la invención, un polipéptido que comprende o consiste en una endolisina aislada o un su fragmento(e.g.,un dominio CHAP) que muestra actividad antibacteriana contra una o más especies o cepas de bacterias,e.g.,bacterias Gram-positivas y/o bacterias Gram-negativas comoA. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosay/o S.aureus.El polipéptido de la presente solicitud de patente es una proteína lisina aislada,e.g., una endolisina o lisina de cola, que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:447, SEQ ID NO:448, SEQ ID NO:575, SEQ ID NO:641 o SEQ ID NO:712.
Se describe aquí sin ser parte de la invención, un polipéptido que comprende un fragmento, variante o derivado de SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:447, SEQ ID NO:448, SEQ ID NO:575, SEQ ID NO:641 o SEQ ID NO:712, donde dicho fragmento, variante o derivado tiene actividad antibacteriana o actividad antimicrobiana,e.g.,actividad lítica mortal, contra una o más cepas deE. faecalis, E. faecium, P. aeruginosay/o S.aureus.En ejemplos específicos de acuerdo con esta forma de realización, la variante, fragmento o derivado de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:202 y/o SEQ ID NO:203 muestra actividad antibacteriana o antimicrobiana(e.g.,actividad lítica mortal) contra una o más cepas deE. faecalisy/oE. faecium.En otros ejemplos, la variante, fragmento o derivado de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:447, SEQ ID NO:448, SEQ ID NO:575, SEQ ID NO:641 y/o SEQ ID NO:712 muestra actividad antibacteriana o antimicrobiana(e.g.,actividad lítica mortal) contra una o más cepas deS. aureus.
Se describe aquí sin ser parte de la invención, el polipéptido aislado que comprende o consiste en el dominio CHAP de SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:575, SEQ ID NO:641 o SEQ ID NO:712. El polipéptido aislado comprende o consiste en el dominio CHAP de SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:575, SEQ ID NO:641 o s Eq ID NO:712, e.g., teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:755, SEQ ID NO:756, SEQ ID NO:757, SEQ ID NO:758 o SEQ ID NO:759, respectivamente. Se describe aquí sin ser parte de la invención, un polipéptido de la invención comprende un fragmento, variante o derivado de SEQ ID NO:755, SEQ ID NO:756, SeQ ID NO:757, SEQ ID NO:758 o SEQ ID NO:759, donde dicho fragmento, variante o derivado tiene actividad antibacteriana o actividad antimicrobiana,e.g.,actividad lítica mortal, contra al menos una o más cepas deE. faecalis, E. faecium, P. aeruginosay/o S.aureus.Se describe aquí sin ser parte de la invención, un polipéptido comprende un fragmento, variante o derivado de SEQ ID NO: 761 a SEQ ID NO: 816, donde dicho fragmento, variante o derivado tiene actividad antibacteriana o actividad antimicrobiana,e.g.,actividad lítica mortal, contra al menos una o más cepas deA. baumannii.
Se describe aquí, sin formar parte de la invención, un polipéptido que comprende o consiste en una proteína de medida de longitud de cola aislada o proteínas de cola(e.g.,componente de cola, proteína de fibra de cola, proteína de cola asociada a la adsorción), o un su fragmento, que tiene una función biológica asociada con el bacteriófago del cual se deriva,e.g.,actividad antimicrobiana o antibacteriana(e.g.,actividad de lisis letal), que se dirige contra una o más especies o cepas deE. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureusy/oA. baumannii.El polipéptido es una proteína de medida de longitud de cola aislada o proteínas de cola que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:435, SEQ ID NO:438, SEQ ID NO:440, SEQ ID NO:525, SEQ ID NO:526, SEQ ID NO:527, SEQ ID NO:528, SEQ ID NO:529, SEQ ID NO:530, SEQ ID NO:531, SEQ ID NO:532, SEQ ID NO:533, SEQ ID NO:534, SEQ ID NO:535, SEQ ID NO:536, SEQ ID NO:537, SEQ ID NO:538, SEQ ID NO:539, SEQ ID NO:567, SEQ ID NO:568, SEQ ID NO:632, SEQ ID NO:633, SEQ ID NO:700, SEQ ID NO:701, SEQ ID NO:702, SEQ ID NO:703, SEQ ID NO:704 or SEQ ID NO:795. El polipéptido descrito aquí (sin formar parte de la invención) comprende un fragmento, variante o derivado de SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:435, SEQ ID NO:438, SEQ ID NO:440, SEQ ID NO:525, SEQ ID NO:526, SEQ ID NO:527, SEQ ID NO:528, SEQ ID NO:529, SEQ ID NO:530, SEQ ID NO:531, SEQ ID NO:532, SEQ ID NO:533, SEQ ID NO:534, SEQ ID NO:535, SEQ ID NO:536, SEQ ID NO:537, SEQ ID NO:538, SEQ ID NO:539, SEQ ID NO:567, SEQ ID NO:568, SEQ ID NO:632, SEQ ID NO:633, SEQ ID NO:700, SEQ ID NO:701, SEQ ID NO:702, SEQ ID NO:703, SEQ ID NO:704 or SEQ ID NO:795, donde dicho fragmento, variante o derivado muestra una función biológica asociada con el bacteriófago del cual se deriva,e.g.,actividad antimicrobiana o antibacteriana(e.g.,actividad de lisis letal), que se dirige contra una o más cepas deE.faecalis, E.faecium, P. aeruginosa,S. aureus, y/oA. baumannii.
Se describe también aquí, sin formar parte de la invención, una variante, fragmento o derivado de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:61 o SEQ ID NO:63 que exhibe una función biológica asociada con el bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO:1,e.g.,actividad antimicrobiana o antibacteriana (e.g., actividad de lisis letal), que se dirige contra una o más cepas deE. faecalisy/oE. faecium.Se describe también aquí, sin formar parte de la invención, una variante, fragmento o derivado de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:204 o SEQ ID NO:214 que exhibe una función biológica asociada con el bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO:2,e.g.,actividad antimicrobiana o antibacteriana(e.g.,actividad de lisis letal), que se dirige contra una o más cepas deE. faecalisy/oE. faecium.
También se describe aquí, sin formar parte de la invención, una variante, fragmento o derivado de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:435 o SEQ ID NO:438 que exhibe una función biológica asociada con el bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO:3,e.g.,actividad antimicrobiana o antibacteriana(e.g.,actividad de lisis letal), que se dirige contra una o más cepas deP. aeruginosa.
También se describe aquí, sin formar parte de la invención, una variante, fragmento o derivado de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:440, SEQ ID NO:525, SEQ ID NO:526, SEQ ID NO:527, SEQ ID NO:528, SEQ ID NO:529, SEQ ID NO:530, SEQ ID NO:531, SEQ ID NO:532, SEQ ID NO:533, SEQ ID NO:534, SEQ ID NO:535, SEQ ID NO:536, SEQ ID NO:537, SEQ ID NO:538 o SEQ ID NO:539 que exhibe una función biológica asociada con el bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO:4,e.g.,actividad antimicrobiana o antibacteriana(e.g.,actividad de lisis letal), que se dirige contra una o más cepas de S.aureus.También se describe aquí (sin formar parte de la invención) una variante, fragmento o derivado de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:567 o SEQ ID NO:568 que muestra una función biológica asociada con el bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO:5,e.g.,actividad antimicrobiana o antibacteriana(e.g.,actividad de lisis letal), que se dirige contra una o más cepas de S.aureus.También se describe aquí (sin formar parte de la invención) una variante, fragmento o derivado de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:632 o SEQ ID NO:633 que muestra una función biológica asociada con el bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO:6,e.g.,actividad antimicrobiana o antibacteriana (e . gactividad de lisis letal), que se dirige contra una o más cepas de S.aureus.También se describe aquí, sin formar parte de la invención, una variante, fragmento o derivado de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:700, SEQ ID NO:701, SEQ ID NO:702, SEQ ID NO:703 o SEQ ID NO:704 que muestra una función biológica asociada con el bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO:7,e.g.,actividad antimicrobiana o antibacteriana(e.g.,actividad de lisis letal), que se dirige contra una o más cepas deS. aureus.
También se describe aquí una variante, fragmento o derivado de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOS: 761-816 que muestra una función biológica asociada con el bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO:760,e.g.,actividad antimicrobiana o antibacteriana(e.g.,actividad de lisis letal), que se dirige contra una o más cepas deA. baumannii.
También se describe aquí, sin ser parte de la invención, polipéptidos aislados que muestran actividad antimicrobiana o antibacteriana(e.g.,actividad de lisis letal) contra una o más cepas de bacterias(e.g.,bacterias Gram-positivas(e.g., E. faecalis, E. faecium, S. aureus),bacterias Gram-negativas (e.g.,A. baumannii, P. aeruginosa)o bacterias no clasificadas como Gram-positivas o Gram-negativas), donde los polipéptidos aislados tienen una secuencia de aminoácidos con al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad de secuencia con una segunda secuencia de aminoácidos de la misma longitud(i.e.,que consta del mismo número de residuos), siendo esta segunda secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:61, s Eq ID NO:63, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:435, SEQ ID NO:438, SEQ ID NO:440, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:447, SEQ ID NO:448, SEQ ID NO:525, SEQ ID NO:526, SEQ ID NO:527, SEQ ID NO:528, SEQ ID NO:529, SEQ ID NO:530, SEQ ID NO:531, SEQ ID NO:532, SEQ ID NO:533, SEQ ID NO:534, SEQ ID NO:535, SEQ ID NO:536, SEQ ID NO:537, SEQ ID NO:538, SEQ ID NO:539, SEQ ID NO:567, SEQ ID NO:568, SEQ ID NO:575, SEQ ID NO:632, SEQ ID NO:633, SEQ ID NO:641, SEQ ID NO:700, SEQ ID NO:701, SEQ ID NO:702, SEQ ID NO:703, SEQ ID NO:704, SEQ ID NO:712, SEQ ID NO:755, SEQ ID NO:756, SEQ ID NO:757, SEQ ID NO:758, SEQ ID NO:759, SEQ ID NOS:761-816 y/o un su fragmento.
También se describe aquí, sin ser parte de la invención, polipéptidos aislados que comprenden o consisten en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOS:8-130, SEQ ID No S:131-343, SEQ ID NOS:344-438, SEQ ID NOS:439-553, SEQ ID NOS:554-616, SEQ ID NOS:617-681, SEQ ID NOS:682-759 y SEQ ID NOS:761-816. También se describe aquí, sin ser parte de la invención, polipéptidos aislados de la invención fusionados recombinantemente o conjugados químicamente(e.g.,conjugación covalente o no covalente) a agentes terapéuticos(e.g.,polipéptidos heterólogos o pequeñas moléculas).
La presente solicitud de patente también describe, aunque no es parte de la invención, polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la invención. La presente solicitud de patente también describe un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de cualquiera de SEQ ID NOS:8-130, SEQ ID NOS:131-343, SEQ ID NOS:344-438, SEQ ID NOS:439-553, SEQ ID NOS:554-616, SEQ ID NOS:617-681, SEQ ID NOS:682-759 y SEQ ID NOS 761-816. También se describe aquí, sin ser parte de la invención, un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de cualquiera de SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:435, SEQ ID NO:438, SEQ ID NO:440, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:447, SEQ ID NO:448, SEQ ID NO:525, SEQ ID NO:526, SEQ ID NO:527, SEQ ID NO:528, SEQ ID NO:529, SEQ ID NO:530, SEQ ID NO:531, SEQ ID NO:532, SEQ ID NO:533, SEQ ID NO:534, SEQ ID NO:535, SEQ ID NO:536, SEQ ID NO:537, SEQ ID NO:538, SEQ ID NO:539, SEQ ID NO:567, SEQ ID NO:568, SEQ ID NO:575, SEQ ID NO:632, SEQ ID NO:633, SEQ ID NO:641, SEQ ID NO:700, SEQ ID NO:701, SEQ ID NO:702, SEQ ID NO:703, SEQ ID NO:704, SEQ ID NO:712, SEQ ID NO:755, SEQ ID NO:756, SEQ ID NO:757, SEQ ID NO:758, SEQ ID NO:759 y SEQ ID NOS 761-816, o fragmento activo, variante o su derivado, el cual polipéptido o fragmento activo, variante o derivado exhibe una función biológica asociada con el bacteriófago del cual es aislado y/o derivado,e.g.,actividad antimicrobiana o antibacteriana(e.g.,actividad de muerte lítica).
La presente solicitud de patente describe (aunque no forma parte de la invención) métodos para la producción de polipéptidos de la invención o sus fragmentos activos, en particular para su uso en composiciones farmacéuticas,i.e.,composiciones antimicrobianas. Por ejemplo, los polipéptidos de la invención pueden aislarse directamente de cultivos celulares (por ejemplo, cultivos de células bacterianas) infectados con el bacteriófago Fl245/05, Fl68/08, Fl70/08, F770/05, Fl97/08, F86/06, F87s/06 o F9la/06. Alternativamente, los polipéptidos de la presente invención pueden derivarse por medios recombinantes utilizando vectores de expresión que comprenden secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la invención,e.g.,SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63,, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:435, SEQ ID NO:438, SEQ ID NO:440, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:447, SEQ ID NO:448, SEQ ID NO:525, SEQ ID NO:526, SEQ ID NO:527, SEQ ID NO:528, SEQ ID NO:529, SEQ ID NO:530, SEQ ID NO:531, SEQ ID NO:532, SEQ ID NO:533, SEQ ID NO:534, SEQ ID NO:535, SEQ ID NO:536, SEQ ID NO:537, SEQ ID NO:538, SEQ ID NO:539, SEQ ID NO:567, SEQ ID NO:568, SEQ ID NO:575, SEQ ID NO:632, SEQ ID NO:633, SEQ ID NO:641, SEQ ID NO:700, SEQ ID NO:701, SEQ ID NO:702, SEQ ID NO:703, SEQ ID NO:704, SEQ ID NO:712, SEQ ID NO:755, SEQ ID NO:756, SEQ ID NO:757, SEQ ID NO:758, SEQ ID NO:759, SEQ ID NOS:761-816, o sus fragmentos activos, derivados o variantes. Los polipéptidos o sus fragmentos que se describen aquí, sin formar parte de la invención, pueden producirse por cualquier método conocido en la tecnica para la producción de un polipéptido, en particular, por síntesis química o por técnicas de expresión recombinante. La presente solicitud de patente describe (aunque no forma parte de la invención) un método para producir recombinantemente una proteína de fago,e.g.,una proteína lisina, proteína de cola o un su fragmento activo, variante o derivado. Dicho método comprende: (i) cultivar, bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicha proteína en un medio, una célula huésped que contiene un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:435, SEQ ID NO:438, SEQ ID NO:440, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:447, SEQ ID NO:448, SEQ ID NO:525, SEQ ID NO:526, SEQ ID NO:527, SEQ ID NO:528, SEQ ID NO:529, SEQ ID NO:530, SEQ ID NO:531, SEQ ID NO:532, SEQ ID NO:533, SEQ ID NO:534, SEQ ID NO:535, SEQ ID NO:536, SEQ ID NO:537, SEQ ID NO:538, SEQ ID NO:539, SEQ ID NO:567, SEQ ID NO:568, SEQ ID NO:575, SEQ ID NO:632, SEQ ID NO:633, SEQ ID NO:641, SEQ ID NO:700, SEQ ID NO:701, SEQ ID NO:702, SEQ ID NO:703, SEQ ID NO:704, SEQ ID NO:712, SEQ ID NO:755, SEQ ID NO:756, SEQ ID NO:757, SEQ ID NO:758, SEQ ID NO:759, SEQ ID NOS:761-816, o su fragmento; y (ii) recuperar dicha proteína de dicho medio. En ciertas formas de realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la invención está operativamente vinculada a un promotor heterólogo.
La invención también abarca métodos para el diagnóstico del agente causante en una presentación clínica de infección bacteriana. Los bacteriófagos aislados o polipéptidos de la invención pueden utilizarse para ayudar en la determinación de especies de bacterias en una muestra de paciente al establecer la susceptibilidad de las bacterias en la muestra a los bacteriófagos y/o polipéptidos de la invención. Estos métodos también incluyen métodos de evaluación de la actividad antibacteriana de los bacteriófagos aislados y/o polipéptidos de la invención. La actividad antibacteriana de los bacteriófagos o los polipéptidos de la invención, o la susceptibilidad de una muestra desconocida a dicha actividad, puede evaluarse por cualquier método conocido en la tecnica y/o descrito aquí. En ciertas formas de realizaciones, la actividad antibacteriana y/o la susceptibilidad se evalúan cultivando bacterias conocidas y/o tejido del paciente, sangre, líquido o muestras con hisopo según técnicas estándar(e.g.,en cultivo líquido o en placas de agar), poniendo en contacto el cultivo con bacteriófagos y/o polipéptidos de la invención y monitoreando el crecimiento celular después de dicho contacto. Por ejemplo, en un cultivo líquido, las bacterias(e.g., A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureus)pueden cultivarse hasta una densidad óptica ("OD") representativa de un punto medio en el crecimiento exponencial de la cultura; la cultura se expone a una o más concentraciones de uno o más bacteriófagos y/o polipéptidos de la invención y se monitorea la OD en relación con una cultura de control. Una OD disminuida en relación con una cultura de control es representativa de un bacteriófago y/o polipéptido que exhibe actividad antibacteriana(e.g.,muestra actividad lítica) contra la muestra probada o especies y/o cepa bacteriana en la cultura. De manera similar, se pueden permitir que las colonias bacterianas se formen en una placa de agar, exponer la placa a un bacteriófago o polipéptido de la invención y evaluar el crecimiento posterior de las colonias en relación con las placas de control. Un tamaño disminuido de colonias, o un número total disminuido de colonias, indica un bacteriófago y/o polipéptido con actividad antibacteriana contra la muestra probada y/o especies o cepa cultivada.
La presente invención también está dirigida a composiciones farmacéuticas que comprenden o consisten en un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO:760. En ciertas formas de realizaciones, la composición farmacéutica de la invención comprende un bacteriófago que tiene el genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO:760 además de uno o más otros bacteriófagos. Estos uno o más otros bacteriófagos pueden ser uno o más bacteriófagos de la invención(e.g.,teniendo un genoma que comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7, o SEQ ID NO:760), una o más de sus cepas, o pueden ser uno o más bacteriófagos conocidos en la técnica. Además, los uno o más bacteriófagos en la composición farmacéutica de la invención pueden tener como objetivo las mismas o diferentes especies o cepas de bacterias. La presente solicitud de patente describe composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más bacteriófagos de la invención y que además comprenden uno o más polipéptidos de la invención y/o otros productos de fagos según lo descrito aquí o conocidos en la técnica.
Se describe en la presente solicitud de patente composiciones farmacéuticas que comprenden polipéptidos, o sus fragmentos activos, en particular aquellos que tienen actividad antimicrobiana y/o antibacteriana, aislados de bacteriófagos que tienen un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y/o SEQ ID NO:760. Las composiciones farmacéuticas descritas en este documento, sin ser parte de la invención, comprenden uno o más polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:435, SEQ ID NO:438, SEQ ID NO:440, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:447, SEQ ID NO:448, SEQ ID NO:525, SEQ ID NO:526, SEQ ID NO:527, SEQ ID NO:528, SEQ ID NO:529, SEQ ID NO:530, SEQ ID NO:531, SEQ ID NO:532, SEQ ID NO:533, SEQ ID NO:534, SEQ ID NO:535, SEQ ID NO:536, SEQ ID NO:537, SEQ ID NO:538, SEQ ID NO:539, SEQ ID NO:567, SEQ ID NO:568, SEQ ID NO:575, SEQ ID NO:632, SEQ ID NO:633, SEQ ID NO:641, SEQ ID NO:700, SEQ ID NO:701, SEQ ID NO:702, SEQ ID NO:703, SEQ ID NO:704, SEQ ID NO:712, SEQ ID NO:755, SEQ ID NO:756, SEQ ID NO:757, SEQ ID NO:758, SEQ ID NO:759 o SEQ ID NOS:761-816. Las composiciones farmacéuticas descritas aquí, sin ser parte de la invención, comprenden un polipéptido que es una variante, derivado o fragmento de SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:435, SEQ ID NO:438, SEQ ID NO:440, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:447, SEQ ID NO:448, SEQ ID NO:525, SEQ ID NO:526, SEQ ID NO:527, SEQ ID NO:528, SEQ ID NO:529, SEQ ID NO:530, SEQ ID NO:531, SEQ ID NO:532, SEQ ID NO:533, SEQ ID NO:534, SEQ ID NO:535, SEQ ID NO:536, SEQ ID NO:537, SEQ ID NO:538, SEQ ID NO:539, SEQ ID NO:567, SEQ ID NO:568, SEQ ID NO:575, SEQ ID NO:632, SEQ ID NO:633, SEQ ID NO:641, SEQ ID NO:700, SEQ ID NO:701, SEQ ID NO:702, SEQ ID NO:703, SEQ ID NO:704, SEQ ID NO:712, SEQ ID NO:755, SEQ ID NO:756, SEQ ID NO:757, SEQ ID NO:758, SEQ ID NO:759, o SEQ ID NOS:761-816; donde la variante, derivado o fragmento conserva una función biológica del polipéptido del cual se deriva,e.g.,actividad antimicrobiana o antibacteriana(e.g.,actividad lítica), preferiblemente contra una o más cepas deA. baumannii, E.faecalis, E.faecium, P. aeruginosay/o S.aureus.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden adicionalmente comprender un vehículo, excipiente o estabilizador farmacéuticamente aceptable. En ciertas formas de realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención son composiciones antibióticas (en el sentido de que muestran actividad antibacteriana) o composiciones terapéuticas para el tratamiento, prevención y/o alivio de los síntomas de una enfermedad o trastorno asociado con infección por bacterias en un sujeto que lo necesite. En realizaciones específicas, las composiciones farmacéuticas de la invención son composiciones antibacterianas o composiciones terapéuticas para el tratamiento, prevención y/o alivio de los síntomas de una enfermedad o trastorno asociado con infección porA. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosay/o S.aureus.En ciertas formas de realizaciones, el sujeto que recibe una composición farmacéutica de la invención es un mamífero(e.g.,bovino, ovino, caprino, équido, primate(e.g.,humano), roedor, lagomorfo o aviar(e.g.,pollo, pato, ganso)).
La presente invención proporciona métodos para el tratamiento o prevención de infecciones bacterianas que comprenden la administración a un sujeto que lo necesite de una composición farmacéutica que contiene uno o más bacteriófagos o productos de fagos(e,g,,un polipéptido de bacteriófago aislado o un fragmento activo, variante o su derivado), opcionalmente en adición a uno o más otros bacteriófagos u otros productos de fagos, como se describe aquí. En el contexto de la presente invención, "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, donde el objetivo es eliminar, reducir, disminuir la gravedad de, retardar la progresión de o retrasar o prevenir los síntomas o la causa subyacente(e.g.,infección bacteriana) asociados con la condición patológica o trastorno. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden usarse en el tratamiento o manejo de infecciones asociadas con cualquier infección bacteriana, incluyendo, pero no limitado aA. baumanni, S. aureus, S. epidermidis, S. auricularis, S. capitis, S. haemolyticus, S. hominis, S. saprophyticus, S. simulans, S. xylosis, M. luteus, B. subtilis, B. pumilus, E. faecalis, E. hirae, E. faecium, E. avium, P. aeruginosay sus combinaciones. En ciertas formas de realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden usarse para tratar condiciones o trastornos asociados con infecciones bacterianas, incluyendo, pero no limitado a, endoftalmitis post-operatoria, endocarditis, infecciones del sistema nervioso central, neumonía, osteomielitis, infecciones de heridas(e.g.,úlceras del pie diabético), mastitis, septicemia, intoxicación alimentaria y meningitis y/u otras condiciones asociadas con infecciones bacterianas nosocomiales.
En ciertas formas de realizaciones, la invención proporciona el uso de un bacteriófago o un producto de fago aislado(e.g.,un polipéptido de fago aislado o fragmento activo, variante o su derivado) como terapia de agente único. En otras realizaciones, la invención proporciona el uso de un bacteriófago, o producto de fago(e.g.,un polipéptido de fago aislado o fragmento activo, variante o su derivado), en combinación con un tratamiento estándar o experimental para infecciones bacterianas. Dicha terapia combinada puede mejorar la eficacia del tratamiento estándar o experimental. Ejemplos de agentes terapéuticos que son particularmente útiles en combinación con un polipéptido de la invención son agentes antiinflamatorios, agentes antibióticos quimioterapéuticos estándar(e.g.,penicilina, penicilinas sintéticas, bacitracina, meticilina, cefalosporina, polimixina, cefaclor, Cefadroxilo, cefamandol nafato, cefazolina, cefixima, cefmetazol, cefonioid, cefoperazona, ceforanida, cefotanme, cefotaxima, cefotetán, cefoxitina, cefpodoxima proxetilo, ceftazidima, ceftizoxima, ceftriaxona, cefriaxona moxalactam, cefuroxima, cefalexina, cefalosporina C, sal sódica de cefalosporina C, cefalotina, sal sódica de cefalotina, cefapirina, cefradina, cefuroxima axetilo, dihidrato de cefalotina, moxalactam, loracarbef mafato y agentes quelantes), agentes anestésicos locales y/o corticosteroides. En otra realización, las composiciones de la presente invención pueden combinarse con uno o más bacteriófagos o productos de fago conocidos en la tecnica. Las terapias combinadas comprendidas por la invención pueden formularse en una única composición farmacéutica o pueden administrarse en composiciones separadas, pero como parte de un régimen de tratamiento general.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser administradas por cualquier método conocido en la técnica adecuado para la administración de un compuesto antibacteriano(e.g.,vía oral o parenteral(e.g.,inhalación, intramuscular, intravenosa o epidérmica)). En realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas de la invención se administran tópicamente,e.g.,en una formulación tópica. Las composiciones de la invención pueden usarse tópicamente para tratar y/o prevenir infecciones nosocomiales comunes, como infecciones en sitios de incisión quirúrgica o asociadas con catéteres o drenajes. En otras formas de realizaciones, las composiciones de la invención se utilizan para tratar infecciones bacterianas de la piel o capas dérmicas superiores(e.g.,infecciones de úlceras diabéticas del pie)).
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden ser utilizadas para usos tradicionalmente no terapéuticos, como agentes antibacterianos en cosméticos, o en aerosoles o soluciones para su uso en superficies sólidas para prevenir la colonización de bacterias(i.e.,como desinfectantes).
Se describen también métodos para cribar péptidos en busca de actividad antibacteriana.
4.1. DEFINICIONES
Tal como se utiliza aquí, el término "fragmento" se refiere a un péptido o polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 5 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 15 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 20 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 25 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 40 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 50 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 60 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 70 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 80 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 90 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 100 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 125 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 150 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 175 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 200 residuos de aminoácidos contiguos, o al menos 250 residuos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de una proteína. En una realización específica, el fragmento es un fragmento funcional en el sentido de que retiene al menos una función de la proteína de la cual está aislado(e.g.,actividad antimicrobiana o antibacteriana(e.g.,actividad lítica de destrucción celular)).
Tal como se utiliza aquí, los términos "productos activos de bacteriófago" y "productos de bacteriófago" se refieren a polipéptidos, o fragmentos, variantes o sus derivados, aislados de un bacteriófago de la invención, cuyo polipéptido, o fragmento, variante o su derivado, exhibe una función o actividad biológica asociada con el bacteriófago del cual fue aislado o derivado(e.g.,actividad antimicrobiana o antibacteriana(e.g.,actividad lítica de destrucción celular)).
Tal como se utiliza aquí, el término "aislado" en el contexto de un péptido, polipéptido o proteína de fusión se refiere a un péptido, polipéptido o proteína de fusión que está sustancialmente libre de material celular o proteínas contaminantes de la célula o tejido del cual se deriva, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. La expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de un péptido, polipéptido o proteína de fusión en las que dicho péptido, polipéptido o proteína de fusión está separado de los componentes celulares de las células de las que se aísla o se produce recombinantemente. Por lo tanto, un péptido, polipéptido o proteína de fusión que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de un péptido, polipéptido o proteína de fusión que tiene menos del 30%, 20%, 10% o 5% (en peso seco) de proteína heteróloga (también referido aquí como una "proteína contaminante"). Cuando el péptido, polipéptido o proteína de fusión se produce recombinantemente, también es preferiblemente sustancialmente libre de medio de cultivo,i.e.,el medio de cultivo representa menos del 20%, 10% o 5% del volumen de la preparación proteica. Cuando el péptido, polipéptido o proteína de fusión se produce por síntesis química, es preferiblemente sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos,i.e.,está separado de los precursores químicos u otros productos químicos que intervienen en la síntesis del péptido, polipéptido o proteína de fusión. Por lo tanto, tales preparaciones de un péptido, polipéptido, proteína de fusión o anticuerpo tienen menos del 30%, 20%, 10%, 5% (en peso seco) de precursores químicos o compuestos distintos del péptido, polipéptido o proteína de fusión de interés.
Tal como se utiliza aquí, el término "aislado" en el contexto de moléculas de ácido nucleico se refiere a una molécula de ácido nucleico que está separada de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural de la primera molécula de ácido nucleico. Además, una molécula de ácido nucleico "aislada", como una molécula de cDNA, está sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente y puede estar libre de moléculas de cDNA u otro DNA genómico,e.g.,ha sido aislada de otros clones en una biblioteca de ácido nucleico.
El término "purificado" significa que el péptido, polipéptido, proteína de fusión o molécula de ácido nucleico ha aumentado mediblemente en concentración mediante cualquier proceso de purificación, incluido pero no limitado a, cromatografía de columna, HPLC, precipitación, electroforesis, etc., eliminando parcial, sustancial o completamente impurezas como precursores u otros productos químicos involucrados en la preparación del péptido, polipéptido, proteína de fusión o molécula de ácido nucleico. Un experto en la materia apreciará la cantidad de purificación necesaria para un uso dado. Por ejemplo, una proteína aislada destinada a ser utilizada en composiciones terapéuticas para administración en humanos generalmente debe ser de alta pureza de acuerdo con los estándares regulatorios y las buenas prácticas de fabricación.
Tal como se utiliza aquí, el término "derivado" en el contexto de polipéptidos se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que ha sido alterada mediante la introducción de sustituciones, eliminaciones o adiciones de residuos de aminoácidos. El término "derivado" también se refiere a un polipéptido que ha sido modificado,i.e.,mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula al polipéptido. Por ejemplo, pero sin limitarse a ello, un polipéptido puede ser modificado,e.g.,mediante glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización con grupos de protección/bloqueo conocidos, escisión proteolítica, enlace a un ligando celular u otra proteína, etc. Un polipéptido derivado puede producirse mediante modificaciones químicas utilizando técnicas conocidas por aquellos con habilidad en la técnica, incluyendo, pero no limitado a, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, un polipéptido derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos. Un derivado de polipéptido posee una función similar o idéntica a la del polipéptido del cual se derivó. El término "derivado" utilizado en referencia a un polipéptido "derivado" de un organismo también puede referirse a la aislación de un polipéptido directamente de dicho organismo(e.g.,células bacterianas o fago).
Tal como se utiliza aquí, el término "célula huésped" se refiere a la célula sujeto particular que ha sido transfectada con una molécula de ácido nucleico y la progenie o potencial progenie de dicha célula que contienen la molécula de ácido nucleico o una versión de la misma integrada cromosómicamente. La progenie de dicha célula puede no ser idéntica a la célula madre transfectada con la molécula de ácido nucleico debido a mutaciones o influencias ambientales que pueden ocurrir en generaciones sucesivas o a la integración de la molécula de ácido nucleico en el genoma de la célula huésped. Para la expresión de proteínas y polipéptidos de bacteriófagos, la célula huésped preferiblemente no es de la misma especie o cepa de la cual el bacteriófago fue aislado o cultivado.
Tal como se utiliza aquí, el término "en combinación" se refiere al uso de más de un agente profiláctico y/o terapéutico. El uso del término "en combinación" no restringe el orden en que se administran los agentes profilácticos y/o terapéuticos a un sujeto con una enfermedad o trastorno. Un primer agente profiláctico o terapéutico puede ser administrado antes de(e.g.,5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas antes), de forma concomitante con, o posterior a (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas después) la administración de un segundo agente profiláctico o terapéutico (diferente del primer agente profiláctico o terapéutico) a un sujeto con una enfermedad o trastorno.
Tal como se utiliza aquí, los términos "ácidos nucleicos" y "secuencias nucleotídicas" incluyen moléculas de DNA y/o RNA de una sola hebra y de doble hebra, o sus combinaciones. Tal como se utiliza aquí, el término "codificado por el ácido nucleico" se refiere a una secuencia de aminoácidos que resulta de la traducción de la secuencia hacia adelante, inversa, complementaria o inversa complementaria de la secuencia de ácido nucleico referenciada utilizando el código genético estándar(i.e.,tripletes de codones estándar) como es bien conocido en la técnica.
Tal como se utiliza aquí, los términos "agente profiláctico" y "agentes profilácticos" se refieren a bacteriófagos y/o polipéptidos de la invención, que pueden ser utilizados en la prevención, tratamiento, manejo o mejoramiento de uno o más síntomas asociados con una infección por una bacteria.
Tal como se utiliza aquí, los términos "agente terapéutico" y "agentes terapéuticos" se refieren a bacteriófagos y/o polipéptidos de la invención que pueden ser utilizados en la prevención, tratamiento, manejo o mejoramiento de uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno, en particular, una enfermedad o trastorno asociado con una infección bacteriana.
Tal como se utiliza aquí, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de un agente terapéutico suficiente para resultar en el mejoramiento de uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno, en particular, una enfermedad o trastorno asociado con una infección bacteriana.
Tal como se utiliza aquí, los términos "tratar", "tratamiento" y "tratando" se refieren al alivio de uno o más síntomas asociados con una infección bacteriana que resulta de la administración de uno o más bacteriófagos y/o polipéptidos de la invención. Como se mencionó anteriormente, "tratamiento" y términos relacionados se refieren tanto al tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, donde el objetivo es eliminar, aliviar, disminuir la gravedad de, retardar la progresión de, o retrasar o prevenir los síntomas o la causa subyacente(e.g.,infección bacteriana) asociada con la condición patológica o trastorno.
Tal como se utiliza aquí, los términos "actividad antibacteriana" y "actividad antimicrobiana" en relación con un bacteriófago, proteína de bacteriófago aislada (o su variante, derivado o fragmento), o producto de bacteriófago, se usan indistintamente para referirse a la capacidad de matar y/o inhibir el crecimiento o reproducción de un microorganismo, en particular, las bacterias de la especie o cepa que el bacteriófago infecta. En ciertas formas de realizaciones, la actividad antibacteriana o antimicrobiana se evalúa cultivando bacterias(e.g.,bacterias Grampositivas(e.g., E. faecalis, E. faecium, S. aureus),bacterias Gram-negativas(e.g., A. baumannii, P. aeruginosa)o bacterias no clasificadas como Gram-positivas o Gram-negativas) según técnicas estándar(e.g.,en cultivo líquido o en placas de agar), poniendo en contacto el cultivo con un bacteriófago o polipéptido de la invención y monitoreando el crecimiento celular después de dicho contacto. Por ejemplo, en un cultivo líquido, las bacterias pueden ser cultivadas hasta una densidad óptica ("OD") representativa de un punto medio en el crecimiento exponencial de la cultura; la cultura se expone a una o más concentraciones de uno o más bacteriófagos o polipéptidos de la invención y se monitorea la OD en relación con una cultura de control. Una OD disminuida en relación con una cultura de control es representativa de un bacteriófago o polipéptido que exhibe actividad antibacteriana(e.g.,exhibe actividad de muerte lítica). De manera similar, se pueden permitir que las colonias bacterianas se formen en una placa de agar, la placa expuesta a un bacteriófago o polipéptido de la invención, y luego se evalúa el crecimiento subsiguiente de las colonias en relación con las placas de control. Un tamaño reducido de colonias, o un número total reducido de colonias, indica un bacteriófago o polipéptido con actividad antibacteriana.
Tal como se utiliza aquí, un "dominio CHAP" se refiere a un dominio amidasa conservado encontrado en varias hidorlasas de peptidoglicano codificadas por fagos y es un acrónimo de "cysteine, histidine-dependent amidohydrolases/peptidases" (amidohidrolasas/peptidasas dependientes de cisteína e histidina). Véase,e.g., Rigden D, et. al., Trends Biochem Sci. 2003 May 28(5): 230-4. Se encuentra en una superfamilia de amidasas, incluidas las amidasa GSP y las hidrolasas de peptidoglicano. La familia incluye al menos dos tipos diferentes de actividades de escisión de peptidoglicano: actividad de amidasa de L-muramoil-L-alanina y actividad de endopeptidasa de D-alanil-glicilo. Los dominios CHAP generalmente contienen residuos conservados de cisteína e histidina e hidrolizan sustratos que contienen Y-glutamil. Se cree que estos residuos de cisteína son esenciales para la actividad de varias de estas amidasas, y sus grupos tiol parecen funcionar como nucleófilos en los mecanismos catalíticos de todas las enzimas que contienen este dominio. Los dominios CHAP a menudo se encuentran en asociación con otros dominios que escinden el peptidoglicano,e.g., actuando de manera cooperativa para escindir sustratos especializados. Véase también, Bateman A, et al., Trends Biochem Sci. 2003 May 28(5): 234-7.
5. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1: Esquema de la organización del genoma de Fl68/08, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1. Los marcos de lectura abiertos ("ORFs") predichos en el genoma están representados por flechas y numerados en negro. La dirección de una flecha indica la dirección de la transcripción. Codificación por colores: Negro - ORFs para los cuales se podría hacer una asignación funcional basada en las funciones conocidas de proteínas homólogas (ORFs que codifican productos que muestran homología con las mismas proteínas o similares se indican con el mismo número y se diferencian por letra minúscula); Gris - ORFs que codifican productos que son similares a proteínas de función desconocida; Blanco o Vacío - ORFs que codifican proteínas que no comparten homología significativa con proteínas en bases de datos disponibles. ORFs con asignación funcional también se enumeran en la figura. La información en la figura también se incluye en forma tabular en la FIG. 2.
FIGS. 2A-X: Características del genoma del bacteriófago Fl68/08, incluyendo productos génicos y asignación de funciones putativas. La figura incluye una lista de los ORFs del genoma y proporciona para cada ORF (i) su posición dentro del genoma, (ii) la secuencia de aminoácidos codificada, (iii) una lista de proteínas homólogas y dominios conservados dentro de su polipéptido codificado y (iv) una asignación de función putativa. Los ORFs 1-116 listados en la FIG. 2 codifican las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:8-130, respectivamente.
FIGS. 3A-B: El rango de hospedador de Fl68/08 determinado por la prueba de mancha en 105 cepas de Enterococcus faecalis (EFS) (3A) y 56 cepas de Enterococcus faecium (e Fm ) (3B) aisladas de muestras clínicas. Cada mancha contenía 5 pl de suspensión de bacteriófago con los títulos indicados (preparados a partir de lisado purificado con CsCl). La sensibilidad de cada cepa al fago se evaluó en función de una escala relativa que va desde halos de lisis turbios (+) a claros (++++). La resistencia a la infección por fago se indica como (-).
FIG. 4: Esquema de la organización del genoma F170/08, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:2. Los ORFs predichos en el genoma están representados por flechas y numerados en negro. La dirección de una flecha indica la dirección de la transcripción. Codificación por colores: Negro - ORFs para los cuales se pudo hacer una asignación funcional de los productos basada en las funciones conocidas de proteínas homólogas (los ORFs que codifican productos que exhiben homología con las mismas proteínas o similares se indican usando el mismo número y se diferencian por letra minúscula); Gris - ORFs que codifican productos que son similares a proteínas de función desconocida; Blanco o Vacío - ORFs que codifican proteínas que no comparten homología significativa con proteínas en las bases de datos disponibles. Los ORFs con función asignada también están listados en la figura. La información de la figura también se incluye en forma de tabla en la FIG. 5.
FIGS. 5A-ARU: Características del genoma del bacteriófago Fl 70/08, incluyendo productos génicos y asignación de funciones putativas. La figura incluye una lista de los ORFs del genoma y proporciona para cada ORF (i) su posición dentro del genoma, (ii) la secuencia de aminoácidos codificada, (iii) una lista de proteínas homólogas y dominios conservados dentro de su polipéptido codificado y (iv) una asignación de función putativa. Los ORFs 1 213 listados en la FIG. 5 codifican las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:131-343, respectivamente.
FIGS. 6A-B: El rango de hospedadores de Fl 70/08 determinado por la prueba de mancha en 105 cepas deEnterococcus faecalis(EFS) (6a ) y 56 cepas deEnterococcus faecium(EFM) (6B) aisladas de muestras clínicas. Cada mancha contenía 5 pl de suspensión de bacteriófago con los títulos indicados (preparados a partir de lisado purificado con CsCl). La sensibilidad de cada cepa al fago se evaluó basándose en una escala relativa que va desde halos de lisis turbios (+) a halos de lisis claros (++++). La resistencia a la infección por fagos se indica como
FIG. 7: Esquema de la organización del genoma F770/05, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:3. Los ORFs predichos en el genoma están representados por flechas y numerados en negro. La dirección de una flecha indica la dirección de la transcripción. Codificación por colores: Negro - ORFs para los cuales se pudo hacer una asignación funcional de productos basada en las funciones conocidas de proteínas homólogas (los ORFs que codifican productos que exhiben homología con las mismas proteínas o proteínas similares se indican usando el mismo número y se diferencian por una letra minúscula); Gris - ORFs que codifican productos que son similares a proteínas de función desconocida; Blanco o Vacío - ORFs que codifican proteínas que no comparten homología significativa con proteínas en bases de datos disponibles. Los ORFs con asignación funcional también están listados en la figura. La información de la figura también está incluida en forma tabular en la FIG. 8.
FIGS. 8A-ACE: Características del genoma del bacteriófago F770/05, incluyendo productos génicos y asignación de funciones putativas. La figura incluye un listado de los ORFs del genoma y proporciona para cada ORF (i) su posición dentro del genoma, (ii) la secuencia de aminoácidos codificada, (iii) un listado de proteínas homólogas y dominios conservados dentro de su polipéptido codificado y (iv) una asignación de función putativa. Los ORFs 1 95 listados en la FIG. 8 codifican las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:344-438, respectivamente.
FIG. 9: El rango de hospedadores de F770/05 determinado por la prueba de mancha en 100 cepas dePseudomonas aeruginosa(PSA) aisladas de muestras clínicas. Cada mancha contenía 5 pl de suspensión de bacteriófago con títulos indicados (preparados a partir de lisado purificado con CsCl). La sensibilidad de cada cepa al fago se evaluó en función de una escala relativa que varía desde turbio(+) hasta claro(++++) halos de lisis. La resistencia a la infección por fago se indica como (-).
FIG. 10: Esquema de la organización del genoma Fl97/08, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:4. Los ORFs predichos en el genoma están representados por flechas y numerados en negro. La dirección de una flecha indica la dirección de la transcripción. Codificación por colores: Negro - ORFs para los cuales se pudo asignar una función a los productos basada en las funciones conocidas de proteínas homólogas (los ORFs que codifican productos que exhiben homología con las mismas o similares proteínas se indican con el mismo número y se diferencian por letra minúscula); Gris - ORFs que codifican productos que son similares a proteínas de función desconocida; Blanco o Vacío - ORFs que codifican proteínas que no comparten homología significativa con proteínas en las bases de datos disponibles. Los ORFs con funciones asignadas también se enumeran en la figura. La información en la figura también está incluida en forma tabular en la FIG. 11.
FIGS. 11A-AA: Características del genoma del bacteriófago Fl97/08, incluyendo productos genicos y asignación de funciones putativas. La figura incluye un listado de los ORFs del genoma y proporciona para cada ORF (i) su posición dentro del genoma, (ii) la secuencia de aminoácidos codificada, (iii) un listado de proteínas homólogas y dominios conservados dentro de su polipéptido codificado y (iv) una asignación de función putativa. Los ORFs 1 66 listados en la FIG. 11 codifican las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:439-553, respectivamente.
FIG. 12: El rango de hospedadores de F197/08 determinado mediante la prueba de mancha en 100 cepas de Staphylococcus aureus (STA) aisladas de muestras clínicas. Cada mancha contenía 5 pl de suspensión de bacteriófago con los títulos indicados (preparados a partir de lisado purificado con CsCI). La sensibilidad de cada cepa al bacteriófago se evaluó en base a una escala relativa que va desde halos de lisis turbios(+) hasta claros(++++). La resistencia a la infección por bacteriófago se indica como (-).
FIG. 13: Esquema de la organización del genoma de F86/06, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:5. Los ORFs predichos en el genoma están representados por flechas y numerados en negro. La dirección de una flecha indica la dirección de la transcripción. Codificación por colores: Negro - ORFs para los cuales se pudo hacer una asignación funcional de productos basada en las funciones conocidas de proteínas homólogas (ORFs que codifican productos que exhiben homología con proteínas iguales o similares están indicados con el mismo número y diferenciados por una letra minúscula); Gris - ORFs que codifican productos que son similares a proteínas de función desconocida; Blanco o Vacío - ORFs que codifican proteínas que no comparten homología significativa con proteínas en bases de datos disponibles. Los ORFs asignados funcionalmente también se enumeran en la figura. La información de la figura también está incluida en forma de tabla en la FIG. 14.
FIGS. 14A-SU: Características del genoma del bacteriófago F86/06, incluidos los productos génicos y la asignación de funciones putativas. La figura incluye un listado de los ORFs del genoma y proporciona para cada ORF (i) su posición dentro del genoma, (ii) la secuencia de aminoácidos codificada, (iii) un listado de proteínas homólogas y dominios conservados dentro de su polipéptido codificado y (iv) una asignación de función putativa. Los ORFs 1 63 enumerados en la FIG. 14 codifican las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:554-616, respectivamente.
FIG. 15: El rango de huéspedes de F86/06 determinado por la prueba de punto en 100 cepas deStaphylococcus aureus(STA) aisladas de muestras clínicas. Cada punto contenía 5 pl de suspensión de bacteriófago con los títulos indicados (preparados a partir de lisado purificado con CsCl). La sensibilidad de cada cepa al fago se evaluó en función de una escala relativa que varía desde halos de lisis turbios (+) hasta claros (++++). La resistencia a la infección por fagos se indica como (-).
FIG. 16: Esquema de la organización del genoma de F87s/06, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 6. Los ORFs predichos en el genoma están representados por flechas y numerados en negro. La dirección de una flecha indica la dirección de la transcripción. Código de colores: Negro: ORFs para los cuales se pudo hacer una asignación funcional en función de las funciones conocidas de proteínas homólogas (los ORFs que codifican productos que muestran homología con proteínas iguales o similares se indican con el mismo número y se diferencian con letras minúsculas); Gris: ORFs que codifican productos similares a proteínas de función desconocida; Blanco o Vacío: ORFs que codifican proteínas que no comparten una homología significativa con proteínas en las bases de datos disponibles. Los ORFs con asignación funcional también se enumeran en la figura. La información en la figura también se incluye en forma tabular en FIG. 17.
FIGS. 17A-UV: Características del genoma del bacteriófago F87s/06, incluyendo los productos génicos y la asignación de funciones putativas. La figura incluye una lista de los ORFs del genoma y proporciona para cada ORF (i) su posición dentro del genoma, (ii) la secuencia de aminoácidos codificada, (iii) una lista de proteínas homólogas y dominios conservados dentro de su polipéptido codificado y (iv) una asignación de función putativa. Los ORFs 1-61 enumerados en la FIG. 17 codifican las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 617-681, respectivamente.
FIG. 18: El rango de hospedador de F87s/06 determinado mediante la prueba de puntos en 100 cepas deStaphylococcus aureus(STA) aisladas de muestras clínicas. Cada punto contenía 5 pl de suspensión de bacteriófagos con los títulos indicados (preparados a partir de lisado purificado con CsCl). La sensibilidad de cada cepa al fago se evaluó en una escala relativa que iba desde turbia (+) hasta halos de lisis claros (++++) en la escala. La resistencia a la infección por fagos se indica como (-).
FIG. 19: Esquema de la organización del genoma de F9la/06, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7. Las ORFs predichas en el genoma están representadas por flechas y numeradas en negro. La dirección de una flecha indica la dirección de la transcripción. Código de colores: Negro - ORFs para los cuales se pudo hacer una asignación funcional en función de las funciones conocidas de proteínas homólogas (las ORFs que codifican productos que muestran homología con proteínas del mismo tipo o similares se indican con el mismo número y se diferencian con letras minúsculas); Gris - ORFs que codifican productos similares a proteínas de función desconocida; Blanco o Vacío - ORFs que codifican proteínas que no comparten homología significativa con proteínas en las bases de datos disponibles. Las ORFs con asignación funcional también se enumeran en la figura. La información de la figura también se incluye en forma de tabla en la FIG. 20.
FIGS. 20A-U: Características del genoma del bacteriófago F9la/06, incluyendo los productos génicos y la asignación de funciones putativas. La figura incluye una lista de las ORFs del genoma y proporciona para cada ORF (i) su posición dentro del genoma, (ii) la secuencia de aminoácidos codificada, (iii) una lista de proteínas homologas y dominios conservados dentro de su polipéptido codificado y (iv) una asignación de función putativa. Las ORFs 1-64 enumeradas en la FIG. 20 codifican las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 682-754, respectivamente.
FIG. 21: El rango de hospedaje de F9la/06 determinado mediante la prueba de puntos en 100 cepas deStaphylococcus aureus(STA) aisladas de muestras clínicas. Cada punto contenía 5 pl de suspensión de bacteriófago con los títulos indicados (preparados a partir de lisados purificados con CsCl). La sensibilidad de cada cepa al fago se evaluó en una escala relativa que iba desde turbio (+) hasta halos de lisis claros (++++). La resistencia a la infección por el fago se indica como (-).
FIG. 22: Organización esquemática del genoma Fl245/05, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:760. Las ORFs predichas en el genoma de 43 kb están representadas por flechas numeradas en negro. Para las ORF funcionalmente asignadas, el número se sustituye por la función predicha. La dirección de una flecha indica la dirección de la transcripción. Código de color: Negro - ORFs cuyos productos se les pudo asignar una función funcional basada en proteínas homólogas; Gris - ORFs que codifican productos similares a proteínas de función desconocida; Rayado - ORFs con una función asignada en función de su posición relativa en el genoma y de la presencia de dominios transmembranales putativos en el producto codificado; Flechas vacías - ORFs que codifican proteínas que no comparten una homología significativa con proteínas en bases de datos.
FIGS. 23A-IO: Se proporcionan características del genoma del bacteriófago Fl245/05, incluidos los productos génicos y la asignación de funciones putativas.
FIGS. 24A-E: Se proporciona el rango de hospedadores de Fl245/05 según lo determinado por la prueba de puntos en 100 cepas deAcinetobacter baumanniiaisladas de muestras clínicas. Cada punto contenía suspensiones de bacteriófagos de 5 pl con los títulos indicados (preparadas a partir de lisados purificados con CsCl). La sensibilidad al fago se presenta en una escala que va desde turbio (+) hasta halos de lisis claros (++++). La resistencia a la infección por fagos se indica como (-).
6. DESCRIPCIÓN PORMENORIZADA
La presente invención se dirige a bacteriófagos aislados que tienen actividad antibacteriana contra una o más especies o cepas de las bacterias patógenas nosocomialesA. baumannii.Se describe aquí, sin formar parte de la invención, bacteriófagos o polipéptidos aislados que muestran actividad antimicrobiana y/o antibacteriana contra cepas resistentes a la meticilina de S.aureus(MRSA). Además, los bacteriófagos y polipéptidos descritos aquí pueden mostrar actividad antibacteriana o antimicrobiana contra una o más especies o cepas de bacterias patógenas, incluyendo, pero no limitándose a, S.epidermidis, S. auricularis, S. capitis, S. haemolyticus, S. hominis, S. saprophyticus, S. simulans, S. xylosis, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, B. pumilus, E. hiraeyE. avium.
Se describe aquí, sin formar parte de la invención, un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:1. Un ejemplo específico en este sentido es el bacteriófago aislado Fl68/08, que ataca a varias cepas deE. faecalisyE. faecium.Los marcos de lectura abiertos (ORF) en el genoma Fl68/08, las secuencias de aminoácidos codificadas por los ORF y la asignación de funciones putativas de las secuencias de aminoácidos codificadas(i.e.,proteínas y/o polipéptidos codificados) se proporcionan en la FIG. 2 (que también proporciona las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOS: 8-130).
LosEnterococcison bacterias esféricas grampositivas que forman colonias en grupos o cadenas. Se encuentran como parte de la flora del tracto digestivo en muchos mamíferos, incluyendo los humanos. Las infecciones porEnterococcusrepresentan el 12% de todas las infecciones nosocomiales. Una infección porEnterococcuspuede causar infecciones abdominales complicadas, infecciones de la piel y estructuras cutáneas, infecciones del tracto urinario e infecciones del torrente sanguíneo, las cuales pueden ser difíciles de tratar, especialmente en casos en los que la cepa involucrada ha desarrollado resistencia a varios antibióticos. En tales casos, la infección puede poner en peligro la vida, especialmente cuando el paciente ya es inmunodeficiente.
Enterococcus faecalises responsable de la mayoría de las infecciones porEnterococciy es una bacteria comensal Grampositiva que habita en el tracto gastrointestinal de los seres humanos y otros mamíferos. Es no mótil y facultativamente anaeróbico.E. faecalispuede causar endocarditis, así como infecciones de la vejiga, próstata y epidídimo, incluyendo infecciones potencialmente mortales en los seres humanos, especialmente en el entorno nosocomial.E. faecalises resistente a muchos agentes antimicrobianos comúnmente utilizados, (como,e.g.,los aminoglucósidos, aztreonam, cefalosporinas, clindamicina, las penicilinas semisintéticas nafcilina y oxacilina, trimetoprim-sulfametoxazol, y similares).
Enterococcus faeciumes conocido por su resistencia a varios tipos de antibióticos, incluyendo quinolonas y aminoglucósidos. También se conocen cepas deE. faeciumresistentes a la vancomicina. La resistencia a varios antibióticos y la tolerancia a condiciones adversas hacen deE. faeciumuna gran preocupación para la comunidad médica, que ha apodado a este microbio como un "supergermen". También se describe un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:2, sin formar parte de la invención. Un ejemplo específico de acuerdo con esta forma de realización es el bacteriófago aislado Fl 70/08, que ataca a varias cepas deE. faecalisyE. faecium.Los marcos de lectura abierta (ORFs) en el genoma de Fl 78/08, las secuencias de aminoácidos codificadas por los ORFs y la asignación de las posibles funciones de las secuencias de aminoácidos codificadas(i.e.,proteínas y/o polipéptidos codificados) se proporcionan en la FIG. 5 (también se proporcionan las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOS: 131-343).
Se describe aquí, sin formar parte de la invención, un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:3. Un ejemplo específico de acuerdo con esta forma de realización es el bacteriófago aislado F770/05, que ataca a varias cepas deP. aeruginosa.Los marcos de lectura abierta (ORFs) en el genoma de F770/05, las secuencias de aminoácidos codificadas por los ORFs y la asignación de las posibles funciones de las secuencias de aminoácidos codificadas(i.e.,proteínas y/o polipéptidos codificados) se proporcionan en la FIG. 8 (también se proporcionan las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOS: 344-438).
Pseudomonas aeruginosaes una bacteria común en forma de bastón Gram negativo que se encuentra en el suelo, el agua, la flora cutánea y la mayoría de los entornos fabricados por el ser humano. Prospera no solo en atmósferas normales, sino también con poco oxígeno como anaerobio facultativo y puede infectar tejidos dañados o individuos inmunocomprometidos. Cuando estas colonizaciones ocurren en órganos críticos del cuerpo como los pulmones, el tracto urinario y los riñones, los resultados pueden ser fatales. Debido a que prospera en superficies, esta bacteria también se encuentra en el equipo médico, incluyendo catéteres, lo que provoca infecciones cruzadas en hospitales y clínicas.P. aeruginosaes uno de los patógenos nosocomiales oportunista más relevantes y se estima que una de cada diez infecciones adquiridas en el hospital proviene de Pseudomonas. P. aeruginosa también es la causa más común de infecciones por quemaduras y el colonizador más frecuente de dispositivos médicos, como catéteres.
También se describe en este documento, sin formar parte de la invención, un bacteriófago cuyo genoma comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4. Un ejemplo específico en este sentido es el bacteriófago aislado Fl97/08, que ataca a varias cepas de S.aureus.En la FIG. 11 se proporcionan los marcos de lectura abierta (ORFs) en el genoma de Fl97/08, las secuencias de aminoácidos codificadas por los ORFs y la asignación de funciones presuntas de las secuencias de aminoácidos codificadas(i.e.,proteínas y/o polipéptidos codificados), proporcionando también las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOS: 439-553).
También se describe en este documento, sin formar parte de la invención, un bacteriófago cuyo genoma comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5. Un ejemplo específico en este sentido es el bacteriófago aislado F86/06, que ataca a varias cepas de S.aureus.En la FIG. 14 se proporcionan los marcos de lectura abierta (ORFs) en el genoma de F86/06, las secuencias de aminoácidos codificadas por los ORFs y la asignación de funciones presuntas de las secuencias de aminoácidos codificadas(i.e.,proteínas y/o polipéptidos codificados), proporcionando también las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOS: 554-616).
También se describe en este documento, sin formar parte de la invención, un bacteriófago cuyo genoma comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 6. Un ejemplo específico en este sentido es el bacteriófago aislado F87s/06, que ataca a varias cepas de S.aureus.En la FIG. 17 se proporcionan los marcos de lectura abierta (ORFs) en el genoma de F87s/06, las secuencias de aminoácidos codificadas por los ORFs y la asignación de funciones presuntas de las secuencias de aminoácidos codificadas(i.e.,proteínas y/o polipéptidos codificados), (proporcionando también las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOS: 617-681).
También se describe en este documento, sin formar parte de la invención, un bacteriófago cuyo genoma comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7. Un ejemplo específico en este sentido es el bacteriófago aislado F9la/06, que ataca a varias cepas de S.aureus.En la FIG. 20 se proporcionan los marcos de lectura abierta (ORFs) en el genoma de F9la/06, las secuencias de aminoácidos codificadas por los ORFs y la asignación de funciones presuntas de las secuencias de aminoácidos codificadas(i.e.,proteínas y/o polipéptidos codificados), (proporcionando también las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOS:682-754).
S.aureuses una bacteria esférica, facultativamente anaerobia, grampositiva, a menudo parte de la flora cutánea que se encuentra en la nariz y la piel. S.aureuspuede causar una variedad de enfermedades, desde infecciones cutáneas menores, como espinillas, hasta gastroenteritis, enfermedades potencialmente mortales como la neumonía, la meningitis, la osteomielitis, la endocarditis, el síndrome de shock tóxico (TSS), la bacteriemia y la sepsis. Es una de las cinco causas más comunes de infecciones nosocomiales y a menudo la causa de infecciones de heridas postoperatorias. Hoy en día, S.aureusse ha vuelto resistente a muchos antibióticos comúnmente utilizados, y se estima que solo el 2% de todos los aislamientos deS. aureusson sensibles a la penicilina. Se desarrollaron penicilinas de segunda generación, como la meticilina, la oxacilina, la cloxacilina y la flucloxacilina, para tratar S.aureusresistente a la penicilina. La meticilina fue el primer antibiótico de esta clase en utilizarse, pero solo dos años después se informó del primer caso de S.aureusresistente a la meticilina (MRSA). Desde la década de 1990, ha habido un aumento explosivo en la prevalencia de MRSA en los hospitales, donde ahora se considera endémica.
En una forma de realización, la invención proporciona un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:760. Un ejemplo específico de acuerdo con esta forma de realización es el bacteriófago aislado Fl245/05, que se dirige a una serie de cepas deA. baumannii.En la FIG.
23 se proporcionan los marcos de lectura abiertos (ORFs) en el genoma de Fl245/05, las secuencias de aminoácidos codificadas por los ORFs y la asignación de funciones putativas de las secuencias de aminoácidos codificadas(i.e.,proteínas y/o polipéptidos codificados), (también se proporcionan las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOS:761-816).
Acinetobacter baumanniies una especie de bacteria que causa una serie de infecciones clínicas graves, especialmente en personas con sistemas inmunológicos comprometidos.Acinetobacter baumanniies un bacilo pleomórfico gramnegativo aerobio que se encuentra comúnmente en el entorno hospitalario y en pacientes hospitalizados. La bacteria a menudo ingresa al cuerpo a través de heridas abiertas, catéteres o tubos de respiración.Acinetobacter baumanniisuele colonizar ambientes acuáticos y a menudo se cultiva a partir de esputo o secreciones respiratorias de pacientes hospitalizados, heridas y orina. En un entorno hospitalario,Acinetobacter baumanniisuele colonizar soluciones de irrigación y soluciones intravenosas. También se sabe que es resistente a múltiples antibióticos y el número de infecciones nosocomiales causadas porA. baumanniiha aumentado en los últimos años.
En ciertas formas de realizaciones, el bacteriófago de la invención comprende o consiste en un genoma con una identidad de secuencia de al menos el 99% con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 760, que presenta al menos una actividad biológica,e.g.,actividad antimicrobiana o antibacteriana(e.g.,actividad de lisis), de uno o más de los bacteriófagos Fl245/05. Alternativamente o además, también se describe en la presente solicitud de patente, aunque no forma parte de la invención, que el bacteriófago puede tener un genoma que comprenda un fragmento funcional de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID nO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 760, incluyendo las secuencias de cualquiera de los marcos de lectura abierta descritos en las FIGS. 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20 y 23.
La presente solicitud de patente también proporciona bacterias aisladas infectadas con uno o más de los bacteriófagos de la invención. La presente solicitud de patente describe (aunque no forma parte de la invención)E. faecalisoE. faeciumaislados infectados con un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2. La presente solicitud de patente describe (sin formar parte de la invención)P. aeruginosaaislada infectada con un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3. La presente solicitud de patente describe (aunque no forma parte de la invención) S.aureusaislada infectada con un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y/o SEQ ID NO: 7. En una realización, la invención proporcionaA. baumanniiaislada infectada con un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 760.
La presente solicitud de patente proporciona métodos de producción y aislamiento de un bacteriófago cuyo genoma comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ iD NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:760. También se describe aquí (sin formar parte de la invención) un método para producir y/o aislar un bacteriófago cuyo genoma comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:l o SEQ ID NO:2 que comprende (i) obtener un cultivo deE. faecalisoE. faecium,(ii) infectarlo con el bacteriófago cuyo genoma comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2; (iii) cultivar hasta que se observe una lisis significativa del cultivo y (iv) aislar el bacteriófago del cultivo. Se describe también aquí (sin formar parte de la invención) un método para producir y/o aislar un bacteriófago cuyo genoma comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:3 que comprende (i) obtener un cultivo deP. aeruginosa,(ii) infectarlo con el bacteriófago cuyo genoma comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:3; (iii) cultivar hasta que se observe una lisis significativa del cultivo y (iv) aislar el bacteriófago del cultivo. La presente solicitud de patente describe, sin formar parte de la invención, un método para producir y/o aislar un bacteriófago cuyo genoma comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 o SEQ ID nO:7 que comprende (i) obtener un cultivo de S.aureus,(ii) infectarlo con el bacteriófago cuyo genoma comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7; (iii) cultivar hasta que se observe una lisis significativa del cultivo y (iv) aislar el bacteriófago del cultivo. En una forma de realización, la invención proporciona un método para producir y/o aislar un bacteriófago cuyo genoma comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:760 que comprende (i) obtener un cultivo deA. baumannii,(ii) infectarlo con el bacteriófago cuyo genoma comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:760; (iii) cultivar hasta que se observe una lisis significativa del cultivo y (iv) aislar el bacteriófago del cultivo.
Los bacteriófagos pueden ser aislados de una muestra bacteriana utilizando cualquier método descrito aquí o conocido en la tecnica (véase,e.g.,Carlson, "Trabajo con bacteriófagos: técnicas comunes y enfoques metodológicos,"In,Kutter y Sulakvelidze (Eds) Bacteriófagos: Biología y Aplicaciones, 5a ed. CRC Press (2005)).
La presente solicitud de patente describe, sin formar parte de la invención, polipéptidos aislados de los bacteriófagos de la invención. Los polipéptidos aislados pueden ser proteínas de bacteriófagos completas o pueden ser fragmentos, variantes o derivados de las proteínas de bacteriófagos, siempre que el fragmento, variante o derivado muestre al menos una actividad biológica asociada con el bacteriófago o el polipéptido del que se deriva. En ciertas formas de realizaciones, los polipéptidos de la invención se aíslan de los bacteriófagos Fl245/05 (que típicamente infectanA. baumannii),Fl68/08 o Fl 70/08 (que típicamente infectanE. faecalisy/oE. faecium),bacteriófago F770/05 (que típicamente infectaP. aeruginosa)o bacteriófago Fl 97/08, F86/06, F87s/06 o F9la/06 (que típicamente infectan S.aureus).
El polipéptido descrito aquí (sin formar parte de la invención) es un endolisina o lisina aislado de un bacteriófago cuyo genoma comprende o consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 760(e.g.,el bacteriófago Fl68/08, Fl 70/08, Fl97/08, F86/06, F87s/06, F9la/06 o Fl245/05, respectivamente). El polipéptido descrito aquí (sin formar parte de la invención) es un endolisina o lisina con la secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en Se Q ID NO:797, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:447, SEQ ID NO:448, SEQ ID NO:575, SEQ ID NO:641 o SEQ ID NO:712. El polipéptido aislado descrito aquí (sin formar parte de la invención) es un fragmento, variante o derivado de un endolisina o lisina aislado de un bacteriófago de la invención, el cual fragmento, variante o derivado muestra al menos una actividad biológica, preferiblemente actividad antibacteriana(e.g.,actividad de lisis), del endolisina, lisina o bacteriófago del que se aísla o deriva. En consecuencia, se describen aquí, sin formar parte de la invención, polipéptidos aislados que son fragmentos, variantes o derivados de endolisinas o lisinas aislados de bacteriófagos de la invención, los cuales fragmentos, variantes o derivados exhiben actividad antibacteriana o antimicrobiana(e.g.,actividad de lisis) contra uno o más deA. baumannii, E. faecalis, E. faeciumo S.aureus.Los polipéptidos aislados que son fragmentos, variantes o derivados de endolisinas o lisinas aislados de bacteriófagos de la invención que exhiben actividad antibacteriana o antimicrobiana(e.g.,actividad de lisis) contra una o más especies de bacterias distintas aA. baumannii, E. faecalis, E. faeciumo S.aureus (e.g., P. aeruginosa). La presente solicitud de patente describe, sin formar parte de la invención, un polipéptido que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:202 o SEQ ID NO:203, o un fragmento, variante o derivado de dicho polipéptido, el cual polipéptido muestra actividad antibacteriana o antimicrobiana contraE. faecalisoE. faecium. También se describe (sin formar parte de la invención) un polipéptido que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:447, SEQ ID NO:448, SEQ ID NO:575, SEQ ID NO:641 o SEQ ID NO:712, o un fragmento, variante o derivado de dicho polipéptido, el cual polipéptido muestra actividad antibacteriana o antimicrobiana contra S.aureus.El polipéptido comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:797, o un fragmento, variante o derivado de dicho polipéptido, el cual polipéptido muestra actividad antibacteriana o antimicrobiana contraA. baumannii.
La presente solicitud de patente describe (aunque no forma parte de la invención) un polipéptido que comprende o consiste en un dominio CHAP aislado de un endolisina o lisina de los bacteriófagos Fl68/08, Fl 70/08, F770/05, Fl97/08, F86/06, F87s/06 o F9la/06. Se ha demostrado que los dominios CHAP aislados retienen la actividad antibacteriana,e.g.,la actividad de lisis, de la endolisina o lisina de la que se derivan; los dominios CHAP pueden identificarse y aislarse mediante métodos rutinarios en la tecnica (véase,e.g.,Rigden et al., 2003,Trends Biochem. Sci.28:230-234; Bateman et al., 2003,Trends Biochem. Sci.28:234-237). La presente solicitud de patente también describe (aunque no forma parte de la invención) un polipéptido que comprende o consiste en un dominio CHAP aislado de un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:447, SEQ ID NO:448, SEQ ID NO:575, SEQ ID NO:641 o SEQ ID NO:712. También se describe aquí (sin formar parte de la invención) un polipéptido aislado que comprende o consiste en el dominio CHAP derivado de un segundo polipéptido con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:575, SEQ ID NO:641 o SEQ ID NO:712, en el que el dominio CHAP tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:755, SEQ ID NO:756, SEQ ID NO:757, SEQ ID NO:758 o SEQ ID NO:759, respectivamente. Es decir, SEQ ID NO:755 corresponde a un dominio CHAP derivado del polipéptido con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68; SEQ ID NO:756 corresponde a un dominio CHAP derivado del polipéptido con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:446, y así sucesivamente. En otras formas de realizaciones, la invención proporciona un fragmento, variante o derivado de un dominio CHAP aislado de un endolisina o lisina de los bacteriófagos Fl68/08, Fl 70/08, F770/05, Fl97/08, F86/06, F87s/06 o F9la/06, que fragmento, variante o derivado muestra al menos una actividad biológica,e.g.,la lisis celular, del dominio CHAP del que se deriva y en el que dicho dominio CHAP tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:755, SEQ ID NO:756, SEQ ID NO:757, SEQ ID NO:758 o SEQ ID NO:759. Las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:755 a SEQ ID NO:759 se proporcionan en la Tabla 1
Tabla 1: Secuencias de aminoácidos de dominios CHAP aislados de bacteriófagos de la presente invención
Se describe aquí (sin formar parte de la invención) un polipéptido que comprende o consiste en una proteína de medida de cinta de cola o una proteína de cola(e.g.,componente de cola, proteína de fibra de cola, proteína de cola asociada a la adsorción), o un su fragmento, aislado de un bacteriófago cuyo genoma comprende o consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:760(e.g.,el bacteriófago Fl68/08, Fl 70/08, F770/05, Fl97/08, F86/06, F87s/06, F9la/06 o Fl245/05, respectivamente), en el cual la proteína de medida de cinta de cola o la proteína de cola, o su fragmento, tiene una función biológica asociada con el bacteriófago del que se deriva,e.g.,actividad antimicrobiana o antibacteriana(e.g.,actividad de lisis). En formas de realizaciones específicas, la actividad antimicrobiana o antibacteriana de la proteína de medida de cinta de cola o de la proteína de cola se dirige contra al menos una o más especies o cepas deA. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosay/o S.aureus.Se describe aquí (sin formar parte de la invención) una proteína de medida de cinta de cola o proteína de cola que tiene la secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:435, SEQ ID NO:438, SEQ ID NO:440, SEQ ID NO:525, SEQ ID NO:526, SEQ ID NO:527, SEQ ID NO:528, SEQ ID NO:529, SEQ ID NO:530, SEQ ID NO:531, SEQ ID NO:532, SEQ ID NO:533, SEQ ID NO:534, SEQ ID NO:535, SEQ ID NO:536, SEQ ID NO:537, SEQ ID NO:538, SEQ ID NO:539, SEQ ID NO:567, SEQ ID NO:568, SEQ ID NO:632, SEQ ID NO:633, SEQ ID NO:700, SEQ ID NO:701, SEQ ID NO:702, SEQ ID NO:703, SEQ ID NO:704 o SEQ ID NO:795. El polipéptido aislado es un fragmento, variante o derivado de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:435, SEQ ID NO:438, SEQ ID NO:440, SEQ ID NO:525, SEQ ID NO:526, SEQ ID NO:527, SEQ ID NO:528, SEQ ID NO:529, SEQ ID NO:530, SEQ ID NO:531, SEQ ID NO:532, SEQ ID NO:533, SEQ ID NO:534, SEQ ID NO:535, SEQ ID NO:536, SEQ ID NO:537, SEQ ID NO:538, SEQ ID NO:539, SEQ ID NO:567, SEQ ID NO:568, SEQ ID NO:632, SEQ ID NO:633, SEQ ID NO:700, SEQ ID NO:701, SEQ ID NO:702, SEQ ID NO:703, SEQ ID NO:704 o SEQ ID NO:795, el cual fragmento, variante o derivado muestra al menos una actividad biológica o función del bacteriófago del que se aísla o deriva, por ejemplo, actividad antimicrobiana o antibacteriana(e.g.,actividad de lisis). En formas de realizaciones preferidas, al menos una actividad biológica o función del fragmento, variante o derivado se dirige contra una o más cepas deE. faecalis,E. faecium,P. aeruginosa,S. aureusy/oA. baumannii.
Se describe aquí (sin formar parte de la invención) que el polipéptido aislado de la presente solicitud de patente es una variante de un polipéptido de bacteriófago, la cual variante comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad de secuencia con una segunda secuencia de aminoácidos de la misma longitud(i.e.,que consiste en el mismo número de residuos), la cual segunda secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:435, SEQ ID NO:438, SEQ ID NO:440, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:447, SEQ ID NO:448, SEQ ID NO:525, SEQ ID NO:526, SEQ ID NO:527, SEQ ID NO:528, SEQ ID NO:529, SEQ ID NO:530, SEQ ID NO:531, SEQ ID NO:532, SEQ ID NO:533, SEQ ID NO:534, SEQ ID NO:535, SEQ ID NO:536, SEQ ID NO:537, SEQ ID NO:538, SEQ ID NO:539, SEQ ID NO:567, SEQ ID NO:568, SEQ ID NO:575, SEQ ID NO:632, SEQ ID NO:633, SEQ ID NO:641, SEQ ID NO:700, SEQ ID NO:701, SEQ ID NO:702, SEQ ID NO:703, SEQ ID NO:704, SEQ ID NO:712, SEQ ID NO:755, SEQ ID NO:756, SEQ ID NO:757, SEQ ID NO:758, SEQ ID NO:759, SEQ ID NO:795 o SEQ ID NO:797, y/o un su fragmento, y en la cual la variante exhibe al menos una función o actividad biológica del bacteriófago del que se deriva(e.g.,actividad antimicrobiana o antibacteriana(e.g.,actividad de lisis)) contra una o más cepas de bacterias(e.g.,bacterias Gram-positivas(e.g., E. faecalis, E. faecium, S. aureus),bacterias Gram-negativas(e.g., P. aeruginosa, A. baumannii)o bacterias no clasificadas como Gram-positivas o Gram-negativas).
Se describe aquí (sin formar parte de la invención) un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOS:2-124, SEQ ID NOS: 126-338, SEQ ID NOS:340-434, SEQ ID NOS:436-550, SEQ ID NOS:552-614, SEQ ID NOS:616-680, SEQ ID NOS:682-759, SEQ ID NOS:761-816, y sus fragmentos biológicamente activos. También se describe aquí, sin formar parte de la invención, un polipéptido variante que exhibe al menos una actividad biológica asociada con el polipéptido o el bacteriófago del que se aisló o derivó, dirigida contra al menos una o más cepas deE. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureusy/oA. baumannii.
Se describe aquí, sin formar parte de la invención, una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica la secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NOS:8-130, SEQ ID NOS:131-343, SEQ ID NOS:344-438, SEQ ID NOS:439-553, SEQ ID NOS:554-616, SEQ ID NOS:617-681, SEQ ID NOS:682-759, SEQ ID NOS:761-816, y sus fragmentos activos. También se describe aquí (sin formar parte de la invención) que la secuencia de ácido nucleico corresponde a cualquiera de los marcos de lectura abierta identificados en las FIGS. 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20 y 23.
Se describe aquí (sin formar parte de la invención) que los polipéptidos de la presente invención son recombinantemente fusionados o conjugados químicamente (incluyendo tanto conjugaciones covalentes como no covalentes) a agentes terapéuticos, por ejemplo, polipéptidos heterólogos o pequeñas moléculas, para generar proteínas de fusión o polipéptidos quiméricos. La fusión no necesariamente debe ser directa, sino que puede ocurrir a través de secuencias de enlace o mediante conjugación química. Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos a los que los polipéptidos de la invención pueden estar conjugados son citotoxinas de péptidos o no péptidos (incluyendo antimicrobianos y/o antibióticos), moléculas trazadoras/marcadoras(e.g.,radionúclidos y fluoróforos) y otros compuestos antibióticos o antibacterianos conocidos en la tecnica.
6.1. COMPOSICIONES ANTIBIÓTICAS
Los bacteriófagos o polipéptidos aislados de la presente invención pueden administrarse solos o incorporarse en una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o la profilaxis de infecciones bacterianas, por ejemplo, infecciones causadas por bacterias que incluyen, pero no se limitan a,A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosay S.aureus.Los polipéptidos pueden combinarse con un vehículo, excipiente o estabilizador farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de vehículos, excipientes y estabilizadores farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, tampones como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes como ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular; proteínas, como albúmina sérica y gelatina; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; alcoholes de azúcar como manitol o sorbitol; contraiones formadoras de sales como el sodio; y/o surfactantes no iónicos como TWEEN™, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS™. La composición farmacéutica de la presente invención(e.g.,composición antibacteriana) también puede incluir un lubricante, un agente humectante, un edulcorante, un agente saborizante, un emulsionante, un agente suspensorio y un conservante, además de los ingredientes mencionados anteriormente.
Los bacteriófagos y/o polipéptidos de la presente invención también pueden combinarse con uno o más agentes terapéuticos y/o profilácticos útiles para el tratamiento de infecciones bacterianas como se describe aquí y/o conocidos en la tecnica(e.g.,uno o más lisinas). Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden, por lo tanto, comprender dos o más bacteriófagos aislados de la invención (con actividad antibacteriana contra la misma o diferentes especies o cepas bacterianas), la combinación de un bacteriófago y un polipéptido de la invención o la combinación de un bacteriófago y/o polipéptido de la invención y un bacteriófago y/o polipéptido terapéutico conocido en la tecnica. En ejemplos específicos, los componentes terapéuticos de una combinación pueden dirigirse a dos o más especies o cepas de bacterias o exhibir diferentes actividades enzimáticas. Por ejemplo, las lisinas, en general, exhiben una de las actividades amidasa, endopeptidasa, muramidasa o glucosamidasa. Por lo tanto, la combinación de lisinas que exhiben diferentes actividades puede proporcionar un aumento sinérgico en la actividad terapéutica de la composición farmacéutica de la invención.
Ejemplos de otros agentes terapéuticos que pueden utilizarse en combinación con el polipéptido de la invención incluyen, pero no se limitan a, agentes antibióticos estándar, agentes antiinflamatorios, agentes antivirales, agentes anestésicos locales y corticosteroides.
Los antibióticos estándar que pueden utilizarse con composiciones farmacéuticas que contienen polipéptidos de la invención incluyen, pero no se limitan a, amikacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, paromicina, rodostreptomicina, estreptomicina, tobramicina, apramicina, rifamicina, nafthomicina, mupirocina, geldanamicina, ansamitocina, carbacéfems, imipenem, meropenem, ertapenem, faropenem, doripenem, panipenem/betamiprona, biapenem, PZ-601, cefalosporinas, cefacetrio, cefadroxilo, cefalexina, cefaloglicina, cefalonio, cefaloridina, cefalotina, cefapirina, cefatrizina, cefazaflur, cefazedona, cefazolina, cefradina, cefroxadina, ceftezola, cefaclor, cefonicida, cefprozilo, cefuroxima, cefuzonam, cefmetazol, cefotetán, cefoxitina, cefcapeno, cefdaloxima, cefdinir, cefditoreno, cefetamet, cefixima, cefmenoxima, cefteram, ceftibuten, ceftiofur, ceftioleno, ceftizoxima, ceftriaxona, cefoperazona, ceftazidima, latamoxef, cefclidina, cefepima, cefluprenama, cefoselis, cefozopran, cefpiroma, cefquinoma, flomoxef, ceftobiprol, azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, roxitromicina, aztreonam, penicilina y derivados de penicilina, actinomicina, bacitracina, colistina, polimixina B, cinoxacina, flumequina, ácido nalidíxico, ácido oxolínico, ácido piromídico, ácido pipemídico, rosoxacina, ciprofloxacina, enoxacina, fleroxacina, lomefloxacina, nadifloxacina, norfloxacina, ofloxacina, pefloxacina, rufloxacina, balofloxacina, gatifloxacina, grepafloxacina, levofloxacina, moxifloxacina, pazufloxacina, sparfloxacina, temafloxacina, tosufloxacina, clinafloxacina, garenoxacina, gemifloxacina, stifloxacina, trovafloxacina, prulifloxacina, acetazolamida, benzolamida, bumetanida, celecoxib, clortalidona, clopamida, diclorfenamida, dorzolamida, etoxizolamida, furosemida, hidroclorotiazida, indapamida, mafendida, mefrusida, metolazona, probenecid, sulfacetamida, sulfadimetoxina, sulfadoxina, sulfanilamidas, sulfametoxazol, sulfasalazina, sultiama, sumatriptán, xipamida, tetraciclina, clortetraciclina, oxitetraciclina, doxiciclina, limeciclina, mecloclina, metaciclina, minociclina, rolitetraciclina y su cualquier combinación en cantidades que sean efectivas para potenciar aditiva o sinérgicamente el efecto terapéutico del bacteriófago o polipéptido de la invención para una infección específica.
Los anestésicos locales que pueden utilizarse en composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen tetracaína, clorhidrato de tetracaína, lidocaína, clorhidrato de lidocaína, dimetisoquina hidrocloruro, dibucaína, clorhidrato de dibucaína, butamben picrato y clorhidrato de pramoxina. Una concentración ejemplar de anestésico local es aproximadamente del 0.025% al 5% en peso del total de la composición.
Los corticosteroides que pueden ser útiles en combinación con los polipéptidos, fagos y/o composiciones farmacéuticas de la invención incluyen betametasona, dipropionato, fluocinolona, actinida, valerato de betametasona, actinida de triamcinolona, propionato de clobetasol, desoximetasona, diflorasona diacetato, amcinonida, flurandrenolida, valerato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona y desonida. Una concentración ejemplar de corticosteroide es aproximadamente del 0.01% al 1% en peso del total de la composición.
En ciertas formas de realizaciones, una formulación que comprende un bacteriófago y/o un polipéptido de la invención también contiene un tampón SM (0.05 M Tris-HCl (pH 7.4-7.5); 0.1 M NaCl; 10 mM MgSO4). En otras formas de realizaciones, la formulación contiene además un tampón SM y 10 mM de MgCl2. En otras formas de realizaciones aún, la formulación contiene además un tampón SM y aproximadamente un 20% o un 30% de etanol.
Las composiciones farmacéuticas que compreendem un bacteriófago y/o un polipéptido de la presente invención pueden formularse en una dosis unitaria o en una formulación de dosis múltiples. Las formulaciones adecuadas pueden seleccionarse del grupo que consiste en ungüentos, soluciones, suspensiones o emulsiones, extractos, polvos, gránulos, aerosoles, pastillas, tabletas o cápsulas y pueden incluir adicionalmente un agente dispersante o un agente estabilizante.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse por inhalación, en forma de supositorio o óvulo, tópicamente(e.g.,en forma de loción, solución, crema, ungüento o polvo para espolvorear), de forma epidérmica o transdérmicae.g.,mediante el uso de un parche cutáneo), por vía oral(e.g.,como una tableta, que puede contener excipientes como almidón o lactosa), en forma de cápsula, óvulo, elixires, soluciones o suspensiones (cada uno de ellos opcionalmente con saborizantes, colorantes y/o excipientes), o pueden administrarse parenteralmente(e.g.,intravenosamente, intramuscularmente o subcutáneamente). Para la administración parenteral, las composiciones pueden ser mejor utilizadas en forma de una solución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo, suficiente cantidad de sales o monosacáridos para hacer que la solución sea isotónica con la sangre. Para la administración bucal o sublingual, las composiciones pueden administrarse en forma de tabletas o pastillas que pueden formularse de manera convencional. En una forma de realización preferida, un bacteriófago y/o un polipéptido de la presente invención se administra tópicamente, ya sea como agente único o en combinación con otros tratamientos con antibióticos, según se describe en la presente memoria o según se conoce en la técnica.
Un bacteriófago y/o polipéptido de la presente invención también puede administrarse de manera dérmica o transdérmica. Para la aplicación tópica en la piel, los bacteriófagos y/o polipéptidos de la presente invención pueden combinarse con uno o una combinación de excipientes, que incluyen, entre otros, un líquido acuoso, un líquido a base de alcohol, un gel soluble en agua, una loción, una pomada, una base líquida no acuosa, una base de aceite mineral, una mezcla de aceite mineral y petrolato, lanolina, liposomas, excipientes proteicos como albúmina sérica o gelatina, celulosa en polvo, caramelo y sus combinaciones. Un modo tópico de administración puede incluir una aplicación mediante frotamiento, una pulverización, un parche de liberación controlada, una toallita absorbida en líquido y sus combinaciones. El bacteriófago y/o polipéptido de la invención puede aplicarse a un parche o vendaje directamente o en uno de los excipientes. Los parches pueden ser húmedos o secos, en los que el fago y/o polipéptido(e.g.,un lisina) está en forma liofilizada en el parche. Los excipientes de las composiciones tópicas pueden comprender vehículos semisólidos y de tipo gel que incluyen un espesante polimérico, agua, conservantes, tensioactivos activos, o emulsionantes, antioxidantes, protectores solares y un sistema de solventes o solventes mixtos. La Patente de EE. UU. N° 5,863,560 describe diversas combinaciones de excipientes que pueden ayudar a la exposición de la piel a un medicamento.
Para la administración intranasal o por inhalación, el bacteriófago y/o polipéptido de la invención se administra convenientemente en forma de inhalador de polvo seco o una presentación en aerosol desde un contenedor presurizado, bomba, pulverizador o nebulizador con el uso de un propulsor adecuado,e.g.,diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, un hidrofluoroalcano como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134A) o 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano (HFA 227EA), dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. El contenedor presurizado, la bomba, el pulverizador o el nebulizador pueden contener una solución o suspensión del compuesto activo,e.g.utilizando una mezcla de etanol y el propulsor como solvente, que puede contener además un lubricante,e.g.sorbitán trioleato. Cápsulas y cartuchos (hechos, por ejemplo, de gelatina) para su uso en un inhalador o insuflador pueden formularse para contener una mezcla en polvo del bacteriófago y/o polipéptido de la invención y una base en polvo adecuada como lactosa o almidón.
Para la administración en forma de supositorio o pessario, las composiciones terapéuticas pueden aplicarse tópicamente en forma de gel, hidrogel, loción, solución, crema, ungüento o polvo para espolvorear. Las composiciones de la invención también pueden administrarse por vía ocular. Para uso oftálmico, las composiciones de la invención pueden formularse como suspensiones micronizadas en solución salina isotónica estéril, ajustada a pH, o preferiblemente como soluciones en solución salina isotónica estéril ajustada a pH, opcionalmente en combinación con un conservante como el cloruro de benzalquonio. Alternativamente, pueden formularse en forma de ungüento, como vaselina.
Las dosis y concentraciones deseadas de las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variar dependiendo del uso particular. La determinación de la dosis adecuada o la vía de administración está bien dentro de la habilidad de un especialista común. Los experimentos con animales pueden proporcionar una guía confiable para la determinación de dosis efectivas en terapia humana. El escalado entre especies de dosis efectivas puede ser realizado por alguien con habilidad ordinaria en la tecnica siguiendo los principios descritos por Mordenti, J. y Chappell, W. "El uso del escalado entre especies en toxicocinética" en Toxicocinética y Desarrollo de Nuevos Medicamentos, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, Nueva York 1989, pp42-96.
6.2. USO TERAPÉUTICO
Los bacteriófagos y polipéptidos de la presente invención tienen actividad contra una pluralidad de cepas deE. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureusy/oA. baumannii,como se describe en las FIGS. 3A-B, 6A-B, 9, 12, 15, 18, 21 y 23. Por lo tanto, las composiciones de la presente invención pueden ser utilizadas en métodos para prevenir y tratar infecciones asociadas conE. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureusy/oA. baumanniien humanos y animales. En otras formas de realizaciones, las composiciones de la presente invención pueden ser utilizadas para tratar infecciones asociadas con especies o cepas relacionadas de estas bacterias, incluyendo, pero no limitado a, S.epidermidis, S. auricularis, S. capitis, S. haemolyticus, S. hominis, S. saprophyticus, S. simulans, S. xylosis, Micrococcus luteus, Bacilus subtilis, B. pumilus, E. hiraey/o una o más de las cepas deA. baumannii, e.g.,una o más de las cepas descritas en la FIG. 24.
En formas de realizaciones específicas, el sujeto que recibe una composición farmacéutica de la invención es un mamífero(e.g.,bovino, ovino, caprino, equino, primate(e.g.,humano), roedor, lagomorfo o ave(e.g.,pollo, pato, ganso)). En el contexto de la presente invención, "tratamiento" se refiere a tratamiento terapéutico y donde el objetivo es eliminar, reducir, disminuir la gravedad de, mejorar, ralentizar la progresión de o prevenir los síntomas o la causa subyacente(e.g.,infección bacteriana) asociados con la condición patológica o trastorno. "Tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, donde el objetivo es eliminar, reducir, disminuir la gravedad de, ralentizar la progresión de o retrasar o prevenir los síntomas o la causa subyacente (e . ginfección bacteriana) asociados con la condición patológica o trastorno. También se contempla que un bacteriófago y/o polipéptido de la invención actúa como una medida profiláctica o preventiva, previniendo el inicio de infección causada por una o más bacterias.
A.baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosay S.aureusson responsables de muchas infecciones oportunistas graves, especialmente en individuos con sistemas inmunológicos comprometidos. Se contempla que las composiciones farmacéuticas de la presente invención sean para tratar cualquier infección asociada conA. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosao S.aureus,o asociada con otras especies o cepas de bacterias, incluyendo, pero no limitado a, infecciones de la piel (incluyendo pero no limitado a úlceras de piel, llagas por presión y úlceras del pie diabético), infecciones en y alrededor de heridas, infecciones postoperatorias, infecciones asociadas con catéteres y drenajes quirúrgicos e infecciones de la sangre.
A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosay S.aureustambién están asociados con infecciones que involucran sistemas de órganos que tienen un alto contenido de líquido, y se contempla que los bacteriófagos y/o polipéptidos de la invención tengan un uso terapéutico en la prevención y tratamiento de estas infecciones. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser utilizadas para la prevención o tratamiento de infecciones del tracto respiratorio, del líquido cefalorraquídeo, del líquido peritoneal y del tracto urinario. Las composiciones de la invención también pueden ser utilizadas para prevenir y/o tratar la neumonía nosocomial, infecciones asociadas con diálisis peritoneal ambulatoria continua (CAPD), bacteriuria asociada a catéter, y meningitis nosocomial.
En una forma de realización preferida, un bacteriófago y/o polipéptido de la invención se utiliza profilácticamente en un entorno hospitalario, particularmente para prevenir infecciones asociadas con heridas, úlceras y aberturas en la piel debido a cateterización, y cualquier otro procedimiento médico o dispositivos.
En ciertas formas de realizaciones, un bacteriófago y/o polipéptido de la invención se utiliza como agente único para tratar o prevenir infecciones asociadas conA. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureusu otras especies bacterianas. En otras formas de realizaciones de la invención, un bacteriófago y/o polipéptido de la invención se utiliza en combinación con otros agentes, incluyendo otros bacteriófagos (por ejemplo, que se dirigen a una especie o cepa diferente de bacteria) o con antibióticos que se dirigen a los mismos o diferentes tipos de bacterias, incluidas bacterias seleccionadas de cualquier bacteria gram-positiva, cualquier bacteria gram-negativa, y cualquier otro grupo de bacterias que no esté clasificado como gram-positiva o gram-negativa. Las composiciones de la invención también pueden ser utilizadas en combinación con cualquier otro medio de tratamiento de infección bacteriana conocido para alguien con habilidad en la tecnica.
También se contempla por la invención métodos para prevenir y métodos para tratar una infección causada por bacterias incluyendo, pero no limitado a,E. faecalis,E. faecium, P. aeruginosa, S.aureusy/oA. baumannii,comprendiendo administrar a un mamífero que lo necesita una composición que comprende una lisina que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:202, s Eq ID NO:203, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:447, SEQ ID NO:448, SEQ ID NO:575, SEQ ID NO:641, I.D. NO:712, y/o SEQ ID NO:797, o un su fragmento, variante o derivado, donde el fragmento, variante o derivado muestra actividad antibacteriana o antimicrobiana contra las especies de bacterias de las cuales se aisló el bacteriófago parenteral. Se describe aquí sin ser parte de la invención métodos para prevenir o tratar una infección causada por una bacteria incluyendo, pero no limitado a,E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureusy/oA. baumannii,comprendiendo administrar a un mamífero que lo necesita una composición que comprende un dominio CHAP aislado de una lisina, o un fragmento, variante o su derivado que muestra al menos una actividad biológica del dominio CHAP del cual fue aislado(e.g.,lisis celular). Se describe aquí (sin ser parte de la invención) que el dominio CHAP aislado comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SeQ ID NO:755, SEQ ID NO:756, SEQ ID NO:757, SEQ ID NO:758 o SEQ ID NO:759. Se describe aquí (sin ser parte de la invención) métodos para prevenir y tratar una infección causada por bacterias incluyendo, pero no limitado a,E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureusy/oA. baumannii,comprendiendo administrar a un mamífero que lo necesita una composición que comprende una proteína de medida de cinta de cola o proteína de cola que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:435, SEQ ID NO:438, SEQ ID NO:440, SEQ ID NO:525, SEQ ID NO:526, SEQ ID NO:527, SEQ ID NO:528, SEQ ID NO:529, SEQ ID NO:530, SEQ ID NO:531, SEQ ID NO:532, SEQ ID NO:533, SEQ ID NO:534, SEQ ID NO:535, SEQ ID NO:536, SEQ ID NO:537, SEQ ID NO:538, SEQ ID NO:539, SEQ ID NO:567, SEQ ID NO:568, SEQ ID NO:632, SEQ ID NO:633, SEQ ID NO:700, SEQ ID NO:701, SEQ ID NO:702, SEQ ID NO:703, SEQ ID NO:704 y/o SEQ ID NO:795, o un su fragmento, variante o derivado, donde el fragmento, variante o derivado muestra una actividad biológica asociada con el bacteriófago parental. En otras formas de realizaciones, la invención proporciona métodos para prevenir y tratar una infección causada por bacterias incluyendo, pero no limitado a,E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureusy/oA. baumannii,comprendiendo administrar a un mamífero que lo necesita una composición que comprende un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y/o SEQ ID NO:760. Combinaciones de las lisinas (o sus fragmentos, variantes o derivados como se describió anteriormente) y de proteínas de medida de cinta de cola o proteínas de cola (o sus fragmentos, variantes o derivados como se describió anteriormente), opcionalmente con uno o más bacteriófagos de la invención o con otros tratamientos, como antibióticos, también se contemplan, así como métodos de tratamiento y métodos de prevención de una infección bacteriana utilizando una o más de las combinaciones aquí descritas.
Tal como se utiliza aquí, el término "en combinación" se refiere al uso de más de un agente profiláctico y/o terapéutico. El uso del término "en combinación" no restringe el orden en que se administran los agentes profilácticos y/o terapéuticos a un sujeto con una enfermedad o trastorno. Un primer agente profiláctico o terapéutico puede ser administrado antes de(e.g.,5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas antes), simultáneamente con, o posteriormente a(e.g.,5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas después) la administración de un segundo agente profiláctico o terapéutico (diferente del primer agente profiláctico o terapéutico) a un sujeto con una enfermedad o trastorno.
6.3 USO COMO DESINFECTANTE Y ANTIINFECCIOSO
Los patógenos bacterianos a menudo infectan en un sitio de membrana mucosa(e.g.,respiratorio superior e inferior, intestinal, urogenital y ocular). Las membranas mucosas mismas a menudo son el reservorio, a veces el único reservorio, para muchas bacterias patógenas encontradas en el ambiente(e.g.,neumococos, estafilococos y estreptococos). Hay muy pocos agentes antiinfecciosos diseñados para controlar el estado portador de bacterias patógenas. Sin embargo, los estudios han mostrado que al reducir o eliminar este reservorio en entornos como hospitales y residencias de ancianos, la incidencia de infecciones por estas bacterias se reducirá notablemente.
Los bacteriófagos y/o polipéptidos de la presente invención pueden ser utilizados en composiciones antiinfecciosas para controlar el crecimiento de bacterias(e.g.,bacterias Gram-positivas(e.g. E.faecalis, E.faecium, S. aureus),bacterias Gram-negativas(e.g., P. aeruginosa, A. baumannii)o bacterias no clasificadas como Gram-positivas o Gram-negativas), con el objetivo de prevenir o reducir la incidencia de infecciones graves. Además de su uso en composiciones para aplicación en membranas mucosas, un bacteriófago y/o polipéptido de la presente incorporación también puede ser incorporado en formulaciones tales como geles, cremas, ungüentos o aerosoles para controlar o prevenir la colonización de bacterias en superficies corporales(e.g.,piel y membranas mucosas)(e.g.,para la esterilización de campos quirúrgicos o de las manos y piel expuesta de trabajadores de salud y/o pacientes) y otras superficies sólidas(e.g.,electrodomésticos, encimeras y, en particular, equipo hospitalario).
6.4. MÉTODOS DIAGNÓSTICOS
La presente invención también abarca métodos diagnósticos para determinar el agente causante en una infección bacteriana. En ciertas formas de realizaciones, el diagnóstico del agente causante en una presentación de infección bacteriana se realiza mediante (i) el cultivo de muestras de tejido, sangre o fluido de un paciente según técnicas estándar, (ii) poniendo en contacto el cultivo con uno o más bacteriófagos y/o polipéptidos de la invención y (iii) monitoreando el crecimiento celular y la evidencia de lisis después de dicho contacto. Dado que la actividad de los bacteriófagos y/o sus productos aislados(e.g.,polipéptidos, o fragmentos, variantes o sus derivados biológicamente activos) tiende a ser específica para especies o cepas, la susceptibilidad, o falta de susceptibilidad, a uno o más bacteriófagos y/o polipéptidos de la invención puede ser indicativa de la especie o cepa de bacterias infecciosas. Por ejemplo, un crecimiento reducido de cultivos de prueba después de poner en contacto con un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: I o SEQ ID NO:2, o con un su producto polipeptídico aislado, puede indicar que la muestra de prueba comprendeE. faecalisoE. faecium.De manera similar, un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO:3, o un su producto polipeptídico aislado, puede usarse para identificar una infección porP. aeruginosa;un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO:760, o un su producto polipeptídico aislado, puede usarse para identificar una infección porA. baumannii,mientras que aquel que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO:4, SeQ ID No :5, SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7, o un su producto polipeptídico aislado, puede usarse para identificar una infección por S.aureus.
6.5. VARIANTES DE AMINOÁCIDOS
Las variantes de secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de la invención pueden crearse de manera que sean variantes de sustitución, inserción o eliminación. Las variantes de eliminación carecen de uno o más residuos de la proteína nativa que no son esenciales para su función (e . gactividad antimicrobiana o antibacteriana). Los mutantes por inserción generalmente involucran la adición de material en un punto no terminal del polipéptido. Las variantes por sustitución generalmente contienen el intercambio de un aminoácido por otro en uno o más sitios dentro de la proteína y pueden estar diseñadas para modular una o más propiedades del polipéptido, como la estabilidad frente a la escisión proteolítica, sin la pérdida de otras funciones o propiedades. Preferiblemente las sustituciones de este tipo son conservadoras, es decir, un aminoácido es reemplazado por otro de forma y carga similares. Las sustituciones conservadoras son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, los cambios de: alanina a serina; arginina a lisina; asparagina a glutamina o histidina; aspartato a glutamato; cisteína a serina; glutamina a asparagina; glutamato a aspartato; glicina a prolina; histidina a asparagina o glutamina; isoleucina a leucina o valina; leucina a valina o isoleucina; lisina a arginina; metionina a leucina o isoleucina; fenilalanina a tirosina, leucina o metionina; serina a treonina; treonina a serina; triptófano a tirosina; tirosina a triptófano o fenilalanina; y valina a isoleucina o leucina.
Una vez que se identifican áreas generales del gen que codifican la proteína lisina particular descrita aquí, se puede emplear mutagénesis puntual para identificar con particularidad qué residuos de aminoácidos son importantes en las actividades antibacterianas. Por lo tanto, una persona con habilidad en la técnica podrá generar cambios de una sola base en la cadena de DNA, resultando en un codón alterado y una mutación sin sentido.
Preferiblemente, la mutación de los aminoácidos de una proteína crea una molécula de segunda generación equivalente o incluso mejorada. Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos en una estructura proteica sin pérdida detectable de función(e.g.,actividad antibacteriana o antimicrobiana). Al hacer tales cambios, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice de aminoácidos hidropáticos al conferir función biológica interactiva a una proteína es generalmente entendida en la tecnica. Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, lo que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, interacción con un peptidoglicano dentro de la capa externa de una bacteria gram-positiva. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático en función de su hidrofobicidad y características de carga; por ejemplo: isoleucina(+4.5); valina(+4.2); leucina(+3.8); fenilalanina(+2.8); cisteína/cistina(+2.5); metionina(+1.9); alanina(+1.8); glicina(-0.4); treonina(-0.7); serina(-0.8); triptófano(-0.9); tirosina(-1.3); prolina(-1.6); histidina(-3.2); glutamato(-3.5); glutamina(-3.5); aspartato(-3.5); asparagina(-3.5); lisina(-3.9); y arginina(-4.5).
También se comprende en la tecnica que la sustitución de aminoácidos similares se puede realizar eficazmente en función de la hidrofilicidad. Al igual que la hidrofobicidad, se han asignado valores de hidrofilicidad a cada aminoácido: arginina (+3.0); lisina (+3.0); aspartato (+3.0 ± 1); glutamato (+3.0 ± 1); serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0.5 ± 1); alanina (-0.5); histidina (-0.5); cisteína (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5) y triptófano (-3.4). Se pueden obtener moléculas equivalentes sustituyendo un aminoácido por otro cuando sus índices de hidrofilicidad están dentro de ± 2, preferiblemente ± 1, o más preferiblemente ± 0.5 entre sí. Se describe aquí (sin formar parte de la invención) péptidos aislados que comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más modificaciones de aminoácidos(e.g.,inserción, sustitución, eliminación, etc.) en relación con una secuencia de aminoácidos revelada aquí. Se describe aquí (sin formar parte de la invención) que las mutación(es) se realizan de tal manera que se retiene la actividad biológica del polipéptido en particular. Por ejemplo, la presente invención abarca polipéptidos aislados de bacteriófagos Fl245/05, Fl68/08, Fl 70/08, F770/05, Fl97/08, F86/06, F87s/06 y/o F9la/06, que están mutados para comprender 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más modificaciones de aminoácidos en relación con una secuencia de aminoácidos mencionada aquí, y que muestran actividad antibacteriana contra una o más especies o cepas de bacterias Gram-positivas o Gram-negativas,e.g., A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosay/o S.aureus.Se describe aquí (sin formar parte de la invención) que los polipéptidos derivados de Fl68/08 o F/170/08 muestran actividad antibacteriana o antimicrobiana,e.g.,actividad lítica, contra al menosE. faecalisy/oE. faecium;aquellos derivados de F770/05 contra al menosP. aeruginosa;aquellos derivados de Fl97/08, F86/06, F87s/06 o F9la/06 contra al menos S.aureus;y aquellos derivados de Fl245/05 contra al menosA. baumannii.
6.6. POLINUCLEÓTIDOS QUE CODIFICAN POLIPÉPTIDOS DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la invención. La invención también abarca polinucleótidos que hibridan bajo condiciones de hibridación de alta rigidez, intermedia o de baja rigidez,e.g.,como se definesupra,a polinucleótidos que codifican un polipéptido de la invención y que codifican polipéptidos modificados que tienen actividad antibiótica y/o otra actividad biológica.
Los polinucleótidos pueden obtenerse, y la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos determinarse, por cualquier método conocido en la tecnica. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención puede generarse a partir de ácido nucleico de una fuente adecuada (e . gbacteriófago FI245/05, FI68/08, Fl 70/08, F770/05, Fl97/08, Fl97/08, F86/06, F87s/06 o F9la/06). Las secuencias de nucleótidos pueden aislarse de genomas de fagos mediante métodos rutinarios conocidos en la tecnica (véase,e.g.,Carlson, "Trabajando con bacteriófagos: técnicas comunes y enfoques metodológicos",In,Kutter y Sulakvelidze (Eds) Bacteriófagos: Biología y Aplicaciones, 5ta ed. CRC Press (2005)). Si no se dispone de una fuente que contenga un ácido nucleico que codifique un polipéptido en particular, pero se conoce la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la invención, se puede sintetizar químicamente un ácido nucleico que codifique el polipéptido y clonarlo en vectores de clonación replicables utilizando cualquier método bien conocido en la tecnica.
Una vez determinada la secuencia de nucleótidos del polipéptido de la invención, la secuencia de nucleótidos del polipéptido puede ser manipulada utilizando métodos bien conocidos en la tecnica para la manipulación de secuencias de nucleótidos,e.g.,técnicas de DNA recombinante, mutagénesis dirigida por sitio, PCR, etc. (véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., 1990, Clonación Molecular, Un Manual de Laboratorio, 2da Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY y Ausubelet al.,eds., 1998, Protocolos Actuales en Biología Molecular, John Wiley & Sons, NY), para generar polipéptidos con una secuencia de aminoácidos diferente, por ejemplo, para crear sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos.
En otra forma de realización de la invención, se proporcionan las siguientes secuencias nucleotídicas: la secuencia nucleotídica desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 85 de SEQ ID NO:760; la secuencia nucleotídica desde el nucleótido 87 hasta el nucleótido 584 de SEQ ID NO:760; la secuencia nucleotídica desde el nucleótido 594 hasta el nucleótido 767 de SEQ ID NO:760; la secuencia nucleotídica desde el nucleótido 724 hasta el nucleótido 1035 de SEQ ID NO:760; la secuencia nucleotídica desde el nucleótido 1005 hasta el nucleótido 1823 de SEQ ID NO:760; la secuencia nucleotídica desde el nucleótido 1816 hasta el nucleótido 2130 de SEQ ID NO:760; la secuencia nucleotídica desde el nucleótido 2132 hasta el nucleótido 2383 de SEQ ID NO:760; la secuencia nucleotídica desde el nucleótido 2383 hasta el nucleótido 3690 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 3687 hasta el 4469 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 4466 hasta el 5458 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 5632 hasta el 7956 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 8010 hasta el 8912 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 8915 hasta el 9262 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 9252 hasta el 10223 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 10213 hasta el 10782 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 10769 hasta el 11218 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 11202 hasta el 11420 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 11413 hasta el 12342 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 12339 hasta el 12515 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 12512 hasta el 13165 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 13170 hasta el 15599 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 15609 hasta el 15872 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 15979 hasta el 16173 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 16175 hasta el 16482 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 16494 hasta el 18059 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 18072 hasta el 18815 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 18857 hasta el 19879 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 19930 hasta el 20178 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 20180 hasta el 20545 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 20646 hasta el 21203 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 21212 hasta el 23506 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 23506 hasta el 24186 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 24201 hasta el 27068 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 27084 hasta el 30212 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 30214 hasta el 32505 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 32515 hasta el 32880 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 32873 hasta el 33460 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 33460 hasta el 33816 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 33825 hasta el 35777 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 35774 hasta el 35872 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 35869 hasta el 36027 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 36038 hasta el 36193 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 36916 hasta el 36788 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 37209 hasta el 37427 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 37868 hasta el 38386 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 38383 hasta el 38586 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 38912 hasta el 39406 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 39406 hasta el 39915 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 39917 hasta el 40021 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 40018 hasta el 40101 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 40101 hasta el 40670 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 40720 hasta el 41838 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 41822 hasta el 42127 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 42105 hasta el 42308 de SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 42382 hasta el 42912 de SEQ ID NO:760; y la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 42896 hasta el 43015 de SEQ ID NO:760.
6.7 EXPRESIÓN RECOMBINANTE DE MOLÉCULAS DE LA INVENCIÓN
Una vez obtenida una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de la invención(e.g.,un polipéptido), el vector para la producción de las moléculas puede ser producido mediante tecnología de DNA recombinante utilizando técnicas bien conocidas en el campo. Métodos que son bien conocidos para aquellos expertos en la materia pueden ser utilizados para construir vectores de expresión que contienen las secuencias codificantes para las moléculas de la invención y señales apropiadas de control transcripcional y traduccional. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicasin vitrode DNA recombinante, técnicas sintéticas y recombinación genéticain vivo.(Véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrooket al.,1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2da Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY y Ausubelet al.eds., 1998, Protocolos Actuales en Biología Molecular, John Wiley & Sons, NY).
La presente invención proporciona vectores de expresión que codifican los polipéptidos de la invención. Un vector de expresión que comprende la secuencia nucleotídica de una molécula identificada por los métodos de la invención puede ser transferido a una célula huésped mediante técnicas convencionales(e.g.,electroforación, transfección liposomal y precipitación de fosfato de calcio) y las células transfectadas se cultivan entonces mediante técnicas convencionales para producir las moléculas de la invención. Se describe aquí (sin ser parte de la invención) que, la célula huésped es distinta de la especie de la bacteria progenitora de la cual se derivó el bacteriófago que comprende la secuencia. Se describe aquí que, la expresión de las moléculas de la invención está regulada por un promotor constitutivo, uno inducible o uno específico de tejido. Se describe aquí (sin ser parte de la invención) que el vector de expresión es pQE-30 (Qiagen) o pET-29(a) (Novagen).
Las células huésped utilizadas para expresar las moléculas identificadas por los métodos de la invención pueden ser células bacterianas (no susceptibles a la proteína del bacteriófago o su fragmento de la invención) comoEscherichia coli.Se pueden utilizar una variedad de sistemas de vectores de expresión huésped para expresar las moléculas identificadas por los métodos de la invención. Estos sistemas de expresión huésped representan vehículos mediante los cuales se pueden producir y posteriormente purificar las secuencias codificantes de las moléculas de la invención, pero también representan células que, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos apropiados, expresan las moléculas de la invenciónin situ.Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos como bacterias que no son susceptibles a la proteína del bacteriófago o su fragmento de la invención(e.g., E.coliyB. subtilis)transformados con DNA de bacteriófago recombinante, DNA plasmídico o vectores de expresión de DNA cósmido que contienen secuencias codificantes para las moléculas identificadas por los métodos de la invención; levaduras(e.g., Saccharomyces Pichia)transformadas con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen secuencias que codifican las moléculas identificadas por los métodos de la invención; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen las secuencias que codifican las moléculas identificadas por los métodos de la invención; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y virus del mosaico del tabaco (TMV)) o transformadas con vectores de expresión plasmídicos recombinantes(e.g.,plásmido Ti) que contienen secuencias que codifican las moléculas identificadas por los métodos de la invención; o sistemas de células mamíferas(e.g.,Co S, CHO, BHK, 293, 293T, 3T3, células linfáticas (véase U.S. 5,807,715), células Per C.6 (células retinianas humanas desarrolladas por Crucell) que albergan construcciones de expresión recombinante que contienen promotores derivados del genoma de células mamíferas(e.g.,promotor de metalotioneína) o de virus mamíferos(e.g.,el promotor tardío del adenovirus; el promotor 7.5K del virus de la viruela).
En sistemas bacterianos no susceptibles a la proteína del bacteriófago o fragmento de la invención, se pueden seleccionar ventajosamente una serie de vectores de expresión dependiendo del uso previsto para la molécula que se expresa. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de dicha proteína, para la generación de composiciones farmacéuticas de un polipéptido, pueden ser deseables vectores que dirijan la expresión de altos niveles de productos de proteínas de fusión que se purifican fácilmente. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, el vector de expresión deE. colipUR278 (Rutheret al.,1983, EMBO J. 2:1791), en el cual la secuencia proteica puede ser ligada individualmente en el vector en marco con la región codificante delac Zpara que se produzca una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985,Nucleic Acids Res.13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989,J. Biol. Chem.24:5503-5509); y similares. Los vectores pGEX también pueden ser utilizados para expresar polipéptidos extranjeros como proteínas de fusión con la glutatión S-transferasa (GST). En general, estas proteínas de fusión son solubles y pueden ser fácilmente purificadas de células lisadas por adsorción y unión a una matriz de cuentas de glutatión-agarosa seguido de elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX están diseñados para incluir sitios de escisión de proteasa trombina o factor Xa, de modo que el producto del gen objetivo clonado puede ser liberado de la porción GST.
En un sistema de insectos, el virus polihedrosis nuclear deAutographa californica(AcNPV) se utiliza como vector para expresar genes extranjeros. El virus crece en células deSpodoptera frugiperda.La secuencia de codificación de polipéptidos puede ser clonada individualmente en regiones no esenciales(e.g.,el gen polihedrina) del virus y colocada bajo el control de un promotor de AcNPV (e.g., el promotor polihedrina).
Una vez que se ha expresado recombinantemente una molécula de la invención(i.e.,polipéptidos), puede ser purificada por cualquier método conocido en la tecnica para la purificación de polipéptidos, por ejemplo, por cromatografía(e.g.,cromatografía de intercambio iónico, afinidad y cromatografía de columnas de dimensionamiento), centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de polipéptidos o anticuerpos.
Ciertas modificaciones y mejoras ocurrirán a aquellos expertos en la tecnica tras leer la descripción anterior. Debe entenderse que todas esas modificaciones y mejoras han sido omitidas aquí por el bien de la concisión y legibilidad, pero se encuentran adecuadamente dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.
7. EJEMPLOS
Se entiende que los siguientes ejemplos y modalidades descritos aquí son solo con fines ilustrativos y que diversas modificaciones o cambios a la luz de estos serán sugeridos para personas expertas en la tecnica y están incluidos dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se indique lo contrario, los bacteriófagos de la invención fueron aislados, procesados y analizados de acuerdo con los siguientes métodos.
7.1. MÉTODOS
7.1.1. PURIFICACIÓN DEL BACTERIÓFAGO.
Las preparaciones de stock de bacteriófagos aislados de muestras clínicas se prepararon según los protocolos descritos en Carlson, "Trabajando con bacteriófagos: técnicas comunes y enfoques metodológicos",In,Kutter y Sulakvelidze (Eds) Bacteriófagos: Biología y Aplicaciones, 5a ed. CRC Press (2005).
Las preparaciones de stock de bacteriófagos fueron concentradas por precipitación con PEG según el protocolo descrito por Carlson y Yamamoto et al., 2004,PNAS101:6415-6420. Breve y a grandes rasgos, la preparación de stock fue incubada en 1 M NaCl durante una hora a 4°C con agitación. A continuación, se añadió gradualmente PEG 8000 (AppliChem, Cheshire, MA) hasta una concentración final del 10% (w/v). La composición fue entonces incubada durante la noche a 4°C. Después del período de incubación, la composición fue centrifugada a 10,000 x g durante 30 minutos a 4°C. El sedimento fue luego resuspendido en tampón SM (0.05 M Tris-HCL a pH 7.4, 0.1 M NaCl, 10 mM MgSCM) con gelatina al 1 % w/v y centrifugado nuevamente a 1,000 rpm a 4°C durante 10 minutos. El sobrenadante que contenía el fago suspendido fue guardado para su posterior purificación. El sobrenadante fue purificado usando un gradiente de CsCl según los métodos descritos en Carlson.
El CsCl fue eliminado del stock de bacteriófago purificado y concentrado por diálisis. Una membrana de diálisis, Cellu.Sep HI High Grade Regenerated Cellulose Tubular Membrane (Cellu.Sep, River Street, USA), fue preparada de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La diálisis consistió en una primera incubación de 30 minutos en 100 mM Tris-HCl y 3 M NaCl (pH 7.4) a 4°C. Esto fue seguido por una segunda incubación de 30 minutos en 100 mM Tris-HCl y 0.3 M NaCl (pH 7,4) a 4°C. Después de la diálisis, el bacteriófago suspendido fue retirado del interior de la bolsa de diálisis y almacenado a 4°C.
7.1.2. EXTRACCIÓN DE DNA DEL BACTERIÓFAGO
A 5 ml de las muestras de bacteriófago purificadas y concentradas se añadió EDTA a 20 mM con pH 8.0, SDS al 0.5% (p/v) y Proteinasa K a una concentración final de 40 pg/ml. La mezcla se incubó a 56° C durante una hora. Se realizaron extracciones sucesivas en fenol:cloroformo:alcohol en proporciones de 25:24:1, hasta que la interfaz entre las fases acuosa y orgánica estuvo clara. La fase acuosa se trató luego con un volumen igual de cloroformo y se centrifugó a 13,0000 x g durante 10 minutos a 4°C. Nuevamente se extrajo la fase acuosa, y el DNA se precipitó añadiendo dos volúmenes de etanol absoluto e incubando durante treinta minutos a -20°C. Las muestras se centrifugaron luego a 11,000 x g durante 30 minutos a 4°C. El pellet se lavó con etanol al 70% a temperatura ambiente y se resuspendió en 50 pl de agua ultra-pura (Gibco, California). La concentración de DNA se determinó midiendo la absorbancia a 260 nm en un espectrofotómetro ND-I 000. La integridad del DNA del bacteriófago aislado se analizó mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1%.
7.1.3. ANÁLISIS DE GENOMAS DE BACTERIÓFAGOS
La secuenciación del genoma del bacteriófago permitió la identificación de posibles marcos de lectura abiertos (ORFs) dentro del genoma. Los ORFs putativos de los bacteriófagos se usaron para buscar secuencias de DNA homólogas en la colección de nucleótidos de NCBI utilizando el programa BLASTN (véase,e.g.,Zhang et al., 2000,J. Comput. Biol.7:203-214).
7.2. EJEMPLO 1: Bacteriófago F168/08
Comparación de los ORFs putativos del genoma del bacteriófago Fl68/08 con las secuencias en la base de datos de nucleótidos de NCBI reveló que solo pequeñas porciones del genoma (< 1%) mostraron homología con secuencias conocidas. Los ORFs de Fl68/08, sus secuencias de aminoácidos codificadas y las proteínas homólogas conocidas se proporcionan en la FIG. 2. La predicción de ORFs se realizó integrando los resultados obtenidos con los programas GeneMark.hmm y MetaGeneAnnotator (Besemer, J. y Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27: 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). Las búsquedas de homología de proteínas se llevaron a cabo con el programa BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389 33402) utilizando la base de datos de secuencias de proteínas no redundantes de NCBI. Los dominios conservados de proteínas se predijeron usando BLAST especializado de NCBI (Marchler-Bauer, A et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237-240). Los ORFs cuyos productos presentaron homología con la misma proteína(s) se indican con el mismo número añadido de una letra minúscula, en la FIG. 2. La identificación de genes putativos de RNA de transferencia (tRNA) se llevó a cabo utilizando el programa tRNAscan-SE (Lowe, T.M. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 955-964).
Las FIGS. 3A-B muestran los resultados de pruebas de punto que evaluaron la actividad del bacteriófago Fl 68/08 contra 105 cepas deEnterococcus faecalis(A) y 56 cepas deEnterococcus faecium(B) aisladas de muestras clínicas. Cada punto consistió en 5 pl de suspensión de bacteriófago con los títulos indicados, preparados a partir de un lisado purificado con CsCl. La sensibilidad al fago se representa en una escala que varía desde halos de lisis turbio (+) hasta halos de lisis claros (++++). La resistencia a la infección por fago se indica como (-).
7.3. EJEMPLO 2: Bacteriófago F170/08
Comparación de los ORFs putativos del genoma del bacteriófago Fl70/08 con las secuencias en la base de datos de nucleótidos NCBI reveló que aproximadamente el 94% de su genoma era altamente similar al del fago de Enterococcus <l>EF24C, con identidades de ORF individuales que varían del 80 al 100%. Los ORFs Fl70/08, sus secuencias de aminoácidos codificadas y proteínas homólogas conocidas se proporcionan en la FIG. 5. La predicción deorfsse realizó integrando los resultados obtenidos con los programas GeneMark.hmm y MetaGeneAnnotator (Besemer, J. y Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27: 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). Las búsquedas de homología de proteínas se llevaron a cabo con el programa BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) utilizando la base de datos de secuencias de proteínas no redundantes del NCBI. Los dominios conservados de proteínas se predijeron utilizando el BLAST especializado del NCBI (Marchler Bauer, A et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237-240). Losorfscuyos productos presentaron homología con la misma proteína(s) están indicados con el mismo número añadido de una letra minúscula, en la FIG. 5. La identificación de genes de RNA de transferencia putativos (tRNA) se llevó a cabo utilizando el programa tRNAscan-SE (Lowe, T.M. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 955-964).
Las FIGS. 6A-B proporcionan los resultados de las pruebas de mancha que evaluaron la actividad del bacteriófago Fl70/08 contra 105 cepas deEnterococcus faecalis(A) y 56 cepas deEnterococcus faecium(B) aisladas de muestras clínicas. Cada mancha consistió en 5 pl de suspensión de bacteriófago con los títulos indicados, preparados a partir de un lisado purificado con CsCl. La sensibilidad al fago se representa en una escala que varía de turbio (+) a halos de lisis claros (++++). La resistencia a la infección por fago se indica como (-).
7.4. EJEMPLO 3: Bacteriófago F770/05
La comparación de los ORFs putativos del genoma del bacteriófago F770/05 con las secuencias en la base de datos de nucleótidos de NCBI reveló que solo pequeñas porciones del genoma (< 1%) mostraron homología con secuencias conocidas. Los ORFs de F770/05, sus secuencias de aminoácidos codificados y las proteínas homólogas conocidas se proporcionan en la FIG. 8. La predicción deorfsse realizó mediante la integración de los resultados obtenidos con los programas GeneMark.hmm y MetaGeneAnnotator (Besemer, J. y Borodovsky, M.
1999. Nucleic Acids Res., 27: 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). Las búsquedas de homología de proteínas se llevaron a cabo con el programa BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) utilizando la base de datos de secuencias de proteínas no redundantes de NCBI. Los dominios conservados de proteínas se predijeron utilizando el BLAST especializado de NCBI (Marchler-Bauer, A et al., 2007.
Nucleic Acids Res. 35: 237-240).
La FIG. 9 muestra los resultados de las pruebas de mancha que evaluaron la actividad del bacteriófago FI70/05 contra 100 cepas dePseudomonas aeruginosaaisladas de muestras clínicas. Cada mancha consistió en 5 pl de suspensión de bacteriófago con los títulos indicados, preparados a partir de un lisado purificado con CsCl. La sensibilidad al fago se representa en una escala que varía desde turbia (+) hasta halos de lisis claros (++++). La resistencia a la infección por fago se indica como (-).
7.5. EJEMPLO 4: Bacteriófago F197/08
La comparación de los ORFs putativos del genoma del bacteriófago Fl 97/08 con las secuencias en la base de datos de nucleótidos de NCBI reveló que el genoma era altamente homólogo con múltiples genomas de bacteriófagos estafilococos. En particular, aproximadamente el 90% del genoma de Fl 97/08 es altamente similar al del bacteriófagoStaphylococcusphiSauS-IPLA35, con identidades de ORF individuales que van desde el 80 al 98%. Los ORFs de Fl97/08, sus secuencias de aminoácidos codificados y las proteínas homólogas conocidas se proporcionan en la FIG. 11. La predicción deorfsse realizó mediante la integración de los resultados obtenidos con los programas GeneMark.hmm y MetaGeneAnnotator (Besemer, J. y Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27: 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). Las búsquedas de homología de proteínas se llevaron a cabo con el programa BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) utilizando la base de datos de secuencias de proteínas no redundantes de NCBI. Los dominios conservados de proteínas se predijeron utilizando el BLAST especializado de NCBI (Marchler-Bauer, A et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237 240). Losorfscuyos productos presentaron homología con la misma proteína(s) se indican con el mismo número seguido de una letra minúscula, en la FIG. 11.
La FIG. 12 muestra los resultados de las pruebas de mancha que evaluaron la actividad del bacteriófago F197/08 contra 100 cepas deStaphylococcus aureusaisladas de muestras clínicas. Cada mancha consistió en 5 pl de suspensión de bacteriófago con los títulos indicados, preparados a partir de un lisado purificado con CsCl. La sensibilidad al fago se representa en una escala que varía desde turbia (+) hasta halos de lisis claros (++++). La resistencia a la infección por fago se indica como (-).
7.6. EJEMPLO 5: Bacteriófago F86/06
La comparación de los ORFs putativos del genoma del bacteriófago F86/06 con las secuencias en la base de datos de nucleótidos de NCBI reveló que el genoma era altamente homólogo con múltiples genomas de bacteriófagos estafilococos. En particular, aproximadamente el 80% del genoma de F86/06 es altamente similar al del bacteriófagoStaphylococcustp3l 0-1, con identidades de ORF individuales que van desde el 85 al 100%. Los ORFs de F86/06, sus secuencias de aminoácidos codificados y las proteínas homólogas conocidas se proporcionan en la FIG. 14. La predicción deorfsse realizó mediante la integración de los resultados obtenidos con los programas GeneMark.hmm y MetaGeneAnnotator (Besemer, J. y Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27: 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). Las búsquedas de homología de proteínas se llevaron a cabo con el programa BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) utilizando la base de datos de secuencias de proteínas no redundantes de NCBI. Los dominios conservados de proteínas se predijeron utilizando el BLAST especializado de NCBI (Marchler-Bauer, A et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237 240).
La FIG. 15 muestra los resultados de las pruebas de mancha que evaluaron la actividad del bacteriófago F86/06 contra 100 cepas deStaphylococcus aureusaisladas de muestras clínicas. Cada mancha consistió en 5 pl de suspensión de bacteriófago con los títulos indicados, preparados a partir de un lisado purficado con CsCl. La sensibilidad al fago se representa en una escala que varía desde turbia (+) hasta halos de lisis claros (++++). La resistencia a la infección por fago se indica como (-).
7.7. EJEMPLO 6: Bacteriófago F87s/06
La comparación de los posibles ORF del genoma del bacteriófago F87s/06 con las secuencias en la base de datos de nucleótidos del NCBi reveló que el genoma era altamente homólogo con múltiples genomas de bacteriófagos estafilococos. En particular, alrededor del 82% del genoma de F87s/06 es altamente similar al del bacteriófagoStaphylococcus<l>NM3, con identidades de ORF individuales que van desde el 90 hasta el 100%. Los ORFs de F86/06, sus secuencias de aminoácidos codificadas y las proteínas homólogas conocidas se proporcionan en la FIG. 17. La predicción de losorfsse realizó integrando los resultados obtenidos con los programas GeneMark.hmm y MetaGeneAnnotator (Besemer, J. y Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27: 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). Las búsquedas de homología de proteínas se llevaron a cabo con el programa BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) utilizando la base de datos de secuencias de proteínas no redundantes del NCBI. Los dominios conservados de proteínas se predijeron utilizando el BLAST especializado de NCBI (Marchler-Bauer, A et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237-240). Losorfscuyos productos presentaron homología con la(s) misma(s) proteína(s) se indican con el mismo número acompañado de una letra minúscula en la FIG. 17.
La FIG. 18 muestra los resultados de las pruebas de mancha que evaluaron la actividad del bacteriófago F87s/06 contra 100 cepas deStaphylococcus aureusaisladas de muestras clínicas. Cada mancha consistía en 5 pl de suspensión de bacteriófago con los títulos indicados, preparados a partir de un lisado purificado con CsCl. La sensibilidad al fago se representa en una escala que varía desde turbia (+) hasta halos de lisis claros (++++). La resistencia a la infección por fago se indica como (-).
7.8. EJEMPLO 7: Bacteriófago F91a/06
La comparación de los posibles ORF del genoma del bacteriófago F9la/06 con las secuencias en la base de datos de nucleótidos del NCBI reveló que el genoma era altamente homólogo con múltiples genomas de bacteriófagos estafilocócicos. En particular, alrededor del 82% del genoma de F9la/06 es altamente similar al del bacteriófagoStaphylococcus0NM3, con identidades individuales de ORF que oscilan entre el 86 y el 99%. Los posibles ORF de F9la/06, sus secuencias de aminoácidos codificadas y proteínas homólogas conocidas se proporcionan en la FIG. 20. La predicción de losorfsse realizó mediante la integración de los resultados obtenidos con los programas GeneMark.hmm y MetaGeneAnnotator (Besemer, J. y Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27: 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). Las búsquedas de homología de proteínas se realizaron con el programa BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) utilizando la base de datos de secuencias de proteínas no redundantes del NCBI. Los dominios conservados de las proteínas se predijeron utilizando BLAST especializado del NCBI (Marchler-Bauer, A et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237-240). Losorfscuyos productos presentaron homología con las mismas proteínas se indican con el mismo número acompañado de una letra minúscula, en la FIG. 20.
La FIG. 21 muestra los resultados de pruebas de puntos que evaluaron la actividad del bacteriófago F9la/06 contra 100 cepas deStaphylococcus aureusaisladas de muestras clínicas. Cada punto consistió en 5 pl de suspensión de bacteriófagos con los títulos indicados, preparados a partir de un lisado purificado con CsCl. La sensibilidad al fago se representa en una escala que va desde turbia (+) hasta halos de lisis claros (++++) y la resistencia a la infección por fagos se indica como (-).
7.9. EJEMPLO 8: Bacteriófago F1245/05
Los ORF de Fl245/05, sus secuencias de aminoácidos codificados y proteínas homólogas conocidas se proporcionan en las FIGS. 23A-IO. La predicción de losorfsse realizó integrando los resultados obtenidos con los programas GeneMark.hmm y MetaGeneAnnotator (Besemer, J. y Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27: 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). Las búsquedas de homología de proteínas se llevaron a cabo con el programa BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) utilizando la base de datos de secuencias de proteínas no redundantes del NCBI. Se predijeron los dominios conservados de las proteínas utilizando el BLAST especializado del NCBI (Marchler Bauer, A et al., 2007. Nucleic Acids Res.
35: 237-240). La función de las proteínas se predijo en función de la localización en el genoma del gen correspondiente y de la presencia de dominios transmembranales putativos del producto codificado (servidor TMHMM v. 2.0; Krogh, A et al., 2001. J. Mol. Biol., 305: 567-580.
Las FIGS. 24 A-E proporcionan los resultados de pruebas de manchas que evaluaron la actividad del bacteriófago Fl245/05 contra 100 cepas deAcinetobacter baumanniaisladas de muestras clínicas. Cada mancha consistía en 5 pl de suspensión de bacteriófago con las concentraciones indicadas, preparadas a partir de un lisado purificado con CsCl. La sensibilidad al fago se representa en una escala que va de turbia (+) a halos de lisis claros (++++). La resistencia a la infección por fagos se indica como (-).

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Bacteriófago purificado que tiene un genoma que comprende al menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:760, y que tiene actividad antibacteriana contra una o más cepas deAcinetobacter baumannii.
2. Composición farmacéutica que comprende el bacteriófago de acuerdo con la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
3. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende el bacteriófago cuyo genoma comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:760.
4. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, que además comprende uno o más bacteriófagos adicionales efectivos contraAcinetobacter baumannii.
5. Composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, para su uso en el tratamiento o la reducción de la incidencia de una infección bacteriana en un sujeto que lo necesite, en donde dicha infección bacteriana es una infección porAcinetobacter baumannii.
6. Composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la infección es una infección nosocomial.
7. Composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la composición farmacéutica se administra tópicamente.
8. Composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, para su empleo de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el sujeto es un mamífero, preferentemente un humano.
9. Composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, para su empleo de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la infección es una infección de la piel, preferiblemente en donde dicha infección de la piel es una infección asociada con una úlcera de pie diabético.
10. Composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, para su empleo de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la composición farmacéutica se administra tópicamente.
11. Composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, para su empleo de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la infección es una infección del tracto respiratorio.
12. Composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, para su empleo de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la composición farmacéutica se administra por inhalación, preferiblemente mediante el uso de una bomba, un aerosol o un nebulizador; y/o
preferiblemente en donde la composición farmacéutica para la administración por inhalación comprende un inhalador de polvo seco o un aerosol en spray.
13. Composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, para su uso según la reivindicación 5, en donde la infección es una infección del tracto urinario.
14. Composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, para su uso según la reivindicación 5, en donde dicha composición farmacéutica comprende además al menos uno de:
(i) un antibiótico contraAcinetobacter baumannii; y
(ii)un bacteriófago adicional conocido por tener actividad antibacteriana contraAcinetobacter baumannii.
15. Método para diagnosticar el agente causal de una infección bacteriana que comprende:
(i) cultivar una muestra de tejido de un paciente;
(ii) poner en contacto el cultivo del paso (i) con el bacteriófago de la reivindicación 1; y
(iii) supervisar la evidencia de crecimiento o lisis del cultivo; donde la evidencia de lisis del cultivo indica que el cultivo comprende una cepa de bacteriasAcinetobacter baumanniisusceptible al bacteriófago o proteína utilizados en el paso (ii).
16. Método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la muestra es una muestra de sangre, orina, esputo, fluido, tejido o frotis recogido del paciente.
32
17. Método in vitro para reducir o inhibir la colonización o el crecimiento de una o más cepas deAcinetobacter baumanniien una superficie sólida, que comprende poner en contacto dicha superficie sólida con el bacteriófago de acuerdo con la reivindicación 1.
18. Método de acuerdo con la reivindicación 17, en el cual dicha superficie es la superficie de un aparato hospitalario o un equipo hospitalario, preferiblemente en donde dicho aparato o equipo es un aparato quirúrgico o un equipo quirúrgico.
19. Bacteriófago de acuerdo con la reivindicación 1, para su uso en reducir o inhibir la colonización de una o más cepas deAcinetobacter baumanniien superficies corporales.
20. Bacteriófago de acuerdo con la reivindicación 1, para su uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dicha superficie corporal es la piel, o una membrana mucosa de un mamífero, preferiblemente de un ser humano.
33
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