CN110499266B - 一株粪肠球菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株能分离出粪肠球菌烈性噬菌体的粪肠球菌及其应用，属于生物工程领域。该细菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019275，保藏日期为2019年4月19日，该菌分离自昆明医科大学附属延安医院口腔科再治疗根管。在本发明中，透射电镜观察到该细菌无芽胞，无鞭毛，直径0.9～1.1μm。生长温度范围为20℃～42℃，最适温度约为37℃。其生长周期分为迟缓期，对数期，稳定期，衰亡期四个阶段，对数生长期大约维持在160～240min。采用本发明的粪肠球菌能分离针对粪肠球菌的烈性噬菌体；同时以此菌为感染源建立SD大鼠粪肠球菌腹腔感染模型和滇南小耳猪粪肠球菌感染根尖周炎模型，从而全面可用于对粪肠球菌感染和治疗的评价。

Description

一株粪肠球菌及其应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体而言涉及一株能分离出粪肠球菌烈性噬菌体的粪肠球菌及其应用。
背景技术
粪肠球菌(Enterococcus faecalis)属于肠球菌科肠球菌属，为革兰阳性兼性厌氧菌，呈圆形或椭圆形，直径0.5～1.0nm，大多数成对或短链状排列，通常不运动，是人体重要的条件致病菌。粪肠球菌多定居在人类和动物的胃肠和泌尿生殖器官，口腔中也有一定量的存在，它是引起口腔粘膜损害、牙周病及根管感染的重要细菌，是难治性根尖周炎中根管内混合感染的主要致病菌。
难治性根尖周炎(Refractory Periapical Periodontitis)，又称顽固性根尖周炎，是指经反复多次规范根管治疗，根尖周病变仍迁延不愈的疾病。临床表现为复发性根尖周脓肿和进行性骨质破坏，并导致牙齿丧失和牙槽骨缺损，严重影响患者的治疗效果和生存质量，是口腔医师面临的棘手问题，也是牙髓病临床治疗的难题。
粪肠球菌(Enterococcus faecalis)是根管治疗后再感染和难治性根尖周炎的主要病。在根管治疗后持续性感染的根尖周粪肠球菌检出率明显增高，最高达77％，粪肠球菌甚至成为根管治疗后根管再次感染的唯一检出细菌。因此，控制粪肠球菌感染在根管治疗中十分重要，彻底清除粪肠球菌感染是提高难治性根尖炎治愈率的关键。
噬菌体能特异性与宿主细菌结合，而且只感染原核细胞，不感染真核细胞，对人和动物无害，为控制难治性根尖周炎粪肠球菌感染提供了一种有效快捷的解决方法。
发明内容
本发明的目的是提供一株能分离出粪肠球菌烈性噬菌体Enterococcus faecalisbacteriophage的粪肠球菌，
本发明所提供的菌株为粪肠球菌Enterococcus faecalis YN771，是从昆明医科大学附属延安医院口腔科再治疗根管内分离获得。已于2019年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCC NO:M2019275。
其具有的以下生物学特性：光学显微镜下经革兰氏染色的菌体形态为圆形或椭圆形，呈链状排列，为G+菌。透射电镜观察到细菌无芽胞，无鞭毛，直径0.9～1.1μm。生长温度范围为20℃～42℃，最适温度约为37℃。紫外吸光度法测定粪肠球菌YN771的生长曲线。其生长周期分为迟缓期，对数期，稳定期，衰亡期四个阶段，对数生长期大约维持在160～240min。
本发明粪肠球菌Enterococcus faecalis YN771具体的采集样本方法为：整个操作过程保证严格无菌操作。首先用橡皮障隔离患牙，去除患牙冠部的充填体、去尽龋坏组织、暴露根管口，用3％过氧化氢液和25g/L次氯酸钠液交替清洁牙面，然后用GG钻和不锈钢K锉去除原根充物(注意：这一过程不使用任何化学溶剂)。再用根管测量仪测定根管工作长度。接着用生理盐水冲洗根管去除残留的根充物并使根管保持湿润状态，最后将干燥无菌纸尖插入根管并达到工作长度，停留40～70s后将纸尖转至BHI液体培养基内，尽快将样本送至实验室。
本发明粪肠球菌Enterococcus faecalis YN771具体的分离方法为：先将装有样本的试管振荡均匀，35～37℃，120～170rpm，有氧条件下孵育20～26h后观察，如果培养基变浑浊，证明培养基中有细菌生长；如果培养基清亮或者颜色无变化则认为培养基中无细菌生长，阴性结果。
取培养基变浑浊的阳性结果样本，用接种环蘸取少量液体在克林霉素抗性固体培养基上划线，35～37℃，120～170rpm恒温培养20～26h。最终从克林霉素抗性平板上分离出一株粪肠球菌。利用16S rRNA基因序列分析法鉴定细菌。
本发明还有一个目的将一株粪肠球菌YN771用于分离粪肠球菌烈性噬菌体。
分离方法如下：
1、宿主菌的准备：以粪肠球菌E.faecalisYN771作为分离烈性噬菌体的宿主菌，将粪肠球菌YN771，在BHI固体培养基上划线，32～40℃恒温孵育20～30h，然后挑取单菌落接种于5mL BHI液体培养基中，培养至对数生长早期OD为0.3，供分离粪肠球菌烈性噬菌体用；
2、噬菌体的分离：以分离的培养至对数生长早期OD为0.3的粪肠球菌YN771为宿主菌，从昆明医科大学附属延安医院口腔科污水口取回的未经氯水处理的污水为样本，两者富集培养，2～8℃，8000～11,000rpm离心9～12min，收集上清液，用0.40～0.48μm无菌滤膜抽滤，再用0.20～0.24μm无菌滤膜过滤，收集滤液。将过滤液7倍稀释，从每个稀释梯度中分别取80～130μL与280～320μL宿主菌液混合，放置32～40℃恒温箱中静止吸附12～15min，然后加入冷却至40℃、琼脂浓度为0.75％的BHI半固体培养基4～8mL，混匀后快速的倾倒于普通BHI固体培养基上，形成双层平板。超净工作台下静置12～18min，使其充分凝固，倒置于37℃恒温箱静置培养。10～13h后，观察到BHI双层平板上长出边缘清晰的噬菌斑；
3、噬菌体的纯化：以分离的培养至对数生长早期OD为0.3的粪肠球菌YN771为宿主菌，用无菌棒挑取噬菌体单个噬菌斑，接种到宿主菌液中，32～40℃120～170rpm，培养10～24h。取混合物8000～11,000rpm离心9～12min，收集上清液，先用0.40～0.48μm微孔滤膜抽滤，再用0.20～0.24μm无菌微孔滤膜过滤。采用双层琼脂平板法分离噬菌体，将过滤液十倍稀释，从每个稀释梯度中分别取80～130μL与280～320μL宿主菌液混合，放置32～40℃恒温箱中静止吸附12～15min，然后加入冷却至40℃、琼脂浓度为0.75％的BHI半固体培养基4～8mL，混匀后快速的倾倒于新鲜BHI固体培养基上，形成双层平板。实验重复三次以上纯化，当看到双层平板上形成形态大小均一的噬菌斑时，将最后一次得到的单个噬菌斑取出，接种到处于宿主菌液中，32～40℃120～170rpm过夜振荡培养。取混合物8000～11,000rpm离心9～12min，收集上清液，先用0.40～0.48μm微孔滤膜抽滤，再用0.20～0.24μm无菌微孔滤膜过滤，得到的即为噬菌体原液，4℃保存备用。
本发明还有一个目的是将一株粪肠球菌用于建立SD大鼠粪肠球菌腹腔感染模型。
建立SD大鼠粪肠球菌腹腔感染模型后，开展了粪肠球菌噬菌体PEf771抗病原菌粪肠球菌E.faecalis YN771腹腔感染的动物实验，实验结果表明，在高浓度病原菌E.faecalis YN771(9.6×1011cfu/mL)感染的情况下SD大鼠全部死亡，而低浓度病原菌E.faecalis YN771组(6.4×1010cfu/mL)的SD大鼠存活时间可达72h，解剖中腹腔可见到多发脓肿形成。经过噬菌体PEf771治疗组，所有实验动物均存活达72h，病理解剖证实治疗组腹腔中肝脏、肾脏、肠道均正常，未见有脓肿及脓性腹水形成，首次证明了粪肠球菌噬菌体PEf771对病原菌E.faecalis YN771引起的大鼠腹腔感染有明确治疗效果。
本发明的还有一个目的是将一株粪肠球菌用于建立滇南小耳猪粪肠球菌感染根尖周炎模型。
通过建立滇南小耳猪粪肠球菌感染根尖周炎模型，验证了噬菌体PEf771在口腔内对病原菌E.faecalis YN771感染根尖周炎的治疗作用。实验结果表明，HE染色发现对照组-1(开髓+消毒+接种病原菌E.faecalis YN771)慢性炎症最重，牙周膜与牙骨质之间的裂隙明显增宽，牙骨质部分吸收，吸收区域牙骨质细胞增多，牙骨质局部增厚。经噬菌体PEf771治疗的实验牙，牙及牙周组织基本正常，未见有明显的炎症细胞浸润，牙骨质未见破坏，牙骨质细胞排列整齐，牙骨质与牙周膜紧密结合，说明噬菌体PEf771治疗根尖周炎有确切的疗效。
附图说明
图1为粪肠球菌E.faecalisYN771菌落形态图；
图2为粪肠球菌E.faecalisYN771光学显微镜下经革兰氏染色的菌体形态；
图3为粪肠球菌E.faecalisYN771透射电子显微镜形态图；
图4为粪肠球菌E.faecalisYN771透射电子显微镜形态图；
图5为粪肠球菌E.faecalisYN771生长曲线图；
图6为透射电子显微镜下噬菌体PEf771形态；
图7为正常大鼠肝肾；
图8为正常大鼠胃肠道；
图9为低浓度病原菌E.faecalis YN771组SD大鼠胃脾韧带脓肿图；
图10为低浓度病原菌E.faecalis YN771组SD大鼠镰状韧带脓肿图；
图11为低浓度病原菌E.faecalis YN771组SD大鼠胃膈韧带脓肿图；
图12为低浓度病原菌E.faecalis YN771组SD大鼠肠系膜脓肿图；
图13为低浓度病原菌E.faecalis YN771组SD大鼠肾包膜脓肿图；
图14为低浓度病原菌E.faecalis YN771组SD大鼠后腹膜血管旁脓肿图；
图15为高浓度病原菌E.faecalis YN771组SD大鼠脓性腹水图；
图16为高浓度病原菌E.faecalis YN771组SD大鼠小肠坏死图；
图17为滇南小耳猪牙根尖周各组牙颌骨组织HE染色，其中，A：空白组：开髓+消毒；B：实验组:开髓+消毒+接种病原菌YN771+噬菌体PEf771；C：对照组-2：开髓+根管治疗+接种病原菌YN771；D：对照组-1：开髓+消毒+接种病原菌YN771；
图18为滇南小耳猪牙根尖周各组牙颌骨组织CT，其中，1表示空白组(消毒组)：开髓+消毒。CT未发现根尖暗影，无根尖周炎形成；2表示对照组-1(消毒后感染组)：开髓+消毒+接种粪肠球菌。CT发现根尖暗影，根尖周炎形成；3表示对照组-2(根管治疗后感染组)：开髓+根管治疗+接种粪肠球菌。CT发现根尖暗影，根尖周炎形成。4表示实验组(消毒后感染+噬菌体)：开髓+消毒+接种粪肠球菌+噬菌体。CT未发现根尖暗影，无根尖周炎形成。；
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明所提供的菌株为粪肠球菌Enterococcus faecalis YN771，是从昆明医科大学附属延安医院口腔科再治疗根管内分离获得。已于2019年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCC NO:M2019275。
抗生素抗性平板的配制
将克林霉素加无菌蒸馏水溶解后，过滤除菌后备用。四环素加入乙醇溶解，四种抗生素贮存液的浓度均调整为10mg/mL。将已灭菌的四瓶BHI琼脂培养基冷却到50℃左右，分别加入四种抗生素，使得终浓度为10μg/mL。摇匀后倒平板，每皿20～30mL，待培养基冷却后，贴上标签，注明名称、批号、配制日期，置于4℃冰箱中保存，待用。
实施例1粪肠球菌的分离与鉴定
1、样本的采集
在患者治疗过程中完成再治疗根管内粪肠球菌样本的采集工作，具体的采集样本方法：整个操作过程保证严格无菌操作。首先用橡皮障隔离患牙，去除患牙冠部的充填体、去尽龋坏组织、暴露根管口，用3％过氧化氢液和25g/L次氯酸钠液交替清洁牙面，然后用GG钻和不锈钢K锉去除原根充物(注意：这一过程不使用任何化学溶剂)。再用根管测量仪测定根管工作长度，接着用生理盐水冲洗根管去除残留的根充物并使根管保持湿润状态，最后将干燥无菌纸尖插入根管并达到工作长度，停留60s后将纸尖转至BHI液体培养基内，尽快将样本送至实验室。
2、致病菌的分离及培养
先将装有样本的试管振荡均匀，37℃，150rpm，有氧条件下孵育24h后观察，如果培养基变浑浊，证明培养基中有细菌生长；如果培养基清亮或者颜色无变化则认为培养基中无细菌生长，阴性结果。
取培养基变浑浊的阳性结果样本，用接种环蘸取少量液体在克林霉素抗性固体培养基上划线，37℃，150rpm恒温培养24h。最终从克林霉素抗性平板上分离出一株粪肠球菌。利用16S rRNA基因序列分析法鉴定细菌。
3、该菌株的16s rDNA基因序列测定结果如下(SEQ-1)：
TGGCCATCATCCACCTTAGGCGGCTGGCTCCAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGGCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAGAAGCTTTAAGAGATTTGCATGACCTCGCGGTCTAGCGACTCGTTGTACTTCCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCGCTAGAGTGCCCAACTAAATGATGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTTTGTCCCCGAAGGGAAAGCTCTATCTCTAGAGTGGTCAAAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTTGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGATACCGTCAGGGGACGTTCAGTTACTAACGTCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAGTTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCGGTCAGACTTTCGTCCATTGCCGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTATGCATCGTGGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCACCGCGGGTCCATCCATCAGCGACACCCGAAAGCGCCTTTCACTCTTATGCCATGCGGCATAAACTGTTATGCGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATCCCCCTCTGATGGGTAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCACTCCTCTTTCCAATTGAGTGCAAGCACTCGGGAGGAAAGAAGCGTTCGACTTGCATGTATAGCACCCCCCCTTT
实施例2E.faecalis YN771的生物学特性
1、致病菌的形态观察
经抗生素抗性平板培养，在克林霉素抗性培养基上发现6个菌落，各菌落的形态均一致，每个菌落直径约0.5～1.0mm，呈圆形，菌落不透明，灰白色、表面光滑。将6个菌落分别经三次划线纯化后转接至新的抗性平皿上均能生长，随机挑取其中的一个单菌落接种至液体培养基中振荡培养，待菌液处于对数生长期时，取100μL梯度稀释后涂板，37℃恒温孵育24h后，菌落形态见图1。光学显微镜下经革兰氏染色的菌体形态如图2所示，圆形或椭圆形，呈链状排列，为G+菌。透射电镜观察到细菌无芽胞，无鞭毛，直径0.9～1.1μm，见图3、图4。
2、E.faecalis YN771的生长温度范围
将E.faecalis YN771接种到新鲜BHI固体平板上，置于不同温度的恒温培养箱中过夜培养24h，观察记录E.faecalis YN771生长状况，见表1。从实验结果可以看出，E.faecalis YN771生长温度范围在20～42℃，最适温度约为37℃。
表1E.faecalis YN771在不同温度下的生长情况
Figure BDA0002164133440000071
－：不可生长或者不可感染；*：生长不好；+：可生长；++：生长较好2、E.faecalisYN771的生长曲线
通过吸光度法测定E.faecalis YN771的生长情况，并根据吸光度绘制了该菌的生长曲线，扩大培养不同时间段测得吸光度值，根据吸光度值制得吸光度变化曲线，如图5。E.faecalis YN771的吸光度值随着时间的延长而不断上升。宿主菌按1％的接种量，在37℃培养箱中培养160min进入对数生长期，对数生长期维持时间较短，大约有80min，培养240min进入到平台期。
实验例3粪肠球菌噬菌体的分离、纯化
1、宿主菌的准备：以粪肠球菌E.faecalis YN771作为分离噬菌体的宿主菌，该菌株于2019年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019275，将粪肠球菌YN771，在BHI固体培养基上划线，37℃恒温孵育24h，然后挑取单菌落接种于5mLBHI液体培养基中，培养至对数生长早期OD600为0.3，供分离粪肠球菌噬菌体用。
2、噬菌体的分离：以分离的培养至对数生长早期OD600为0.3的粪肠球菌YN771为宿主菌，从昆明医科大学附属延安医院口腔科污水口取回的未经氯水处理的污水为样本，两者富集培养，4℃，10,000rpm离心10min，收集上清液，用0.45μm无菌滤膜抽滤，再用0.22μm无菌滤膜过滤，收集滤液。将过滤液7倍稀释，从每个稀释梯度中分别取100μL与300μL宿主菌液混合，放置37℃恒温箱中静止吸附10min，然后加入冷却至40℃、琼脂浓度为0.75％的BHI半固体培养基5mL，混匀后快速的倾倒于普通BHI固体培养基上，形成双层平板。超净工作台下静置15min，使其充分凝固，倒置于37℃恒温箱静置培养。12h后，观察到BHI双层平板上长出边缘清晰的噬菌斑，见图6。
3、噬菌体的纯化：以分离的培养至对数生长早期OD600为0.3的粪肠球菌YN771为宿主菌，用无菌棒挑取噬菌体单个噬菌斑，接种到处于宿主菌液中，37℃，150rpm。取混合物10,000rpm离心10min，收集上清液，先用0.45μm微孔滤膜抽滤，再用0.22μm无菌微孔滤膜过滤。采用双层琼脂平板法分离噬菌体，将过滤液十倍稀释，从每个稀释梯度中分别取100μL与300μL宿主菌液混合，放置37℃恒温箱中静止吸附10min，然后加入冷却至40℃、琼脂浓度为0.75％的BHI半固体培养基5mL，混匀后快速的倾倒于新鲜BHI固体培养基上，形成双层平板。实验重复三次以上纯化，当看到双层平板上形成形态大小均一的噬菌斑时，将最后一次得到的单个噬菌斑取出，接种到宿主菌液中，37℃，150rpm过夜振荡培养。取混合物10,000rpm离心10min，收集上清液，先用0.45μm微孔滤膜抽滤，再用0.22μm无菌微孔滤膜过滤，得到的即为噬菌体原液，4℃保存备用。
实施例4建立SD大鼠粪肠球菌E.faecalis YN771腹腔感染模型
1、SD大鼠准备：
SD大鼠购买后，先喂养3天，观察大鼠的精神状态及生理状态，如饮食、大小便、毛发、皮肤巩膜等。手术器械常规高温消毒。
2、病原菌E.faecalis YN771菌悬液和病原菌E.faecalis YN771菌悬液+噬菌体混合液的准备：
1)取保存在4℃的E.faecalis YN771菌悬液按1％的接种量接种至5mL的新鲜BHI液体培养基中，3管，37℃，150rpm，过夜培养。
2)次日在1200mL BHI培养基中加入1％的接种量，37℃，150rpm，培养2h左右，测OD600＝0.3时，停止培养，分成两份，每份600mL，取出600mL E.faecalis YN771菌悬液，按最佳感染复数(噬菌体：菌＝1)加入2.4mL滴度为1.3×1010pfu/mL噬菌体PEf771，混匀。根据MOI＝1计算病原菌E.faecalis YN771与噬菌体PEf771的体积。
3)将600mL液1(菌悬液)和600mL液2(菌悬液+噬菌体混合液)37℃恒温箱内静置培养10min后取出，将两瓶液体10,000g离心15min后弃上清，用新鲜BHI液体洗涤2遍后用新鲜BHI液体重悬使得终体积为每瓶3mL。
4)重悬后E.faecalis YN771浓菌为9.6×1011cfu/mL，稀释15倍的菌为6.4×1010cfu/mL。实验中把9.6×1011cfu/mL浓度的病原菌E.faecalis YN771定义为高浓度E.faecalis YN771菌悬液，把6.4×1010cfu/mL浓度的病原菌E.faecalis YN771定义为低浓度E.faecalis YN771菌悬液。
5)每只SD大鼠注射0.5mL。
3、SD大鼠分组
(1)空白组(n＝5)：即SD大鼠腹腔内注射BHI培养基。
(2)病原菌E.faecalis YN771组(E.faecalis组)(n＝10):
1)高浓度病原菌E.faecalis YN771组(H-E.faecalis组)(n＝5)即SD大鼠腹腔内注射高浓度的病原菌E.faecalis YN771(9.6×1011cfu/mL)0.5mL。
2)低浓度病原菌E.faecalis YN771组(L-E.faecalis组)(n＝5)即SD大鼠腹腔内注射低浓度的病原菌E.faecalis YN771(6.4×1010cfu/mL)0.5mL。
(3)病原菌E.faecalis YN771+噬菌体PEf771组(n＝10)(E.faecalis+phage组):
1)高浓度病原菌E.faecalis YN771+噬菌体PEf771组(H-E.faecalis+phage组)(n＝5)即SD大鼠腹腔内注射液2(菌悬液+噬菌体混合液)0.5mL。
2)低浓度病原菌E.faecalis YN771+噬菌体PEf771组(L-E.faecalis+phage组)(n＝5)即SD大鼠腹腔内注射稀释15倍的液2(菌悬液+噬菌体混合液)0.5mL。
4、SD大鼠腹腔感染模型的建立
术前SD大鼠禁食12h，禁饮6h，3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(麻醉剂量为1mL/Kg)。手术过程中根据SD大鼠的麻醉状态适量加用戊巴比妥钠。首先穿刺部位给予常规碘伏消毒。然后取剑突下4cm腹正中偏左0.5cm注射各实验组试剂。术后SD大鼠正常饮食、饮水。密切观察大鼠饮食、饮水量、精神状态、毛发色泽。
5、手术情况及手术后动物生存状况
高浓度病原菌E.faecalis YN771组SD大鼠8h内全部死亡，其余各组均无SD大鼠死亡。从SD大鼠麻醉到采血完毕时间平均为8min。探查腹腔时间平均为4min，从麻醉到腹腔探查完毕整个手术过程平均为15min，见表2。
表2各组SD大鼠生存状况
Figure BDA0002164133440000101
6、样本解剖及术中观察
正常SD大鼠腹腔内光滑整洁，少量清亮腹水，胃肠道颜色淡红，无粘连，肝脏颜色鲜红，质地较软，分叶明显，双肾红褐色，见图7和图8。空白组SD大鼠腹腔接近正常大鼠，腹腔内光滑整洁，无粘连，少量清亮腹水，胃肠道颜色淡红，肝脏颜色鲜红，质地较软，双肾红褐色；低浓度病原菌E.faecalis YN771组SD大鼠均存活72h，腹腔内可以见到肝韧带、肠系膜、肝包膜、肾包膜等多处均有包裹性脓肿形成，见图9-14，腹水清亮，较空白组稍多，胃肠道颜色正常，肝脏颜色鲜红，体积正常；双肾颜色、体积正常；高浓度病原菌E.faecalisYN771组SD大鼠8h内全部死亡。腹腔内可以见到血性腹水，胃肠道颜色暗红、肿胀，刺激后蠕动差，肝脏颜色暗红，体积肿大；双肾暗红色，体积肿大，见图15和图16；高浓度和低浓度病原菌E.faecalis YN771+噬菌体PEf771组SD大鼠均存活72h，腹腔内光滑整洁，未见粘连，少量清亮腹水，胃肠道颜色淡红，蠕动正常；肝脏、双肾颜色、体积正常。
实施例5滇南小耳猪E.faecalis YN771感染根尖周炎模型的建立
第一步：建立空白组模型(开髓+消毒)
滇南小耳猪，体重20～30Kg，4～5月龄，无龋齿及牙周病。1％丙泊酚静脉麻醉耳静脉，手术过程中可根据麻醉效果及时间适量加量。麻醉满意后，取卧位，根据所开髓的牙齿取不同的体位，上颌牙取仰卧位，下颌牙取俯卧位。四肢固定于手术台上，助手协助抬起上颌，呈最大张口状，用球钻行开髓术，拔髓针拔除牙髓，次氯酸钠、双氧水交替冲洗根管，根管内放置Ca(OH)2糊剂消毒根管，氧化锌封闭洞口，整个过程保持无菌操作。动物清醒后正常喂养2周，建立空白组模型。
第二步：建立对照组模型
(1)建立对照组-1(消毒后感染组)模型：开髓+消毒+接种E.faecalis YN771。
方法：在空白组基础上，选择2颗牙齿，空白组模型建立2周后，再次麻醉固定小耳猪，碘伏消毒开髓牙，去除开髓口的氧化锌暂封物，行根管预备。先取出根管内的消毒糊剂，根管锉去除残余牙髓，次氯酸钠、双氧水交替冲洗，最后用生理盐水冲洗根管，并用无菌纸尖干燥根管，注射器注入0.1mL病原菌E.faecalis YN771菌悬液，窝洞用光固化松风玻璃离子充填。
(2)建立对照组-2(根管治疗后感染组)模型：开髓+根管治疗+接种E.faecalisYN771。
方法：在空白组基础上，选择2颗牙齿，空白组模型建立2周后，再次麻醉固定小耳猪，碘伏消毒开髓牙，去除开髓口的氧化锌暂封物，行根管预备。先取出根管内的消毒糊剂，根管锉去除残余牙髓，次氯酸钠、双氧水交替冲洗，最后用生理盐水冲洗根管，并用无菌纸尖干燥根管，根管预备后用牙胶尖严密填充根管，注射器注入0.1mL E.faecalis YN771菌悬液，窝洞用光固化松风玻璃离子充填。
第三步：建立实验组模型(消毒后再感染+噬菌体)：开髓+消毒+接种E.faecalisYN771+噬菌体PEf771
方法：在空白组基础上，选择2颗牙齿，空白组模型建立2周后，再次麻醉固定小耳猪，碘伏消毒开髓牙，去除开髓口的氧化锌暂封物，取出根管内的消毒糊剂，根管锉去除残余牙髓，次氯酸钠、双氧水交替冲洗，最后用生理盐水冲洗根管，并用无菌纸尖干燥根管，注射器注入0.1mL液2(菌悬液+噬菌体混合液)，窝洞用光固化松风玻璃离子充填。
术后滇南小耳猪正常饮食、饮水。密切观察滇南小耳猪饮食、饮水量、精神状态、毛发色泽。
第四步标本的收集
术后4周处死滇南小耳猪。切取含牙颌骨组织，剔除软组织。
第五步病理切片的制备
(1)固定将取下的含牙颌骨组织浸泡于4％多聚甲醛中固定。
(2)脱钙采用脱钙液进行脱钙
(3)组织块修整
(4)水洗水洗的目的是洗去渗入组织中的固定液，终止固定。以免影响对组织内结构的观察、分析和研究。
(5)脱水采用多个浓度的酒精进行脱水。
乙醇脱水过程如下：
Figure BDA0002164133440000121
(6)透明采用二甲苯透明。
第一次透明约15min
第二次时间根据第一次透明效果而定
(7)浸蜡浸蜡的目的是置换组织中的透明剂，为包埋做准备。
在60℃恒温蜡箱中放置3个蜡杯，取透明好的组织块放入蜡中各1h。
(8)包埋
在金属框中倒入蜡，然后用无齿镊子取组织块放入石蜡中，置好方向。
待蜡块完全凝固以后，便可拆卸包埋框架取出蜡块。
(9)石蜡切片制备
将切片刀装在切片机的刀架上并固定紧，固定蜡块底座或蜡块，调整蜡块与刀至合适位置，然后切片。
(10)烤片
切片在室温下稍微干燥后，放在60℃恒温烤箱中，烤干备用。
第六步含牙颌骨组织HE染色
1)切片常规脱蜡至水，65℃烤片2h。
2)二甲苯脱蜡处理2次，每次10min。
3)分别在95％、80％、70％乙醇脱水5min。
4)蒸馏水洗3min。
5)苏木素染色6min。
6)蒸馏水洗3min。
7)促染液2min。
8)蒸馏水洗3min。
9)伊红染色20s。
10)95％酒精洗3次，每次3min。
11)100％酒精洗3次，每次3min。
12)二甲苯洗2次，每次1min。
13)中性树胶封片。
第七步影像学检测
滇南小耳猪送昆明医科大学附属延安医院医学影像科CT室扫描头部结构，观察牙根尖周结构。
(1)各组HE染色
空白组(开髓+消毒组)与实验组(开髓+消毒+接种病原菌E.faecalis YN771+噬菌体PEf771组)显示牙及牙周组织基本正常，未见有明显的炎症细胞浸润，牙骨质未见破坏，牙骨质细胞排列整齐，牙骨质与牙周膜紧密结合。对照组-1(开髓+消毒+接种病原菌E.faecalis YN771组)见牙周膜与牙骨质之间的裂隙明显增宽，牙骨质吸收破坏，吸收区域牙骨质细胞增多，牙骨质局部增厚。对照组-2(开髓+根管治疗+接种病原菌E.faecalisYN771组)仅见到牙周膜与牙骨质之间的裂隙明显增宽，牙骨质完整，牙骨质细胞排列整齐，未见明显炎性细胞浸润，见图17。
(2)各组CT表现
从图中我们可知，在对照组-1(消毒后感染组)和对照组-2(根管治疗后感染组)中，CT根尖处可见暗影，有根尖周炎形成；空白组(消毒组)、实验组(消毒后感染+噬菌体)CT未发现根尖暗影，无根尖周炎形成，见图18。
SEQUENCE LISTING
<110> 昆明理工大学和昆明市延安医院
<120> 一株粪肠球菌及其应用
<130> 20190802
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1466
<212> DNA
<213> Enterococcus faecalis
<400> 1
tggccatcat ccaccttagg cggctggctc caaaaggtta cctcaccgac ttcgggtgtt 60
acaaactctc gtggtgtgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc 120
gtgctgatcc gcgattacta gcgattccgg cttcatgcag gcgagttgca gcctgcaatc 180
cgaactgaga gaagctttaa gagatttgca tgacctcgcg gtctagcgac tcgttgtact 240
tcccattgta gcacgtgtgt agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc 300
caccttcctc cggtttgtca ccggcagtct cgctagagtg cccaactaaa tgatggcaac 360
taacaataag ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac 420
gacaaccatg caccacctgt cactttgtcc ccgaagggaa agctctatct ctagagtggt 480
caaaggatgt caagacctgg taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc 540
accgcttgtg cgggcccccg tcaattcctt tgagtttcaa ccttgcggtc gtactcccca 600
ggcggagtgc ttaatgcgtt tgctgcagca ctgaagggcg gaaaccctcc aacacttagc 660
actcatcgtt tacggcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgtttgctcc ccacgctttc 720
gagcctcagc gtcagttaca gaccagagag ccgccttcgc cactggtgtt cctccatata 780
tctacgcatt tcaccgctac acatggaatt ccactctcct cttctgcact caagtctccc 840
agtttccaat gaccctcccc ggttgagccg ggggctttca catcagactt aagaaaccgc 900
ctgcgctcgc tttacgccca ataaatccgg acaacgcttg ccacctacgt attaccgcgg 960
ctgctggcac gtagttagcc gtggctttct ggttagatac cgtcagggga cgttcagtta 1020
ctaacgtcct tgttcttctc taacaacaga gttttacgat ccgaaaacct tcttcactca 1080
cgcggcgttg ctcggtcaga ctttcgtcca ttgccgaaga ttccctactg ctgcctcccg 1140
taggagtctg ggccgtgtct cagtcccagt gtggccgatc accctctcag gtcggctatg 1200
catcgtggcc ttggtgagcc gttacctcac caactagcta atgcaccgcg ggtccatcca 1260
tcagcgacac ccgaaagcgc ctttcactct tatgccatgc ggcataaact gttatgcggt 1320
attagcacct gtttccaagt gttatccccc tctgatgggt aggttaccca cgtgttactc 1380
acccgtccgc cactcctctt tccaattgag tgcaagcact cgggaggaaa gaagcgttcg 1440
acttgcatgt atagcacccc cccttt 1466

Claims (4)

1.一株用于分离粪肠球菌烈性噬菌体的粪肠球菌，其特征在于：该细菌被命名为粪肠球菌YN771，于2019年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019275；该噬菌体被命名为PEf771，于2019年4月19日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为:CCTCC NO:M 2019276，分类名称Enterococcus faecalis bacteriophage，该噬菌体对粪肠球菌有强的裂解作用。
2.如权利要求1所述的一株用于分离粪肠球菌烈性噬菌体的粪肠球菌，其特征在于：所述的粪肠球菌YN771用于建立SD大鼠粪肠球菌腹腔感染模型。
3.如权利要求1所述的一株用于分离粪肠球菌烈性噬菌体的粪肠球菌，其特征在于：所述的粪肠球菌YN771用于建立滇南小耳猪粪肠球菌感染根尖周炎模型。
4.如权利要求1所述的一株用于分离粪肠球菌烈性噬菌体的粪肠球菌，其特征在于：其分离特征包括以下步骤：(1)宿主菌的准备：以粪肠球菌YN771作为分离噬菌体的宿主菌，将粪肠球菌YN771，在BHI固体培养基上划线，32～40℃恒温孵育20～30h，然后挑取单菌落接种于5mL BHI液体培养基中，培养至对数生长早期OD为0.3，供分离粪肠球菌烈性噬菌体用；
(2)噬菌体的分离：以分离的培养至对数生长早期OD为0.3的粪肠球菌YN771为宿主菌，从昆明医科大学附属延安医院口腔科污水口取回的未经氯水处理的污水为样本，两者富集培养，2～8℃，8000～11,000rpm离心9～12min，收集上清液，用0.40～0.48μm无菌滤膜抽滤，再用0.20～0.24μm无菌滤膜过滤，收集滤液，将过滤液7倍稀释，从每个稀释梯度中分别取80～130μL与280～320μL宿主菌液混合，放置32～40℃恒温箱中静止吸附12～15min，然后加入冷却至40℃、琼脂浓度为0.75％的BHI半固体培养基4～8mL，混匀后快速的倾倒于普通BHI固体培养基上，形成双层平板，超净工作台下静置12～18min，使其充分凝固，倒置于37℃恒温箱静置培养，10～13h后，观察到BHI双层平板上长出边缘清晰的噬菌斑；
(3)噬菌体的纯化：以分离的培养至对数生长早期OD为0.3的粪肠球菌YN771为宿主菌，用无菌棒挑取噬菌体单个噬菌斑，接种到宿主菌液，32～40℃，120～170rpm，培养10～24h，取混合物8000～11,000rpm离心9～12min，收集上清液，先用0.40～0.48μm微孔滤膜抽滤，再用0.20～0.24μm无菌微孔滤膜过滤，采用双层琼脂平板法分离噬菌体，将过滤液7倍稀释，从每个稀释梯度中分别取80～130μL与280～320μL宿主菌液混合，放置32～40℃恒温箱中静止吸附12～15min，然后加入冷却至40℃、琼脂浓度为0.75％的BHI半固体培养基4～8mL，混匀后快速的倾倒于新鲜BHI固体培养基上，形成双层平板，实验重复三次以上纯化，当看到双层平板上形成形态大小均一的噬菌斑时，将最后一次得到的单个噬菌斑取出，接种到宿主菌液中，于32～40℃，120～170rpm过夜振荡培养，取混合物8000～11,000rpm离心9～12min，收集上清液，先用0.40～0.48μm微孔滤膜抽滤，再用0.20～0.24μm无菌微孔滤膜过滤，得到的即为噬菌体原液，4℃保存备用；
(4)噬菌体的富集：以分离的培养至对数生长早期OD为0.3的粪肠球菌YN771为宿主菌，加入效价为108pfu/mL的噬菌体原液12～18mL，放置32～40℃恒温箱中静止吸附9～12min，32～40℃120～170rpm，培养10～24h，将混合液8000～11,000rpm离心9～12min，收集上清液，除菌； 十倍稀释至10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7备用，在超净工作台中取出4mL高温灭菌后的EP管，加入各个稀释梯度的噬菌体80～130μL，每管中分别加入280～320μL的对数生长早期OD为0.3的粪肠球菌YN771，做好编号标记，在37℃恒温箱中静止吸附9～12min，得到的即为噬菌体富集液。
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