CN103667230A - 一种粪肠球菌噬菌体裂解酶及其编码基因与应用 - Google Patents

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张文惠
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李玉元
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范华昊
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Abstract

本发明公开了一种粪肠球菌噬菌体裂解酶及其编码基因与应用。本发明所提供的粪肠球菌噬菌体裂解酶是如下a）或b）的蛋白质：a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有具有裂解粪肠球菌功能的由序列1衍生的蛋白质。实验证明，该裂解酶蛋白能够裂解多种粪肠球菌，可与敏感菌特异性紧密结合。另外，动物实验表明该裂解酶对于粪肠球菌所导致的感染具有较好的治疗效果，在感染后及时有效的给药对于降低小鼠死亡率有一定意义。本发明为耐药粪肠球菌的抗生素替代疗法打下了基础。

Description

一种粪肠球菌噬菌体裂解酶及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种粪肠球菌噬菌体裂解酶及其编码基因与应用。
背景技术
粪肠球菌又叫粪链球菌，为革兰氏阳性菌。根据兰氏（Lancefield）血清学分类，可将链球菌分成许多个群，而粪肠球菌属于其中的D群。D群链球菌又分为肠球菌和非肠球菌，其中肠球菌包括粪肠球菌（S.faecalis）、屎肠球菌（S.faecium）和坚忍肠球菌（S.durans）。近年来，通过DNA-DNA杂交分析发现肠球菌与链球菌属间的同源性较低，故将肠球菌分出，另立为肠球菌属。与人类感染疾病有关的肠球菌为粪肠球菌（E.faecalis）和屎肠球菌（E.faecium），其中粪肠球菌占90-95%。粪肠球菌形态呈圆形或椭圆形，可顺链的方向延长，直径为0.5-1.0um，大多数呈双或呈短链状排列，一般不运动。在营养丰富的培养基上，其菌落大而光滑，直径1-2mm。其营养要求低，在普通营养琼脂培养基上也可生长。粪肠球菌对环境有极强的抵抗能力，能在10℃或45℃的PH值为9.6或NaCl浓度达6.5%的肉汤培养基中生长，可在65℃环境下存活30min。
粪肠球菌是人或动物肠道、口腔和生殖道的正常菌群，正常情况下，共生的粪肠球菌对宿主没有致病性。当其异位寄生时可引起败血症、尿路感染、化脓性腹部感染和心内膜炎等疾病，尤其在获得了毒力因子或较高水平的抗生素抗性之后，可导致严重的细菌感染性疾病，是仅次于葡萄球菌的院内感染革兰氏阳性球菌。
20世纪70年代，肠球菌主要表现为氨基糖苷类抗生素耐药，随着抗生素的不断更新换代，首例耐万古霉素肠球菌（VRE）在1986年被发现，90年代以来，抗菌药物应用的普遍化、头孢菌素类和氟喹诺酮类药物的过度使用以及介入性治疗等因素，导致耐药肠球菌所致感染病例不断增加。近年来，伴随着院内感染率的上升，粪肠球菌的耐药范围愈加扩大。万古霉素曾被认为是对付耐药菌的最后一道防线，但随着耐万古霉素粪肠球菌的频繁出现及该种抗性在菌株间的迅速传播，对人类的健康已经造成严重威胁，也向临床治疗耐药粪肠球菌提出了极大的挑战。
随着抗生素的滥用现象日益严重，细菌的耐药性问题日益加剧，新抗生素的研发速度远远赶不上耐药菌的产生速度，寻找新的抗菌制剂刻不容缓。而噬菌体及其裂解酶因其高效的杀菌能力及高度的宿主专一性而成为新一代抗菌制剂的候选之一，对于噬菌体及其裂解酶的研究在近些年被许多研究者提上日程。
噬菌体是一类以微生物（包括细菌、真菌、放线菌或螺旋体等）为宿主的病毒，没有细胞结构，仅由衣壳蛋白和其内部的遗传物质组成，必须依赖宿主进行复制和增殖。噬菌体是细菌的天然杀手，广泛存在于自然界中，是自然界中数量最大的生物类群，有人估计自然界中存在1030-1032株、上亿种不同型别的噬菌体。
相对于传统的抗生素治疗细菌感染，噬菌体治疗具有其独特的优势：能自我扩增，消灭病原菌之后自我死亡；特异性强，只针对特定的病原菌，对人体、动植物和环境没有任何毒副作用等。
除了活噬菌体制剂，来源于噬菌体的裂解酶也是防治细菌性疾病的另一种手段。噬菌体裂解酶在噬菌体裂解细菌的过程中水解细菌细胞壁肽聚糖，从而破坏细胞壁释放子代噬菌体，作为潜在的新型杀菌剂，它具有抗生素所无法比拟的优势。噬菌体裂解酶的杀菌机制与抗生素完全不同，细菌的细胞壁肽聚糖结构在细菌的进化过程中十分保守，因此裂解酶导致细菌耐药性的可能性远小于抗生素。
发明内容
本发明的目的是提供一种粪肠球菌噬菌体裂解酶及其编码基因与应用。
本发明所提供的粪肠球菌噬菌体裂解酶，名称为Lysin-EF1，来源于粪肠球菌噬菌体（Enterococcus faecalis bacteriophage）IME-EF1，具体可为如下（a）或（b）：
（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有具有裂解粪肠球菌功能的由序列1衍生的蛋白质。
上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。
其中，序列表中序列1由237个氨基酸残基组成。
编码所述Lysin-EF1蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。
所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
在本发明的一个实施例中，所述核酸分子是编码所述Lysin-EF1蛋白的基因（命名为Lysin-EF1基因）；所述Lysin-EF1基因具体可为如下1）至4）中任一所述的DNA分子：
1）编码序列为序列表中序列2所示的DNA分子；
2）序列表中序列2所示的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码所述Lysin-EF1蛋白的DNA分子；
4）与1）或2）或3）限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述Lysin-EF1蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。
其中，序列2由714个核苷酸组成，整个序列2为编码序列（CDS），编码序列表中序列1所示的Lysin-EF1蛋白。
含有所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
在本发明的实施例中，所述重组表达载体中启动所述Lysin-EF1基因转录的启动子具体为cspA启动子。
更为具体的，所述重组表达载体为在pCold I载体的多克隆位点（如Xba I和BamHI）之间插入所述Lysin-EF1基因后得到的重组质粒（命名为pCold I-Lysin-EF1）。
所述表达盒由能够启动所述Lysin-EF1基因表达的启动子，所述Lysin-EF1基因，以及转录终止序列组成。
所述Lysin-EF1蛋白，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌，在如下a1）-a4）任一中的应用也属于本发明的保护范围：
a1）制备裂解粪肠球菌的产品；
a2）制备裂解屎肠球菌的产品；
a3）制备用于治疗由粪肠球菌感染引起的疾病的产品；
a4）制备用于治疗由屎肠球菌感染引起的疾病的产品。
本发明的另一个目的是提供一种活性成分为所述Lysin-EF1蛋白的如下任一产品：
b1）裂解粪肠球菌的产品；
b2）裂解屎肠球菌的产品；
b3）用于治疗由粪肠球菌感染引起的疾病的产品；
b4）用于治疗由屎肠球菌感染引起的疾病的产品。
在所述应用，或所述产品中，所有的所述粪肠球菌均可为如下4种中的至少一种：粪肠球菌（Enterococcus faecalis）002、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）255、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）281和粪肠球菌（Enterococcus faecalis）284。
在所述应用，或所述产品中，所有的所述屎肠球菌均可为屎肠球菌（Enterococcusfaecium）010。
以上所有的所述产品均可为药物。
在本发明的一个实施例中，所述Lysin-EF1蛋白具体是按照如下方法制备得到的：将所述Lysin-EF1蛋白编码基因（序列2）插入到pCold I载体的多克隆位点Xba I和BamHI之间后表达得到所述Lysin-EF1蛋白。
本发明分离出一株粪肠球菌噬菌体IME-EF1，并从中克隆得到了裂解酶蛋白Lysin-EF1的编码基因。实验证明，该裂解酶蛋白Lysin-EF1能够裂解多种粪肠球菌，可与敏感菌特异性紧密结合。另外，动物实验表明该裂解酶蛋白Lysin-EF1对于粪肠球菌所导致的感染具有较好的治疗效果，在感染后及时有效的给药对于降低小鼠死亡率有一定意义。本发明为耐药粪肠球菌的抗生素替代疗法打下了基础。
附图说明
图1为以粪肠球菌（Enterococcus faecalis）002为指示菌分离粪肠球菌噬菌体。其中，A为以粪肠球菌002从医院污水中分离出的噬菌体，1：噬菌体原液（箭头所示处为噬菌斑），2：PBS缓冲液；B为粪肠球菌噬菌体原液107倍稀释后噬菌斑实验结果（图中黑色点状区域为噬菌斑）。
图2为限制性内切酶Nhe I消化粪肠球菌噬菌体IME-EF1基因组结果。其中，M：BMD1Kb Marker；1：酶切后基因组；2：未处理基因组。
图3为粪肠球菌噬菌体IME-EF1的一步生长曲线。
图4为电子显微镜观察粪肠球菌噬菌体IME-EF1形态。其中，A放大倍数：×30.0k；B放大倍数：×100k。
图5为连接产物转化后的单克隆菌落PCR产物鉴定结果。其中，M、M’：BMD2000bp Marker；1-8：连接产物转化后的单克隆菌落PCR产物（扩增出目的条带的1、3、4、5、8为阳性克隆）。
图6为Lysin-EF1蛋白的SDS-PAGE鉴定结果。其中，A为全菌液，1：阴性对照（空表达载体）；2：未加IPTG诱导；3：IPTG诱导后全菌液；M：Takara Blue plus proteinMarker。B为超声后沉淀或上清，1：超声后上清；2：超声后沉淀；3：超声前上清；4：未加IPTG诱导菌液超声后上清；5：未加IPTG诱导菌液超声后沉淀；6：未加IPTG诱导菌液超声后上清；M和M’：Takara Blue plus protein Marker。图中，箭头所示处为Lysin-EF1蛋白。
图7为点滴法测定Lysin-EF1蛋白的裂解酶活性，供试菌为粪肠球菌002。图中箭头所示位置为噬菌斑。
图8为浊度法测定Lysin-EF1蛋白的裂解酶活性及裂解谱。
图9为各供试菌与Lysin-EF1蛋白混合并离心，ELISA检测上清中未与细菌结合的Lysin-EF1蛋白。其中，1为粪肠球菌002；2为屎肠球菌064；3为屎肠球菌065；4为屎肠球菌081；5为纯化后的Lysin-EF1蛋白溶液（内参）。
图10为各供试菌离心后上清的Western blot检测结果。其中，1：纯化后的Lysin-EF1蛋白溶液（内参）；2：粪肠球菌002离心后上清；3：粪肠球菌281离心后上清；4：金黄色葡萄球001菌离心后上清；5：金黄色葡萄球037离心后上清。图中，箭头所示位置为Lysin-EF1蛋白。
图11为粪肠球菌噬菌体IME-EF1及Lysin-EF1蛋白治疗效果对比及时间依赖性分析结果，具体为小鼠尾静脉血液细菌平板计数结果（n＝6；p≤0.05）。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1、菌株及质粒
粪肠球菌（Enterococcus faecalis）002、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）255、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）281和粪肠球菌（Enterococcus faecalis）284：见文献“张文慧,安小平,范航等.一株粪肠球菌噬菌体的分离及其生物学特性研究.生物技术通讯,24(4):484-487”。
屎肠球菌（Enterococcus faecium）010、屎肠球菌（Enterococcus faecium）064、屎肠球菌（Enterococcus faecium）065、屎肠球菌（Enterococcus faecium）081和屎肠球菌（Enterococcus faecium）106：见文献“张文慧,安小平,范航等.一株粪肠球菌噬菌体的分离及其生物学特性研究.生物技术通讯,24(4):484-487”。
金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）001、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocusaureus）037、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）069和金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）091：见文献“张文慧,安小平,范航等.一株粪肠球菌噬菌体的分离及其生物学特性研究.生物技术通讯,24(4):484-487”。
大肠杆菌感受态细胞DH5α和M15：均购自北京博迈德生物技术有限公司。
表达载体pCold I：购自Takara公司，产品目录号：#3360_3364。
pEASY-Blunt simple载体：购自全式金公司，产品目录号：CB111。
2、培养基和试剂
BHI培养基：BHI（Brain Heart Infusion，购自美国BD医疗器械有限公司）37g，加水800ml，定容至1L。制作半固体培养基时加入0.75%（0.75g/100mL）琼脂粉；制作固体平板时加入1.5%（1.5g/100mL）琼脂粉。121℃高压灭菌20min。
SM缓冲液：氯化钠5.8g，硫酸镁2.0g，1mol/L Tris-HCl50ml，2%（2g/100ml）明胶5ml，pH7.5，加水定容至1L。
酚：氯仿：异戊醇液（体积比25:24:1）：购自北京索莱宝科技有限公司。
PEG6000（聚乙二醇6000）：购自美国AMRESCO公司。蛋白酶K、RNase、Dnase：购自Fermentas公司。所用限制性内切酶均购自NEB公司。DNA Marker和ProteinMarker均购自北京博迈德生物技术有限公司。PCR产物纯化回收试剂盒购自QIAGEN公司。质粒小提试剂盒购自北京博迈德生物技术有限公司。生理盐水（氯化钠注射液）购自石家庄四药有限公司。
实施例1、粪肠球菌噬菌体IME-EF1的分离和鉴定
一、粪肠球菌噬菌体的分离
利用粪肠球菌（Enterococcus faecalis）002作为指示菌，从医院污水中分离噬菌体，具体步骤如下：
（1）污水预处理：从中国人民解放军307医院污水处理站取来未经任何消毒处理的污水，10000rpm离心10min，收集上清，用0.45um微孔滤膜过滤处理后，收集滤液；
（2）将粪肠球菌（Enterococcus faecalis）002甘油菌于固体BHI培养基上划线，37℃过夜培养；
（3）挑取单克隆接种于BHI培养基，于摇床内220rpm，37℃培养至对数生长期，加入100μl污水滤液后于37℃震荡过夜培养，而后于10000rpm离心10min，收集上清，并用0.45μm滤器过滤处理，所得滤液即为噬菌体原液。
（4）点滴法验证：将500μl对数生长期的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）002菌液加入55℃的5ml BHI半固体培养基中，适当吹吸混匀后倒入下层BHI培养基平板上，静置于水平台面10min，待上层半固体培养基完全凝固后分别在平板的两个区域内点滴1.5μl的噬菌体原液和1.5μl的PBS缓冲液，倒置于37℃培养，10h后观察结果。
结果如图1中A所示，将铺有粪肠球菌（Enterococcus faecalis）002指示菌的双层平板划分为两个区域，其中区域1中点滴1.5μl噬菌体原液，区域2点滴1.5μl PBS缓冲液，可见滴有噬菌体原液的区域1出现透亮的圆形噬菌斑，即所分离出的噬菌体原液对指示菌有裂解能力。
二、噬菌体效价的测定
噬菌体效价，又称噬菌体的滴度，为每毫升样品中所含有的噬菌体个数，可通过双层平板法测定。具体测定方法如下：
（1）将噬菌体原液用BHI培养基倍比稀释102-107倍，分别取100μl与500μl对数生长期的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）002指示菌混合，室温静置15min；
（2）分别将上述混合悬液加入5ml55℃BHI半固体培养基中，适当吹吸混匀后倒入下层BHI培养基平板上，静置于水平台面10min，待上层半固体凝固后倒置放入37℃温箱培养10h；
（3）观察噬菌斑并按照不同稀释倍数平板上的噬菌斑个数来计算噬菌体的滴度。
结果显示，双层琼脂平板培养3h开始出现噬菌斑，5h后得到如图1中A所示结果，噬菌斑透亮且边缘清晰，直径1.5mm左右，107倍稀释的平板上长出85个噬菌斑，可计算得到噬菌体效价约为8.5×109pfu/ml。
三、噬菌体的纯化与浓缩
1、噬菌体的纯化
（1）用高压灭菌后的移液器吸头挑取单个噬菌斑，接种到对数生长期的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）002菌液中，37℃震荡培养至菌液被裂解至澄清，10000rpm离心10min后收集上清，并用0.45μm滤器过滤收集滤液；
（2）将滤液梯度稀释，与对数生长期的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）002混合，铺双层平板，在适当的梯度获得噬菌斑；
（3）重复上面两个步骤3次，将最后一次获得的单个噬菌斑与对数生长期的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）002混合震荡培养至菌液澄清，10000rpm离心10min后过滤，将滤液储存于4℃。
将步骤（3）最终得到的其中一种纯化后噬菌体命名为粪肠球菌噬菌体IME-EF1。
2、噬菌体的大量培养
（1）将粪肠球菌（Enterococcus faecalis）002接种于BHI培养基，于37℃200rpm培养过夜；
（2）分别取50μl过夜培养的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）002加入3管5ml新鲜的BHI培养基中，分别标示1、2、3，于37℃震荡培养至OD600达到0.4；
（3）向管1中加入100μl步骤1得到的粪肠球菌噬菌体IME-EF1滤液，继续于37℃培养至菌液完全裂解；将管2中的菌液加入500ml新鲜的BHI培养基中，37℃培养至对数期；管3为管1的对照组，加入100μl BHI培养基，并于37℃震荡培养，用于判断管1内菌液被裂解的程度；
（4）将管1内悬液于10000rpm离心10min，收集上清，加入已培养至对数期的500ml粪肠球菌（Enterococcus faecalis）002菌液中，37℃震荡培养过夜，使细菌完全裂解。
3、噬菌体的浓缩
采用PEG沉淀的方法进行噬菌体的浓缩，具体步骤如下：
（1）向步骤2得到的500ml粪肠球菌噬菌体IME-EF1裂解培养物中加入29.2g固体NaCl至终浓度1mol/L，于室温用磁力搅拌器搅拌至其完全溶解后，静置于冰水浴1h；
（2）于4℃，10000rpm离心10min，收集上清，并测定上清体积；
（3）根据上清体积加入适量固体PEG8000至终浓度为10%（m/v，如500ml上清加入50g PEG8000），室温下搅拌器搅拌至其完全溶解；
（4）将上述溶液分装于离心管中，并配平，静置于冰水浴中至少1h，以使噬菌体颗粒充分沉淀；
（5）于4℃，10000rpm离心10min，去上清，将离心管倾斜倒置5min，以使管内剩余的液体充分流干，也可用移液器吸去残余液体；
（6）用移液器吸取适量SM缓冲液重悬噬菌体沉淀；
（7）向悬液中加入等体积的氯仿，并温和震荡30s以充分混匀，3000rpm离心15min，分离有机相与亲水相，从而去除含有PEG和细胞碎片的有机相，回收含粪肠球菌噬菌体IME-EF1颗粒的亲水相。
四、粪肠球菌噬菌体IME-EF1的基因组的提取及鉴定
1、提取噬菌体基因组
采用蛋白酶K/SDS的方法提取噬菌体的基因组，具体方法如下：
（1）向200μl已纯化的粪肠球菌噬菌体IME-EF1悬液中分别加入蛋白酶K至终浓度为50μg/ml、SDS至终浓度0.5%（w/v）、EDTA至终浓度20mM，56℃温育1h；
（2）向上述混合液中加入等体积的饱和酚，温和颠倒混匀后10000rpm离心5min，吸取上层水相至一新离心管；
（3）加入等体积的酚：氯仿：异戊醇液（体积比25:24:1），轻柔混匀后10000rpm离心5min，将上层水相移至新离心管中；
（4）加入等体积氯仿，充分混匀后10000rpm离心5min，移上层水相至新离心管中；
（5）重复上一步骤至上层水相无苯酚气味；
（6）加入等体积异丙醇，于-20℃静置至少30min；
（7）12000rpm离心20min，弃上清；
（8）加1ml75%的乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min后弃上清，将离心管开口置于干净环境下至无乙醇气味；
（9）用20μl ddH2O溶解沉淀，储存于-20℃。
2、噬菌体基因组的鉴定
取1μl步骤1获得的粪肠球菌噬菌体IME-EF1基因组溶液，加入限制性内切酶NheI配制20μl酶切体系，于37℃温育2h，0.8%琼脂糖凝胶电泳观察条带。
酶切处理结果如图2所示，从图中可以看出，粪肠球菌噬菌体IME-EF1基因组经限制性内切酶NheI消化后电泳条带呈抹带，说明粪肠球菌噬菌体IME-EF1的遗传物质可被限制性内切酶片段化，得出其遗传物质是双链DNA(dsDNA)。
五、粪肠球菌噬菌体IME-EF1的生物学特性鉴定
1、噬菌体的最佳感染复数
感染复数（MOI，multiplicity of infection），其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。而最佳感染复数，即是可使噬菌体获得最佳生长状态时的感染复数。具体测定方法为：
（1）按MOI分别为0.01、0.1、1、10、100混合粪肠球菌噬菌体IME-EF1悬液和粪肠球菌（Enterococcus faecalis）002宿主菌悬液，加入新鲜的BHI培养基补足体积至5ml，于37℃震荡培养6h；
（2）10000rpm离心1min，分别用0.45μm滤器过滤；
（3）梯度稀释后，双层平板法测定噬菌体滴度，其中噬菌体滴度最高的MOI即为最佳感染复数。
按表1所示加入粪肠球菌噬菌体IME-EF1和粪肠球菌（Enterococcus faecalis）002宿主菌培养6h后，分别测定各管中噬菌体滴度。可见当MOI=1时噬菌体滴度最高，可以得出噬菌体IME-EF1的最佳感染复数为1。
表1噬菌体IME-EF1最佳感染复数的测定
管编号 宿主菌数量 噬菌体数量 MOI 6h时滴度（pfu/ml）
1 1.0×106 1.0×104 0.01 5.0×105
2 1.0×106 1.0×105 0.1 1.9×107
3 1.0×106 1.0×106 1 8.3×108
4 1.0×106 1.0×107 10 3.9×108
5 1.0×106 1.0×108 100 1.4×108
2、噬菌体的一步生长曲线
一步生长曲线（One-step growth curve）是可定量描述毒性噬菌体生长规律的实验曲线，用于研究噬菌体的复制情况。具体操作时将适量噬菌体接种于高浓度细菌培养物中以建立同步感染，以感染时间为横坐标，以噬菌体效价为纵坐标而绘制出的特征曲线即为一步生长曲线，分为潜伏期、裂解期和平稳期。通过绘制一步生长曲线，可以得出噬菌体的三个重要的特性参数：潜伏期、裂解期和裂解量。具体操作如下：
（1）将粪肠球菌（Enterococcus faecalis）002培养至对数生长期，取适量菌液倍比稀释后涂板，确定在此状态下每毫升菌液所含细菌个数；
（2）将粪肠球菌（Enterococcus faecalis）002接种至适量体积的新鲜BHI培养基，培养至对数期后离心并重悬于BHI培养基，使其浓度达到108细胞/ml，以感染复数MOI为1加入粪肠球菌噬菌体IME-EF1；
（3）室温静置2min后，加入新鲜的BHI培养基将其稀释10000倍，置于37℃震荡培养；
（4）自加入噬菌体开始计时，分别在5、10、20、25、30、40、50、60、90和120min时间点取样，并测定样品效价（方法同上）；
（5）以感染时间为横坐标，以各时间点效价为纵坐标绘制粪肠球菌噬菌体IME-EF1的一步生长曲线。
结果如图3所示，从图中可以看出，前25min内，噬菌斑数目不见增加，说明其尚未复制和组装，这段时间为粪肠球菌噬菌体IME-EF1的潜伏期；此后的35min里噬菌体数目急速上升，这个时期称为爆发期。通过了解噬菌体感染初期的宿主菌量和爆发末期的噬菌体量，可以计算出噬菌体的裂解量（Burst size）即每个被感染的细菌所产生的子代噬菌体颗粒的平均值为60pfu。
3、电镜下观察噬菌体形态
将50μl含0.5%戊二醛和4%多聚甲醛的溶液（即50μl溶液中戊二醛的体积含量为0.5%，多聚甲醛的含量为4g/100ml）加入50μl已纯化浓缩的粪肠球菌噬菌体IME-EF1滤液中以固定噬菌体，然后将混合液滴在覆有碳膜的铜网上，静置30min，用滤纸吸去未吸附的混合液；滴一滴磷钨酸（PTA）于铜网上染色2min，并用滤纸吸去多余液体；待室温干燥后置于Philips TECNAL-10型透射电子显微镜（TEM）下，观察并记录噬菌体颗粒的形态和大小。
电镜结果如图4所示，从图中可以看出，粪肠球菌噬菌体IME-EF1呈蝌蚪形，头部宽35-60nm，长75-90nm，尾部长130-220nm，尾部末端有典型尾板结构，按照国际病毒分类委员会分类标准，该噬菌体属于长尾噬菌体科（siphoviridae）。
4、粪肠球菌噬菌体IME-EF1的全基因组测序
将粪肠球菌噬菌体IME-EF1基因组DNA经超声打碎，利用ION TORRENT2000进行全基因组测序，通过生物信息学分析及在线分析软件分析研究其基因组序列特点。
输出全基因组测序结果，通过序列拼接与生物信息学分析，得到总共57081bp的全基因组序列，包含96个ORF，用RAST工具进行基因注释后发现，其中11个ORF为已知功能的编码蛋白基因。通过在线BLAST，发现编码粪肠球菌噬菌体IME-EF1的结构蛋白基因与长尾科噬菌体的结构蛋白编码基因有较高的同源性，再次证明粪肠球菌噬菌体IME-EF1在噬菌体分类学上属于长尾噬菌体科（siphoviridae），与电镜观察结果一致。
六、粪肠球菌噬菌体IME-EF1宽噬实验
通常情况下噬菌体具有严格的宿主特异性，但是一些噬菌体还是表现出对同一种属范围内的不同菌株具有侵染或裂解能力。为了观察粪肠球菌噬菌体IME-EF1的杀菌范围，本发明采用点滴法（Spot test）测定受试菌对粪肠球菌噬菌体IME-EF1的敏感性。实验重复三次。具体如下：
（1）将受试菌（见表2）培养至对数生长期，分别取500μl菌液加入55℃的BHI半固体培养基中，吹吸混匀后，倒入下层BHI固体平板上，室温静置于水平桌面待其凝固；
（2）吸取1.5μl粪肠球菌噬菌体IME-EF1原液点滴于各平板上，正置于37℃温箱10min待噬菌体原液被吸收后，倒置培养10h，观察有无噬菌斑。
结果如表2所示，其中3株粪肠球菌（3/4）、1株屎肠球菌（1/5）所铺平板上长出明显噬菌斑，而其他菌株对该噬菌体不敏感，说明本发明粪肠球菌噬菌体IME-EF1的宿主专一性较强。
表2粪肠球菌噬菌体IME-EF1对多种菌株的裂解谱分析
Figure BDA0000425165420000111
注：表中+表示相应菌株对粪肠球菌噬菌体IME-EF1敏感，可被其裂解。
实施例2、Lysin-EF1蛋白的表达与活性检测
一、重组表达载体pColdI-Lysin-EF1的构建
1、Lysin-EF1基因的获得
以噬菌体IME-EF1的基因组DNA为模板，采用引物1和引物2进行PCR扩增。
反应体系：噬菌体IME-EF1的基因组DNA0.5μl，5×Buffer10μl，dNTPs4μl，Pusion酶0.5μl，上下游引物各2.5μl，去离子水补足至50μl。
反应条件：98℃预变性30s；98℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸7min。
引物1：5’-GCGGATCCATGGTTAAATTAAACG-3’（下划线部分为BamH I的识别位点，其后的序列为序列2的第1-16位）；
引物2：5’-GCTCTAGACTATACTTTAACTTGT-3’（下划线部分为Xba I的识别位点，其后的序列为序列2的第699-714位的反向互补序列）。
反应结束后，取5μl PCR扩增产物，加入1μl DNA6×LoadingBuffer缓冲液，1％琼脂糖凝胶电泳20min后于紫外透射仪下观察结果并记录。如PCR产物含有目的条带，即可用EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收。
进一步，将纯化后的PCR扩增连接入pEASY-Blunt simple载体，并转化入感受态细胞DH5α。挑取平板上的白斑菌落，过夜培养后用博迈德质粒小样快速提取试剂盒提取质粒，并进行BamH I和Xba I双酶切鉴定。将初步鉴定正确的重组质粒（酶切得到大小约为3800bp和740bp的两个条带）送样测序。测序表明在pEASY-Blunt simple载体中插入“GCGGATCC+序列2+TCTAGAGC”的重组质粒命名为pEASY-Bluntsimple-Lysin-EF1。其中，将序列表中序列2所示基因命名为Lysin-EF1基因。Lysin-EF1基因编码序列表中序列1所示的Lysin-EF1蛋白。
2、重组表达载体pColdI-Lysin-EF1的构建
分别用Xba I和BamH I双酶切步骤一已鉴定正确的重组质粒pEASY-Bluntsimple-Lysin-EF1和载体pColdI，回收重组质粒中的Lysin-EF1基因片段（大小约为740bp）及酶切后的pCold I载体骨架片段，并将二者进行连接。将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞M15。采用菌落PCR的方法鉴定重组质粒pColdI-Lysin-EF1。具体操作如下：从平板上挑取数个白斑，作为模板加入配置好的PCR体系中，反应体系和反应程序同步骤一1，反应结束后，1%琼脂糖凝胶电泳观察条带大小。
菌落PCR鉴定结果如图5所示，可看出有5个克隆的PCR产物为单一清晰条带，且大小位于500bp至750bp之间，与目的条带大小（约740bp）相符，初步判定克隆正确。
进一步将菌落PCR鉴定正确的重组质粒送样测序，将经测序表明在质粒pCold I的多克隆位点Xba I和BamH I之间插入序列表中序列2所示的Lysin-EF1基因的重组质粒命名为pColdI-Lysin-EF1。在重组表达载体pColdI-Lysin-EF1中，启动所述Lysin-EF1基因转录的启动子为cspA启动子。在重组表达载体pColdI-Lysin-EF1中，在BamH I的上游有His标签的编码序列，且与序列2所示的Lysin-EF1基因的编码框一致，因此，在理论上，重组表达载体pColdI-Lysin-EF1表达出的Lysin-EF1蛋白的N端融合有His签。
二、Lysin-EF1蛋白的表达
1、重组蛋白的表达
（1）将步骤一构建的重组表达载体pColdI-Lysin-EF1转化入感受态细胞大肠杆菌M15，过夜培养；
（2）挑取单克隆，加入5ml Amp+的LB培养基中，于37℃200rpm震荡培养至对数生长期后，加入495ml Amp+的LB培养基中，于37℃200rpm震荡培养至OD600为0.6；
（3）将菌液静置于16℃30min后，加入终浓度为1mM的IPTG（同时设置未加IPTG的对照），16℃150rpm震荡培养24h；
（4）于4℃10000rpm离心10min收集细菌沉淀，将其重悬于20ml PBS中；
（5）将细菌悬液置于冰上超声（功率300HZ，每超声5s，间隔8s）30-60min，离心（4℃，10000rpm，10min），收集上清，得到Lysin-EF1蛋白粗提液。
将Lysin-EF1蛋白粗提液进行SDS-PAGE电泳检测，电泳结束后将胶块放入考马斯亮蓝溶液中染色1h左右，取出放入脱色液中过夜脱色，观察记录结果。
实验同时设置向感受态细胞大肠杆菌M15中转入空载体pCold I的对照。
SDS-PAGE鉴定结果如图6所示，从图中可以看出，转入重组表达载体pColdI-Lysin-EF1的大肠杆菌M15经IPTG诱导后表达了与预期大小（约为27kDa）一致的目的蛋白条带，且目的蛋白绝大部分存在于超声后的上清中，因此，认为大多目的蛋白都是可溶性表达。而转入空载体pCold I的大肠杆菌M15没有目的条带表达。
2、重组蛋白的纯化
亲和层析法（镍柱）纯化回收重组蛋白，按照所购买的镍柱纯化说明书，具体纯化步骤如下：
（1）打开开关，将柱内的乙醇冲洗干净；
（2）用5-10倍柱体积（1柱体积=5ml，1ml树脂可结合6mg蛋白）的Ni-Native-0缓冲液（配方：50mM NaH2PO4，300mM NaCl，pH8.0）平衡柱子，控制流速在1ml/min；
（3）超声后的上清经过0.45μm微孔滤器过滤后上样过柱，收集的液体再过柱一次，控制流速0.5-1ml/min；
（4）用5倍柱体积的Ni-Native-0缓冲液（配方同上）过柱，直至在OD=280nm检测时没有蛋白洗出；
（5）用5-10倍柱体积的Ni-Native-20缓冲液（配方：50mM NaH2PO4，300mMNaCl，20mM咪唑，pH8.0）过柱并收集过柱液，控制流速在1ml/min；
（6）用5-10倍柱体积的Ni-Native-50缓冲液（配方：50mM NaH2PO4，300mMNaCl，50mM咪唑，pH8.0）过柱并收集过柱液，控制流速在1ml/min；
（7）用5-10倍柱体积的Ni-Native-100缓冲液（配方：50mM NaH2PO4，300mMNaCl，100mM咪唑，pH8.0）过柱并收集过柱液，控制流速在1ml/min；
（8）用5-10倍柱体积的Ni-Native-250缓冲液（配方：50mM NaH2PO4，300mMNaCl，250mM咪唑，pH8.0）过柱并收集过柱液，控制流速在1ml/min；
（9）用5-10倍柱体积的Ni-Native-500缓冲液（配方：50mM NaH2PO4，300mMNaCl，500mM咪唑，pH8.0）过柱并收集过柱液（即为Ni柱纯化后的重组蛋白液），控制流速在1ml/min；
（10）用5-10倍柱体积的Ni-Native-0缓冲液（配方同上）平衡柱子，保存在30%的乙醇中；
（11）用SDS-PAGE分析回收结果。
3、重组蛋白的超滤及浓缩
用milipore Amicon Ultra-15Centiifugal Filter10KD的超滤柱将步骤2所得的重组蛋白溶液的buffer替换为PBS缓冲液。具体步骤为：将步骤2所得的重组蛋白溶液加入到超滤柱中，于4℃10000rpm离心20min，弃流出液；加入5ml PBS缓冲液冲洗超滤柱，以重悬吸附在柱上的蛋白，于4℃10000rpm离心20min；重复5次以上，从而不断降低蛋白溶液中咪唑的浓度；最后一次不再加入PBS，离心至管内剩余液体少于1ml，冲洗超滤柱内壁，重悬蛋白，从而达到更换buffer及浓缩蛋白的目的。
三、Lysin-EF1蛋白活性检测实验及裂解谱测定
利用表3中的待试菌株（包括粪肠球菌4株、屎肠球菌5株、金黄色葡萄球菌2株），分别采取点滴法、浊度法测定步骤二所得Lysin-EF1蛋白的裂解酶活性及裂解谱。实验重复三次。
1、点滴法
（1）取500μl培养至对数生长期的待试菌株，加入5ml于55℃预热的BHI半固体培养基中，吹吸混匀后，倒入下层BHI固体平板上，室温静置于水平台面10min；
（2）待半固体凝固完全，取1.5μl步骤二所得Lysin-EF1蛋白溶液和1.5μl PBS分别点滴于平板上，于37℃正置20min，待液体被吸收后，倒置，4-6h后观察结果。
2、浊度法
（1）待试菌株过夜培养后，9000rpm离心30s收集沉淀；
（2）将细菌沉淀重悬于3ml PBS缓冲液中，分别测OD600数值并记录；
（3）向每管细菌悬液中加入50μl步骤二所得Lysin-EF1蛋白溶液，于37℃200rpm震荡培养；
（4）分别于1.5h和4h的时间点，测定菌液OD600并记录数值。
3、结果
点滴法和浊度法的测定结果分别如图7和图8所示，从图中可以看出，两种方法测定结果一致，步骤二所得Lysin-EF1蛋白能够裂解所有的粪肠球菌（4/4）、极少数的屎肠球菌（1/5）、无法裂解金黄色葡萄球菌（0/2）。统计得到步骤二所得Lysin-EF1蛋白的裂解谱如表3所示，可见Lysin-EF1蛋白的裂解谱比噬菌体IME-EF1更宽一些。
表3待试菌株对Lysin-EF1蛋白的裂解谱分析
待试菌株 敏感型 待试菌株 敏感型
粪肠球菌002 + 屎肠球菌065 -
粪肠球菌255 + 屎肠球菌081 -
粪肠球菌281 + 屎肠球菌106 -
粪肠球菌284 + 金黄色葡萄球菌037 -
屎肠球菌010 + 金黄色葡萄球菌069 -
屎肠球菌064 -
注：表中+表示相应菌株对Lysin-EF1蛋白敏感，可被其裂解。
四、ELISA验证Lysin-EF1蛋白与细菌结合形式
（1）样品处理：离心收集3ml对数期供试菌（粪肠球菌002，以屎肠球菌064、屎肠球菌065和屎肠球菌081作为对照）菌液沉淀，重悬于200μl PBS缓冲液中；加入50μl步骤二所得Lysin-EF1蛋白溶液，于室温静置反应10min；10000rpm离心5min，分别收集沉淀与上清，做ELISA检测；
（2）包被：将各样品用包被液（配方：Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，pH9.6，用去离子水定容至1000mL）稀释，分别取100μl加入聚苯乙烯酶联检测板孔中，4℃包被过夜；
（3）洗板：倒掉孔内液体，用PBST（配方：NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO4.12H2O，2.9g，KH2PO40.2g，Tween-200.5mL，pH9.6，用去离子水定容至1000mL）洗涤，拍干，重复3次；
（4）封闭：向各孔内加入200μl封闭液（配方：含5%脱脂奶粉的PBST），于37℃孵育2h后洗板，洗板同步骤5；
（5）加一抗：用稀释液（配方：含2%脱脂奶粉的PBST）将一抗（抗His鼠源抗体，Sigma Aldrich）稀释至合适浓度，取100μl加入孔内，37℃孵育1h后洗板，洗板同上；
（6）加二抗：将二抗（HRP标记的羊抗鼠IgG，北京中杉金桥）用稀释液稀释至适宜浓度，取100μl加入孔内，37℃孵育1h后洗板，洗板同上；
（7）显色：向各孔内加入显色A\B液（上海沪峰化工有限公司），80μl/孔，37℃反应15min；
（8）终止：向各孔内加入80μl终止液；
（9）读数：测定各孔OD450数值。
实验以未纯化过的Lysin-EF1蛋白溶液为内参对照。
实验重复三次，结果取平均值。
各供试菌上清的ELISA检测结果如图9所示，从图中可以看出，敏感菌粪肠球菌002裂解液上清内的Lysin-EF1蛋白因吸附在细菌上而被离心到沉淀内，从而OD450的检测值较其他细菌低。
五、Western blot验证Lysin-EF1蛋白与细菌结合形式
（1）样品处理：离心收集3ml对数期供试菌（粪肠球菌002和粪肠球菌281，以金黄色葡萄球菌001和金黄色葡萄球菌037作为对照）菌液沉淀，重悬于200μl PBS缓冲液中；加入50μl步骤二所得Lysin-EF1蛋白溶液，于室温静置反应10min；10000rpm离心5min，分别收集沉淀与上清，做Western blot检测；
（2）各取25μl样品加5μl的6×protein loading buffer，吹吸混匀后，置于沸水中加热5分钟（使蛋白质热变性）后，室温静置至样品冷却；
（3）上样于提前配制好的SDS蛋白胶，90V恒压电泳，30min后提高电压至120V；
（4）转膜；
（5）封闭：将PVDF膜置于20ml封闭液中，4℃封闭过夜；
（6）洗膜：加TBST于水平摇床，洗涤10min；
（7）加一抗：将一抗（抗His鼠源抗体，Sigma Aldrich）用含2%脱脂奶粉的PBST稀释至合适浓度，加入培养皿中，用镊子将PVDF膜移入，4℃孵育过夜；
（8）洗膜：同步骤（6），重复3次；
（9）加二抗：将二抗（HRP标记的羊抗鼠IgG，北京中杉金桥）用稀释液（配方：含2%脱脂奶粉的PBST）稀释至适宜浓度，加入培养皿中，用镊子将PVDF膜加入，37℃孵育1h；
（10）洗膜：同步骤（6），重复3次；
（11）显示曝光（ECL）：将适量体积（根据膜的大小加入，一般为0.1ml/cm2）的A/B显色液（上海沪峰化工有限公司）等体积混匀，均匀加到PVDF膜表面，将PVDF膜包裹入薄膜内；剪取数张适宜大小的底片，将底片与膜放入曝光板内反应曝光，梯度设置曝光时间长短（根据膜上目的条带的亮度圈定曝光时间长短梯度，如5s、30s、5min）；将曝光后的底片放入显影液显影（根据显影液新鲜程度确定显影时间，一般为1-10min），于清水中洗净后，置于定影液中定影；
（12）分析条带。
实验以未纯化过的Lysin-EF1蛋白溶液为内参对照。
实验重复三次。
各供试菌上清的Western blot检测结果如图10所示，从图中可以看出，敏感菌粪肠球菌002和粪肠球菌281裂解液上清内的Lysin-EF1蛋白因吸附在细菌上而被离心到沉淀内，从而Western blot未检测到大小约为27kDa的目的条带，而作为对照的其他菌株均检测到了大小约为27kD的目的条带。
实施例3、Lysin-EF1蛋白治疗效果分析
本实施例建立了小鼠腹部感染粪肠球菌002的模型，采用重组表达的Lysin-EF1蛋白进行治疗，并通过小鼠死亡率、血液内细菌浓度等指标对治疗效果进行评价。
SPF级的Balb/C小鼠：数十只，雌性，6-8周龄，购于军事医学科学院实验动物中心。
一、小鼠最小致死量的测定
为构建小鼠腹部感染模型，事先测定粪肠球菌002对同批次小鼠的最小致死剂量（minimum lethal dose，MLD）及最小致死浓度（Minimum lethal concentration，MLC），具体测定方法如下：
（1）细菌准备：将5ml对数生长期的粪肠球菌002菌液接种至1L新鲜BHI培养基中，37℃震荡培养至菌液OD600为1.6左右，离心收集细菌沉淀，将沉淀重悬于3ml生理盐水中，平板计数法得到其效价约为5×1011cfu/ml；
（2）用生理盐水将上述细菌悬液倍比稀释，得到7个效价梯度的菌液：2×1011cfu/ml、1×1011cfu/ml、5×1010cfu/ml、2×1010cfu/ml、1×1010cfu/ml、5×109cfu/ml、2×109cfu/ml；
（3）将Balb/C小鼠分为9组（每组8只），其中实验组8组，空白组1组，实验组小鼠腹腔注射200μl/只上述8个梯度的菌液，空白组注射200μl生理盐水；
（4）观察48h，记录导致一组小鼠全部死亡的最小细菌量即为此细菌的最小致死剂量（单位：cfu），该细菌的浓度即为最小致死浓度（单位：cfu/ml）。
结果显示，腹腔注射200μl效价5×109cfu/ml及以上菌液的实验组小鼠48h内全部死亡，2×109cfu/ml浓度及以下实验组小鼠48h内均有存活，故判断粪肠球菌002对小的最小致死浓度为5×109cfu/ml，最小致死量为1×109cfu。
二、Lysin-EF1蛋白治疗效果分析及时间依赖性分析
将Balb/C小鼠按照表4分为3组，每组8只。小鼠腹腔注射最小致死量的粪肠球菌002，然后分别于注射细菌后30min和240min时，腹腔注射稀释于200μl磷酸盐缓冲液（PBS）中Lysin-EF1蛋白，对照组注射等量磷酸盐缓冲液（PBS），观察48h，记录小鼠死亡率，平板计数法（取小鼠静脉血稀释后涂板计数）测定小鼠血液内细菌分布情况。
小鼠死亡率的统计结果如表4所示，在细菌感染后30min内给予Lysin-EF1蛋白治疗，小鼠死亡率为33%；在细菌感染后240min后给药结果显示Lysin-EF1蛋白治疗组小鼠死亡率为83%；而对照组小鼠死亡率为100%。
表4小鼠死亡率的对比
Figure BDA0000425165420000181
小鼠尾静脉血液细菌平板计数结果如图11所示，从图中可以看出，Lysin-EF1蛋白治疗组细菌量明显少于PBS对照组，细菌感染30min后给予Lysin-EF1蛋白的杀菌效果明显好于细菌感染240min后给予的杀菌效果。
Figure IDA0000425165520000021
Figure IDA0000425165520000031

Claims (10)

1.蛋白质，是如下（a）或（b）：
（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有具有裂解粪肠球菌功能的由序列1衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子是编码权利要求1所述蛋白质的基因；所述基因是如下1）至4）中任一所述的DNA分子：
1）编码序列为序列表中序列2所示的DNA分子；
2）序列表中序列2所示的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
4）与1）或2）或3）限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子为cspA启动子。
7.权利要求1所述的蛋白质，或权利要求2或3所述的核酸分子，或权利要求4或5所述的重组表达载体、表达盒或重组菌在如下a1）-a4）任一中的应用：
a1）制备裂解粪肠球菌的产品；
a2）制备裂解屎肠球菌的产品；
a3）制备用于治疗由粪肠球菌感染引起的疾病的产品；
a4）制备用于治疗由屎肠球菌感染引起的疾病的产品。
8.活性成分为权利要求1所述的蛋白质的如下任一产品：
b1）裂解粪肠球菌的产品；
b2）裂解屎肠球菌的产品；
b3）用于治疗由粪肠球菌感染引起的疾病的产品；
b4）用于治疗由屎肠球菌感染引起的疾病的产品。
9.根据权利要求7所述的应用，或权利要求8所述的产品，其特征在于：所述粪肠球菌为如下中的至少一种：粪肠球菌（Enterococcus faecalis）002、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）255、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）281和粪肠球菌（Enterococcus faecalis）284。
10.根据权利要求7所述的应用，或权利要求8所述的产品，其特征在于：所述屎肠球菌为屎肠球菌（Enterococcus faecium）010。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110129279A (zh) * 2019-04-24 2019-08-16 昆明理工大学 一种粪肠球菌噬菌体及其分离、纯化、富集和应用
CN110499266A (zh) * 2019-08-05 2019-11-26 昆明理工大学 一株粪肠球菌及其应用
CN110621776A (zh) * 2017-02-22 2019-12-27 尹特荣生物科技株式会社 新型屎肠球菌噬菌体Ent-FAP-4及其用于抑制屎肠球菌增殖的用途
CN114807106A (zh) * 2022-04-25 2022-07-29 昆明市延安医院 一种粪肠球菌噬菌体PEf771的裂解酶pEf51和穿孔素蛋白pEf191、其基因克隆纯化方法及其应用
WO2022166736A1 (zh) * 2021-02-08 2022-08-11 武汉乐斯吉生物科技有限公司 噬菌体裂解酶、其嵌合物及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHANG W等: "Characterization of Enterococcus faecalis phage IME-EF1 and its endolysin.", 《PLOS ONE》 *
ZHANG W等: "KF192053.1", 《GENBANK》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110621776A (zh) * 2017-02-22 2019-12-27 尹特荣生物科技株式会社 新型屎肠球菌噬菌体Ent-FAP-4及其用于抑制屎肠球菌增殖的用途
CN110129279A (zh) * 2019-04-24 2019-08-16 昆明理工大学 一种粪肠球菌噬菌体及其分离、纯化、富集和应用
CN110129279B (zh) * 2019-04-24 2022-02-18 昆明理工大学 一种粪肠球菌噬菌体及其分离、纯化、富集和应用
CN110499266A (zh) * 2019-08-05 2019-11-26 昆明理工大学 一株粪肠球菌及其应用
WO2022166736A1 (zh) * 2021-02-08 2022-08-11 武汉乐斯吉生物科技有限公司 噬菌体裂解酶、其嵌合物及应用
CN114807106A (zh) * 2022-04-25 2022-07-29 昆明市延安医院 一种粪肠球菌噬菌体PEf771的裂解酶pEf51和穿孔素蛋白pEf191、其基因克隆纯化方法及其应用
CN114807106B (zh) * 2022-04-25 2023-09-01 昆明市延安医院 一种裂解酶pEf51和穿孔素蛋白pEf191的应用

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