CN114807106A

CN114807106A - 一种粪肠球菌噬菌体PEf771的裂解酶pEf51和穿孔素蛋白pEf191、其基因克隆纯化方法及其应用

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Publication number: CN114807106A
Application number: CN202210436629.5A
Authority: CN
Inventors: 向盈盈; 宋飞; 季秀玲; 涂渝娇; 王粟萍; 蒋蕾; 袁琳; 黄浩
Original assignee: Yanan Hospital of Kunming City
Current assignee: Yanan Hospital of Kunming City
Priority date: 2022-04-25
Filing date: 2022-04-25
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2042-04-25
Also published as: CN114807106B

Abstract

本发明公开了一种粪肠球菌噬菌体PEf771的裂解酶pEf51和穿孔素蛋白pEf191、其基因克隆纯化方法及其应用，所述粪肠球菌噬菌体裂解酶pEf51和穿孔素蛋白pEf191克隆自粪肠球菌噬菌体PEf771，裂解酶pEf51氨基酸总数202个，分子大小21.9kDa，蛋白分子式为C₉₇₂H₁₄₉₂N₂₆₀O₃₁₃S₁，等电点4.42；包含12个正电荷残基，25个负电荷残基；不稳定指数为26.84，脂肪系数85.99，总的平均亲水性为(GRAVY)‑0.347，为可溶性蛋白；所述穿孔素pEf191基酸总数107个，相对分子质量12.1kDa，蛋白分子式为C₅₅₀H₈₅₈N₁₄₂O₁₅₅S₆，等电点为8.96；不稳定指数35.1所以该蛋白稳定；脂肪系数为82.90，平均亲水性(GRAVY)‑0.115，为可溶性蛋白；并展开抑菌活性、裂解谱及粪肠球菌生物膜去除研究；通过SD大鼠腹腔感染模型，为进一步研究抗菌的应用范围奠定基础。

Description

一种粪肠球菌噬菌体PEf771的裂解酶pEf51和穿孔素蛋白 pEf191、其基因克隆纯化方法及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种粪肠球菌噬菌体裂解酶和穿孔素蛋白的基因克隆纯化方法及其应用，具体涉及一种粪肠球菌噬菌体PEf771的裂解酶pEf51和穿孔素蛋白pEf191、其基因克隆纯化方法及其应用。

技术背景

粪肠球菌(Enterococcus faecalis)又叫做粪链球菌，一种兼性厌氧菌，有圆形、椭圆形两种形态，直径0.5～1.0μm，菌落形态呈光滑的圆形，颜色灰白，大多数呈短链状或者成对排列，无鞭毛、无芽孢，一般不运动，是自然界中存在比较广泛的一种细菌，也是人类、其他哺乳动物和昆虫胃肠道的共生菌群。作为正常菌群时，对人体或动物往往是有益菌，因为许多粪肠球菌可以产生细菌素或抗生素者等抑菌的成分，能抑制部分有害菌生长；此外，粪肠球菌还能以益生菌成分添加至动物饲料中。但根据世界卫生组织对益生菌的筛选原则和严格定义，只有极少数粪肠球菌属于益生菌，其他大部分均是无用或致病菌。当其出现在水体和土壤等环境时，属于条件致病菌。近年来已逐渐成为人体中感染仅次于葡萄球菌的第二大革兰氏阳性病原菌，当抵抗力较低或者发生异位寄生时，均可能引起严重的细菌性感染。粪肠球菌具有很强的适应和生存能力，并且是医院相关感染中最常分离的物种之一，会引起心内膜炎、菌血症、尿路感染、口腔疾病以及其他致命形式的局部甚至全身感染，严重影响人类生命健康。

粪肠球菌与生物被膜密切相关的毒力因子包括脂磷酸壁、聚合物质、性信息素、细胞溶血素和溶解酶，生物被膜的组成成分主要有EPS(胞外多糖)、胞外蛋白和eDNA(胞外DNA)，其形成与表面蛋白(Esp)表达增多相关，它的发展主要分为三个阶段：吸附、成熟、拆卸。形成生物被膜的第一阶段为吸附，细菌能否附着取决于接触面间形成的排斥力小于吸附力、接触面积是否够大，因此该阶段可逆。Esp编码的是粪肠球菌细胞壁上一个表面蛋白，其相对分子质量较大，具有介导细菌间粘附的功能，因此在粪肠球菌生物被膜研究受到广泛关注。据美国国立卫生研究院估计，至少65％的人类感染与生物被膜相关，进一步说明这种生长模式的重要性。群体感应系统(Quorumsensing，QS)是细菌间的一种通信系统，通过分泌和响应化学信号而相互交流，目前研究认为粪肠球菌生物被膜的形成由QS调控，使某些特定基因进行协同表达。粪肠球菌QS中Fsr组分的群体感应依赖性调节系统可通过调控肠球菌表面蛋白(Esp)、明胶酶(GelE)、EbpC、SprE等表达来调节生物膜形成与成熟。据报道，许多肠球菌包括粪肠球菌均具有生物被膜形成能力，食品加工厂中肠球菌生物被膜会污染肉制品表层，这一发现有助于解释为何肠球菌是在肉制品中产生的常见菌种，由于对胞外多糖基质的保护，生物膜包裹的细菌细胞难以消除。

生物被膜抵御抗生素，主要是由于某些抗生素会被阻止进入。一些研究表明，生物膜可以通过抗生素的亚抑制浓度而被刺激生成，生物膜内的一些细菌虽然与易感菌在基因上相同，但其休眠表型表现出对抗生素的易感性降低，而且会造成宿主被反复感染。因此，对于生物被膜的提早预防、尽快减弱、尽量破坏甚至清除的探索具有研究价值。开发新型、有效的抗生物膜剂对抑制病原菌生物膜的形成具有重要意义。

噬菌体，一类以细菌为宿主的病毒，无细胞结构，仅由内部的遗传物质及衣壳蛋白组成，凭借宿主菌进行复制、装配和增殖，根据噬菌体遗传物质不同可以分为dsDNA噬菌体、dsRNA噬菌体、ssDNA噬菌体、ssRNA噬菌体；按照噬菌体有无尾部，可以分为有尾噬菌体和无尾噬菌体，也存在丝状噬菌体，比如M13噬菌体。噬菌体广泛存在于人体、动物、粪便、土壤、废水、食品、水体以及微生物中，是地球上最丰富的“生命形式”。截至2021年，国际核苷序列联合数据库已有噬菌体核苷酸测序序列3.5万个，噬菌体总数超过1032个。噬菌体属于专性细菌寄生生物，而且大多数噬菌体的寄主仅有一种或者少数不同来源的同种细菌，尽管宿主范围有限，但能特异性地感染和杀死其宿主菌，因此，其可以成为有效的生物抑制剂，能将致病性细菌作为目标进行消灭或者抑制，但不会危害有益或被保护的作物和微生物。尽管如此，在临床应用中，噬菌体作为一种新型抗菌制剂仍存在一系列的问题，比如在长期进化过程中，细菌对噬菌体会产生一定程度的抗性；由于噬菌体需要在活宿主菌内进行增殖从而裂解宿主，对于一些已经形成生物膜的情况治疗效果会减弱，制备大量噬菌体的操作过程也比较复杂。此外，噬菌体在应用过程中的安全性仍然是被顾虑的因素。

许多噬菌体有内肽酶、酰胺酶和裂解酶3种，根据裂解酶作用的化学键不同，可以分为以下几类：(1)裂解性转糖苷酶；(2)N-乙酰-β-葡糖胺糖苷酶；(3)N-乙酰胞壁酸酶(lysozymes)，以上三种均作用于肽聚糖的糖链；(4)N-乙酰-L丙氨酸酰胺酶，作用于肽链之间的酰胺键；(5)内肽酶，作用于肽聚糖的四肽侧链；除转糖酶，其他四种均属于水解酶类，其中酰胺酶和胞壁酸酶研究的较多。由于其特异性与宿主菌细菌壁肽聚糖相关，因此细菌难以对其具有抵抗能力。裂解酶在极短时间内便可杀伤细菌细胞。因此噬菌体裂解酶具有以下特点：(1)具有种属特异性，比如李斯特菌噬菌体裂解酶只对李斯特菌作用较好，金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶对金黄色葡萄球菌有较好作用，针对性杀死病原菌而不会影响其他正常菌群；(2)对宿主不易产生抗性，其作用靶点是细胞壁肽聚糖，直接快速地裂解宿主菌从而起到杀菌的作用；(3)具有免疫原性，不易与自身的抗体发生中和反应；(4)具有高效微量的特点，十几分钟内便能起作用；(5)与噬菌体和其他抗菌剂相比，裂解酶更安全，性质更稳定，更容易控制。

虽然裂解酶的生物学功能大致都是裂解宿主菌，但生物化学性质和结构却具有较大差异。革兰氏阳性细菌的噬菌体Lysin大部分为25～40kDa，革兰氏阴性细菌的噬菌体Lysin为15～20kDa，噬菌体裂解酶包含N端起催化作用的裂解结构域，C端识别和结合细胞壁的结合结构域。裂解酶的裂解谱取决于以高亲和力结合细胞壁中特定配体的细胞壁的结合结构域，广谱裂解酶的细胞壁的结合结构域在预测的结构和序列都具有一定相似性，这可能是由于广谱裂解酶需要针对细胞壁保守区进行裂解。

革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁主要是由肽聚糖组成，但也存在较大区别，前者的肽聚糖层数较多、较厚，后者的肽聚糖层数较少、较薄且被外膜包裹。由于二者在细胞壁结构上的差别，使裂解酶能从外部直接作用于阳性菌细胞壁从而杀死细菌；对于阴性菌，由于外膜的阻隔使得裂解酶很难对其产生作用。

除活噬菌体制剂外，噬菌体编码的裂解酶在外源应用时表现出快速、高效的裂菌活性，也是防治细菌感染性疾病的一种手段。在裂菌过程中，噬菌体Lysin水解肽聚糖从而消化细胞壁，噬菌体子代得以释放。在进化过程中，细菌细胞壁肽聚糖十分保守，产生耐药的可能性远小于抗生素，因此裂解酶作为潜在新型杀菌制剂，作用机制与抗生素大不相同，具有无法比拟的优势。将裂解酶用于治疗细菌性疾病具有更广泛的应用前景。对于裂解酶作为一种蛋白类物质进入体内时可能引起免疫反应的问题，也有研究者通过大量的动物实验表明，体内产生针对裂解酶的抗体并不足以使裂解酶失活，而且没有发现副作用和严重的过敏反应，相反，裂解酶进入体内后发挥抗菌作用的速度更快，裂解谱比噬菌体本身更宽。

徐晶晶等发现裂解酶ClyR能快速杀死致龋菌中的S.mutans和S.sobrinus，具有预防和治疗龋病新型制剂的潜能；徐晶晶等还构建了一个由天然噬菌体裂解酶PlyGBS的催化结构域和PlySs2的细胞壁结合结构域融合表达的嵌合裂解酶ClyE，对多种链球菌、肠球菌和部分葡萄球菌表现出极佳的杀菌活性。Pritchard等通过实验证实B链球菌(GBS)噬菌体溶菌素在体内外均有显著的杀菌作用。研究表明噬菌体IME-EF1的裂解酶比亲本噬菌体具有更宽的裂解谱，包括两株耐万古霉素粪肠球菌；体内实验表明，用200μg裂解酶治疗感染粪肠球菌的小鼠，保护率可达到80％。利用内溶素(LytSD)在体外应用时，分解了7/18被测菌株，分别是阿维链球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌和沙门氏菌。裂解酶PlyV12可以同时裂解酶屎肠球菌和粪肠球菌，也具有中等程度的杀菌作用。

穿孔素是噬菌体晚期转录表达的、具有高电荷和羧基端结构域的疏水膜蛋白，分子量约为10kDa。在特定时间内，自发组装成寡聚体，在细胞膜中形成非特异性的跨膜通道，使细胞膜受损，以便释放细胞内的裂解酶，进而引发细菌死亡甚至裂解。在体外，穿孔素可以不通过内溶素使细胞死亡，致使细菌活力丧失的致命性原因主要穿孔素在细胞膜上形成的孔洞，并不是与细胞破裂有关。与内溶素不同的是，穿孔素对G⁺和G^-均表示出较好的抑菌作用。穿孔素就像一个“分子定时器”，决定感染周期结束的时间，使细菌被裂解这一过程具有一定的可控性。

研究发现HolGH15表达后导致E.coli BL21的形态学改变，包括细胞壁和细胞质膜的损伤和细胞内容物的外流，不仅抑制S.aureus生长，还表现出对其他细菌的抑菌活性，包含L.monocytogenes,B.subtilis,P.aeruginosa,K.pneumoniae和E.coli。噬菌体Bp7的holin序列特征和抗菌活性研究中发现holin的表达能显著抑制E.coli BL21的生长，且细胞呈凝聚状态。夏安越等得到一株多重耐药鲍曼不动杆菌噬菌体，通过无细胞蛋白质合成方法表达其穿孔素，表现出较好抑菌活性。穿孔素不止局限于对细菌的控制，在癌症治疗方面也具有一定潜力。它在细菌细胞膜上造成小孔的现象表明可能对真核肿瘤细胞具有一定的细胞毒性；体内实验表明λ-holin对人乳腺癌和宫颈癌细胞系具有非常有效的杀伤活性，但未影响到小鼠治疗本身，因此揭示该蛋白作用机制可进一步用于癌症基因治疗。

近年来，抗生素的滥用问题给世界范围内临床医学和细菌性感染疾病的治疗带来了严峻的挑战，同时造成生态和环境的污染，但新型抗生素的研发远远赶不上耐药菌的产生。研究表明，粪肠球菌作为根尖周炎的主要病原菌之一，同样对大部分抗生素具有抗性，并且可以在根尖周围环境中形成生物膜结构，一旦形成生物膜对抗生素的耐药性将会提高10倍～1000倍，从而导致根尖周炎通过根管治疗后仍难以清除^[91]。

前期研究中，我们分离得到一株对粪肠球菌YN771具有强裂解活性的噬菌体，命名为PEf771，并对其全基因组测序及注释后，比对分析可能编码噬菌体裂解酶的基因序列。

发明内容

本发明提供了一种粪肠球菌噬菌体PEf771的裂解酶pEf51和穿孔素蛋白pEf191的基因克隆表达和应用，用以解决在长期进化过程中，细菌对噬菌体产生一定程度的抗性，并且由于噬菌体需要在活宿主菌内进行增殖从而裂解宿主，对于一些已经形成生物膜的情况治疗效果会减弱，制备大量噬菌体的操作过程也比较复杂，以及噬菌体在应用过程中的安全性等问题。

本发明的目的在于：提供一种粪肠球菌噬菌体PEf771的裂解酶pEf51，该噬菌体裂解酶pEf51克隆自粪肠球菌噬菌体PEf771，其氨基酸总数202个，分子大小21.9kDa，蛋白分子式为C₉₇₂H₁₄₉₂N₂₆₀O₃₁₃S₁，等电点4.42；包含12个正电荷残基，25个负电荷残基；不稳定指数为26.84，脂肪系数85.99，总的平均亲水性为(GRAVY)-0.347，为可溶性蛋白，所述裂解酶pEf51氨基酸序列为(SEQ ID NO:1)所示。

进一步的，一种粪肠球菌噬菌体PEf771的裂解酶pEf51基因克隆纯化方法，该方法步骤如下：

(1)引物的设计与合成：根据测序所得的裂解酶pEf51基因序列，设计的引物为：

上游pEf51-F：5'-GCACCATGGCGTTGAAGAAAACGACAATTGCAAC-3'

下游pEf51-R：5'-ATACGGATCCTTAGTACCAACCGTTAGCTAACCAG-3'

(2)目的基因的扩增：提取噬菌体PEf771基因组DNA，以噬菌体PEf771基因组DNA为模板，利用设计的pEf51引物扩增目的基因；

(3)重组质粒的构建：利用限制酶Xho I和Nco I分别双酶切基因片段pEf51和质粒pET28a(+)，再按质粒：基因＝1：3的摩尔比进行连接后，转化至E.coli DH5α克隆菌株中，成功得到克隆pET28a-pEf51重组质粒；

(4)重组基因工程菌的构建：热激法将重组质粒转化表达菌株的感受态细胞，选取无突变的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)表达菌株，进行菌落PCR和测序鉴定；

(5)裂解酶pEf51基因的诱导表达：通过SDS-PAGE蛋白凝胶电泳，鉴定质粒pET28a-pEf51转化至表达载体BL21(DE3)后，通过测定不同浓度IPTG诱导后菌液浊度发现，诱导4h后OD₆₀₀值降至0.5左右，37℃，0.8mmol/L IPTG，150rpm诱导4h为裂解酶pEf51最佳表达条件；

(6)裂解酶pEf51的蛋白纯化：目的蛋白纯化—镍离子亲和层析纯化；具体步骤如下：(a)制备裂解酶重组蛋白粗酶液；(b)吸取2mL NTA-NI镍柱料于纯化柱中，当柱料中的乙醇全部滴完后，加入灭菌且滤膜过滤的双蒸水8mL，以此清洗NTA-NI镍柱料2～3次；(c)加入8mL 0.02mol/L Tris-HCI(镍柱平衡液，pH 7.9)溶液与NTA-Ni镍柱料混合均匀，自然滴穿，重复操作2～3次；(d)将制备的pEf51粗酶液加入纯化柱中与NTA-Ni镍柱料混合均匀，放置在血液混匀器上4℃过夜结合，次日流穿未结合的废液；(e)0.01mol/L、0.02mol/L、0.04mol/L咪唑洗脱液洗脱与目的蛋白分子量大小不符合的杂蛋；为了使NTA-Ni镍柱料与咪唑洗脱液充分结合，上下多次颠倒纯化柱，再放置摇摆摇床上结合5～10min，自然流穿，收集流出液，每个浓度洗脱2遍；(f)用浓度为0.1mol/L、0.25mol/L、0.5mol/L的咪唑洗脱液洗脱目的蛋白，操作同步骤(e)，保存流穿液液，每个浓度洗脱2遍；(g)洗脱后的纯化柱用镍柱平衡液洗涤2遍，4℃保存，1周内若再次使用，用500mM咪唑进行洗涤；1周以上未使用，用20％乙醇保存镍柱。

一种粪肠球菌噬菌体PEf771的裂解酶pEf51在制备粪肠球菌和金黄色葡萄球菌生物被膜清除新药物中的应用。

进一步的，一种粪肠球菌噬菌体PEf771的裂解酶pEf51在制备治疗由粪肠球菌YN771感染引起的牙髓炎和难治性根尖周炎的药物中的应用。

进一步的，所述裂解酶pEf51浓度为0.715mg/mL的粗酶液具有高效抑菌活性。

一种粪肠球菌噬菌体PEf771的穿孔素蛋白pEf191，该穿孔素蛋白pEf191克隆自粪肠球菌噬菌体PEf771，其氨基酸总数107个，相对分子质量12.1kDa，蛋白分子式为C₅₅₀H₈₅₈N₁₄₂O₁₅₅S₆，等电点为8.96；不稳定指数35.1所以该蛋白稳定；脂肪系数为82.90，平均亲水性(GRAVY)-0.115，为可溶性蛋白，所述孔素蛋白pEf191氨基酸序列为(SEQ ID NO:2)：

一种粪肠球菌噬菌体PEf771的穿孔素蛋白pEf191的基因克隆纯化方法，其特征在于，该方法步骤如下：(1)引物的设计与合成：根据测序所得的裂解酶pEf191基因序列，设计的引物为：

上游pEf191-F：5'-GCGCCATGGCGGTGTATGCTATATTAGCAGTAGAAA-3下游pEf191-R：5'-CGGGATCCTTAGCCTTGTTGTTTGAAGTCTT-3'

(2)目的基因的扩增：提取噬菌体PEf771基因组DNA，以噬菌体PEf771基因组DNA为模板，利用设计的的pEf191引物扩增目的基因；

(3)重组质粒的构建：利用限制酶Xho I和Nco I分别双酶切基因片段pEf191和质粒pET28a(+)，再按质粒：基因＝1：3的摩尔比进行连接后，转化至E.coli DH5α克隆菌株中，成功得到克隆pET28a-pEf191重组质粒；

(5)穿孔素蛋白pEf191的诱导表达：通过SDS-PAGE凝胶电泳检测重组质粒pET28a-pEf191是否在表达菌株E.coli BL21(DE3)中实现表达，通过测定不同浓度IPTG诱导后菌液浊度发现，诱导4h后OD₆₀₀值均在0.4左右，因此选取37℃、0.2mmol/LIPTG诱导4h作为最佳表达条件；

(6)穿孔素蛋白的纯化：通过目的蛋白pEf191的His-tag与镍柱结合的原理，对重组蛋白进行Ni-NTA亲和层析纯化。用浓度为0.01、0.02、0.04mmol/L咪唑洗脱杂蛋白，0.1、0.25mol/L咪唑洗脱目的蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳进行检测。在0.01、0.02、0.04、0.1、0.25mmol/L咪唑洗脱液中均未发现目的蛋白的条带，因此无法得到纯化蛋白。

一种粪肠球菌噬菌体PEf771的穿孔素蛋白pEf191在制备治疗由粪肠球菌感染引起的疾病药物中的应用。

进一步的，一种粪肠球菌噬菌体PEf771的穿孔素蛋白pEf191在制备治疗由粪肠球菌YN771感染引起的牙髓炎和难治性根尖周炎的药物中的应用。

进一步的，所述穿孔素蛋白pEf191浓度为1.135mg/mL的粗酶液具有高效抑菌活性。

本发明提供了一种粪肠球菌噬菌体PEf771的裂解酶pEf51和穿孔素蛋白pEf191、其基因克隆纯化方法及其应用，裂解酶pEf51和穿孔素pEf191具有广谱抑菌作用，能有效清除粪肠球菌和金黄色葡萄球菌形成的生物被膜，在治疗SD大鼠腹腔感染中表现出良好治疗效果，且对SD大鼠治疗后的肠道菌群多样性几乎无影响。因此，pEf51和pEf191在治疗粪肠球菌感染方面具有成为抗生素代替新型药物的潜力。

通过结晶紫染色法测定裂解酶和穿孔素对宿主菌粪肠球菌和非宿主菌金黄色葡萄球菌生物被膜的清除作用，RT-qPCR法检测生物被膜相关基因表达量，发现两种蛋白对粪肠球菌的生物被膜清除效率更加高效，使毒力因子SprE、EbpC、GelE、Esp表达量显著下调；比较两种细菌的生物被膜清除作用得知，pEf51较pEf191的作用效果更佳。

SD大鼠腹腔感染模型研究表明：pEf191组治疗72h后，SD大鼠疗效同空白组一样；pEf51组治疗72h后，1只SD大鼠出现胸腔包膜脓肿和脾脏包膜脓肿，表明pEf191能够很大程度保护感染粪肠球菌的SD大鼠；利用Illumi-naMiSeq对治疗前后SD大鼠肠道菌群16S rDNA进行测序及分析，穿孔素pEf191在门和属水平上对肠道微生物多样性几乎无影响，而且pEf191可以显著提高有益菌属—嗜黏蛋白阿克曼菌属的相对丰度，而pEf51组出现了与胃肠道疾病相关的菌属—脱硫弧菌属和螺杆菌属，进一步表明pEf191粗酶液治疗粪肠球菌感染的效果更佳。

附图说明

图1为裂解酶基因PCR扩增图；其中条带2为编码pEf51的基因PCR产物；

图2为裂解酶蛋白pEf51的诱导表达图；

其中：M为蛋白marker(10～180kDa)；1～6为重组菌(pET28a-pEf51)，分别为0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L IPTG，37℃诱导4h；7为重组菌(pET28a-pEf51)全细胞；8.重组菌(pET28a-pEf51)上清液；9.重组菌(pET28a-pEf51)沉淀；

图3为重组蛋白pET28a-pEf51的分离纯化；

其中：M为蛋白marker(10～180kDa)；1为诱导重组菌(pET28a-pEf51)破碎全细胞；2为流穿液；3～7为0.01、0.02、0.04、0.1、0.25mol/L咪唑洗脱液；

图4为pEf51表达对BL21生长的影响，

其中：a：不同IPTG浓度诱导pEf51表达对BL21(DE3)生长的影响；b图1号试管：实验组pET28a-pEf51-BL21(DE3)添加0.8mmol/L IPTG诱导4h后的菌液；b图2号试管：pET28a-pEf51-BL21(DE3)不添加IPTG诱导4h后的菌液；b图3号试管：pET28a空载体添加0.8mmol/mLIPTG诱导4h后的菌液；c：不添加IPTG时pEf51表达后BL21的细菌细胞扫描电镜图；d：添加IPTG诱导时pEf51表达后BL21的细菌细胞扫描电镜图；

图5为pEf51对粪肠球菌YN771的抑菌作用，

其中：A图①流穿液，②0.01mol/L咪唑洗脱液，③0.02mol/L咪唑洗脱液，④0.04mol/L咪唑洗脱液，⑤0.1mol/L咪唑洗脱液，⑥0.25mol/L咪唑洗脱液，⑦0.5mol/L咪唑洗脱液；B图①PBS，②pEf51粗酶液。

图6为pEf51的体外抑菌活性，

其中：a.pEf51对粪肠球菌抑菌活性测定；b.不添加pEf51处理的E.faecalisYN771扫描电镜图；c.添加pEf51处理的E.faecalisYN771扫描电镜图；

图7为Holin蛋白pEf191的诱导表达

(左图)M：蛋白marker；1：pET28a-pEf191重组菌，0mmol/L IPTG，37℃诱导4h；2～6：pET28a-pEf191重组菌在IPTG浓度0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L条件下37℃诱导4h。

(右图)1：pET28a-pEf191重组菌，0mmol/L IPTG，37℃诱导4h菌液；2：pET28a-pEf191重组菌，0.2mmol/L IPTG，37℃诱导4h菌液

图8为Holin蛋白pEf191分离纯化，

(1：诱导重组菌(pET28a-pEf191)破碎全细胞；2:流穿液；3-7:分别为0.01mmol/L、0.02mmol/L、0.04mmol/L、0.1mol/L、0.25mol/L咪唑洗脱液)

图9为pEf191表达对BL21(DE3)生长的影响，

其中：a.0.2mmol/L IPTG诱导pEf191蛋白表达对BL21(DE3)生长的影响；b.不添加IPTG时pEf191表达后E.coli BL21的细菌细胞扫描电镜图；c.添加IPTG诱导时pEf191表达后E.coli BL21细菌细胞扫描电镜图；

图10为pEF191对E.faecalis YN771产生的抑菌圈，

其中：A图中①流穿液，②PBS buffer洗脱液，③～⑥0.01、0.02、0.1、0.25mmol/L咪唑洗脱液；⑦0.1mmol/L咪唑缓冲液；B图为分别加入4μL和10μL pEf191粗酶液产生的抑菌圈

图11为pEf191的体外抑菌活性，

其中：a：pEf191对E.faecalis YN771的杀菌作用；b：pEf191对S.aureus的杀菌作用；c：未添加pEf191粗酶液处理的E.faecalisYN771扫描电镜图；d：添加pEf191处理粗酶液的E.faecalisYN771扫描电镜图

图12为细菌生物膜形成能力测定；

图13为pEf51和pEf191对细菌生物被膜的清除作用；

图14为pEf51和pEf191对粪肠球菌生物膜形成相关基因的影响；

图15为SD大鼠腹腔解剖图，

其中：A.正常SD大鼠腹腔；B.空白组SD大鼠腹腔；C.L51组中大鼠胸腔包膜脓肿；D.L51组中大鼠脾脏包膜脓肿；E.P组中大鼠肠系膜脓肿；F.P组中胃脾韧带脓肿；

图16为基于OTUs总数的Alpha多样性分析，

其中：BL代表空白组；CO代表只加病原菌YN771组；P代表加入噬菌体pEf771组；L51代表加入裂解酶pEf51组；H191代表加入穿孔素蛋白pEf191组

图17为SD大鼠肠道微生物主坐标分析；

图18为SD大鼠肠道菌群门水平物种分布图；

图19为SD大鼠肠道菌群门水平热图；

图20为属水平上SD大鼠肠道菌群组成柱状图；

图21为属水平组间差异显著性检验；

图22为SD大鼠肠道菌群属水平上的物种组成热图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细发明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下发明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。

实施例1:粪肠球菌噬菌体PEf771的裂解酶pEf51和穿孔素蛋白pEf191的蛋白理化性质分析：

通过ExPASy Protparam tool预测结果显示，ORF51氨基酸总数202个，分子大小21.9kDa，蛋白分子式为C₉₇₂H₁₄₉₂N₂₆₀O₃₁₃S₁，等电点4.42；12个正电荷残基，25个负电荷残基；不稳定指数26.84，判定该蛋白稳定；脂肪系数85.99，总的平均亲水性(GRAVY)-0.347，因此该蛋白为可溶性蛋白，氨基酸组成如下表：

表1 pEf51的氨基酸组成

通过ExPASy Protparam tool预测表明，ORF191氨基酸107个，相对分子质量12.1kDa，蛋白分子式为C₅₅₀H₈₅₈N₁₄₂O₁₅₅S₆，等电点为8.96；不稳定指数35.1所以该蛋白稳定；脂肪系数为82.90，平均亲水性(GRAVY)-0.115，因此该蛋白为可溶性蛋白^[104]。氨基酸组成如下表：

表2 pEf191的氨基酸组成

实施例2：基因的克隆

1、引物设计及合成：根据pEf51蛋白氨基酸序列从NCBI数据库中查找比对完成后的裂解酶pEf51和穿孔素pEf191的基因进行引物设计，裂解酶pEf51的基因引物设计如表3所示，穿孔素pEf191的基因引物设计如表4所示

表3裂解酶pEf51的基因引物

表4穿孔素pEf191的基因引物

2、PCR扩增

以噬菌体PEf771基因组DNA为模板，根据所设计的引物进行PCR扩增，扩增体系如下表所示。

表5扩增反应体系

PCR反应体系配好后，混匀并低速离心，进行PCR扩增反应。PCR条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃总延伸10min。扩增完成后，吸取3.5μL PCR产物核酸电泳，观察结果。

PCR产物回收

用快速DNA纯化试剂盒进行对琼脂糖凝胶电泳检测正确的PCR产物进行纯化，纯化物保存于-20℃。

利用内切酶Xho I和Nco I对纯化后目的基因进行双位点酶切。体系为：Xho I和Nco I分别加1μL，10×K Buffer 5μL，0.1％BSA 5μL，目的基因1,000ng，无酶水补足至50μL，37℃温浴2.5h。所得产物进行核酸电泳，利用Faster DNA Gel试剂盒胶回收，并测定回收产物浓度。

pET-28a(+)质粒提取

挑取Kan⁺平皿上含pET-28a(+)空质粒的单菌落接至100μg/mL Kan⁺LB培养基中，37℃，150rpm培养14h左右，利用GeneStar质粒小提试剂盒提取质粒，对空质粒进行双位点酶切3.5h，产物进行核酸电泳，利用Faster DNA Gel试剂盒胶回收，并测定回收产物浓度。

3、载体构建

氯化钙法制E.coli DH5α感受态，方法如下：

(1)从-80℃低温冰箱中取出菌种DH5α，融化后吸取50μL涂布于LB固体平皿上，37℃培养箱过夜培养；

(2)将单菌落转至5mL LB培养基中，150rpm，37℃过夜增殖；

(3)取增殖后的DH5α培养物，接种于无抗性的50mL LB培养基中(2％接种量)，转速为150rpm摇床增殖至生长系数为0.6-0.8左右，于冰水中预冷20min；

(4)低温高速离心机降温至4℃后，设置参数为2,000g离心4min后，弃掉上清液体并收集下底沉淀菌体；

(5)无菌条件下吸取20mL已做灭菌、预冷处理的0.1mol/L氯化钙，用移液枪轻轻吹打菌体，冰水浴20min；

(6)4℃，2,000g离心4min后弃掉上清液，取2mL 15％甘油的0.1mol/L CaCl₂预冷溶液轻轻重悬菌体，冰水浴30min；

(7)按照每100mL/管规格进行分装，且需在冰上和无菌条件下操作，最后-80℃冰箱保存备用。

构建表达载体：以构建表达载体pET28a-pEf51为例(pET28a-pEf191同理)：利用限制性核酸内切酶Xho I和Nco I分别酶切目的基因片段pEf51和质粒pET28a(+)，再按照质粒:片段＝1:3摩尔比进行连接，转化至E.DH5α克隆菌株中，最终成功得到克隆载体pET28a-pEf51，具体操作步骤如下。

载体连接：将胶回收的目的片段和载体根据基因：质粒＝3:1摩尔比进行计算，计算得出的最优连接体系(如表6所示)，配制完成后瞬时离心，16℃过夜连接。

表6连接反应体系

克隆菌株pET28a-pEf51-DH5α构建。热激法将重组质粒转化至DH5α感受态中，方法如下：

(1)从-80℃取出DH5α感受态放置冰水中缓慢融化，再将16℃过夜连接后产物加入冰水浴融化后的50μL DH5α克隆载体中；

(2)移液枪轻柔地将感受态和质粒混匀，冰水浴30min；

(3)待感受态复苏后放置42℃热激90s，立即冰水浴5min；

(4)加入1mL LB培养基，100rpm、37℃增殖菌体60min，；

(5)2,500g短暂离心2min，收集并重悬菌体，涂布于Kan⁺LB平皿上，37℃培养12h。

(6)观察菌落情况。

重组质粒鉴定

从Kan⁺LB平皿上随机挑选4个重组子，点涂于Kan⁺LB平皿上，待平皿长出单菌落，用接种环挑取并接种至含抗性的LB培养基中，150rpm增殖14h，质粒小量试剂盒提取重组质粒。

酶切鉴定：将测量浓度后的重组质粒通过内切酶Xho I和Nco I进行双位点消化鉴定，体系如下表。体系组分添加完成后，于37℃水浴反应3.5h，吸取3μL反应物进行核酸电泳，观察结果。

表7连接反应体系

测序鉴定：将电泳检测后判定正确的重组质粒，进行测序鉴定，通过DNAMAN工具对测序后的序列结果进行组装，再利用SnapGene3.2软件对拼接序列与原序列进行比对，鉴定氨基酸是否突变，选取无突变或者无义突变的重组质粒进行后续实验。

4、重组质粒转化：选取无突变的重组质粒转化至BL21(DE3)表达菌株中

5、基因的诱导表达

蛋白表达的条件探索:

(1)从Kan⁺平皿中随机挑取pET28a-pEf51(DE3)或者pET28a-pEf191-BL21(DE3)重组菌株的阳性单克隆子接种于Kan⁺LB培养基，37℃，pET28a-pEf51(DE3)150rpm/pET28a-pEf191-BL21(DE3)180rpm活化增殖12h；

(2)按比例1：50接入LB抗性培养基，37℃，pET28a-pEf51(DE3)150rpm/pET28a-pEf191-BL21(DE3)180rpm培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8。

(3)裂解酶：培养液按5mL/管分装于试管中，加入终浓度分别为0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L IPTG进行温度梯度(15℃、25℃、37℃)表达，并设置对照组(不加入IPTG)，转速为150rpm诱导4h，摸索最佳表达条件。

穿孔素：将培养液5mL/管分装于试管中，加入终浓度为0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L的IPTG，37℃，150rpm诱导4h，并设置对照组(不加入IPTG)，摸索最佳表达条件。

(4)诱导完成后，移取2mL菌液至EP管，裂解酶5,000g离心10min,穿孔素5,000g离心3min。

(5)弃上清液，沥干残余水分，加入100μL PBS缓冲液重悬菌体，按1：1加入2×SDSLoading buffer吹打混匀，瞬时离心，沸水浴15min，冷却至室温，再次瞬时离心，则SDS-PAGE电泳样品制备完成。

验证蛋白表达是否为可溶性蛋白：

(1)选取上述蛋白表达量最大的诱导条件，对重组表达菌株进行扩大培养至100mL，4℃，5,000g离心5min；

(2)弃上清液，沥干残余水分，加入4mL PBS重悬菌体。

(3)超声破碎。参数设置为90w，5min，工作3.5s停止5s，冰浴条件下破碎至重悬液澄清透亮即可；

(4)吸取10μL全细胞破碎液于PCR管中留样。剩余的破碎液于4℃，12,000g离心20min；

(5)轻轻吸取上清液20μL于EP管中，倒掉剩余上清液，沥干残余液体，吸取1mL PBS重悬沉淀并混匀，取20μL于EP管；

(6)按1：1比例加入2×SDS Loading Buffer混匀后，沸水浴5min，样品制备完成。

根据上述操作手段得出：

(1)裂解酶蛋白表达

通过SDS-PAGE蛋白凝胶电泳，鉴定质粒pET28a-pEf51转化至表达载体BL21(DE3)后，目的蛋白是否成功表达。结果显示：pET28a-pEf51在28kDa附近有一条清晰的蛋白条带，与连接正确的重组质粒蛋白分子量一致；图2中泳道1无目的条带，而泳道2～6有明显目的条带，泳道8也有目的条带，说明pET28a-pEf51为可溶性蛋白；图中的泳道1无目的蛋白条带存在，表明空质粒不含本体表达。pET28a-pEf51能够实现可溶性的过量表达。

(2)穿孔素蛋白表达

通过SDS-PAGE凝胶电泳检测重组质粒pET28a-pEf191是否在表达菌株E.coliBL21(DE3)中实现表达。图7(左)结果显示：2～6号泳道与1号泳道相比，看不到明显重组蛋白条带，但从诱导后的试管却发现菌液变得澄清，并伴有凝集现象，疑似重组蛋白的表达会造成表达宿主菌裂解死亡。图7(右)显示，通过测定不同浓度IPTG诱导后菌液浊度发现，诱导4h后OD₆₀₀值均在0.4左右，因此选取37℃、0.2mmol/LIPTG诱导4h作为最佳表达条件，进行后续实验。

6、蛋白纯化

裂解酶重组蛋白粗酶液的大量制备：

(1)吸取新鲜培养的BL21-pET28a-pEf51菌液(2％接种量)加入至400mL LB(含终浓度为50μg/mL kan)培养基中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养。

(2)当生长对数达到0.6左右时，加入终浓度为0.6mmol/LIPTG溶液，于150rpm、37℃诱导培养4h。诱导结束后，用1L离心管处理菌液，4℃、8,000g离心15min收集下沉菌体，再用1×PBS缓冲液清洗菌体1～2遍，同等参数下离心收集菌体。最后吸取8mL镍柱平衡液于离心管内充分重悬菌体沉淀。

(3)细胞破碎。设置细胞破碎仪工作参数为：300W，Work 3.5s，Stop 5s，总时长30min，将破碎液于4℃，12,000g，离心20min，分离上清液和沉淀，上层液体用0.22μm无菌滤膜过滤至2mL离心管内，得到pEf51粗酶液。

利用NTA-Ni亲和层析纯化方法6×His-tag重组蛋白。具体步骤如下：

(1)吸取2mL NTA-NI镍柱料于纯化柱中，当柱料中的乙醇全部滴完后，加入灭菌且滤膜过滤的双蒸水8mL，以此清洗NTA-NI镍柱料2～3次；

(2)加入8mL 0.02mol/L Tris-HCI(镍柱平衡液，pH 7.9)溶液与NTA-Ni镍柱料混合均匀，自然滴穿，重复操作2～3次；

(3)将制备的pEf51粗酶液加入纯化柱中与NTA-Ni镍柱料混合均匀，放置在血液混匀器上4℃过夜结合，次日流穿未结合的废液；

(4)0.01mol/L、0.02mol/L、0.04mol/L咪唑洗脱液洗脱与目的蛋白分子量大小不符合的杂蛋。为了使NTA-Ni镍柱料与咪唑洗脱液充分结合，上下多次颠倒纯化柱，再放置摇摆摇床上结合5～10min，自然流穿，收集流出液，每个浓度洗脱2遍；

(5)用浓度为0.1mol/L、0.25mol/L、0.5mol/L的咪唑洗脱液洗脱目的蛋白，操作同步骤(4)，保存流穿液液，每个浓度洗脱2遍；

(6)洗脱后的纯化柱用镍柱平衡液洗涤2遍，4℃保存，1周内若再次使用，用500mM咪唑进行洗涤；1周以上未使用，用20％乙醇保存镍柱。

参照上述纯化方法，对目的蛋白pEf51进行His-tag亲和层析纯化，由图2可知：在各组分浓度咪唑洗脱液中均能检测出目的蛋白pEf51，推测为重组蛋白与NTA-Ni结合率低、结合不稳定以及缓冲液不匹配等原因造成。因此后续对纯化条件和参数进行优化。但0.1mol/L洗脱液中蛋白浓度明显更高。

使用上述方法纯化穿孔素pEf191，由图13可知：在0.01、0.02、0.04、0.1、0.25mmol/L咪唑洗脱液中均未发现目的蛋白的条带，可能是穿孔素表达后会导致表达宿主裂解死亡，致使穿孔素表达量较低，因此无法得到纯化蛋白。

实施例3：裂解酶PEF51的抑菌活性检测

(1)菌内裂解活性检测。

将含有pET28a-pEf51的BL21(DE3)菌株在37℃、180rpm培养4h，OD₆₀₀＝0.6～0.8。在此基础上加入终浓度为0.6mmol/L IPTG诱导裂解酶表达，诱导过程中，通过浊度法来监测裂解酶蛋白表达对BL21(DE3)菌株生长的影响，从而确定IPTG最佳诱导浓度。结果表明，未加入IPTG前，pET28a-pEf51-BL21(DE3)的OD₆₀₀比pET28a-BL21(DE3)低0.2左右；加入IPTG后，pET28a-pEf51-BL21(DE3)细菌浓度不再增加，并随诱导时间延长，OD₆₀₀反而出现降低的趋势，诱导4h后降至0.5左右，但可以看出0.8mmol/LIPTG浓度诱导4h后OD₆₀₀稍大一些(图4a)。

通过试管诱导后进行观察(图4b)，发现pET28a-pEf51-BL21(DE3)在加入IPTG诱导之后的1号试管与阴性对照2号试管和pET28a-pEf51-BL21(DE3)不添加IPTG诱导剂的3号试管相比，1号试管的培养基较于阴性对照2号培养基和空白对照3号培养基有肉眼可见的浊度下降现象，表明pEf51的表达对E.coli BL21(DE3)生长具有明显的抑制和裂解作用。

图4中的c和d为扫描电镜观察结果，显示添加IPTG诱导的pET28a-pEf51-BL21(DE3)菌株其形态具有明显改变，而且诱导4h后大部分细胞的细胞膜已被裂解，无完整的细胞结构，部分残存的菌体表面粗糙(图4d)；未添加IPTG诱导的pET28a-pEf51-BL21(DE3)菌株表面光滑呈现椭圆形(图4c)，因此选取37℃、0.8mmol/LIPTG诱导4h作为PEF51最佳表达时间。

(2)抑菌圈法：利用纯化后的PEF51对宿主菌YN771进行抑菌圈实验。结果表明纯化后的裂解酶对其均没有抑菌圈产生(图5A)，说明纯化后的酶液没有抑菌作用；而用未纯化的粗酶液进行抑菌圈实验时，从结果来看，pEf51的粗酶液4μL(总蛋白浓度1.43mg/mL)对E.faecalisYN771具有较好的抑菌作用(图5)，因此选取pEf51表达的蛋白进行体外抑菌、裂解谱测定等实验。

(3)稀释涂布法：利用pEf51的粗酶液(粗酶液终浓度0.715mg/mL)验证对E.faecalisYN771的体外抑菌活性。图6a显示，作用2h后，活菌数下降3个log左右，作用3h后pEf51粗酶液基本能杀死所有的活菌，0.1mol/L洗脱液作用4h后也能使活菌数下降接近4个log左右。图6中b和c为扫描电镜观察结果，表明添加pEf51蛋白处理的E.faecalisYN771细胞表面明显变得粗糙，凹凸不平，且部分细菌的细胞结构已经被破坏，而未添加pEf51蛋白处理的E.faecalisYN771表面光滑，形态完整，由此说明pEf51粗酶液(总蛋白浓度0.725mg/mL)在体外具有较好杀菌活性。

实施例4：穿孔素pEf191的抑菌活性检测

菌内裂解活性检测

pET28a-pEf191-BL21(DE3)菌株37℃、180rpm培养2.5h，OD₆₀₀＝0.6。加入IPTG(终浓度0.2mmol/L)诱导穿孔素表达。通过菌液浊度监测pEf191表达对菌株E.coli BL21(DE3)生长的影响，确定最佳诱导条件。如图9a可知，加入IPTG诱导剂前，pET28a-pEf191-BL21(DE3)的OD₆₀₀比pET28a-BL21(DE3)的OD₆₀₀低0.2左右；在加入IPTG诱导后，pET28a-pEf51-BL21(DE3)中的细菌浓度不再增加，并随着诱导时间的延长，OD₆₀₀不再增长反而出现降低的趋势，诱导表达2h后，OD₆₀₀降至0.4左右，表明pEf191的表达对菌株BL21(DE3)生长有一定的抑制作用。

从图9b和c扫描电镜图可以看出，添加IPTG诱导的pET28a-pEf191-BL21(DE3)菌株其形态有明显改变，而且诱导4h后大部分细胞的细胞膜已经被破坏，无完整的细胞结构，部分残存的菌体表面粗糙(图9c)；而pET28a-BL21(DE3)菌株表面光滑呈现椭圆形(图9b)，进一步说明穿孔素蛋白的表达造成细胞膜损伤，其结构的完整性被破坏导致内容物被释放至胞外，造成菌体死亡。

抑菌圈法

利用pEf191粗酶液对E.faecalisYN771进行抑菌圈实验，结果表明pEf191粗酶液对其有较好的抑菌效果。图10B可看出，pEf191粗酶液4μL(总蛋白浓度2.27mg/mL)对E.faecalis YN771具有较好抑菌作用，而纯化后的pEf191却未产生抑菌圈(图10A)，进一步说明pEf191未得到纯化蛋白，因此接下来便选取pEf191粗酶液进行体外抑菌、裂解谱测定等实验。

稀释涂布法

检测pEf191粗酶液(粗酶液终浓度1.135mg/mL)对E.faecalis YN771的体外抑菌活性，结果显示，图11a显示终浓度为1.135mg/mL的pEf191粗酶液作用2h后活菌数开始下降，而作用5h后下降了3个log单位左右；图11b显示出对金黄色葡萄球菌作用4h后也能使其活菌数下降接近3个log单位左右，也有较好的抑菌作用。

扫描电镜观察结果显示，添加pEf191粗酶液处理的E.faecalis YN771细胞表面明显变得粗糙、塌陷，菌体皱缩，且部分细菌的细胞结构已被破坏，甚至成为零散碎片；未添加pEf191粗酶液处理的E.faecalisYN771表面光滑，形态完整，因此说明pEf191粗酶液(总蛋白浓度1.135mg/mL)在体外同样表现出了较好的抑菌活性。

实施例5：裂解谱测定

裂解酶pEf51裂解谱结果表明，裂解酶pEf51可以裂解革兰氏阳性菌株粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌和革兰氏阴性菌株大肠杆菌、荧光假单胞杆菌等菌株，裂解谱远远宽于亲本噬菌体，但对革兰氏阴性菌株变异链球菌、铜绿假单胞菌却未表现出杀菌活性(表8)，表明pEf51应用前景可观。

表8 pEf51蛋白的裂解范围

测定了穿孔素pEf191的裂解谱，结果表明pEf191可以对革兰氏阳性菌株粪肠球菌、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、变异链球菌和革兰氏阴性菌株荧光假单胞杆菌、大肠杆菌等菌株产生抑菌圈，裂解谱比亲本噬菌体和pEf51更加宽泛，但对革兰氏阴性菌株铜绿假单胞菌却未表现出杀菌活性(表9)。

表9 pEf191蛋白的裂解范围

实施例6：裂解酶、穿孔素对SD大鼠腹腔感染模型的治疗效果

1、前期准备工作：

SD大鼠购买后，先喂养3天，观察大鼠的生理状态以及精神状况，比如毛发、皮肤、大小便、饮食等状态。手术器械均需要高温灭菌消毒。

病原菌E.faecalis YN771菌悬液、噬菌体pEf771噬菌体液、蛋白粗酶液pEf51和pEf191的准备。

(1)菌悬液样品：将菌种接入50mL BHI培养基中过夜活化，按比例1：50接至1L BHI培养基进行扩培，37℃、150rpm培养至OD₆₀₀＝1.5左右，转移至离心管中，5,000g，4℃离心15min，弃上清液，用BHI培养基洗涤2遍，50mLBHI培养基重悬菌体，分装至4mL离心管，稀释涂布后测定菌液细菌浓度。

(2)噬菌体样品：将活化后的E.faecalis YN771按2％接种量接至100mL BHI培养基中，37℃、150rpm培养至OD₆₀₀＝0.4左右，以最佳感染复数0.1加入噬菌体PEf771 10mL，孵育10min后混匀，37℃，150rpm培养2h左右，直至液体变得清亮，此时菌体被彻底裂解，收集噬菌体液，12,000g离心15min，0.22μm滤膜过滤，分装至4mL离心管，测定噬菌体的效价。

(3)根据pEf51和pEf191的最佳表达条件制备粗酶液(其中pEf51的最佳表达条件为37℃，0.8mmol/L IPTG，150rpm诱导4h；pEf191的最佳表达条件为37℃、0.2mmol/L IPTG、150rpm诱导4h)，超滤浓缩管缓慢离心浓缩，对浓缩粗酶液进行浓度测定，调整两种蛋白的粗酶液浓度基本一致。

(4)每只SD大鼠每次注射0.5mL菌液和样品。

(5)大鼠分组。空白组(n＝3)，即SD大鼠腹腔只注射已灭菌的BHI培养基；实验组，每只SD大鼠均注射0.5mL E.faecalis YN771菌液，72h后腹腔内分别注射各组试剂0.5mL。

采集注射E.faecalis YN771 72h后的粪便，以及术后24h、48h、72h的粪便标本，用于粪便16S rRNA测序检测分析；72h后处死解剖。

标本采集具体步骤，采集全过程均在手术显微镜下操作：

(1)SD大鼠四肢仰卧，固定后，腹部手术部位碘伏消毒。

(2)采取腹部正中切口，血管钳钳住腹壁。

(3)探查腹腔是否有腹腔积液。

(4)探查肝脏的颜色是否正常，有无缺血，肝包膜、肝韧带是否有脓肿形成。

(5)再探查胃部、小肠、大肠以及肠系膜，有无肠道充血、肿胀、坏死形成。

(6)再探查双侧肾脏、肾包膜，是否有缺血、肿胀形成。

(7)探查完毕后，胃肠道向左上方轻微推移，充分暴露下腔静脉，采集下腔静脉血液。

2、结晶紫法测定pEf51和pEf191对生物被膜的清除作用

pEf51和pEf191清除E.faecalis YN771生物被膜：通过结晶紫染色的视觉比较以及酶标仪读取OD₅₉₅值测定两种蛋白粗酶液处理已形成的生物被膜的清除率(分别为24h和36h)，如图13所示，与PBS处理的对照组相比，两种蛋白粗酶液(pEf51和pEf191)处理组的结晶紫染色颜色明显降低，说明E.faecalis Y N771的生物被膜可以被两种蛋白粗酶液破坏，但pEf51组OD₅₉₅值低于pEf191组，表明pEf51对E.faecalis YN771生物被膜的破坏程度更强(图13A)。因此pEf51和pEf191均具有较强的清除E.faecalis YN771生物被膜的作用。

对金黄色葡萄球菌的清除作用，从图13B可看出，与PBS处理的对照组相比，pEf51和pEf191两种蛋白粗酶液对金黄色葡萄菌生物被膜清除能力低于粪肠球菌生物被膜的清除能力，并且pEf51组的OD₅₉₅同样低于pEf191组，证明pEf51裂解酶蛋白对金黄色葡萄球菌形成的生物膜清除能力更强。说明pEf51和pEf191对金黄色葡萄球生物被膜均具有一定的清除能力。总的来说，pEf51对细菌生物被膜的清除能力高于pEf191。

pEf51和pEf191对生物膜形成相关基因转录水平的影响

GelE是粪肠球菌分泌的一种重要毒性因子，Fsr系统中fsrA、fsrB、fsrC等基因调节其表达量，通过从转录组水平上检测裂解酶pEf51和pEf191对gelE基因表达的影响，可以推测两种抗菌蛋白对粪肠球菌的生物被膜有无破坏作用。qRT-PCR结果显示，对照组中gelE、sprE、ebpC、esp四个基因表达量稳定，而加入两种蛋白(pEf51和pEf191)粗酶液可使sprE、ebpC、gelE、esp表达量明显下调(图14)，表明pEf51和pEf191均能抑制gelE、ebpC等生物膜相关基因的表达。

3、pEf51、pEf191对SD大鼠感染模型的治疗效果

(1)SD大鼠解剖与术中观察

从解剖后大鼠的各个组织器官来看，正常SD大鼠整个腹腔整洁，腹水清亮，无黏液，肠道鲜艳，肝脏鲜红，质地柔软，肝叶分明，脾脏红褐色(图15A)。空白组中大鼠腹腔与正常SD大鼠较接近(如图15A)。治疗72h后，治疗组各组中SD大鼠均存活，处死解剖后观察发现，H191组(pEf191)同空白组一样，无任何异常和可疑的病变，而L51组(pEf51)中1只大鼠出现胸腔包膜脓肿和脾脏包膜脓肿(图15C和D)，其余大鼠腹腔内整洁，肠道、肝脏和脾脏颜色正常；噬菌体(P组)1只大鼠出现肠系膜脓肿和胃脾韧带脓肿，肝脏暗红色，少量黏液(如图15E和F)，其余SD大鼠胃、肠、脾颜色正常，肝脏鲜红；因此，穿孔素蛋白pEf191的粗酶液对粪肠球菌感染的治疗效果更佳。

(2)SD大鼠肠道微生物多样性分析

1.Alpha多样性分析

本实验中主要以Sobs指数、Chao1指数、ACE指数、Shannon指数、Simpson指数、PD-tree指数分析各个实验组样本的Alpha多样性。PD-tree指数基于OTU序列进化树的系统发育特征，评估谱系多样性，数值越大表明该环境中物种越丰富，同时各物质分配越均匀。

由图16可知，Sobs指数、Chao指数、ace指数、Shannon指数、Simpson指数、PD-tree指数的变化趋势大致相同。在SD大鼠腹腔注射各组试剂(P组、L51组、H191组)后的24h、48h、72h中，L51组的各多样性指数均低于空白对照组，而P组、CO组、H191组的各多样性指数几乎持平，说明注射裂解酶pEf51降低了菌群的多样性，而注射穿孔素蛋白pEf191和噬菌体对SD大鼠的肠道菌群丰富度和均匀度几乎无影响。

2.Beta多样性分析

从图17的主成分分析可知，H191组的24h、48h、72h和P组的24h、48h、72h均与BL组的72h相距距离较近，组间差异较小，L51组的24h、48h、72h与BL组的72h相聚距离较远，说明裂解酶pEf51对SD大鼠的肠道菌群结构产生了一定影响，而穿孔素蛋白pEf191对肠道菌群结构无明显影响。

综合Alpha多样性和Beta多样性分析可得，本次样品的测序量足够大，结果可以反映出样本绝大部分的物种信息。在注射不同试剂后的24h、48h、72h时，裂解酶pEf51均降低了菌群多样性，但随着时间延长，72h后菌群多样性也有所增长，说明随着生物活性的发挥，对菌群多样性的影响也在逐渐减小；而注射穿孔素蛋白pEf191和噬菌体对SD大鼠的肠道菌群丰富度和均匀度几乎没有影响。由此可表明pEf191能够治疗病原菌感染的同时对肠道菌群的物种多样性几乎没有产生影响。

1.肠道微生物物种组成分析

物种组成分析可得知各个实验组在各类水平上的分类学情况。采用统计学分析法，可以观察样本在门、纲、目、科、属5个水平的菌群结构^[115]。

基于门水平的物种差异性分析。探究注射不同试剂对门水平上大鼠肠道菌群多样性的影响，结合图18可知，各组样本所生成的OTUs主要由以下5个门组成：疣微菌门(Verrucomicrobia)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、巴氏杆菌门(Patescibacteria)、变形菌门(Proteobacteria)，其中疣微菌门、厚壁菌门和拟杆菌门占绝对主导地位；与空白组相比，L51组的疣微菌门相对丰度显著增加(p<0.05)，拟杆菌门含量显著减少(p<0.05)，厚壁菌门含量显著减少(p<0.05)；H191组的疣微菌门含量显著增加(p<0.05)，拟杆菌门含量显著减少(p<0.05)。表10可以看出，其他相对丰度较高的门还有放线菌门、

-变形菌(Epsilonbacteraeota)、迷踪菌门(Elusimicrobia)、蓝菌门(Cyanobacteria)等。随着时间增加，注射不同试剂组并没有出现新菌门，表明从菌门上来看，注射L51、H191和噬菌体治疗粪肠球菌的感染对大鼠肠道微生物多样性几乎无影响，还能调节优势菌群—疣微菌门。

表10生物膜形成相关因子引物设计

基于属水平的物种差异性分析：由图20和图21可知，嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia)、乳杆菌属(Lactobacillus)、普氏菌科(Prevotellaceae)下的未知属Prevotella_9、毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)下的未知属Lachnospiraceae_NK4A136_group、、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)下的未知属Ruminococcaceae_UCG-014、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、拟杆菌(Bacteroides)等为SD大鼠肠道菌群相对丰度较高的菌属。与空白组相比，L51组的嗜黏蛋白阿克曼菌相对丰度显著提高(p<0.05)，未知属Lachnospiraceae_NK4A136_group和罗斯氏菌属(Romboutsia)相对丰度显著下降(p<0.05)；L191组的嗜黏蛋白阿克曼菌相对丰度显著提高(p<0.05)，拟杆菌属相对丰度下降，说明注射L51和H191均能提高嗜黏蛋白阿克曼菌属的相对丰度，研究表明，该菌属有助于改善肥胖、葡萄糖耐受和糖尿病炎症等症状，维持体内代谢平衡，能调节机体免疫应答，属于疣微菌门的有益菌属。从图22可以看出，其他相对丰度较高的菌属有Candidatus_Saccharimonas、Romboutsia、胃球菌属(Ruminococcus)、产粪甾醇真细菌(Eubacterium_coprostanoligenes_group)、杜氏杆菌属(Dubosiella)等。从图22可知，随着时间的增加，L51出现了新属-脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、螺杆菌属(Helicobacter)，在肠道菌群中以上两种菌属均属于有害菌属，其中螺杆菌属种相关的幽门螺杆菌与消化性溃疡和胃肠道癌症相关，而脱硫弧菌属在肠道上皮可能产生毒性，导致胃肠道疾病；H191中这两种菌属相对丰度与空白组接近。由此可选用H191进行粪肠球菌感染治疗后对肠道菌群多样性影响相对较小。

应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性发明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。

SEQUENCE LISTING

<110> 昆明市延安医院

<120> 一种粪肠球菌噬菌体PEf771的裂解酶pEf51和穿孔素蛋白pEf191、其基因克

隆纯化方法及其应用

<130> 2022.4.23

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 202

<212> PRT

<213> 粪肠球菌噬菌体PEf771

<400> 1

Met Lys Lys Thr Thr Ile Ala Thr Leu Gly Leu Leu Gly Leu Gly Leu

1 5 10 15

Ser Leu Gly Leu Gly Ala Lys Ala His Ala Asp Glu Ile Gln Glu Asn

20 25 30

Gly Gln Thr Tyr Trp Gln Val Glu Ser Gly Asp Thr Leu Ser Ala Ile

35 40 45

Gly Asn Arg Tyr Gly Ile Asp Phe Asn Leu Ile His Gln Ala Asn Ser

50 55 60

Asp Lys Val Ser Asp Ala Asn Leu Ile Tyr Val Gly Asp Lys Leu Leu

65 70 75 80

Leu Pro Leu Asn Gly Glu Val Gln Ala Pro Val Ala Gln Pro Val Gln

85 90 95

Glu Ala Pro Val Val Glu Gln Ala Pro Val Val Glu Glu Thr Pro Val

100 105 110

Val Glu Gln Ala Pro Val Val Gln Glu Pro Val Glu Gln Ala Pro Ala

115 120 125

Val Thr Ser Asn Ser Ala Lys Glu Trp Ile Ala Gln Lys Glu Ser Ser

130 135 140

Gly Ser Tyr Ser Ala Thr Asn Gly Arg Tyr Ile Gly Arg Tyr Gln Leu

145 150 155 160

Asp Ala Ser Tyr Leu Asn Gly Asp Tyr Ser Pro Glu Asn Gln Glu Arg

165 170 175

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180 185 190

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<212> PRT

<213> 粪肠球菌噬菌体PEf771

<400> 2

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1 5 10 15

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Trp Glu Pro Leu Pro Phe Thr Asp Glu Gln Met Asn Gln Gly Leu Met

50 55 60

Leu Val Leu Ser Val Gly Leu Ala Ile Tyr Asn Trp Tyr Lys Asn Asn

65 70 75 80

Ala Val Thr Lys Tyr Gly Lys Ala Lys Glu Gln Ala Gly Lys Glu Val

85 90 95

Val Gly Thr Arg Gln Asp Phe Lys Gln Gln Gly

100 105

Claims

1.一种粪肠球菌噬菌体PEf771的裂解酶pEf51，其特征在于，该噬菌体裂解酶pEf51克隆自粪肠球菌噬菌体PEf771，其氨基酸总数202个，分子大小21.9kDa，蛋白分子式为C₉₇₂H₁₄₉₂N₂₆₀O₃₁₃S₁，等电点4.42；包含12个正电荷残基，25个负电荷残基；不稳定指数为26.84，脂肪系数85.99，总的平均亲水性为(GRAVY)-0.347，为可溶性蛋白，所述裂解酶pEf51氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。

2.一种根据权利要求1所述的一种粪肠球菌噬菌体PEf771的裂解酶pEf51的基因克隆纯化方法，其特征在于，该方法步骤如下：

(1)引物的设计与合成：根据测序所得的裂解酶pEf51的基因序列，设计的引物为：

上游pEf51-F：5'-GCACCATGGCGTTGAAGAAAACGACAATTGCAAC-3'

下游pEf51-R：5'-ATACGGATCCTTAGTACCAACCGTTAGCTAACCAG-3'

(2)目的基因的扩增：提取噬菌体YN771基因组DNA，以噬菌体YN771基因组DNA为模板，利用设计的pEF51引物扩增目的基因；

(4)重组基因工程菌的构建：热激法将重组质粒转化表达菌株的感受态细胞，选取无突变的重组质粒转化E.coliBL21(DE3)表达菌株，进行菌落PCR和测序鉴定；

(5)裂解酶pEf51的诱导表达：通过SDS-PAGE蛋白凝胶电泳，鉴定质粒pET28a-pEf51转化至表达载体BL21(DE3)后，通过测定不同浓度IPTG诱导后菌液浊度发现，诱导4h后OD₆₀₀值降至0.5左右，37℃，0.8mmol/L IPTG，150rpm诱导4h为裂解酶pEf51最佳表达条件；

3.根据权利要求1所述的一种粪肠球菌噬菌体PEf771的裂解酶pEf51在制备粪肠球菌和金黄色葡萄球菌生物被膜清除新药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的一种粪肠球菌噬菌体PEf771的裂解酶pEf51在制备治疗由粪肠球菌YN771感染引起的牙髓炎和难治性根尖周炎的药物中的应用。

5.根据权利要求3所述的一种粪肠球菌噬菌体PEf771的裂解酶pEf51，其特征在于，所述裂解酶pEf51浓度为0.715mg/mL的粗酶液具有高效抑菌活性。

6.一种粪肠球菌噬菌体PEf771的穿孔素蛋白pEf191，其特征在于，该穿孔素蛋白pEf191克隆自粪肠球菌噬菌体PEf771，其氨基酸总数107个，相对分子质量12.1kDa，蛋白分子式为C₅₅₀H₈₅₈N₁₄₂O₁₅₅S₆，等电点为8.96；不稳定指数35.1所以该蛋白稳定；脂肪系数为82.90，平均亲水性(GRAVY)-0.115，为可溶性蛋白，所述孔素蛋白pEf191氨基酸序列为SEQID NO:2所示。

7.一种根据权利要求6所述的一种粪肠球菌噬菌体PEf771的穿孔素蛋白pEf191的基因克隆纯化方法，其特征在于，该方法步骤如下：(1)引物的设计与合成：根据测序所得的裂解酶pEf191基因序列，设计的引物为：

上游pEf191-F：5'-GCGCCATGGCGGTGTATGCTATATTAGCAGTAGAAA-3

下游pEf191-R：5'-CGGGATCCTTAGCCTTGTTGTTTGAAGTCTT-3'

(2)目的基因的扩增：提取噬菌体YN771基因组DNA，以噬菌体YN771基因组DNA为模板，利用设计的的pEf191引物扩增目的基因；

(5)穿孔素蛋白pEf191的诱导表达：通过SDS-PAGE凝胶电泳检测重组质粒pET28a-pEf191是否在表达菌株E.coliBL21(DE3)中实现表达，通过测定不同浓度IPTG诱导后菌液浊度发现，诱导4h后OD₆₀₀值均在0.4左右，因此选取37℃、0.2mmol/LIPTG诱导4h作为最佳表达条件；

(6)穿孔素蛋白的纯化：通过目的蛋白pEf191的His-tag与镍柱结合的原理，对重组蛋白进行Ni-NTA亲和层析纯化。用浓度为0.01、0.02、0.04mmol/L咪唑洗脱杂蛋白，0.1、0.25mol/L咪唑洗脱目的蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳进行检测。在0.01、0.02、0.04、0.1、0.25mmol/L咪唑洗脱液中均未发现目的蛋白的条带，因此未得到纯化蛋白。

8.根据权利要求6所述的一种粪肠球菌噬菌体PEf771的穿孔素蛋白pEf191在制备治疗由粪肠球菌感染引起的疾病药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的一种粪肠球菌噬菌体PEf771的穿孔素蛋白pEf191在制备治疗由粪肠球菌YN771感染引起的牙髓炎和难治性根尖周炎的药物中的应用。

10.根据权利要求8所述的一种粪肠球菌噬菌体PEf771的穿孔素蛋白pEf191，其特征在于，所述穿孔素蛋白pEf191浓度为1.135mg/mL的粗酶液具有高效抑菌活性。