KR100988771B1

KR100988771B1 - 엔테로코쿠스 및 스트렙토코쿠스 특이적 사멸능을 갖는 신규한 리신 단백질

Info

Publication number: KR100988771B1
Application number: KR1020080095253A
Authority: KR
Inventors: 윤성준; 최윤재; 손지수; 전수연; 백형록; 강상현
Original assignee: 주식회사 인트론바이오테크놀로지
Priority date: 2008-09-29
Filing date: 2008-09-29
Publication date: 2010-10-20
Also published as: KR20100035879A

Abstract

본 발명은 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 특이적 사멸능을 갖는 신규한 박테리오파지(bacteriophage)로부터 유래한, 엔테로코쿠스(Enterococcus) 및 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 특이적 용균 단백질인 리신(lysin) 단백질에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인간을 포함한 동물의 감염성 질환 원인균인 엔테로코쿠스 및 스트렙토코쿠스를 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 리신 단백질, 및 상기 리신 단백질을 유효성분으로 포함하는 엔테로코쿠스 및 스트렙토코쿠스에 의해 유발되는 감염성 질환의 예방 또는 치료용의 약학적 조성물, 항생제, 구강 위생 관련 제제, 및 소독제에 관한 것이다.

엔테로코쿠스, 스트렙토코쿠스, 박테리오파지, 리신, 단백질, 예방, 치료, 약학적 조성물, 항생제, 구강 위생 관련 제제, 소독제

Description

엔테로코쿠스 및 스트렙토코쿠스 특이적 사멸능을 갖는 신규한 리신 단백질{ Novel Lysin Protein Having Killing Activity Specific to Enterococcus and Streptococcus}

본 발명은 엔테로코쿠스 패칼리스 특이적 사멸능을 갖는 신규한 박테리오파지로부터 유래한, 엔테로코쿠스 및 스트렙토코쿠스 특이적 용균 단백질인 리신 단백질, 및 이를 유효 성분으로 포함하는 엔테로코쿠스 또는 스트렙토코쿠스 감염성 질환의 예방과 치료 목적의 약학적 조성물, 항생제, 구강 위생 관련 제제, 및 소독제에 관한 것이다.

박테리오파지는 세균을 감염시키는 바이러스의 일종으로 보통 파지라고 줄여서 부르기도 한다. 박테리오파지는 핵산으로 이루어진 유전물질 중심부를 단백질 외피가 싸고 있는 단순한 구조의 유기체이며 핵산은 단일 사슬이거나 이중 사슬인 DNA 또는 RNA로 되어있다. 박테리오파지는 생존에 숙주가 반드시 필요하며 모든 세균에는 특정 박테리오파지가 존재한다고 알려져 있다. 박테리오파지는 숙주에 침투하여 복제 과정을 끝낸 다음, 숙주인 세균의 세포벽을 분해하기 위해 필요한 효소인 리신 단백질을 발현시킨다. 이 리신 단백질은 세포벽의 경직성(rigidity) 및 기계적 강도(mechanical strength)를 담당하는 세포벽의 펩티도글리칸(peptidoglycan) 층을 공격하여 세포벽을 파괴한다.

박테리오파지는 1915년 영국의 세균학자 Twort가 포도상구균(Micrococcus) 집락이 어떤 것에 의해 투명하게 녹는 현상에 대한 연구에서 발견되었다. 또한, 1917년에는 프랑스의 세균학자 d'Herelle이 이질환자 변의 여과액 중에 적리균(Shigella disentriae)을 녹이는 작용을 가진 것이 있다는 것을 발견하고 이에 대한 연구를 통해 독립적으로 박테리오파지를 발견하였으며, 세균을 잡아먹는다는 뜻에서 박테리오파지라고 명명하였다. 이후 이질균, 장티푸스균, 콜레라균 등 여러 병원균에 대한 박테리오파지가 계속적으로 발견되었다. 그러나 1950년 Flemming에 의해 페니실린이 발견된 이후, 항생제 사용의 보급화로 인해 일부 동유럽 국가에 한정되어서만 박테리오파지에 대한 연구가 계속되었으며 그 밖의 지역에서는 다소 시들하였다. 그러나 2000년 이후에 항생제의 오남용으로 인해 다재 내성(Multidrug-resistant)을 지닌 병원성 세균의 출현빈도가 높아지고 기존 항생제의 많은 문제점들이 부각되면서 기존 항생제의 대체 물질 및 특정 감염성 질환에 대한 치료제로의 개발 가능성 때문에 박테리오파지에 대한 연구가 선진국들을 중심으로 많은 관심을 받으며 다시 활발하게 진행되고 있다.

비록 항생제(또는 항균제)가 세균 감염에 의한 감염성 질환의 치료에 있어 여전히 주된 방법으로 널리 사용되고 있는 실정이지만, 과도한 항생제의 사용으로 인하여 1980년대부터 많은 항생제 내성 균주가 발생하기 시작했으며, 1986년 최후의 항생제로 불리는 반코마이신(Vancomycin)에 내성을 지닌 황색포도상구 균(Vancomycin-Resistant Staphylococcus Aureus; VRSA) 및 장구균(Vancomycin-Resistant Enterococci;VRE)이 발견됨으로써 의학계에 큰 충격을 주었었다. 또한 앞서 언급했듯이 2000년 이후로 더욱 많은 항생제 내성균주 및 다재 내성균이 발생하고 있어 이는 커다란 사회적 문제로 대두되고 있다.

따라서 기존 항생제에 내성을 갖는 세균에 의한 질환까지도 치료할 수 있는 새로운 항생 물질의 개발이 시급한 상황이다. 물론 이러한 새로운 항생 물질의 개발은 기존 항생제와는 근본적으로 다른 방법에 의해 개발되어야 한다.

엔테로코쿠스는 그람양성구균으로서 일반적으로 인간을 포함한 포유동물의 장내에 서식하고 있는 세균(commensal bacterium)이다. 따라서 정상상태일 때는 무해하다. 그러나 엔테로코쿠스 경우에는 다른 일반 균들과는 달리 유전적으로 교잡 가능성이 상당히 높아 병원성을 획득하는 경우가 흔하며, 이런 경우 매우 위해한 병원균이 된다.

엔테로코쿠스는 앞서 언급했듯이 외부로부터 유전자 교잡을 통하여 병독인자(virulent factor)를 획득하여 감염성 질환(infectious disease)을 유발할 수 있으며, 심내막염(endocarditis), 방광(bladder), 전립선(prostate), 부고환(epididymal) 감염질환, 신경계(nervous system) 감염질환의 원인균으로 알려져 있다. 또한, 가축질환의 경우, 젖소 유방염(bovine mastitis)을 일으키는 환경형 유방염(environmental mastitis)의 원인균으로도 알려져 있다.

일반적으로 엔테로코쿠스 처치에 사용되는 항생제로는 아미노글리코사이드(aminoglycosides), 세팔로스포린(cephalosporins), 클린다마이신(clindamycin) 및 반합성 페니실린제제들이 사용되나, 특정 고농도의 항생제 및 여러 항생제에 대한 민감도가 떨어지는 경우가 많으며, 더 나아가 이들 항생제에 대한 내성이 자주 보고 되고 있다. 1986년 프랑스에서 처음으로 반코마이신에 내성을 보이는 VRE가 보고되었고 국내에서는 1992년에 VRE가 처음으로 분리되었다. 미국의 경우, 1988년 처음으로 VRE가 분리된 이래, NNIS(National Nosocomial Infection Surveilance)의 자료에 따르면 1990-1997년 사이에 분리된 엔테로코쿠스 중 1-15%가 VRE 였으며 1999년 25%, 2003년 28.5%로 증가되고 있는 추세이다. 최근에는 유럽, 미국 뿐 아니라 한국을 포함한 아시아 및 오세아니아를 비롯하여 전 세계적으로 VRE의 출현이 증가하고 있다.

엔테로코쿠스는 주요 원내 병원균(nosocomial pathogen)중 하나이며 면역기능이 감소된 사람에게 심각한 감염증을 일으키는 기회감염(opportunistic infection)의 주요 원인균이다. 대부분 VRE 감염은 병원에서 일어나는데, 그 중에서도 특히 엔테로코쿠스 패칼리스는 엔테로코쿠스 원내 감염의 약 80%를 차지할 만큼 심각한 병원균으로 인식되고 있다. 최근 VRE에 대한 관심이 높아지면서 VRE에 해당하는 엔테로코쿠스 패칼리스 V583의 전체유전자 서열분석에 대한 연구가 진행되어 이들이 독성을 갖게 된 경로와 약물에 대한 내성을 갖게 된 이유가 밝혀지기도 하였다(Science 299: 2071-2074, 2003).

VRE에 감염되면 패혈증을 일으키거나 심하면 사망에까지 이를 수 있음에도 불구하고 아직까지 치료를 위해서는 서로 다른 계열의 항생제를 병용하여 처치해보는 것뿐이며 궁극적인 치료제는 없는 실정이다. 이에 대한 대안 마련이 매우 시 급한 상황이다.

스트렙토코쿠스는 엔테로코쿠스와 분류학적 유연관계가 크며 또한 심각한 병원균이다. 특히 스트렙토코쿠스 중에서 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans)와 스트렙토코쿠스 상귀니스(Streptococcus sanguinis)는 충치 및 프라그 형성과 관련된다. 스트렙토코쿠스는 전통적으로 항생제 내성이 잘 생기지 않는 균으로 유명했으나 최근에는 기존 항생제에 대한 내성문제가 자주 보고되고 있다. 따라서 스트렙토코쿠스에서의 항생제 내성 발생에 대한 대책 수립도 필요하다고 할 수 있다.

이를 위하여, 본 발명자들은 엔테로코쿠스 중 엔테로코쿠스 패칼리스를 특이적으로 사멸시킬 수 있는 신규 박테리오파지를 분리하였으며, 이렇게 선별된 박테리오파지를 2008년 2월 26일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터 (기탁번호 KCTC 11289BP)에 기탁하였으며, 관련 내용을 특허출원한 바 있다(대한민국 특허출원 제10-2008-0029847호). 상기 신규 박테리오파지는 엔테로코쿠스 패칼리스에 의한 감염성 질환의 예방 및 치료에 매우 효과적이기는 하지만 몇 가지 단점을 가지고 있다. 박테리오파지를 직접 사용하는 방법은 박테리오파지라는 미생물 자체를 이용하는 것에 대한 막연한 거부감으로 인하여 그 활용에 제약이 따르고, 직접 사용되는 박테리오파지를 대량으로 확보하기 위해서는 반드시 숙주인 병원성 세균의 배양 단계가 생산 공정 중에 필요한데, 이로 인해 작업자가 병원성 세균에 노출될 위험성이 있으며, 이로 인한 병원성 세균의 엄격한 관리가 필요하다는 등의 문제점이 있다. 이에 따라, 엔테로코쿠스 패칼리스를 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 특 성은 그대로 가지면서도 안전한 생산이 가능하고 또한 다양한 분야로의 활용이 가능한 새로운 물질의 개발이 요구된다.

이에, 본 발명자들은 유해 병원성 박테리아인 엔테로코쿠스 패칼리스를 선택적으로 사멸시킬 수 있는, 본 발명자들에 의해 분리된 박테리오파지의 유전정보를 이용하여, 엔테로코쿠스 패칼리스를 선택적으로 사멸시킬 수 있는 리신 단백질을 제공하고, 더 나아가 이를 엔테로코쿠스 패칼리스에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료 목적으로 이용하는 방법을 제공하고자 한다. 또 상기 리신 단백질의 용균 활성을 엔테로코쿠스 및 스트렙토코쿠스에 대하여 조사하여 본 발명의 활용 범위를 엔테로코쿠스 및 스트렙토코쿠스까지로 넓히고자 한다.

따라서 본 발명의 목적은 인간을 포함한 동물의 감염성 질환의 원인균인 엔테로코쿠스 및 스트렙토코쿠스를 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 가진 신규한 리신 단백질을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 리신 단백질을 유효성분으로 포함하는 엔테로코쿠스 또는 스트렙토코쿠스에 의해 유발되는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 리신 단백질을 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 리신 단백질을 유효성분으로 포함하는 구강 세정제나 치약 등을 포함하는 구강 위생 관련 제제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 리신 단백질을 유효성분으로 포함하는 소독제를 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은, 본 발명자들에 의해 분리되었던 박테리오파지 EFA-1로부터 유래한 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 엔테로코쿠스 및 스트렙트코쿠스를 특이적으로 사멸시킬 수 있는 리신 단백질을 제공한다.

본 발명자들은 엔테로코쿠스 패칼리스를 선택적으로 사멸시키기 위해 예의 노력한 결과, 엔테로코쿠스 패칼리스를 특이적으로 사멸시킬 수 있는 신규한 박테리오파지를 선별하였고 이를 박테리오파지 EFA-1(Bacteriophage EFA-1)로 명명하였다. 이렇게 선별된 박테리오파지를 2008년 2월 26일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터 (기탁번호 KCTC 11289BP)에 기탁하였으며, 관련 내용을 특허출원한 바 있다(대한민국특허출원 제10-2008-0029847).

본 발명자들은 박테리오파지 EFA-1의 유전체로부터 용균 작용과 직접적으로 관련이 있는 리신 단백질의 유전자 부분을 찾아내고, 이를 이용하여 분자생물학 기 술(유전자재조합 기술) 및 생명공학 기술을 이용하여 리신 단백질을 생산하였다.

상기 리신 단백질은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 이를 코딩하는 유전자는 바람직하게는 서열번호 1로 기재되는 염기 서열을 가진다.

본 명세서에서 사용된 "유전자"라는 용어는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 유전자에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Chemical Reviews 90:543-584, 1990).

또 본 발명자들은 본 발명의 리신 단백질이 엔테로코쿠스 패칼리스 뿐만 아니라 엔테로코쿠스 패슘(Enterococcus faecium)과 스트렙토코쿠스 뮤탄스, 스트렙토코쿠스 상귀니스를 포함한 몇 종의 스트렙토코쿠스에 대한 용균 활성도 있음을 확인하였다(참고: 실시예 7, 실시예 8).

따라서, 본 발명의 리신 단백질은 엔테로코쿠스 및 스트렙토코쿠스를 특이적으로 사멸하며, 상기 엔테로코쿠스는 엔테로코쿠스 패칼리스 또는 엔테로코쿠스 패슘이고, 상기 스트렙토코쿠스는 스트렙토코쿠스 아가락티애(Streptocuccus agalactiae), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 상귀니스(Sterptococcus sanguinis) 및 스트렙토코쿠스 우베리스(Streptocuccus uberis)로부터 선택되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 엔테로코쿠스 패칼리스 특이적 사멸능을 갖는 박테리오파지 EFA-1로부터 유래한, 엔테로코쿠스 및 스트렙토 코쿠스의 증식을 효과적으로 억제할 수 있는 리신 단백질을 유효성분으로 포함하는 엔테로코쿠스 또는 스트렙토코쿠스에 의해 유발되는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함되는, 본 발명의 리신 단백질은 상술한 바와 같이 엔테로코쿠스 및 스트렙토코쿠스를 특이적으로 사멸시키므로, 엔테로코쿠스 또는 스트렙토코쿠스에 의해 유발되는 다양한 질환의 치료에 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 약학적 조성물은 엔테로코쿠스에 의해 유발되는 대표 질환인 심내막염, 방광, 전립선 및 부고환의 감염질환, 신경계 감염질환, 패혈증, 젖소 유방염에 대한 치료에 이용될 수 있으며 스트렙토코쿠스에 의한 충치 및 플라그 형성 예방에도 이용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 '치료'라는 용어는 (ⅰ) 엔테로코쿠스 또는 스트렙토코쿠스에 의해 유발된 감염성 질환의 억제; 및 (ⅱ) 엔테로코쿠스 또는 스트렙토코쿠스에 의해 유발된 감염성 질환의 경감을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추 가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 질환 부위에의 도포 또는 분무하는 방법으로 이용할 수 있으며, 그 밖에 경구 투여 또는 비경구 투여를 통해 투여할 수도 있으며, 비경구 투여의 경우 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 도포, 분무 및 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 대상이 되는 동물 및 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사나 수의사는 소망하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로서 본 발명의 리신 단백질을 0.0001-10% (w/v) 포함하며, 바람직하게는 0.001-1% (w/v), 가장 바람직하게는 0.1% (w/v)를 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수도 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 박테리오파지 EFA-1로부터 유 래한 리신 단백질을 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공한다.

본 명세서에 있어서, '항생제’라는 용어는 방부제, 살균제 및 항균제를 총칭한다.

본 발명의 항생제는 일차적으로 엔테로코쿠스 또는 스트렙토코쿠스에 의해 유발되는 질병에 대한 예방 및 치료제로 활용될 수 있다. 또한 기존 항생제에 대한 내성을 획득한 다재 내성 엔테로코쿠스 또는 스트렙토코쿠스에 의한 감염질환 치료에도 활용될 수 있다.

박테리오파지 EFA-1로부터 유래한 본 발명의 리신 단백질은 기존 항생제에 비하여 엔테로코쿠스 및 스트렙토코쿠스에 대한 특이성이 매우 높다는 장점을 갖고 있다. 이는 유용한 다른 균은 죽이지 않고 병원균인 엔테로코쿠스 및 스트렙토코쿠스만을 선택적으로 죽일 수 있으므로 부작용이 상당히 감소된 항생제로서 매우 가치가 있다고 할 수 있다. 또한, 박테리오파지 EFA-1로부터 유래한 본 발명의 리신 단백질을 항생 물질로 이용하게 되면 기존의 항생제를 이용하는 것과는 달리 병원균의 내성 내지 저항성(resistance)을 유도하지 않는다는 중요한 장점을 갖기 때문에 기존의 항생물질에 비하여 제품수명주기(life cycling)가 긴 신규 항생제로서 이용될 수 있다. 다시 말해, 대부분의 항생 물질들은 내성 증가에 직면함에 따라 갈수록 사용범위가 줄어들 수밖에 없는데 반해, 박테리오파지 EFA-1로부터 유래한 본 발명의 리신 단백질을 유효성분으로 포함하는 항생제는 내성 문제를 근본적으로 해결할 수 있기에 그 만큼 항생제로서의 제품수명 주기가 길어질 것으로 기대된다. 따라서 병원성 세균인 엔테로코쿠스 패칼리스를 특이적으로 사멸시키는 박테리오파지 EFA-1로부터 유래한 본 발명의 리신 단백질을 유효성분으로 포함하는 항생제는 항균 효과, 살균 효과 및 방부 효과가 뛰어난 항생제로 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 리신 단백질을 유효성분으로 포함하는 구강 세정제나 치약 등을 포함하는 구강 위생 관련 제제를 제공한다. 구강관련 질환을 유발하는 스트렙토코쿠스 뮤탄스와 스트렙토코쿠스 상귀니스에 대한 특이적 사멸 능력을 가진 본 발명의 리신 단백질을 이용하면 구강용 세정제나 치약 형태의 구강 위생 관련 제제로 구현될 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 박테리오파지 EFA-1로부터 유래한 리신 단백질을 유효성분으로 포함하는 소독제를 제공한다.

박테리오파지 EFA-1로부터 유래한 리신 단백질을 유효성분으로 포함하는 소독제는 병원 2차 감염 예방, 식품위생, 및 축산업 분야에서의 소독제로 그 활용가치가 높다. 이 소독제는 식품산업에서 소독제 및 식품첨가제로 활용될 수 있으며, 조리 장소 및 조리 설비의 소독제로도 유용하게 사용될 수 있다. 그 밖에 축산업 분야에서 엔테로코쿠스 및 스트렙토코쿠스 청정 축산물 생산에도 활용될 수 있다. 특히 상기 리신 단백질은 병원 2차 감염 예방에 효과적이다.

즉, 병원 2차 감염의 예방이나 병원 2차 감염에 대한 치료 목적에 활용될 수 있다. 현재 병원 2차 감염은 매우 심각한 상황이며 이러한 병원 2차 감염의 주된 원인균 중 하나가 바로 엔테로코쿠스이다. 병원 2차 감염 때문에 발생하는 미국의 일 년간 치료비용이 약 300억불에 달한다고 한다. 이는 병원 2차 감염의 심각성을 보여 준다 할 수 있다.

또한 본 발명은 식품산업에서 엔테로코쿠스 및 스트렙토코쿠스 오염 방지용 소독제 및 식품첨가제로 활용될 수 있으며, 조리 장소 및 조리 설비의 소독제로도 유용하게 사용될 수 있다.

그 밖에 축산업 분야에서 엔테로코쿠스 및 스트렙토코쿠스 청정 축산물 생산에 활용될 수 있다. 축산물은 대부분 구입과 동시에 별도의 세척이나 소독과정 없이 식탁에 오른다. 그만큼 생산과 유통과정에서 안전성과 위생성 확보가 중요하다는 얘기다.

본 발명은 병원성 세균인 엔테로코쿠스 및 스트렙토코쿠스를 특이적으로 사멸시키는 능력을 갖는 신규한 리신 단백질을 제공한다. 박테리오파지 EFA-1로부터 유래한 본 발명의 리신 단백질은 엔테로코쿠스 또는 스트렙토코쿠스가 주원인이 되는 감염성 질환의 예방 및 치료제, 구강 위생 관련 제제, 항생제, 항균제, 방부제, 및 다양한 소독제 등으로 광범위하게 사용될 수 있다. 특히 엔테로코쿠스 패칼리스가 병원 2차 감염의 주원인균임을 고려할 때 병원 2차 감염 방지를 위한 약제로 활용될 수 있다. 본 발명에서 개시한 박테리오파지 EFA-1로부터 유래한 리신 단백질을 이용하는 방법은 기존 항생제를 이용하는 방법에 비하여 엔테로코쿠스 및 스트렙토코쿠스에 대한 특이성이 매우 높다는 장점을 갖고 있다. 이는 유용한 다른 균들은 죽이지 않고 병원균인 엔테로코쿠스 및 스트렙토코쿠스만을 선택적으로 죽 일 수 있는 방법을 제공해 줄 수 있으므로 부작용이 획기적으로 감소된 항생제 또는 치료제를 제공할 수 있다는 점에서 매우 가치가 있다고 할 수 있다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 엔테로코쿠스 패칼리스의 분리, 동정 및 엔테로코쿠스 패칼리스를 특이적으로 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리

(1-1) 엔테로코쿠스 패칼리스의 분리 및 동정

엔테로코쿠스 패칼리스에 특이적으로 감염하는 박테리오파지를 분리하기 위해서는 일차적으로 엔테로코쿠스 패칼리스가 분리되어야 한다. 이를 위해 엔테로코쿠스 패칼리스가 존재할 것으로 예상되는 곳을 기반으로 시료를 채집하였다. 엔테로코쿠스 패칼리스를 병원체로부터 분리하고자 선택한 질환은 젖소 유방염으로 하였다. 유방염은 다양한 병원성 세균에 의해 발병되고, 전염성 유방염과 환경형 유방염으로 분류될 수 있며 엔테로코쿠스 패칼리스의 경우 환경형 유방염의 원인세균으로 알려진 세균 중 하나이다. 유방염에 감염된 젖소의 우유 및 기타 우사 내 환경 시료인 토양 및 지푸라기로부터 시료를 채취하였다. 이 시료를 엔테로코쿠스 선택배지인 Bile Esculin Azide agar 배지에 도말(spreading)하여 배양된 세균 집락(colony)을 회수하여 동정(identification)을 실시하였다. 얻어진 세균 중에서 그람염색법(Gram staining method), 카탈라아제 조사(catalase test)와 bioMerieux 사의 Vitek을 이용한 생화학적 조사, 및 16S rDNA 서열분석을 통해 엔테로코쿠스 패칼리스를 분리 및 확인할 수 있었다. Vitek을 이용한 생화학적 조사 결과는 다음 표 1과 같으며 16S rDNA 서열분석 결과는 도 1과 같다.

Vitek ID	200000-0 (C1-12) Catalase - Beta homolysis -
Type	Gram Positive Identification Card (GPI)
Status	Final
Elapsed Time	3 hours
Organism	Enterococcus faecalis - (Group D)
Bionumber	75767621410
PB + BAC + OPT + HCS + 6NC - 10B + 40B + ESC + ARG + URE - TZR + NOV + DEX + LAC + MAN + RAF - SAL + SOR + SUC - TRE + ARA - PYR + PUL - INU - MEL - MLZ - CEL + RIB + XYL - CAT - BH/CO -
99 % Enterococcus faecalis -(Group D)
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(1-2) 엔테로코쿠스 패칼리스에 특이적으로 감염하는 박테리오파지의 분리

그 다음으로, 분리한 엔테로코쿠스 패칼리스를 이용하여 엔테로코쿠스 패칼리스에 특이적으로 감염하는 박테리오파지를 분리하고자 하였다. 박테리오파지는 자연계에 널리 존재하는데, 특히 세균이 존재하는 곳에 공생하는 경우가 많다. 본 발명자들은 엔테로코쿠스 패칼리스에 특이적으로 감염하는 박테리오파지를 분리하기 위해 엔테로코쿠스 패칼리스가 존재할 것으로 예상되는 곳을 기반으로 시료를 채집하였다. 이 채집된 시료를 엔테로코쿠스 패칼리스와 함께 배양한 후, 이 배양액을 원심분리하여 상등액을 얻었다. 이렇게 얻어진 상등액을 여과한 다음, 이 여과액에 박테리오파지 분리를 위한 미끼로 배양된 엔테로코쿠스 패칼리스를 넣어 준 다음 함께 다시 배양하여 엔테로코쿠스 패칼리스의 사멸 여부를 확인하였다. 사멸 여부 확인은 최종적으로 용균반 분석(plaque assay)을 통해 판별하였다.

이를 상세히 설명하면, 엔테로코쿠스 패칼리스를 선택적으로 사멸시킬 수 있는 박테리오파지를 분리하기 위하여 박테리오파지가 존재할 것이라 예상되는 우사 내의 토양, 지푸라기, 흙, 및 하수 등으로부터 시료를 수집하였다. 이 수집된 시료를 엔테로코쿠스 패칼리스와 함께 37℃에서 3-4시간동안 진탕배양 후, 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 이 회수된 상등액을 0.45 μm의 필터를 이용하여 여과를 해준 후, 이렇게 얻어진 여과액을 이용한 용균반 분석을 통해 엔테로코쿠스 패칼리스에 특이적인 박테리오파지를 검출하였다.

용균반 분석 결과가 도 2에 제시되어 있으며, 이렇게 하여 분리된 박테리오파지를 박테리오파지 EFA-1(Bacteriophage EFA-1)로 명명한 뒤, 2008년 2월 26일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(기탁번호 KCTC 11289BP)에 기탁하였다.

실시예 2: 분리된 박테리오파지 유전체의 유전자 서열 분석

상기 실시예 1에서 얻어진 박테리오파지 EFA-1을 특정 짓기 위해 유전체의 유전자 서열 분석을 실시하였다. 이를 위해 박테리오파지 EFA-1의 유전체를 통상의 방법으로 추출하였고 이를 유전자 서열 분석에 이용하였다.

(2-1) 박테리오파지 EFA-1의 유전체 분리

구체적으로, 먼저 1 L 플라스크에 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지(카제인 다이제스트, 17 g/L; 소이빈 다이제스트, 3 g/L; 덱스트로스, 2.5 g/L; NaCl, 5 g/L; 디포타슘 포스페이트, 2.5 g/L) 200 ml, 600 nm에서 흡광도가 1인 엔테로코쿠스 패칼리스 부유액 20 ml 및 1× 10⁸ pfu/ml 수준으로 여과한 박테리오파지 용액 1 ml을 첨가하여 37℃에서 3-4시간 진탕배양 하였다. 배양 후, 엔테로코쿠스 패칼리스가 용균 되었는지 여부를 확인한 다음, 용균이 일어났을 때 이 배양액을 0.45 μm의 필터로 여과해 주었다. 그 후 여과액에 여과액 부피의 6분의 1 부피에 해당하는 20%(w/v)의 "수분자량 8,000의 폴리에틸렌 글리콜/2.5 M NaCl 수용액"을 첨가한 다음, 4℃에서 하룻밤 동안 정치시켰다. 그 후 정치한 액을 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 박테리오파지를 침전물로 얻었다. 이렇게 얻어진 박테리오파지 침전물을 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS) 1 ml로 부유시킨 후, 다시 "20% 폴리에틸렌 글리콜 8000/2.5 M NaCl 수용액"을 6분의 1 부피만큼 첨가한 다음 4℃에서 한 시간 동안 정치시켰다. 한 시간이 지난 후, 정치했던 액을 14,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 정제된 박테리오파지 침전물을 얻는다. 이 침전물을 인산완충식염수 500 μl을 이용해 다시 부유하였다. 그 다음 단계로 박테리오파지 외벽을 와해시키기 위해 proteinase K (20 ㎎/ml) 100 μl와 10%(w/v) 도데실 황산 나트륨염(sodium dodecyl sulfate; SDS) 500 μl를 첨가한 다음 65℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1 시간 반응 후, 이 반응액에 25:24:1의 구성비를 갖는 페놀(phenol) : 클로로포름(chloroform) : 이소아밀알코올(isoamylalcohol)의 혼합액 10 ml를 첨가해 준 후 잘 섞어 주었다. 그리고는 이것을 14,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하여 층이 분리되게 한 다음, 분리된 층 중에서 위층을 취하고 여기에 2 부피비의 차가운 100%(v/v) 알코올을 가하여 순수한 유전체만을 추출하였다.

추출한 박테리오파지의 유전체가 DNA인지, RNA 인지를 확인하기 위해, DNaseⅠ (10 U/μl) 및 RNase A (10 μg/μl)를 각각 첨가해 준 다음 37℃에서 1시간동안 처리하였고, 이와 더불어 DNA일 경우에 단일가닥 DNA인지, 이중가닥 DNA인지 구분하기 위해 녹두(Mung Bean) 뉴클레아제(45 U/μl)를 첨가해 준 다음 상온에서 15분간 처리 하였다. 이렇게 처리한 시료들을 0.8% 아가로즈(agarose) 젤을 이용한 전기영동을 실시하여 각 효소에 의한 절단 양상을 조사하였다. 그 결과, 얻어진 유전체는 DNase I에 민감하였으며 녹두 뉴클레아제에 민감하지 않았다. 이는 얻어진 유전체가 DNA 이중가닥 형태임을 의미한다. 이 결과로부터 얻어진 박테리오파지의 유전체가 DNA형이면서 이중가닥임을 확인할 수 있었다.

(2-2) 박테리오파지 유전체의 유전자 서열 분석

위와 같이 분리된 박테리오파지 유전체는 게노믹 DNA(genomic DNA; gDNA)이다. 이 gDNA의 유전자 서열 분석을 실시하기 위해 gDNA의 라이브러리(library) 구축에 흔히 사용되는 방법인 샷건 라이브러리 구축(shotgun library construction)방법으로 라이브러리를 구축하였다. 이를 상세히 설명하면, 네불라이저(Nebulizer)를 이용한 무작위 절단(random shearing) 기법을 통하여 박테리오파지의 유전체를 1-6kbp 정도로 조각낸 후 이를 말단 수선(end-repairing) 과정을 거쳐 다시 한 번 아가로즈 젤에서 전기영동을 실시한 후 크기에 기반하여 2-5 kbp에 해당되는 유전자 조각(gDNA fragment; insert)을 확보하였다. 이렇게 얻어진 박테리오파지의 유전자 단편을 T4 리가아제(ligase)를 이용해 pC31 벡터(vector)에 삽입(ligation)하여 라이브러리를 구축하였다. 이렇게 하여 준비된 박테리오파지의 유전자 단편이 도입된 재조합 벡터를 통상 사용되는 열자극(heat-shock) 방법에 의한 형질전환법으로 대장균의 한 종인 DH10B' 종에 도입시켰다. 이 플라스미드(plasmid)가 도입된 형질전환체를 배양한 다음 이것으로부터 플라스미드 정제 키트(iNtRON사)를 사용하여 유전자 조각을 포함하고 있는 플라스미드를 추출하였다. 이후 전기영동을 통해 플라스미드에 포함된 유전자 조각의 크기를 확인하였으며 최종 16개의 클론을 선별하였다. 이 선별된 클론들의 플라스미드를 통상의 방법에 따라 회수한 다음 회수된 유전자의 염기서열 분석을 실시하였다. 최종 16개 클론의 유전자 서열을 이용하여 단일 콘티그 지도를 제작하였으며 프라이머 워킹(primer walking)을 통해 최종 21,115 bp의 크기의 전체 유전자 서열을 분석할 수 있었다. 상기 과정을 보여주는 그림이 도 3에 제시되어 있다. 이렇게 하여 얻어진 유전자 서열은 분리된 박테리오파지의 유전체를 구성하는 전체 유전자 서열이며 상세 서열은 대한민국특허출원 제10-2008-0029847호에 제시되어 있다. NCBI Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)를 이용해 공지의 유전자 서열들과 상기 얻어진 유전자 서열과의 비교를 통하여, 상기 얻어진 유전자 서열로부터 리신 단백질에 해당하는 유전자 서열을 추정할 수 있었다. 추정된 리신 단백질의 유전자 서열(987 bp)이 서열번호 1로 제시되어 있다. 상기 리신 단백질의 유전자 서열은 전체 유전자 서열에서 Orf2(Open reading frame 2)에 해당하며 유전자 서열로는 297-1,283 bp에 해당한다(전체 유전자 서열의 분석 결과인 도 4 참조). 참고로, 이 유전자 서열에 해당하는 리신 단백질의 아미노산 서열(328개 아미노산 잔기로 구성)이 서열번호 2로 제시되어 있다. 이렇게 확보된 아미노산 서열을 공지의 다른 리신 단백질 서열들과 비교, 분석해 본 결과, 박테리오파지 EFA-1로부터 유래한 리신 단백질은 현재까지 보고된 바 없는 신규 리신 단백질임을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 리신 단백질 유전자의 클로닝 및 발현 벡터 제작

리신 단백질의 발현을 위하여 리신 단백질의 발현 벡터를 제작했다. 앞서 실시예 2에서의 확인된 리신 단백질의 유전자를 Nco I과 Not I 제한효소 자리를 이용하여 pBAD-TOPO 벡터(Invitrogen 사)에 PCR(polymerase chain reaction) 클로닝하였다. 이를 위해 클로닝 전에 미리 pBAD-TOPO 벡터 내에 존재했던 엔테로키나아제 자리(Enterokinase cleavage site)를 없애고 Not I 제한효소 자리를 삽입시킨 것을 제작한 다음 이를 PCR 클로닝에 이용하였다. 또한 클로닝 후에 스타트 코돈(start codon)을 맞추기 위해 위치특이적 돌연변이 유발 키트(site-directed mutagenesis kit; iNtRON사)를 이용하였으며, 최종 리신 단백질 발현 벡터를 구축하였다. 이렇게 제작된 용균 단백질의 발현 벡터를 pBAD::EFAL-1로 명명하였다. 이 리신 단백질의 발현 벡터를 이용하여 대장균 BL21(DE3)/pLysS(Novagen사)을 형질전환 시켜 리신 단백질의 생산 균주를 제작하였다.

실시예 4: 리신 단백질의 과발현

실시예 3에서 제작된 재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균을 생산균주로 이용하여 리신 단백질을 과발현시켰다. pBAD-TOPO 벡터 기반의 발현시스템은 L-아라비노즈(arabinose)를 이용하여 과발현을 유도(induction)하는 방식으로, 생산균주에 해로운(toxic) 유전자의 경우에도 원활히 발현시킬 수 있는 장점을 지닌 발현 벡터 시스템이다(제작사의 “pBAD expression system"이라는 제목의 설명서 및 제작사의 2004년 발행 설명서 25-0257호).

과발현 유도 과정을 상세히 제시하면 다음과 같다. 제작된 벡터에는 암피실린 저항성 유전자가 존재하고 생산균주 자체에는 클로람페니콜 내성 유전자가 존재하기 때문에 암피실린과 클로람페니콜이 포함된 LB배지(트립톤, 10 g/L; 효모 추출물, 5 g/L; 염화나트륨, 10 g/L) 5 ml에 제작된 리신 단백질의 생산균주를 접종한 다음 37℃에서 한밤동안 진탕 배양한다. 이렇게 밤새 배양한 배양액에서 100 μl를 취해 암피실린과 클로람페니콜이 포함된 새로운 LB배지 10 ml에 재접종하여 37℃에서 다시 진탕 배양한다. 세포 농도가 600 nm에서의 흡광도 기준으로 0.5가 되었을 때, 최종 농도가 0.2%가 되도록 L-아라비노즈를 첨가하여 리신 단백질의 발현을 유도하였다. 발현 유도시 배양온도는 37℃로 동일하게 진행하였으며 추가 4시간 배양을 실시하였다. 배양 종료 후, 세포 배양액 1 ml을 취하여 8,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포 침전물을 회수하였다. 회수된 세포 침전물에 1%(w/v) SDS 용액 100 μl를 가하여 세포를 파쇄한 다음, 세포 파쇄액 중 12 μl를 취하여 전기영동용 시료로 사용하였다. 취한 세포 파쇄액에 통상의 전기영동에 사용되는 5× 전기영동용 샘플 완충액(sample loading buffer) 3 μl를 첨가하여 잘 혼합하고 5분간 물중탕으로 끓여주는 방식으로 시료를 처리한 다음, 통상의 방법에 따라 전기영동을 실시하여 과발현된 리신 단백질을 확인하였으며 이로부터 과발현된 리신 단백질을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 발현된 리신 단백질의 용균 활성 조사

발현된 리신 단백질의 엔테로코쿠스 패칼리스에 대한 용균 활성을 확인하기 위해, 생산균주 배양액 100 ml을 취한 다음 8,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 침전물 형태로 회수하였고, 80 mM 트리스-염산(Tris-HCl, pH 7.2) 완충액 1 ml을 사용하여 이 세포 침전물을 부유시킨 후 초음파 분쇄법(sonication)을 사용하여 세포를 파쇄하였다. 초음파 분쇄법의 적용 조건은 20초간 초음파를 가하여 세포를 깨고 5초간 멈추는 것을 총 20분간 반복하여 실시하였다. 이렇게 하여 얻어진 세포 파쇄액(whole cell lysate)을 다시 한 번 원심분리하여(10,000× g, 5분) 상등액을 회수하였고, 이렇게 얻어진 상등액을 이용하여 발현된 리신 단백질의 용균 활성을 확인해 보았다. 리신 단백질 용균 활성 확인에 사용된 박테리아는 본 발명자들이 분리한, 실시예 1에 제시된 엔테로코쿠스 패칼리스이었다.

실험방법은 TSA 배지에 600 ㎚에서 흡광도가 1 정도 되는 엔테로코쿠스 패칼리스 배양액 1 ml을 평판배지에 도말하여 말린 후, 앞에서 준비한 세포 파쇄액의 원심분리 후의 상등액 5 μl씩을 몇 군데 떨어뜨린 후 37℃ 배양기에서 밤새도록 배양하여 엔테로코쿠스 패칼리스의 용균 정도를 확인하였다. 그 결과는 도 5에 제시되어 있으며, 이 도 5의 결과에서 리신 단백질에 의한 용균 작용으로 투명 용균반이 형성되는 것을 확인할 수 있다.

실시예 6: 발현된 리신 단백질의 분리, 정제

LB 배지를 이용하여 배양한 생산균주의 배양액 500 ml을 8,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포 침전물을 얻었다. 이를 10 ml의 30 mM 트리스-염산(Tris-HCl, pH 8.0) 완충액에 부유시켰다. 이렇게 준비된 세포 부유액을 실시예 5에서와 동일하게 초음파 분쇄법을 이용하여 세포를 파쇄한 다음 이를 8,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거하였다. 이 원심분리를 통하여 얻어진 상등액을 이용한 20%(w/v) 암모늄 설페이트 침전법으로 불필요한 단백질을 침전시켰다. 이를 자세히 설명하면, 상기 얻어진 상등액에 최종 농도가 20%(w/v)가 되게 암모늄 설페이트를 첨가한 후 얼음 속에 15분간 정치시켜 불필요한 단백질이 원활히 침전되도록 하였다. 15분간의 정치 후, 혼합액을 10,000× g에서 15분간 원심분리하여 상층액 회수하였다. 이렇게 준비된 단백질 용액에 포함된 암모늄 설페이트를 제거하기 위해 염제거 크로마토그라피(desalting chromatography)를 실시하였다. 이 때 컬럼 수지(resin)으로는 세파덱스 G-25(sephadex G-25)를 이용하였다. 이 단백질 용액을 마지막으로 0.2 μm 필터로 여과한 다음 음이온-교환 크로마토그라피(anion-exchange chromatography)를 수행하였다. 이때, 음이온-교환수지(anion-exchange resin)로는 Q-Sepharose Fast Flow (QFF, GE Healthcare사)을 사용하였으며, 이는 강한(strong) 음이온-교환 수지에 해당한다. 크로마토그라피는 칼럼을 흡착 완충액(adsorption buffer; 30 mM 트리스-염산, pH 8.0)으로 미리 평형화시킨 다음 실시하였고, 리신 단백질 용액을 칼럼에 적하한 다음에는 3 ml의 흡착 완충액으로 세척 단계를 실시하였다. 이 조건에서는 많은 대장균 유래의 다른 단백질은 칼럼의 충진 수지에 붙지 않고 씻겨 나왔다. 최종적으로 1 M의 염화칼륨 용액을 사용하여 0 에서 1 M까지 농도를 변화시키면서 리신 단백질을 용출시켰다. 리신 단백질을 포함한 용출액 분획(fraction)은 4℃에서 밤새도록 30 mM 트리스-염산 완충액 (pH 8.0)에 대하여 투석하여 리신 단백질의 용출에 사용된 염화칼륨을 제거하였고, 이 투석액을 건조한 폴리에틸렌 글리콜 20,000에 대하여 투석을 한 번 더 실시하여 마지막으로 농축하였다. 분리, 정제의 결과가 도 6에 제시되어 있다.

실시예 7: 정제된 리신 단백질의 다양한 박테리아에 대한 용균 활성 조사

본 발명자들은 박테리오파지 EFA-1로부터 유래한 본 발명의 리신 단백질의 용균 활성을 여러 엔테로코쿠스, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 살모넬라(Salmonella), 및 스트렙토코쿠스 종에 대하여 조사해 보았다. 상기 박테리아는 항생제내성균주은행(Culture Collection of Antimicrobial Resistant Microbes; CCARM; 서울시 노원구 공릉 2동 126 서울여자대학교 제 1 과학관 429호) 또는 미국의 The American Type Culture Collection(ATCC)로부터 분양을 받았거나 본 발명자들에 의해 분리, 확보된 것들이다.

실험방법은 TSA 배지에 600 ㎚에서 흡광도가 1 정도 되는 각 박테리아 배양액 1 ml을 각각 다른 평판배지에 도말하여 말린 후, 실시예 6에서 준비한 리신 단백질 용액을 적용된 리신 단백질의 양이 10 μg이 되도록 몇 군데 떨어뜨렸다. 이를 37℃ 배양기에서 30분 동안 배양하면서 각 박테리아의 용균 정도를 확인하였다. 그 결과는 다음과 같다.

종명	균주정보¹⁾	용균활성²⁾
Enterococcus faecalis	5168(CCARM)	++
Enterococcus faecalis	5169(CCARM)	++
Enterococcus faecalis	5170(CCARM)	++
Enterococcus faecalis	5171(CCARM)	++
Enterococcus faecalis	5172(CCARM)	+
Enterococcus faecalis	5173(CCARM)	+
Enterococcus faecalis	5174(CCARM)	+
Enterococcus faecalis	5175(CCARM)	+
Enterococcus faecalis	5176(CCARM)	+
Enterococcus faecalis	5177(CCARM)	+
Enterococcus faecalis	0011(ATCC)	+
Enterococcus faecium	5192(CCARM)	++
Enterococcus faecium	5193(CCARM)	++
Enterococcus faecium	5195(CCARM)	++
Enterococcus faecium	5196(CCARM)	++
Enterococcus faecium	5197(CCARM)	++
Enterococcus faecium	5198(CCARM)	++
Enterococcus faecium	5199(CCARM)	++
Salmonella enteritidis	자체 분리	-
Salmonella gallinarum	자체 분리	-
Salmonella typhimurium	자체 분리	-
Staphylococcus aureus	31886 (ATCC)	-
Staphylococcus aureus	자체 분리	-
Streptococcus agalactiae	27956 (ATCC)	-
Streptococcus agalactiae	7077 (ATCC)	+
Streptococcus mutans	자체 분리	++
Streptococcus sanguinis	자체 분리	+
Streptococcus uberis	BAA 854 (ATCC)	-
Streptococcus uberis	자체 분리	++
¹⁾ 균주정보: CCARM, Culture Collection of Antimicrobial Resistant Microbes; ATCC, The American Type Culture Collection
²⁾ 용균활성: ++, 강한 용균 활성; +, 중간 용균 활성; -, 비 용균 활성 (처치 30 분후 조사). “강한 용균 활성”과 “중간 용균 활성”은 상대적 활성의 차이를 나타내며, 이 두 경우 모두 용균 활성이 확인된 경우에 해당함. “비 용균 활성”은 용균 활성이 확인되지 않은 경우에 해당함.

이 결과에서 알 수 있듯이 박테리오파지 EFA-1로부터 유래한 리신 단백질은 예상했듯이 황색포도상구균 및 살모넬라에는 용균 활성이 없었으며, 엔테로코쿠스와 스트렙토코쿠스에는 용균 활성이 있었다. 이로부터 박테리오파지 EFA-1로부터 유래한 본 발명의 리신 단백질은 엔테로코쿠스 또는 스트렙토코쿠스에 의해 유발되는 감염성 질환의 치료에 효과적으로 활용될 수 있음을 알 수 있다.

실시예 8: 얻어진 리신 단백질을 이용한 엔테로코쿠스 패칼리스의 감염 예방에 대한 적용예

9 ml의 영양배지(Nutrient broth: 소고기 추출물 3 g/L, 펩톤 5 g/L) 하나에는 약 0.1%(w/v)의 리신 단백질 용액 100 μl를 넣어주고 대조실험의 같은 조성의 배지에는 리신 단백질 용액을 넣어주지 않은 시료를 각각 준비하였다. 여기에 최종적으로 600 nm에서 흡광도가 0.5 정도가 되도록 병원성 엔테로코쿠스 패칼리스 배양액을 각각 넣어준 다음 엔테로코쿠스 패칼리스의 배양 상태를 관찰해 보았다. 표 3의 결과에서 보는 바와 같이, 리신 단백질 용액을 첨가해 주지 않은 배지에서는 60분 후 600 nm에서의 흡광도가 1.5 정도가 될 정도로 엔테로코쿠스 패칼리스가 매우 잘 성장하는 반면에, 리신 단백질 용액을 첨가해 준 영양배지에서는 10분경과 후 600 nm에서의 흡광도가 0.1 정도 수준으로, 60분 후에는 0.04 수준으로 점차 감소하는 것을 관찰할 수 있었다.

엔테로코쿠스 패칼리스 사멸 능력(OD₆₀₀ 흡광도 값)

구분	배양 0시간	배양 후 10분	배양 후 60분
대조군(무처리)	0.5	0.7	1.5
실험군 (리신 단백질 용액 첨가)	0.5	0.1	0.04

이 결과로부터 박테리오파지 EFA-1로부터 유래한 본 발명의 리신 단백질이 엔테로코쿠스 패칼리스의 성장을 저해할 뿐만 아니라 사멸까지 시키는 능력이 있어 엔테로코쿠스 패칼리스의 감염을 막는데 매우 효과적임을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 분리된 엔테로코쿠스 패칼리스의 16S rDNA 서열분석 결과를 보여주는 결과이다.

도 2는 용균반 분석에 의해 엔테로코쿠스 패칼리스에 특이적인 박테리오파지를 검출한 평판접시 사진이다.

도 3은 박테리오파지 EFA-1 유전자의 라이브러리 구축 과정을 보여주는 결과이다.

도 4는 박테리오파지 EFA-1의 유전체의 유전자 서열을 분석한 결과를 보여주는 결과이다.

도 5는 엔테로코쿠스 패칼리스에 대한 용균 활성을 확인한 결과를 보여주는 사진으로서, 투명한 용균반은 본 발명에서 개시한 리신 단백질의 용균 활성에 의해 생성된 것이다.

도 6은 정제된 리신 단백질을 단백질 전기영동으로 확인한 결과를 보여주는 사진으로서, 레인 M은 단백질 크기 마커(맨 위에서부터 198, 115, 90.5, 61.5, 46.2, 37.8, 26, 및 18.5 kDa)이고, 레인 1은 정제 전 시료이고, 레인 2는 정제 후 시료이다. “*”표시는 본 발명의 리신 단백질 위치를 가리킨다.

<110> iNtRON Biotechnology, Co. Ltd. <120> Novel Lysin Protein Having Killing Activity Specific to Enterococcus and Streptococcus <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 987 <212> DNA <213> Nucleic acid sequence of Lysin Protein from Bacteriophage EFA-1 <400> 1 atgaaattaa aaggaatttt attatcagta gtaacaacat ttggattgct ttttggtgca 60 acaaatgtac aagcatatga agtcaacaac gaatttaatt tacaaccatg ggaaggtagc 120 caacaactgg catatcctaa taaaatcatc ttacatgaaa cagctaatcc acgtgcaaca 180 ggtcgtaatg aagctacgta tatgaaaaac aactggttta atgcacatac tacagccatt 240 gttggtgatg gtggcattgt ttataaagta gcaccagaag gtaacgtatc atggggtgct 300 ggtaatgcta acccttacgc accagttcaa attgagttac aacatacaaa cgaccctgaa 360 ctatttaaag ccaactataa agcatatgtt gactatacac gggacatggg caaaaagttt 420 ggtattccaa tgacacttga ccaaggtggt tcactttggg aaaaaggtgt agtatctcac 480 caatgggtta cagactttgt atggggtgac cacacagacc cttatggtta cttagctaag 540 atgggtatca gtaaagctca attggcacat gacttagcta atggggttag tggtaacaca 600 gcaacaccta ctcctaaacc tgataaacct aagccaacac aacctagtaa acctagtaat 660 aaaaaacgct tcaattaccg tgtagatggc ttagagtatg taaatggaat gtggcaaatc 720 tacaacgaac atttaggtaa aattgacttt aattggactg aaaacggtat tccagtagaa 780 gttgttgaca aggttaatcc agcaacagga caacctacta aggaccaagt actaaaagtt 840 ggcgactatt tcaacttcca agaaaacagc acaggtgtag tacaagagca aacaccttac 900 atgggttata cattatctca tgtacaatta ccaaatgaat ttatctggtt gttcacagat 960 agtaaacaag ccttaatgta tcaataa 987 <210> 2 <211> 328 <212> PRT <213> Lysin Protein from Bacteriophage EFA-1 <400> 2 Met Lys Leu Lys Gly Ile Leu Leu Ser Val Val Thr Thr Phe Gly Leu 1 5 10 15 Leu Phe Gly Ala Thr Asn Val Gln Ala Tyr Glu Val Asn Asn Glu Phe 20 25 30 Asn Leu Gln Pro Trp Glu Gly Ser Gln Gln Leu Ala Tyr Pro Asn Lys 35 40 45 Ile Ile Leu His Glu Thr Ala Asn Pro Arg Ala Thr Gly Arg Asn Glu 50 55 60 Ala Thr Tyr Met Lys Asn Asn Trp Phe Asn Ala His Thr Thr Ala Ile 65 70 75 80 Val Gly Asp Gly Gly Ile Val Tyr Lys Val Ala Pro Glu Gly Asn Val 85 90 95 Ser Trp Gly Ala Gly Asn Ala Asn Pro Tyr Ala Pro Val Gln Ile Glu 100 105 110 Leu Gln His Thr Asn Asp Pro Glu Leu Phe Lys Ala Asn Tyr Lys Ala 115 120 125 Tyr Val Asp Tyr Thr Arg Asp Met Gly Lys Lys Phe Gly Ile Pro Met 130 135 140 Thr Leu Asp Gln Gly Gly Ser Leu Trp Glu Lys Gly Val Val Ser His 145 150 155 160 Gln Trp Val Thr Asp Phe Val Trp Gly Asp His Thr Asp Pro Tyr Gly 165 170 175 Tyr Leu Ala Lys Met Gly Ile Ser Lys Ala Gln Leu Ala His Asp Leu 180 185 190 Ala Asn Gly Val Ser Gly Asn Thr Ala Thr Pro Thr Pro Lys Pro Asp 195 200 205 Lys Pro Lys Pro Thr Gln Pro Ser Lys Pro Ser Asn Lys Lys Arg Phe 210 215 220 Asn Tyr Arg Val Asp Gly Leu Glu Tyr Val Asn Gly Met Trp Gln Ile 225 230 235 240 Tyr Asn Glu His Leu Gly Lys Ile Asp Phe Asn Trp Thr Glu Asn Gly 245 250 255 Ile Pro Val Glu Val Val Asp Lys Val Asn Pro Ala Thr Gly Gln Pro 260 265 270 Thr Lys Asp Gln Val Leu Lys Val Gly Asp Tyr Phe Asn Phe Gln Glu 275 280 285 Asn Ser Thr Gly Val Val Gln Glu Gln Thr Pro Tyr Met Gly Tyr Thr 290 295 300 Leu Ser His Val Gln Leu Pro Asn Glu Phe Ile Trp Leu Phe Thr Asp 305 310 315 320 Ser Lys Gln Ala Leu Met Tyr Gln 325

Claims

엔테로코쿠스(Enterococcus) 및 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 특이적 사멸능을 갖는, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 리신(Lysin) 단백질.
제 1 항에 있어서, 상기 리신 단백질은 박테리오파지 EFA-1(Bacteriophage EFA-1, 기탁번호 KCTC 11289BP)로부터 유래된 것을 특징으로 하는 리신 단백질.
제 1 항에 있어서, 상기 엔테로코쿠스는 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 또는 엔테로코쿠스 패슘(Enterococcus faecium)인 것을 특징으로 하는 리신 단백질.
제 1 항에 있어서, 상기 스트렙토코쿠스는 스트렙토코쿠스 아가락티애(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 상귀니스(Streptococcus sanguinis) 및 스트렙토코쿠스 우베리스(Streptococcus uberis)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 리신 단백질.
제 1 항의 리신 단백질을 코딩하는 유전자.
제 5 항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 리신 단백질을 유효성분으로 포함하는, 엔테로코쿠스 또는 스트렙토코쿠스에 의해 유발되는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 엔테로코쿠스 또는 스트렙토코쿠스에 의해 유발되는 감염성 질환은 심내막염(endocarditis), 방광(bladder), 전립선(prostate) 및 부고환(epididymal) 감염질환, 신경계(nervous system) 감염질환, 패혈증, 젖소 유방염(bovine mastitis), 및 충치로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 리신 단백질을 유효성분으로 포함하는 항생제.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 리신 단백질을 유효성분으로 포함하는 구강 위생 관련 제제.
제 10 항에 있어서, 상기 구강 위생 관련 제제는 구강 세정제 및 치약을 포함하는 구강 위생 관련 제제.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 리신 단백질을 포함하는 소독제.