CN117295509A - 用于抑制产肠毒素脆弱拟杆菌增殖的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

一种用于预防或治疗由产肠毒素脆弱拟杆菌引起的感染或疾病的组合物，包括具有裂解产肠毒素脆弱拟杆菌细胞的能力的长尾噬菌体科噬菌体(Bac‑FRP‑3)和药学上可接受的载体。一种用于预防或治疗由产肠毒素脆弱拟杆菌引起的感染或疾病的方法，包括向受试者施用长尾噬菌体科噬菌体以及用长尾噬菌体科噬菌体裂解产肠毒素脆弱拟杆菌细胞。

Description

用于抑制产肠毒素脆弱拟杆菌增殖的组合物和方法

本申请要求于2021年4月10日提交的美国非临时专利申请号17/227,284的优先权，该申请出于所有目的通过引用并入，如同在本文中完整阐述一样。

技术领域

本发明涉及用于抑制产肠毒素脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)增殖的组合物和方法，更具体地，涉及含长尾噬菌体科噬菌体(Siphoviridae bacteriophage)的组合物及其使用方法。

背景技术

拟杆菌属占粪便菌群群落的近一半，并且是对宿主营养以及粘膜和全身免疫至关重要的宿主共生体。在拟杆菌属中，脆弱拟杆菌(B.fragilis)菌株是机会致病菌。产肠毒素脆弱拟杆菌(ETBF)可产生一种蛋白水解肠毒素，称为脆弱拟杆菌肠毒素(BFT)或脆弱菌溶素，其可引起分泌性腹泻和结肠上皮损伤。ETBF在过去35年中作为动物和人类腹泻疾病的全球病因而出现，并伴有结肠炎(Clin.Microbiol.Rev.22:349–369,2009)。ETBF与慢性肠道疾病的关联已被证实20多年，ETBF还与溃疡性结肠炎和结肠肿瘤正相关(Gut Pathog.9:53-59,2017；BMC Canc.19:879-882,2019)。

此外，ETBF可能导致癌症，例如结直肠癌(CRC)。CRC是最常见的癌症之一，约占所有癌症病例的10％，约占所有癌症死亡的8％。已知BFT可与结肠上皮细胞(CEC)结合，并刺激肿瘤抑制蛋白E-钙粘蛋白的裂解。E-钙粘蛋白裂解增加肠道屏障通透性，并通过基本上在所有CRC中都被组成性激活的β-连环蛋白/Wnt途径增强细胞信号传导。因此，BFT在体外刺激人结肠癌细胞的增殖和迁移(Gastroenterology 124：392-400，2003)。BFT进一步激活核因子-κB(NF-κB)途径(其通过CEC诱导促炎细胞因子分泌)的能力以及表明特定的NF-κB库促进上皮肿瘤发生的启动和升级的数据导致了以下假设：ETBF是促炎、致癌的结肠细菌。这一假设得到了最近在土耳其进行的一项小型研究的支持，该研究表明CRC患者中的ETBF定殖比没有CRC的对照组更频繁(Clin.Microbiol.Infect.12:782–786,2006)。

通常，抗生素被用于ETBF的传染性疾病的治疗。在这里，由于抗生素耐药性ETBF的增加，抗生素的有效性一直在不断下降，需要研发除目前处方抗生素以外的有效方法。

最近，使用噬菌体作为防治细菌性传染性疾病的对策引起了广泛关注。噬菌体是感染细菌的非常小的微生物，通常简称为“噬体”。一旦噬菌体感染细菌细胞，噬菌体就会在细菌细胞内增殖。增殖后，噬菌体的后代破坏细菌细胞壁并从宿主细菌中逃脱，表明噬菌体具有杀灭细菌的能力。噬菌体感染细菌的方式的特点是其非常高的特异性，因此感染特定细菌的噬菌体类型的数量是有限的。也就是说，某种噬菌体只能感染特定的细菌，这表明某种噬菌体仅能杀灭特定的细菌而不能伤害其他细菌。由于噬菌体的这种细菌特异性，噬菌体仅对目标细菌具有抗菌作用，但不影响包括人类在内的动物中的共生细菌。广泛用于细菌治疗的传统抗生素附带地也会影响多种细菌。这会导致诸如正常微生物群落紊乱的问题。另一方面，噬菌体的使用不会干扰正常微生物群落，因为目标细菌被选择性地杀灭。因此，可以安全地使用噬菌体，与任何其他抗生素相比，这大大降低了使用中发生不良作用的可能性。

由于噬菌体具有杀灭细菌的独特的能力，自其被发现以来，噬菌体作为一种防治细菌感染的潜在的有效对策引起了人们的关注，存在大量相关研究。

噬菌体往往对细菌具有高度特异性。研究表明，噬菌体的攻击具有特异性，即一种噬菌体仅针对一种细菌(甚至一种细菌的特定菌株)。此外，噬菌体的抗菌强度可能取决于目标菌株的类型。因此，有必要收集多种有用的噬菌体，以便有效控制特定细菌。因此，为了研发针对ETBF的有效噬菌体利用方法，必须获得对ETBF具有抗菌作用的多种噬菌体。此外，需要筛选产生的噬菌体，根据它们在抗菌强度和抗菌谱方面是否优于其他噬菌体。

发明内容

因此，本发明是考虑到相关技术中遇到的问题而做出的，并且旨在解决这些问题。

在一个实施方式中，用于预防或治疗由ETBF引起的感染或疾病的组合物包括：具有裂解ETBF细胞的能力的长尾噬菌体科噬菌体以及药学上可接受的载体。

在另一个实施方式中，长尾噬菌体科噬菌体具有包括如SEQ ID NO:1所述的序列的基因组；或者具有这样的基因组，该基因组具有：(1)具有至少93％查询覆盖率且与SEQID NO:1具有至少95％同一性的序列，(2)环状基因组拓扑，以及(3)69个开放阅读框。

在另一个实施方式中，长尾噬菌体科噬菌体的浓度为1×10¹pfu/ml至1×10³⁰pfu/ml或1×10¹pfu/g至1×10³⁰pfu/g。

在另一个实施方式中，长尾噬菌体科噬菌体的浓度为1×10⁴pfu/ml至1×10¹⁵pfu/ml或1×10⁴pfu/g至1×10¹⁵pfu/g。

在另一个实施方式中，药学上可接受的载体是乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶橡胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁或矿物油。

在另一个实施方式中，组合物还包括选自由润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂组成的组的一种或多种。

在另一个实施方式中，由ETBF引起的感染或疾病是急慢和慢性肠道疾病、菌血症、腹泻、结肠炎、结肠瘤或癌症。癌症是结直肠癌或结肠癌，但不限于此。

在另一个实施方式中，组合物是溶液、悬浮液、油乳液、水溶性介质、提取物、粉末、颗粒、片剂或胶囊。

在另一个实施方式中，组合物进一步包括具有裂解ETBF细菌种的能力的第二噬菌体，所述第二噬菌体的基因组具有查询覆盖率低于93％且与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的序列。

在另一个实施方式中，长尾噬菌体科噬菌体的主要结构蛋白的大小约为25kDa、48kDa、68kDa、75kDa、117kDa和245kDa。

在另一个实施方式中，长尾噬菌体科噬菌体具有10-100分钟的潜伏期和1000-2100PFU/感染细胞的裂解量。

在另一个实施方式中，潜伏期为40-80分钟，裂解量为300-1500PFU/感染细胞。

在一个实施方式中，用于预防或治疗由ETBF引起的感染或疾病的方法包括向受试者施用长尾噬菌体科噬菌体；以及用长尾噬菌体科噬菌体裂解ETBF。

在另一个实施方式中，长尾噬菌体科噬菌体包括如SEQ ID NO:1所述的序列。

在另一个实施方式中，长尾噬菌体科噬菌体的浓度为1×10¹pfu/ml至1×10³⁰pfu/ml或1×10¹pfu/g至1×10³⁰pfu/g。

在另一个实施方式中，长尾噬菌体科噬菌体的浓度为1×10⁴pfu/ml至1×10¹⁵pfu/ml或1×10⁴pfu/g至1×10¹⁵pfu/g。

应当理解，上述一般描述和以下详细描述都是示例性和解释性的，旨在提供对所要求保护的本发明的进一步解释。

发明的有益效果

与基于抗生素的传统组合物和方法相比，本申请的用于抑制ETBF增殖的组合物和方法对ETBF具有高特异性。该组合物可用于预防或治疗ETBF感染，而不影响其他有用的共生菌，并且具有较小的副作用。一般来说，当使用抗生素时，共生菌也受到损害，因此由于其使用而产生各种副作用。同时，在噬菌体对相同细菌菌种表现出抗菌活性的情况下，噬菌体的每种抗菌特性(例如抗菌强度和抗菌谱(宿主范围))是不同的，并且噬菌体通常仅对相同细菌菌种中的某些细菌菌株有效。因此，本申请的组合物和方法在其工业应用中提供了不同的效果。

附图说明

附图是为了提供对本发明的进一步理解而被列入的，其被纳入本说明书并构成本说明书的一部分，附图说明了本发明的实施方式，并与描述一起用于解释本发明的原理。

在附图中：

图1是示出噬菌体Bac-FRP-3的形态的电子显微照片。

图2是噬菌体Bac-FRP-3的主要结构蛋白的分析结果。

图3是示出噬菌体Bac-FRP-3杀灭ETBF的能力的实验结果的照片。透明区是由目标细菌裂解形成的斑块。

图4是噬菌体Bac-FRP-3的一步生长曲线。

具体实施方式

现在将详细参考本发明的实施方式，其示例在附图中示出。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种名为Bac-FRP-3的长尾噬菌体科噬菌体，其具有特异性杀灭ETBF的能力，并具有包含如SEQ ID NO:1所述序列的基因组。在一些实施方式中，长尾噬菌体科噬菌体含有：具有所有以下特征的基因组：1)包括具有至少93％查询覆盖率且与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的序列，2)具有环状基因组拓扑，3)具有69个开放阅读框；具有以下所有特征的基因组：1)包括具有至少94％查询覆盖率且与SEQID NO:1具有至少95％同一性的序列，2)具有环状基因组拓扑，以及3)具有69个开放阅读框；具有以下所有特征的基因组：1)包括具有至少95％查询覆盖率且与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的序列，2)具有环状基因组拓扑，以及3)具有69个开放阅读框；或具有所有以下特征的基因组：1)包括具有至少96％查询覆盖率且与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的序列，2)具有环状基因组拓扑，以及3)具有69个开放阅读框。

本发明还提供了使用包含其作为活性成分的组合物的用于预防和治疗由ETBF引起的感染或疾病的方法。

噬菌体Bac-FRP-3由本申请的发明人分离，然后于2020年12月9日保藏在韩国生命工学研究院的韩国典型培养物保藏中心(保藏号：KCTC 14401BP)。

噬菌体Bac-FRP-3的主要结构蛋白的分子量约为25kDa、48kDa、68kDa、75kDa、117kDa和245kDa。

噬菌体Bac-FRP-3的潜伏期和裂解量分别为10-100分钟和1000-2100PFU/感染细胞，优选分别为40-80分钟和300-1500PFU/感染细胞，但不限于此。

此外，本发明提供了一种可用于预防或治疗由ETBF引起的感染或疾病的组合物，其包括噬菌体Bac-FRP-3作为活性成分。

因为包含在本发明组合物中的噬菌体Bac-FRP-3能有效杀灭ETBF，所以其被认为可有效预防ETBF感染或治疗由ETBF引起的疾病。因此，本发明的组合物能够被用于预防和治疗由ETBF引起的疾病。

本发明中由ETBF引起的疾病包括急性和慢性肠道疾病、菌血症、腹泻、结肠炎、结肠瘤或癌症，但不限于此。

本发明的组合物中包含的药学上可接受的载体是通常用于制备药物制剂的载体，其示例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶橡胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油，但不限于此。除了上述成分之外，本发明的组合物还可以包括润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂。

在本发明的组合物中，包括噬菌体Bac-FRP-3作为活性成分。包括的噬菌体Bac-FRP-3的浓度为1×10¹pfu/ml至1×10³⁰pfu/ml或1×10¹pfu/g至1×10³⁰pfu/g，优选浓度为1×10⁴pfu/ml至1×10¹⁵pfu/ml或1×10⁴pfu/g至1×10¹⁵pfu/g。

本发明的组合物可以根据本发明所属领域的普通技术人员使用单位剂量形式或在多剂量容器中的药学上可接受的载体和/或赋形剂能够容易地进行的方法进行配置。然后，制剂可以是溶液、悬浮液或油乳液或水溶性介质、提取物、粉末、颗粒、片剂或胶囊的形式。可以另外包括分散剂或稳定剂。

为了提高上述目的的有效性，可在本发明的组合物中进一步包括对非ETBF细菌菌种具有抗菌活性的噬菌体。此外，在本发明的组合物中还可以包括对ETBF具有抗菌活性的其他种类的噬菌体。可以附加地包括这些噬菌体，以使抗菌效果最大化，因为噬菌体的每种抗菌性质(例如抗菌强度和抗菌谱(宿主范围))在噬菌体对相同细菌菌种表现出抗菌活性的情况下是不同的。

在本说明书中，术语“预防”表示(i)阻断ETBF感染；和(ii)抑制由ETBF感染引起的疾病的进展。

在本说明书中，术语“治疗”表示所有以下活动：(i)抑制由ETBF引起的疾病；和(ii)减轻由ETBF引起的疾病的病理状况。

在本说明书中，术语“由ETBF引起的疾病”和“ETBF感染”表示急性和慢性肠道疾病、菌血症、腹泻、结肠炎、结肠瘤或癌症，但不限于此。

在本说明书中，术语“潜伏期”表示噬菌体微粒在受感染的宿主细胞内繁殖所花的时间。

在本说明书中，术语“裂解量”表示每个被感染的细菌产生的噬菌体的数量。

在本说明书中，术语“分离”表示通过应用各种实验技术从自然界中分离噬菌体的行为，以及确保能够区分目标噬菌体和其他噬菌体的特性的行为，并且还包括使用生物工程技术增殖目标噬菌体从而使得目标噬菌体可工业应用的行为。

在本说明书中，术语“查询覆盖率”和“同一性”与BLAST(基本局部比对搜索工具)有关，BLAST是由NCBI(美国国家生物技术信息中心)提供的在线搜索工具。

在本说明书中，查询覆盖率是描述多少查询序列(即，噬菌体Bac-FRP-3的基因组序列)被目标序列(即，先前报告的噬菌体的基因组序列)覆盖的数字。如果数据库中的目标序列涵盖整个查询序列，则查询覆盖率是100％。这表明序列相对于彼此有多长。

在本说明书中，针对“查询覆盖率”测量了术语“同一性”或“序列同一性”，并且“同一性”或“序列同一性”是描述查询序列(即噬菌体Bac-FRP-3的基因组序列)与目标序列(即，先前报告的噬菌体的基因组序列)相似程度的数字。更具体地，当查询序列(即噬菌体Bac-FRP-3的基因组序列)和目标序列(即，先前报告的噬菌体的基因组序列)通过BLAST比对分析来分析时，术语“同一性”或“序列同一性”是指目标序列(即，先前报告的噬菌体的基因组序列)或查询序列(即噬菌体Bac-FRP-3的基因组序列)的跨越序列部分中相同核苷酸的百分比。同一性百分比越高，匹配越显著。从以上对于“查询覆盖率”和“序列同一性”的定义，对于本领域技术人员来说明显的是，两个相似噬菌体的基因组之间“查询覆盖率”和/或“序列同一性”的差异导致位于两个基因组中的ORF(开放阅读框)数量的差异，然后导致两个相似噬菌体的区别特征(包括目标菌株的范围以及抗菌活性强度)。

在本说明书中，术语“第二噬菌体”是具有特异性杀死ETBF的能力并且具有基因组的任何噬菌体，所述基因组具有含以下特征的序列：具有小于93％查询覆盖率且与SEQ IDNO:1具有至少95％同一性，且具有与噬菌体Bac-FRP-3在基因组拓扑和ORF的数量方面不同的特征，其中第二噬菌体的基因组拓扑为线性形式。

如以下实施例所示，本发明的实际的和当前优选的实施方式是说明性的。

然而，应当理解，本领域技术人员在考虑本公开内容的基础上，可以在本发明的精神和范围内进行修改和完善。

实施例1：能够杀灭ETBF的噬菌体的分离

从环境或临床样本中收集样本，以分离能够杀灭ETBF的噬菌体。这里，用于噬菌体分离的ETBF菌株已经由本申请的发明人预先分离并鉴定为ETBF。

下文详细描述了分离噬菌体的步骤。将收集的样本添加到以1/100的比例接种ETBF的BHIB(脑心浸液肉汤)培养基(小牛脑浸液200克起，7.7g/L；牛心浸液250克起，9.8g/L；月示蛋白胨，10g/L；葡萄糖，2g/L；氯化钠，5g/L；磷酸二钠，2.5g/L)，然后在37℃厌氧条件下静止培养两天。培养完成后，以8000rpm离心20分钟，回收上清液。回收的上清液以1/100的比例接种ETBF，然后在37℃厌氧条件下静止培养两天。当样本含有噬菌体时，为了充分增加噬菌体的数量(滴度)，将上述步骤重复总共5次。重复该步骤5次后，将培养液以8000rpm离心20分钟。离心后，使用0.45μm过滤器过滤回收的上清液。将获得的滤液用于典型的斑点试验，以检查其中是否包含能够杀灭ETBF的噬菌体。

斑点试验如下进行：以1/100的比例将ETBF接种到BHIB培养基，然后在37℃厌氧条件下静止培养两天。将2ml(OD₆₀₀为1.5)的上述制备的ETBF培养液涂抹在BHIA(小牛脑浸液200克起，7.7g/L；牛心浸液250克起，9.8g/L；月示蛋白胨，10g/L；葡萄糖，2g/L；氯化钠，5g/L；磷酸二钠，2.5g/L；琼脂，15g/L)平板上。将平板放置在清洁的工作台上约30分钟，以干燥涂抹的溶液。干燥后，将10μl制备好的滤液点在其上涂有ETBF的平板培养基上，然后放置干燥约30分钟。干燥后，将被点滴的平板培养基在37℃厌氧条件下培养两天，然后检查在滴有滤液的位置透明区的形成。在滤液产生透明区的情况下，则判断其中包括能够杀灭ETBF的噬菌体。通过上述检查，可以获得含有具有杀灭ETBF能力的噬菌体的滤液。

从上述确认的滤液中分离出纯噬菌体，以得到能够杀灭ETBF的噬菌体。传统的噬斑测定用于分离纯噬菌体。详细地说，使用灭菌的尖端回收在噬斑测定过程中形成的噬斑，然后将其添加到ETBF的培养溶液中，然后在37℃厌氧条件下培养两天。培养后，以8000rpm离心20分钟以获得上清液。将ETBF培养液以1/50的体积比添加到获得的上清液中，然后在37℃厌氧条件下培养2天。为了增加噬菌体的数量，重复上述步骤至少5次。然后，以8000rpm离心20分钟，以获得最终上清液。使用得到的上清液进一步进行噬斑测定。一般来说，纯噬菌体的分离不是通过步骤的单次迭代完成的，因此使用上述形成的得到的噬斑重复上述步骤。在至少5次重复该步骤后，获得含有纯噬菌体的溶液。通常重复分离纯噬菌体的步骤，直到生成的噬斑在大小和形态上变得彼此相似。此外，使用电子显微镜确认纯噬菌体的最终分离。重复上述步骤，直到使用电子显微镜确认分离出纯噬菌体。根据常规方法操作电子显微镜。简言之，将含有纯噬菌体的溶液加载到铜网格上，然后用2％醋酸铀酰进行负染色并干燥。然后使用透射电子显微镜观察其形态。分离的纯噬菌体的电子显微照片如图1所示。根据形态学特征，确认上述分离的新噬菌体属于长尾噬菌体科噬菌体。

对含有上述确认的纯噬菌体的溶液进行以下纯化过程。以噬菌体溶液的总体积计，以1/50的体积比将ETBF培养液添加到含有纯噬菌体的溶液中，然后进一步在厌氧条件下培养两天。培养后，以8000rpm离心20分钟以获得上清液。重复该步骤总共5次，以获得含有足够数量的噬菌体的溶液。将最终离心得到的上清液使用0.45μm过滤器过滤，然后采用常规聚乙二醇(PEG)沉淀工艺。具体地，将PEG和NaCl添加到100ml滤液中，直到达到10％PEG 8000/0.5M NaCl，然后在4℃下放置2-3小时。此后，以8000rpm离心30分钟以获得噬菌体沉淀。将所得噬菌体沉淀悬浮于5ml缓冲液中(10mM Tris-HCl、10mM MgSO₄、0.1％明胶、pH 8.0)。所得材料被称为噬菌体悬浮液或噬菌体溶液。

因此，收集上述纯化的纯噬菌体，命名为噬菌体Bac-FRP-3，然后于2020年12月9日保藏在韩国生命工学研究院的韩国典型培养物保藏中心(保藏号：KCTC 14401BP)。

实施例2：噬菌体Bac-FRP-3的基因组的分离和序列分析

噬菌体Bac-FRP-3的基因组如下进行分离。从使用与实施例1相同的方法获得的噬菌体悬浮液中分离基因组。首先，为了去除悬浮液中包含的ETBF的DNA和RNA，将200U的脱氧核糖核酸酶I和核糖核酸酶A分别添加到10ml噬菌体悬浮液中，然后在37℃放置30分钟。静置30分钟后，为了停止脱氧核糖核酸酶I和核糖核酸酶A的活性，向其中加入500μl的0.5M乙二胺四乙酸(EDTA)，然后静置10分钟。此外，将所得混合物进一步在65℃放置10分钟，然后向其中加入100μl蛋白酶K(20mg/ml)以破坏噬菌体的外壁，随后在37℃反应20分钟。之后，向其中加入500μl 10％十二烷基硫酸钠(SDS)，然后在65℃反应1小时。反应1小时后，向反应溶液中加入10ml以25:24:1的组分比混合的苯酚∶氯仿∶异戊醇溶液，然后彻底混合。此外，将所得混合物以13000rpm离心15分钟以分层。在分离的层中，选择上层，并以1.5的体积比向其中加入异丙醇，随后以13000rpm离心10分钟以沉淀基因组。收集沉淀物后，向沉淀物中加入70％乙醇，然后以13000rpm离心10分钟以洗涤沉淀物。回收洗涤的沉淀物，真空干燥，然后溶于100μl水中。重复该过程以获得足够量的噬菌体Bac-FRP-3的基因组。

通过使用来自首尔国立大学国家环境管理仪器中心(National InstrumentationCenter for Environmental Management,Seoul National University)的Illumina Mi-Seq设备进行下一代测序分析，获得了上述获得的噬菌体Bac-FRP-3的基因组的序列信息。最终分析的噬菌体Bac-FRP-3的基因组大小为45462bp，全基因组序列由SEQ ID NO:1表达。

使用BLAST调查对上述获得的噬菌体Bac-FRP-3基因组序列与先前报道的噬菌体基因组序列的同源性(相似性)进行了研究，发现噬菌体Bac-FRP-3的基因组序列与拟杆菌噬菌体vB_BfrS_23(基因库登录号MT630433.1)的序列具有相对高的同源性(查询覆盖率：93％，序列同一性：96.63％)。此外，噬菌体Bac-FRP-3基因组上的开放阅读框(ORF)的数量为69，而拟杆菌噬菌体vB_BfrS_23具有72个开放阅读框。

根据这一结果，可以得出结论，噬菌体Bac-FRP-3一定是一种不同于传统报道的噬菌体的新型噬菌体。此外，由于噬菌体的抗菌强度和抗菌谱通常取决于噬菌体的类型，因此认为噬菌体Bac-FRP-3可以提供不同于先前报道的任何其他噬菌体的抗菌活性。

实施例3：噬菌体Bac-FRP-3的主要结构蛋白的分析

进行一维电泳以分析噬菌体Bac-FRP-3的主要结构蛋白。为了获得构成噬菌体Bac-FRP-3外壁的蛋白质，将200μl的实施例1中制备的噬菌体悬浮液与800μl丙酮混合，并剧烈涡旋。混合物在-20℃下静置10分钟。以13000rpm在4℃离心20分钟以除去上清液，然后空气干燥。将沉淀物重新悬浮在50μl电泳样本缓冲液(5×)中，然后将其煮沸5分钟。通过一维电泳分析制备的样本。因此，如图2所示，确认了大小约为25kDa、48kDa、68kDa、75kDa、117kDa和245kDa的主要结构蛋白。

实施例4：噬菌体Bac-FRP-3杀灭ETBF能力的研究

研究了噬菌体Bac-FRP-3杀灭ETBF的能力。为了研究杀灭能力，以与实施例1中所述相同的方式使用斑点试验观察透明区的形成。将总共5株已鉴定为ETBF菌株的菌株用作ETBF以研究杀灭能力。噬菌体Bac-FRP-3具有裂解和杀灭作为实验目标的5株ETBF中总共3株的能力。其实验结果示于表1中，代表性结果示于图3中。

[表1]噬菌体Bac-FRP-3的抗菌活性测试

同时，也在单独的实验中研究了噬菌体Bac-FRP-3对支气管败血博代氏杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌的杀灭能力。结果，噬菌体Bac-FRP-3不具有杀灭这些细菌的能力。

因此，证实噬菌体Bac-FRP-3具有较强的杀灭ETBF的能力和针对ETBF的广谱抗菌谱，这表明噬菌体Bac-FRP-3可以用作用于预防和治疗ETBF感染的组合物的活性成分。

实施例5：噬菌体Bac-FRP-3的生长特性

噬菌体Bac-FRP-3的生长特性通过一步生长曲线分析进行分析。噬菌体Bac-FRP-3的一步生长曲线分析如下进行：将50ml BHIB(脑心浸液肉汤，Difco)培养基以1/100的比例接种ETBF，然后在厌氧条件下静止培养至指数期(OD₆₀₀＝0.4～0.5)。培养完成后，以8000rpm离心5分钟，回收细菌细胞团块。将回收的团块悬浮在50ml BHIB中。所得材料可称为细菌悬浮液。将噬菌体Bac-FRP-3与细菌悬浮液以0.1的感染复数(MOI)混合，并在室温下培养10分钟，然后以12000rpm离心30秒。除去上清液后，将含有噬菌体感染的细菌细胞的团块悬浮于50ml BHIB中，并在37℃无振荡培养。在140分钟内以20分钟间隔取等分试样，并立即通过常规噬斑测定法测定等分试样中的滴度(图4)。

噬菌体Bac-FRP-3的潜伏期估计约为60±10分钟，平均裂解量约为1100±500pfu/感染细胞。

实施例6：关于使用噬菌体Bac-FRP-3预防ETBF感染的实验实施例

将100μl噬菌体Bac-FRP-3悬浮液(1×10⁸pfu/ml)加入含有9ml BHIB培养基的试管中。在含有9ml BHIB培养基的另一试管中，仅进一步添加相同量的BHIB培养基。然后将ETBF菌株(CCARM 18104)的培养液添加到每个试管中，使得在600nm处的吸光度达到约0.5。添加ETBF后，将试管转移到37℃的培养箱中，然后进行静止培养，在此期间观察ETBF的生长。如表2所示，观察到在添加了噬菌体Bac-FRP-3悬浮液的试管中，ETBF的生长被抑制，而在未添加噬菌体悬浮液的试管中，ETBF的生长没有被抑制。

[表2]噬菌体Bac-FRP-3的细菌生长抑制试验

上述结果表明，本发明的噬菌体Bac-FRP-3不仅抑制ETBF的生长，而且具有杀灭ETBF的能力。因此，得出结论，噬菌体Bac-FRP-3可用作用于预防ETBF感染的组合物的活性成分。

实施例7：噬菌体Bac-FRP-3对动物模型中ETBF感染的预防作用

研究了噬菌体Bac-FRP-3对受ETBF影响的断奶仔猪的预防作用。将4头25日龄断奶仔猪分组在一起；每个猪圈(1.1m×1.0m)共饲养2组猪。提供加热系统，并控制周围环境。始终控制猪圈的温度和湿度，每天清洁地板。从实验的第1天开始，按照常规饲料供应步骤向实验组的猪(添加噬菌体)喂食添加了1×10⁸pfu/g的噬菌体Bac-FRP-3的饲料，同时按照常规步骤向对照组的猪(不添加噬菌体)喂食不添加噬菌体Bac-FRP-3的相同的饲料。从实验第7天开始，两组的饲料均被1×10⁸cfu/gETBF污染2天，然后分别为实验组和对照组每天提供两次，以引起ETBF感染。施用的ETBF悬浮液如下制备：使用BHIB培养基在37℃厌氧培养ETBF菌株(CCARM 18107)两天，之后分离细菌并使用生理盐水(pH 7.2)将细菌调节至10⁹CFU/ml。从提供受污染饲料2天后的下二天(实验的第9天)开始，实验组(添加噬菌体)的猪按照之前的常规饲料供应步骤再次喂食添加了1×10⁸pfu/g噬菌体Bac-FRP-3且未污染ETBF的饲料，而对照组(不添加噬菌体)的猪按照常规步骤喂食不添加噬菌体的相同饲料。从实验第9天开始，每天检查所有试验动物的腹泻情况。通过根据腹泻指数进行测量来确定腹泻程度。腹泻指数采用常用的粪便稠度(FC)评分来测量(正常：0，软便：1，轻度腹泻(loose diarrhea)：2，严重腹泻：3)。结果如表3所示。

[表3]粪便稠度评分

从上述结果可以证实，本发明的噬菌体Bac-FRP-3可以非常有效地抑制ETBF的感染。

实施例8：使用噬菌体Bac-FRP-3治疗ETBF的传染性疾病的实施例

噬菌体Bac-FRP-3对由ETBF引起的疾病的治疗效果如下评估：将40只8周龄小鼠分为总共两组，每组20只小鼠，然后将每组5只小鼠的亚组分别饲养在单独的实验鼠笼中，实验进行7天。在实验的第二天，通过腹腔注射向所有小鼠施用0.1ml ETBF悬浮液。施用的ETBF悬浮液如下制备：使用BHIB培养基在37℃厌氧培养ETBF菌株(CCARM 18107)两天，之后分离细菌并使用生理盐水(pH 7.2)将细菌调节至10⁹CFU/ml。在施用ETBF后2小时，通过腹腔注射给实验组小鼠(施用噬菌体悬浮液)施用10⁹pfu的噬菌体Bac-FRP-3。通过腹腔注射给对照组小鼠(未施用噬菌体悬浮液)施用0.1ml盐水。对照组和实验组均同样地喂食饲料和饮用水。从施用ETBF开始直到试验结束，每天观察小鼠是否存活。结果如下表4所示。

[表4]存活率

从上述结果可以明显地得出结论，本发明的噬菌体Bac-FRP-3在治疗由ETBF引起的疾病方面非常有效。

本领域技术人员将认识到，上述描述中公开的概念和具体实施方式可以容易地用作改进或设计其他实施方式以实现本发明的相同目的的基础。本领域技术人员还将理解，这样的等效实施方式不脱离所附权利要求中所述的本发明的精神和范围。

对本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可以对本发明进行各种改进和变化。因此，本发明旨在覆盖本发明的改进和变化，只要它们在所附权利要求及其等价物的范围内。

保藏号

保藏机构名称：韩国典型培养物保藏中心(KCTC)

保藏号：KCTC 14401BP

保藏日期：2020年12月9日

序列表

<110> 尹特荣生物科技株式会社

<120> 用于抑制产肠毒素脆弱拟杆菌增殖的组合物和方法

<130> 20001.0059WO

<150> US 17/227,284

<151> 2021-04-10

<160> 1

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 45462

<212> DNA

<213> 未知的

<220>

<223> 长尾噬菌体科噬菌体

<400> 1

ataataaccc ttcgttcggc tatttggtta tattaccgaa aagcgcagag gaaacaattg 60

tttcgactaa aataacgcct tcgaatgatg atgcagcgta tttctatttc tataaaaccc 120

cacagaaaga aacaacccaa acgtatgtaa aatgggctgt aattactgag ggtgatattg 180

gtgtagccgc atggataccg tcacgaactg aggctaaaac aggcattagg aacttatttc 240

caatatcacg gatgcagaca gcgactaaca atcatttgaa ctattttgat attacaggat 300

gggtagcaac tgtatacagt gaagaagaat ttaagtcaag gtttaaacca tctacgaaat 360

ataccataac agggaaatat actattcttg gaaagccaac atcaggaacc ggatacaaag 420

atagtatcgt agctttttgt atgtggaata actctaattt aatagacctt tggcgtaaaa 480

ttgtcgagta tgaagcagta ggagcttcgg gagaaatatc taatacattt actacacctt 540

cgaatctcga tgggtatagg atagtagtgt ataccatgta caatacagga aatttaggag 600

agtttcgttt tactgatttg atggtatcag aaggaattga ggcagtaggg tggacacaag 660

caccggaaga tatagaatac gactaccgga agtacaccga tacgcagata ctggctgttg 720

atgggaaaat cgaactatct gtgaatacgc aattgaacaa gcgtgtaatt ggtgggtcaa 780

accttctttt aaaatcggat atttgtgttt ccgaggctac tgcacccaaa tcaattatca 840

tgtctaagta ttggagggaa cttgctggaa aaaaaatatc tatttcattt gattatgaat 900

atagtaatct tgttttaggg ggatcgcaaa gaataggact cgaagctgcc atcttaaaag 960

atggtacttc acagtatcac tatatcggag cttttaagaa ttttgattca acttctttaa 1020

aagctgattc gggaaggttt gccaataccg tgacagttcc taatgatata ttaaattctg 1080

aaagcatatc tattaatgtc tacattcaag ttgggagcgg gtctaaagtg aagatgtgta 1140

actttcagat tgaaataggt gacacagcaa ccggatggaa acccgcaccc gaagatagcg 1200

taaatgagtc aaaagagtat acgagacagc aaataagcat tgttgagggt aaaatcacca 1260

ctacggtaga aaagataaca gaggttgacg ggaaggttac cggacttgct tcacgggtag 1320

accaaaccga aaagagtata acgtctgttg ttggggatat taatgttctt aatagcacta 1380

caaatagacg cattactaag caaatagatt taacaggatg ggacaataat aagtttttcc 1440

ctctcactat aaatctccct gtttactaca aaactaaggt tgttataagc cgtcccttaa 1500

atacagcata cggaaaacct tcatacagta cacatgatac cggtttttct atgaacttaa 1560

cgtttgagat gtccggttcg ggatggggtt ctttgcctga cgtaacaaat atatttgatt 1620

atacacgtgc gtggagtaca ggaccgatag ttgtagattt gggacaaata agagaaacct 1680

ctacttgcgt aatgggtatt cgtggtgggt ctaagtatga tgtaaccgtt tacgacacaa 1740

caaactccga tgtgataaac gtttatcaaa cagattatca cggttcgtac ggtacatctt 1800

tccccgtacg caccgatggt acagagccat tccggacgta tggttactac tctgagataa 1860

aacagacaca agaaagtctc tcagcaacgg ttgcaaaggt agacgatcaa ggcaggcggt 1920

taagtgcggc tgagttaaca ttatctgccg atcacgcaaa attatcggtg gtagaaacga 1980

ctgcaaacaa tgccaattca cttgccggaa ctgccaacaa caaagcggaa gcggcagacg 2040

gtcgagttac cgccacacag aacggtttgg tcgagactgg aataaacatc acgtcccgca 2100

aaatcgtgtt aaagtctgat aacgtccttt tccaaaacaa cgcaggacag cagacagccg 2160

ccatcaatgc gaacggaaaa cttactgcaa acgcaattga agttggtgag gttgttgccg 2220

gaggttttgc ggcacagcgc atcactaccg gaaacctgac tgtaacggat ggtgcggtta 2280

ttgggggaat gactatcaca gggggagtgt tgaccggaaa gaacatcaat atacaggatg 2340

gtgcaaagat cggtaacttc accattgtat cgggtatatt ttccgcccaa aatacgcccg 2400

caggcataca aatgactcta tcgaataatg ccgctacttt tgacagtagc ggagtacgtg 2460

tagaacataa ttcgggtggt tatgcgttga ctactacggg taacggaaga gtattcctaa 2520

cagggtcaaa tttttgggtt cagtgtaagg acgttgattt tatgggtgct caaacatgga 2580

aagccccggg tgttttttac gcatgtacga ttttggcaaa cggagcaatc ggtaaaacat 2640

gggggaaccc tgactttcac ataacaagag taactaaaaa ctcaacaggg agatatactg 2700

ttaatactac cggttccaat ggggactact ttgttatgat tacagcgtat gacccttcaa 2760

actggctaag tacaacagta gaaccatact cagagggaca gtttacgtac aaagtattcg 2820

atgtaaatta tagcatgcgt gacggcggag ttattattta tttttgtggc atggttaggt 2880

agtttagtgt tttaattaac ggtaagttgg ttttatcctt cttaccgttt acctttgtac 2940

caaacattaa tcaattaata taaaattatg gaaaagaaaa gtttagattt tgatttaaag 3000

tcagtagttt acacgaaaga gacaaaagtg atggactacc attttgagac ggaaaacggt 3060

aagtacgtag gtcaattaac cacggtatcg acagagccgg ataagtacaa cattactcac 3120

tgtacggctg atgtgtcaga gaaacaaatg gtagagatgc ctgatacttc cggtagtcct 3180

attctgcaag agcaatatgt tccggtcgga tcgcttgcca tccgtgacgg tcgctttgag 3240

gcaaaccagt ttcctctatc tactaaaaca tccgtctatg tgaacgactt tcaaaacttc 3300

atatttgcgt taaccgcacc taaagcagta gaataatgaa tgttacacaa gaacagttaa 3360

ggttaatgct tgtatcggca attagtccga tacttgcgtt tctcacccct acgagcggtt 3420

ttataaccgc ccttgtgttc atgttcggct ttaacattat ttgcggtatg cgtgccgatg 3480

gggtcaattt gtcggtaaat ggtgttcgta ggttcactat gctaaaattc atctcagccg 3540

tgcaggaact tattttgtac atccttgtga taaccgttat cttttcgtct gtggcgaaga 3600

tgggggatca cgatgcagca gttctatcgg caaagacgat tacatacgtc ttcatgtacg 3660

tatatttgtc gaacggtttt aagaaccttt gtataagcta tccggataac aaatctttcc 3720

ggttaatata ccatattgtc cggtttgagt ttaagaggtt gatgggagag aacgcagcaa 3780

agatagtcga ggaacacgaa gaaaaaattg agattgaaac taagtaatta acacgggagg 3840

tttaacgcct ccctttaaac tttatcaaaa tgaaatattt cacattaaaa gagctaacac 3900

gctcagcaac ggcagaggca aaaggcattg ataacgcgcc cacaccggag gttgaaaaga 3960

acttaacgtt gttagtagat aacgtactgg ataaattacg tgagatttac ggtaaaccga 4020

tcacggttaa ttcgggctat cggtgtccgg agttaaacaa agctgttgga ggctctaaga 4080

catccgatca cgtgaaaggt tttgcggctg atattaccgg aggcagcaag gaagagaacg 4140

aacgcctttt caatatcatt aagcacaatt tccatttcaa acaattaata gacgagagag 4200

atttttcatg ggtgcatgtc tcctacgatc cctctaatct caaaaaccaa atactaaagc 4260

tatgaaaaag caattatttg cgtttttagc gacttttgtt ctttgccttg gcattgtgtc 4320

gctattactg ataaacgctg atttacggaa gaaaaaggct attgcagaaa gaaatgttag 4380

cgtcctaaca actcagaacg ttgcgtaccg gacgaaaagt gggcaaagtg tcatgaaggc 4440

agaggaattg aatctgactt taaatcatta ccggaacacc atacaaggga aggataacac 4500

tataagagag ctaaagcagt ctattaagga cttgaaaagt cacacaagcg ttcaaacatc 4560

aactgagacg cattttagaa cgccagtacg ggatagtgtt gttcttcgtg atagtttggt 4620

tatcgacaca atgaaatgcg taaatatgcg atctaaatgg cttgacttat ccggctgcat 4680

agatagcaac ggcacgtttg ccggaacaac cgttacccgt gatagcttgg aaatattaaa 4740

catagagcat agaaagcggt ttttgtggtt tcgactaaag aaggtgaagt atagggagtt 4800

tatcgtaacg agcaaaaacc cacatacaga gataacaggt tttaacgtaa ctacgataat 4860

aaagtgataa ttccatgtta aaacagttaa tgcacgttaa agtatttgct actgagaaat 4920

atatccgtat atttgcagcg tagaagttat tactaacgtc attaacagcg gttattgatt 4980

ttcatagaat catgttttta gaagatttgt atcacatttt atcttaaact gtcggtatgc 5040

gaatatagac agtttttaat tagaacattt tcactaacta tatatattgg gttttgtcat 5100

aattacattt ttccccctcc gcttgtgaaa gtagaggggt tttttattac cttatccgaa 5160

cacgcctcaa aagttaaatt agtgttaaat attaaactta tgctttgata tttaaaatat 5220

ctccttaact ttgcaacgtc aaaaggaaac gaattactaa caataaaact tatagttatg 5280

gaagaaaagg aatttattta ttgcttgacc ggagagatta acgtattagg aactgtcaag 5340

gctaagacaa taaaaagtgc tatgaaactt gtagcggcta ttcagagagg tgctatattg 5400

aatgatccgg aaaggaaatc aatcttttgg agcgtttcac gtgctgatct cccgtttaaa 5460

cttggtcgta ttgtatacac aatatgctat tcagatgggt ctatttgttc acatgtatgc 5520

taacaataaa aatttagagt tatggaatta gtaaaattca gagaggcaaa gagtataatg 5580

gaagaaaaag cttttttgca aaaaaagctt gaaaggcttc agtccggctg tcttagtaga 5640

acagaattat atttcagttc gggaaatatc gtaacatttt cggaaggtga tggcgaattt 5700

tatgaaggtt tgcgcaaaaa ctttgaaaag tctataagag aatatattga aaatcgtatt 5760

ggctatcttg aatctaaatt tgataaacta tgatacgatc gtttaataag tcgggttcaa 5820

catctatgct gacagataag gaaaaagcgt ttaaccgcta ctgcctaact aacaaggaag 5880

tttcatataa cttaatgcgt atagaaatgg cagttgttca aatgtcgtat tacggcaacc 5940

gttcatcgga cgttacgcta acaaccgata gttctgaggt tttgaatgct atttatatag 6000

tcctaacaaa cgaagggttt aaatattcct tcaatttacc taataaagta ttaaccataa 6060

gtatttttta atttaaaatt taatcaaaat gaaagaagaa gtaaaattgt tcagagcgtt 6120

aatcattgtt tttgtgttac ttgtgttcac cttcgtgtta acttcgtgcg gtgatgatag 6180

tgacaatgtg tatcaaacag aatattctat tgatgttccg gcatggcaga cggtttatgt 6240

taatggtgag gttacaacgt ctatatctcc atatgtttgg gaacatgtgg acttatcaga 6300

caaatgtgtt agagtattct cagcagggca tgttagttat cacaaggtta caaaggtgtc 6360

acacgatgat ttaggcttta ccgtttattc aatagaaggt agcaataacg aaaggtttgc 6420

atacaataaa aataaaggta tattgcaata ttggtgcaca agaaacggta ttgaaacagt 6480

tgttgtttat cgtgaattaa agtaagtttc attttaccct cacccggtgg cggttaaccg 6540

ggttattaag tatgaaagta aatgttgtat tagaagagaa aaagattcca tgtttcgaag 6600

ctaaatacgg tttagatgta tataacgata aaggacaaaa atatactatc gagttcgata 6660

taatgggaaa tttagtagtt agtagtccaa aaggtacgtt attagtaaaa cccgaatgta 6720

acaacaaaat atcaattaga attgaatgat atgaaagaga taaacgaaac tcaattacag 6780

ctatctactg agggaaaaag acttcccgat atgataaagc aggcgaacgg catacacgaa 6840

cttgttaagc agaaactttc tgagtataac tcaatagagt ataccgatga taatataaag 6900

gtggcaaaag ccgatagagc cactttaaac aaggcgaaaa agggacttaa cgacagccgt 6960

atagaacttg aaaaggcttg gatgaaacca ttcaacgaac taaaggatgt tgttaacgaa 7020

acttgtaagc tgatcggtga agcttcttca cgaatagata gtaagataaa ggaaacggag 7080

gaaaaggaga agcaaaagaa actggatcaa ataagggagt atttcgagga acacaatgaa 7140

aatcttatct tgtttgattt tgctttccgt ccggagtggc ttaataagac taaagcactt 7200

tcagttgtga aaatggagat agacgaattg ttcaaaacag tagacgatga tcttaacaga 7260

ctgaaagagc attttgcggg agaggcgttt tatattccgg ttatcgacaa atatacgtct 7320

acactcgact acaacaaatc attcgactat ggaaaccacc taaaagaagc tgtaatacaa 7380

gccgcaaaca gacagtttga acagaaggcg acagataaca cgcttcagca acaaaagcca 7440

gaaattaagc ctcaaaacga gccaaagact aacgaagaag aagtttatat acgaggcttt 7500

aaagtccatg taacgagaaa gcaggctttt gcgcttgctg agtttatgaa tagccacaat 7560

ataaagtttg aaagcatatc aatatagacg gtagcccaat tgggctacct ttttttgttt 7620

tgtttgcaat ggttaatcta ttgttaaaac ttaaagtttc acttgaactt ttaaataatg 7680

tgcttatatt tgcagtgtcg aaagaaacaa agtagtaaca attaaaaatt agaattatgg 7740

aaaatgttag attaacaaaa aagcaaaaag gagataaatt taagagtgaa cagttggtga 7800

aagcactcga aaagagattc aaaggtaata ttaacaataa tttattttaa aatggaacag 7860

tatttagact tactaaaaga gactttaaat tatggtgaaa agagatcaga ccgaaccgga 7920

acgggaacta tcagtttatt cggcttgcaa cgatcttacg atctgcgtga cggtttccca 7980

cttgtcacaa ctaagaaggt attcacgaag ggaattatac atgaactcct ttggatgttg 8040

aaaggtgata ccaatataaa atacctaaat gaaaatggtg ttcatatttg ggacgattgg 8100

gcaaagccct ccggtgatct tggacgcata tacggtaaac aatggcgtga ctggcgtata 8160

aatagcaaaa tgaaagtaga tcaaattgat tcagttatag atatgattaa gtttaacccg 8220

gagtcaagaa ggctaattgt tagtgcttgg aatgttggag aaatacacat gatggcaatt 8280

cctccgtgtc actgcttttt tcagttctat gtgtctgagt ccggttattt ggacttgaaa 8340

ctgtaccaaa gaagcgcaga cctattttta ggcgttcctt tcaatattgc atcttattct 8400

atcttgctgt ctatggctgc acaggtttgc ggtttaaagc ctcgtagatt cattcatacg 8460

atcggggacg gacatatata tttgaatcac gttgaacagg tgaaagaaca attgagtaga 8520

gagccgttcg cccttcccaa attggaatta aacccgaata ttcgtaatat attcgatttt 8580

aagtatgaag atattaagat agtaaattat aactgccatc cggctataaa gggagaggtt 8640

gcggtatgaa tgaaaaagaa ttttacaggt ttttagccta taataaattg gtagattttg 8700

aaagatacct tcacatggaa tctgtatatt atctgaataa cttgctaaag aaaaccgtta 8760

attcgtattt gagagattgt atattgaacg ctataaatca taaattagcg ggattataat 8820

ttaaaaggga tgtgcaacgc tttgccatcc ctttttagtt tctatatatc acataccgaa 8880

actatcgttg ctctatgaaa caaatctaac aatatgtagt aacaagtatg aaagtgatac 8940

aaaggtaggc ttttgatact atccaatggt taaaacgagt ctttttatat ttcattaaca 9000

ataaaattaa agaattcctt tgcatattta aagtttatcc ttaactttgc gacatcaaaa 9060

aataagtagt aacattaaaa acgaataata tgcagattaa aaaagatcga aattacaaat 9120

tgcttgtgca ggtttgcaag aataaaggta ttccattctc ctacgaaaaa cttgttttgt 9180

ttttgaataa gtacatttat gaagatgaag aagattcagt atttggatat acaatatctg 9240

atattgattt ttcaatcgct aaacatatat cggttgatat ttgcggaatg cttacattaa 9300

gcaatattat cagtaaatta acttgtatcg gtgcgggaga ttgcccgaat tgcggaggtt 9360

tactcagatt gatagaatct tatcccaaat ttagcaaaca gtattgcgat cgtgattgtg 9420

agccggagag agaggaagaa aatgtatatg aatgtttaac atgtggaaag gaggttgttt 9480

tatgaatatt gaaaacacaa tgatccgtat caatgatgcg attataagcg cacgtatgaa 9540

cggcaaaaag attacgaaaa aggatattgc agcgttgttg tggaaggatt caaagcaaag 9600

aacgcaggcg gtaaacatgt ctgccttgtg taaccacaaa acccaaacga taaaaataga 9660

gtgggtgaaa gagatatgcg aggctaccgg agtcgatgcg aatttcctat ttaatattaa 9720

ccctaaaaaa taaaagttat gattaaaaat ttacccaaca ttcaaaacga aatgaatgtt 9780

caaaagtcga gatttaacaa ttttggcgga tacaaatacc gttcgtgtga ggatattttg 9840

caagaagcga aaagggtgtg cgaaaaatac ggatgttatg ttatggtgac tgattctatc 9900

gaatttatcg aagggcgttt ttacgtgaag gcaaccgcaa agattgttga gactgaaacc 9960

gggtttattg aaacatgttc ggcttttgca cgtgaagaag atagcaaaaa ggggatggac 10020

ttagcacaat taaccggggc tacatccagt tatgcacgaa aatacgcctt atgtgggctt 10080

tttgcaatag atgatagcat agacagtgat tcaatgaacg gagagccgga gacgaaagaa 10140

aaacggcaaa agacagcctc aaaacaagct gccaacacaa gtaataccgg aagtaactct 10200

aattatttgg gtgtgctgat tgatgaaata aagaaagcaa caacttataa acatttgggt 10260

gatattcaca agaacaacgg tcaatttcat caaaacagtg agttcatgaa cgctttagta 10320

gttagaaagg cggaacttga aaaggcggaa gcagaagcaa agaaggtata aataattcgg 10380

gggatgcgtt cccccaataa aaacaaaaga aatatgaaag aattaacatt actccccaaa 10440

ttggttaatg ccgatgtaac gtatatcagc gagacacatg aatatttttc aagagatttt 10500

agaaaactga gaggaataac aggttttatc aacgatcaat tatttcccgg aaaacttgat 10560

aatataccgg ataatatttt gagatcggca actgagagag ggaaagcggt tcacgatgaa 10620

gtagagagaa tcgacaaaga aggtattgag ccggaaacgg tttacggaga gaactatttg 10680

gatttaaaag ccgaaagcgg tttaattcat atcgcatctg agtatattct aactgataac 10740

gagtttatcg cctcaccgac cgataaagtg tatttaggta gctctgaaaa ttcagtcgta 10800

ttgggtgacg ttaaaactac ctataaactt gatttgcttt atctgtcttg gcagctatca 10860

atatacgcct accttttcga gagacaaaac ccaaacttga aagtagaggg acttatcgca 10920

atttggctga gaggtgacaa ggataaggac ggcattttct ccgttgaacg cataccggac 10980

agcgaaatag aattgttcct taattgctgt aagaatggcg ttcgatatgc agataatgca 11040

agcaaagata gctacatagc aaaattggaa tcactgcccg caaaagttgc gcatatcgaa 11100

gaaggcgttt acgaacttct tgaaatgcaa aagaagatag acgagcattt aggcaagttt 11160

aaagaacagt tgttaggtct gatgtctgag gcgaaagctg acaatataaa aggggaactt 11220

atttcagtca caagaaagaa agcgtatagc cgtgaatcac ttgattctaa agcactgaaa 11280

gagcaatacc ccgaaatata cgatcagttc gttaaaacat caaatgtcaa agaatcaatt 11340

caattaaaag cgttgtaata actaagtaga aaggagctaa aaagatgata ctaactactg 11400

gtaagatatt atttgttact gattcagatg attctgactg ccatattgag aacttgagga 11460

cggagtataa aacaaatatt tattgcataa agattgatag aacgcttaaa cctccctatt 11520

accagctatt ccatgagtgt aaggagggca aacgaaaatt gcatcgtgaa ttattctctt 11580

ccagcaaact ggaaaagatt gtaaaatata taagtgaaaa tattcaatag aaagaagaaa 11640

tgaaggaaat tgattttgtt gtatgtggga atagctacat aactaaatgt ccattctcgc 11700

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acatagatat tggaagcggt ggcgaaggtg ttattatatg ttctaaactg aataagaaat 11820

gaataaaatt aaagaatcag aattaaatac cctcttagaa aatggtgatc tttgtgatta 11880

ttgtccgaat gttagaggcg aaatatctaa agggctttat gatttgtgcg aagggtgcta 11940

ttgcgaacag gcaaaggata attatgtact tgaaaacgat ttagattatg aagaggaatg 12000

aatttattaa taagcttatt aggcgttcta attatatgga taaacttgta tatgtaacgg 12060

cagacggagg aagaagggaa ataataaagt taaagccgaa aaaaaagaaa tattataatt 12120

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atacgtagag ggtagtttac actatcgtaa atatacagac tctaataacg ttgaaagaac 19560

tatttctgag atcgttgtaa ggtctatgca gatgggaaga aaagcgggtg agggaaacca 19620

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attggggatg tatattgcat cccctttttt gtgttaaata catgttaaaa cttaaacttt 19800

agattgcaat attaaatatt atccttatat ttgcagtgtc aaaaggaaac aaattactaa 19860

catttaaaaa taaatattat ggcaacaatg acatcaaaac aattttgtga gagaatgtat 19920

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ggcaagggta gaggcggcag aagtggcggt acaggcagca gagaaagaag tatcagccag 39780

acaaaaggtt ttggacgctg agatacaagc gagggcgaac ggatacgcca acaacgtagc 39840

aaccgcacaa aaagagcttg attttgcacg caaacaacag gaaaaagcgc tgagggataa 39900

gaagaaggcg cagaagcagc aagaacgcat agatacactt atgcaggcaa gttctttggt 39960

aaccgcaacc gctaacctat ggaaagattt aggtttggca gcgatcccgg ctattgcgtt 40020

gatgtgggga tcatttgctt ttgctaagat aaaagcctca cagctatcta aagcctcgca 40080

ggacacagag gaatacgggg acggtacggt agaaatgatt gattacggag gttcgcacgc 40140

atccggaaac gatgtagatt taggtacgac taaggacggt aagcgtagac gggtagaacg 40200

tggtgaatac ttcgcagtag tgaacaaacg ttcatctcag aagtataaga aactcgttcc 40260

ggacttgatt aattcgctaa ataagggtat ttttgaacag aaatacttaa acgcctattc 40320

cggtagtgat gaagtaacga atataatgca aggttcaacg gttgatctgt ctaaggtcga 40380

aaaagatctg aaatcaatca aagagcaggg acgtgttaag tacatcacag gtgcggacgg 40440

cacgataatt gaagtaaggg gaaatattaa acgaataatt aaatcataat gaacgttaaa 40500

gatttgcggt ttaaattggg gggtgtagaa atacatcccc actattcaga gctaaaacgg 40560

aagtttggca aagagaatca acaggagttt ttcagagagt cgatagaggg gagtttaacg 40620

ctgatagggg cggactacct tcttgttaaa aatgcgagta ttgaggatat tttgtacttg 40680

caaatagagc aaaaggataa agggcagcta tcaacgcagt atcaagtaat atttgagggc 40740

tatttcagta agacagactg tgagatagac agtgataacc ggacgtgcaa ggtgaagata 40800

agcccacgtg atgaatacac cgatattatg aagggaattg agaacaaata tgatcttatc 40860

aagcttgcac ccggcttaac acaaataggc gtgtctaagc gtcctattgt tcaagtttat 40920

attgcaggtt cgcctacaat atcaaactac cttgcaggaa ctcactacga aactgaggtt 40980

tcaaacgttg taactgataa caaggaatta acggacaaaa atttctttgc cttctttgct 41040

gcatacaacg aagtggaaat aaaggcattg ccttatcagt cttttaacgg gaagtattac 41100

ggaacgaacg gtaattattc aaaattagac ggaaactata cattaacatg gaaatatgta 41160

gatttgagtc aaggtttttt agtgcttaaa aacaggaatg gagataggct ttttaggtca 41220

aatgcgcttg tttgggggaa taagaattat ttctatatag acgcttctga gttaacattt 41280

acgaggttag tagaagaacc tacatttcct cagtcgttcg ggggaaatac ggtattactc 41340

caaaaggtat ttcaaagaat gttgcttaac cttccggagt tggacggtaa acctactggg 41400

aaactatcat cagaggacgt ttaccctacc aatagtaact acatgtatgc cgcaccatta 41460

aaggggaact acttttatac gtctacgaag gttcagaacg agccgacaga gtacggtgta 41520

aatgatgaag gcaagtattt taccgataac ttcgttccgg ctgtggcggg tgctggaaag 41580

ttgtatccgg tatgccgttc acgatggggg aatatgtcga tttggttcga gtttgatttg 41640

tcctatgcgc cattggagga aagagcgaga aaggagtatg ttttaaggga ctcgttcgcc 41700

atacaggacg ctattagggc gcttattaag caaattgatc ccactttgac gcacgaagct 41760

acggaggaat atagtaagtt tttgtatgcc ggcaataacc ctatttccgg tgcacctttt 41820

aaggtgttca tcacacagaa aagcaacatc ctaaagggtg agtatgaccg tccggcaaaa 41880

aaggcggaaa caaccctcag cgatataatg aagatgttgc gtgacacgat gaaactatat 41940

tggtttatag atggagataa gtttaggata gaacatattt cttacttcat gaatggcgga 42000

agttataccg gtagcgggac ggtcggcata gacttaacaa agcttagata tgcaaaatcg 42060

ggtcagttaa tgacgtggaa aactaacacg gtcaaatatg ataaaaccga tctgccttca 42120

cgctttgaat tttcttggat ggacgatacc acaaatacgt ttgcaggttt tccgattgac 42180

gttaaatcaa actacgtgca ggagggaaag aaagaagaag taagggtatc taacttttcg 42240

tccgatgtag attatatgct actgtctccg ggtgactttt cacaggatgg ttttgcgctg 42300

ttgggagcta tacaggtgag tgggaaatgg aaacttccgt ttgttacgtt caatttggta 42360

gacaagaaca ataataagta taccgtaaac ccccaaaatg gctatatgtc gttccttcac 42420

ctcgttaaat actacatgta tgatatgcca gccttagaga ttgagcacgg aggcgatcag 42480

acggtaaggg tgagaggaat aaaacggagt atgacgcaag atttatcctt tacatacgac 42540

accacgccaa acccggtaca actgataaca acggatgtcg gcaacgggaa accgatctct 42600

atgactgagg acttaaccac ccgacaaata accgtatctt tatcttacac ccccttatga 42660

tagggggtgt tttcttttaa attgctatct ttgtccctat aatcaatttt ttaatcaaaa 42720

tggaagtaca taacaacttt agtccgttgg catttagaaa gaaggaatct aaagccacat 42780

acgaaaaatg gtacgctttc gggaagaact acgctattcc tgcaagcgca aacacgctaa 42840

ctcctttcca gtttacagag ttgaacatac cagtctttga ccccgatacg atcgaagtag 42900

atgcggttaa cgaggaaacg ggagaggcga caaaaacggg tgtatatgtt agcttcgatg 42960

ttatgcccga acatggtggt gttttgtacg tgtcaccagg caagaactcg tttagggagg 43020

ctttgccgca ggggacgtat agagcacgtt tttcaatcgg tgatcaagta tatatttcga 43080

ctcctttttg cgttataccc ggcatagaaa cgagtagcaa atatctattg attgaatatt 43140

ggaacgatga aaagatcgtc tatccggatg gctttattac aacgggtacg aacaatgact 43200

tccggtatca gatgtatgtt cctgcaacta tctgcaaacc gaaatatgag tttgaagaag 43260

aactaaccaa acgcgccgga tacaagttct tagaactgca aacgtctacg aaggtgtacg 43320

cctttacatt tgttgcgcct gagtttattt gtgacgctat gcgactgatc cgcctatctg 43380

actatatccg aatttcgcac gatggcgaat attacaacgc cctcaacttc gagtttgatg 43440

ttgattggca ggaacaattg tatttggcgg ctgttgactg ccagtttgag acggactcaa 43500

tcatacaaaa actcccttct ttcaatagac gagataaagc gtctttttat aatgccctat 43560

tagcgaacat tgacaccccg ataatgttct cccccgatac cgtagggctg tattacaaag 43620

agtatcggga aacagagcca gttgtcaaag gtaaattgat ccgtgaacta tcaccgattg 43680

atttgattga cgaaaatacc actattgccg tagatatggg tgcgggtgag gcacgcaaat 43740

tcaaccttta ccgcatgttg gagggataca tctctaagaa ccacgaagat gtaacggagt 43800

tccttttatc ccttcgtgga ggcgtgaata tcggtacacc gaatgcaagc ggtgagtatc 43860

ctgcaagcgt agacaggtac gggaacgcta agttaaagga catacagggg aatgatgcaa 43920

cgttgaacaa cgtcacagga aaagaagcta cgtttaaaac tgtggaaacc ggtttcttaa 43980

ctgttaacaa gacttccgca acaattgacg gaatgggtaa cgccaatgta accgatttaa 44040

ctgcaagggg tgactctatg ttgcgcagcg acgtatatac agggtcaaaa aatggcagtc 44100

ataccggaaa gataacgaaa gaaggacagt tgcagtatct atcagctatc atttacgagt 44160

tcctttcgtc cgaaacgttc gttcccggct tcttaggtga aggctttaaa atatggttgg 44220

ataatggtaa ttggcatatc gaatgcgata acctaaccgt ccgccaaact atgaacattt 44280

ttgagttgct tatccaaaag attcgcagcg tcaacggtgc tattgtcgta tcccaatcaa 44340

acggtaaggt tacagccgtt gaggacaccg gaacacagta caaaatcacg ttcggagagg 44400

aatttcctac cttccaagaa ggtgacttga tacgctgcca atcgtggagt aagaacaaca 44460

ttaaattcta ttgggtagag gcaaagacag ccgcagacgg ttatgttctt tgcgataagt 44520

ccgagttcaa caacgttgtt ccggctgttg gcgatgaagt tgtgcagatg ggtaacacga 44580

agaatgccga aagacaggct ttgatctata ttacagcgca ggaaagcggc aaaccgtaca 44640

ttgagattct gaacggtgtc aagacaaaga gtctgaccgg gacagaccgc acccgtcttg 44700

gcgatttgtc taacattgta gaccccgatt ttacaggtga ggcggctgtg aaagggaccg 44760

gtttctattc tacgaatgct ttcttgaaag gtatctttgt attgcgcaac ggaaagcgtg 44820

tagaggacga aattaagatt gcaaaggacg cagcagacca agcggcaaag gacgcagcga 44880

acgcagcaca atcggcacag gaagcgaaag ataggcttaa caaatgggca gacgatggat 44940

ttatttcacc gactgagaaa cctgcattga ttgacgaggg gaagcgcatt caagcggagt 45000

atctgcaaat aaaggcgaat gcggacaagt acggtgttcc tgtaactgaa tatacggagg 45060

cgtataacaa ctatcttaac gaactacgtt atcattcggc tactacacct gaaaatattg 45120

tcgtgcgtcc agaattggca cagagccaaa cggcttacta cgacaaacgt aatggagcgt 45180

tgaatgcaat tgctacggct tcaaaagaat atgtagataa tgctgacaaa aagttaaagg 45240

aatacttaga tactgagata actgctattc ccggtaagat tgaacttgct gtacggagtc 45300

tgaaaacggc aaattacaac ttgctgttag atagtaacca cactcttagc gaaaacccgt 45360

atcagcttgg atcatacaaa tatgatgttc atttggtgaa aggtaaatct tatacgttga 45420

ctgtttgtta caagtgtgca gattcggacg atgttgtagc gt 45462

Claims (16)

1.一种用于预防或治疗由产肠毒素脆弱拟杆菌引起的感染或疾病的组合物，包括：

具有裂解产肠毒素脆弱拟杆菌细胞的能力的长尾噬菌体科噬菌体，和

药学上可接受的载体。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中长尾噬菌体科噬菌体的基因组包括如SEQ IDNO:1所述的序列；或者具有：(1)具有至少93％查询覆盖率且与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的序列，(2)环状基因组拓扑，以及(3)69个开放阅读框。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述长尾噬菌体科噬菌体的浓度为1×10¹pfu/ml至1×10³⁰pfu/ml或1×10¹pfu/g至1×10³⁰pfu/g。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述长尾噬菌体科噬菌体的浓度为1×10⁴pfu/ml至1×10¹⁵pfu/ml或1×10⁴pfu/g至1×10¹⁵pfu/g。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体是乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶橡胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁或矿物油。

6.根据权利要求1所述的组合物，还包括：

选自由润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂组成的组的一种或多种。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述感染或疾病是急性和慢性肠道疾病、菌血症、腹泻、结肠炎、结肠瘤或癌症。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是溶液、悬浮液、油乳液、水溶性介质、提取物、粉末、颗粒、片剂或胶囊。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述长尾噬菌体科噬菌体具有大小为约25kDa、48kDa、68kDa、75kDa、117kDa和245kDa的主要结构蛋白。

10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述长尾噬菌体科噬菌体具有10-100分钟的潜伏期和1000-2100PFU/感染细胞的裂解量。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述潜伏期为40-80分钟，所述裂解量为300-1500PFU/感染细胞。

12.根据权利要求1所述的组合物，进一步包括：

具有裂解产肠毒素脆弱拟杆菌菌种的能力的第二噬菌体，

其中所述第二噬菌体具有基因组，所述基因组具有查询覆盖率低于93％且与SEQ IDNO:1具有至少95％同一性的序列。

13.一种用于预防或治疗由产肠毒素脆弱拟杆菌(ETBF)引起的感染或疾病的方法，包括：

向受试者施用长尾噬菌体科噬菌体；以及

用长尾噬菌体科噬菌体裂解ETBF细胞。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述长尾噬菌体科噬菌体具有包括如SEQ IDNO:1所述的序列的基因组。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述长尾噬菌体科噬菌体的浓度为1×10¹pfu/ml至1×10³⁰pfu/ml或1×10¹pfu/g至1×10³⁰pfu/g。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述长尾噬菌体科噬菌体的浓度为1×10⁴pfu/ml至1×10¹⁵pfu/ml或1×10⁴pfu/g至1×10¹⁵pfu/g。