CN117222420A - 用于抑制产肠毒素脆弱拟杆菌增殖的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

一种用于预防或治疗由产肠毒素脆弱拟杆菌引起的感染或疾病的组合物，包括具有裂解产肠毒素脆弱拟杆菌细胞的能力的长尾噬菌体科噬菌体(Bac‑FRP‑4)和药学上可接受的载体。一种用于预防或治疗由产肠毒素脆弱拟杆菌引起的感染或疾病的方法，包括向受试者施用长尾噬菌体科噬菌体以及用长尾噬菌体科噬菌体裂解产肠毒素脆弱拟杆菌细胞。

Description

用于抑制产肠毒素脆弱拟杆菌增殖的组合物和方法

本申请要求于2021年4月10日提交的美国非临时专利申请号17/227,286的优先权，该申请出于所有目的通过引用并入，如同在本文中完整阐述一样。

技术领域

本发明涉及用于抑制产肠毒素脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)增殖的组合物和方法，更具体地，涉及含长尾噬菌体科噬菌体(Siphoviridae bacteriophage)的组合物及其使用方法。

背景技术

拟杆菌属占粪便菌群群落的近一半，并且是对宿主营养以及粘膜和全身免疫至关重要的宿主共生体。在拟杆菌属中，脆弱拟杆菌(B.fragilis)菌株是机会致病菌。产肠毒素脆弱拟杆菌(ETBF)可产生一种蛋白水解肠毒素，称为脆弱拟杆菌肠毒素(BFT)或脆弱菌溶素，其可引起分泌性腹泻和结肠上皮损伤。ETBF在过去35年中作为动物和人类腹泻疾病的全球病因而出现，并伴有结肠炎(Clin.Microbiol.Rev.22:349–369,2009)。ETBF与慢性肠道疾病的关联已被证实20多年，ETBF还与溃疡性结肠炎和结肠肿瘤正相关(Gut Pathog.9:53-59,2017；BMC Canc.19:879-882,2019)。

此外，ETBF可能导致癌症，例如结直肠癌(CRC)。CRC是最常见的癌症之一，约占所有癌症病例的10％，约占所有癌症死亡的8％。已知BFT可与结肠上皮细胞(CEC)结合，并刺激肿瘤抑制蛋白E-钙粘蛋白的裂解。E-钙粘蛋白裂解增加肠道屏障通透性，并通过基本上在所有CRC中都被组成性激活的β-连环蛋白/Wnt途径增强细胞信号传导。因此，BFT在体外刺激人结肠癌细胞的增殖和迁移(Gastroenterology 124：392-400，2003)。BFT进一步激活核因子-κB(NF-κB)途径(其通过CEC诱导促炎细胞因子分泌)的能力以及表明特定的NF-κB库促进上皮肿瘤发生的启动和升级的数据导致了以下假设：ETBF是促炎、致癌的结肠细菌。这一假设得到了最近在土耳其进行的一项小型研究的支持，该研究表明CRC患者中的ETBF定殖比没有CRC的对照组更频繁(Clin.Microbiol.Infect.12:782–786,2006)。

通常，抗生素被用于ETBF的传染性疾病的治疗。在这里，由于抗生素耐药性ETBF的增加，抗生素的有效性一直在不断下降，需要研发除目前处方抗生素以外的有效方法。

最近，使用噬菌体作为防治细菌性传染性疾病的对策引起了广泛关注。噬菌体是感染细菌的非常小的微生物，通常简称为“噬体”。一旦噬菌体感染细菌细胞，噬菌体就会在细菌细胞内增殖。增殖后，噬菌体的后代破坏细菌细胞壁并从宿主细菌中逃脱，表明噬菌体具有杀灭细菌的能力。噬菌体感染细菌的方式的特点是其非常高的特异性，因此感染特定细菌的噬菌体类型的数量是有限的。也就是说，某种噬菌体只能感染特定的细菌，这表明某种噬菌体仅能杀灭特定的细菌而不能伤害其他细菌。由于噬菌体的这种细菌特异性，噬菌体仅对目标细菌具有抗菌作用，但不影响包括人类在内的动物中的共生细菌。广泛用于细菌治疗的传统抗生素附带地也会影响多种细菌。这会导致诸如正常微生物群落紊乱的问题。另一方面，噬菌体的使用不会干扰正常微生物群落，因为目标细菌被选择性地杀灭。因此，可以安全地使用噬菌体，与任何其他抗生素相比，这大大降低了使用中发生不良作用的可能性。

由于噬菌体具有杀灭细菌的独特的能力，自其被发现以来，噬菌体作为一种防治细菌感染的潜在的有效对策引起了人们的关注，存在大量相关研究。

噬菌体往往对细菌具有高度特异性。研究表明，噬菌体的攻击具有特异性，即一种噬菌体仅针对一种细菌(甚至一种细菌的特定菌株)。此外，噬菌体的抗菌强度可能取决于目标菌株的类型。因此，有必要收集多种有用的噬菌体，以便有效控制特定细菌。因此，为了研发针对ETBF的有效噬菌体利用方法，必须获得对ETBF具有抗菌作用的多种噬菌体。此外，需要筛选产生的噬菌体，根据它们在抗菌强度和抗菌谱方面是否优于其他噬菌体。

发明内容

因此，本发明是考虑到相关技术中遇到的问题而做出的，并且旨在解决这些问题。

在一个实施方式中，用于预防或治疗由ETBF引起的感染或疾病的组合物包括：具有裂解ETBF细胞的能力的长尾噬菌体科噬菌体以及药学上可接受的载体。

在另一个实施方式中，长尾噬菌体科噬菌体具有包括如SEQ ID NO:1所述的序列的基因组；或者具有这样的基因组，该基因组具有：(1)具有至少90％查询覆盖率且与SEQID NO:1具有至少96％同一性的序列，(2)环状基因组拓扑，以及(3)67个开放阅读框。

在另一个实施方式中，长尾噬菌体科噬菌体的浓度为1×10¹pfu/ml至1×10³⁰pfu/ml或1×10¹pfu/g至1×10³⁰pfu/g。

在另一个实施方式中，长尾噬菌体科噬菌体的浓度为1×10⁴pfu/ml至1×10¹⁵pfu/ml或1×10⁴pfu/g至1×10¹⁵pfu/g。

在另一个实施方式中，药学上可接受的载体是乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶橡胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁或矿物油。

在另一个实施方式中，组合物还包括选自由润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂组成的组的一种或多种。

在另一个实施方式中，由ETBF引起的感染或疾病是急慢和慢性肠道疾病、菌血症、腹泻、结肠炎、结肠瘤或癌症。癌症是结直肠癌或结肠癌，但不限于此。

在另一个实施方式中，组合物是溶液、悬浮液、油乳液、水溶性介质、提取物、粉末、颗粒、片剂或胶囊。

在另一个实施方式中，组合物进一步包括具有裂解ETBF细菌种的能力的第二噬菌体并且所述第二噬菌体的基因组具有查询覆盖率低于90％且与SEQ ID NO:1具有至少96％同一性的序列。

在另一个实施方式中，长尾噬菌体科噬菌体的主要结构蛋白的大小约为25kDa、42kDa、48kDa和65kDa。

在另一个实施方式中，长尾噬菌体科噬菌体具有10-100分钟的潜伏期和580-800PFU/感染细胞的裂解量。

在另一个实施方式中，潜伏期为40-80分钟，裂解量为240-330PFU/感染细胞。

在一个实施方式中，用于预防或治疗由ETBF引起的感染或疾病的方法包括向受试者施用长尾噬菌体科噬菌体；以及用长尾噬菌体科噬菌体裂解ETBF。

在另一个实施方式中，长尾噬菌体科噬菌体包括如SEQ ID NO:1所述的序列。

在另一个实施方式中，长尾噬菌体科噬菌体的浓度为1×10¹pfu/ml至1×10³⁰pfu/ml或1×10¹pfu/g至1×10³⁰pfu/g。

在另一个实施方式中，长尾噬菌体科噬菌体的浓度为1×10⁴pfu/ml至1×10¹⁵pfu/ml或1×10⁴pfu/g至1×10¹⁵pfu/g。

应当理解，上述一般描述和以下详细描述都是示例性和解释性的，旨在提供对所要求保护的本发明的进一步解释。

发明的有益效果

与基于抗生素的传统组合物和方法相比，本申请的用于抑制ETBF增殖的组合物和方法对ETBF具有高特异性。该组合物可用于预防或治疗ETBF感染，而不影响其他有用的共生菌，并且具有较小的副作用。一般来说，当使用抗生素时，共生菌也受到损害，因此由于其使用而产生各种副作用。同时，在噬菌体对相同细菌菌种表现出抗菌活性的情况下，噬菌体的每种抗菌特性(例如抗菌强度和抗菌谱(宿主范围))是不同的，并且噬菌体通常仅对相同细菌菌种中的某些细菌菌株有效。因此，本申请的组合物和方法在其工业应用中提供了不同的效果。

附图说明

附图是为了提供对本发明的进一步理解而被列入的，其被纳入本说明书并构成本说明书的一部分，附图说明了本发明的实施方式，并与描述一起用于解释本发明的原理。

在附图中：

图1是示出噬菌体Bac-FRP-4的形态的电子显微照片。

图2是噬菌体Bac-FRP-4的主要结构蛋白的分析结果。

图3是示出噬菌体Bac-FRP-4杀灭ETBF的能力的实验结果的照片。透明区是由目标细菌裂解形成的斑块。

图4是噬菌体Bac-FRP-4的一步生长曲线。

具体实施方式

现在将详细参考本发明的实施方式，其示例在附图中示出。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种名为Bac-FRP-4的长尾噬菌体科噬菌体，其具有特异性杀灭ETBF的能力，并具有包含如SEQ ID NO:1所述序列的基因组。在一些实施方式中，长尾噬菌体科噬菌体含有：具有所有以下特征的基因组：1)包括具有至少90％查询覆盖率且与SEQ ID NO:1具有至少96％同一性的序列，2)具有环状基因组拓扑，3)具有67个开放阅读框；具有以下所有特征的基因组：1)包括具有至少92％查询覆盖率且与SEQID NO:1具有至少96％同一性的序列，2)具有环状基因组拓扑，和3)具有67个开放阅读框；具有以下所有特征的基因组：1)包括具有至少94％查询覆盖率且与SEQ ID NO:1具有至少96％同一性的序列，2)具有环状基因组拓扑，以及3)具有67个开放阅读框；或具有所有以下特征的基因组：1)包括具有至少96％查询覆盖率且与SEQ ID NO:1具有至少96％同一性的序列，2)具有环状基因组拓扑，以及3)具有67个开放阅读框。

本发明还提供了使用包含其作为活性成分的组合物的用于预防和治疗由ETBF引起的感染或疾病的方法。

噬菌体Bac-FRP-4由本申请的发明人分离，然后于2020年12月9日保藏在韩国生命工学研究院的韩国典型培养物保藏中心(保藏号：KCTC 14402BP)。

噬菌体Bac-FRP-4的主要结构蛋白的分子量约为25kDa、42kDa、48kDa和65kDa。

噬菌体Bac-FRP-4的潜伏期和裂解量分别为10-80分钟和580-800PFU/感染细胞，优选分别为40-70分钟和240-330PFU/感染细胞，但不限于此。

此外，本发明提供了一种可用于预防或治疗由ETBF引起的感染或疾病的组合物，其包括噬菌体Bac-FRP-4作为活性成分。

因为包含在本发明组合物中的噬菌体Bac-FRP-4能有效杀灭ETBF，所以其被认为可有效预防ETBF感染或治疗由ETBF引起的疾病。因此，本发明的组合物能够被用于预防和治疗由ETBF引起的疾病。

本发明中由ETBF引起的疾病包括急性和慢性肠道疾病、菌血症、腹泻、结肠炎、结肠瘤或癌症，但不限于此。

本发明的组合物中包含的药学上可接受的载体是通常用于制备药物制剂的载体，其示例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶橡胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油，但不限于此。除了上述成分之外，本发明的组合物还可以包括润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂。

在本发明的组合物中，包括噬菌体Bac-FRP-4作为活性成分。包括的噬菌体Bac-FRP-4的浓度为1×10¹pfu/ml至1×10³⁰pfu/ml或1×10¹pfu/g至1×10³⁰pfu/g，优选浓度为1×10⁴pfu/ml至1×10¹⁵pfu/ml或1×10⁴pfu/g至1×10¹⁵pfu/g。

本发明的组合物可以根据本发明所属领域的普通技术人员使用单位剂量形式或在多剂量容器中的药学上可接受的载体和/或赋形剂能够容易地进行的方法进行配置。然后，制剂可以是溶液、悬浮液或油乳液或水溶性介质、提取物、粉末、颗粒、片剂或胶囊的形式。可以另外包括分散剂或稳定剂。

为了提高上述目的的有效性，可在本发明的组合物中进一步包括对非ETBF细菌菌种具有抗菌活性的噬菌体。此外，在本发明的组合物中还可以包括对ETBF具有抗菌活性的其他种类的噬菌体。可以附加地包括这些噬菌体，以使抗菌效果最大化，因为噬菌体的每种抗菌性质(例如抗菌强度和抗菌谱(宿主范围))在噬菌体对相同细菌菌种表现出抗菌活性的情况下是不同的。

在本说明书中，术语“预防”表示(i)阻断ETBF感染；和(ii)抑制由ETBF感染引起的疾病的进展。

在本说明书中，术语“治疗”表示所有以下活动：(i)抑制由ETBF引起的疾病；和(ii)减轻由ETBF引起的疾病的病理状况。

在本说明书中，术语“由ETBF引起的疾病”和“ETBF感染”表示急性和慢性肠道疾病、菌血症、腹泻、结肠炎、结肠瘤或癌症，但不限于此。

在本说明书中，术语“潜伏期”表示噬菌体微粒在受感染的宿主细胞内繁殖所花的时间。

在本说明书中，术语“裂解量”表示每个被感染的细菌产生的噬菌体的数量。

在本说明书中，术语“分离”表示通过应用各种实验技术从自然界中分离噬菌体的行为，以及确保能够区分目标噬菌体和其他噬菌体的特性的行为，并且还包括使用生物工程技术增殖目标噬菌体从而使得目标噬菌体可工业应用的行为。

在本说明书中，术语“查询覆盖率”和“同一性”与BLAST(基本局部比对搜索工具)有关，BLAST是由NCBI(美国国家生物技术信息中心)提供的在线搜索工具。

在本说明书中，查询覆盖率是描述多少查询序列(即，噬菌体Bac-FRP-4的基因组序列)被目标序列(即，先前报告的噬菌体的基因组序列)覆盖的数字。如果数据库中的目标序列涵盖整个查询序列，则查询覆盖率是100％。这表明序列相对于彼此有多长。

在本说明书中，针对“查询覆盖率”测量了术语“同一性”或“序列同一性”，并且“同一性”或“序列同一性”是描述查询序列(即噬菌体Bac-FRP-4的基因组序列)与目标序列(即，先前报告的噬菌体的基因组序列)相似程度的数字。更具体地，当查询序列(即噬菌体Bac-FRP-4的基因组序列)和目标序列(即，先前报告的噬菌体的基因组序列)通过BLAST比对分析来分析时，术语“同一性”或“序列同一性”是指目标序列(即，先前报告的噬菌体的基因组序列)或查询序列(即噬菌体Bac-FRP-4的基因组序列)的跨越序列部分中相同核苷酸的百分比。同一性百分比越高，匹配越显著。从以上对于“查询覆盖率”和“序列同一性”的定义，对于本领域技术人员来说明显的是，两个相似噬菌体的基因组之间“查询覆盖率”和/或“序列同一性”的差异导致位于两个基因组中的ORF(开放阅读框)数量的差异，然后导致两个相似噬菌体的区别特征(包括目标菌株的范围以及抗菌活性强度)。

在本说明书中，术语“第二噬菌体”是具有特异性杀死ETBF的能力并且具有基因组的任何噬菌体，所述基因组具有含以下特征的序列：具有小于90％查询覆盖率且与SEQ IDNO:1具有至少96％同一性，且具有与噬菌体Bac-FRP-4在基因组拓扑和ORF的数量方面不同的特征，其中第二噬菌体的基因组拓扑为线性形式。

如以下实施例所示，本发明的实际的和当前优选的实施方式是说明性的。

然而，应当理解，本领域技术人员在考虑本公开内容的基础上，可以在本发明的精神和范围内进行修改和完善。

实施例1：能够杀灭ETBF的噬菌体的分离

从环境或临床样本中收集样本，以分离能够杀灭ETBF的噬菌体。这里，用于噬菌体分离的ETBF菌株已经由本申请的发明人预先分离并鉴定为ETBF。

下文详细描述了分离噬菌体的步骤。将收集的样本添加到以1/100的比例接种ETBF的BHIB(脑心浸液肉汤)培养基(小牛脑浸液200克起，7.7g/L；牛心浸液250克起，9.8g/L；月示蛋白胨，10g/L；葡萄糖，2g/L；氯化钠，5g/L；磷酸二钠，2.5g/L)，然后在37℃厌氧条件下静止培养两天。培养完成后，以8000rpm离心20分钟，回收上清液。回收的上清液以1/100的比例接种ETBF，然后在37℃厌氧条件下静止培养两天。当样本含有噬菌体时，为了充分增加噬菌体的数量(滴度)，将上述步骤重复总共5次。重复该步骤5次后，将培养液以8000rpm离心20分钟。离心后，使用0.45μm过滤器过滤回收的上清液。将获得的滤液用于典型的斑点试验，以检查其中是否包含能够杀灭ETBF的噬菌体。

斑点试验如下进行：以1/100的比例将ETBF接种到BHIB培养基，然后在37℃厌氧条件下静止培养两天。将2ml(OD₆₀₀为1.5)的上述制备的ETBF培养液涂抹在BHIA(小牛脑浸液200克起，7.7g/L；牛心浸液250克起，9.8g/L；月示蛋白胨，10g/L；葡萄糖，2g/L；氯化钠，5g/L；磷酸二钠，2.5g/L；琼脂，15g/L)平板上。将平板放置在清洁的工作台上约30分钟，以干燥涂抹的溶液。干燥后，将10μl制备好的滤液点在其上涂有ETBF的平板培养基上，然后放置干燥约30分钟。干燥后，将被点滴的平板培养基在37℃厌氧条件下培养两天，然后检查在滴有滤液的位置透明区的形成。在滤液产生透明区的情况下，则判断其中包括能够杀灭ETBF的噬菌体。通过上述检查，可以获得含有具有杀灭ETBF能力的噬菌体的滤液。

从上述确认的滤液中分离出纯噬菌体，以得到能够杀灭ETBF的噬菌体。传统的噬斑测定用于分离纯噬菌体。详细地说，使用灭菌的尖端回收在噬斑测定过程中形成的噬斑，然后将其添加到ETBF的培养溶液中，然后在37℃厌氧条件下培养两天。培养后，以8000rpm离心20分钟以获得上清液。将ETBF培养液以1/50的体积比添加到获得的上清液中，然后在37℃厌氧条件下培养2天。为了增加噬菌体的数量，重复上述步骤至少5次。然后，以8000rpm离心20分钟，以获得最终上清液。使用得到的上清液进一步进行噬斑测定。一般来说，纯噬菌体的分离不是通过步骤的单次迭代完成的，因此使用上述形成的得到的噬斑重复上述步骤。在至少5次重复该步骤后，获得含有纯噬菌体的溶液。通常重复分离纯噬菌体的步骤，直到生成的噬斑在大小和形态上变得彼此相似。此外，使用电子显微镜确认纯噬菌体的最终分离。重复上述步骤，直到使用电子显微镜确认分离出纯噬菌体。根据常规方法操作电子显微镜。简言之，将含有纯噬菌体的溶液加载到铜网格上，然后用2％醋酸铀酰进行负染色并干燥。然后使用透射电子显微镜观察其形态。分离的纯噬菌体的电子显微照片如图1所示。根据形态学特征，确认上述分离的新噬菌体属于长尾噬菌体科噬菌体。

对含有上述确认的纯噬菌体的溶液进行以下纯化过程。以噬菌体溶液的总体积计，以1/50的体积比将ETBF培养液添加到含有纯噬菌体的溶液中，然后进一步在厌氧条件下培养两天。培养后，以8000rpm离心20分钟以获得上清液。重复该步骤总共5次，以获得含有足够数量的噬菌体的溶液。将最终离心得到的上清液使用0.45μm过滤器过滤，然后采用常规聚乙二醇(PEG)沉淀工艺。具体地，将PEG和NaCl添加到100ml滤液中，直到达到10％PEG 8000/0.5M NaCl，然后在4℃下放置2-3小时。此后，以8000rpm离心30分钟以获得噬菌体沉淀。将所得噬菌体沉淀悬浮于5ml缓冲液中(10mM Tris-HCl、10mM MgSO₄、0.1％明胶、pH 8.0)。所得材料被称为噬菌体悬浮液或噬菌体溶液。

因此，收集上述纯化的纯噬菌体，命名为噬菌体Bac-FRP-4，然后于2020年12月9日保藏在韩国生命工学研究院的韩国典型培养物保藏中心(保藏号：KCTC 14402BP)。

实施例2：噬菌体Bac-FRP-4的基因组的分离和序列分析

噬菌体Bac-FRP-4的基因组如下进行分离。从使用与实施例1相同的方法获得的噬菌体悬浮液中分离基因组。首先，为了去除悬浮液中包含的ETBF的DNA和RNA，将200U的脱氧核糖核酸酶I和核糖核酸酶A分别添加到10ml噬菌体悬浮液中，然后在37℃放置30分钟。静置30分钟后，为了停止脱氧核糖核酸酶I和核糖核酸酶A的活性，向其中加入500μl的0.5M乙二胺四乙酸(EDTA)，然后静置10分钟。此外，将所得混合物进一步在65℃放置10分钟，然后向其中加入100μl蛋白酶K(20mg/ml)以破坏噬菌体的外壁，随后在37℃反应20分钟。之后，向其中加入500μl 10％十二烷基硫酸钠(SDS)，然后在65℃反应1小时。反应1小时后，向反应溶液中加入10ml以25:24:1的组分比混合的苯酚∶氯仿∶异戊醇溶液，然后彻底混合。此外，将所得混合物以13000rpm离心15分钟以分层。在分离的层中，选择上层，并以1.5的体积比向其中加入异丙醇，随后以13000rpm离心10分钟以沉淀基因组。收集沉淀物后，向沉淀物中加入70％乙醇，然后以13000rpm离心10分钟以洗涤沉淀物。回收洗涤的沉淀物，真空干燥，然后溶于100μl水中。重复该过程以获得足够量的噬菌体Bac-FRP-4的基因组。

通过使用来自首尔国立大学国家环境管理仪器中心(National InstrumentationCenter for Environmental Management,Seoul National University)的Illumina Mi-Seq设备进行下一代测序分析，获得了上述获得的噬菌体Bac-FRP-4的基因组的序列信息。最终分析的噬菌体Bac-FRP-4的基因组大小为46960bp，全基因组序列由SEQ ID NO:1表达。

使用BLAST调查对上述获得的噬菌体Bac-FRP-4基因组序列与先前报道的噬菌体基因组序列的同源性(相似性)进行了研究，发现噬菌体Bac-FRP-4的基因组序列与拟杆菌噬菌体B124-14(基因库登录号HE608841.1)的序列具有相对高的同源性(查询覆盖率：86％，序列同一性：97.16％)。此外，噬菌体Bac-FRP-4基因组上的开放阅读框(ORF)的数量为67，而拟杆菌噬菌体B-124-14具有68个开放阅读框。

根据这一结果，可以得出结论，噬菌体Bac-FRP-4一定是一种不同于传统报道的噬菌体的新型噬菌体。此外，由于噬菌体的抗菌强度和抗菌谱通常取决于噬菌体的类型，因此认为噬菌体Bac-FRP-4可以提供不同于先前报道的任何其他噬菌体的抗菌活性。

实施例3：噬菌体Bac-FRP-4的主要结构蛋白的分析

进行一维电泳以分析噬菌体Bac-FRP-4的主要结构蛋白。为了获得构成噬菌体Bac-FRP-4外壁的蛋白质，将200μl的实施例1中制备的噬菌体悬浮液与800μl丙酮混合，并剧烈涡旋。混合物在-20℃下静置10分钟。以13000rpm在4℃离心20分钟以除去上清液，然后空气干燥。将沉淀物重新悬浮在50μl电泳样本缓冲液(5×)中，然后将其煮沸5分钟。通过一维电泳分析制备的样本。因此，如图2所示，确认了大小约为25kDa、42kDa、48kDa和65kDa的主要结构蛋白。

实施例4：噬菌体Bac-FRP-4杀灭ETBF能力的研究

研究了噬菌体Bac-FRP-4杀灭ETBF的能力。为了研究杀灭能力，以与实施例1中所述相同的方式使用斑点试验观察透明区的形成。将总共5株已鉴定为ETBF菌株的菌株用作ETBF以研究杀灭能力。噬菌体Bac-FRP-4具有裂解和杀灭作为实验目标的5株ETBF中总共3株的能力。其实验结果示于表1中，代表性结果示于图3中。

[表1]噬菌体Bac-FRP-4的抗菌活性测试

同时，也在单独的实验中研究了噬菌体Bac-FRP-4对支气管败血博代氏杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌的杀灭能力。结果，噬菌体Bac-FRP-4不具有杀灭这些细菌的能力。

因此，证实噬菌体Bac-FRP-4具有较强的杀灭ETBF的能力和针对ETBF的广谱抗菌谱，这表明噬菌体Bac-FRP-4可以用作用于预防和治疗ETBF感染的组合物的活性成分。

实施例5：噬菌体Bac-FRP-4的生长特性

噬菌体Bac-FRP-4的生长特性通过一步生长曲线分析进行分析。噬菌体Bac-FRP-4的一步生长曲线分析如下进行：将50ml BHIB(脑心浸液肉汤，Difco)培养基以1/100的比例接种ETBF，然后在厌氧条件下静止培养至指数期(OD₆₀₀＝0.4～0.5)。培养完成后，以8000rpm离心5分钟，回收细菌细胞团块。将回收的团块悬浮在50ml BHIB中。所得材料可称为细菌悬浮液。将噬菌体Bac-FRP-4与细菌悬浮液以0.1的感染复数(MOI)混合，并在室温下培养10分钟，然后以12000rpm离心30秒。除去上清液后，将含有噬菌体感染的细菌细胞的团块悬浮于50ml BHIB中，并在37℃无振荡培养。在140分钟内以20分钟间隔取等分试样，并立即通过常规噬斑测定法测定等分试样中的滴度(图4)。

噬菌体Bac-FRP-4的潜伏期估计约为60±10分钟，平均裂解量约为320±50pfu/感染细胞。

实施例6：关于使用噬菌体Bac-FRP-4预防ETBF感染的实验实施例

将100μl噬菌体Bac-FRP-4悬浮液(1×10⁸pfu/ml)加入含有9ml BHIB培养基的试管中。在含有9ml BHIB培养基的另一试管中，仅进一步添加相同量的BHIB培养基。然后将ETBF菌株(CCARM 18105)的培养液添加到每个试管中，使得在600nm处的吸光度达到约0.5。添加ETBF后，将试管转移到37℃的培养箱中，然后进行静止培养，在此期间观察ETBF的生长。如表2所示，观察到在添加了噬菌体Bac-FRP-4悬浮液的试管中，ETBF的生长被抑制，而在未添加噬菌体悬浮液的试管中，ETBF的生长没有被抑制。

[表2]噬菌体Bac-FRP-4的细菌生长抑制试验

上述结果表明，本发明的噬菌体Bac-FRP-4不仅抑制ETBF的生长，而且具有杀灭ETBF的能力。因此，得出结论，噬菌体Bac-FRP-4可用作用于预防ETBF感染的组合物的活性成分。

实施例7：噬菌体Bac-FRP-4对动物模型中ETBF感染的预防作用

研究了噬菌体Bac-FRP-4对受ETBF影响的断奶仔猪的预防作用。将4头25日龄断奶仔猪分组在一起；每个猪圈(1.1m×1.0m)共饲养2组猪。提供加热系统，并控制周围环境。始终控制猪圈的温度和湿度，每天清洁地板。从实验的第1天开始，按照常规饲料供应步骤向实验组的猪(添加噬菌体)喂食添加了1×10⁸pfu/g的噬菌体Bac-FRP-4的饲料，同时按照常规步骤向对照组的猪(不添加噬菌体)喂食不添加噬菌体Bac-FRP-4的相同的饲料。从实验第7天开始，两组的饲料均被1×10⁸cfu/gETBF污染2天，然后分别为实验组和对照组每天提供两次，以引起ETBF感染。施用的ETBF悬浮液如下制备：使用BHIB培养基在37℃厌氧培养ETBF菌株(CCARM 18109)两天，之后分离细菌并使用生理盐水(pH 7.2)将细菌调节至10⁹CFU/ml。从提供受污染饲料2天后的下二天(实验的第9天)开始，实验组(添加噬菌体)的猪按照之前的常规饲料供应步骤再次喂食添加了1×10⁸pfu/g噬菌体Bac-FRP-4且未污染ETBF的饲料，而对照组(不添加噬菌体)的猪按照常规步骤喂食不添加噬菌体的相同饲料。从实验第9天开始，每天检查所有试验动物的腹泻情况。通过根据腹泻指数进行测量来确定腹泻程度。腹泻指数采用常用的粪便稠度(FC)评分来测量(正常：0，软便：1，轻度腹泻(loose diarrhea)：2，严重腹泻：3)。结果如表3所示。

[表3]粪便稠度评分

从上述结果可以证实，本发明的噬菌体Bac-FRP-4可以非常有效地抑制ETBF的感染。

实施例8：使用噬菌体Bac-FRP-4治疗ETBF的传染性疾病的实施例

噬菌体Bac-FRP-4对由ETBF引起的疾病的治疗效果如下评估：将40只8周龄小鼠分为总共两组，每组20只小鼠，然后将每组5只小鼠的亚组分别饲养在单独的实验鼠笼中，实验进行7天。在实验的第二天，通过腹腔注射向所有小鼠施用0.1ml ETBF悬浮液。施用的ETBF悬浮液如下制备：使用BHIB培养基在37℃厌氧培养ETBF菌株(CCARM 18109)两天，之后分离细菌并使用生理盐水(pH 7.2)将细菌调节至10⁹CFU/ml。在施用ETBF后2小时，通过腹腔注射给实验组小鼠(施用噬菌体悬浮液)施用10⁹pfu的噬菌体Bac-FRP-4。通过腹腔注射给对照组小鼠(未施用噬菌体悬浮液)施用0.1ml盐水。对照组和实验组均同样地喂食饲料和饮用水。从施用ETBF开始直到试验结束，每天观察小鼠是否存活。结果如下表4所示。

[表4]存活率

从上述结果可以明显地得出结论，本发明的噬菌体Bac-FRP-4在治疗由ETBF引起的疾病方面非常有效。

本领域技术人员将认识到，上述描述中公开的概念和具体实施方式可以容易地用作改进或设计其他实施方式以实现本发明的相同目的的基础。本领域技术人员还将理解，这样的等效实施方式不脱离所附权利要求中所述的本发明的精神和范围。

对本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可以对本发明进行各种改进和变化。因此，本发明旨在覆盖本发明的改进和变化，只要它们在所附权利要求及其等价物的范围内。

保藏号

保藏机构名称：韩国典型培养物保藏中心(KCTC)

保藏号：KCTC 14402BP

保藏日期：2020年12月9日。

序列表

<110> 尹特荣生物科技株式会社

<120> 用于抑制产肠毒素脆弱拟杆菌增殖的组合物和方法

<130> 20001.0060WO

<150> US 17/227,286

<151> 2021-04-10

<160> 1

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 46960

<212> DNA

<213> 未知的

<220>

<223> 长尾噬菌体科噬菌体(Siphoviridae bacteriophage)

<400> 1

gctaataagg atatgttcgg tttgacctat gaccctcaaa aaaggtatta tgtgtttata 60

gatcattctg ttctatcatc tacaattcct aatgacacaa gaagtatctt tttgcggatc 120

gtatacactg atggcacaag cgaggacatg tcggtattta atgacagcat aggaaacaat 180

ttcatcctta catcaaaggc tattagatac atattgggtt cttatggtac ttctgtctcg 240

acttacttgc gtattggaat atttgaaaca aactttcctg tttcatggag tcccgcaccg 300

gaagatcaat tataccagtc tgttaagtac acagatactc aaattttggc agttgatggt 360

aagatagaac tatctgtaac aacggaatta aataaacgtg tcattggtgg cgctaatttg 420

atattaaaat cgggtacatg tgtttccggt gttgacaggg aagaacgttt tgatatgtcc 480

caatatttta gagatttgag agggaagaaa gttactattt cttttgatta tgaatatagt 540

aatttggaat taggtcgtga aaatcgaata ggtcttgaag agccagtatt gaaagacgga 600

acttcccaat attattgggt gggtactttt aaacatttca attcttcgtc accgaaatct 660

gaaaaaggac gatttgttaa tactattacg gtacccgatg atattgtaac ctctcagaat 720

aaagggatat acttaattat tcaagtaggg aatggtacaa acatgaaagt ttgcaatcct 780

cagattgaaa tcggagatac tgcaactggg tggagtcctg caccagaaga tggaataata 840

gaatctaagg aatatactaa tagtcaaatt agtgtagtcg aaggtaagat aacatccacc 900

gttgaaaaga taaataccgt tgatggacgt gttaccggac ttgcttcacg cgtcgaacag 960

accgaaaaaa gtatcacgtc tgttgttggt gatattggtg ttattaatag taccaccaat 1020

aggcatatat caaagcgaat agatttaaga ggatgggaca ataataagtt tttcccgttg 1080

gttataagta ttccggttta ccacaaaaca agggttgaaa taagtaggcc tcttaatgcg 1140

ggatacggaa aaccttcata cggtactcac gatggcggtt tttctatgaa cttaacgttt 1200

gagatgtccg gttcgggttg gggttcgttg ccagcagtaa ccaatatctt tgactatact 1260

aaagcatgga cttctgcggg tgcaaagata gttgttgatt tgggacaaat aactgaaacg 1320

tctacgtgta gaatgggtat taggggcggt tctatgtatg acgtaaccgt atatgatact 1380

attgacccaa acgtaatcaa cgtttatcaa accgattatc acggttcgta taatacatcg 1440

ttccccgttc gcaccgatgg aactgaaccc gtccgcacat acggatacta taccgaaata 1500

aagcagacgc aggaaagcat agctttaact gcgaacaaag tggacgatca aggtaggcga 1560

ttaagtgcgg ctgagttaac tctaagttca gaccacgcaa aattaagcgt agtagaacaa 1620

gcggcaaatt ccgccaattc cttagcaggc acagccaata acaaagccga agccgcagac 1680

ggtcgtgtca ccgccaccca aaacggctta gtcgaaaccg gaatcaacat cacgtcccgc 1740

aaaatcgtgc taaagtctga taacgtcctt ttccaaaaca acgcaggaca gcagacagcc 1800

gctatcaatg cgaacgggaa acttactgca aatgcaatcg aggttggaga agttgttgcc 1860

ggaggttttg cggctcagag aattactacc gggaacttga ctgtgacgga tggggctgtt 1920

atcggtggta tgactatcaa agggggagtg ctgaccggga agaacatcaa tatacaggat 1980

ggtgcaaaga tcggtaactt caccattgta tcgggtatat tttccgccca aaatacgccc 2040

gcaggcatac aaatgactct atcgaataat gccgctactt ttgacagtag cggagtacgt 2100

gtagaacata attcgggtgg ttatgcgttg actactacgg gtaacggaag agtgttctta 2160

acaggttcaa atttttgggt tcagtgtaag gacgttgatt ttatgggtgc tcaaacatgg 2220

aaagccccgg gtgtttttta cgcatgtacg attttggcaa acggagcaat cggtaaaaca 2280

tgggggaacc ctgactttca tataacaaga gtaactagaa actcaacagg gagatatact 2340

gttaatacta ccggttccaa tggggactac tttgttatga ttacagcgta tcatcctaca 2400

agttggttaa gtacaacagt agaaccatac tcagaaggac agtttgcgta caaagtattc 2460

gatgtaaata ctggcatgac tgacagcgga gttattattt atttttgtgg catggttagg 2520

tagtttagtg ttttaattaa cggtaagttg gttttatcct tcttaccgtt tacctttgta 2580

ccaaacatta atcaattaat ataaaattat ggaaaagaaa agtttagatt ttgatttaaa 2640

gtcagtagtt tacacgaaag aaacaaaagt gatggactac catttcgaga cggaaaacgg 2700

caagtacgta ggtcaattaa caacggtatc gacagagccg gacaagtaca acattaccca 2760

ctgtacggct gatgtgtcag agaaacaaat ggtagaaatg ccgggaacta ccggtagtcc 2820

aattctgcaa gaacaatacg ttccggtcgg atcgcttgcc atccgtgacg gtcgctttga 2880

ggcaaaccag tttcctctat ctactaaaac atccgtctat gtgaacgact ttcaaaattt 2940

catctttgcg ttaaccgcac ctaaaacagt agaataatga atgttacaca agaacagtta 3000

aggttaatgc ttgtatcggc aattagtccg atacttgcgt ttctcacccc tacgagcggt 3060

tttataaccg cccttgtgtt catgtttggc tttaacatta tttgcggcat gcgtgccgat 3120

ggggttaatt tgtcggtaaa tggtgttcgt aggttcacta tgctgaaatt catctcagcc 3180

gtgcaggaac ttattttgta catccttgtg ataaccgtta tcttttcgtc tgtggctaag 3240

atgggggatc acgacgcagc cgttctatcg gcaaagacga ttacatacgt ctttatgtac 3300

gtatatctgt cgaacggttt taagaacctt tgtatcagct acccggataa caaatctttc 3360

cggttgatat accacattgt ccggtttgag tttaagaggc tgatgggaga gaacgcatca 3420

aagatagtcg aggaacacga agaaaagatt gagattgaaa ctaagtaatt aacatgggag 3480

gtttaacgcc tccctttaac ctttatcaga atgaagtatt ttacattaaa agagctaaca 3540

cgctcagcaa cggcagaggc aaaaggtatt gataacacgc ctacgccgga agttgaaaag 3600

aacttaaagt tattggtaga taatgtactt gataaattac gtgagattta cggcaagccg 3660

atcacggtta attcgggtta tcggtgtccg gagttaaaca aagccgtcgg aggatctaaa 3720

acatccgatc acgttaaagg ttttgcggct gatattaccg gaggcagcaa ggaagagaac 3780

gaacgccttt tcaatatcat taagcacaat ttccatttca aacaattaat aaacgagaaa 3840

gatttttcat gggtgcatgt ctcctacgat ccctctaatc tcaaaaacca aatactaaaa 3900

ctatgaaacg acaattattt gcgtttttag cgacttttgt gctttgcctt ggtattgtgt 3960

cgctattact gataaacgct gatttacgga agaaaaaagc tattgcagaa agaaatgtta 4020

gcgtcctcac aactcagaac gttgcgtacc ggacgaaaag cggtcaaagt gccatgaaag 4080

tagaggaatt gaatctaact ttaaagcagt accggaacac tatacagggg aaggataaca 4140

ccataaaaga gctaaagcag tctatcaagg acttgaaaag tcacacaagc gttcaaatat 4200

caactgaggc gcattttagc acggctgtac gggatagtat tgttattctt gatagtttgg 4260

ttatcgacac aatgaaatgc gtaaatattc gctctaaatg gattgactta tccggctgta 4320

tagatagcaa cggcacgttt gccggaacaa ccgttacccg tgatagcttg gaaatactaa 4380

atatagagca tagaaagagg tttttgtggt ttagactaaa gaaggtgaag tatagagagt 4440

ttattgtaac gagcaaaaac ccctacgctg agataacagg ttttaacgta actacgataa 4500

taaagtgata attccatgtt aaaacagtta atgcacgtta aagtatttgc tactgagaaa 4560

tatatccgta tatttgcagc gtagaagtta ttactaacgt cattaacagc ggttattgat 4620

tttcacagaa tcatgttttt ggaagatttg tatcacattt tatcttaaac tgtcggtatg 4680

agaatataga cagtttttaa ttagaacatt ttcactaact atatatattg ggttttgtca 4740

taattacatt tttccccctc cgcttgtgaa agtagagggg ttttttatta ccttatccga 4800

acacgtctaa aaagttaaat tagtgttaaa tatcaaactt atgctttgat atttaaaata 4860

tctccttaac ttcgcgacat caaaaggaaa cgaattacta acaataaaac ttagagttat 4920

ggaagaaaag gaatttattt attgcttgac cggagagatt aacgtattag gcactgtcaa 4980

ggctaagaca ataaaaagtg ctatgaaact tgtagcggct attcagagag gtgctatatt 5040

gaatgatccg gaaaggaaat caatcttttg gagcgtttca cgtgctgatc tcccgtttaa 5100

acttggtcgt attgtgtata caatatgcta ttccgatggt tctgtccgtt cacatgtgtg 5160

ctaacaataa aaaattagaa ttatgatacg atcgtttaat aagtcgggtt caacatctat 5220

gctgacagat aaggaaaaag cgtttaaccg atactgccta actaacaagg aagtttcata 5280

caacttaatg cgtatagaaa tggcagttgt tcaaatgtcg tattacggca accgttcatc 5340

ggacgttacg ttaacaaccg atagttctga ggtcttggat gcaatttata cagtcctaac 5400

aaatgaaggg tttaaatact ctttcaattt acctaataaa gtattaacca taagtatttt 5460

ttaatttaaa atttaatcaa aatgaaagaa gaagtaaaat tgttcagagc gttaattatt 5520

gtttttgtgt cgcttgtatt caccttcgta gtaacttcat gcagtgatga tagcgacaat 5580

gtgtatcaaa cagagtattc tattgatgta ccggagtggc aaactgttta tgtgaatggt 5640

gaggttacaa cgtctatatc accatatgtt tgggaacatg tggacttatc agataaatgt 5700

gttagggtat tctccgcagg acatgttagt tatcacaagg taacgagggt gtcacgtgat 5760

gatttaggct ttaccgttta ttcaatagaa ggtagcaata acgaaaggtt tgcatacaat 5820

aaaaataaag gtatattgca atattggtgc acaagaaacg gtattgaaac agttgttgtt 5880

tatcgtgaat taaagtaagt ttcattttac cctcacccgg tggcggttaa ccgggttatt 5940

aagtatgaaa gtaaatgttc tattagaaga gaaaaagatt ccatgtttcg aagctaaata 6000

cggttagatg tatataacga taaaggacaa aaatatacta tcgagttcga tataatggga 6060

aatttagtag ttagtagtcc aaaaggtacg ttattagtaa aacccgaatg taacaacaaa 6120

atatcaatta gaattgaatg atatgaaaga gataaacgaa actcaattac agctatcgac 6180

tgagggaaaa agacttcccg atatgataaa gcaggcgaac gatattcacg aacttgttaa 6240

gcagaaactt tctgagtata actcaataga gtataccgat gataatataa aggtggcaaa 6300

agccgataga gctactttaa acaaggcgaa aaagggactt aacgacagcc gtatagaact 6360

tgaaaaggct tggatgaaac cgttcaacga actaaaggat gttgttaacg aaacttgtaa 6420

gctgatcggt gaggcttctt cgcgcataga tagcaagata aaggaaacgg aggaaaagga 6480

gaagcaaaag aaactggatc aaataaggga gtatttcgag gaacacaatg aaaatcttat 6540

cttgtttgat tttgctttcc gtccggagtg gcttaataag actaaagcac tttcagttgt 6600

gaaaatggag atagacgaat tgttcaaaac agtagacgat gatcttaaca gactgaaaga 6660

gcattttgcg ggagaggcgt tttatattcc ggttatcgac aaatatacgt ctacactcga 6720

ctacaacaaa tcattcgact atggaaacca cctaaaagaa gctgcaatac aagccgcaaa 6780

cagacagttt gaacagaagg ctacagatag cacgcctcag caacaaaagc ccgaaattaa 6840

gccacaaaac gagccaaaga cgaacgaaga agaagtttat atacgaggct ttaaagtcca 6900

tgtaacgaga aagcaggctt ttgcgcttgc tgagtttatg aatagccaca atataaagtt 6960

tgaaagtata tcaatataga cggtagccca attgggctac cttttttgtt ttgtttgcaa 7020

tagttaatct attgttaaaa cttaaagttt cgcttgaact ttcaaataat gtgcttatat 7080

ttgcagtgtc gaaagaaaca aagtagtaac aattaaaaat taaatattat ggcaactaaa 7140

acagattttc agaaagtagc aagatgtaaa acagaactcg gaacaacata cggttatata 7200

tacactaaaa acggatggta cgcttattac atgtgtggtt cttctatccc cgaatttaaa 7260

ggaactttag atgaagttga gaattacgtc cgttctgagt ggaatcttga aattgcaaga 7320

atggctaagt ttagaaacaa atagtaacaa ttaaaaatta gaattatgaa ggaaattaga 7380

tgcgttaaat gcgtatgtgt gattaataca gatgccgggt actatgcttc ttttgatggt 7440

agcttttgca gaaagtgttg gattaaacaa tcagatagat ttaaaagtga acaattgatg 7500

aaagcactct caaagagatt caaatgtaat attaacaaat agtttatttt aaaatggaac 7560

agtatttaga cttactaaaa gagactttga attatggtga aaagagatca gaccgaacag 7620

gaacgggaac tatcagttta ttcggtttac aacgatctta tgatttgcgt gacggtttcc 7680

cgcttgtcac aactaagaag gtattcacga agggagttat atatgagctt ctttggatgt 7740

taaaaggaga caccaatata aaatacctaa atgaaaatgg tgttcatatt tgggacgaat 7800

gggcaaagcc ttccggtgat cttggacgta tatacggtaa acaatggcgt gactggagta 7860

taaatagcaa gttaagagta gatcaaattg agtcagttat agatatgatt aagtttaacc 7920

cggggtcaag aaggctaatt gttagtgctt ggaatgttgg agaaatacac atgatggcac 7980

ttcctccgtg tcactgcttt tttcagttct atgtgtctga gtccggttat ttggatttga 8040

aactgtatca aagaagtgca gacctatttt taggcgttcc tttcaacatt gcgtcttatt 8100

ctatcttgct gtctatggta gcgcaggttt gcggcttaaa gcctcgtaga ttcattcaca 8160

ctatcgggga cggacatata tatttgaatc acgttgaaca ggtgaaagaa caattgagta 8220

gagagccgtt cgcccttccc aaattggaat taaacccgaa tgttcgtaat atattcgatt 8280

ttaagtatga agatattaag atagtaaatt ataactgcca tccggctata aagggagagg 8340

ttgcggtatg aatgaaaaag aattttacag gtttttagcc tataataaat tggtagattt 8400

tgaaagatac cttcacatgg aatctgtata ttatctgaat aacttgctaa agaaaaccgt 8460

taattcgtat ttaagagatt gtatattgaa cgctataaat cataaattag cgggattata 8520

atttaaaagg gatgtgcaac gctttgccat ccctttttag tttctatata tcacataccg 8580

aaactatcgt tgctctatga aacaaatcta acaatatgta gtaacaagta tgaaagtgat 8640

gcaaatgtag gattttgaat ctattcgatg gttaaaacga tacgttttac atttcattaa 8700

caataaaatt aaagaatttc tttgcgtatt taaagtttat ccttaacttt gcaacatcaa 8760

aaaagaagta gtaacattaa aaacgaataa tatgcagatt aaaaaagatc aaatttacaa 8820

attgcttgtg caagtttgca agaatgaagg tatttcattc tcctacgaaa aacttgtttt 8880

atctcttaat aagtacattg atgaagacga agaagattca gtattcgggt atgaaatatc 8940

tgatattgat atttcaatcg ccaaacatat atcagttgat atttgcggaa cgcttgtatt 9000

aagcaatatt atttgccaat taacttgcat cggtgcggga gattgcccga attgcggagg 9060

tttactcaga ttgatagaat cttaccccaa atttagcaaa cagtattgcg atcgtgattg 9120

tgagccggag agagaagaag aaaatgtata cgaatgttta acatgtggaa aggaggttat 9180

tttatgaata ttgaaaacac aatgatccga atcaatgatg cgattataag cgcacgtatg 9240

aacggcaaaa agattacgaa aaaggatatt gcagcgttgt tgtggaagga ctcaaagcaa 9300

agaacgcagg cggtaaacat gtctgccttg tgtaatcaca aaacccaaac aataaaaatc 9360

gaatgggtga aagagatatg cgaggctacc ggagtcgatg cgaatttcct atttaatatt 9420

aaccctaaaa aataaaagtt atgattaaaa atttaccaaa cattcaaaac gaaatgaatg 9480

ttcaaaagtc gaggtataac cagtttggaa aatacaatta tcgttcgtgc gaggatattt 9540

tgcaagaagc gaaaagagtg tgcggaaaat acggatgtta tgttatggtg actgactcta 9600

tcgaatttat cgaagggcgt ttttacgtga aggcaaccgc aaagattgtt gagactgaaa 9660

ccgggtctat tgaaacatgt tcggcttttg cacgtgaaga agatagcaaa aaggggatgg 9720

acttagcaca attaaccggg gcgacatcca gttatgcacg aaaatacgcc ttatgtgggc 9780

tttttgcaat agacgatagt atagacagtg attcaatgaa cggagagccg gaagcgaaag 9840

aaaaacggca aaagacagcc tcaaaacaag ctaccaacca aagtaatact ggaagcaact 9900

caaattattt gggtgtgctt cttgaagaaa taaaaaaagc aacaacttat aaacatttgg 9960

gcgatattca caagaataac gctaattacc atcaaaatag tgagttcatg aacgctttag 10020

ttgtccgtaa ggcggaactt gaaaaggcgg aagcggaagc aaagaaagta taaataattc 10080

gggggatgcg ttcccccaat aaaaataaaa gcaatatgaa agaactaaca ttactcccca 10140

aattggttaa tgctgatgta acgtatatca gcgaaacaca tgaatatttt tcaagcgatt 10200

ttagaaagct gagagggata acgggtttta tcaatgatca attatttctc ggcaaacttg 10260

acaatatacc ggataatatt ttgagatcgg caactgagag agggaaagcg gttcatgatg 10320

aagttgagag gatcgacaaa gaaggtattg aaccggaaac ggtctacgga gagaactatt 10380

tgaatttaaa agccggaagc ggtttaattc atatcgcatc tgagtatatt ctaactgata 10440

acgagtttat cgcatcaccg accgataaag tgtatttggg tggctctgat aaatcagtcg 10500

ttttaggtga cattaaaact acctacaaac ttgatttgct ttatttgtct tggcagctat 10560

caatatacgc ctatcttttc gagagacaaa acccaaattt gaaagtagag ggacttatcg 10620

caatttggct aagaggtgac aaggataagg acggaatttt ctctgttgaa cgcataccgg 10680

acagcgaaat agaattattc cttaattgct gtaagaatgg agttcgatat gcagacaatg 10740

caagcaaaga cagctacata gcaaaattgg aatcattgcc cgcaagagtt gcgcatatcg 10800

aagaaggcgt ttacgaactt cttgaaatgc aaaagaagat agacgagcat ttaggcaagt 10860

tcaaagaaca gttgttaggt ctgatgtctg aggcgaaagc tgacaatata aaaggggaac 10920

ttatttcagt cacaagaaag aaagcgtata gccgtgaatc acttgattct aaagcgttga 10980

aagagcaata ccccgaaata tacgatcagt tcgttaaaac atctaatgtc aaagaatcaa 11040

ttcaattaaa agcgttataa ttatggttat aaatgaaagt ttagcgaacg agatcggttt 11100

agagggtgcg actgtgtaca gctatgtatc tatcatccta tcaactgact tttataagga 11160

tcgttttaag ggatgccggg ttaaaggcaa gaagtgtaca gccttcatat caataagcaa 11220

gttaaaagaa ataattccct tcctatcgac aaagaagctg tacaacgcta tgaacttatt 11280

agtagatacg ggatacttaa aagaactacc attgcgaaaa ccgggtttaa atacaacccg 11340

atgttaccaa cttgttaatg tgatccaaca tttcgagtaa ccgataatac acccaccaac 11400

gttttttagt tgtgtgggtg ttttttgtac agcacgattc tgtgcagtat gtctatacct 11460

aattatcaga tatttgcaaa acaaagaatg ttaaatcata aaaaaataga tgtttttcca 11520

ttgcagtata taataataaa cactatattt gcagagtaaa atttaaaaca gtatgtatat 11580

gaaagtagaa aacttagtta agattaagag ttatgccgat ttaaagggag ttacagtacc 11640

ttggatatgg aggcttatta agagaggaaa attagagtat attcaaattg atggtgcatg 11700

cttcattgag ttaacggatg aagaactgaa aaagtatgcg gagtacaaag aacggataag 11760

ttcatttttg aatagcaaat agtattaatc attaaaattt tagaaaatga aagaattagt 11820

tttttaaagg agaatcaaat caagttttaa ccaacagctt attggtagct gataagttcg 11880

ggaaaaacca caagcatgta ttagacgcta taagagagtt aattagtagc gccgaaaaat 11940

cggctgtact aaaaatgtct gataatcaat gtaaaggata ttttccagat acatctgtat 12000

agattaatcg tggtgcaaca aattgagtat tattgtttta taatataaat agtatcaatc 12060

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ggtgtggctt tggaggcggc tttacaaggg caggcgtccg catggaatac cgccaaaaag 39900

gaggcaaaga gctatgacga acaaatagca gttatcaata agtcaagtga ggaacttgct 39960

aaaaaggtgg ttattcccga tcttcttgca ggggacaaag taggtaagac gaaggaaagg 40020

acaaagaagg actttgacct acaagctgag tatgaaaata gccgtatagc tcttattatt 40080

gattcccgtt tgaaagagca ggaagaacgt aaaaaggcaa cggctgacga actgaaaaag 40140

ctaaaggaga gcacaacgga gaaacaaaga gctacgcagt tatatgctga taccgtatac 40200

aatatcgagg caaaattgcg tagagacttg gagaaactgc aaaacgactg gcgggtagag 40260

gacttgcaaa tcacgcatga ccgattgagt gaacgcctaa aagctgttag acgtggcacg 40320

gctgacgaac tattaattca agtgcagcta ctcgaaaacg aaagagcgca ggacgaattg 40380

cgcattaagc agtcaaccga tagcgaacag gtaaagaatg aacgtttgct tatcctgcaa 40440

agatcgtatc agcttgcatc tatccaactg caaaaggact tcactgacaa tcaagataaa 40500

cgtattattg atcggtctgt gttccgcctt aatcagcaac agcaggcgga aagtgcagcc 40560

tttaatatcg tgcagcgttc ggagaaagaa cagagccgtt tccggttaaa gttggagcgt 40620

gaaaagtggg agcaaatatt agagttaaca aggcagtacg gagagcaaat cacgggatac 40680

aacgtaaaga cggtagagga taccattaag ggaatagaca atgcaattaa gcgtgatact 40740

tccggatggg atagcaatca aggcgtgttt ggcaatctgt ttgatctcgt tttcggagac 40800

gcatttagcg ctaaagatgg taagtcgggc gcagagcgtg cagaacagtt taaagactcc 40860

atattagagg cttcggattt cgccatagaa aacctaaaga gtgttgcgca ggcaagggta 40920

gaggcggcag aggtggcagt ccaagcagcc gaaaaggaag tgtcagcccg acaaaaggtt 40980

ttggacgctg agatacaagc gagggcgaac ggatacgcca acaacgtagc aaccgcacaa 41040

aaagagcttg attttgcacg caaacaacag gaaaaagcgc ttagggataa gaagaaggcg 41100

cagaagcagc aagaacgcat agatacactt atgcaggcaa gttctttggt aaccgcaacc 41160

gctaacctat ggaaagattt aggtttggca gcgatcccgg ctattgcgtt gatgtgggga 41220

tcatttgctt ttgctaagat aaaagcctca cagctatcta aagcctcgca ggacacagag 41280

gaatacgggg acggtacggt agaaatgatt gattacggag gttcgcacgc atccggaaac 41340

gatgtagatt taggtacgac taaggacggt aagcgtagac gggtagaacg tggtgaatac 41400

ttcgcagtag tgaacaaacg ttcatctcag aagtataaga aactcgttcc ggacttgatt 41460

aattcgctaa ataagggtac ttttgaacag aaatacttaa acgcctattc cggtagtgat 41520

gaagtaacga atataatgca aggttcaacg gttgatctgt ctaaggtcga aaaagatctg 41580

aaatcaatca aagagcaggg acgtgttaag tacatcacag gtgcggacgg tacgataatt 41640

gaagtaaggg gaaatattaa acgaataatt aaatcataat gaacgttaaa gatttgcggt 41700

ttaaattggg gggtgtagaa atacatcccc actactcaga gctaaaacgg aagtttggca 41760

aagagaatca acaggagttt ttcagagagt cgatagaagg aagtttaacg ctgatcgggg 41820

cggactacct tcttgttaaa aatgcaagta tcgaagatat tttgtacttg cagatagaac 41880

agaaggacaa agggcaacta tcaacgcagt atcaagttat atttgagggc tatttcagta 41940

agacagattg tgagatagac agcgataacc gtacgtgcaa agtcaagata agcccacgag 42000

atgaatatac cgatataatg aagggtattg agaacaaata cgatcttatt aagcttgcac 42060

ctgctttgtc gcaaatagga gtctcaaagc gtccgattgt gcaagtttac attgcgggtg 42120

catctacaat atcgaactac cttgcaggca ctcactacga aactgaggtt ttcaacgttg 42180

taacggataa caaggagcta acggataaga atttctttgc cttcttcgct gcatacaacg 42240

aaatagaggt aaaggctgtg ccctatcagt tctttaacgg gaagtactac ggaacgaatg 42300

gaacgtacac taaattggat ggcaatttct caataaaatg gactctaagc gaaggtttaa 42360

atattggttt ccttcacttg gaaaataaag agggaactat attgtaccga tcagataaaa 42420

tcaattggag cgataaaagt tactactaca tagacgtttc tgaaataaca ttcacaagaa 42480

tagtagatga tccgacactt cctcaaaagt ttggcggaaa cactgttctt ttgcagaagc 42540

tatttcaaag aatgttgctt aaccttccgg agttggacgg taaacctacc gggaaactat 42600

catcagagga cgtttaccct accaatagca actacatgta tgccgcacca ttaaagggga 42660

actactttta tacgtctacg aaggttcaga acgagccgac agagtacggt gtaaatgatg 42720

aaggcaagta ttttaccgat aacttcgttc cggctgtggc gggtactgga aagctgtatc 42780

cggtatgccg ttcacgatgg gggaatatgt cgatttggtt cgagtttgat ttgtcctatg 42840

cgccattgga ggaaagagcg agaaaggagt atgttttaaa ggactcgttc gccatacagg 42900

acgctattag ggcgcttatt aagcaaattg atcccacttt gacgcacgaa gctacggaag 42960

aatatagtaa gtttttgtat gctgccaata accctatttc cggtgcacct tttaaggtgt 43020

tcatcacaca gaaaagcaac atcctaaagg gtgagtatga ccgtccggca aagaaggcgg 43080

aaacaaccct cagcgatata atgaagatgt tgcgtgacac gatgaaacta tattggttta 43140

tagatggcga taagtttagg atagaacata tttcttactt cataaatggc ggaagttata 43200

ccggtagtgg aacggtcggc atagacttaa caaatcttag atatgctaaa tcgggtcagc 43260

taatgacatg gaaaactaac acggtcaagt acgataaaac cgatctgcct tcacggtttg 43320

aattttcttg gatggacgat acaacaaata cgtttgcggg tttccctatt gatgtgaaat 43380

caaactacgt gcaagaggga aagaaggaag aaataagggt gtctaacttt tcgtccgatg 43440

tagattatat gctactatca ccgggtgact tttcacagga tggttttgcg ttattggggg 43500

ctacacaggt gggcggaaaa tggaaacttc cgttcgttac gttcaacttg gtagacaaga 43560

acaataagaa gtacaccgta aacccccaaa acggctacat gtcgttcttg cacctcgtta 43620

aatactacat gcacgatatg ccagcctcag agatagagca gggaggcgat cagacgataa 43680

gagtgagagg aataaagcgg agtatgacgc aagatttatc tttcacatac gacaccacac 43740

caaaccccgt gcaactgata acaacggata taggcaacgg gaaaccgata actatgactg 43800

aggatctaac aactcgccaa ataaccgtat ctttatctta caccccctta tagtaggggg 43860

tgttttcttt taaattgcta tctttgtgcc tataatcaat tttttaatca aaatggaagt 43920

acataacaac tttagtcctt tggcgtttag aaagaaagaa tctaaagcca catacgaaaa 43980

atggtacgct ttcgggaaga attatgctat ccccgcaagc gcaaatacgc ttataccttt 44040

ccagtttacc gatgtaaatg taggagaggt tcagcccgat tctattgagg ttgtagcggt 44100

aaaccaagaa accggagagg gcattaaaac aggtgtgtat gttagtcgtg acgacatgcc 44160

cgaacatggc agcgttctgt acgtgtcacc cggtaagaac tcgtttcgtg aggctttgcc 44220

acagggtaca tatcgggcgg agttttcaat cggaacacag ttttatattt caactccttt 44280

ttgtgttatt ccaggtatcg aaacaagtag caaatatctg ttgattgagt attggaacga 44340

tgaaaagatc gcatatccgg atggctttat tacaacgggt gcgaacaatg acttccggta 44400

tcagatgtat gttcctgcaa ctatctgcaa accgaaatat gagtttgaag aagaactaac 44460

caaacgtgcc ggatacaagt tcttagaact gcaaacgtct acgaaggtgt acgcctttac 44520

atttgttgca cctgagttta tttgtgacgc tatgcgactt attcgcctat ctgactatat 44580

ccgaatttcg cacgatggcg aatattacaa cgccctcaac ttcgagtttg atgttgattg 44640

gcaggaacaa ttatatttgg ctgctgttga ctgccagttt gagacggact caatcataca 44700

aaaactccct tctttcaata gacgagataa agcgtctttt tataatgccc tattagcgaa 44760

cattgataca cctataatgt tctctcccga taccgtaggg ctgtattaca aagagtatcg 44820

ggaaacagag ccagtagtca agggtaaatt gatacgggag ttatccccta ttgacttgat 44880

agatgaaaat acaactattg ccgttgattt gggtacaggt gaggcgagaa agtttaactt 44940

ataccgaatg ttgcaggact acatttctaa agcccatgaa gatgcaacag actttttgtt 45000

acaccttcgt ggaggcgcaa cgttcggtga gggtataact ggttctgccg cttctatcaa 45060

cgcagtagga gatgcggagg tgcagggtct aaacgcacgt gtaaccaaag ttaaatcgct 45120

tgattcggaa gattatgtaa ctgttaataa aacagccttc accgtaaaca aacaaggtga 45180

tacggcttta aatgcgctta atgcgagggg agtttcccgc ttgcagcaag atgtgtatac 45240

cggaaatgat accggaaaga tcaccaaaga aggtcaattg cagtaccttt ctgcaattat 45300

ccaacagttc ctatcatccc ctacgttcgt ttccggcttt cttggcgagg gctttaaaat 45360

atgggtcgag aatggcaatt ggcatataga atgtgacaat ttgacagtaa gacagactat 45420

gaatatattt gagctactta tccaaaagat aaggagcgtt aacggtgcat tggtcgtgtc 45480

tcagtcgaac ggaaagatta aaagcgtgtc ggaagatgaa acgaactacg ttatcacaat 45540

ggaggaagaa ggggaaacgt tccagcctaa cgatttagtt aggtgtcaag tttggacggg 45600

aagcaaagcc aaattctatt gggtcgaggt tgcaagcgtt tccggcaact ctattactgt 45660

gaaaaagtcc gaatttacag ccggaaataa gccggaaaaa ggcgatgaag tggtacagat 45720

gggtaacacg cagaacgcac aaaggcaggc tttaatctat atcacagcgc aggaaagcgg 45780

acatccgtac atagagatat tgaacggagt taaaactaaa tcgttgtccg gtacgaatag 45840

gacacgtctt ggcgatttaa gtaacataca ggactctgcg tttccggaag gacaacagcc 45900

atccggtagc ggcttgtatt gcgataacgc ttttcttcgt ggtatattct tgctgagaaa 45960

cggcaagtca gttgaggatg aagtaaacca agcgaagcaa gatgcagcca acgcagcaac 46020

agaggcggag agagcacaac agacagcgca ggaggcgaaa gatcggctta ataaatgggc 46080

tgacgatggt tttatatctc ctactgaaaa gcccgctttg attgatgaag gaaagcgtat 46140

acaggcagag tttttgcaga taaaaaataa cgctgacaaa tacggtgtat ccgttactga 46200

atataccaag gcttatgaag attatttaaa tgaacttaga taccattcag cccaacagcc 46260

ggaagatatt gcggtgcgtc cggaacttgc aaggacgcaa acgatatact acgatcggag 46320

aaacggagcg ttgaacgcta ttgcgaacgc tgcaaagagc tacgtagatg aagctgacaa 46380

gaagctaaag gagtatttag atacggagat cacagcgata cccggtaaga tcgaacttgc 46440

tgtacggagt atgaaaacgg ctgatgttaa cttgttgaag ggttcgtatg aagaaaaagc 46500

aaataactct tatagatttg ccgcatataa ctatgataca ccagttatag acgggaagaa 46560

atacactttg actgtatgct atactattgg gagtggtaat accaatataa gtgtttattc 46620

taatgctggt atgaaccaaa taacaaatct cacaactaag ggggaaagag ttatagaaag 46680

cacaaaagta accatgaaag gatataagcc gggtgaacca ttgtctttct atcaatttcc 46740

gaacggagct ttcggctcaa aagtacattg ggctgttttg actgatggca atttaggcgt 46800

aaccagttgg ataccttctg caagtgagaa gaacgtagga cttaagaact tatgttcgtt 46860

taagcgtatt actgatgcgg gatttaccta tgcttcacga tatgatgatg acggtgtaat 46920

tcttatgtta ccatcggtat tgcacaagga gtcatttgta 46960

Claims (16)

1.一种用于预防或治疗由产肠毒素脆弱拟杆菌引起的感染或疾病的组合物，包括：

具有裂解产肠毒素脆弱拟杆菌细胞的能力的长尾噬菌体科噬菌体，和

药学上可接受的载体。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中长尾噬菌体科噬菌体的基因组包括如SEQ IDNO:1所述的序列；或者具有：(1)具有至少90％查询覆盖率且与SEQ ID NO:1具有至少96％同一性的序列，(2)环状基因组拓扑，以及(3)67个开放阅读框。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述长尾噬菌体科噬菌体的浓度为1×10¹pfu/ml至1×10³⁰pfu/ml或1×10¹pfu/g至1×10³⁰pfu/g。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述长尾噬菌体科噬菌体的浓度为1×10⁴pfu/ml至1×10¹⁵pfu/ml或1×10⁴pfu/g至1×10¹⁵pfu/g。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体是乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶橡胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁或矿物油。

6.根据权利要求1所述的组合物，还包括：

选自由润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂组成的组的一种或多种。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述感染或疾病是急性和慢性肠道疾病、菌血症、腹泻、结肠炎、结肠瘤或癌症。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是溶液、悬浮液、油乳液、水溶性介质、提取物、粉末、颗粒、片剂或胶囊。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述长尾噬菌体科噬菌体具有大小为约25kDa、42kDa、48kDa和65kDa的主要结构蛋白。

10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述长尾噬菌体科噬菌体具有10-100分钟的潜伏期和580-800PFU/感染细胞的裂解量。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述潜伏期为40-80分钟，所述裂解量为240-330PFU/感染细胞。

12.根据权利要求1所述的组合物，进一步包括：

具有裂解产肠毒素脆弱拟杆菌菌种的能力的第二噬菌体，

其中所述第二噬菌体具有基因组，所述基因组具有查询覆盖率低于90％且与SEQ IDNO:1具有至少96％同一性的序列。

13.一种用于预防或治疗由产肠毒素脆弱拟杆菌(ETBF)引起的感染或疾病的方法，包括：

向受试者施用长尾噬菌体科噬菌体；以及

用长尾噬菌体科噬菌体裂解ETBF细胞。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述长尾噬菌体科噬菌体具有包括如SEQ IDNO:1所述的序列的基因组。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述长尾噬菌体科噬菌体的浓度为1×10¹pfu/ml至1×10³⁰pfu/ml或1×10¹pfu/g至1×10³⁰pfu/g。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述长尾噬菌体科噬菌体的浓度为1×10⁴pfu/ml至1×10¹⁵pfu/ml或1×10⁴pfu/g至1×10¹⁵pfu/g。