CN110612349B - 新型铜绿假单胞菌噬菌体Pse-AEP-3及其用于抑制铜绿假单胞菌的增殖的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从自然界分离的短尾病毒科噬菌体Pse‑AEP‑3(登录号：KCTC 13165BP)，所述短尾病毒科噬菌体Pse‑AEP‑3具有特异性杀死铜绿假单胞菌的能力，并且具有以SEQ ID NO:1表示的基因组，并且涉及一种使用含有所述短尾病毒科噬菌体Pse‑AEP‑3作为活性成分的组合物来预防或治疗铜绿假单胞菌导致的疾病的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种从自然界分离的噬菌体，所述噬菌体感染铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，从而杀死铜绿假单胞菌，并且涉及一种使用含有所述噬菌体作为活性成分的组合物来预防或治疗铜绿假单胞菌感染的方法。具体而言，本发明涉及一种从自然界分离的短尾病毒科(Podoviridae)噬菌体Pse-AEP-3(登录号：KCTC 13165BP)，所述短尾病毒科噬菌体Pse-AEP-3能够杀死铜绿假单胞菌，并且具有以SEQ ID NO:1表示的基因组，并且涉及一种使用含有上述噬菌体作为活性成分的组合物来预防和治疗铜绿假单胞菌感染的方法。
背景技术
铜绿假单胞菌(它是革兰氏阴性杆菌)是一种机会性细菌，它是自然环境中常见的，但是能够在免疫力下降(由于手术、烧伤、创伤或化疗而引起)的人们中引起脓毒症。铜绿假单胞菌是已知的主要医院感染病原体，并且是各种疾病(诸如心内膜炎、肺炎、脑脊髓膜炎等等)的致因。具体而言，铜绿假单胞菌感染在囊性纤维化患者中通常是致命的，并且已知婴儿被铜绿假单胞菌感染时，会经历严重的肺功能丧失。
典型地，疫苗和抗生素被用于预防和治疗铜绿假单胞菌导致的感染性疾病。在这里，由于抗生素耐药性细菌的增殖，抗生素的有效性不断降低。因此，迫切需要开发用于预防或治疗抗生素耐药性铜绿假单胞菌感染的药物。
最近，使用噬菌体作为针对细菌性疾病的对策已引起相当大的关注。具体而言，这些噬菌体由于具有针对抗生素耐药性细菌的强大抗细菌活性而受到极大关注。噬菌体是感染细菌的非常小的微生物，通常简单地称为“噬体(phage)”。一旦噬菌体感染细菌，该噬菌体即可在细菌细胞内部增殖。在增殖之后，噬菌体的子代会破坏细菌细胞壁，并从宿主细菌中逃出，这表明噬菌体具有杀死细菌的能力。噬菌体感染细菌的方式通过其非常高的特异性来表征，因此感染特定细菌的噬菌体的类型范围是有限的。也就是说，某些噬菌体可以仅感染特定细菌，这表明某些噬菌体能够提供仅针对特定细菌的抗细菌作用，因此能够单独杀死特定细菌，而不伤害其他细菌。由于噬菌体的这种细菌特异性，噬菌体赋予仅针对目标细菌的抗细菌作用，但是不影响环境中或动物肠道中的共生细菌。已经广泛用于细菌治疗的常规抗生素会顺带影响许多其他细菌类型。这会导致诸如环境污染和动物中的正常菌群紊乱的问题。相比之下，噬菌体的使用不会干扰动物中的正常菌群，因为目标细菌会被选择性杀死。因此，可以安全地利用噬菌体，从而与抗生素相比大大减少噬菌体使用的不良反应的可能性。
噬菌体由英国细菌学家图尔特(Twort)在1915年首先发现，当时他注意到微球菌属(Micrococcus)菌落由于某些未知的原因而变软并变得透明。在1917年，法国细菌学家德赫雷尔(d’Herelle)发现，痢疾患者粪便滤液中的痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)由于某些原因而受到破坏，并且进一步研究了这种现象。结果，他独立地鉴定出这种微生物并将其命名为噬菌体，意思是“细菌的吞噬者”。从那以后，不断鉴定出作用于诸如志贺氏菌属(Shigella)、伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhi)和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的病原菌的噬菌体。
由于噬菌体杀死细菌的独特能力，噬菌体自发现以来作为针对细菌感染的潜在有效对策引起了关注，并且已经进行了许多与噬菌体相关的研究。然而，自从弗莱明(Fleming)发现青霉素以来，对噬菌体的研究仅在一些国家继续进行，因为抗生素的使用已经普及。自从2000年以来，由于抗生素耐药性细菌的增加，常规抗生素的局限性已经很明显，并且开发作为常规抗生素的替代物的噬菌体的可能性已经非常突出，因此作为抗细菌剂的噬菌体再次引起了关注。
如上文所述，噬菌体往往对特定细菌具有高特异性。由于这种特异性，噬菌体通常展示出仅针对某些细菌株系的抗细菌作用，甚至在相同的种类内的抗细菌作用。此外，噬菌体的抗细菌强度可以根据目标细菌株系而变化。所以，有必要收集多种用于有效控制特定细菌的噬菌体。因此，为了开发有效的用于控制铜绿假单胞菌的噬菌体利用方法，必须获得展示出针对铜绿假单胞菌的抗细菌作用的多种噬菌体。此外，需要筛选所得的噬菌体以确定它们在抗细菌强度和抗细菌谱方面是否优于其他噬菌体。
发明内容
技术问题
因此，本发明人致力于开发适用于使用从自然界分离的并且能够杀死铜绿假单胞菌的噬菌体来预防或治疗铜绿假单胞菌感染的组合物，并进一步建立使用所述组合物来预防或治疗铜绿假单胞菌感染的方法。结果，本发明人从自然界分离了适用于此目的的噬菌体，并且确定了基因组的基因序列，所述基因序列将分离的噬菌体与其他噬菌体区分开。然后，本发明人开发了含有所述噬菌体作为活性成分的组合物，并确定该组合物能够用于有效地预防或治疗铜绿假单胞菌感染，从而最终实现本发明。
因此，本发明的一个目的是提供从自然界分离的短尾病毒科噬菌体Pse-AEP-3(登录号：KCTC 13165BP)，所述短尾病毒科噬菌体Pse-AEP-3具有杀死铜绿假单胞菌的能力，并且具有以SEQ ID NO:1表示的基因组。
本发明的另一个目的是提供适用于预防铜绿假单胞菌感染的组合物，所述组合物含有分离的噬菌体Pse-AEP-3(登录号：KCTC 13165BP)作为活性成分，所述分离的噬菌体Pse-AEP-3感染铜绿假单胞菌，从而杀死铜绿假单胞菌，以及使用所述组合物来预防铜绿假单胞菌感染的方法。
本发明的另一个目的是提供适用于治疗铜绿假单胞菌导致的疾病的组合物，所述组合物含有分离的噬菌体Pse-AEP-3(登录号：KCTC 13165BP)作为活性成分，所述分离的噬菌体Pse-AEP-3感染铜绿假单胞菌，从而杀死铜绿假单胞菌，以及使用所述组合物来治疗铜绿假单胞菌导致的疾病的方法。
本发明的另一个目的是提供使用上述组合物来预防或治疗铜绿假单胞菌感染的药物组合物，所述药物组合物含有分离的噬菌体Pse-AEP-3(登录号：KCTC13165BP)作为活性成分，所述分离的噬菌体Pse-AEP-3感染铜绿假单胞菌，从而杀死铜绿假单胞菌。
本发明的另一个目的是提供杀菌剂，所述杀菌剂含有分离的噬菌体Pse-AEP-3(登录号：KCTC 13165BP)作为活性成分，所述分离的噬菌体Pse-AEP-3感染铜绿假单胞菌，从而杀死铜绿假单胞菌。具体而言，该杀菌剂可有效预防医院内感染。
本发明的另一个目的是提供抗生素，所述抗生素含有分离的噬菌体Pse-AEP-3(登录号：KCTC 13165BP)作为活性成分，所述分离的噬菌体Pse-AEP-3感染铜绿假单胞菌，从而杀死铜绿假单胞菌。
技术方案
本发明提供了从自然界分离的短尾病毒科噬菌体Pse-AEP-3(登录号：KCTC13165BP)，所述短尾病毒科噬菌体Pse-AEP-3具有特异性杀死铜绿假单胞菌的能力，并且具有以SEQ ID NO:1表示的基因组，以及使用含有所述短尾病毒科噬菌体Pse-AEP-3作为活性成分的组合物来预防或治疗铜绿假单胞菌感染的方法。
本发明人分离了噬菌体Pse-AEP-3，然后在2016年11月29日保藏于韩国生物科学与生物技术研究所(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)的韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures)(登录号：KCTC13165BP)。
本发明还提供了适用于预防或治疗铜绿假单胞菌感染的药物组合物，所述药物组合物含有噬菌体Pse-AEP-3作为活性成分。药物组合物的实例包括但不限于杀菌剂或抗生素。
由于本发明的组合物中含有的噬菌体Pse-AEP-3能够有效地杀死铜绿假单胞菌，所述噬菌体Pse-AEP-3对于铜绿假单胞菌导致的疾病(诸如泌尿道感染、伤口感染、菌血症、心内膜炎等等)的预防(感染的预防)或治疗(感染的治疗)是有效的。因此，本发明的组合物能够用于预防和治疗铜绿假单胞菌导致的疾病。在本发明中，铜绿假单胞菌导致的疾病可以包括泌尿道感染、伤口感染、菌血症、心内膜炎等等。
本说明书中的铜绿假单胞菌可能对现有抗生素敏感，或可能具有针对现有抗生素的耐药性。简而言之，是否表现出针对现有抗生素的耐药性并不重要。
如本文所用，术语“预防(prevention和prevent)”是指(i)预防铜绿假单胞菌感染以及(ii)抑制铜绿假单胞菌感染导致的疾病的发展。
如本文所用，术语“治疗(treatment和treat)”是指(i)抑制铜绿假单胞菌导致的疾病以及(ii)减轻铜绿假单胞菌导致的疾病的病理状况的所有作用。
如本文所用，术语“分离(isolate、isolating和isolated)”是指使用多种实验技术从自然界分离噬菌体并且确保可以将本发明的噬菌体与其他噬菌体区分开的特征的作用，并且还包括使用生物工程技术来增殖本发明的噬菌体以使得所述噬菌体适用于行业用途的作用。
本发明的组合物中包含的药学上可接受的载剂是通常用于制备药物制剂的载剂，所述载剂的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯橡胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，但是不限于此。除了上述成分之外，本发明的组合物还可以另外包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、矫味剂、乳化剂、混悬剂和防腐剂。
本发明的组合物可以通过施用或喷涂于患病部位来使用，或者可以通过口服施用或肠胃外施用来施用。在这里，肠胃外施用可以包括静脉内施用、腹膜内施用、肌肉内施用、皮下施用或局部施用。
本发明的药物组合物的适当施用、喷涂和剂量可以根据诸如以下因素而变化：配制方法、施用方式、受试动物或患者的年龄、体重、性别和患病状况、饮食、施用时间、施用途径、排泄率和反应性。通常，用于所期望的治疗的有效剂量可以由熟练的内科医生或兽医容易地确定和规定。
噬菌体Pse-AEP-3作为活性成分包含在本发明的组合物中。噬菌体Pse-AEP-3以1×101pfu/ml至1×1030pfu/ml或1×101pfu/g至1×1030pfu/g的浓度，并且优选地以1×104pfu/ml至1×1015pfu/ml或1×104pfu/g至1×1015pfu/g的浓度包含在其中。
可以根据本发明所属领域的技术人员可以容易实施的方法使用药学上可接受的载剂和/或赋形剂来配制本发明的组合物，以便将所述组合物制备成单位剂型或将其加入多剂量容器中。在这里，所述组合物的制剂可以以油性或水性介质中的溶液剂、混悬剂或乳剂的形式，或者以提取物、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂的形式提供，并且可以另外含有分散剂或稳定剂。
本发明的组合物可以根据其使用目的制备为杀菌剂或抗生素，但不限于此。如本文所用，术语“抗生素”统称为防腐剂、杀细菌剂和抗细菌剂。
为了改善本发明的组合物的有效性，赋予针对其他细菌种类的抗细菌活性的噬菌体也可以包含在其中。此外，具有针对铜绿假单胞菌的抗细菌活性的其他类型的噬菌体也可以包含在本发明的组合物中。这些噬菌体可以适当组合，以使其抗细菌效果最大化，因为它们针对铜绿假单胞菌的抗细菌活性可以在抗细菌强度和抗细菌谱方面变化。
有益效果
根据本发明，与基于现有抗生素的常规方法相比，使用含有噬菌体Pse-AEP-3作为活性成分的组合物来预防或治疗铜绿假单胞菌感染的方法可以具有针对铜绿假单胞菌的非常高的特异性的优点。这意味着，组合物可以用于预防或治疗铜绿假单胞菌感染，而不影响其他细菌，即有用的共生细菌，并且具有较少的可归因于其使用的副作用。典型地，当使用抗生素时，还会伤害共生细菌，因此必然伴有由于其使用的副作用。同时，在各种噬菌体表现出针对相同细菌种类的抗细菌活性的情况下，噬菌体的抗细菌活性在抗细菌强度和抗细菌谱方面是不同的[就属于铜绿假单胞菌的各种细菌株系而言，噬菌体的抗细菌活性谱适用于单个细菌株系，噬菌体通常仅对一些细菌株系有效，甚至在相同种类内的细菌株系也是如此，因此噬菌体的抗细菌活性取决于细菌株系，即使对于相同的细菌种类也是如此]。因此，本发明可以提供针对铜绿假单胞菌的抗细菌活性，所述抗细菌活性不同于作用于铜绿假单胞菌的其他噬菌体。这为多个行业领域提供了适用性。
附图说明
图1是示出噬菌体Pse-AEP-3的形态的电子显微照片。
图2是示出关于噬菌体Pse-AEP-3杀死铜绿假单胞菌的能力的实验结果的照片，其中亮区是细菌裂解形成的噬菌斑。
具体实施方式
在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，实施例仅仅是本发明的实施例，并且本发明的范围不限于这些实施例。
实施例1：能够杀死铜绿假单胞菌的噬菌体的分离
从自然界收集样品，以分离能够杀死铜绿假单胞菌的噬菌体。在这里，本发明人此前已分离用于噬菌体分离的铜绿假单胞菌，并将其鉴定为铜绿假单胞菌。
在下文中详细地描述了用于分离噬菌体的程序。将收集的样品添加至TSB(胰蛋白酶大豆培养液)培养基(酪蛋白消化物，17g/L；大豆消化物，3g/L；葡萄糖，2.5g/L；NaCl，5g/L；磷酸氢二钾，2.5g/L)中，以1/1000的比率接种铜绿假单胞菌，然后在37℃下振荡培养3至4小时。在培养完成后，以8,000rpm进行离心20min，并回收上清液。以1/1000的比率用铜绿假单胞菌接种所回收的上清液，然后在37℃下振荡培养3至4小时。当样品含有噬菌体时，重复上述程序5次，以充分增加噬菌体的数量(滴定度)。在重复所述程序5次后，将培养液以8,000rpm离心20min。在离心后，使用0.45μm过滤器来过滤所回收的上清液。将所得的滤液用于典型点板测定，以检查其中是否包含能够杀死铜绿假单胞菌的噬菌体。
如下所述进行点板测定：以1/1000的比率用铜绿假单胞菌接种TSB培养基，然后在37℃下振荡培养过夜。将3ml(OD600为1.5)上述制备的铜绿假单胞菌培养液涂布于TSA(胰蛋白酶大豆琼脂)平板培养基(酪蛋白消化物，15g/L；大豆消化物，5g/L；NaCl，5g/L；琼脂，15g/L)上。将涂布的平板放置于干净的工作台上30min，从而使涂布的溶液干燥。在干燥后，将10μl所制备的滤液点在铜绿假单胞菌涂布的平板培养基上，然后放置使其干燥约30min。在干燥后，将经过点板的平板培养基在37℃不振荡的情况下培养一天，然后检查滴加滤液位置处的亮区形成。就产生亮区的滤液而言，可以判断其中包含能够杀死铜绿假单胞菌的噬菌体。通过上述检查，可以获得含有具有杀死铜绿假单胞菌能力的噬菌体的滤液。
从上述确认具有能够杀死铜绿假单胞菌的噬菌体的滤液分离纯噬菌体。使用常规噬菌斑测定来分离纯噬菌体。详细地讲，使用灭菌吸头来回收在噬菌斑测定过程中形成的噬菌斑，然后将所述噬菌斑添加至铜绿假单胞菌的培养液中，然后在37℃下培养4至5小时。在培养后，以8,000rpm进行离心20min以获得上清液。将铜绿假单胞菌培养液以1/50的体积比添加至所得的上清液，然后在37℃下培养4至5小时。为了增加噬菌体的数量，重复上述程序至少5次。然后，以8,000rpm进行离心20min，以获得最终上清液。使用所得的上清液进一步进行噬菌斑测定。通常，纯噬菌体的分离不是通过程序的一次重复完成的，所以使用上述形成的所得噬菌斑来重复上述程序。在重复该程序至少5次之后，获得含有纯噬菌体的溶液。完全重复用于分离纯噬菌体的程序，直到所产生的噬菌斑在大小和形态方面变得彼此类似。此外，使用电子显微镜检查来确认纯噬菌体的最终分离。重复上述程序直到使用电子显微镜检查确认纯噬菌体的分离。根据常规方法来进行电子显微镜检查。简而言之，将含有纯噬菌体的溶液添加到铜载网上，然后用2％乙酸铀酰进行负染色并干燥。然后使用透射电子显微镜来观察纯噬菌体的形态。所分离的纯噬菌体的电子显微照片如图1所示。根据纯噬菌体的形态特征，确认上述分离的新型噬菌体为短尾病毒科噬菌体。
使用上述确认的含有纯噬菌体的溶液来进行以下纯化过程。将铜绿假单胞菌培养液以基于噬菌体溶液的总体积计1/50的体积比添加至含有纯噬菌体的溶液，然后进一步培养4至5小时。在培养后，以8,000rpm进行离心20min以获得上清液。重复该程序总共5次以获得含有足够数量的噬菌体的溶液。使用0.45μm过滤器来过滤从最终离心步骤获得的上清液，然后进行常规聚乙二醇(PEG)沉淀过程。具体而言，将PEG和NaCl添加至100ml滤液中直到达到10％PEG8000/0.5MNaCl，然后将所述滤液放置在4℃下2至3小时。其后，以8,000rpm进行离心30min，以获得噬菌体沉淀物。将所得的噬菌体沉淀物悬浮于5ml缓冲液(10mMTris-HCl，10mM MgSO4，0.1％明胶，pH8.0)中。所得的材料可以称为噬菌体悬浮液或噬菌体溶液。
结果，收集上述纯化的纯噬菌体，将其命名为噬菌体Pse-AEP-3，并在2016年11月29日保藏于韩国生物科学与生物技术研究所(Korea Research Institute of Bioscienceand Biotechnology)的韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for TypeCultures)(登录号：KCTC 13165BP)。
实施例2：噬菌体Pse-AEP-3基因组的分离和序列分析
如下所述分别噬菌体Pse-AEP-3的基因组。使用与实施例1中相同的方法从所获得的噬菌体悬浮液分离基因组。首先，为了除去悬浮液中包含的铜绿假单胞菌的DNA和RNA，将200U DNA酶I和RNA酶A中的每者添加至10ml噬菌体悬浮液中，然后放置在37℃下30min。在放置30min之后，为了终止DNA酶I和RNA酶A活性，将500μl0.5M乙二胺四乙酸(EDTA)添加至其中，然后将所得的混合物放置10min。此外，将所得的混合物进一步放置在65℃下10min，然后将100μl蛋白酶K(20mg/ml)添加至其中，以破坏噬菌体的外壁，然后在37℃下反应20min。其后，将500μl 10％十二烷基硫酸钠(SDS)添加至其中，然后在65℃下反应1小时。在反应1小时之后，将10ml苯酚:氯仿:异戊醇(以25:24:1的组分比混合)的溶液添加至反应溶液中，然后充分混合。此外，将所得的混合物以13,000rpm进行离心15min，从而分离各层。在分离的层中，选择上层，将异丙醇以1.5的体积比添加至其中，然后以13,000rpm离心10min以沉淀基因组。在回收沉淀物之后，将70％乙醇添加至沉淀物中，然后以13,000rpm离心10min以洗涤沉淀物。回收经洗涤的沉淀物，将其真空干燥，然后溶解于100μl水中。重复该程序从而获得大量噬菌体Pse-AEP-3的基因组。
通过进行下一代测序分析来确保关于上述获得的噬菌体Pse-AEP-3的基因组序列的信息，所述下一代测序使用首尔大学(Seoul National University)的韩国国家环境管理仪器中心(National Instrumentation Center for Environmental Management)提供的Pac-bio设备进行。最终分析的噬菌体Pse-AEP-3的基因组的大小为45,213bp，全基因组序列以SEQ ID NO:1表示。
使用基于网页的BLAST来研究上述获得的噬菌体Pse-AEP-3基因组序列与此前报道的噬菌体基因组序列的同源性(相似性)。根据BLAST研究的结果，发现噬菌体Pse-AEP-3的基因组序列与铜绿假单胞菌噬菌体PaP4的序列(GenBank登录号：KC294142.1)具有相对较高的同源性(同一性：93％)。然而，噬菌体Pse-AEP-3具有环状基因组，铜绿假单胞菌噬菌体PaP4具有线性基因组，因此它们之间的基因组拓扑结构存在显著差异，并且噬菌体Pse-AEP-3基因组上的开放阅读框(ORF)的数量为69，而与噬菌体Pse-AEP-3不同的是铜绿假单胞菌噬菌体PaP4具有70个开放阅读框。
所以，可以得出以下结论：噬菌体Pse-AEP-3是不同于常规报道的噬菌体的新型噬菌体。此外，由于噬菌体的抗细菌强度和抗细菌谱通常取决于噬菌体的类型，因此认为噬菌体Pse-AEP-3可以提供不同于此前报道的任何其他噬菌体的抗细菌活性。
实施例3：噬菌体Pse-AEP-3杀死铜绿假单胞菌的能力研究
研究了所分离的噬菌体Pse-AEP-3杀死铜绿假单胞菌的能力。为了评估杀死能力，使用结合实施例1描述的以相同方式进行的点板测定来观察亮区的形成。将总共10个株系(包括由本发明人分离和鉴定为铜绿假单胞菌的9个株系和从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)获得的1个株系(铜绿假单胞菌ATCC 15692))作为用于杀死能力研究的铜绿假单胞菌。噬菌体Pse-AEP-3具有杀死10个铜绿假单胞菌株系(即，实验目标)中的总共9个株系(包含从ATCC获得的1个株系)的能力。所述噬菌体的代表性实验结果如图2所示。同时，还测量了噬菌体Pse-AEP-3杀死金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、多杀性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的能力。因此，发现噬菌体Pse-AEP-3不具有杀死这些微生物的能力。
所以，可以得出以下结论：噬菌体Pse-AEP-3具有高水平的杀死铜绿假单胞菌的能力和针对多种铜绿假单胞菌的抗细菌效果，这表明噬菌体Pse-AEP-3可以用作用于预防和治疗铜绿假单胞菌感染的组合物的活性成分。
实施例4：使用噬菌体Pse-AEP-3来预防铜绿假单胞菌感染的实验
将100μl噬菌体Pse-AEP-3溶液以1×109pfu/ml的水平添加至含有9ml TSB培养基的管中。向另一个含有9ml TSB培养基的管，仅另外添加相同量的TSB培养基。然后将铜绿假单胞菌培养液添加至每个管，以使得600nm下的吸光度达到约0.5。在添加铜绿假单胞菌之后，将管放置于37℃的培养箱中，然后振荡培养，在此期间观察铜绿假单胞菌的生长。如下表1所示，观察到在添加了噬菌体Pse-AEP-3溶液的管中，铜绿假单胞菌的生长受到抑制，而在未添加所述噬菌体溶液的管中，铜绿假单胞菌的生长不受抑制。
[表1]
铜绿假单胞菌的生长抑制
上述结果显示，本发明的噬菌体Pse-AEP-3不仅抑制铜绿假单胞菌的生长，而且还具有杀死铜绿假单胞菌的能力。所以，可以得出以下结论：噬菌体Pse-AEP-3可以用作用于预防铜绿假单胞菌感染的组合物的活性成分。
实施例5：使用噬菌体Pse-AEP-3来治疗铜绿假单胞菌导致的感染性疾病1
评估了噬菌体Pse-AEP-3对铜绿假单胞菌感染的动物的治疗效果。准备2组2日龄小鸡(每组40只)，分别饲养，实验进行14天。从实验开始之后的第五天起3天内，以典型的喂养方式供应含有1×107cfu/g铜绿假单胞菌的饲料。从用含有铜绿假单胞菌的饲料喂养的最后一天起，在两组的粪便中发现铜绿假单胞菌。从供应包含铜绿假单胞菌的饲料之后的第二天起3天内，在实验组(施用噬菌体)中用含有1×108pfu/g噬菌体Pse-AEP-3的饲料以典型的喂养方式喂养小鸡。相比之下，在对照组(不施用噬菌体)中用具有相同组成但是不包含噬菌体Pse-AEP-3的饲料以相同的方式喂养小鸡。从实验开始之后的第九天起，测量实验动物的粪便中铜绿假单胞菌的数量。在本实施例中，在铜绿假单胞菌数量的测量中，将铜绿假单胞菌选择性培养基(假单胞菌属(Pseudomonas)十六烷基三甲基溴化铵琼脂平板；Oxoid)用于防止其他污染细菌的干扰。将样品涂布于选择性培养基上，并在37℃下培养18至24小时。从选择性培养基分离推断为铜绿假单胞菌的菌落，其后通过聚合酶链式反应(PCR)来鉴定铜绿假单胞菌(通过PCR鉴定为铜绿假单胞菌的菌落的数量为102cfu/ml或更多的情况＝2，通过PCR鉴定为铜绿假单胞菌的菌落的数量为101～102cfu/ml的情况＝1，通过PCR鉴定为铜绿假单胞菌的菌落的数量为100～101cfu/ml的情况＝0)。结果如下表2所示。
[表2]
铜绿假单胞菌的数量测量结果(平均值)
| 天 | D9 | D10 | D11 | D12 | D13 | D14 |
| 对照组(不施用噬菌体) | 1.1 | 1.0 | 1.2 | 1.2 | 1.1 | 1.3 |
| 实验组(施用噬菌体) | 0.2 | 0.2 | 0.1 | 0 | 0 | 0 |
从上述结果看出，可以得出以下结论：本发明的噬菌体Pse-AEP-3在铜绿假单胞菌导致的疾病的治疗中非常有效。
实施例6：使用噬菌体Pse-AEP-3来治疗铜绿假单胞菌导致的感染性疾病2
如下所述评估了噬菌体Pse-AEP-3对铜绿假单胞菌导致的疾病的治疗效果。将40只8周龄小鼠分为总共2组，每组20只小鼠，其后分别在单独的实验小鼠笼中饲养小鼠的子组(每个子组5只)，实验进行7天。在实验的第二天，通过腹膜内注射将0.1ml铜绿假单胞菌悬浮液施用于全部小鼠。如下所述制备施用的铜绿假单胞菌悬浮液。具体而言，在37℃下在TSB培养基中培养铜绿假单胞菌18小时，仅回收细胞，并且将所回收的细胞以5×109cfu/ml的浓度悬浮于盐水(pH7.2)中。在施用铜绿假单胞菌2小时后，在实验组(施用噬菌体溶液)中通过腹膜内注射至小鼠来施用109pfu的噬菌体Pse-AEP-3。在对照组(不施用噬菌体溶液)中通过腹膜内注射至小鼠来施用0.1ml盐水。对照组和实验组二者都用等同的饲料和饮用水来喂养。从铜绿假单胞菌的施用开始直到测试结束，每日观察小鼠是否存活。结果如下表3所示。
[表3]
存活率的测量结果(％)
| 细菌施用后的天数 | D0 | D1 | D2 | D3 | D4 | D5 |
| 对照组(不施用噬菌体溶液) | 100 | 75 | 35 | 10 | 10 | 10 |
| 实验组(通过腹膜内注射来施用噬菌体溶液) | 100 | 95 | 95 | 95 | 95 | 95 |
从上述结果看出，可以得出以下结论：本发明的噬菌体Pse-AEP-3在铜绿假单胞菌导致的感染性疾病的治疗中非常有效。
虽然已经参考本发明的示例性实施方案具体示出并描述了本发明，但是本领域的技术人员将理解，具体描述仅仅是优选的实施方案，并且本发明的范围不限于此。因此，本发明的范围旨在由所附权利要求及其等同物限定。
【登录号】
保藏单位名称：KCTC
登录号：KCTC 13165BP
登录日期：20161129
国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约国际表单
原始保藏情况下的收据
依照细则7.1出具
保藏方名称：尹特荣生物科技株式会社
地址：韩国京畿道城南市中院区沙器膜谷路137号中央工业大厦V 903(JoongangInduspia V 903,137Sagimakgol-ro,Joongwon-gu,Seongnam,Kyeonggi-do,Republic ofKorea)(13202)
序列表
<110> 尹特荣生物科技株式会社
<120> 新型铜绿假单胞菌噬菌体Pse-AEP-3及其用于抑制铜绿假单胞菌的增殖的用途
<130> KP090505
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45213
<212> DNA
<213> Pseudomonas aeruginosa bacteriophage Pse-AEP-3
<400> 1
tgatgacccg acgttgtagc caggtctaac ccaacgggcc ctgtcgggcc ccgttgtttc 60
tccgtaggga ctacatcatt agccatccaa ctgactttgc aattgacgaa gaccttgggc 120
tctttatccg aggataccga gaatcctgta cagcactcct agtccgtcac gcaagagcgc 180
cactctgtca acagataacc gaaaggataa tatgcgcaag gtagcaagta gtacaccccc 240
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tcccaaccaa ggtaatcgct aagtctatcg tgactggagc taaggccctg gcagagaaga 1140
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gttggtctcg ggctgcccaa gaggtgaccc ctgcggctga agctacgggt cgtggtgccc 6300
tgggccgtat cgcaggtatc ctcggtggac cggtatccgt tggcatccaa gcggctgtaa 6360
ccccaggaga acttggggat gcagagcgta ctcgtgcaga agaaatagct caggctagtc 6420
aggctgtgga gaatatgggg cctgaggttg ctcaagaggc aaaccaatgg gcccagggtg 6480
taggccaacg tgcagcccag aacgccacag ggggccctac gggggctgaa ctcctgtcct 6540
atggggtaac ccctaaccaa ccctctatcg agcctgagat caccccagag gtggcttccg 6600
aggctggtgc tgctgtagca gatgaggagg aggctaatcg ccaggtcatc caacagggtg 6660
cagctgaagg tcttcgtact ggtgctgtaa gtcgtcctga aatggcccag gctgtagttg 6720
aagctgatgc ccagagagag ggtgtagagc ttaaacccca agagcttaag aaccgggtga 6780
acgaagagtt gacccagatg aggactatgg acaatgatga tctgtctcgt tatgtatctt 6840
acgctctcat tggtactggt cttctggctt cggccctaga caagactggt aaagccgggg 6900
atatgttcgc tgcttcctac gagcgtcagc tggatcgtaa cctacaggct gggatcaacc 6960
agcagaagat ggctgccgca gctgctgatc gtcagatcaa ggaaaaggat ctggagcgta 7020
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gaacccttaa ggaaacctct cgtaagaaca ctggtcttct ggataggtgg actgaggagg 7140
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gggcccagct acaggctgaa acaacccgtc gtggccagga tatgtctcaa gagaatgccc 7260
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gacctatagg ctcttaagat tccttcttcc ttttgactta cttactaaga aggttagtat 7680
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tttctccaga actgaaggcc gctattgatg cggaactggc tgaggtcaag ggcctcgacg 7800
tagccgctga attggcttcc ttgaatgagc cagaggttat cgaagaggca ccccaggaag 7860
tagctccagc tacccctgag cctgccccag acctgagtgc cctagtaact ccggctgacc 7920
ctaattctat tagctctgcg attggtcgcg gggttgatac catgcagtct aacatcggtg 7980
gtaccattgc tactctcggt gagttgactg gcagtgacta cctgaaagac tacggcacac 8040
agatggccga agagaatgct caggaagcgt cacagtacgg aacccccgat gttaggtcct 8100
tcgctgatat ccaagatatc ccatccatcg gttcgttcct caagaataac atcgtagagg 8160
cactcccctc gatggctcct gtcctggctg gtggtgcagc aggggctaag gctggctctg 8220
tatttggagc cccaggtcgt atgggtggtg ccctcattgg ttccttccta agctccatgg 8280
gtatcaacgt gggtgccctg agcaaccaga tgaaggagct agaccccgac caaagcaacc 8340
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agtccggtct acccaagcag actgctattg aagctgttac ccaagctggt aaacacgctg 8520
tagtctctgg tgtggctgaa ggtgttacct ctggtgccca gcaggccctc caggacacta 8580
tcgcgtatga tgccgttggg cagacccaat cccctgagca gttcatggat aacctcctga 8640
cggctgcatt cactggtact gctatgggta ctgccggtgg tgctgtatcc tcggggatgg 8700
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gtgagttctc tgagaccttc cgtgctgata tgagtggtaa gcgggcctct ggtaagacta 8940
tctttgagga ccaggaacta caggcaggta agtggaactc tgaactagat aacatctttg 9000
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aggctaacgc taagattgct tctgctgtag ctgaggctca acgggctggt aagagagtca 9660
ctaaggaaga agtggatcgg atgtatgacc tagtggatgc ctataatggt atgcacggtc 9720
gtatcaaaga tcctaacctt aagaagctag cggctgttac gtcgggtgcc ctcgtgctct 9780
ccagacttcc cctcgccggc ttctcgaccc taaccgagtt cagcctacca ttcgctaagg 9840
ctggggttat gcctaccctt ggggctgtac tcccaaccat gggtgaggta gtaaggcaag 9900
cagcccgcag gatctacagt ggggttccaa agtctgagac cggtcggttt atgagtgata 9960
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ttaactctac catccaaaag gcgatccgtg gtcagttcct catcaacggc ttgtccatcc 10080
taacccatgt taaccgagtc tttgcaacag agactgctaa gcgggtctat cagaacaacc 10140
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agtcttccga cgtaatgccg atggtgatct cattgagatt acctcggatg ccggtcgggt 11040
aaatactaac atcgttaccg ctacagagtt cctccctgac tattatgcag ttaaggagaa 11100
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tttcggtggt accgtgggta ccttcaaatc ggcagtttaa taggagttag attatggcag 11820
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aggcactcgt ggataagttc aatacactac tgaacgctct ccggagctaa agataaggcc 12180
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cgctgtcgta cttcgtccca atcaatgact tcagtttggg tctgaagaat ctcccctgct 14400
ttgccaatga gccctccttc ttgaagcttc cagataaccg agagtgtccc ttcagtcagg 14460
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tacttcagtt tgatacgttg gatatgagag acaacctttt caacttggtt gtcagttagg 14580
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atacattctc caagaagcgg agactcttcc aagaccatca acttgaaacg gtcccaactc 15540
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ccggagcagc ttagagttca atcccaggag gaatacctgg aagaatgcac tccagaagat 20040
gacaaggact tgtagagcta ttgacatgac tcgcatacct cgggatctag gccacaggca 20100
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ggctttgcta cagacacgct gaaagaagta ttggtcatgg cgtcacctta ctgaacccga 34260
tgaacgatgt ggtccaccgg gatgccgagt tcgaagaagg tttcggtgat gaactgcccg 34320
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ttgagcgtcc accgggatga cctcgcagtc gctatggatg ctgcaaatga taccagcctc 34620
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gccgacttgt tcttgtccga ctgagccttg atcttgccgt gatcgatgaa ccacgaggcc 36000
agagcgttgc ggcgggagcc cttgggcatg gccttgaaca gcttgcatgc caacgagact 36060
tcaccatgct cgtcgatgtg cttgagaatg tccaggccgg tagtttgaat cagcttgtcc 36120
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caattggaaa tgatcccgaa cttctgttct gcccgctgct gagctttgcc aaggtgccca 36420
atgttaatac cttgagcacg agccttgcgg ctagccttgc ggcgcagctt cttatcgata 36480
gcagcgttca tcgtttcatc cttttggaat catcagccgg gacacgcatc ccgatacgat 36540
aaaggggtta gtcggcaaac cttggcattg gcgtagccgg cccctttccg cgttagtatc 36600
gctgttatgg tctgtcctct ggctatcctc gggggtcttc gtgtctactc gcccctacct 36660
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tttacggggt tgtctactgg tttttcatac agtctaagga ctatcagtcc cccagcaaac 37380
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tgcgccgtat cctgtacgtg ggcgactaca tcatcagcaa cgagccttgg gattgccgtc 41880
ccttcgctga cctgaatgcc tatcgaattg cccataagtt ccacgggatg agtgtctacg 41940
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ccctgcgtgt aaacaacgag aagtccggtg ctc 45213
Claims (3)
1.一种从自然界分离的短尾病毒科噬菌体Pse-AEP-3，其保藏编号为KCTC13165BP，所述短尾病毒科噬菌体Pse-AEP-3具有特异性杀死铜绿假单胞菌的能力，并且具有如SEQ IDNO:1所示的基因组。
2.一种用于预防或治疗铜绿假单胞菌导致的疾病的组合物，所述组合物包含如权利要求1所述的噬菌体Pse-AEP-3作为活性成分。
3.如权利要求2所述的用于预防或治疗铜绿假单胞菌导致的疾病的组合物，所述组合物用于制备杀菌剂和抗生素。
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