KR101237233B1 - 녹농균 및 황색포도상구균을 사멸시키는 박테리오파지 - Google Patents

Abstract

본 발명은 녹농균 및 황색포도상구균을 사멸시키는 박테리오파지에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 녹농균, 황색포도상구균, 표피포도상구균, 스타필로코커스 호모니스, 이질균, 리스테리아균 및 연쇄상폐렴구균으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 균주에 대한 사멸능을 갖고, 서열번호 1로 표시되는 전장 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 시포비리대 과의 박테리오파지 PA1Ø에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 상기 박테리오파지 PA1Ø을 이용하여 상기 균주들을 효과적으로 사멸시키거나 감소시킬 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 균주들에 의해 생성된 균막을 제거하는데도 유용하게 사용될 수 있다. 특히 박테리오파지는 세균을 숙주로 하는 바이러스로 사람과 동물 등에는 전혀 작용하지 않는 것으로 알려져 있기 때문에 의약산업, 식품산업, 생명공학 등에 응용이 가능할 뿐 아니라, 항생제 내성에 대한 문제점 없이 유해 세균을 목표장소 또는 목표물질에서 효과적으로 사멸시킬 수 있다.

Description

녹농균 및 황색포도상구균을 사멸시키는 박테리오파지 {A bacteriophage killing Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus}

본 발명은 녹농균 및 황색포도상구균을 사멸시키는 박테리오파지에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 녹농균 및 황색포도상구균에 대한 사멸능을 갖고 서열번호 1로 표시되는 전장 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 시포비리대 과(Siphoviridae)의 박테리오파지(Bacteriophage) PA1Ø에 관한 것이다.

녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 사람을 포함하여 동물에서도 질병을 일으키는 흔한 그람음성 간균이다. 녹농균은 토양, 습지, 사람의 피부 등 다양한 환경에서도 흔히 존재한다. 면역저하 환자에서는 흔히 염증과 패혈증을 일으키는 기회감염세균이다. 현재 병원감염을 일으키는 주요 세균으로 알려져 있으며 외국에서는 낭포성 섬유증(cystic fibrosis) 환자의 유병률이 높은데 이들 환자에게서 녹농균의 감염은 매우 치명적이다.

또 하나의 병원감염세균으로 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)이 있는데 정상인이나 환경에서도 쉽게 발견되는 상재세균이다. 이 세균은 상처나 면역저하 환자, 그리고 외과적 치료부위에 오염된 의료기구 등을 통하여 감염하여 항균제로 치료하기 어려운 내성을 가지고 화농성 질환을 일으킨다. 균의 특성상 의료기구나 비생물체의 표면에 고착하여 오랫동안 생존하고 있기 때문에 일반적인 세제나 알코올류로 완전히 제거가 어렵다. 이를 세균의 균막형성이라 하며 균막형성 시 치료가 더욱 어렵고 항균제에도 보다 높은 저항성을 나타낸다. 인체 감염 시 균막은 인체의 면역체계에 저항하며, 항균물질에 대한 저항성이 부유상태의 500배에서 1000배 이상 증가하는 것으로 나타나 항균치료만으로는 효과적인 치료를 기대하기 힘들다. 뿐만 아니라 항균제 내성균의 출현 및 확산 문제가 매우 심각해서 현재까지 개발되어 사용되고 있는 거의 모든 종류의 항균치료제에 내성을 나타내는 슈퍼박테리아까지 출현하여, 항균제 이외의 대체치료제의 개발이 시급하고 절실하게 요구되고 있다.

박테리오파지(Bacteriophage)는 세균에 특이적으로 감염하고 용균을 일으키는 바이러스로 1915년 최초발견 이후 지금까지 다양한 세균성 질병의 치료를 위해 연구되어 왔으며, 80년 전 파지 발견자인 Felix d'Herelle는 최초로 파지를 감염질환의 치료 목적으로 사용하였다.

박테리오파지를 이용한 연구는 과거부터 지금까지 그루지아, 폴란드와 구소련에서는 꾸준히 치료 연구가 진행되고 있으며, 실제 병원성 미생물에 대한 치료에도 사용되고 있다. 1994년, 위절제술 후에 재발한 횡경막 종양에 감염된 내성 대장균에 박테리오파지를 처리하여 깨끗하게 치료하였다. 1995년, 급성 만성 비뇨기염증환자 46명에게 박테리오파지를 처리하여 92%가 임상적으로 회복되었고, 84%가 병원성 미생물을 완벽히 제거하였다. 1999년, 신생아의 수막염을 일으키는 균인 Klebsiella pueumoniae에 항생제 처리가 실패하여 구강주입을 통해 박테리오파지를 처리하여 치료에 성공하였다. 2001년, 20명의 난치 종양환자에게 2~9주 동안 하루에 3번 구강으로 박테리오파지를 주입하여 치료에 성공하였다. 2001년, 54명의 환자들의 화상부위에 감염균의 수에 1.5~2배의 파지를 처리하여 Staphylococcus, Streptococcus, Proteus 등에 대한 감염으로부터 보호하였다. 2002년, 박테리오파지와 생물분해성 혼합물을 상처와 종양에 처리하여 환자 96명중 67명이 회복되었다.

최근 종 선택성에 대한 광범위 효과를 발휘하는 박테리오파지에 대한 탐색과 살균효과의 전달에 대한 약물동력학적 연구가 진행됨에 따라 점차 그 활용가능성이 높아지고 있고 외국의 경우 활발한 관련연구가 진행되고 있지만 국내에서는 파지 관련연구가 시작단계에 불과하다.

세계적인 학술지인 Nature review와 Nature biotechnology에서는 박테리오파지를 이용한 치료에 대하여 소개하면서 치료용 박테리오파지의 선별 방법과 치료방법들에 대하여 자세하게 보고 하였으며, 게놈 유전자의 산물을 이용하여 감염세균의 성장을 억제하는 방법을 소개하였다.

2007년, 미국 식품의약품안전청(FDA)이 당뇨병성 발 괴사의 세균감염 치료를 위한 파지 사용 1단계 임상실험을 승인하여 파지를 이용한 동물의 감염질환 치료 뿐 아니라 사람에게도 치료목적으로 사용할 수 있는 길이 열렸다. 2008년, FDA는 살모넬라 특이적 박테리오파지를 이용하여 닭고기 처리과정 중에 살모넬라 오염을 저감하는 방법을 승인하였다. 감염질환의 치료를 위하여 파지 자체를 개발하는 것 뿐 아니라 파지가 가지고 있는 살균 인자(bactericidal factor)를 탐색하여 응용하는 것이 필요하다. 감염질환의 경제적 효과와 보건의료기술 향상에 큰 영향을 줄 것으로 기대되어 국가적 연구지원을 통한 관련기술 및 연구기반 향상이 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 감염질환의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 환경으로부터 분리된 박테리오파지 PA1Ø이 녹농균 및 황색포도상구균을 효과적으로 사멸시키고 이들에 의해 생성되는 균막을 효과적으로 제거함을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 녹농균 및 황색포도상구균에 대한 사멸능을 갖는 박테리오파지(Bacteriophage) PA1Ø을 갖는 박테리오파지 PA1Ø을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 박테리오파지 PA1Ø을 유효성분으로 함유하고, 상기 균주들에 의해 유발되는 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 박테리오파지 PA1Ø을 포함하는 항생제 및 소독제를 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 녹농균 및 황색포도상구균에 대한 사멸능을 갖고, 서열번호 1로 표시되는 전장 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 시포비리대 과(Siphoviridae)의 박테리오파지(Bacteriophage) PA1Ø을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 박테리오파지 PA1Ø은 본 발명에서 처음으로 분리 동정된 것으로서, 그 유전체의 서열 또한 본 발명자에 의해 처음으로 밝혀졌다. 본 발명자들은 분리된 박테리오파지 PA1Ø의 전장 유전체를 분리하고 이를 시퀀싱함으로써 파지의 유전체가 34,553 bp 크기인 이중 가닥 DNA이며 51개의 단백질 암호와 부위(open reading frame, ORF)를 가짐을 확인하였다 (도 5 참조). 또한 본 발명에서 분리된 박테리오파지 PA1Ø은 상기 녹농균 및 황색포도상구균에 대하여 탁월한 사멸능을 가짐을 확인하였다 (표 1, 및 도 2 내지 도 4 참조).

본 발명에 있어서, 상기 박테리오파지는 기탁번호 KCTC 11796BP인 것을 특징으로 한다. 본 발명자들은 환경으로부터 녹농균, 포도상구균 등에 대하여 사멸능을 가지고 있는 신규한 박테리오파지를 선별하였고, 분리된 박테리오파지를 한국 생명공학연구원의 유전자은행에 2010년 10월 26일자로 기탁하였다.

본 발명에 있어서, 상기 박테리오파지는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 표피포도상구균(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 호모니스(Staphylococcus homonis), 이질균(Shigella sonnei), 리스테리아균(Listeria monocytogenes) 및 연쇄상폐렴구균(Streptococcus pneumonia)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 균주에 대한 사멸능을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실시예에서는, 박테리오파지 PA1이 상기 균주들에 대하여 탁월한 사멸능을 가짐을 확인하였다 (표 1, 및 도 2 내지 도 4 참조).

따라서 본 발명에 따른 박테리오파지 PA1Ø은 의학 산업, 식품 산업, 생명공학 산업 등에 응용하여 항균제 내성에 대한 문제점 없이 유해한 병원성 균주들, 예컨대 녹농균, 황색포도상구균, 표피포도상구균, 스타필로코커스 호모니스, 이질균, 리스테리아균 및 연쇄상폐렴구균을 효과적으로 사멸시킬 수 있으므로, 이들 균주들에 대한 항균 용도로서 광범위하게 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 박테리오파지는 상기와 같은 여러 균주들에 대하여 높은 사멸능을 보일 뿐만 아니라, 녹농균, 황색포도상구균, 표피포도상구균 또는 스타필로코커스 호모니스에 의해 생성된 균막을 제거하는데도 사용될 수 있다. 균막 형성균의 경우, 기존의 항균제에도 보다 높은 저항성을 나타내는데, 인체 감염 시 균막은 부유상태일 때와 비교하여 500배에서 1000배 이상 항균제 저항성이 증가하는 것으로 나타나 항균치료만으로는 효과적인 치료를 기대하기 힘들다. 따라서 본원발명의 박테리오파지 PA1Ø은 이들 균막 형성균의 균막 제거에도 효과가 있으므로, 항균제 내성을 갖는 균막 형성균의 제거를 위한 용도로서 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 박테리오파지 PA1Ø을 유효성분으로 포함하는, 녹농균, 황색포도상구균, 표피포도상구균, 스타필로코커스 호모니스, 이질균, 리스테리아균 및 연쇄상폐렴구균으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 균주에 의해 유발되는 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 박테리오파지는 일반 항균제보다 내성세균 출현의 문제가 적고, 세균에만 용균작용을 나타낼 뿐 진핵세포에는 작용하지 않는 선택적 독성이 우수하므로 인체와 동물에 무해하기 때문에 감염병 치료에 이용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 ‘치료’라는 용어는 녹농균, 황색포도상구균, 표피포도상구균, 스타필로코커스 호모니스, 이질균, 리스테리아균 및 연쇄상폐렴구균에 의해 유발된 질환의 예방; 상기 균주들에 의해 유발된 질환의 억제; 및 상기 균주들에 의해 유발된 질환의 경감을 의미한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 박테리오파지는 상술한 바와 같이 녹농균, 황색포도상구균, 표피포도상구균, 스타필로코커스 호모니스, 이질균, 리스테리아균 및 연쇄상폐렴구균을 사멸시킬 수 있으므로, 이들 균주에 의해 유발되거나 균막 형성으로 인해 만성화된 다양한 질환, 예컨대 유방염, 피부염, 패혈증, 화농성 질환, 식중독, 폐렴, 골수염, 농가진, 균혈증, 심내막염, 및 장염 등에 대한 치료에 효과를 나타낸다. 이러한 목적의 조성물에는 추가적 치료의 효과를 얻기 위하여 이미 이들 균주에 대해 항균 활성이 입증된 성분이 추가로 포함될 수 있다.

본 발명에 적용될 수 있는 상기 병원성 균주들에 대해 항균 활성이 입증된 성분으로는 메티실린, 옥사실린, 반코마이신 등이 있는데 이에 국한되지 않고 다양한 항생제가 적용될 수 있다.

또한 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 질환 부위에의 도포 또는 분무하는 방법으로 이용할 수 있으며, 그 밖에 경구 투여 또는 비경구 투여를 통해 투여할 수도 있으며, 비경구 투여의 경우 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 도포, 분무 및 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 1×10³ 내지 1×10¹⁰ pfu/㎖의 박테리오파지를 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 박테리오파지 PA1Ø을 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공한다. 바람직하게는 상기 항생제는 화장품용 항균제 또는 의약용 항생제일 수 있다.

본 발명의 박테리오파지 PA1Ø이 효과적인 사멸능을 나타내는 녹농균과 황색포도상구균은 고초균(Bacillus subtilis), 대장균 등과 함께 화장품에서 자주 발견되는 유해균이기도 하다. 화장품은 기름이나 물을 주성분으로 하며, 미생물의 탄소원이 되는 글리세린이나 솔비톨 등과 질소원이 되는 아미노산 유도체, 단백질 등이 배합된 것이 많으므로 세균 등의 미생물 침투가 용이하다. 또한, 식품에 비하여 사용기간이 매우 길기 때문에 미생물에 의한 오염 위험이 훨씬 크다고 할 수 있다. 사용함에 따른 미생물 오염으로 나타나는 변색이나 변취 등으로부터 화장품을 장기간 보호하기 위하여 항균제의 첨가가 필수적이다.

최근 화장품에 가장 널리 사용되고 있는 파라벤류와 같은 합성방부제는 그 위험성이 부각되고 있고, 합성 방부제 함유 화장품이 예상 외로 위험할 수도 있다고 인식되고 있다. 또한, 미국 피부과학회는 합성 방부제를 피부 알레르기 유발 원인물질 2위에 올려놓은 바도 있다. 이와 함께 최근에는 어린이용 제품에 대한 인공 합성 방부제의 사용은 어린 시절부터 방부제 함유제품을 사용하게 함으로써 방부제의 사용기간과 양을 성인에 비해 늘릴 수 있기 때문에 더욱 위험할 수 있다는 우려가 있어 새로운 천연유래의 방부제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

본 발명의 박테리오파지는 기존 항생제에 비하여 탁월한 녹농균 및 황색포도상구균의 사멸능을 갖고 이들 균주에 의해 형성된 균막의 제거능력이 있는 장점을 갖고 있다. 본 발명의 박테리오파지를 항생제로 이용하게 되면 기존의 항생제를 이용하는 것과는 달리 이들 균주의 내성 내지 저항성(resistance)을 유도하지 않는다는 중요한 장점을 갖기 때문에 기존의 항생물질에 비하여 제품수명(life cycling)이 긴 신규 항생제로서 제공될 수 있다. 대부분의 항생 물질들은 내성 증가에 직면함에 따라 갈수록 사용범위가 줄어들 수밖에 없는데 반해, 본 발명의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항생제는 항생제 내성 문제를 근본적으로 해결할 수 있기에 그 만큼 항생제로서의 제품수명이 길어질 것으로 기대된다.

따라서 녹농균 및 황색포도상구균을 사멸시키는 본 발명의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항생제는 항균 효과, 살균 효과 및 방부 효과가 뛰어난 항생제로서 유용하게 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 ‘항생제’라는 용어는 방부제, 살균제 및 항균제를 총칭한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 박테리오파지 PA1Ø을 유효성분으로 포함하는 소독제를 제공한다.

상술한 바와 같이, 녹농균, 황색포도상구균, 표피포도상구균, 스타필로코커스 호모니스, 이질균, 리스테리아균 및 연쇄상폐렴구균에 대해 효과적인 사멸능을 갖는 본 발명의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제는, 병원감염을 막기 위한 병원 및 보건용의 소독제로 유용하게 사용될 수 있고 또한, 일반 생활 소독제, 식품 및 조리 장소 및 설비의 소독제, 축산산업의 축사 소독제로서 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 소독제에 사용되는 박테리오파지는 자연 분해되므로 친환경적이고 액상으로 준비 가능하기 때문에 일반 환경 또는 의료 기구에 존재하는 상기 유해 세균을 제거하기 위한 소독제의 용도로서 매우 유용하다. 박테리오파지를 생산하는 비용 또한 항균제 개발과 생산보다 훨씬 경제적이기 때문에 보건산업에서의 박테리오파지의 효용성은 매우 크다고 할 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 녹농균, 황색포도상구균, 표피포도상구균, 스타필로코커스 호모니스, 이질균, 리스테리아균 및 연쇄상폐렴구균을 효과적으로 사멸시키는 것은 질병치료 및 예방 차원에서 매우 중요하다. 이러한 유해 균주들에 의해 유발되는 질환을 치료하거나 원인세균을 사멸시키기 위하여 인체 또는 가축 등에 화학적 항균제를 투여하고 식자재나 환경에는 물리화학적 요법으로 원인세균을 저감하기도 한다. 그러나 현재 항균제 남용으로 인한 내성 세균의 유행이 국민보건에 크게 위해요소가 되고 있으며 물리화학적 요법은 환경오염과 경제적 비용이 많이 든다는 단점이 있다. 본 발명의 박테리오파지 PA1Ø은 녹농균, 황색포도상구균, 표피포도상구균, 및 스타필로코커스 호모니스에 의해 생성된 균막의 제거에도 탁월한 효과를 나타낸다. 따라서 다양한 질병의 원인이 되는 이들 균주를 사멸하는 PA1Ø은 보건산업 뿐 아니라 식품, 친환경 대체항균제로 이용될 가치가 높다.

도 1은 본 발명에 따른 박테리오파지 PA1Ø의 전자현미경 사진이다.
도 2는 여러 가지 부유세균 종에 대한 박테리오파지 PA1Ø의 사멸능을 TTC를 이용한 흡광도법으로 측정한 값을 나타낸 그래프이다.
도 3은 여러 가지 균막형성 세균 종에 대한 박테리오파지 PA1Ø의 사멸능을 TTC를 이용한 흡광도법으로 측정한 값을 나타낸 그래프이다.
도 4는 P. aeruginosa PAO1 (A, E), S aureus ATCC 25923 (B, F), S. epidermidis KNUH-134 (C, G), 및 S. hominis KNUH-329　(D, H)의 24시간 동안 형성된 세균막의 주사전자현미경 사진(A-D), 및 이들을 각각 본 발명의 PA1Ø로 3시간 동안 처리한 후의 주사전자현미경 사진(E-H)이다.
도 5는 PA1Ø 전체게놈의 유전자 지도를 도형화한 것이다. 전체 51개의 유전자로 구성되었으며 검은 색 화살표들은 구조유전자, 붉은 색 화살표는 전사 및 윤저자 발현관련 유전자, 그리고 하얀 색 화살표는 이론적인 유전자들을 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. PA1Ø 파지의 생산 및 분리

파지 분리를 위하여 돼지, 소를 키우는 농장 근처의 오수를 채취하여 아래와 같이 분리하였다. 오수는 큰 입자들과 건더기들을 제거하기 위하여 6000 rpm으로 10분간 원심분리한 후, 상층액을 취하였다. 10x 의 LB 액체배지 4.5 ml에 생장기의 녹농균 (P. aeruginosa PAO1; ATCC 15692, 10⁸ cfu/ml) 0.1 ml을 첨가하고 위에서 얻은 오수 4.5 ml을 첨가하여 혼합하고 37℃에서 하룻밤 교반배양하였다. 그리고 클로로포름 200 μl를 넣어 혼합하고 4℃에서 2시간 정치배양하고 8000 rpm으로 10분간 원심분리 후 상층액을 0.45 μm 구멍크기의 필터로 걸렀다.

상기 용액에서 파지의 존재를 확인하기 위하여, 녹농균을 포함한 여러 가지 세균을 가지고 LB 고체배지에 균을 도말한 다음에 5분간 말리고 용액을 점적하여 다시 말린 후, 37℃ 배양기에 넣어 하룻밤 배양하였다 (Spot test). 용액이 떨어진 부위가 투명하게 보이는 것을 세균의 용혈이 일어난 것으로 판정하였다.

녹농균 특이적 파지의 순수분리를 위하여, 대수기로 증식한 녹농균 배양액과 파지 용액을 혼합하고 0.5% agar를 함유하는 top LB agar 10 ml과 혼합한 후 LB agar plate에 부어 잘 굳게 하였다. 37℃ 배양기에서 배양한 후 플라크(plaque) 형성 유무를 관찰하였다. 플라크가 형성된 것을 다시 같은 균을 이용하여 파지를 증폭하고 이러한 과정을 반복하여 파지를 순수분리 및 정제하였다. 이렇게 순수분리된 박테리오파지를 본 발명자들은 한국 생명공학연구원의 유전자은행(KCTC)에 기탁하고 (KCTC 11796BP), ‘박테리오파지 PA1Ø’이라고 명명하였다. Stock phage는 7% DMSO가 첨가된 SM 완충용액 (100 mM NaCl, 8.1 mM MgSO₄H₂O, 50 mM TrisHCl (pH 7.5), 0.01% gelatin)으로 용해하여 4℃에 보관하였다.

실시예 2. PA1Ø의 여러 가지 세균에 대한 숙주특이성 및 사멸능

실시예 1에서 얻은 순수 분리된 파지용액을 이용하여 영양배지에서 배양한 녹농균 등 여러 가지 세균들을 영양배지(Nutrient broth)에서 1시간 교반배양 후 평판영양배지(Nutrient agar plate)에 도말하고 PA1Ø 파지용액을 떨어뜨린 후 37℃ 배양기에서 18시간 동안 배양하여 세균용혈정도를 확인하였다. 각 세균에 대한 사멸능은 하기 표 1에 나타내었다.

상기 표 1에서, PA1Ø 파지는 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus), 리스테리아균 (Listeria monocytogenes)을 사멸시키는 결과를 보였다. 그러나 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 엔테로박터 에어로제네스 (Enterobacter aerogenes), 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), 및 대장균　(Escherichia coli)은 사멸시키지 못하였다. 이러한 결과는 PA1Ø 파지가 녹농균, 황색포도상구균, 리스테리아균을 효과적으로 저감할 수 있는 광범위 숙주 파괴 파지임을 증명한다.

실시예 3. 전자현미경을 이용한 PA1Ø의 형태관찰

파지의 모양을 관찰하기 위하여 주사전자현미경을 사용하였다. 약 10¹² pfu의 순수 분리된 파지를 탄소로 코팅된 구리판에 바른 후, 2%의 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 염색하고 주사전자현미경 (Philips EM 300)을 사용하여 관찰하였다.

관찰결과, 도 1에서 각이 진 머리(icosahedral head)와 긴 하나의 꼬리가 관찰되어 형태적 분류를 통해 시포비리데(Siphoviridae)에 속하는 것으로 판단하였다.

실시예 4. PA1Ø의 유전학적 특성

파지의 유전체는 Lambda midikit (Qiagen)를 사용하여 순수분리하였다. 분리된 파지 유전체는 전체유전자 염기서열 결정을 위하여 (주)마크로젠에 맡겼다. 전체 염기서열 결정은 shotgun 방법과 포스미드 라이브러리 제작, 그리고 자동화 염기서열기기 (ABI PRISM 377)에 의하여 수행되었다. 염기서열 분석결과에서 단백질 암호화 부위 (open reading frame, ORF)들은 Sequin 소프트웨어 버전 9.5를 사용하여 분석하였다. 분석결과, 파지의 유전체는 이중가닥 DNA로 크기가 약 34.5 kbp이고 (서열번호 1), 51개의 ORF로 구성되어 있었다 (도 5 참조). 전체 염기서열을 미국 NCBI의 BLAST 검색을 한 결과, 녹농균 특이 파지들인 MP29와 D3112에 각각 97% 및 90%의 유사도를 보이며, 이들 모두 시포비리데 (siphoviridae)에 속하는 파지들이다.

실시예 5. PA1Ø의 부유세균 사멸효과 및 균막 제거효과

PA1Ø의 부유세균 사멸효과 및 균막 제거 효과를 시험하기 위해 다음의 균주들을 이용하였다. Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Staphylococcus aureus WS-05, Staphylococcus aureus D43-a , Staphylococcus epidermidis KNUH-134, Staphylococcus epidermidis KNUH-174, Staphylococcus homonis KNUH-328, Staphylococcus hominis KNUH-329, Pseudomonas aeruginosa PAO1 (ATCC 15692), Pseudomonas aeruginosa GFP.

녹농균은 Trypton Soy Broth (TSB) 배지를 이용하여 배양하고 녹농균 이외의 세균은 0.25% 포도당이 첨가된 TSB를 이용하여 배양한 후, 부유세균을 얻었다. 이 세균액을 5×10⁷ CFU/ml 농도로 맞추고 0.1 ml을 취하여 96-well 마이크로플레이트에 분주한 후, 1 x 10¹¹ PFU/ml의 PA1Ø 파지용액에서 0.1 ml을 취하여 위 세균액에 처리하였다. 그리고 이를 37℃ 배양기에서 6시간 배양하고 0.1% triphenyltetrazolium chloride (TTC) 50 μl를 첨가한 후, 추가로 37℃ 배양기에서 1시간 배양하고 600 nm 파장의 빛으로 흡광도를 측정하여 살아있는 세균을 수치화하였다. 여기에서 TTC는 생존균의 지표 물질로서 기질로 첨가되어 이의 흡광도를 측정하는 기법이다.

도 2는 여러 가지 부유세균 종에 대한 박테리오파지 PA1Ø의 사멸능을 TTC를 이용한 흡광도법으로 측정한 값을 나타낸 그래프이다. Control은 파지를 처리하지 않은 대조군이며, Phage PA1Ø treated는 파지를 처리한 시험군이다. 1: S. aureus ATCC 25923, 2: S. aureus WS-05, 3: S. aureus D43-a , 4: S. epidermidis KNUH-134, 5: S. epidermidis KNUH-174, 6: S. homonis KNUH-328, 7: S. hominis KNUH-329, 8: P. aeruginosa PAO1, 9: P. aeruginosa GFP.

도 2에서, 시험에 사용된 모든 균주들은 본 발명의 PA1Ø 파지에 의해 모두 80% 이상 사멸되었다.

또한, 세균의 균막 형성을 위해, 세균액을 5×10⁷ CFU/ml 농도로 맞추고 0.1 ml을 취하여 96-well 마이크로플레이트에 분주한 후, 37℃ 배양기에서 24시간 배양하고 부유세균과 액체배지를 조심스럽게 제거하고 이를 무균대에서 말렸다. PA1Ø 파지용액 0.1 ml (1×10¹⁰ PFU)을 가하고 3시간 동안 처리 후 새로운 TSB 0.1 ml과 0.1% TTC 50 μl를 넣고 위와 같이 반응시킨 후, 흡광도를 측정하였다.

도 3은 여러 가지 균막형성 세균 종에 대한 박테리오파지 PA1Ø의 사멸능을 TTC를 이용한 흡광도법으로 측정한 값을 나타낸 그래프이다. Control은 파지를 처리하지 않은 대조군이며 Phage PA1Ø treated는 파지를 처리한 시험군이다. 1: S. aureus ATCC 25923, 2: S. aureus WS-05, 3: S. aureus D43-a , 4: S. epidermidis KNUH-134, 5: S. epidermidis KNUH-174, 6: S. homonis KNUH-328, 7: S. hominis KNUH-329, 8: P. aeruginosa PAO1, 9: P. aeruginosa GFP.

도 3에서, 시험에 사용된 모든 균막 형성 균주들이 효과적으로 사멸되었지만, 그 중에 S. hominis는 약 30%가 생존해 있어 가장 저항성이 강했으며 황색포도상구균의 균막 세균들은 95% 이상 사멸하여 가장 좋은 세균사멸효과를 보였다.

상기의 실험을 똑같이 재현하여 주사전자현미경을 이용하여 균막 제거 효과를 관찰하였다. 도 4는 P. aeruginosa PAO1 (A, E), S aureus ATCC 25923 (B, F), S. epidermidis KNUH-134 (C, G), 및 S. hominis KNUH-329　(D, H)의 24시간 동안 형성된 세균막의 주사전자현미경 사진(A-D), 및 이들을 각각 본 발명의 PA1Ø로 3시간 동안 처리한 후의 주사전자현미경 사진(E-H)이다.

도 4에서 보이는 바와 같이, 24시간 형성된 균막 세균들은 매우 조밀하고 밀집된 세균군체를 보인다 (A-D). 그러나 3시간 동안의 본 발명의 PA1Ø 파지 처치 이후 녹농균(E)과 황색포도상구균(F)은 거의 세균막과 세균 세포들이 사라졌으며, S. epidermidis와 S. hominis는 균막이 사라지고 남아 흩어진 세균들만이 관찰되었다.

이상의 결과를 종합하면, 본 발명에 따른 박테리오파지 PA1Ø은 녹농균, 황색포도상구균, 표피포도상구균, 스타필로코커스 호모니스, 이질균, 리스테리아균 및 연쇄상폐렴구균에 대하여 탁월한 사멸능을 가지며, 동시에 녹농균, 황색포도상구균, 표피포도상구균, 및 스타필로코커스 호모니스에 의해 생성된 균막의 제거에도 효과를 나타냄을 확인하였다.

한국생명공학연구원 KCTC11796 20101026

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> A bacteriophage killing Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 34553 <212> DNA <213> Bacterio phage PA1 <400> 1 tccgaaagct ggcagaaagg gaaggctgga agaagcagaa gcactccggg cgcggtggtg 60 gatatgagta ccacgtttcg gccctgccga aagaaacccg cgccgcgctg ctgaacgccg 120 ccctgggcga ggtggccacc aaggtggtcc gccaggagac gcaactggcc ctggtcgaaa 180 ccaaccgcca gcagctggtc gccgatgccc gccagggggt gctgcacgcc ctggacctga 240 tgatggcccg caccggctac agccggaaac gctccatcac cctgatgctg gacatggcgc 300 gcctcggcca ggtcgagccg caactgctcg ccatgctcaa gatggcccgc gatcctcgcg 360 gccgcccgag cgcggatggc ctgccgagcg tgcgcagcct ggagcgcttc ctggaccaag 420 ccgagcgtgg cgccctggtg ccgaaggtcc gccgcccgga catgagcgtt cccgactggg 480 cgccggcatt catgacgatc taccaggggc cggagaagcg cagcgcccgc gctgcccatg 540 cactgctgga gaagcactgg caggggcaaa tgcccagcct ggaccaggtc tatgcgttcc 600 tgcgcaaggt cggcaacgtc agccgcgagg tcgggcgcat 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gggccgtcgc gatatccgca tcgagctata cgacggcacg gtctatcacc gccgcatcct 29040 caccagcaca gagctggacg ccgacaccga gcgcttggcc atcgatgccg ccctgggccg 29100 gctggtcgag cctggtgacg tggcgcgcat ttgtttcatg gcgctctgta gcgccgccac 29160 cgacgtggtc gagatcgagc acgtcactga tagcgagggc gtagcaactg ccgccctgac 29220 gttcaaaggg gttcgtgacg atgagtttta acagccgcga aagctcgctc gcggatgggc 29280 agccggtgcg gctgtaccag ttcagccgtg gagccatccg ctggagctac aacagcagcg 29340 accgggacat cacctaccag aaccagattt tccgcaccgt gccgggcggc atcactgaca 29400 acgggatcat ctgttccggc gatccgcagt ccgaccagtt cgtcatcacc gcgccggccg 29460 acctcgacgt cgcgctgctg tacaagaccc ggtcgccgag cggtgccatc gacttggtcg 29520 tctacgacat gcactacggc gacaccgagg cagcggtttc ctgggtgggc cagattggcg 29580 atgtggactg gccgaccgtg gacagctgcc gcataacgtg cgtgtcagaa gacgaactga 29640 tggaccagcc cggcttgatc gacacctact gccgcacctg cacggcagtc gttggcgacc 29700 atcgctgcaa ggtcaacctc gttccgtatc gcgtgacgct gacgccgcag agcatcagcg 29760 gctgggtgat ctccagcggc gtggtcgccg gctatgtcga tggctggttt accgggggct 29820 acgtcgagtg gcaagtggac ggcgacaact acgatagccg ctacatcgag cggcacgccg 29880 gacccgatct ttacatcctg ggcggcaccg agggcattcc ggcaggtggc caactgcggg 29940 tttatccagg ttgcgacggg ctcgcgcaga cctgcgacga caaattcagc aacctcccca 30000 acttcagggg gtttaacgcg atgcaaggca agtcgccatt cgatggcgac caggtctggt 30060 gaggtaggcc atggacccga tcacaatcaa tctcgtcatc ctggcggcgt cgttcatcct 30120 atccaaggtc ttggcgccga agccgcagaa gcccaagccg accgcctttg aagacatcga 30180 tttcccgcgc tgcgacgagg gtgacgaaca ggtcgccgtc ttcggtcagt gctggtcgaa 30240 gagctggatg gtgctgaccg tgggcaacta cagaacgaag gcgatcaaga ccaaagggag 30300 caagaaatga tcgttacggc tcagcacctg cataccgtgc cgacctggac cactcggcag 30360 ggctactgcc accggcaggc gcgggacttc ttcaagcgcc atggcctgga ttggatggcg 30420 ttcttacggg acggcatcga ggccgacgtg ctagtcgcga ccggcgacgc gctcgcgctc 30480 aagctggttg agcacgcatg ccaggaggta gccgatgggc gctaaaccga aggcacagac 30540 ggtcgggttc gagtactttt ttgacatcca tttcgccctg ggtaagaaga tcgacgaggt 30600 ctgtgcaatc cgggcgagcg gcaagaccgc atggaagggc 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Claims (7)

1. 녹농균 및 황색포도상구균에 대한 사멸능을 갖고, 서열번호 1로 표시되는 전장 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 시포비리대 과(Siphoviridae)의 박테리오파지(Bacteriophage) PA1Ø.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 박테리오파지는 기탁번호 KCTC 11796BP의 박테리오파지인 것을 특징으로 하는 박테리오파지 PA1Ø.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 박테리오파지는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 표피포도상구균(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 호모니스(Staphylococcus homonis), 이질균(Shigella sonnei), 리스테리아균(Listeria monocytogenes) 및 연쇄상폐렴구균(Streptococcus pneumonia)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 균주에 대한 사멸능을 갖는 것을 특징으로 하는 박테리오파지 PA1Ø.
   
4. 제 1항에 있어서, 상기 박테리오파지는 녹농균, 황색포도상구균, 표피포도상구균 또는 스타필로코커스 호모니스에 의해 생성된 균막을 제거하는 것을 특징으로 하는 박테리오파지 PA1Ø.
   
5. 삭제
6. 제 1항의 박테리오파지 PA1Ø을 유효성분으로 포함하는 항생제.
   
7. 제 1항의 박테리오파지 PA1Ø을 유효성분으로 포함하는 소독제.

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