CN112063545B - 一种可降解含能材料的菌株及其应用 - Google Patents

一种可降解含能材料的菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种可降解含能材料的菌株，所述菌株于2019年8月8日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)中，保藏号为CGMCC No.18373；还涉及该菌株在降解含能材料中的应用；还涉及一种降解含能材料的方法。本发明的菌株为好氧的假单胞菌，能够以含能材料例如CL‑20为唯一氮源生长，并高效降解其所处环境中的含能材料，最终可使含能材料浓度降低到0μg/mL左右，在治理含能材料例如CL‑20生产和应用导致的环境污染中具有广阔的应用前景。

Description

一种可降解含能材料的菌株及其应用
技术领域
本发明涉及污染物处理领域，更特别地，涉及一种可降解含能材料的菌株及其应用，还涉及一种降解含能材料的方法。
背景技术
含能材料是一种能量密度高、瞬间功率大的亚稳定性物质，作为武器弹药系统中关键功效组件、推进剂的燃料以及火炸药的组分，在军事、航空航天及民用领域中均得到广泛应用。传统含能材料包括三硝基甲苯(TNT)、环三亚甲基三硝胺(RDX)和环四亚甲基四硝胺(HMX)。国内外在含能材料毒性及环境危害研究方面开展了大量工作。根据美国和欧洲的生产车间工人的职业健康调查，RDX暴露可导致严重惊厥、眩晕、呕吐，甚至意识障碍，而HMX暴露对肝脏和神经系统均有影响。EPA在2014年已将TNT和RDX确定为“人类可能致癌物”(C类)
CL-20(六硝基六氮杂异伍兹烷，Hexanitrohexaazaisowurtzitane)是一种具有复杂笼型结构的多环硝胺类化合物，与传统含能材料TNT、RDX和HMX具有相似分子结构。自1987年合成以来，由于其优越的爆炸性能，近年来受到广泛关注。研究表明，CL-20具有1.8倍TNT当量，其密度、爆速、爆压和能量密度均高于RDX和HMX，同时还具有良好的热稳定性。由CL-20作为主要配方能显著提升弹药的比冲、燃烧速度和爆能，在火药、发射药、推进剂等领域均具有广阔的应用前景。许多欧美发达国家已将CL-20的合成和应用列入关键军事研究技术，并有望作为RDX和HMX的替代材料，因此还被誉为是“第四代”含能材料。
目前对CL-20的健康和环境影响研究报道较少，而由于其结构与TNT、RDX和HMX较为相似，推测其可能具有相近的毒性效应。我们在前期对CL-20的毒性进行了系统研究，发现其可诱发小鼠微核率升高，并可造成染色体损伤和形成非整倍体。致畸试验结果表明，CL-20对孕鼠有毒性作用。有研究者发现，与RDX、HMX、TNT等含能材料相比，CL-20对蚯蚓、土壤微生物具有更大的毒性，0.02mg/kg的CL-20就可造成土壤中蚯蚓密度大量减少。一项关于鸟类的急性经口毒性试验表明，CL-20对动物体重有影响，呈明显剂量效应关系，且对肝脏有毒性作用。由于CL-20的广泛使用和对土壤环境、水体环境及人体的明显危害性，限制着其生产和使用，因此很有必要采取一定的措施对残留于土壤及水体环境中的CL-20进行处理。
国内外在含能材料的微生物降解方面也开展了大量研究工作，其典型代表是关于TNT的微生物降解研究。随着近年来对含能材料微生物降解研究的不断发展，目前已筛选出许多能够降解TNT、RDX和/或HMX的微生物。然而，关于CL-20微生物降解的研究较少。由于CL-20结构与RDX类似，有研究者选择能够降解RDX的两株细菌Rhodococcus sp.DN22和Rhodococcus rhodochrous 11Y来降解CL-20，结果发现均不能发挥降解作用。有研究发现两种白腐真菌Phanerochaete chrysosporium和Irpex lacteus可在需氧条件下通过胞外氧化酶的脱硝机制，如LiP、MnP等分解CL-20。这些酶可非特异性降解CL-20，研究表明其对RDX、HMX等含能材料均具有一定的降解能力，且仅在周围环境中缺少碳源和氮源情况下才能发挥较高的降解能力。研究者在花园土壤中筛选出一株需氧土壤杆菌(Agrobacteriumsp.strain)JS71和一株厌氧假单胞菌(Pseudomonas sp.strain)FA1，在海洋沉积物中筛选出一株梭菌(Clostridium sp.Strain)EDB2，均具有CL-20降解作用。其中，JS71不能以CL-20作为唯一氮源或碳源生长，且其生长和降解CL-20的速率均较低；FA1细菌中发现一种NADH依赖型酶，分别为亚硝酸盐还原酶(Nitrite reductase)和一氧化氮还原酶(Nitricoxide reductase)，EDB2中也发现了NADH依赖型酶，能够将CL-20降解为NO2 -、N2O和HCOOH。
目前，仅国外研究者开展了少量关于CL-20微生物降解的研究，其降解CL-20的效率均不高，且降解谱较窄，无论在降解机制及实际应用方面均无法发挥实际作用。因此，寻找能够在真实环境条件下高效降解CL-20的微生物菌株，对CL-20生产和应用导致的环境污染治理工作具有十分重要和现实的意义。
微生物材料的保藏
本发明涉及的菌株已于2019年8月8日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内的中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)中，保藏号为CGMCCNo.18373。分类学命名为假单胞菌Pseudomonas sp.。
发明内容
为解决以上技术问题，本发明提供了一种可降解含能材料的菌株，所述菌株于2019年8月8日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)中，保藏号为CGMCCNo.18373。
本发明还提供了上述菌株在降解含能材料中的应用。
在一个实施方案中，所述含能材料为六硝基六氮杂异伍兹烷、三硝基甲苯、环三亚甲基三硝胺和环四亚甲基四硝胺中的一种或多种组合。
本发明还提供了一种降解含能材料的方法，包括在含有所述含能材料的环境中加入权利要求1所述的菌株的步骤。
在一个实施方案中，所述含能材料为六硝基六氮杂异伍兹烷、三硝基甲苯、环三亚甲基三硝胺和环四亚甲基四硝胺中的一种或多种组合。
在一个实施方案中，所述含能材料为六硝基六氮杂异伍兹烷。
在一个具体实施方案中，所述方法包括以下步骤：
S1：将含有六硝基六氮杂异伍兹烷的材料配制成培养基；
S2：将所述菌株的细胞加入到所述培养基中，培养12h以上，得到培养物；
S3：除去所述培养物中的菌细胞。
在一个优选实施方案中，S1中的培养基不含其它氮源，或者其它氮源含量极低。
在一个优选实施方案中，S2中培养36-48h。
本发明的菌株为好氧的假单胞菌，能够以含能材料例如CL-20为唯一氮源生长，并高效降解其所处环境中的含能材料，最终可使含能材料浓度降低到0μg/mL左右，在治理含能材料例如CL-20生产和应用导致的环境污染中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为菌株ZyL-01在CL-20无机盐固体培养基上划线培养48h后的菌落照片；
图2为菌株ZyL-01在革兰氏染色后的光学显微照片；
图3菌株ZyL-01的16s rDNA序列在NCBI进行Blast比对后，采用MEGA5.0构建的系统发育树；
图4为LB培养基中菌株ZyL-01在不同温度下的生长曲线；
图5为LB培养基中菌株ZyL-01在不同pH值下培养20h后的OD600的统计图；
图6为加有菌株ZyL-01菌细胞的培养基中CL-20浓度随时间的变化。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1.可降解CL-20菌株的筛选
称取5g土壤(来自辽宁省辽阳市某CL-20生产线的污水处理厂)，加入到CL-20无机盐培养基中，于28℃培养7d，使土壤中的微生物充分生长，随后进行传代培养。取5mL培养液加入新的CL-20无机盐培养基中，于28℃，150rpm恒温摇床培养7d。传代5次后，进行分离纯化，得到纯化的菌株。
无机盐培养基的配制：含Na2HPO4·12H2O(浓度3.8g/L)和KH2PO4(浓度1.5g/L)的溶液100mL，121℃高压灭菌20min，加入1mL高压灭菌的CaCl2溶液(浓度0.755g/L)，1mL过滤除菌的含MgSO4·7H2O(浓度5.0g/L)、MnSO4·H2O(浓度0.152g/L)和FeSO4·7H2O(浓度0.5g/L)的溶液，1mL115℃高压灭菌的20％葡萄糖溶液，以及1mL过滤除菌的1％CL-20丙酮溶液。
将其中一株命名为ZyL-01，保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内的中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)中，保藏号为CGMCC No.18373。
2.菌株ZyL-01的种属鉴定
将对数生长期的菌液划线接种至CL-20无机盐固体培养基中，28℃恒温培养48h，观察菌落形状、颜色、粘稠度、隆起及边缘形态等特征，并通过革兰氏染色在显微镜下观察细胞形态。结果如图1和2所示，ZyL-01菌落为圆形，白色，直径约1-2mm，表明湿润，易挑起；ZyL-01细胞呈杆状，2-3μm，无鞭毛，革兰氏染色呈阴性。
对其16s rDNA进行测序，序列如SEQ ID NO:1所示。将其16s rDNA序列在NCBI中进行BLAST比对，并构建系统发育树，结果如图3所示，菌株ZyL-01的16s rDNA序列与假单胞菌属的类群具有较高同源性。
结合菌落和细胞形态，以及16s rDNA序列特性，将本发明的ZyL-01菌株划入假单胞菌属。
3.菌株ZyL-01的培养条件
在固体培养基中挑取单菌落，接种至25mL LB培养基，28℃，150rpm摇床培养2-3d，至细菌生长至对数生长期。取25μL菌液接种至新的LB培养基，采用OD600检测在不同温度(21℃、28℃、37℃)及pH值(4.0、5.5、7.0、8.5、10.0)条件下细菌的生长情况。
结果如图4和5所示，菌株ZyL-01在温度21-37℃，pH5.5-8.5的条件下均可良好生长，培养的最适温度为28℃，最适pH为7.0。
4.菌株ZyL-01降解CL-20
取用液体LB培养基培养至对数生长期的ZyL-01培养物1mL，10000rpm离心5min后弃上清，加1mL无菌水重新悬浮后，加入25mL无机盐培养基中作为ZyL-01组；将1mL无菌水重新悬浮的菌液经121℃，20min高压灭菌后，加入25mL无机盐培养基中作为对照组。28℃，150rpm摇床培养，检测不同时间点CL-20浓度。将培养物在12000rpm下离心5min，吸取上清，采用紫外分光光度法(OD230)检测CL-20浓度。结果如表1和图6所示，菌株ZyL-01能够在含有CL-20的无机盐培养基中生长，该培养基中仅CL-20分子中含有氮源，表明该细菌能够利用CL-20作为唯一氮源。菌株ZyL-01在12h内可降解46.6μg/mL的CL-20，在36h内降解率达到97％以上，基本将培养基中的CL-20完全代谢。
表1加有ZyL-01的培养基中CL-20浓度随培养时间的变化
Figure GDA0002725683600000061
Figure GDA0002725683600000071
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 西北工业大学
<120> 一种可降解含能材料的菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1479
<212> DNA
<213> 假单胞菌(Pseudomonas sp.)
<400> 1
tggctcagat tgaacgctgg cggcaggcct aacacatgca agtcgagcgg tagagagaag 60
cttgcttctc ttgagagcgg cggacgggtg agtaatgcct aggaatctgc ctggtagtgg 120
gggataacgc tcggaaacgg acgctaatac cgcatacgtc ctacgggaga aagcagggga 180
ccttcgggcc ttgcgctatc agatgagcct aggtcggatt agctagttgg tgaggtaatg 240
gctcaccaag gcgacgatcc gtaactggtc tgagaggatg atcagtcaca ctggaactga 300
gacacggtcc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attggacaat gggcgaaagc 360
ctgatccagc catgccgcgt gtgtgaagaa ggtcttcgga ttgtaaagca ctttaagttg 420
ggaggaaggg cagttactta atacgtatct gttttgacgt taccgacaga ataagcaccg 480
gctaactctg tgccagcagc cgcggtaata cagagggtgc aagcgttaat cggaattact 540
gggcgtaaag cgcgcgtagg tggttcgtta agttggatgt gaaatccccg ggctcaacct 600
gggaactgca ttcaaaactg tcgagctaga gtatggtaga gggtggtaga atttcctgtg 660
tagcggtgaa atgcgtagat ataggaagga acaccagtgg cgaaggcgac cacctggact 720
gatactgaca ctgaggtgcg aaagcgtggg gagcaaccag gattagatac cctggtagtc 780
cacgccgtaa acgatgtcaa ttagccgttg ggagccttga gctgttagtg gcgcagctaa 840
cgcattaagt tgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg 900
ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 960
aggccttgac atccaatgaa ctttccagag atggattggt gccttcggga acattgagac 1020
aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgtaacga 1080
gcgcaaccct tgtccttagt taccagcacg taatggtggg cactctaagg agactgccgg 1140
tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca tggcccttac ggcctgggct 1200
acacacgtgc tacaatggtc ggtacagagg gttgccaagc cgcgaggtgg agctaatccc 1260
agaaaaccga tcgtagtccg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag tcggaatcgc 1320
tagtaatcgc gaatcagaat gtcgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1380
gtcacaccat gggagtgggt tgcaccagaa gtagctagtc taaccttcgg gaggacggtt 1440
accacggtgt gattcatgac tggggtgaag tcgtaacaa 1479

Claims (6)

1.一种可降解含能材料的菌株，所述菌株于2019年8月8日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）中，保藏号为CGMCC No.18373。
2.权利要求1所述的菌株在降解含能材料中的应用，所述含能材料为六硝基六氮杂异伍兹烷。
3.一种降解含能材料的方法，其特征在于，包括在含有所述含能材料的环境中加入权利要求1所述的菌株的步骤，所述含能材料为六硝基六氮杂异伍兹烷。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将含有六氮杂异伍兹烷的材料配制成培养基；
S2：将所述菌株的细胞加入到所述培养基中，培养12 h以上，得到培养物；
S3：除去所述培养物中的菌细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S1中的培养基不含其它氮源，或者其它氮源含量比较低。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S2中培养36-48 h。
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