KR100910961B1 - 황색포도상구균의 균막 처치에 효과적인 박테리오파지 또는그것 유래의 용균단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 황색포도상구균에 의해 형성된 균막(biofilm)의 처치(treatment)에 유용한 박테리오파지(bacteriophage) 또는 그것 유래의 용균단백질의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1 내지 서열번호 26으로 구성된 군으로 특정되어지는 염기서열을 갖는 박테리오파지 또는 그것 유래의 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열의 용균단백질, 또는 서열번호 29의 염기서열을 갖는 박테리오파지 또는 그것 유래의 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열의 용균단백질을 포함하는, 황색포도상구균에 의해 형성된 균막 제거용 조성물에 관한 것이다.

황색포도상구균, 균막, 박테리오파지, 용균단백질, 제거

Description

황색포도상구균의 균막 처치에 효과적인 박테리오파지 또는 그것 유래의 용균단백질{Bacteriophage or Lytic Protein Derived From the Bacteriophage Which Effective For Treatment of Staphylococcus aureus Biofilm}

본 발명은 박테리오파지(bacteriophage) 또는 그것 유래의 용균단백질(lytic protein)을 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 의해 형성된 균막의 제거(removal; destroy)에 활용하는 것에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 박테리오파지 및 그것 유래의 용균단백질이 황색포도상구균에 의해 형성된 균막의 제거 능력이 있음을 활용하여 황색포도상구균에 원인한 질병의 치료에 이용하는 것에 관한 것이다. 따라서 박테리오파지 또는 그것 유래의 용균단백질을 유효성분으로 포함하는 황색포도상구균에 의해 형성된 균막 제거를 목적으로 하는 조성물을 제공하고 또 기존 항생제의 효능을 증진시키기 위한 목적으로 박테리오파지 또는 그것 유래의 용균단백질을 항생제와 함께 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 따라서 본 발명은 황색포도상구균에 의해 형성된 균막의 제거를 목적으로 하는 소독제, 의료용세정제, 및 환경정화제를 제공하며 황색포도상구균 균막과 관련된 감염성 질환(biofilm-associated Staphylococcus aureus infection)에 대한 의료용 치 료제 및 항생제를 제공한다.

세균이 감염된 부분에는, 폴리머(polymer) 기질로 감싸인 세균의 집락인 점액질이 존재할 때가 있다. 이 세균에 의해 형성된 점액질의 세균 복합체를 균막(biofilm)이라 부르며 바이오필름 또는 생물막이라고도 부른다(J Bacteriol 176: 2137-2142, 1994). 균막에는 폴리머 기질(다당류와 폴리펩타이드가 주성분임)로 된 외막(extracellular matrix; mucosal surface)이 세균집락을 둘러싸고 있다. 즉 균막은 고형(solid)의 생물학적 표면(biological surface)인 세균집락과 비생물학적 표면(non-biological surface)인 외막으로 구성된 복합체이다. 따라서 본 명세서의 균막이란 이 외막과 그 속에 들어있는 세균집락을 포함한 전체를 의미한다. 균막은 미국 몬타나주립대학 바이오필름공학센터장인 Costerton 교수가 1970년대 후반에 제창한 개념으로, 세균 등이 분비하는 점성물질(고체 표면에 붙은 박테리아는 다당류등의 점성물질을 분비)인 외막 안에 복수의 세균이 공존하는 환경을 말한다. 균막은 자연계에 흔하게 발견되는데, 예컨대 바위나 연못에서 발견되는 점액질이 바로 그것이다. 균막은 세균으로 이루어진 작은 도시라 할 수 있으며, 그 속에서 세균은 서로 의사소통을 하고, 외부세계에 대하여 방어를 한다. 이로 인하여 균막은 항생제를 포함한 여러 환경 스트레스(environmental stress) 아래에서도 세균의 생존을 가능하게 만든다.

이런 균막은 일반 자연 환경 외에 세균감염성 질환과 관련하여서도 자주 발견된다. 사람의 장기에 형성되기도 하고 치아의 플라크 형태로 나타나기도 하며, 산업용 장비나 의료용 이식 기구에 생길 수도 있다. 이런 탓에 균막은 치주 질환(periodontal disease)이나 낭포성 섬유증(cystic fibrosis)에 동반하는 폐렴, 중이(middle ear)에 생기는 이통(earache) 등을 연구하는 학자들의 관심 대상이 되어 왔다. 미국 국립보건연구소는 2002년 보고에서 박테리아군의 최대 80%가 이 같은 균막 형성을 통해 병원균을 퍼트리고 있는 것으로 추산했다.

별개로 부유하던 세균(planktonic bacteria)에 대해 약효를 나타내던 항생제도 세균이 균막을 형성하면 효능을 상실하는 경향이 커진다(Trends Microbiol 9: 34-39, 2001). 세균이 균막을 형성하면 균막에 존재하는 외막을 항체 등이 투과할 수 없어 숙주의 면역체계(host immune system)를 무력화시키고, 항생제에 대한 세균의 저항성이 약 1,000배까지 높아질 수 있다고 한다(Antimicrob Agents Chemother 47: 3407-3414, 2003). 이런 균막형성에 의한 항생제에 대한 저항성의 증가 원인은 아직 정확하게 밝혀져 있지는 않으나 다음의 3가지 정도로 설명된다. 첫 번째는 “미생물의 생태적 변화”이다. 균막이 형성된 상태에서는 세균 사이의 결착력이 강화되어 결과적으로 세균집락이 잘 퍼지지 않게 되며 따라서 세균 증식도 저하되게 된다. 이렇게 되면 주위 환경과의 교환 작용에 대한 의존성이 약화되고, 대사 작용이 느려지며, 결과적으로 항생물질에 대한 감수성이 낮아지게 된다.

두 번째는 “점액성 다당류로 구성된 외막”의 물리적 특성이다. 외막을 형 성하는 점액성 다당류들은 전기적 성질을 가지고 있어 항생물질과 결합하려는 경향을 갖고 있으며 이렇게 항생물질과 결합함으로써 항생물질이 퍼지는 것을 방해한다. 즉 항생물질이 개개의 세균까지 잘 전달되지 않게 되어 항생물질은 그 효능을 발휘하기 어렵게 된다. 세 번째는 일반적 항생제 내성 획득 기작과 관련 있는 추정으로 “억제 인자의 생산”이다. 항생물질의 효능을 억제하는 억제 인자로 가장 많이 알려진 물질로는 슈도모나스균에 의하여 생산되는 베타-락타메이스(β-lactamases)를 들 수 있다. 균막이 형성되면 그 균막 속에 존재하는 내성이 없던 세균들도 주위의 내성세균으로부터 수평 유전자 전이(horizontal gene transfer)를 통하여 내성인자 관련 유전자를 획득하여 내성 세균화 되는 경향이 있다. 즉, 감염부위에 균막이 형성되게 되면 이는 항생제 내성 상태가 되었다고 볼 수 있다. 이러한 이유들로 인하여 균막이 형성되면 감염증 치료에 널리 사용되던 항생제의 작용이 어렵게 되어 결과적으로 항생제에 의한 치료 효과가 약화된다.

이런 이유로 인하여, 균막이 형성된다는 것은 만성적인 세균 감염 상태에 돌입한다는 것을 의미한다. 이 경우 상기에 기술했듯이 세균들의 항생제에 대한 감수성이 낮아져 항생제를 사용해도 거의 효과가 없으며 이를 극복하기 위해 단순하게 항생제를 과다처방하면 세균의 항생제 내성만을 키우게 된다. 즉, 균막이 형성된 세균 감염증은 단순히 항생제로만 치료하는 것은 더 이상 효과적 치료가 되지 못함을 의미한다. 특히 균막을 형성하고 있는 세균에 의한 감염은 여러 가지 항생제에 대해 내성을 갖는 다제내성(multi-drug resistance) 균에 의한 경우가 많아 더욱 문제가 심각해진다.

따라서 이러한 균막의 형성으로 인한 항생제 치료의 무력화를 막기 위해서는 균막이 형성되더라도 이 균막을 제거할 수 있는 새로운 항생제가 개발되든가, 또는 기존 항생제가 효능을 발휘할 수 있도록 균막에 존재하는 외막을 파괴해 줄 수 있는 성분을 기존 항생제와 함께 사용하여야 한다.

황색포도상구균은 그램 양성(Gram positive) 세균으로서 화농, 농양형성, 다양한 화농성 감염, 패혈증을 유발하는 병원성 미생물이다. 국내에서 조사된 항생제 메티실린에 대한 내성률이 평균 73%로 세계 최고 수준인 매우 위해한 병원균이다. 이는 항생제를 써도 죽지 않는 황색포도상구균이 73%가 된다는 뜻으로 내성이 매우 심각한 병원균이라고 할 수 있다. 또한, 황색포도상구균은 균막을 형성할 수 있는 종이 많으며 균막이 생성되면 약물 침투가 불가능하여 고질적인 감염 양상을 나타낸다. 이러하기 때문에, 황색포도상구균에 의한 균막이 형성되면 만성적 감염증을 초래한다(FEMS Microbiology Letters 252: 89-96, 2005). 균막이 형성된 황색포도상구균에 의해 유발된 질환의 치료는 다른 세균에 의해 형성된 균막으로 인한 질환의 치료에 비해서도 특히 어렵다. 왜냐하면, 질환의 치료를 위해 약물을 사용해도 균막으로 인한 약물전달의 어려움이 있을 뿐 아니라 설사 약물이 전달되었다 할지라도 내성균주가 많은 황색포도상구균의 특성상 기존 항생제에 기반한 치료는 효과적이지 않다. 따라서 황색포도상구균에 의한 균막 처치는 기존 항생제에 의존한 방 법이 아닌 새로운 물질에 의한 접근이 필요하다.

황색포도상구균에 의한 균막 처치에 관련하여 여러 가지 시도가 있었으나 뚜렷하게 효과적인 방법은 없었다. 그나마 다소 효과적인 시도는 리소스타핀(lysostaphin)을 이용하는 것으로서 리소스타핀이 황색포도상구균에 의해 형성된 균막 제거에 활용될 수 있음이 보고된 적이 있다(Antimicrob Agents Chemother 47: 3407-3414, 2003). 리소스타핀은 포도상구균에서 얻어지는 항균성 효소로서 포도상구균의 세포막을 파괴할 수 있는 효소이다. 이는 글리실글리신 엔도펩티데이즈(glycylglycine endopeptidase)로서 포도상구균의 펩티도글리칸(peptidoglycan) 구조에서 발견되는 펜타글리신 결합(pentaglycine cross bridges)을 특이적으로 자른다. 따라서 리소스타핀은 포도상구균에 대한 특이 항생제(extremely potent anti-Staphylococcal agent)로의 개발 가능성을 가지고 있다고 할 수 있다. 비록 리소스타핀이 우수한 효능을 가지고 있기는 하지만 완벽하다고 할 수는 없다. 포도상구균 중에는 리소스타핀에 민감하지 않은 것(lysostaphin-resistant strain)이 상당히 존재한다(J Clin Microbiol 11: 724-727, 1980; Antimicrob Agents Chemother 47: 3407-3414, 2003). 즉, 포도상구균들의 리소스타핀 감수성(lysostaphin sensitivity)이 서로 다르기 때문에 리소스타핀이 모든 포도상구균에서 효과적일 것으로 기대하는 것은 무리이다. 이에 더하여 또 다른 문제는 리소스타핀에 내성을 획득한 포도상구균이 생기고 있다는 것이다. 이러한 리소스타핀에 내성을 획득한 변종을 리소스타핀-저항성 황색포도상구균 변종(lysostaphin- resistant Staphylococcus aureus variants)이라 부른다(Antimicrob Agents Chemother 51: 475-482, 2007). 이들의 리소스타핀에 대한 내성 획득의 기작은 아직 정확히 밝혀져 있지는 않지만 보고된 한 가지 기작은 다음과 같은 것이 있다. femA 유전자에 돌연변이가 생겨서 비활성의 FemA 단백질(nonfunctional FemA protein)이 발현되어 펩티도글리칸 구조에 모노글리신 결합(monoglycine cross bridges)이 생겨 리소스타핀의 작용을 무력화시킨다는 것이다(J Bacteriol 188: 6288-6297, 2006). 이러한 리소스타핀의 단점을 극복하기 위한 시도로 리소자임(lysozyme) 같은 다른 효소나, 또는 메티실린(methicillin), 옥사실린(oxacillin), 반코마이신(vancomycin) 등의 항생물질과 리소스타핀을 함께 사용하는 것에 대한 연구가 활발하다(Antimicrob Agents Chemother 21: 631-535, 1982; J Antimicrob Chemother 59: 759-762, 2007; Folia Microbiol (Praha) 51: 381-386, 2006). 그러나 이러한 물질을 함께 사용한다 할지라도 리소스타핀 감수성이 낮은 황색포도상구균 혹은 리소스타핀 내성을 획득한 변종으로 이루어진 균막이라면 역시 효과적인 균막제거가 불가능함은 마찬가지이다. 결국, 리소스타핀의 단점을 보완해 줄 수 있는 새로운 물질의 개발이 필요하다 할 것이다. 이러한 목적에 맞는 물질은 단독 사용, 또는 리소스타핀이나 기존 항생제와 함께 병용될 수 있을 것이다. 특히 리소스타핀이나 다른 항생제와는 다른 기작으로 항균 효과를 발휘할 수 있다면 더욱 바람직하다.

균막에 관련된 기존 기술의 단점을 보완할 수 있는 새로운 접근법으로 최근 관심을 받고 있는 것이 박테리오파지의 활용이다. 박테리오파지는 세균을 감염시키는 바이러스의 일종으로 보통 파지라고 줄여서 부르기도 한다. 박테리오파지는 핵산으로 이루어진 유전물질 중심부를 단백질 외피가 싸고 있는 단순한 구조의 유기체이며 핵산은 단일 사슬이거나 이중 사슬인 DNA 또는 RNA로 되어있다. 박테리오파지는 1915년 영국의 세균학자 Twort가 포도상구균(Micrococcus) 집락이 어떤 것에 의해 투명하게 녹는 현상에 대한 연구에서 발견되었다. 또한, 1917년에는 프랑스의 세균학자 d'Herelle이 이질환자 변의 여과액 중에 적리균(Shigella disentriae)을 녹이는 작용을 가진 것이 있다는 것을 발견하고 이에 대한 연구를 통해 독립적으로 박테리오파지를 발견하였으며, 세균을 잡아먹는다는 뜻에서 박테리오파지라고 명명하였다. 박테리오파지는 생존에 숙주가 반드시 필요하며 모든 세균에는 특정 박테리오파지가 존재한다고 알려져 있다. 박테리오파지는 숙주에 침투하여 복제 과정을 끝낸 다음, 숙주인 세균의 세포벽을 분해하기 위해 필요한 일군의 효소를 발현시킨다. 이들 효소는 세포벽의 경직성(rigidity) 및 기계적 강도 (mechanical strength)를 담당하는 세포벽의 펩티도글리칸 층을 공격하여 세포벽을 파괴한다. 즉, 이러한 박테리오파지의 용균단백질은 박테리오파지가 숙주로부터 밖으로 나올 때, 숙주의 세포벽을 파괴하는 역할을 하는 단백질이다. 이러한 박테리오파지의 용균단백질을 보통 리신이라고 부르기도 한다.

비록 항생제(또는 항균제)가 세균 감염에 의한 감염성 질환의 치료에 있어 여전히 주된 방법으로 널리 사용되고 있는 실정이지만, 1980년대 이후 과도한 항생제의 사용으로 더욱 많은 항생제 내성 균주가 발생하고 있으며 2000년 이후에 다재 내성(multidrug-resistant)을 지닌 병원성 세균의 출현빈도가 높아지고 기존 항생제의 많은 문제점들이 부각됨에 따라 기존 항생제의 대체 물질로의 개발 가능성 때문에 박테리오파지에 대한 연구가 선진국들을 중심으로 많은 관심을 받으며 진행되고 있었다. 또한 박테리오파지는 항생제 내성균에 의한 질환에 효과적일 뿐만 아니라 항생제에 알러지(allergy)를 가진 환자의 질환 치료에도 효과적이다. 특히, 박테리오파지 유래의 용균단백질인 리신효소의 경우, 바이오테러에 있어서 생화학무기로 사용될 수 있는 탄저균을 사멸하는데 이용될 수 있음이 보고(Nature 418: 884-889, 2002)되면서, 세균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 리신효소 및 그 작용에 대한 연구가 활발해 지고 있다.

기존항생제 대체제로서 박테리오파지 및 그 유래의 용균단백질에 관한 연구는 한 단계 더 나아가 병원성 세균의 균막 처치제로서도 관심을 받고 있다. 균막과 관련하여 박테리오파지 자체의 이용이 개시된 바 있다 (International Publication Number WO 2006/063176 A2; WO 2004/062677 A1). 그러나 박테리오파지가 항균활성을 나타낼 수 있는 세균의 범위가 좁기 때문에 어떤 한 가지 박테리오파지가 어떤 세균 한 종 전체에 효과적일 수는 없다. 따라서 효과적 처치법을 확보하기 위해서는 다양한 박테리오파지의 확보가 필요하며, 경우에 따라서는 몇 가지 박테리오파지의 병용 또한 필요하다. 이런 여러 박테리오파지가 병용된 박테리오파지의 혼합물을 박테리오파지 칵테일(cocktail)이라 한다. 또한 같은 세균에 효과가 있는 박테리오파지 간에도 실제 작용하는 기작과 세포벽의 파쇄 부분에 차이가 있어 이들의 효능은 상이한 것이 일반적이며 또 이 두 박테리오파지를 병용하는 것이 각각의 단독 사용에 비해 효과적일 수도 있다.

그리고 최근 박테리오파지 유래의 용균단백질도 형성된 균막의 제거 목적에 활용하고자 하는 시도가 있다. 일반적으로 박테리오파지 유래의 용균단백질은 그 모체가 되는 박테리오파지보다 넓은 항균 활성을 보인다. 이런 이유로 균막 제거에의 활용에서도 박테리오파지 자체의 이용 경우보다 더 넓은 효능을 발휘할 것으로 기대를 받고 있다. 아직 관련 보고가 너무 적어 어떠한 결론을 내릴 수는 없지만 지금까지는 충분한 효능을 가진 경우가 보고된 적은 없다. 박테리오파지 유래의 용균단백질 관련 보고로는, 황색포도상구균에 의해 형성된 균막을 제거하는 능력을 가진 재조합 Φ11(recombinant Φ11) 엔도리신(endolysin) 관련 보고가 있다(Applied and Environmental Microbiology 73: 347-352, 2007). 그렇지만 Φ11 엔도리신의 효능도 충분하다고는 할 수 없다. 역시 효과를 보이는 세균의 범위가 좁기 때문이다. 따라서 다양한 세균에 의해 형성된 균막에 대처하기 위해서는 가급적 다양한 종류의 박테리오파지 유래의 용균단백질의 확보가 요청된다 할 것이다. 여기서 간과하지 말아야 할 점은 모든 박테리오파지 유래의 용균단백질이 균막 제거 능력이 있는 것은 아니라는 점이다. Φ11 엔도리신의 균막 제거 능력을 보고한 자료에 따르면, Φ11 엔도리신은 균막 제거 능력이 있음에 반해 Φ12 엔도리신은 균막 제거 능력이 없었다. 따라서 균막 제거 능력은 박테리오파지 유래의 용균단백질의 일반적인 능력이라 할 수는 없으므로 이러한 균막 제거 능력을 가진 박테리오파지 유래의 다양한 용균단백질의 확보는 다양한 박테리오파지의 확보와 마찬가지로 필요하다 할 것이다.

본 발명자들은 박테리오파지 또는 그것 유래의 용균단백질을 이용하여 균막을 형성할 수 있는 황색포도상구균에 의해 형성된 균막 제거용 조성물을 제공하고, 더 나아가 이를 황색포도상구균에 의해 유발되고 균막 형성으로 인해 만성화된 질환의 치료에 활용코자 하였다.

특히 여러 감염성 질환의 원인균이면서 균막 형성이 문제가 되어 온 황색포도상구균에 의해 생성된 균막의 제거 및 처치에 효과적인 조성물을 개발하고자 노력한 결과, 본 발명자가 최초로 확인한 박테리오파지 또는 그것 유래 용균단백질을 활용하여 황색포도상구균에 의해 생성된 균막의 제거 및 처치에 효과적인 조성물을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 본 발명의 박테리오파지 또는 그것 유래의 용균단백질을 유효성분으로 포함한 황색포도상구균에 의해 형성된 균막 제거용 조성물을 제공하는 것이다. 상기 조성물에는 황색포도상구균에 대해 항균 활성이 입증된 성분이 추가로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 박테리오파지 또는 그것 유래의 용균단백질을 유효성분으로 포함한 균막 형성능을 가진 황색포도상구균에 대한 의료 용세정제 및 환경정화제를 제공하는 것이다. 상기 의료용세정제 및 환경정화제에는 황색포도상구균에 대해 항균 활성이 입증된 성분이 추가로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 박테리오파지 또는 그것 유래의 용균단백질을 유효성분으로 포함한 균막을 형성할 수 있는 황색포도상구균에 의해 유발된 질환에 대한 치료의 효과를 증진시킬 수 있는 의료용 치료제 또는 항생제를 제공하는 것이다. 상기 의료용 치료제 또는 항생제에는 황색포도상구균에 대해 항균 활성이 입증된 성분이 추가로 포함될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 본 발명자들에 의하여 분리된 박테리오파지와 이의 유전자를 이용하여 제조된 용균단백질이 황색포도상구균에 의해 형성된 균막의 제거 능력이 있음을 확인하여 이를 이용함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 황색포도상구균에 의해 형성된 균막을 제거할 수 있는 활성 성분으로서 박테리오파지 또는 그것 유래의 용균단백질을 포함하는, 황색포도상구균에 의해 형성된 균막 제거용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 균막을 형성할 수 있는 황색포도상구균에 의해 유발되는 질 환에 대한 치료를 위한 유효성분으로서, 박테리오파지 또는 그것 유래의 용균단백질을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 조성물에는 황색포도상구균에 대해 항균활성이 입증된 성분이 추가로 포함될 수 있다. 이 추가 구성 성분은 균막에 존재하는 외막을 파괴하는 능력이 없어도 상관없다.

또한, 본 발명은 균막을 형성할 수 있는 황색포도상구균에 의해 유발되는 질환에 대한 기존 항생제 치료의 효과를 증진시키기 위해 기존 항생제와 함께 균막에 존재하는 외막 파괴용 성분으로 박테리오파지 또는 그것 유래의 용균단백질을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 조성물에서 기존 항생제는 균막에 존재하는 외막을 파괴하는 능력이 없어도 상관없다.

본 발명에서 제공하는 조성물은 황색포도상구균에 의해 형성된 균막의 제거 또는 황색포도상구균에 의해 유발되고 균막 형성으로 인해 만성화된 질환의 치료 목적의 소독제, 의료용세정제, 환경정화제, 의료용 치료제 및 항생제의 제형으로 제공된다. 상기 조성물에는 황색포도상구균에 대해 항균 활성이 입증된 성분이 추가로 포함될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 신규 박테리오파지를 분리하였으며, 이렇게 선별된 박테리오파지를 2006년 6월 14일자로 농업 생명공학연구원(기탁번호 KACC 97001P)과 2007년 7월 18일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터 (기탁번호 KCTC 11153BP)에 재차 기탁하였으며, 관련 내용을 특허출원한 바 있다(대한민국 특허출원 제2006-55461호). 본 발명자는 계속적 연구를 통하여 상기 기탁 박테리오파지와는 다른 또 다른 유효 박테리오파지를 확보하였으며 이를 2007년 7월 18일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁한 바도 있으며(기탁번호 KCTC 11154BP) 관련 내용을 특허출원한 바 있다(대한민국 특허출원 제2007-82358호).

이에 더하여 본 발명자들은, 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 상기 각 박테리오파지의 유전정보를 이용하여, 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 신규 항균 단백질을 제공하는 발명을 개시한 바도 있다 (대한민국 특허출원 제2006-73562호 및 제2007-82357호).

이러한 박테리오파지의 항균단백질(또는 용균단백질)은 앞에 설명했듯이 박테리오파지가 숙주로부터 밖으로 나올 때, 숙주의 세포벽을 파괴하는 역할을 하는 단백질이다. 이러한 박테리오파지의 용균단백질을 보통 리신이라고 부르기도 한다. 일반적으로 용균 단백질인 리신은 N-말단 작용 부위(N-terminal catalytic domain)와 C-말단 결합 부위(C-terminal binding domain)로 구성되어 있고 두 부위 사이에 짧은 연결쇄(linker)로 연결되어 있다. 드문 경우에 리신은 두 가지 다른 작용 부위(catalytic domain)를 갖는 경우도 있다. C-말단 결합 부위는 목적 박테리아(target bacteria)의 세포벽에서 기질과 결합하는 기능을 한다. 이러한 작용부 위와 결합부위의 차이로 인해 용균단백질의 항균 효과나 항균 효과가 보이는 세균의 범위가 그 종류에 따라 차이가 있을 수 있다. 이런 이유로 박테리오파지 유래의 용균단백질도 다양한 종류가 확보되어야 한다. 추가적 용균단백질의 확보는 더 많은 세균에 대처할 수 있는 방안을 제공해 주며 또한 이들 용균단백질을 혼용할 시는 한 종류의 용균단백질의 단독 사용에 비하여 추가적 항균 효과의 증가가 기대될 수 있어 가치가 있다.

본 발명은 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시킬 수 있고 이에 의해 형성된 균막의 제거에도 효과가 있는 서열번호 1 내지 서열번호 26으로 구성된 군으로 특정되어지는 염기서열을 갖는 SAP-1 박테리오파지(기탁번호 KCTC 11153BP)와 서열번호 29의 염기서열로 특징지어지는 SAP-2 박테리오파지(기탁번호 KCTC 11154BP)를 제공한다.

본 발명은 또한 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시킬 수 있고 이에 의해 형성된 균막의 제거에도 효과가 있는 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 SAP-1 박테리오파지 유래의 용균단백질 및 이를 코딩하는 서열번호 27로 표시되는 염기서열의 유전자와 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 SAP-2 박테리오파지 유래의 용균단백질 및 이를 코딩하는 서열번호 30으로 표시되는 염기서열의 유전자를 제공한다. 본 명세서에서는 용균 현상에 의한 항균 작용을 다른 메카니즘에 의한 항균 작용과 특별히 구별하지 않고 혼용하여 사용하였다.

본 발명에서는, 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시키고 황색포도상구균에 의해 형성된 균막까지 제거할 수 있는 박테리오파지 및 그것 유래의 용균단백질을 이용한 황색포도상구균에 의해 형성된 균막의 제거에 활용할 수 있는 조성물이 개시되어 있다.

황색포도상구균에 의한 균막이 형성되면 상기에 기술했듯이 만성적 감염증을 초래하고 그 처치는 매우 어렵다. 기존의 항생제에 기반한 방법은 모두 효과적이지 않다. 특히, 항생제 내성 균주의 등장으로 이러한 항생제 내성균주가 형성하는 균막에 대처할 수 있는 새로운 방법이 필요한데, 본 발명자들은 박테리오파지나 그것 유래의 용균단백질을 이용하여 이에 적합한 방법을 제공하였다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지 또는 그것 유래의 용균단백질을 유효성분으로 포함하는 의료용세정제 및 환경정화제용 조성물을 제공하는 것이다.

의료용세정제는 인체에 이식된 인공장기 표면이나 상처에 균막이 형성되는 것을 방지하는 목적으로 사용된다. 황색포도상구균에 의한 균막은 의료 분야에서 카테터(catheters), 심장 판막(heart valves), 단락(shunts), 보철기구(prosthetic devices) 같은 대부분의 삽입된 인공 표면(implanted artificial surfaces)에서 발견된다(New Microbiol 22: 337-341, 1999; J Med Microbiol 50: 582-587, 2001; Infections Associated with Indwelling Medical Devices, pp. 55-88, 2000, ASM, Washington, DC). 그래서 삽입용 의료 장치(implantable medical devices)는 항-박테리아제(antibacterial agent)로 코팅하는 것이 바람직하다.

통상 인공 삽입물(implant)의 경우 균막이 형성되면 외과적 수술로 제거하는 방법이 유일한 방법이기 때문에 균막 형성을 막는 것은 매우 중요하다고 할 수 있다. 이러한 조치는 삽입된 의료 장치의 교체 빈도를 줄여 줄 수 있고 결국 의료비용을 줄여 준다.

이러한 의료용세정제는 스프레이 형태로 균막 형성을 막고자 하는 부분, 즉 인공관절, 도뇨관 표면, 내시경 또는 상처에 뿌리는 방법이 가능하다. 또한 손을 사용한 세척은 물론이고 초음파 세척기 및 자동 세척기를 이용할 수도 있다. 또, 의료용 장치를 의료용세정제에 담구는 방법도 가능하다. 그러나 항생제 내성 균주의 등장으로 이러한 항생제 내성균주가 형성하는 균막에 대처할 수 있는 새로운 방법이 필요하였는데, 본 발명자들은 이에 적합한 방법으로 박테리오파지나 그것 유래의 용균단백질을 이용하였다.

본 발명의 환경정화제로의 활용은 통상 소독제로의 활용을 의미한다. 본 발명의 조성물은 조리 장소 및 조리 설비의 소독제로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 의료용 세정제 및 환경정화제용 조성물에서의 박테리오파지 또는 그것 유래의 용균단백질의 유효 용량은 보통으로 숙련된 당업자에 의해서 간단한 사전 조사를 거쳐 용이하게 결정될 수 있다. 특정 용량은 응용하고자 하는 분야 및 적용방법에 의해 좌우될 것이다. 본 발명의 조성물은 박테리오파지 의 경우 일반적으로, 1 × 10³ 내지 1 × 10¹² pfu/㎖의 박테리오파지를 포함하며, 바람직하게는 1 × 10⁸ 내지 1 × 10¹⁰ pfu/㎖의 박테리오파지를 포함하고 용균단백질의 경우 0.001% (w/v) 내지 0.1% (w/v), 바람직하게는 0.002% (w/v) 내지 0.01% (w/v), 가장 바람직하게는 0.005% (w/v)로 포함한다. 또 본 발명에 개시된 박테리오파지 및 그것 유래의 용균단백질은 상호 보완적으로 혼용될 수도 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지 또는 그것 유래의 용균단백질을 유효성분으로 포함하는 의료용 치료제 및 항생제를 제공하는 것이다.

본 발명의 조성물에 포함되는 박테리오파지 또는 그것 유래의 용균단백질은 상술한 바와 같이 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시키고 그것에 의해 형성된 균막을 효과적으로 제거할 수 있으므로, 황색포도상구균에 의해 유발되고 균막 형성으로 인해 만성화된 다양한 질환, 예컨대 유방염, 피부염, 패혈증, 화농성 질환, 식중독, 폐렴, 골수염, 농가진, 균혈증, 심내막염, 및 장염 등에 대한 치료에 효과를 나타낸다. 이러한 목적의 조성물에는 추가적 치료의 효과를 얻기 위하여 이미 황색포도상구균에 대해 항균 활성이 입증된 성분이 추가로 포함될 수 있다.

본 발명에 적용될 수 있는 황색포도상구균에 대해 항균 활성이 입증된 성분으로는 메티실린, 옥사실린, 반코마이신 등이 있는데 이에 국한되지 않고 다양한 항생제가 적용될 수 있다.

기존의 다른 항생제 또는 기타의 효능이 입증된 물질과 병용될 경우에는 박 테리오파지 또는 이것 유래의 용균단백질이 균막에 존재하는 외막을 파괴해 줌으로 기존 항생제나 기타의 효능이 입증된 물질이 초기 목적대로 효능을 발휘할 수 있게 된다. 특히 본 발명의 박테리오파지 또는 그것 유래의 용균단백질은 리소스타핀과는 다른 펩티도글리칸 구조에 존재하는 결합을 자르므로 리소스타핀에 민감하지 않은 황색포도상구균이나 리소스타핀에 대한 내성을 획득한 변종에 의한 질환의 치료에 특히 효과적일 수 있다.

본 발명에서 개시한 조성물인 의료용 치료제 및 항생제로의 이용에 있어, 조성물의 유효 용량은 보통으로 숙련된 의사가 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 명세서에 있어서, '항생제’라는 용어는 방부제, 살균제 및 항균제를 총칭한다. 특정 용량은 치료하고자 하는 인간을 포함한 동물의 일령 또는 연령, 체중 및 임상 증상과 투여방법에 의해 좌우된다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 도포, 분무, 분사 및 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 박테리오파지의 경우 일반적으로, 1 × 10³ 내지 1 × 10¹² pfu/㎖의 박테리오파지를 포함하며, 바람직하게는 1 × 10⁸ 내지 1 × 10¹⁰ pfu/㎖의 박테리오파지를 포함하고 용균단백질의 경우 0.001% (w/v) 내지 0.1% (w/v), 바람직하게는 0.002% (w/v) 내지 0.01% (w/v), 가장 바람직하게는 0.005% (w/v)로 포함한다. 또 본 발명에 개시된 박테리오파지 및 그것 유래의 용균단백질은 상호 보완적으로 혼용될 수도 있다.

본 발명의 조성물은 질환 부위에의 도포, 분무 또는 분사하는 방법으로 이용할 수 있으며, 그 밖에 경구 투여 또는 비경구 투여를 통해 투여할 수도 있으며, 비경구 투여의 경우 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수도 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수도 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다.

균막 제거능이 있는 박테리오파지나 그것으로부터 유래한 용균단백질의 황색포도상구균에 관련한 질환의 치료에의 활용은 기존의 항생제에 기반한 치료에 비해 추가적 이점을 제공한다. 즉, 균막 제거와 해당 세균의 사멸을 동시에 달성할 수 있어 균막 형태로 황색포도상구균이 존재하더라도 효과적으로 작용할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 '치료'라는 용어는 (ⅰ) 황색포도상구균에 의해 유발된 감염성 질환의 예방; (ⅱ) 황색포도상구균에 의해 유발된 감염성 질환의 억제; 및 (ⅲ) 황색포도상구균에 의해 유발된 감염성 질환의 경감을 의미한다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 SAP-1 박테리오파지, SAP-2 박테리오파지, 또는 그것들 유래의 용균단백질들은 황색포도상구균만을 선별적으로 사멸시킬 수 있으며 이에 더하여 황색포도상구균에 의해 형성된 균막을 효과적으로 제거할 수 있기 때문에, 황색포도상구균에 의해 형성된 균막의 제거에 활용될 수 있다. 따라서 균막 형성능을 가진 황색포도상구균에 의해 형성된 균막의 제거를 위한 의료용세정제 및 환경정화제로 이용될 수 있고, 황색포도상구균의 균막 제거로 치료 효능이 증진될 수 있는 균막 형성능을 가진 황색포도상구균 감염증에 대한 의료용 치료제 및 항생제로 이용될 수 있다.

또한 본 발명의 SAP-1 박테리오파지, SAP-2 박테리오파지, 또는 그것들 유래의 용균단백질들은 황색포도상구균 사멸 능력에 더하여 황색포도상구균에 의해 형 성된 균막 제거 능력도 함께 갖고 있으므로, 황색포도상구균에 의해 형성된 균막의 외막으로 인하여 그 효능의 발휘에 어려움이 있었던 기존의 항생제나 황색포도상구균에 대한 항균효과가 입증된 물질과 병용됨으로써 증진된 치료의 효과를 제공한다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 병원체로부터 황색포도상구균의 분리 및 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리

1-1: 황색포도상구균의 분리

박테리오파지는 자연계에 널리 존재하는데, 특히 세균이 존재하는 곳에 공생하는 경우가 많다. 본 발명자들은 황색포도상구균에 특이적으로 감염하는 박테리오파지를 분리하기 위해 기본적으로 황색포도상구균이 존재할 것으로 예상되는 곳을 기반으로 시료를 채집한 후 실제로 황색포도상구균이 존재하는 지를 황색포도상구균 선택배지인 Baird-Parker 아가(agar) 배지를 이용하여 조사하였다.

이를 상세히 설명하면, 대상 세균인 황색포도상구균을 병원체로부터 분리하고자 선택한 질환은 젖소 유방염이었다. 유방염은 황색포도상구균에 의해 발병되 는 대표적 질환 중의 하나이다. 유방염에 감염된 젖소의 우유에서 채취한 시료로부터 황색포도상구균의 선택배지인 Baird-Parker 아가 배지를 이용하여 황색포도상구균을 획득하였고, 그람염색법(Gram staining method), 카탈라아제 조사(catalase test)와 bioMerieux 사의 Vitek을 이용한 생화학적 조사를 통해 선별된 균이 황색포도상구균임을 최종적으로 확인하였다. 그 결과는 다음 표 1과 같다.

Vitek ID	200000-0 (A1-18) 카탈라아제 + 코아귤라아제(Coagulase) +
타입	그램 양성 동정(identification) 카드(GPI)
상태	최종
경과 시간	5 시간
생물	황색포도상구균
PB + BAC - OPT + HCS + 6NC + 10B + 40B - ESC - ARG - URE - TZR + NOV - DEX + LAC + MAN + RAF - SAL - SOR - SUC + TRE + ARA - PYR + PUL - INU - MEL - MLZ - CEL - RIB - XYL - CAT + BH/CO +

1-2: 황색포도상구균에 특이적인 박테리오파지의 분리

다음 단계로서, 분리된 황색포도상구균에 특이적인 박테리오파지를 분리하기 위해 박테리오파지가 있을 것으로 예상되는 시료를 황색포도상구균과 함께 배양하였다. 이 배양액을 원심분리하여 상등액을 얻은 후 이를 여과한 다음, 배양된 황색포도상구균을 박테리오파지 분리를 위한 미끼로 상기 여과액과 함께 다시 배양하여 황색포도상구균의 사멸 여부를 확인하였다. 사멸 여부 확인은 최종적으로 용균반 분석(plaque assay)을 통해 판별하였다.

이를 상세히 설명하면, 황색포도상구균을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 박테리오파지를 분리하기 위하여 박테리오파지가 존재할 것이라 예상되는 우사 내의 토양, 지푸라기, 흙, 및 하수 등에서 검체를 채집한 후, 상기 실시예 <1-1>에서 얻은 황색포도상구균과 함께 37℃에서 3-4시간 동안 진탕배양 후, 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액을 0.45 ㎛의 필터를 이용하여 여과해준 후, 이렇게 얻어진 여과액을 이용한 용균반 분석을 통해 황색포도상구균에 특이적인 박테리오파지 2종을 검출하였다.

얻어진 박테리오파지들의 형태를 관찰하기 위해 염화세슘(CsCl) 밀도 구배법(밀도: 1.15 g/㎖, 1.45 g/㎖, 1.50 g/㎖ 및 1.70 g/㎖)을 이용한 원심분리(38,000 rpm, 22시간, 4℃)를 통하여 박테리오파지를 정제한 다음, 이를 구리 격자(cupper grid)에 묻히고, 2% 유라닐 아세테이트(Uranyl acetate)를 이용한 역염색법(negative staining)과 건조를 수행한 후, 전자현미경을 통하여 그 형태를 촬영하였다. 그 결과 분리된 박테리오파지가 형태학적 분류상 미오비리대 과(Myoviridae family) T4-유사 파지 속(T4-like phage genus) 및 포도비리대 과(Podoviridae family) φ29-유사 바이러스 속(φ29-like virus genus)에 속하는 것을 확인할 수 있었다 (도 1). 분리된 미오비리대 과 T4-유사 파지 속 박테리오파지를 SAP-1로 명명하였으며 이를 2006년 6월 14일자로 농업생명공학연구원(기탁번호 KACC 97001P)과 2007년 7월 18일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터 (기탁번호 KCTC 11153BP)에 재차 기탁하였다. 또 함께 분리된 포도비리대 과 φ29-유사 바이러스 속 박테리오파지는 SAP-2로 명명하였으며 이를 2007년 7월 18일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(기탁번호 KCTC 11154BP)에 기탁한 바 있다.

실시예 2: 황색포도상구균에 특이적인 분리된 박테리오파지 SAP-1 및 SAP-2의 유전적 특성 분석

2-1: SAP-1의 유전적 특성 분석

얻어진 SAP-1 박테리오파지의 유전적 특성 분석을 실시하였다. 이를 위해 박테리오파지의 유전체를 통상의 방법으로 추출한 다음 유전적 특성을 분석하였다. 구체적으로, 먼저 1 ℓ 플라스크에 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지(카제인 다이제스트, 17 g/ℓ; 소이빈 다이제스트, 3 g/ℓ; 덱스트로스, 2.5 g/ℓ; NaCl, 5 g/ℓ; 디포타슘 포스페이트, 2.5 g/ℓ) 200 ㎖에 600 nm에서 흡광도가 1인 황색포도상구균 부유액 50 ㎖ 및 1× 10⁸ pfu/㎖ 수준으로 여과한 박테리오파지 용액 1 ㎖을 첨가하여 37℃에서 3-4시간 진탕배양 하였다. 배양 후, 황색포도상구균이 용균되었는지 여부를 확인한 다음, 용균이 일어났을 때 이 배양액을 0.45 ㎛의 필터로 여과해 주었다. 그 후 여과액에 여과액 부피의 6분의 1 부피에 해당하는 20%의 수분자량 8,000의 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)/2.5 M NaCl 수용액을 첨가한 다음, 4℃에서 하룻밤 동안 정치시켰다. 그 후 정치한 액을 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 박테리오파지를 침전물로부터 회수하였다. 이렇게 얻어진 박테리오파지 침전물을 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS) 1 ㎖로 부유시킨 후, 다시 20% 폴리에틸렌 글리콜 8,000/2.5 M NaCl 수용액을 6분의 1 부피만큼 첨가한 다음 4℃에서 1시간 동안 정치시켰다. 1시간이 지난 후, 정치했던 액을 14,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 정제된 박테리오파지 침전물을 얻었다. 이 침전물을 요오드 완충액(iodide buffer; 10 mM Tris-HCl(pH 8.0),1 mM EDTA, 4 M NaI) 200 ㎕를 이용해 가볍게 섞어준 다음 이를 15분간 상온에서 정치한 후 DNeasy 티슈(Tissue) 키트(Kit)(QIAGEN사)와 PCR 정제 키트(Labopass사)를 이용하여 박테리오파지의 유전체를 추출하였다.

위와 같이 분리된 박테리오파지의 유전체는 게놈 DNA(genomic DNA; gDNA)이다. 전체 gDNA의 크기가 커서 직접 서열분석은 곤란하여 gDNA 라이브러리를 구축한 다음 이를 이용하여 서열 분석을 실시했다. 제한효소 Msp I을 이용하여 gDNA의 라이브러리를 통상의 방법에 따라 구축하였고 gDNA의 라이브러리 구축에 사용된 방법이 도 2에 모식적으로 제시되어 있다.

이를 상세히 설명하면, 먼저 다양한 유전자 단편을 얻기 위해서, 제한 효소 Msp I으로 추출된 gDNA를 30℃에서 1분간 처리하여 gDNA를 부분적으로 절단시켰다. 절단 후, 절단되어 유리된 유전자 단편들을 T4 리가아제(ligase)를 이용해 pBluescript II SK(+) 파지미드 벡터(phagemid vector)(Stratagene사)에 도입시켰다. 이렇게 하여 준비된 박테리오파지의 유전자 단편이 도입된 재조합 벡터를 전기천공법(electroporation)이라는 전기적 형질전환 방법(electro-transformation)을 통해 대장균의 한 종인 Top10F' 종 (Invitrogen사)에 도입시켰다. 이렇게 하여 형질전환된 형질전환체를 엑스-갈(X-Gal; 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside) 및 이소프로필 베타-디-1-티오갈락토피라노시드(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside; IPTG)가 첨가된 암피실린(ampicillin) 함유 아가 평판배지 상에서 통상의 청백 콜로니 선별법(Blue-White colony selection)을 통해 선별하였다. 선별된 단일 콜로니(colony)를 암피실린이 포함된 배양배지에 접종한 후 하룻밤동안 진탕배양하였다. 이 배양 세포로부터 플라스미드(plasmid) 정제 키트(iNtRON Biotechnology사)를 이용하여 플라스미드를 추출하였다. 이 추출된 플라스미드는 0.8% 아가로즈 젤을 이용한 전기영동을 통하여 그 크기를 확인하였으며 확인된 크기를 바탕으로 재조합된 플라스미드를 선별하였다.

이렇게 선별된 플라스미드는 51개였으며 이에 해당하는 클론(clone)도 당연히 그 플라스미드 수만큼 51개를 얻을 수 있었다. 이 클론들을 다시 배양하여 배양 세포로부터 다시 플라스미드를 상기 방법과 같이 추출하였고, 추출된 플라스미드를 이용하여 염기 서열을 분석하였다. 염기 서열 분석은 통상의 염기 서열 분석에서 널리 이용되는 프라이머(primer)인 M13 정방향(forward) 프라이머와 M13 역방향(reverse) 프라이머를 이용해 수행하였다. 각 프라이머의 서열은 다음과 같다.

Primer	Sequence
M13 정방향 프라이머	GTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCG
M13 역방향 프라이머	TCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCT

이렇게 하여 얻어진 유전자 서열은 분리된 SAP-1 박테리오파지의 전체 유전체를 구성하는 부분서열로서 서열번호 1 내지 서열번호 26으로 제시하였다.

분석된 박테리오파지의 염기 서열을 기반으로 Web상의 BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)를 이용하여 기존 알려진 박테리오파지 유전자와의 상동성을 조사해 보았다. BLAST 조사 결과, 분석된 박테리오파지의 염기 서열은 박테리오파지 G1(Bacteriophage G1)과 가장 높은 상동성을 가지는 것으로 확인되었다. 유전체 각 부분의 유전적 기능을 파악하기 위해 상동성이 가장 높았던 박테리오파지 G1의 유전자 서열을 기반으로 하여 번역영역(Open Reading Frame; ORF) 분석을 NCBI ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)와 Vector NTI ContigExpress (INFORMAX사) 프로그램을 이용하여 실시하였다. 이로부터 해당 박테리오파지의 용균 단백질의 유전자 서열을 확보할 수 있었다. 유전자 서열 분석을 통하여 얻어진 용균관련 유전자의 전체 서열은 서열번호 27로 기재되는 염기 서열을 가지며, 이 유전자 서열로부터 번역될 단백질은 서열번호 28로 기재되는 아미노산 서열을 갖는다. 이 SAP-1 유래의 용균 단백질을 SAL-1로 명명하였다.

2-2: SAP-2의 유전적 특성 분석

얻어진 SAP-2 박테리오파지의 유전적 특성 분석을 실시하였다. 이를 위해 SAP-2 박테리오파지의 유전체를 통상의 방법으로 추출한 다음 유전적 특성을 분석하였다. 구체적으로, 먼저 1 ℓ 플라스크에 TSB배지 200 ㎖에 600 nm에서 흡광도가 1인 황색포도상구균 부유액 50 ㎖ 및 1× 10⁸ pfu/㎖ 수준으로 여과한 박테리오파지 용액 1 ㎖을 첨가하여 37℃에서 3-4시간 진탕배양 하였다. 배양 후, 황색포도상구균이 용균 되었는지 여부를 확인한 다음, 용균이 일어났을 때 이 배양액을 0.45 ㎛의 필터로 여과해 주었다. 그 다음 이 여과한 배양액에 남아 있을 황색포도상구균의 DNA와 RNA를 제거하기 위해 이 여과한 배양액 10 ㎖에 DNase I와 RNase A 각각을 200 U씩 첨가한 다음 37℃에서 30분간 방치하였다. 그 후 DNase I와 RNase A의 활성을 제거하기 위해 0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA) 500 ㎕를 첨가한 후 10분간 정치시켰다. 그 다음 단계로 박테리오파지 외벽을 와해시키기 위해 proteinase K (20 ㎎/㎖) 100 ㎕와 10% 도데실 황산 나트륨염(Sodium Dodecyl Sulfate; SDS) 500 ㎕를 첨가한 다음 65℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 반응 후, 이 반응액에 25:24:1의 구성비를 갖는 페놀(phenol) : 클로로포름(chloroform) : 이소아밀알코올(isoamylalcohol)의 혼합액 10 ㎖를 첨가해 준 후 잘 섞어 주었다. 그리고는 이것을 18,000 rpm에서 원심분리하여 층이 분리되게 한 다음 분리된 층중에서 위층을 취하고 여기에 2부피비의 차가운 100% 알코올을 가하여 순수한 유전체만을 추출하였다.

위와 같이 분리된 박테리오파지의 유전체는 gDNA이다. SAP-2 박테리오파지의 gDNA의 크기가 크지 않아 직접 gDNA의 염기 서열을 분석하였다.

SAP-2 박테리오파지의 gDNA을 이용한 직접 염기 서열 분석에 사용한 프라이머는 다음의 표와 같다.

Primer	Sequence
T7 promoter	TAATACGACTCACTATAGGGCGA
SP6 promoter	GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT
1	CGTAATGCTTCAAAATGTTC
2	GAGCAATGTTAGTTGATTACTCATT
3	CCATTTAAAAAATAATCATCACGTT
4	TGCAATTCATATATTAGATGATAA
5	TATGCTTTATATGGAGGTTGATAAC
6	AATTAGTGTACCGTCACCTAAAGA
7	TGCAACACCATCGTGATGTA
8	GTTGTTGAACATCGCAACAG
9	CAAAATCTGATAAAAACGTCAT
10	GACGTGATGAGGATTATTAT
11	ATAAATTCTCTTTCTTTTTCCTCAAATTCAAATCTCGCTAATGT
12	CATACGTGGATAATTACGTTTCAACATTAATTCCTCATTT
13	ATCAAATTCATTTAAAATTTTCTTTCT
14	AATGTCACCTATGTTTAATGCAGA
15	AGTTCATCATTTAAGAATTGAACAACAGAACT
16	TTTGTTGCTCTAATGATGTAATACGTTGTTCTAATATAACAG
17	TCACTTGCAATAATACCACTTTCTAAT
18	GTCAAGTATCATTTTAATACAATTT
19	TCATTATACATTACGTGACGCTTA
20	AGCTTCTCTTTCTTTTTTCCATCTA
21	GAACTTCATTGTATTTAGCGCTGTTG
22	TGAATCTTCATATGGTCGACCTGCAG
23	ATTTAATAGTTTTGCACAAGTACCAA
24	CAAACTAACCCATCTGATAAACAAAC
25	AACCTAATGGCTATTGGTTCCAACCA
26	GGTAACAGTTCAGTTAATTCACAT
27	GGTGCCATAATTTATTATTCCTCC
28	TTAATCGTACCTAATTTAATATCAC
29	AACGTAAATCGTTATTACTTGCAATG
30	CGTTACAACACCCGGAGAATATTA
31	CCAAATGTCCAAGATTTTGAATAA
32	TTTAAAATGTACAGGTACGTATAC
33	TTGAATTTAACGAATATAATTTGGC
34	ATATTATCATGATTGCACATAACTG
35	GTAAAAGGTTATGGACGTTTTAAT
36	AATTTTTATGACTATATAAAATCATT
37	ACAAAAAACATTTAACAACACGTAT
38	AAATAAAATACAAAACATAATCAAT

상기 방법을 통하여 확보된 SAP-2 박테리오파지의 전체 유전자의 염기 서열은 서열번호 29로 제시되어 있다. 최종적인 SAP-2 박테리오파지 유전체의 총 구성 염기 수는 17938개였다.

분석된 박테리오파지의 염기 서열을 기반으로 Web상의 BLAST를 이용하여 기존 알려진 박테리오파지 유전자와의 상동성을 조사해 보았다. BLAST 조사 결과, 분석된 박테리오파지의 염기 서열은 황색포도상구균 파지 파이 P86(Staphylococcus aureus phage phi P68)과는 86.0%의 상동성을, 44AHJD 및 박테리오파지 66(Bacteriophage 66)은 각각 81.1% 및 49.2%의 상동성을 가지는 것으로 확인되었다. 유전체 각 부분의 유전적 기능을 파악하기 위해 상동성이 가장 높았던 황색포도상구균 파지 파이 P86의 유전자 서열을 기반으로 하여 번역영역 분석을 NCBI ORF finder와 Vector NTI ContigExpress 프로그램을 이용하여 실시하였다. 또한 2003년에 FEMS Microbiology Letters(2003, 219: 275-283)에 발표되었던 ‘Complete nucleotide sequence and molecular characterization of two lytic Staphylococcus aureus phages: 44AHJD and P68’라는 제목의 논문과 비교하면서 ORF의 유사성이 어느 정도 되는지 비교하였다. 이로부터 해당 박테리오파지의 용균단백질의 유전자 서열을 확보할 수 있었다. SAP-2 박테리오파지 유전체에서 용균단백질을 코딩(coding)하고 있는 유전자의 크기는 750bp이며 이로부터 발현된 용균단백질은 250개의 아미노산으로 구성되어 있다. 이 용균단백질을 코딩하고 있는 유전자 서열은 서열번호 30으로 제시되어 있고, 용균단백질의 아미노산 서열은 서열번호 31로 제시되어 있다. 이 SAP-2 유래의 용균단백질을 SAL-2로 명명하였다.

실시예 3: 용균관련 유전자의 클로닝 및 발현 벡터 제작

3-1: 용균단백질 SAL-1의 발현 벡터 제작

앞서 실시예 <2-1>에서의 유전자 서열 분석 및 ORF분석을 통하여 SAL-1 용균단백질의 유전자 서열을 찾을 수 있었다. 용균관련 유전자로부터 목적하는 용균단백질의 발현을 위해 pBAD-TOPO 벡터(Invitrogen 사)를 이용하여 단백질 대량 발현 벡터시스템을 구축하였다. 클로닝에는 Nco I과 Not I 제한효소 자리를 이용하였고 통상의 일반적인 방법을 그대로 따랐다. 이를 위해 클로닝 전에 미리 pBAD-TOPO 벡터 내에 존재했던 엔테로키나아제 자리(Enterokinase cleavage site)를 없애고 Not I 제한효소 자리를 삽입시킨 것을 준비한 다음 클로닝에 이용하였다. 이렇게 제작된 용균단백질의 발현 벡터를 pBAD-TOPO-SAL1로 명명하였다. 이 용균단백질의 발현 벡터를 이용하여 대장균 BL21 (DE3)(Novagen사)을 형질전환 시켜 용균단백질의 생산 균주를 제작하였다. 이렇게 제작된 용균단백질의 생산 균주는 2007년 7월 18일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다 (기탁번호 KCTC 11151BP).

3-2: 용균단백질 SAL-2의 발현 벡터 제작

앞서 실시예 <2-2>에서의 유전자 서열 분석 및 ORF분석을 통하여 SAL-2 용균단백질의 유전자 서열을 찾을 수 있었다. 용균관련 유전자로부터 목적하는 용균단백질의 발현을 위해 pBAD-TOPO 벡터를 이용하여 단백질 대량 발현 벡터시스템을 구축하였다. 클로닝에는 Nco I과 Not I 제한효소 자리를 이용하였고 통상의 일반적인 방법을 그대로 따랐다. 이를 위해 클로닝 전에 미리 pBAD-TOPO 벡터 내에 존재했던 엔테로키나아제 자리를 없애고 Not I 제한효소 자리를 삽입시킨 것을 준비한 다음 클로닝에 이용하였다. 이렇게 제작된 용균단백질의 발현 벡터를 pBAD::lysinM으로 명명하였다. 이 용균단백질의 발현 벡터를 이용하여 대장균 Origami (DE3)(Novagen사)을 형질전환 시켜 용균단백질의 생산 균주를 제작하였다. 이렇게 제작된 용균단백질의 생산 균주는 2007년 7월 18일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다 (기탁번호 KCTC 11152BP).

실시예 4: 용균단백질의 과발현

실시예 3에서 제작된 재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균을 이용하여 용균단백질을 과발현시켰다. 용균단백질 SAL-1 및 SAL-2 모두 그 방법은 대략적으로는 비슷하다. pBAD-TOPO 벡터 기반의 발현시스템은 L-아라비노즈(arabinose)를 이용하여 과발현을 유도(induction)하는 방식으로, 박테리아에 해로운(toxic) 유전자의 경우에도 원활히 발현시킬 수 있는 장점을 지닌 발현 벡터 시스템이다(제작사의 “pBAD expression system"이라는 제목의 설명서 및 제작사의 2004년 발행 설명서 25-0257호).

과발현 유도 과정을 상세히 제시하면 다음과 같다. 제작된 벡터에는 암피실린 저항성 유전자가 존재하므로 모든 배양 배지에는 암피실린을 포함시켰다. 또 용균단백질 SAL-2의 발현 경우에는 Origami (DE3)를 생산균주로 사용했는데 이 생산균주 자체에 테트라사이클린 내성 유전자가 존재하기 때문에 용균단백질 SAL-2의 발현 경우에는 암피실린과 테트라사이클린이 모두 포함된 배지를 사용하였다. 배양 배지로는 LB배지(트립톤, 10 g/L; 효모 추출물, 5 g/L; 염화나트륨, 10 g/L)를 사용하였다. 각각 상기에 설명한 적절한 항생제가 포함된 LB 배지 5㎖에 제작된 각각의 용균단백질의 생산 균주를 접종한 다음 37℃에서 한밤동안 진탕 배양한다. 이렇게 밤새 배양한 각각의 배양액에서 100 ㎕씩을 취해 적절한 항생제가 포함된 각각의 새로운 LB배지 10 ㎖에 재접종하여 37℃에서 다시 진탕 배양한다. 생산 균주의 세포 농도가 600 nm에서의 흡광도 기준으로 0.8에서 1 사이 (용균단백질 SAL-1의 경우) 또는 0.5 (용균단백질 SAL-2의 경우)가 되었을 때, 최종 농도가 0.2%가 되도록 L-아라비노즈를 첨가하여 용균단백질의 발현을 유도하였다. 발현 유도 시, 용균단백질 SAL-1의 경우는 계속 배양 온도를 37℃로 유지하였고, 용균단백질 SAL-2의 경우에는 발현 유도를 한 직후부터는 배양온도를 23℃로 변경하였다. 발현 유도를 위한 추가 배양은 용균단백질 SAL-1의 경우는 4시간, 용균단백질 SAL-2의 경우는 12시간 해 주었다. 배양 종료 후, 세포 배양액 1 ㎖을 취하여 8,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포 침전물을 회수하였다. 회수된 세포 침전물에 1% SDS 용액 100 ㎕를 가하여 세포를 파쇄한 다음, 세포 파쇄액 중 12 ㎕를 취하여 전기영동용 시료로 사용하였다. 취한 세포 파쇄액에 통상의 전기영동에 사용되는 5× 전기영동용 샘플 완충액(sample loading buffer) 3 ㎕를 첨가하여 잘 혼합하고 5분간 물중탕으로 끓여주는 방식으로 시료를 처리한 다음, 통상의 방법에 따라 전기영동을 실시하여 과발현된 용균단백질을 확인하였다. 그 결과가 도 3에 제시되어 있다.

실시예 5: 발현된 용균단백질의 분리 정제

5-1: 용균단백질 SAL-1의 분리 정제

형질전환체의 LB 배지를 이용한 배양액 500 ㎖을 8,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포침전물을 얻었다. 이를 1 mM의 페닐메틸술포닐 플루오라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride)가 포함된 6 ㎖의 20 mM 인산나트륨(sodium phosphate) 완충액(pH 6.0)에 부유시켰다. 여기에 리보소말(ribosomal) 단백질의 침전을 유발시키기 위해 2 ㎎의 스트렙토마이신 설페이트(streptomycin sulfate)를 추가로 넣어주었다. 이렇게 준비된 세포 부유액을 초음파 분쇄법(sonication)을 사용하여 세포를 파쇄하였다. 초음파 분쇄법의 적용 조건은 20초간 초음파를 가하여 세포를 깨고 5초간 멈추는 것을 총 20분간 반복하여 실시하였다. 이렇게 하여 얻어진 세포 파쇄액(whole cell lysate)을 8,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거하였다. 이 원심분리를 통하여 얻어진 상등액은 35%(w/v)의 암모늄 설페이트 침전법으로 발현된 용균단백질을 농축하였다. 이를 자세히 설명하면, 최종 농도가 35%(w/v)가 되게 암모늄 설페이트를 첨가한 후, 그 암모늄 설페이트 첨가액을 얼음 속에 15분간 정치시켜 단백질이 원활히 침전되도록 하였다. 15분간의 정치 후, 혼합액을 10,000× g에서 15분간 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 이를 크로마토그라피에서 사용할 흡착 완충액(adsorption buffer; 50 mM 인산나트륨(sodium phosphate), 0.25 M 염화나트륨(sodium chloride), pH 6.5) 2 ㎖을 사용하여 녹였다. 이렇게 준비된 단백질 용액을 과량 포함된 암모늄 설페이트를 제거하기 위해 흡착 완충액에 대하여 간간이 흡착 완충액을 교환해 주면서 4℃에서 밤새도록 투석을 실시하였다. 투석이 완료된 단백질 용액을 10,000× g에서 25분간 원심분리하여 불용성 물질을 제거해 주었다. 이렇게 준비된 단백질 용액을 마지막으로 0.2 ㎛ 필터로 여과한 다음 양이온-교환 크로마토그라피(cation-exchange chromatography)를 수행하였다. 이때, 양이온-교환 수지(resin)로는 CM-세파덱스 C-50(CM-Sephadex C-50, Pharmacia사)을 사용하였으며, 이는 약한(weak) 양이온-교환 수지에 해당한다. CM-세파덱스 C-50은 2× 7 ㎝로 칼럼에 충진하여 사용하였으며 총 충진 부피는 약 14 ㎖이었다. 크로마토그라피는 칼럼을 흡착 완충액으로 미리 평형화시킨 다음 실시하였고, 용균 단백질액을 칼럼에 적하(loading)한 다음에는 100 ㎖의 흡착 완충액으로 세척 단계를 실시하였다. 이 조건에서는 대장균 유래의 다른 단백질은 거의 칼럼의 충진 수지에 붙지 않았다. 최종적으로 용균단백질은 0.2 에서 0.8 M까지 농도를 변화시킨 염화나트륨를 포함한 50 mM의 인산나트륨 용액(pH 6.5)을 사용하여 용출하였다. 용균단백질을 포함한 용출액 분획(fraction)은 50 mM의 인산나트륨 용액 (pH 6.5)에 대하여 간간히 인산나트륨 용액을 교환해 주면서 4℃에서 밤새도록 투석하여 용균단백질의 용출에 사용된 염화나트륨을 제거하였고, 이 투석액을 건조한 폴리에틸렌 글리콜 20,000에 대하여 투석을 실시하여 마지막으로 농축하였다.

5-2: 용균단백질 SAL-2의 분리 정제

LB 배지를 이용한 형질전환체의 배양액 500 ㎖을 8,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포침전물을 얻었다. 이를 6 ㎖의 80 mM 트리스-염산(Tris-HCl, pH 4.0) 완충액에 부유시켰다. 이렇게 준비된 세포 부유액을 통상의 얼리고 녹이기(freezing/thawing) 방법으로 세포를 파쇄하였다. 얼리고 녹이기의 적용 조건은 액체질소를 사용하여 얼리고 이를 30℃에서 5분간 항온하여 녹이는 것을 총 8회 반복하여 실시하였다. 이렇게 하여 얻어진 세포 파쇄액을 8,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거하였다. 이 원심분리를 통하여 얻어진 상등액은 30%(w/v)의 암모늄 설페이트 침전법으로 발현된 용균단백질을 농축하였다. 이를 자세히 설명하면, 최종 농도가 30%(w/v)가 되게 암모늄 설페이트를 첨가한 후, 그 암모늄 설페이트 첨가액을 얼음 속에 15분간 정치시켜 단백질이 원활히 침전되도록 하였다. 15분간의 정치 후, 혼합액을 10,000× g에서 15분간 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 이를 크로마토그라피에서 사용할 흡착 완충액(25 mM 인산나트륨, pH 5.8) 2 ㎖을 사용하여 녹였다. 이렇게 준비된 단백질 용액에 과량 포함된 암모늄 설페이트를 제거하기 위해 간간이 흡착 완충액을 교환해 주면서 4℃에서 밤새도록 투석을 실시하였다. 투석이 완료된 단백질 용액을 10,000× g에서 25분간 원심분리하여 불용성 물질을 제거해 주었다. 이렇게 준비된 단백질 용액을 마지막으로 0.2 ㎛ 필터로 여과한 다음 양이온-교환 크로마토그라피를 수행하였다. 이때, 양이온-교환 수지로는 HiTrap SPFF(GE Healthcare사)을 사용하였으며, 이는 강한(strong) 양이온-교환 수지에 해당한다. 크로마토그라피는 칼럼을 흡착 완충액으로 미리 평형화시킨 다음 실시하였고, 용균 단백질액을 칼럼에 적하한 다음에는 100 ㎖의 흡착 완충액으로 세척 단계를 실시하였다. 이 조건에서는 대장균 유래의 다른 단백질은 거의 칼럼의 충진 수지에 붙지 않았다. 최종적으로 용균단백질은 0.2 에서 0.8 M까지 농도를 변화시킨 염화칼륨을 포함한 25 mM의 인산나트륨 용액(pH 5.8)을 사용하여 용출하였다. 용균단백질을 포함한 용출액 분획은 25 mM의 인산나트륨 용액 (pH 5.8)에 대하여 간간히 인산나트륨 용액을 교환해 주면서 4℃에서 밤새도록 투석하여 용균단백질의 용출에 사용된 염화칼륨을 제거하였고, 이 투석액을 건조한 폴리에틸렌 글리콜 20,000에 대하여 투석을 한 번 더 실시하여 마지막으로 농축하였다.

실시예 6: 용균단백질의 항균 활성 조사

실시예 5에서 분리 정제된 용균단백질의 항균 활성을 조사해 보았다. 항균 활성 확인에 사용된 박테리아는 실시예 1에서와 같은 방법으로 본 발명자들이 임상적으로 분리하여 동정(identification)하여 확보하고 있던 황색포도상구균이었다.

실험방법은 TSB 배지에 600 ㎚에서 흡광도가 1 정도 되는 황색포도상구균 배양액 1 ㎖을 각각 평판배지에 도말하여 말린 후, 앞에서 준비한 용균단백질을 포함한 단백질액 5 ㎕를 떨어뜨린 후 37℃ 배양기에서 밤새도록 배양하여 황색포도상구균의 용균 정도를 확인하였다. 그 결과로 도 4에 제시된 바와 같이 용균단백질에 의한 용균 작용으로 투명해 지는 용균반이 형성되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7: 균막 제거 능력 조사

7-1: 균막 생성 황색포도상구균의 선별

박테리오파지 또는 그것 유래의 용균단백질을 포함한 조성물이 균막 제거 능력이 있는가를 조사하기 위해, 일차적으로 균막을 형성할 수 있는 황색포도상구균을 선별했다. 균막을 형성할 수 있는 황색포도상구균을 선별하기 위해 균막 형성과 관련이 있는 유전자의 존재 여부를 먼저 조사하였다. 이를 상세히 설명하면, 균막 형성에는 PIA(polysaccharide intercellular adhesion)가 중요하다 (Science 284: 1523-1527, 1999). 이 PIA의 생합성(biosynthesis)에는 ica C(1054 bp) 유전자가 관련된다(J Clin Microbiol 39: 2151-2156, 2001; Infect Immun 67: 5427-5433, 1999). 총 3개의 황색포도상구균에 대하여 균막 형성여부를 조사하기 위해 ica C 유전자의 존재 여부를 PCR을 통하여 조사하였다. 이를 위하여 다음과 같은 PCR용 프라이머를 제작하였다.

Primer	Sequence
ica C F	ATGAAAAAGATTAGACTTGAACTC
ica C R	TTAATAAGCATTAATGTTCAATT

PCR을 수행한 결과 1개의 황색포도상구균(본 발명자들은 이 황색포도상구균을 SA1이라 명명했다)이 ica C 유전자를 갖고 있음을 확인할 수 있었다 (도 5). 즉 이 SA1 황색포도상구균은 균막 형성 능력을 갖고 있을 가능성이 매우 높다. 그 다음으로 이 SA1 황색포도상구균이 균막을 형성할 수 있는지를 조사해 보았다. 이를 상세히 설명하면, SA1 황색포도상구균을 0.25% D-(+)-포도당(D-(+)-glucose)을 포함한 5 ㎖의 TSB 배지에서 한밤 배양하였다. 이 SA1 황색포도상구균의 배양액을 D-(+)-포도당이 포함된 TSB 배지를 사용하여 1:50으로 희석한 후, 96 웰 플레이트(well plate; polystyrene, corning)에 200 ㎕씩 분주하였다. 이를 37℃ 배양기에서 24시간동안 100 rpm으로 진탕배양 하였고, 24시간 배양 후 증발된 배지를 보충하기 위해 50 ㎕의 0.25% D-(+)-포도당을 포함한 TSB 배지를 추가로 첨가한 다음 37℃에서 24시간동안 한번 더 배양하였다. 추가 배양 후, 200 ㎕의 인산완충식염수로 각 웰을 세척해 준 다음 균막 형성여부를 조사하였다. 도 6에서 알 수 있듯이 선별된 SA1 황색포도상구균은 균막을 형성하였다.

7-2: 균막 제거 능력

균막을 생성하는 황색포도상구균 SA1을 대상으로 하여 본 발명의 박테리오파지와 그것으로부터 유래한 용균단백질이 균막을 제거할 수 있는 활성을 가지고 있는지에 대해 조사하였다. 실험 방법은 Wu 등이 발표한 방법(biofilm plate assay)을 따랐다(Antimicrob Agents Chemother 47: 3407-3414, 2003). 이를 상세히 설명하면, 먼저 황색포도상구균 SA1을 0.25% D-(+)-포도당을 포함한 5 ㎖의 TSB 배지에서 한밤 배양하였다. 이 SA1 황색포도상구균의 배양액을 D-(+)-포도당이 포함된 TSB 배지를 사용하여 1:50으로 희석한 후, 96 웰 플레이트에 200 ㎕씩 분주하였다. 이를 37℃ 배양기에서 24시간동안 100 rpm으로 진탕배양 하였고, 24시간 배양 후 증발된 배지를 보충하기 위해 50 ㎕의 0.25% D-(+)-포도당을 포함한 TSB 배지를 추가로 첨가한 다음 37℃에서 24시간 동안 한번 더 배양하였다. 추가 배양 후, 200 ㎕의 인산완충식염수로 세척해 준 다음 박테리오파지 부유액과 용균단백질을 포함한 용액을 각각 구별하여 별도로 각 웰에 첨가해 준 후 24시간 동안 정치시켰다. 24시간 정치 후, 배지를 제거한 다음 인산완충식염수로 각 웰을 세척해 주었다. 이 후 플레이트를 건조시킨 다음 200 ㎕의 사프라닌(safranin)으로 1시간 동안 처리하여 균막의 제거 정도를 가시적으로 확인하였다. 그 결과가 도 7에 제시되어 있다. 본 실시예에서는 SA1 황색포도상구균에 의해 형성된 균막이 SAP-1 박테리오파지, SAP-2 박테리오파지, 및 이 두 박테리오파지 유래의 용균단백질들에 의해서 제거될 수 있음을 보여 준다. 또 박테리오파지 부유액 보다는 용균단백질을 포함한 용액이 균막 제거에 더 효과적임도 알 수 있다. 따라서 박테리오파지를 사용하는 것에 비해 박테리오파지 유래의 용균단백질을 이용하는 것이 균막 제거에는 보다 바람직하다고 할 수 있다. 균막의 제거는 당연히 균막의 외막의 파괴로부터 시작되므로 SAP-1 박테리오파지, SAP-2 박테리오파지, 및 이 두 박테리오파지 유래의 용균단백질들이 균막에 존재하는 외막의 파괴에도 효과적이라 할 수 있다.

실시예 8: 균막 형성 방지능 조사

박테리오파지 또는 그것 유래의 용균단백질을 포함한 조성물이 균막 형성 억제 능력이 있는가를 조사하기 위해, 의료용 카테터를 사용하여 조사해 보았다. 통상 의료용으로 사용되는 카테터(Silicone elastomer coated foley balloon catheter; (주)세운메디컬)를 1 ㎝길이로 잘라 카테터 조각 15개를 준비했다. 이 15개의 카테터 조각을 이용하여 3개는 아무처리도 하지 않고 나머지 12개는 3개씩 그룹으로 나누어 한 그룹은 SAP-1 박테리오파지를 포함한 인산생리식염수를, 또 한 그룹은 SAP-2 박테리오파지를 포함한 인산생리식염수를, 또 한 그룹은 SAP-1 박테리오파지 유래의 용균단백질인 SAL-1을 포함한 인산생리식염수를, 나머지 한 그룹은 SAP-2 박테리오파지 유래의 용균단백질인 SAL-2를 포함한 인산생리식염수를 사용하여 표면처리를 해 주었다. 이 때 사용한 박테리오파지를 포함한 조성물에서 박테리오파지의 농도는 1 × 10¹⁰ pfu/㎖이었고 용균단백질을 포함한 조성물에서 용균단백질의 농도는 0.005% (w/v)였다. 표면처리는 박테리오파지를 포함한 조성물 또는 용균단백질을 포함한 조성물에 카테터 조각을 완전히 잠기게 하는 방법으로 실시하였다(1시간). 표면처리 후, 모든 카테터 조각에 실시예 <7-2>와 같이 배양한 SA1 황색포도상구균의 배양액을 D-(+)-포도당이 포함된 TSB 배지를 사용하여 1:50으로 희석한 다음 이 희석액을 카테터 조각 표면에 골고루 분무해 주었다. 이 때 카테터 내부(lumen)도 분무될 수 있도록 하였다. 이를 무균실험대 속에서 하이브리다이제이션(hybridization) 장치를 이용하여 37℃로 유지하며 24시간동안 배양하였다. 24시간 배양 후 증발된 배지를 보충하기 위해 한번 더 0.25% D-(+)-포도당을 포함한 TSB 배지를 추가로 분부해 주었고 그 후 37℃에서 24시간동안 한번 더 배양하였다. 추가 배양 후, 카테터 조각을 길이 방향으로 자른 다음 이를 인산완충식염수로 세척해 주었다. 세척 후 균막 형성 여부를 조사하였다. 그 결과는 다음과 같다.

표면처리 방법 (1 시간 잠기게 하는 방법)	구분
	무처리	SAP-1 박테리오 파지를 포함한 조성물 이용	SAP-2 박테리오 파지를 포함한 조성물 이용	SAP-1 박테리오 파지 유래의 용균단백질 SAL-1을 포함한 조성물 이용	SAP-2 박테리오 파지 유래의 용균단백질 SAL-2를 포함한 조성물 이용
결과	+ + +	- - -	- - -	- - -	- - -
“+”는 균막이 형성된 경우이고, “-”는 균막이 형성되지 않은 경우임. 각 실험당 3개 표시까지가 최대임. 따라서 “+ + +”는 3개 카테터 조각 모두 균막이 형성되었음을 의미하고, “- - -”는 3개 카테터 조각 모두 균막이 형성되지 않았음을 표시함.

상기 실험에서의 표면처리에는 박테리오파지를 포함한 인산생리식염수 또는 그것 유래의 용균단백질을 포함한 인산생리식염수를 사용하였다. 추가적 실험으로, 모든 과정은 앞 실험과 동일하게 하고 단지 표면처리만 다르게 한 실험을 실시해 보았다. 이 실험의 표면처리에서는 박테리오파지 또는 그것 유래의 용균단백질을 포함한 인산생리식염수 대신 통상 카테터의 삽입 때 널리 이용되는 윤활젤리에 같은 농도로 박테리오파지 또는 그것 유래의 용균단백질을 포함시킨 조성물을 이용하여 표면처리 하였다. 이때는 한 시간 잠기게 하는 방법은 사용하지 않고 그냥 골고루 묻혀 주기만 했다. 이 경우에도 앞 실험과 거의 같은 결과를 얻을 수 있었다.

표면처리 방법 (윤활젤리에 포함시켜 묻히는 방법)	구분
	무처리	SAP-1 박테리오 파지를 포함한 조성물 이용	SAP-2 박테리오 파지를 포함한 조성물 이용	SAP-1 박테리오 파지 유래의 용균단백질 SAL-1을 포함한 조성물 이용	SAP-2 박테리오 파지 유래의 용균단백질 SAL-2를 포함한 조성물 이용
결과	+ + +	- - -	- - -	- - -	- - -
“+”는 균막이 형성된 경우이고, “-”는 균막이 형성되지 않은 경우임. 각 실험당 3개 표시까지가 최대임. 따라서 “+ + +”는 3개 카테터 조각 모두 균막이 형성되었음을 의미하고, “- - -”는 3개 카테터 조각 모두 균막이 형성되지 않았음을 표시함.

상기 결과로부터 SA1 황색포도상구균에 의한 균막 형성이 SAP-1 박테리오파지, SAP-2 박테리오파지, 및 이 두 박테리오파지 유래의 용균단백질을 포함한 조성물에 의해서 효과적으로 억제됨을 확인할 수 있다. 이로부터 본 발명의 조성물의 의료용세정제, 소독제를 포함한 환경정화제로 활용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 9: 황색포도상구균의 감염에 기인한 질환의 치료에의 적용예

황색포도상구균이 주요 원인균인 젖소유방염에 감염된 젖소 24두를 대상으로 본 발명의 SAP-1 박테리오파지, SAP-2 박테리오파지, 및 이 두 박테리오파지 유래의 용균단백질들이 유방염 치료에 효과적인지 여부에 대해 조사해 보았다. 젖소를 3두씩 여덟 그룹으로 나누어 한 그룹은 1× 10⁸ pfu/㎖ 농도의 SAP-1 박테리오파지를 포함한 인산생리식염수를, 또 한 그룹은 1× 10⁸ pfu/㎖ 농도의 SAP-2 박테리오파지를 포함한 인산생리식염수를, 또 한 그룹은 0.005%(w/v) 농도의 SAL-1 용균단백질을 포함한 인산생리식염수를, 또 한 그룹은 0.005%(w/v) 농도의 SAL-2 용균단백질을 포함한 인산생리식염수를, 또 한 그룹은 1× 10⁸ pfu/㎖ 농도의 SAP-1 박테리오파지와 1× 10⁸ pfu/㎖ 농도의 SAP-2 박테리오파지를 함께 포함한 인산생리식염수를, 또 한 그룹은 0.005%(w/v) 농도의 SAL-1 용균단백질과 0.005%(w/v) 농도의 SAL-2 용균단백질을 함께 포함한 인산생리식염수를, 나머지 한 그룹에는 1× 10⁸ pfu/㎖ 농도의 SAP-1 박테리오파지, 1× 10⁸ pfu/㎖ 농도의 SAP-2 박테리오파지, 0.005%(w/v) 농도의 SAL-1 용균단백질, 및 0.005%(w/v) 농도의 SAL-2 용균단백질을 함께 포함한 인산생리식염수를 유두를 통하여 매일 주사해 분방에 투여해 주었다. 주사량은 1회당 5 ㎖이었다. 다른 하나의 3두로 구성된 비교 그룹에는 보통의 인산생리식염수 5 ㎖을 같은 방법으로 매일 주사해 주었다. 이와 같은 처치를 10일간 해 주면서 통상의 방법에 따라 젖소로부터 채취된 우유에 포함되어 있는 체세포 수를 검사하였다. 유방염이 발생하면 병원균 침입을 막기 위해 백혈구가 증가하게 되고 병원균과의 전쟁을 통하여 죽은 백혈구 시체를 체세포라 한다. 종류에는 유선상피세포와 면역세포(백혈구) 호증구, 임파구 단핵구 등이 있다. 체세포 검사법으로는 가장 사용이 용이한 직접 현미경 검사법을 활용하였다. 이를 간략히 설명하면, 슬라이드 글라스의 1㎠ 내에 샘플우유를 도말, 건조시켜 염색한 다음 현미경하에 체세포수를 직접 검사하고 현미경계수를 곱하여 원유 1㎖중의 체세포수를 산정하였다. 그 결과는 다음과 같다. 하기 표 7의 결과는 각 실험 그룹의 3두 평균값이고 그 값들이 평균값에서 크게 벗어나지 않아 표준편차의 제공은 생략한다.

황색포도상구균 감염 질환 치료 능력(우유 1 ㎖당 체세포 수)

구분	A	B	C	D	E	F	G	H
처치 전	4.6× 105	5.1× 105	4.8× 105	4.7× 105	5.0× 105	5.1× 105	4.9× 105	5.1× 105
처치 후	6.7× 105	1.6× 105	1.9× 105	2.2× 105	1.9× 105	1.7× 105	1.8× 105	1.7× 105

상기 표에서, A)는 인산생리식염수 주사 결과이고; B)는 SAP-1 박테리오파지를 포함한 인산생리식염수 주사 결과이고; C)는 SAP-2 박테리오파지를 포함한 인산생리식염수 주사 결과이고; D)는 SAP-1 박테리오파지 유래의 용균단백질 SAL-1을 포함한 인산생리식염수 주사 결과이고; E)SAP-2 박테리오파지 유래의 용균단백질 SAL-2를 포함한 인산생리식염수 주사 결과이고; F)SAP-1 박테리오파지와 SAP-2 박테리오파지를 함께 포함한 인산생리식염수 주사 결과이고; G)SAP-1 박테리오파지 유래의 용균단백질 SAL-1과 SAP-2 박테리오파지 유래의 용균단백질 SAL-2를 함께 포함한 인산생리식염수 주사 결과이고; H)SAP-1 박테리오파지, SAP-2 박테리오파지, SAP-1 박테리오파지 유래의 용균단백질 SAL-1, 및 SAP-2 박테리오파지 유래의 용균단백질 SAL-2를 함께 포함한 인산생리식염수 주사 결과이다.

상기 결과에서 보는 바와 같이 본 발명의 박테리오파지 또는 그것 유래의 용균단백질을 포함한 조성물을 주사해 준 경우에만 유의적 수준으로 유방염 치료 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 또는 그것 유래의 용균단백질이 황색포도상구균을 원인으로 하는 감염성 질환의 치료에도 매우 효과적이라는 것을 알 수 있었다. 또 각 박테리오파지 및 그것 유래의 용균단백질의 개별 투여에 비하여 혼합 투여가 최종 얻어지는 결과에서는 비슷하나 치료 효과가 발휘되는데 필요한 시간이 다소 줄어드는 효과가 있음이 확인되었다. 상기 표의 B)부터 E)까지의 결과는 대략 처치 9-10일 경에 얻어지고, F)부터 H)까지의 결과는 처치 7-8일경에 얻어졌다. F)부터 H)까지의 경우는 B)부터 E)까지의 경우에 비하여 유효성분의 절대량이 더 많다. 이에 따라 F) 경우 만에 대하여 각 박테리오파지의 농도를 반으로 줄여 박테리오파지의 절대량을 B)나 C)와 같게 해 준 후 동일한 실험을 실시해 보았다. 이 경우 얻어진 치료 효과가 발휘되는데 필요한 시간은 박테리오파지의 농도를 줄이기 전과 거의 비슷하였고 또 B)나 C)에 비해서는 짧았다. 따라서 혼합 처치의 효과가 있다고 할 수 있다.

또 젖소유방염에 걸린 젖소로부터 채취한 황색포도상구균에 대하여 실시예 <7-1>과 같은 방법으로 균막을 형성하는지를 조사하여 균막 형성능을 가진 황색포도상구균에 의해 감염된 젖소 6두를 선별하였다. 이렇게 선별된 6두의 젖소를 2두씩 3개 그룹으로 나누어 한 그룹은 기존 항생제만을, 또 한 그룹은 1× 10⁸ pfu/㎖ 농도의 SAP-1 박테리오파지, 1× 10⁸ pfu/㎖ 농도의 SAP-2 박테리오파지, 0.005%(w/v) 농도의 SAL-1 용균단백질, 및 0.005%(w/v) 농도의 SAL-2 용균단백질을 함께 포함한 인산생리식염수를 유두를 통하여 매일 5 ㎖씩 주사해 분방에 투여해 주었다. 나머지 한 그룹은 1× 10⁸ pfu/㎖ 농도의 SAP-1 박테리오파지, 1× 10⁸ pfu/㎖ 농도의 SAP-2 박테리오파지, 0.005%(w/v) 농도의 SAL-1 용균단백질, 및 0.005%(w/v) 농도의 SAL-2 용균단백질을 함께 포함한 인산생리식염수 5 ㎖과 기존 항생제를 유두를 통하여 매일 주사해 분방에 투여해 주었다. 이 경우 본 발명의 조성물을 먼저 투여하고 바로 이어서 기존 항생제를 투여해 주었다. 사용한 기존 항생제는 젖소유방염 치료에 널리 사용되는 겐타마이신크림으로 하였다. 본 약제는 실린지(syringe) 1개당 70 ㎎의 겐타마이신(gentamacin)과 2.5 ㎎의 덱사메타손(dexametasone)을 포함하고 있다. 그 결과는 다음과 같다.

황색포도상구균 감염 질환 치료 능력(우유 1 ㎖당 체세포 수)

구분	A	B	C
처치 전	4.7× 105	5.0× 105	4.8× 105
처치 후	4.3× 105	1.8× 105	1.7× 105

상기 표에서, A)는 기존 항생제만을 투여한 경우이고; B)는 본 발명의 2 종의 박테리오파지 및 2 종의 용균단백질을 포함한 인산생리식염수를 투여한 경우이고; C)는 본 발명의 2 종의 박테리오파지 및 2 종의 용균단백질을 포함한 인산생리식염수를 투여와 기존 항생제 투여를 병행한 결과이다.

상기 결과에서 알 수 있듯이, 균막을 형성할 수 있는 황색포도상구균에 의한 감염의 치료에 기존 항생제는 효과가 없는 반면에 본 발명의 조성물에 의한 치료는 효과가 있었다. 따라서 본 발명의 조성물이 균막을 형성할 수 있는 황색포도상구균에 원인한 감염성 질환의 치료에 매우 효과적임을 알 수 있다. 또 B)의 결과를 얻는 데까지는 대략 7일 정도가 걸렸는데 비하여 C)의 결과가 얻어지기까지는 이에 비해 약간 빠른 6일 정도가 걸렸다. 비록 큰 차이는 아니나 기존 항생제와의 병용도 효과적인 것으로 확인되었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 용균반 분석에 의해 황색포도상구균에 특이적인 박테리오파지를 검출한 다음 이를 전자현미경으로 촬영한 사진으로 (A)는 미오비리대과 T4-유사 파지 속 박테리오파지이고 (B)는 포도비리대 과 φ29-유사 바이러스 속 박테리오파지의 사진이다.

도 2는 박테리오파지의 유전체 라이브러리의 구축을 위하여 사용한 방법을 순서대로 보여주는 모식도이다.

도 3은 발현된 용균단백질을 단백질 전기영동으로 확인한 결과를 보여주는 사진으로서, (A)에서 레인 M은 크기 마커(198, 115, 90.5, 61.5, 46.2, 및 37.8 kDa)를 나타내고, 레인 1은 발현된 SAL-1 용균단백질을 포함한 세포 파쇄물(cell lysate)을 보여주고, (B)에서 레인 M은 크기 마커(198, 115, 90.5, 61.5, 46.2, 37.8, 26, 18.5, 및 9 kDa)를 나타내고, 레인 1은 발현된 SAL-2 용균단백질을 포함한 세포 파쇄물(cell lysate)을 보여준다. 각 사진에서 “*”표시는 과발현된 용균단백질 위치를 가리킨다.

도 4는 임상 분리한 황색포도상구균에 대한 용균 활성을 확인한 결과를 보여주는 사진으로서, 투명한 용균반은 용균단백질의 용균 활성에 의해 생성된 것이다.

도 5는 균막 생성 능력이 있는 황색포도상구균을 선별하기 위해 실시한 ica C 유전자에 대한 PCR 결과이다.

도 6은 선별된 SA1 황색포도상구균이 균막을 형성할 수 있음을 보여주는 사진으로서, (A)는 균막이 형성되지 않은 대조 황색포도상구균이고 (B)는 균막이 형 성된 선별된 SA1 황색포도상구균이다.

도 7은 본 발명의 박테리아와 이것 유래의 용균단백질의 SA1 황색포도상구균에 의해 형성된 균막의 제거 능력을 조사한 결과로서, 1번은 용균단백질 SAL-1로 처리한 후 염색한 시료를 나타내고, 2번은 음성 기준으로 어떠한 처리 없이 염색만 한 시료를 나타내고, 3번은 박테리오파지 SAP-2로 처리한 후 염색한 시료를 나타내고, 4번은 용균단백질 SAL-2로 처리한 후 염색한 시료를 나타내고, 5번은 양성 기준으로 리소스타핀으로 처리한 후 염색한 시료를 나타내고, 6번은 단지 PBS만을 첨가해 주었다가 염색한 시료를 나타낸다. 각 처리에서 처리에 사용한 각 성분의 정확한 양적인 고려는 하지 않았다. 사진의 위는 96 웰 플레이트 전체를 보여 주는 사진이고 아래는 플레이트의 각 웰을 조금 더 자세히 보여주는 사진이다.

<110> iNtRon Biotechnology, Inc <120> Bacteriophage or Lytic Protein Derived From the Bacteriophage Which Effective For Treatment of Staphylococcus aureus Biofilm <160> 31 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 776 <212> DNA <213> Bacteriophage SAP-1 partial gene <400> 1 tatgggtata cacaaattat atcaacaatc tgaccaatgg tattatggtc atagatgtca 60 acattgtgat tatttaaatg aaatgagtta taatgattac aaccctgata atcttgaaga 120 aagtgggaat atgttatgtg ttaaccctga aggtgtagat gaacaggcta aaacagtaca 180 gaatggtagt taccaatttg tttgtcaaaa atgcggtaaa ccactagata gatggtataa 240 tggtgagtgg cattgtaagt atcctgagcg tacaaaaggt aataaagggg tacgaggata 300 cctaataaca caaatgaacg ctgtatggat ttctgctgat gaattaaaag aaaaagaaat 360 gaatacagaa tctaagcaag cgttttacaa ttatattttg ggttatccat ttgaagatgt 420 ttaactgaga gttaatgaag aagacgtttt atggtaacaa atcacctatt gcagaaacac 480 aattaatgaa acgagataga tattctcata tagctaatgg tatagattgg ggaaatactc 540 attggataac tgttcatggt atgttaccta atggtaaggt agacttaata cgattattct 600 ctgttaaaag atgaccagac ctgatttagt gaagcagatt tagaaaaatc atttggggaa 660 atatctagta cgacctgata tataatgcga tacggagatc agaaacatgg tctaaactca 720 tatcatttga aagataaagt atttgatgta cgtataatct tcctcttagt ctacag 776 <210> 2 <211> 1424 <212> DNA <213> Bacteriophage SAP-1 partial gene <400> 2 gaagctaaca aggcaattca aaaaagatgt agattcaggt aaggcaattg aactaggtga 60 tgtagctatt atagatacag cattaagtat tattctttca ggtaacgagt tccaaggaag 120 tattcgttta tgctaaaaaa agacttgaag aaaaagaaag aattagaaaa gaagaagaag 180 agaaacttaa taacttataa aagggaagaa ttatgagact atataaaatg aggtatcata 240 attgaaaaag aaaccacaag gcaatgagat aatcataacc ataataacgg ttatgatagc 300 aatatttgta gtcattatga ccatattttt taataaatac caagatgcta aagaagataa 360 agatagatat cagagattag ttgagattta taaaaaagca gatgataatg atggagagac 420 taaaaagaaa tacgtaaaaa gattaaataa agctgaagaa gaacttaaaa aagtaaagaa 480 agaaacaaat tataaagact ataataagaa gtcaaataaa gaaagacaaa aggaagataa 540 agaaactaga gagaaaatat atgatgtaac tggtgatgat gacttaatat tagtaaaaaa 600 taatattgag tttagtgata aggtagataa acctgaaata 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774 <212> DNA <213> Bacteriophage SAP-1 partial gene <400> 25 agggttatac gatatcacac agcaagcgaa tgctaaggca gctggtattc gtattgctgt 60 tgccgaaaag gcgggaaagt tgtcggcatg tatttattag aaaacagagg gagttcacat 120 tccacctcgt tacaaaatgt ttttgctctc gtgcgagaat caaaactgtc tatgaaaatc 180 gaattcgatt gattgagtgc atactctttt taattattaa catatttccg ttttcccaat 240 ggaggagacc tttactgaga tacatctttt gctaattctg tcaaaaccaa tagattatgg 300 tatgcaagtg gcttacctgc gagcgatcag tattgaaaac cactggaaaa catctatctc 360 atccttcgat ttctgttttc gaccctatta cagttgtaga tacacaggtg tgctatggat 420 caaagatgaa ggcttgattg ttattttaaa tatgggccag cacgacagtt ccatcttttc 480 tatatcgaac gaactctaat gttcccattt attgttacaa tgcctcgtaa tccccctcta 540 ttaagagctg aagattctta ttactaacaa ggcctaaata gatagatgct acggaacact 600 tctccaaaca acaaaattat tatctttttt tcttcccgga aatgttttcc atgctgactt 660 caccccggaa cgactgtcag ctacaccgat tagtgcgacc atacgggtca tcttgcttct 720 tgctacatga aaaaagaaca atcctacaaa taaagattat gtctaggtgc acgt 774 <210> 26 <211> 703 <212> DNA <213> Bacteriophage SAP-1 partial gene <400> 26 gatttcccta atgcagcaaa agatgaacat ggtcgtctac ttgtagccgc agcaatcggt 60 atttcaaaag acactgatat tcgtgctcaa aaattagtcg aagcaggtgt ggatgtctta 120 gttatcgata cagcacatgg tcactctaaa ggtgttatcg atcaagtgaa acatattaag 180 aagacttacc cagaaatcac attagttgca ggtaacgtag caactgcaga agcaacaaag 240 gatttatttg aagcgggtgc agatattgtt aaagttggta ttggcccagg ttcaatttgt 300 acgacacgtg ttgtagcagg tgttggtgta ccacaaatta cagcaattta tgattgtgca 360 actgaagcgc gcaaacatgg taaagctatc attgctgatg gtggtattaa attctcagga 420 gatatcatta aagcattagc tgctggtgga catgcggtta tgttaggtag cttattagca 480 ggtactgaag aaagtccagg cgcaacagaa attttccaag gtagacaata taaagtatac 540 cgcggtatgg gctctttagg tgcgatggaa aaaggttcaa acgaccgtta cttccaagaa 600 gacaaagcgc ctaagaaatt tgtacctgaa ggtatcgaag gacgtacagc atataaaggt 660 gctttacaag atacaattta ccaattaatg ggcggagtgc gtg 703 <210> 27 <211> 1488 <212> DNA <213> Bacteriophage SAP-1 total gene <400> 27 atggctaaga ctcaagcaga aataaataaa cgtttagacg cttatgcaaa aggtacagta 60 gacagtcctt atagaattaa aaaagctaca agctatgacc catcgtttgg tgtaatggaa 120 gcaggagcaa ttgacgcaga tggttactat catgcacagt gccaagactt aattactgat 180 tatgtattat ggttaacaga taataaagtt agaacttggg gtaatgctaa agaccaaatc 240 aaacaaagtt atggtactgg atttaaaata catgaaaata aaccttctac agtacctaaa 300 aaaggatgga ttgctgtatt tacatccggt agttatcagc aatggggtca cataggtatt 360 gtatatgatg gaggtaatac ttctacattt actattttag agcaaaactg gaacggttac 420 gctaataaaa aacctacaaa acgtgtagat aattattacg gattaactca ttttattgag 480 atacctgtaa aagcaggaac tactgttaaa aaagaaacag ctaagaaaag tgcaagtaaa 540 acacctgcac ctaaaaagaa agcaacacta aaagtttcta agaaccatat taactataca 600 atggataaac gtggtaagaa acctgaagga atggtaatac acaacgatgc aggtcgttct 660 tcagggcaac aatacgagaa ttcattagct aacgcaggtt atgctagata tgctaatggt 720 attgctcatt actatggctc tgaaggttat gtatgggaag caatagatgc taagaatcaa 780 attgcttggc acacaggaga tggaacagga gcaaactcag gtaactttag atttgcaggt 840 attgaagtct gtcaatcaat gagtgctagt gatgctcaat tccttaaaaa cgaacaagca 900 gtattccaat ttactgcaga gaaatttaaa gaatggggtc ttactcctaa tcgtaaaact 960 gtaagattgc atatggaatt tgttccaaca gcttgtcctc atcgttctat ggttcttcat 1020 acaggattta atccagtaac acaaggaaga ccatctcaag caataatgaa taaactaaaa 1080 gattatttca ttaaacaaat taaaaactac atggataaag gaacttcaag ttctacagta 1140 gttaaagacg gtaaaacaag tagcgcaagt acaccggcaa ctagaccagt aacaggctct 1200 tggaaaaaga accagtacgg aacttggtac aaaccggaaa atgcaacatt tgttaatggt 1260 aaccaaccta tagtaactag aataggttct ccattcttaa atgctccagt aggaggtaac 1320 ttaccggcag gagctacaat tgtatatgac gaagtttgta tccaagcagg tcacatttgg 1380 ataggttaca atgcttacaa tggtaacaga gtatattgcc ctgttagaac ttgtcaagga 1440 gttccaccta atcatatacc tggggttgcc tggggagtat tcaaatag 1488 <210> 28 <211> 495 <212> PRT <213> SAL-1 protein <400> 28 Met Ala Lys Thr Gln Ala Glu Ile Asn Lys Arg Leu Asp Ala Tyr Ala 1 5 10 15 Lys Gly Thr Val Asp Ser Pro Tyr Arg Ile Lys Lys Ala Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Pro Ser Phe Gly Val Met Glu Ala Gly Ala Ile Asp Ala Asp Gly 35 40 45 Tyr Tyr His Ala Gln Cys 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ttaaaggtta tatattccat tacttagatg 720 aatcaaatga atacattgaa gaatttatac cacttcacga gtatcattta actaaaacac 780 aagcaataga attattacct aacacatgta cactattatc aactacacgc aaaacgaaaa 840 aaatccaagt atattacaat gatttactac aaatttcaat taaagaggag aaataaaaaa 900 tgacaaacgt aaaagaaatt ttatcaagac accaaaatac aacagcgaga tttgaatttg 960 aggaaaaaga aagagaattt ataaaactat cagaattagt tgaaaaatac ggtattaaaa 1020 aagagtatat cgttagagca ttattcacaa acaaagaatc aaaattcggt gtacagggtg 1080 ttatcgtcac tgacgactat aatgtaaact taccgaacca cttaacagag ttaattaaag 1140 aaatgagatc agacgaggac gttgttaaca ttatcaatgc tggtgaagtg caatttacaa 1200 tttatgaata tgaaaacaaa aaaggtcaaa aaggttactc aatcaacttt ggtcaagtat 1260 cattttaata caatttcata ggggatattt atcccctatt ttatgaggtg ctaaacaatg 1320 gaaaaaatat acactgccgt attattatac aatgtatcaa ttaatgaaac atatgaacat 1380 gaaattgaac aattcgaaaa aataaataaa gttaaggtaa tatatagtta ttttgacgca 1440 aacttttaca aaaaaggtgc atataatttt ggtgtaaaat acattaagga gatataaaaa 1500 tgaatattac aacaacatta aacacaaaaa aattaattaa 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tgaagccttt tatgatgatt 4080 ttttcaagta tgtttatcgc cgggatacaa tcacaaaatc aaaaacaaat attatcatga 4140 ttgcacataa ctgtaataaa tacgataatc attttttact taaagacacc atgcgttatt 4200 ttgataatat tacacgcgaa aatgtatatt taaaatctgc agaagaaaat gaacatacaa 4260 taaaaattca agaggctact attttagcca aaaatcaaaa tgtgatttta gaaaaacgtg 4320 ttaaatcttc aatcaattta gatttaacga tgtttttaaa tggttttaaa tttaatatca 4380 ttgataactt tatgaaaacc aatacatcaa tagcaacatt aggaaaaaag ctacttgacg 4440 ggggttattt aacagaaaac caacttaaaa cagattttaa ttatacaatt tttgataaag 4500 ataacgatat gtcagatagt gaagcttatg actatgctgt taagtgtttt gataatctta 4560 catctgaaca attaacctac attcataatg acgtgattat attaggtatg tgccatattc 4620 attatagtga catttttcca aattttgact ataacaaatt aacattctca ctaaatatca 4680 tggaatctta tttgaataat gaaatgactc gttttcagtt actcaatcaa tatcaagata 4740 ttaaaatatc ttatacacat tatcattttc atgatatgaa tttttatgac tatataaaat 4800 cattttatcg tggtggttta aatatgtata ataccaaata tatcaataaa cttattgatg 4860 aaccttgttt ttctatagac atcaattcga gttatcctta 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tatctattgc aaaactttta 9960 ttaccatttg aaagctcact atcactataa tttgatgtaa caaaatgtaa ttcattatta 10020 aagtttaaat ataatcttgt attaatcatt ttcgaatcaa tcgcacattg tgtgtagtga 10080 tgtgtagatt ttaagtttgc gttaatcgta cctaatttaa tatcaccgtt tttcttaatg 10140 ccttttaata ccccttttaa ttgtatggtt ttaacaccat taattgttaa aatacgatat 10200 tgcggtgcag gatatccaac gttgctatca cttgcaataa taccactttc taatgtaata 10260 tcttgccacc ctgtatcatt cacagttgtt ttattttcat taattgtatt taaaatttct 10320 attttatcat tagttattat agcagttaaa ttgttaatac tttgtgtatt attacctaca 10380 ctttcttttg tagctataat atcttgttta tttttttcaa tatcttcttc attttttgtg 10440 tttttatcat ctaatatatg aattgcagat tcatgattac ttagtttatt tgtatgttct 10500 gattgaacat ctgataaatt ttttattttt ttatcttgtt gcacattatc ttctttaata 10560 ttaataatgt ctgtagcgtt ttgagaaata ttatttttat ttgtagcgat atcattttta 10620 tttttattaa tgtcttttgt gttcgtatta attttactta ataattcatc tttaaaggtt 10680 aacttataat aatcctcatc acgtcttata taaatgttac cgtcctttgt agtaattaag 10740 tcatttgctt ctactaaatt atcatttaat ttatctacag agtcaatgtt gcgcaaactt 10800 ccttaaaatc caacaaccat tggttaaacc ttttatttta atgttttcca actaattcaa 10860 agaaaaattc tattttatca ttagttttta tagcagttaa attgttaata ctttgtgtat 10920 tattacctac actttctttt gtagctataa tatcttgttt atttttttca atatcttctt 10980 cattttttgt gtttttatca tctaatatat gaattgcaga ttcatgatta cttagtttat 11040 ttgtatgttc tgattgaaca tctgataaat tttttatttt tttatcttgt tgcacattat 11100 cttctttaat attaataatg tctgtagcgt tttgagaaat attattttta tttgtagcga 11160 tatcattttt atttttattt atgtcttttg tgttcgtatt aattttactt aataattcat 11220 ctttaaaggt taacttataa taatcctcat cacgtcttat ataaatgtta ccgtcctttg 11280 tagtaattaa gtcatttgct tctactaaat tatcatttaa tttatctaca gagtcaatgt 11340 tgcgcaaact tcttacaatt ctatcagcca ttgtttacac ctcttattta tatcgtttcc 11400 aactaaattc aaagaaaaat cctaaaatac ccattatgag aacacccccc aaggtacacc 11460 aatactatat gcattacctg tttttccgtt ccattgtcta actggtaaat aataacgagt 11520 tccttgccag ttataaccaa tccaaactaa cccatctgat aaacaaactt cgtcatatgg 11580 tgtatagccg tttggttgga accaatagcc attaggttca cttaatttag gactacagac 11640 acgtgcaaat attggtaaaa aaccacatgt aaatgttgcc ttttcgtttc tataatatgt 11700 gccgtattgg ttttgtttcc aattattagt tagttgaata ttttgttcta atactttact 11760 ttcactgttt gagaattttg ggcgaataaa atgtgtcaca ccgtcataat aatgtgttct 11820 aattgttgct ttttcccaac catcatatcc accattcaac cagttttgtt ctaaacatgt 11880 ataataatca agatttccac ttgttacaca ttggatatgt ccatattgag aatttgtgta 11940 tactgcaaca tcacctaatt gaggtttaaa gctcgatgta ttttcataca ccgttgctaa 12000 acctttaaag tcattattaa ttgcgtcttt agcattaccc cacatacgca ctttaccgtc 12060 agtaatataa tagatataag caacagctaa gtccatacat tgaaaaccat atgcaccatc 12120 aaagtcaaca ccaacacctt catgtttata tatccaatct ttagcttgtt gttgtgattt 12180 catttataac actcctattt tttatgtttt gctacccatt catattcacg atgttttgta 12240 tcagcgttca cattactgaa aaactcttta tattctgata tgttagcttc taatgtttgt 12300 ctcacttctc caactgcgtt accacttgac acacgtaacc atgcaccaac acgttttatt 12360 tcttccggtg cgtctttgaa taattccatt tggttgcctg taatataata ttctccgggt 12420 gttgtaacgt aagctatcca attattatat ttacttgctt ctaaatattc ttgatatggt 12480 gcgtctgttt tgattgttgt ccataaacca taatcccatt ttaacgtgaa tacatctagc 12540 gtcataccac gcataacttt taccatttta cgaccagttg aaaaacgtgt taattcttga 12600 acagtaccta atgtttgtgt tgtagggtat acattaatga aacaaccagc gtcaataatt 12660 tttttacttc catttgtagg catgttttta agcttttctg ccgtactacc gtcaatataa 12720 taaaatccag cttgcgttaa gtcatttaag tcgtcgatat ggtcaggtat agataatgca 12780 cgaccgtcat cttttgttaa tttataattt tgagaacctc ttgcacgtaa tgcttcaaaa 12840 tgttcatatt ctccaagttg gaagaaaccg tataagttat ggaatcgttt accaccaccg 12900 ccattagtca ttgcaagtaa taacgattta cgttttgttt ttgggtttgt ataaatacaa 12960 ataccctcag gctctttaaa attatcacgt gggaagttaa ttccgtcttg gtaagataac 13020 ttaaacgggt aatcgtataa cttttgacca gttgttaatg aatctttgcc aatttgcaca 13080 tgtgaattaa ctgaactgtt accacttaac cagtacaaat catcaccatc aacagcaata 13140 ccttgcatcc aacgtgcatc gttattttct gaattatcaa ttgtcatttc tttttctaca 13200 ttatcaatat gatttttaac atcagctctt gaacgtacct gtatcgtacc atcaccgaaa 13260 cgtaatacga gtttgtcatt tgcttcatca attaacggtg taaaagaatg tttgtttaaa 13320 agtgactgtg gtgtataatc tgttaaccct ttggcttctt ctaaatctaa tacatagtta 13380 tctttatatg ctacttgcaa cagttttgca acaccatcgt gatgtaacca tattttcatt 13440 tccccgtttg attgtctttc taatccgatt gttgtaccgt gaccaccttg tacaatacgc 13500 atactagaaa ttaaatcacc actaggcgtt aatttattaa tccaaaatcc ctcaggtgtt 13560 tgtgagtcgg attgtgttga gtacatttga ttcgtttctt tatcaatatt aatagattgg 13620 ttcacagcgt tacgaatacc cccaaagccc attacaaact taggttcaag ctcatttaat 13680 tcgaacccat taacaaaacg gttaatgtct ttaattaagt ctttaacttc tgctttaaaa 13740 tcattcattt gtttcatttc agcaacttta aataatgcaa atgcagatgt aagaccggca 13800 ctatatttag taaattcatc atgaataatg ttatctatcg taccatcatt taaccaacct 13860 ctaaataatt ctttagcttg gtctgggaat gctttcatta agtcgtccca atttttgaaa 13920 cgttttttta actcatcgtc atagtcccaa atacgatgtg ctaatacttc aatgagcttt 13980 gataatcttg aaatataatc ataatatgat tttgaattgg tattataatc tgctctatca 14040 tcgtaaaacg gtgtataacg ttctctcgtt ttatatattt cgtctaaaaa tggacgaatg 14100 tcgtcaaaat atttaaaatc gttttcatta tatgccataa ttttccacct ttaccaaatt 14160 tgtaaaaaac atttttttat caaattcatt taaaattttc tttcttaaat cgtatacttt 14220 atcaatatta tcaattaaat actgttttga aaattgtgtg cctttcgcat tacctttttg 14280 attttgatta cgttttacgt tttgattact ttcgttactt gatttattca cagttttacc 14340 gttatcaatc gtgttattgt ctgcaaattt taacgttgtt ttatctacat caatgttaac 14400 ctcgctttgt ggtaatgaca cataagcatt tctgttcgct gtcataccag ttgaattgtc 14460 taaagatgta gcattttgat ttgatgtttc atctgtgttg tttgttgtat cttcattatg 14520 ttctgtaaaa ccttgtgatt gtagatattt ttcaacttca cttgatgaat aaacaacatt 14580 caaataatcc tcatgtgtga tacatacagt aatcacttgc ataccaaatg cctcaactgt 14640 ttgtctgtta atctctctat ctaaaaaatg aatcgtaaat gattttttaa aaagtaagtc 14700 tgataaatct tctttcaatg aaaaaccttt aaatactttt tcattaacga tagctaaaac 14760 atctttatcg aatttcaaca ttttttgcat aaattgaaaa tcatcatcat aaaacgttaa 14820 tttattatca tttacaaatt cattgaaacc ttttttaata agctcagatt taataaaatc 14880 gtataaagtc attgtatatc tagccattta aatcactact ttcatctttt aaaagtgtgt 14940 caaccattga tattttagac gttgtttcat catcgtaata cggtttaata tctaaaccat 15000 agcgtttaga taaaaacgtg attggttcac gaccttttaa ataaatatta ctatttgatg 15060 ttgtaaaacc acgattactt ttagcttctt catctgatac accactttct ttatcaacag 15120 ctaaagagtt aatacctaaa tagttactta attcactaat cttattttga tactctcttt 15180 tcatctcagt taaagcagga atcacactat tacttgttaa atcaataatg tcatcttctg 15240 cattaaacat aggtgacatt ttaacaaatg gtgcaccgtt atatatttct gatacaagtt 15300 gattaattga ctcgtcatta atttctgatt taaatacctt gctaaatttc gcttgcataa 15360 tcaatgaaaa tcgagataaa acaacttcag ctaattcatc ggtatagtgt tcaatgattt 15420 caatatcact attatactgt ataggtttat tttgcataac aacaaagtta ccactcatac 15480 aattatcgta tagcttatga atttgtagac actcatcagg aattaaatag tcaggtacaa 15540 taaaataaat atcttctttt gttaatcgtt tttgaaattg gaaattaaag tttgatgaaa 15600 aatttggtgc ttgattaaaa taggtattat ttacataacc aagtatcata atttgtttat 15660 ttctagcttc accaaccact acattaatat tttgccttaa tgcagactct aactgtataa 15720 aatctatacc aaccgtatca cgattggtat agtttataag taggggtaaa aattccaaat 15780 aacgattaaa cataagacgt ttaaatctgt tgcgatgttc aacaactctt ttgttgattt 15840 cttttgataa ttcaacgttt aaacctcttt tatcgttgtt catatttacg ctccttttat 15900 tctgttgctt cttcctctag ttttggtgtt acatcttggt cagtaattaa tattttatta 15960 aagaatggac taatagcctt gaatgaataa taatgaatcc agtgtgtgac ctcatcaaat 16020 tcaccattat agaatggttg ttttaacata cctttggtat aacgtttgta tttaattgca 16080 ttaatatcta aaataaatgc gtataaatct gattttggtt taatttcttc aatgttacca 16140 gtaaactctt taagtttaga aacatcataa gtaaatactg caccaactgg aattgtgtca 16200 ccaatttgcg actgataatc accgtaagca cgtaagaaat caattgtctc ttgattttgt 16260 aatttaaatt cttttgttac tttaaacaca ccacctaaat catcaaaact tataacatgg 16320 tctgtaaaat caataccagc gatttggaat gtgttagcaa tttttgtatc taataggtaa 16380 gattttaaag aatctgttgt taaaataaca atatctttta acttagatac agttgtatat 16440 tgaccaattg caccaccaga agcacggtga acttcattgt atttagcgct gttgttttgt 16500 aagtttaaaa ttgcttcaaa tactttgctt gctaaatctt cttttgatgt tgttttacgt 16560 acgtttgact ctgataattg atttaatgag taatcaacta acattgctcg catttctttt 16620 tcttctaata cattaatatc agaaattttc tttttatata cacctaatgc gtaatttgtt 16680 gcgtctgcta atgtttggaa attgaaacgt gtatcattat tgtttaatgt gaatttttgt 16740 ttcttcacaa taccactacc atataactta gtagccatac gtggataatt acgtttcaac 16800 attaattcct cattttttga taaatccata ttaattggta ctgtatccat aatgacatat 16860 tcttcactat attgaccaat aaagtcttgt tctttagcta accaattaaa acggttacct 16920 aaagcaatat caattaataa tgtctcgtta atcttaggga ataaatattt atttacaaat 16980 gtttcaaaca ttgtattatt gttatcccat ttatcaccaa atgtccaaga ttttgaataa 17040 tcatggttaa aatcttgtaa tgccgacttt gcagattttg ctactaaaag agctgtttcg 17100 ttttttgtac ttgctggtgc cataatttat tattcctcct ctacgtctcc gctaaaagtt 17160 tgttttgaaa gtgaatggat ttgtacaccg tactcatctt cacttttgtt tacatctatt 17220 gacatatttt catttaattc agtacgttta tttaaacgtg aatcttcata tgatgtcccc 17280 atcatagaac gcatgttatt gccttcatac atattatttt cctcctaatc taaatctaac 17340 ttgtcaacta attcttcatc tgaatagtct ttatcttctt tgtcagcatt tgttacatct 17400 ggttgtgttt gttgtggttg ttgaatttgt gatgataaaa aagtagtcat ttgttgctct 17460 aatgatgtaa tacgttgttc taatataaca gggtcgaatt ttgaactatc ttcatctgtt 17520 atagtaggtt ctaatttatt cttattttct tcttcaattg tttctactgt tttatcttca 17580 gtaggttctt cagttggttc ttcagttggt tcttcagttg gttctttgtc gtctggtttt 17640 acgatttcct caaattctgt cattgtgaca cctccaaaat attttataac taattatatc 17700 atagaatatt taaataagta aattaaattt attaaaaagc gtgaacatag ttttcaataa 17760 aagtaaatag atgtatatat tttgtaatta atgaatatgt aataggttag ataagttgga 17820 aaagtaggtg aacatttttt ataagtttag tttagaaatg ataagttaat ttataagttt 17880 tgatttgtat aatcgtttat tttaaacggt ggggaggtgt aaatttacaa aaactttt 17938 <210> 30 <211> 750 <212> DNA <213> SAL-2 coding gene <400> 30 atgaaatcac aacaacaagc taaagattgg atatataaac atgaaggtgt tggtgttgac 60 tttgatggtg catatggttt tcaatgtatg gacttagctg ttgcttatat ctattatatt 120 actgacggta aagtgcgtat gtggggtaat gctaaagacg caattaataa tgactttaaa 180 ggtttagcaa cggtgtatga aaatacatcg agctttaaac ctcaattagg tgatgttgca 240 gtatacacaa attctcaata tggacatatc caatgtgtaa caagtggaaa tcttgattat 300 tatacatgtt tagaacaaaa ctggttgaat ggtggatatg atggttggga aaaagcaaca 360 attagaacac attattatga cggtgtgaca cattttattc gcccaaaatt ctcaaacagt 420 gaaagtaaag tattagaaca aaatattcaa ctaactaata attggaaaca aaaccaatac 480 ggcacatatt atagaaacga aaaggcaaca tttacatgtg gttttttacc aatatttgca 540 cgtgtctgta gtcctaaatt aagtgaacct aatggctatt ggttccaacc aaacggctat 600 acaccatatg acgaagtttg tttatcagat gggttagttt ggattggtta taactggcaa 660 ggaactcgtt attatttacc agttagacaa tggaacggaa aaacaggtaa tgcatatagt 720 attggtgtac cttggggggt gttctcataa 750 <210> 31 <211> 249 <212> PRT <213> SAL-2 protein <400> 31 Met Lys Ser Gln Gln Gln Ala Lys Asp Trp Ile Tyr Lys His Glu Gly 1 5 10 15 Val Gly Val Asp Phe Asp Gly Ala Tyr Gly Phe Gln Cys Met Asp Leu 20 25 30 Ala Val Ala Tyr Ile Tyr Tyr Ile Thr Asp Gly Lys Val Arg Met Trp 35 40 45 Gly Asn Ala Lys Asp Ala Ile Asn Asn Asp Phe Lys Gly Leu Ala Thr 50 55 60 Val Tyr Glu Asn Thr Ser Ser Phe Lys Pro Gln Leu Gly Asp Val Ala 65 70 75 80 Val Tyr Thr Asn Ser Gln Tyr Gly His Ile Gln Cys Val Thr Ser Gly 85 90 95 Asn Leu Asp Tyr Tyr Thr Cys Leu Glu Gln Asn Trp Leu Asn Gly Gly 100 105 110 Tyr Asp Gly Trp Glu Lys Ala Thr Ile Arg Thr His Tyr Tyr Asp Gly 115 120 125 Val Thr His Phe Ile Arg Pro Lys Phe Ser Asn Ser Glu Ser Lys Val 130 135 140 Leu Glu Gln Asn Ile Gln Leu Thr Asn Asn Trp Lys Gln Asn Gln Tyr 145 150 155 160 Gly Thr Tyr Tyr Arg Asn Glu Lys Ala Thr Phe Thr Cys Gly Phe Leu 165 170 175 Pro Ile Phe Ala Arg Val Cys Ser Pro Lys Leu Ser Glu Pro Asn Gly 180 185 190 Tyr Trp Phe Gln Pro Asn Gly Tyr Thr Pro Tyr Asp Glu Val Cys Leu 195 200 205 Ser Asp Gly Leu Val Trp Ile Gly Tyr Asn Trp Gln Gly Thr Arg Tyr 210 215 220 Tyr Leu Pro Val Arg Gln Trp Asn Gly Lys Thr Gly Asn Ala Tyr Ser 225 230 235 240 Ile Gly Val Pro Trp Gly Val Phe Ser 245

Claims (17)

1. 황색포도상구균 특이적 사멸능을 갖고 황색포도상구균에 의해 형성된 균막의 제거 능력이 있는, 미오비리대과 T4-유사 파지 속 박테리오파지 (기탁번호 KCTC 11153BP, SAP-1), 포도비리대과 Φ29-유사 바이러스 속 박테리오파지 (기탁번호 KCTC 11154BP, SAP-2), 박테리오파지 유래의 서열번호 28로 특징되는 용균단백질, 및 박테리오파지 유래의 서열번호 31로 특징되는 용균단백질로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 성분을 포함한, 균막 형태로 감염된 황색포도상구균 감염에 원인한 감염성 질환 치료용 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 미오비리대과 T4-유사 파지 속 박테리오파지는 서열번호 1 내지 서열번호 26으로 구성된 군으로 특정되어지는 염기서열을 가지고, 상기 포도비리대과 Φ29-유사 바이러스 속 박테리오파지는 서열번호 29로 표시되는 염기서열의 유전자를 갖는 것을 특징으로 하는, 균막 형태로 감염된 황색포도상구균 감염에 원인한 감염성 질환 치료용 조성물.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 질환은 유방염, 피부염, 패혈증, 화농성 질환, 식중독, 폐렴, 골수염, 농가진, 균혈증, 심내막염 및 장염으로 구성된 군으로부터 선택되는 질환에 유효한 것을 특징으로 하는, 균막 형태로 감염된 황색포도상구균 감염에 원인한 감염성 질환 치료용 조성물.
4. 황색포도상구균 특이적 사멸능을 갖고 황색포도상구균에 의해 형성된 균막의 제거 능력이 있는, 미오비리대과 T4-유사 파지 속 박테리오파지 (기탁번호 KCTC 11153BP, SAP-1), 포도비리대과 Φ29-유사 바이러스 속 박테리오파지 (기탁번호 KCTC 11154BP, SAP-2), 박테리오파지 유래의 서열번호 28로 특징되는 용균단백질, 및 박테리오파지 유래의 서열번호 31로 특징되는 용균단백질로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 성분을 포함한, 소독용, 의료세정용 또는 환경정화용 조성물.
5. 제 4 항에 있어서, 항생물질이 더욱 포함되는, 소독용, 의료세정용 또는 환경정화용 조성물.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 항생물질은 리소자임, 리소스타핀, 메티실린, 옥사실린 및 반코마이신으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 소독용, 의료세정용 또는 환경정화용 조성물.
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