KR100958139B1 - 엔테로코쿠스 패칼리스 특이적 사멸능을 갖는 신규한박테리오파지 - Google Patents

Abstract

본 발명은 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 특이적 사멸능을 갖는 신규한 박테리오파지(Bacteriophage)에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인간을 포함한 동물성 질환의 원인균의 하나인 엔테로코쿠스 패칼리스를 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖는 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 박테리오파지, 및 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 엔테로코쿠스 패칼리스에 의해 유발되는 질환의 예방과 치료용의 약학적 조성물 및 사료첨가제에 관한 것이다.

엔테로코쿠스 패칼리스, 박테리오파지, 예방, 치료, 약학적 조성물, 사료첨가제

Description

엔테로코쿠스 패칼리스 특이적 사멸능을 갖는 신규한 박테리오파지{Novel Bacteriophage Having Killing Activity Specific to Enterococcus faecalis}

본 발명은 엔테로코쿠스 패칼리스 특이적 사멸능을 갖는 신규한 박테리오파지, 이를 유효 성분으로 포함하는 엔테로코쿠스 패칼리스 감염성 질환의 예방과 치료 목적의 약학적 조성물 및 사료첨가제에 관한 것이다.

박테리오파지는 세균을 감염시키는 바이러스의 일종으로 보통 파지라고 줄여서 부르기도 한다. 박테리오파지는 핵산으로 이루어진 유전물질 중심부를 단백질 외피가 싸고 있는 단순한 구조의 유기체이며 핵산은 단일 사슬이거나 이중 사슬인 DNA 또는 RNA로 되어있다. 박테리오파지는 생존에 숙주가 반드시 필요하며 모든 세균에는 특정 박테리오파지가 존재한다고 알려져 있다. 박테리오파지는 숙주에 침투하여 복제 과정을 끝낸 다음, 숙주인 세균의 세포벽을 분해하기 위해 필요한 일군의 효소를 발현시킨다. 이들 효소는 세포벽의 경직성(rigidity) 및 기계적 강도(mechanical strength)를 담당하는 세포벽의 펩티도글리칸(peptidoglycan) 층을 공격하여 세포벽을 파괴한다.

박테리오파지는 1915년 영국의 세균학자 Twort가 포도상구균(Micrococcus) 집락이 어떤 것에 의해 투명하게 녹는 현상에 대한 연구에서 발견되었다. 또한, 1917년에는 프랑스의 세균학자 d'Herelle이 이질환자 변의 여과액 중에 적리균(Shigella disentriae)을 녹이는 작용을 가진 것이 있다는 것을 발견하고 이에 대한 연구를 통해 독립적으로 박테리오파지를 발견하였으며, 세균을 잡아먹는다는 뜻에서 박테리오파지라고 명명하였다. 이후 이질균, 장티푸스균, 콜레라균 등 여러 병원균에 대한 박테리오파지가 계속적으로 발견되었다. 그러나 1950년 Flemming에 의해 페니실린이 발견된 이후, 항생제 사용의 보급화로 인해 일부 동유럽 국가에 한정되어서만 박테리오파지에 대한 연구가 계속되었으며 그 밖의 지역에서는 다소 시들하였다. 그러나 2000년 이후에 항생제의 오남용으로 인해 다재 내성(Multidrug-resistant)을 지닌 병원성 세균의 출현빈도가 높아지고 기존 항생제의 많은 문제점들이 부각되면서 기존 항생제의 대체 물질로의 개발 가능성 때문에 박테리오파지에 대한 연구가 선진국들을 중심으로 많은 관심을 받으며 다시 활발하게 진행되고 있다.

비록 항생제(또는 항균제)가 세균 감염에 의한 감염성 질환의 치료에 있어 여전히 주된 방법으로 널리 사용되고 있는 실정이지만, 과도한 항생제의 사용으로 인하여 1980년대부터 많은 항생제 내성 균주가 발생하기 시작했으며, 1986년 최후의 항생제로 불리는 반코마이신(Vancomycin)에 내성을 지닌 황색포도상구균(Vancomycin-Resistent Staphylococcus Aureus; VRSA) 및 장구균(Vancomycin- Resistent Enterococci;VRE)이 발견됨으로써 의학계에 큰 충격을 주었었다. 또한 앞서 언급했듯이 2000년 이후로 더욱 많은 항생제 내성균주 및 다재 내성균이 발생하고 있어 이는 커다란 사회적 문제로 대두되고 있다.

따라서 기존 항생제에 내성을 갖는 세균에 의한 질환까지도 치료할 수 있어 국민 건강 증진에 기여할 수 있고 의약 기술을 선도할 수 있는 새로운 항생 물질의 개발이 시급한 상황이다. 다시 말해, 내성세균의 출현에 대한 심각성뿐만 아니라 최근 사회적으로 큰 문제가 되고 있는 항생제 오남용에 의한 문제 및 항생제 잔류 문제에 대한 새로운 해결책으로 기존 항생제를 대체할 수 있는 물질의 개발 등 대안 마련이 매우 절실한 형편이라 할 수 있다. 물론 이러한 대안 마련의 해결책은 기존 항생제와는 근본적으로 다른 방법에 의한 새로운 개념의 항생 물질의 개발을 통해서 일 것이다.

엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis)는 그람양성구균으로서 일반적으로 인간을 포함한 포유동물의 장내에 서식하고 있는 세균(commensal bacterium)이다. 따라서 정상상태일 때는 무해하다. 그러나 엔테로코쿠스 패칼리스 경우에는 다른 일반 균들과는 달리 유전적으로 교잡 가능성이 상당히 높아 병원성을 획득하는 경우가 흔하며, 이런 경우 매우 위해한 병원균이 된다. 세포벽 항원 D그룹에 해당되는 그룹 D 항원 Streptococcus faecalis로 처음 동정되었으나, 1984년 Schleifer와 Kilpper-BalzR에 의해 Enterococcus faecalis로 재분류되었다(Int. J. Sys. Bacteriol. 34: 31?34, 1984).

엔테로코쿠스 패칼리스는 앞서 언급했듯이 외부로부터 유전자 교잡을 통하여 병독인자(virulent factor)를 획득하여 감염성 질환(infectious disease)을 유발할 수 있으며, 심내막염(endocarditis), 방광(bladder), 전립선(prostate), 부고환(epididymal) 감염질환, 신경계(nervous system) 감염질환의 원인균으로 알려져 있다. 또한, 가축질환의 경우, 젖소 유방염(bovine mastitis)을 일으키는 환경형 유방염(environmental mastitis)의 원인균으로도 알려져 있다.

일반적으로 엔테로코쿠스 패칼리스 처치에 사용되는 항생제로는 아미노글리코사이드(aminoglycosides), 세팔로스포린(cephalosporins), 클린다마이신(clindamycin) 및 반합성 페니실린제제들이 사용되나, 특정 고농도의 항생제 및 여러 항생제에 대한 민감도가 떨어지는 경우가 많으며, 더 나아가 항생제 내성 및 다재 내성을 획득한 경우가 흔한 세균이다. 1986년 프랑스에서 처음으로 반코마이신에 내성을 보이는 VRE가 보고되었고 국내에서는 1992년에 VRE가 처음으로 분리되었다. 미국의 경우, 1988년 처음으로 VRE가 분리된 이래, NNIS(National Nosocomial Infection Surveilance)의 자료에 따르면 1990-1997년 사이에 분리된 엔테로코쿠스 중 1-15%가 VRE 였으며 1999년 25%, 2003년 28.5%로 증가되고 있는 추세이다. 최근에는 유럽, 미국 뿐 아니라 한국을 포함한 아시아 및 오세아니아를 비롯하여 전 세계적으로 VRE의 출현이 증가하고 있다.

엔테로코쿠스는 주요 원내 병원균(nosocomial pathogen)중 하나이며 면역기능이 감소된 사람에게 심각한 감염증을 일으키는 기회감염(opportunistic infection)의 주요 원인균이다. 대부분 VRE 감염은 병원에서 일어나는데, 그 중에서도 특히 엔테로코쿠스 패칼리스는 엔테로코쿠스 원내 감염의 약 80%를 차지할 만 큼 심각한 병원균으로 인식되고 있다. 최근 VRE에 대한 관심이 높아지면서 VRE에 해당하는 엔테로코쿠스 패칼리스 V583의 전체유전자 서열분석에 대한 연구가 진행되어 이들이 독성을 갖게 된 경로와 약물에 대한 내성을 갖게 된 이유가 밝혀지기도 하였다(Science 299: 2071-2074, 2003).

VRE에 감염되면 패혈증을 일으키거나 심하면 사망에까지 이를 수 있음에도 불구하고 아직까지 치료를 위해서는 서로 다른 계열의 항생제를 병용하여 처치해보는 것뿐이며 궁극적인 치료제는 없는 실정이다. 또한, 현재 국내에서 사용되는 항균제의 대부분은 원료 형태 또는 완제품 형태로 외국으로부터 수입되고 있어 해외 의존도가 매우 높을 뿐만 아니라 특히 동물 항생제 분야에서는 기존에 사용되던 값싼 항균제들에 대한 내성문제와 인체에 중요한 신규 항균제의 동물사용 제한으로 인하여 이에 대한 대안 마련이 매우 시급한 상황이다.

이에, 본 발명자들은 유해 병원성 박테리아인 엔테로코쿠스 패칼리스를 선택적으로 사멸시킬 수 있는 박테리오파지를 자연에서 분리하고, 이 분리된 박테리오파지를 타 박테리오파지와 구별하여 특정 지을 수 있는 유전체(genome)의 유전자 서열을 제공하고, 더 나아가 엔테로코쿠스 패칼리스에 대한 특이적 사멸능을 갖는 분리된 박테리오파지를 이용하여 엔테로코쿠스 패칼리스 증식을 효과적으로 예방할 수 있는 방법을 제공하고, 최종적으로 분리된 박테리오파지를 엔테로코쿠스 패칼리스에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료 목적으로 이용함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 인간을 포함한 동물의 감염성 질환의 원인균의 하나인 엔테로코쿠스 패칼리스를 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 가진 신규 박테리오파지를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 엔테로코쿠스 패칼리스 유발성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제를 제공하는 것이다. 이 소독제는 특히 병원감염 예방에 효과적이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 사료첨가제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 음용수 첨가제를 제공하는 것이다.

본 발명은 엔테로코쿠스 패칼리스 특이적 사멸능을 갖는 신규한 박테리오파지를 제공한다.

본 발명자들은 엔테로코쿠스 패칼리스를 선택적으로 사멸시키기 위해 예의 노력한 결과, 엔테로코쿠스 패칼리스를 특이적으로 사멸시킬 수 있는 신규한 박테리오파지를 선별하였고 이를 Bacteriophage EFA-1로 명명하였다. 이렇게 선별된 박테리오파지를 2008년 2월 26일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터 (기탁번호 KCTC 11289BP)에 기탁하였다.

본 발명은 선별된 Bacteriophage EFA-1을 타 박테리오파지와 구별 지을 수 있도록 서열번호 1로 표시되는 유전자 서열을 갖는 유전체를 제공한다.

본 명세서에서 사용된 "유전자"라는 용어는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 유전자에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Chemical Reviews 90:543-584, 1990).

또한, 본 발명은 엔테로코쿠스 패칼리스의 증식을 효과적으로 억제할 수 있는 박테리오파지 EFA-1(Bacteriophage EFA-1)을 유효성분으로 포함하는 엔테로코쿠스 패칼리스 유발성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 박테리오파지는 상술한 바와 같이, 엔테로코쿠스 패칼리스를 특이적으로 사멸시키므로, 엔테로코쿠스 패칼리스에 의해 유발되는 다양한 질환의 치료에 효과를 나타낸다.

따라서 본 발명의 약학적 조성물은 엔테로코쿠스 패칼리스에 의해 유발되는 대표 질환인 심내막염, 방광, 전립선 및 부고환의 감염질환, 신경계 감염질환, 패혈증, 젖소 유방염에 대한 치료에 이용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 '치료'라는 용어는 (ⅰ) 엔테로코쿠스 패칼리스에 의 해 유발된 감염성 질환의 억제; 및 (ⅱ) 엔테로코쿠스 패칼리스에 의해 유발된 감염성 질환의 경감을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 질환 부위에의 도포 또는 분무하는 방법으로 이용할 수 있으며, 그 밖에 경구 투여 또는 비경구 투여를 통해 투여할 수도 있으며, 비경구 투여의 경우 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 도포, 분무 및 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 대상이 되는 동물 및 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사나 수의사는 소망하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결 정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 1 × 10³ 내지 1 × 10¹⁸ pfu/㎖의 박테리오파지를 포함하며, 바람직하게는 1 × 10⁶ 내지 1 × 10¹² pfu/㎖의 박테리오파지를 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수도 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 박테리오파지 EFA-1을 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공한다.

본 명세서에 있어서, '항생제’라는 용어는 방부제, 살균제 및 항균제를 총칭한다.

본 발명의 항생제는 일차적으로 엔테로코쿠스 패칼리스에 의해 유발되는 질병에 대한 예방 및 치료제로 활용될 수 있다. 또한 기존 항생제에 대한 내성을 획득한 다재 내성 엔테로코쿠스 패칼리스에 의한 감염질환 치료에도 활용될 수 있다.

본 발명의 박테리오파지 EFA-1은 기존 항생제에 비하여 엔테로코쿠스 패칼리스에 대한 특이성이 매우 높다는 장점을 갖고 있다. 이는 유용한 다른 균은 죽이 지 않고 병원균인 엔테로코쿠스 패칼리스만을 선택적으로 죽일 수 있으므로 부작용이 상당히 감소된 항생제로서 매우 가치가 있다고 할 수 있다.

또한, 본 발명의 박테리오파지를 항생 물질로 이용하게 되면 기존의 항생제를 이용하는 것과는 달리 병원균의 내성 내지 저항성(resistance)을 유도하지 않는다는 중요한 장점을 갖기 때문에 기존의 항생물질에 비하여 제품수명주기(life cycling)가 긴 신규 항생제로서 이용될 수 있다. 다시 말해, 대부분의 항생 물질들은 내성 증가에 직면함에 따라 갈수록 사용범위가 줄어들 수밖에 없는데 반해, 본 발명의 박테리오파지 EFA-1을 유효성분으로 포함하는 항생제는 내성 문제를 근본적으로 해결할 수 있기에 그 만큼 항생제로서의 제품수명 주기가 길어질 것으로 기대된다. 따라서 병원성 세균인 엔테로코쿠스 패칼리스를 특이적으로 사멸시키는 본 발명의 박테리오파지 EFA-1을 유효성분으로 포함하는 항생제는 항균 효과, 살균 효과 및 방부 효과가 뛰어난 항생제로 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 박테리오파지 EFA-1을 유효성분으로 포함하는 소독제를 제공한다.

박테리오파지 EFA-1을 유효성분으로 포함하는 소독제는 병원감염 예방 및 축산업 분야에서의 소독제로 그 활용가치가 높다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 EFA-1을 유효성분으로 포함하는 사료첨가제 및 음용수 첨가제를 제공한다.

우리나라의 가축들은 ‘과잉진료’에 시달린다. 사람보다 가축에 들어가는 항생제가 더 많다. 축산, 수산업에서 사용되는 사료 첨가용 항생제 사용량은 전체 항생제 판매량의 54%를 차지한다. OECD 국가 중 단연 최고다. 또한 전체 56%에 달하는 항생제가 ‘예방 목적’으로 사용된다는 점이 더 심각하다. 예방 목적 항생제 투여는 내성균 발생 가능성을 높이기 때문이다. 가축에 잔류하는 항생제는 사람에게 전달될 수 있다는 점이 또한 문제다. 항생제가 육류를 통해 인체에 흡수되면 항생제 내성을 유발해 질병의 확산을 부를 수도 있다. 사료에 섞어 먹이는 항생제의 종류가 많은 것 또한 문제다. 많은 종류의 항생제를 사용하면 다제 내성균 발생 확률이 높아지기 때문이다. 그렇기에 질병이 나돌기 쉬운 계절에 항생제를 사료에 섞어 공급하는 이른바 ‘클리닝 서비스’는 심각한 내성 문제를 일으킬 수 있다. 이 에 따라 좀더 자연친화적이면서도 기존의 항생제의 사용에서 발생한 문제를 해결해 줄 수 있는 새로운 사료첨가제용 항생물질이 필요한 것이다.

본 발명의 사료첨가제는 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 하나 또는 그 이상의 효소 제제를 첨가할 수도 있다. 첨가되는 효소 제제는 건조 또는 액체 상태 모두 가능하며 효소 제제로는 리파제(lipase)와 같은 지방 분해효소, 파이틱애시드(phytic acid)를 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만드는 파이타제(phytase), 녹말과 글리코겐(glycogen) 등에 포함되어 있는 알파-1,4-글리코시드 결합(α-1,4-glycoside bond)을 가수분해하는 효소인 아밀라제(amylase), 유기인산에스테르를 가수분해하는 효소인 포스파타제(phosphatase), 셀룰로스(cellulose)를 분해하는 카르복시메틸셀룰라제(carboxymethylcellulase), 자일로스(xylose)를 분 해하는 자일라나제(xylanase), 말토오스(maltose)를 두 분자의 글루코스(glucose)로 가수분해하는 말타제(maltase), 및 사카로스(saccharose)를 가수분해하여 글루코스-프룩토스(glucose-fructose) 혼합물을 만드는 전환효소(invertase) 등과 같은 당 생성 효소로 구성된 군으로부터 선택되어 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에서의 박테리오파지 EFA-1을 포함하는 사료첨가제에는 비병원성의 다른 미생물이 추가로 첨가될 수 있다. 첨가될 수 있는 미생물로는 단백질 분해 효소, 지질 분해효소 및 당 전환 효소를 생산할 수 있는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 고초균, 소의 위와 같은 혐기적 조건에서 생리적 활성 및 유기물 분해능이 있는 락토바실러스 균주(Lactobacillus sp.), 가축의 체중을 증가시키며 우유의 산유량을 늘리고 사료의 소화 흡수율을 높이는 효과를 보여주는 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)와 같은 사상균(J Animal Sci 43: 910-926, 1976) 및 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모(J Anim Sci 56: 735-739, 1983)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

또한 각종 곡물 및 대두 단백을 비롯한 땅콩, 완두콩, 사탕무우, 펄프, 곡물 부산물, 동물 내장 가루 및 어분 가루 등과 같은 사료원료는 가공되지 않거나 또는 가공된 것을 사용할 수 있다.

특히, 양계산업의 육계농장에서 음용수에 혼합하여 공급함으로써 엔테로코쿠스 패칼리스 감염질환을 예방할 수 있다.

본 발명은 병원성 세균인 엔테로코쿠스 패칼리스를 특이적으로 사멸시키는 능력을 갖는 신규한 박테리오파지를 제공한다. 본 발명의 박테리오파지는 엔테로코쿠스 패칼리스가 주원인이 되는 감염성 질환의 예방 및 치료제, 사료첨가제 및 음용수 첨가제, 항생제, 항균제, 방부제, 및 다양한 소독제 등으로 광범위하게 사용될 수 있다. 특히 엔테로코쿠스 패칼리스가 병원 감염의 주원인균임을 고려할 때 병원감염 방지를 위한 약제로 활용될 수 있다. 본 발명에서 개시한 박테리오파지를 이용하는 방법은 기존 항생제를 이용하는 방법에 비하여 엔테로코쿠스 패칼리스에 대한 특이성이 매우 높다는 장점을 갖고 있다. 이는 유용한 다른 균들은 죽이지 않고 병원균인 엔테로코쿠스 패칼리스만을 선택적으로 죽일 수 있는 방법을 제공해 줄 수 있으므로 부작용이 획기적으로 감소된 항생제를 제공할 수 있다는 점에서 매우 가치가 있다고 할 수 있다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 엔테로코쿠스 패칼리스의 분리, 동정 및 엔테로코쿠스 패칼리스를 특이적으로 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리

(1-1) 엔테로코쿠스 패칼리스의 분리 및 동정

엔테로코쿠스 패칼리스에 특이적으로 감염하는 박테리오파지를 분리하기 위해서는 일차적으로 엔테로코쿠스 패칼리스가 분리되어야 한다. 이를 위해 엔테로코쿠스 패칼리스가 존재할 것으로 예상되는 곳을 기반으로 시료를 채집하였다. 엔테로코쿠스 패칼리스를 병원체로부터 분리하고자 선택한 질환은 젖소 유방염으로 하였다. 유방염은 다양한 병원성 세균에 의해 발병되고 전염성 유방염과 환경형 유방염으로 분류될 수 있고 엔테로코쿠스 패칼리스의 경우 환경형 유방염 원인세균으로 알려진 세균 중 하나이다. 유방염에 감염된 젖소의 우유 및 기타 우사 내 환경샘플인 토양 및 지푸라기로부터 시료를 채취하였다. 이 시료를 엔테로코쿠스 선택배지인 Bile Esculin Azide agar 배지에 도말(spreading)하여 배양된 세균 집락(colony)을 회수하여 동정(identification)을 실시하였다. 얻어진 세균 중에서 그람염색법(Gram staining method), 카탈라아제 조사(catalase test)와 bioMerieux 사의 Vitek을 이용한 생화학적 조사, 및 16S rDNA 서열분석을 통해 선별된 균중에서 엔테로코쿠스 패칼리스를 분리 확인할 수 있었다. Vitek을 이용한 생화학적 조사 결과는 다음 표 1과 같으며 16S rDNA 서열분석 결과는 도 1과 같다.

Vitek ID	200000-0 (C1-12) Catalase - Beta homolysis -
Type	Gram Positive Identification Card (GPI)
Status	Final
Elapsed Time	3 hours
Organism	Enterococcus faecalis - (Group D)
Bionumber	75767621410
PB + BAC + OPT + HCS + 6NC - 10B + 40B + ESC + ARG + URE - TZR + NOV + DEX + LAC + MAN + RAF - SAL + SOR + SUC - TRE + ARA - PYR + PUL - INU - MEL - MLZ - CEL + RIB + XYL - CAT - BH/CO -
99 % Enterococcus faecalis -(Group D)
Wait for Nothing

(1-2) 엔테로코쿠스 패칼리스에 특이적으로 감염하는 박테리오파지의 분리

그 다음으로, 분리한 엔테로코쿠스 패칼리스를 이용하여 엔테로코쿠스 패칼리스에 특이적으로 감염하는 박테리오파지를 분리하고자 하였다. 박테리오파지는 자연계에 널리 존재하는데, 특히 세균이 존재하는 곳에 공생하는 경우가 많다. 본 발명자들은 엔테로코쿠스 패칼리스에 특이적으로 감염하는 박테리오파지를 분리하기 위해 엔테로코쿠스 패칼리스가 존재할 것으로 예상되는 곳을 기반으로 시료를 채집하였다. 이 시료를 엔테로코쿠스 패칼리스와 함께 배양한 후 이 배양액을 원심분리하여 상등액을 얻었다. 이렇게 얻어진 상등액을 여과한 다음, 배양된 엔테로코쿠스 패칼리스를 박테리오파지 분리를 위한 미끼로 함께 다시 배양하여 엔테로코쿠스 패칼리스의 사멸 여부를 확인하였다. 사멸 여부 확인은 최종적으로 용균반 분석(plaque assay)을 통해 판별하였다.

이를 상세히 설명하면, 엔테로코쿠스 패칼리스를 선택적으로 사멸시킬 수 있는 박테리오파지를 분리하기 위하여 박테리오파지가 존재할 것이라 예상되는 우사 내의 토양, 지푸라기, 흙, 및 하수 등으로부터 시료를 수집하여 엔테로코쿠스 패칼리스와 함께 37℃에서 3-4시간동안 진탕배양 후, 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 이 회수된 상등액을 0.45 μm의 필터를 이용하여 여과를 해준 후, 이렇게 얻어진 여과액을 이용한 용균반 분석을 통해 엔테로코쿠스 패칼리스에 특이적인 박테리오파지를 검출하였다.

용균반 분석 결과가 도 2에 제시되어 있으며 이 분리된 박테리오파지를 박테리오파지 EFA-1(Bacteriophage EFA-1)로 명명한 뒤, 2008년 2월 26일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(기탁번호 KCTC 11289BP)에 기탁하였다.

얻어진 박테리오파지의 형태를 관찰하기 위해 염화세슘(CsCl) 밀도 구배법 (1.15 g/ml, 1.45 g/ml, 1.50 g/ml, 1.70 g/ml)을 이용한 원심분리(38,000 rpm, 22시간, 4℃)를 통하여 박테리오파지를 정제한 다음, 이를 구리 격자(cupper grid)에 묻히고, 2% 유라닐 아세테이트(Uranyl acetate)로 역염색법(negative staining)과 건조를 수행한 후, 전자현미경을 통하여 그 형태를 촬영하였다. 그 결과 분리된 박테리오파지가 형태학적 분류상 시포비리대 과(Sipoviridae family)에 속하는 것을 확인할 수 있었다(도 3).

실시예 2: 분리된 박테리오파지 유전체의 유전자 서열 분석

얻어진 박테리오파지 EFA-1을 특정 짓기 위해 유전체의 유전자 서열 분석을 실시하였다. 이를 위해 박테리오파지 EFA-1의 유전체를 통상의 방법으로 추출하였고 이를 유전자 서열 분석에 이용하였다.

(2-1) 박테리오파지 유전체의 분리

구체적으로, 먼저 1 ℓ 플라스크에 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지(카제인 다이제스트, 17 g/ℓ; 소이빈 다이제스트, 3 g/ℓ; 덱스트로스, 2.5 g/ℓ; NaCl, 5 g/ℓ; 디포타슘 포스페이트, 2.5 g/ℓ) 200 ㎖에 600 nm에서 흡광도가 1인 엔테로코쿠스 패칼리스 부유액 20 ㎖ 및 1× 10⁸ pfu/㎖ 수준으로 여과한 박테리오파지 용액 1 ㎖을 첨가하여 37℃에서 3-4시간 진탕배양 하였다. 배양 후, 엔테로코쿠스 패칼리스가 용균 되었는지 여부를 확인한 다음, 용균이 일어났을 때 이 배양액을 0.45 ㎛의 필터로 여과해 주었다. 그 후 여과액에 여과액 부피의 6분의 1 부피에 해당하는 20%의 수분자량 8,000의 폴리에틸렌 글리콜/2.5 M NaCl 수용액을 첨가한 다음, 4℃에서 하룻밤 동안 정치시켰다. 그 후 정치한 액을 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 박테리오파지를 침전물로 얻었다. 이렇게 얻어진 박테리오파지 침전물을 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS) 1 ml로 부유시킨 후, 다시 20% 폴리에틸렌 글리콜 8000/2.5 M NaCl 수용액을 6분의 1 부피만큼 첨가한 다음 4℃에서 한 시간 동안 정치시켰다. 한 시간이 지난 후, 정치했던 액을 14,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 정제된 박테리오파지 침전물을 얻는다. 이 침전물을 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS) 500 ㎕을 이용해 다시 부유하였다. 그 다음 단계로 박테리오파지 외벽을 와해시키기 위해 proteinase K (20 ㎎/㎖) 100 ㎕와 10% 도데실 황산 나트륨염(sodium dodecyl sulfate; SDS) 500 ㎕를 첨가한 다음 65℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1 시간 반응 후, 이 반응액에 25:24:1의 구성비를 갖는 페놀(phenol) : 클로로포름(chloroform) : 이소아밀알코올(isoamylalcohol)의 혼합액 10 ㎖를 첨가해 준 후 잘 섞어 주었다. 그리고는 이것을 14,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하여 층이 분리되게 한 다음 분리된 층 중에서 위층을 취하고 여기에 2부피비의 차가운 100% 알코올을 가하여 순수한 유전체만을 추출하였다.

추출한 박테리오파지의 유전체가 DNA인지, RNA 인지를 확인하기 위해, DNaseⅠ (10 U/㎕) 및 RNase A (10 ㎍/㎕)를 각각 첨가해 준 다음 37℃에서 1시간동안 처리하였고, 이와 더불어 DNA일 경우에 단일가닥 DNA인지, 이중가닥 DNA인지 구분하기 위해 녹두(Mung Bean) 뉴클레아제(45 U/㎕)를 첨가해 준 다음 상온에서 15분간 처리 하였다. 이렇게 처리한 시료들을 0.8% 아가로즈(agarose) 젤을 이용한 전기영동을 실시하여 각 효소에 의한 절단 양상을 조사하였다. 그 결과, 얻어진 유전체는 DNaseⅠ에만 민감하였고 DNase I에 민감한 것은 유전체가 DNA임을 의미하고, 녹두 뉴클레아제에 민감하지 않은 것은 유전체가 DNA 이중가닥 형태임을 의미한다. 이 결과로부터 얻어진 박테리오파지의 유전체가 DNA형이면서 이중가닥임을 확인할 수 있었다.

(2-1) 박테리오파지 유전체의 유전자 서열 분석

위와 같이 분리된 박테리오파지 유전체는 게노믹 DNA(genomic DNA; gDNA)이다. 이 gDNA의 유전자 서열 분석을 실시하기 위해 gDNA의 라이브러리(library) 구축에 흔히 사용되는 방법인 샷건 라이브러리 구축(shotgun library construction)방법으로 라이브러리를 구축하였다. 이를 상세히 설명하면, 박테리오파지의 유전체를 네불라이저(Nebulizer)를 이용한 무작위 절단(random shearing) 기법을 통하여 얻은 DNA(1~6kbp)를 말단 수선(end-repairing) 과정을 거친 후 다시 한번 아가로즈 젤에서 전기영동을 실시한 후 크기에 기반하여 2-5kbp에 해당되는 유전자 조각(gDNA fragment; insert)을 확보하였다. 이렇게 얻어진 박테리오파지의 유전자 단편을 T4 리가아제(ligase)를 이용해 pC31 벡터(vector)에 삽입(ligation)하여 라이브러리를 구축하였다. 이렇게 하여 준비된 박테리오파지의 유전자 단편이 도입된 재조합 벡터를 통상 사용되는 열자극(heat-shock) 방법에 의한 형질전환법으로 대장균의 한 종인 DH10B' 종에 도입시켰다. 이 플라스미드(plasmid)가 도입된 형질전환체를 배양한 다음 이것으로부터 플라스미드 정제 키트(iNtRON사)를 사용하여 유전자 조각을 포함하고 있는 플라스미드를 추출하였다. 이후 전기영동을 통해 플라스미드에 포함된 유전자 조각의 크기를 확인하였으며 최종 16개의 클론을 선별하였다. 이 선별된 클론들의 플라스미드를 통상의 방법에 따라 회수한 다음 회수된 유전자의 염기서열 분석을 실시하였다. 최종 16개 클론의 유전자 서열을 이용하여 단일 콘티그 지도를 제작하였으며 프라이머 워킹(primer walking)을 통해 최종 21,115bp의 크기의 전체 유전자 서열을 분석할 수 있었다. 이 유전자 서열 분석 과정을 보여주는 그림이 도 4에 제시되어 있다. 이렇게 하여 얻어진 유전자 서열은 분리된 박테리오파지의 유전체를 구성하는 전체 유전자 서열로서 서열번호 1로 제시하였다. 얻어진 염기서열을 NCBI Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)를 이용해 분석한 결과가 도 5에 제시되어 있다. 염기서열 분석 결과에 의하면, 박테리오파지 EFA-1은 작은 크기의 유전체를 가지며, 현재까지 보고된 바 없는 신규 박테리오파지임을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 얻어진 엔테로코쿠스 패칼리스에 특이적인 박테리오파지를 이용한 엔테로코쿠스 패칼리스의 감염 예방에 대한 적용예

9 ㎖의 영양배지(Nutrient broth: 소고기 추출물 3 g/ℓ, 펩톤 5 g/ℓ) 하나에는 약 1× 10⁸ pfu/㎖ 수준의 박테리오파지 EFA-1 부유액 100 ㎕를 넣어주고 대조실험의 같은 조성의 배지에는 박테리오파지액을 넣어주지 않은 시료를 각각 준비하였다. 여기에 최종적으로 600 nm에서 흡광도가 0.5 정도가 되도록 병원성 엔테로코쿠스 패칼리스 배양액을 각각 넣어준 다음 엔테로코쿠스 패칼리스의 배양 상태를 관찰해 보았다. 표 2의 결과에서 보는 바와 같이, 박테리오파지액을 첨가해 주지 않은 배지에서는 60분 후 600 nm에서의 흡광도가 1.4 정도가 될 정도로 엔테로코쿠스 패칼리스가 매우 잘 성장하는 반면에 박테리오파지액을 첨가해 준 영양배지에서는 10분경과 후 600 nm에서의 흡광도가 0.12 정도 수준으로, 60분 후에는 0.05 수준으로 감소하는 것을 관찰할 수 있었다.

엔테로코쿠스 패칼리스 사멸 능력(OD₆₀₀ 흡광도 값)

구분	배양 0시간	배양후 10분	배양후 60분
대조군(무처리)	0.5	0.7	1.4
실험군 (박테리오파지액 첨가)	0.5	0.12	0.05

이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 EFA-1이 엔테로코쿠스 패칼리스의 성장을 저해할 뿐만 아니라 사멸까지 시키는 능력이 있어 엔테로코쿠스 패칼리스의 감염을 막는데 매우 효과적임을 알 수 있었다.

실시예 4: 엔테로코쿠스 패칼리스에 특이적인 박테리오파지를 이용하여 엔테로코쿠스 패칼리스 감염에 의해 유발되는 질환을 치료한 적용예

먼저 1× 10⁷ cfu의 엔테로코쿠스 패칼리스를 2일령 병아리에게 먹여 인위적으로 감염상태를 만들었다. 그 다음 박테리오파지 EFA-1을 사료 1 g당 1× 10⁹ pfu가 되도록 섞어서 사료로 급이하였다. 급이 후부터 시간별로 분변 및 맹장 내용물에서의 엔테로코쿠스 패칼리스 수를 측정하였다. 측정 시 시료를 생리식염수로 희석한 후 이를 엔테로코쿠스 선택배지인 Bile Esculin Azide agar 배지에 도말하여 37℃ 배양기에서 하룻밤 배양한 다음 엔테로코쿠스 패칼리스 수를 측정하였다. 실험 결과, 박테리오파지 EFA-1을 포함한 사료를 급여한 경우, 분변에서 대조군 대비 500배 이상의 엔테로코쿠스 패칼리스를 줄여 줄 수 있었으며, 맹장 내용물에 있어서도 100배 이상 엔테로코쿠스 패칼리스의 오염을 줄일 수 있었다.

이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 EFA-1이 엔테로코쿠스 패칼리스를 원인으로 하는 감염질환의 치료에도 매우 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 분리된 엔테로코쿠스 패칼리스의 16S rDNA 서열분석 결과를 보여주는 결과이다.

도 2는 용균반 분석에 의해 엔테로코쿠스 패칼리스에 특이적인 박테리오파지를 검출한 평판접시 사진이다.

도 3은 분리된 엔테로코쿠스 패칼리스에 특이적인 박테리오파지를 전자현미경으로 촬영한 사진이다.

도 4는 박테리오파지 EFA-1 유전자의 라이브러리 구축 과정을 보여주는 결과이다.

도 5는 NCBI Blast 프로그램을 이용한 박테리오파지 EFA-1 유전자의 염기서열 분석 결과를 보여주는 결과이다.

<110> iNtRON Biotechnology, Co. Ltd. <120> Novel Bacteriophage Having Killing Activity Specific to Enterococcus faecalise <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21114 <212> DNA <213> Bacteriophage EFA-1 <400> 1 actaaaaata attgcatgcc ttgcaaaatg acaaaacgta aactacaaga gttaggtgtt 60 aactatcaag aaattaatgt ggatgaagat ttgagtgcat taggatattt aatggaatgc 120 ggatttcgtt ctttaccagt tgtgttcaat gaaaatggcg cacctatggt aactggtgga 180 tttgcaccaa atatcttaga aaagcttgtg tgagaggagc attctaagca cgtttcagat 240 tcaaagtaag gtgattatac acgaaaagac cccctataaa ggaggtcttt ttctttttat 300 tgatacatta aggcttgttt actatctgtg aacaaccaga taaattcatt tggtaattgt 360 acatgagata atgtataacc catgtaaggt gtttgctctt gtactacacc tgtgctgttt 420 tcttggaagt tgaaatagtc gccaactttt agtacttggt ccttagtagg ttgtcctgtt 480 gctggattaa ccttgtcaac aacttctact ggaataccgt tttcagtcca attaaagtca 540 attttaccta aatgttcgtt gtagatttgc cacattccat ttacatactc taagccatct 600 acacggtaat tgaagcgttt tttattacta ggtttactag gttgtgttgg cttaggttta 660 tcaggtttag gagtaggtgt tgctgtgtta ccactaaccc 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Claims (9)

1. 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 특이적 사멸능을 갖는 기탁번호 KCTC 11289BP의 박테리오파지(Bacteriophage).
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 박테리오파지는 서열번호 1의 유전자 서열로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 박테리오파지.
4. 제1항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는, 엔테로코쿠스 패칼리스 유발성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 엔테로코쿠스 패칼리스 유발성 질환은 심내막염(endocarditis), 방광(bladder), 전립선(prostate) 및 부고환(epididymal) 감염질환, 신경계(nervous system) 감염질환, 패혈증, 및 젖소 유방염(bovine mastitis)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
6. 제1항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항생제.
7. 제1항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제.
8. 제1항의 박테리오파지를 포함하는 사료첨가제.
9. 제1항의 박테리오파지를 포함하는 음용수 첨가제.

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