KR102131692B1 - 병원성 세균을 효과적으로 사멸시키는 재조합 항균 효소 LysSAP26의 용도 - Google Patents

병원성 세균을 효과적으로 사멸시키는 재조합 항균 효소 LysSAP26의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 병원성 세균을 효과적으로 사멸시키는 재조합 항균 효소 LysSAP26의 용도에 대한 것이다. 본 발명의 박테리오파지 유전체 유래 아미노산 서열로 구성된 재조합 단백질 LysSAP26은 아시네토박터 바우마니를 포함하는 병원성 세균에 사멸능을 나타내어, 이들 세균에 의해 유발되는 감염성 질환을 예방 또는 치료할 수 있으며, 항생제, 소독제, 식품 첨가제, 사료 첨가제 등에 광범위하게 활용될 수 있다. 특히, 상기 LysSAP26은 세균의 세포벽 성분인 펩티도글리칸을 기질로 사용하여 펩티도글리칸 분해로 인한 세균 사멸능을 나타내고, 펩티도글리칸은 세균에만 존재하고 사람이나 동물에는 존재하지 않는 바, 본 발명의 LysSAP26은 사람과 동물에 영향을 미치지 않아 안전하면서도 의약산업, 식품산업, 생명공학 등에 응용이 가능할 뿐 아니라, 다약제 항균제 내성에 대한 문제점 없이 세균을 목표장소 또는 목표물질에서 효과적으로 사멸시킬 수 있는 이점이 있다.

Description

병원성 세균을 효과적으로 사멸시키는 재조합 항균 효소 LysSAP26의 용도{Use of novel recombinant enzyme LysSAP26 killing pathogenic bacteria}
본 발명은 병원성 세균을 효과적으로 사멸시키는 재조합 항균 효소 LysSAP26의 용도에 관한 것으로, 상세하게는, LysSAP26에 의해 용균되는 병원성 세균에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 상기 항균 단백질을 유효성분으로 포함하는 병원성 세균 사멸용 항생제, 소독제, 식품 첨가제, 또는 사료 첨가제에 관한 것이다.
항균제 오남용으로 인한 병원성 세균들의 다약제 항균제 내성이 증가함에 따라, 항생제로 치료가 되지 않는 사례가 크게 증가하여 위중한 보건문제가 되고 있으며 이에 대응하는 새로운 항균제제의 개발이 시급한 실정이다. 새롭게 주목받고 있는 항균제 대체신약으로 세균에 특이적 사멸능을 가지는 박테리오파지(bacteriophage)가 연구되고 있으며, 박테리오파지가 가지고 있는 항균 물질을 이용하여 제제화하려는 연구개발이 진행 중에 있다.
박테리오파지는 세균의 바이러스로써 그 생물학적 생활사에 따라 숙주인 세균을 감염하여 파지를 다량 재생산하고, 숙주 세균의 세포 속 다량의 파지에 의해서 사멸하는 과정에서 세균의 세포벽을 뚫거나 분해하는 단백질들을 만드는 데, 이들 단백질들은 펩티도글리칸으로 구성되는 세포벽을 분해하여 세포벽을 와해시키고 이로써 세균이 죽게 된다.
지금까지 발명된 박테리오파지 유래 항균 단백질들은 타겟 세균이 그람양성에 국한되어 있는데, 그람음성균에 대한 항균 단백질들의 효과가 미비한 이유는 정제된 항균 단백질을 세균 외부로 처리하였을 때, 그람음성균의 막 구조상 외막(outer membrane)을 가지는 특성 때문에 항균 단백질이 펩티도글리칸 세포벽에 도달하지 못한다. 이러한 이유로 세포벽을 분해하는 항균 단백질의 활용도는 그람양성균을 대상으로 개발 방향이 치우쳐졌으며, 따라서 항균 단백질이 그람음성균에 효과적인 사멸능을 가질 수 있다면 매우 유망한 항균제로 각광받을 수 있다.
카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니 세균(carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii, CRAB)은 세계보건기구 WHO가 21세기 가장 위험한 세균 중의 하나로 지정하여 치료제의 개발이 시급한 것으로 보고하였다. 면역 저하 환자나 만성 폐질환자, 성인병 만성질환자들은 CRAB 감염에 매우 취약하고 폐렴, 혈류감염, 창상 감염으로 매우 위독해 질 수 있다. 이에, 그람양성균과 그람음성균 모두에 항균 작용을 갖는 재조합 단백질은 다약제 내성 CRAB 세균 감염증을 치료하는 항균 제제 등으로 널리 활용될 수 있다.
한국공개특허 제10-2010-0082203호 (2010.07.16. 공개)
본 발명의 목적은 LysSAP26 단백질을 유효성분으로 포함하는 병원성 세균 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 LysSAP26 단백질을 유효성분으로 포함하는 병원성 세균 사멸용 항생제, 소독제, 식품 첨가제 및 사료 첨가제를 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 LysSAP26 단백질을 유효성분으로 포함하는 병원성 세균 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 LysSAP26 단백질을 유효성분으로 포함하는 병원성 세균 사멸용 항생제를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 LysSAP26 단백질을 유효성분으로 포함하는 병원성 세균 사멸용 소독제를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 LysSAP26 단백질을 유효성분으로 포함하는 병원성 세균 사멸용 식품 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 LysSAP26 단백질을 유효성분으로 포함하는 병원성 세균 사멸용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명은 병원성 세균을 효과적으로 사멸시키는 재조합 항균 효소 LysSAP26의 용도에 대한 것이다. 본 발명의 박테리오파지 유전체 유래 아미노산 서열로 구성된 재조합 단백질 LysSAP26은 아시네토박터 바우마니를 포함하는 병원성 세균에 사멸능을 나타내어, 이들 세균에 의해 유발되는 감염성 질환을 예방 또는 치료할 수 있으며, 항생제, 소독제, 식품 첨가제, 사료 첨가제 등에 광범위하게 활용될 수 있다. 특히, 상기 LysSAP26은 세균의 세포벽 성분인 펩티도글리칸을 기질로 사용하여 펩티도글리칸 분해로 인한 세균 사멸능을 나타내고, 펩티도글리칸은 세균에만 존재하고 사람이나 동물에는 존재하지 않는 바, 본 발명의 LysSAP26은 사람과 동물에 영향을 미치지 않아 안전하면서도 의약산업, 식품산업, 생명공학 등에 응용이 가능할 뿐 아니라, 다약제 항균제 내성에 대한 문제점 없이 세균을 목표장소 또는 목표물질에서 효과적으로 사멸시킬 수 있는 이점이 있다.
도 1은 항균 활성을 갖는 박테리오파지 유래 항균 단백질인 LysSAP26의 아미노산 서열을 나타낸 것이다(밑줄 친 부위는 단백질 정제를 위해 인위적으로 첨가된 6개의 히스티딘 아미노산 서열임).
도 2는 상기 LysSAP26의 염기 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 상기 LysSAP26의 단백질 정제 후 SDS-PAGE 분석사진이며, LysSAP26의 6개의 히스티딘 아미노산 서열을 인식하는 특이 항체를 사용하여 웨스턴 분석을 수행하여 LysSAP26를 확인한 것이다.
도 4A는 메티실린 내성 황색포도상구균 (MRSA) ATCC 33691과 아시네토박터 바우마니 임상분리주에 대한 LysSAP26의 세균사멸능 결과를 나타낸다. 도 4B는 아시네토박터 바우마니 표준균주 2 주(ATCC 17978, ATCC 19606)와 다약제 임상균주인 1656-2, 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니 세균(carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii, CRAB) 16주를 대상으로 LysSAP26의 세균사멸능 결과를 나타낸다. 1: A. baumannii 1656-2, 2: A. baumannii ATCC 17978, 3: A. baumannii ATCC 19606, 4-6: A. baumannii ST357 strains, 7-9: A. baumannii ST208 strains, 10: A. baumannii ST552 strain, 11-13: A. baumannii ST191 strains, 14-16: A. baumannii ST369 strains, 17-19: A. baumannii ST229 strains. 도 4C는 다양한 세균 대상 세균 사멸능 시험 결과를 나타낸다. 1번부터 9번 까지 차례로 Streptococcus agalactiae ATCC 13813, Staphylococcus aureus ATCC 33591, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis 1주, Corynebacterium diphtheria 1주, Bacillus cereus ATCC 14579, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Escherichia coli ATCC 25922 및 Acinetobacter baumannii 1주.
본 발명의 발명자들은 박테리오파지 SAP26로부터 유래된 재조합 단백질(LysSAP26 로 명명함)을 암호화하는 DNA를 벡터와 함께 대장균에 형질전환하여 단백질을 발현시켰으며, 상기 단백질이 황색포도상구균 사멸능을 나타내었으며 특히, 아시네토박터 바우마니 세균에 대한 대체 항균제제로 활용이 가능함을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 한편, LysSAP26의 소스인 SAP26 박테리오파지는 황색포도상구균을 사멸시킬 수 있으나 아시네토박터 바우마니 세균은 사멸시킬 수 없는 반면, LysSAP26은 상기 세균에 항균효과를 보이는 효과적 세균 살상능을 나타낸다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 LysSAP26 단백질을 유효성분으로 포함하는 병원성 세균 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 LysSAP26 단백질은 시포비리대 과(Siphoviridae)의 박테리오파지 SAP26(KCTC 11665BP) 유래일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명자들은 황색포도상구균 임상분리주에서 신규한 박테리오파지를 유도, 분리하였고, 분리된 박테리오파지를 한국생명공학연구원의 유전자은행에 2010년 3월 11일자로 기탁하였다(기탁번호 KCTC 11665BP).
상세하게는, 상기 LysSAP26 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상세하게는, 상기 병원성 세균은 아시네토박터 바우마니, 황색포도상구균, 백색포도상구균, 살모넬라, 대장균, 코리네박테리움, 바실러스 또는 스트렙토코쿠스 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상세하게는, 상기 병원성 세균 감염성 질환은 패혈증, 폐렴, 식중독, 감염, 농가진, 화농성 질환, 급성 피부염, 창상 감염, 균혈증, 심내막염 또는 장염일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 LysSAP26 단백질은 세균의 세포벽 성분인 펩티도글리칸을 기질로 하여 세포벽을 분해하고 와해시켜 세균을 사멸시킨다. 상기 펩티도글리칸은 세균에만 존재하고 사람이나 동물에는 존재하지 않는 바, 본 발명의 단백질은 사람과 동물에 영향을 미치지 않아 안전하면서도 의약산업, 식품산업, 생명공학 등에 응용이 가능할 뿐 아니라, 다약제 항균제 내성에 대한 문제점 없이 세균을 목표장소 또는 목표물질에서 효과적으로 사멸시킬 수 있는 이점이 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 '치료'는 병원성 세균에 의해 유발되는 감염성 질환의 예방, 억제 및 경감을 의미한다.
본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 투여를 위하여, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형 제제는 상기 유효성분 외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만, 당 업자에 의해 적절하게 선택될 수 있는 바, 상기 조성물의 일일 투여량은 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 50 mg/kg이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 LysSAP26 단백질을 유효성분으로 포함하는 병원성 세균 사멸용 항생제를 제공한다. 본 명세서에서 사용된 "항생제"라는 용어는 화장품용 또는 의약용 방부제, 살균제 및 항균제를 총칭한다.
화장품은 기름이나 물을 주성분으로 하며, 미생물의 탄소원이 되는 글리세린이나 솔비톨 등과 질소원이 되는 아미노산 유도체, 단백질 등이 배합된 것이 많으므로 세균 등의 미생물 침투가 용이하다. 또한, 식품에 비하여 사용 기간이 매우 길기 때문에 미생물에 의한 오염 위험이 훨씬 크다고 할 수 있다. 사용함에 따른 미생물 오염으로 나타나는 변색이나 변취 등으로부터 화장품을 장기간 보호하기 위하여 항균제의 첨가가 필수적이다.
본 발명의 LysSAP26 단백질은 종래 항균제에 비하여 탁월한 선택적 세균 사멸능을 가진다. 상기 단백질을 항균제로 활용하면 종래 항균제와 달리, 세균의 내성 내지 저항성(resistance)을 유도하지 않는다는 이점을 가지기 때문에 종래의 항생 물질에 비하여 제품 수명(life cycling)이 긴 항생 물질을 제공할 수 있다. 대부분의 항생 물질들은 내성 증가에 직면함에 따라 갈수록 사용 범위가 줄어드는데 반해, 본 발명의 단백질을 유효성분으로 포함하는 항균제는 항균제 내성 문제를 근본적으로 해결할 수 있으며, 이에 따라 항균제로서의 제품 수명을 증가시킬 수 있다.
따라서, 병원성 세균에 대한 사멸능을 가지는 본 발명의 단백질을 유효성분으로 포함하는 항생제는 항균 효과, 살균 효과 및 방부 효과가 뛰어난 항생제로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 LysSAP26 단백질을 유효성분으로 포함하는 병원성 세균 사멸용 소독제를 제공한다.
상기 병원성 세균에 선택적 사멸능을 가지는 본 발명의 LysSAP26 단백질을 유효성분으로 포함하는 소독제는 병원 감염을 막기 위한 병원 및 보건용의 소독제로 유용하게 사용될 수 있고 또한, 일반 생활 소독제, 식품 및 조리 장소 및 설비의 소독제, 축산산업의 축사 소독제로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 LysSAP26 단백질을 유효성분으로 포함하는 병원성 세균 사멸용 식품 첨가제를 제공한다.
본 발명의 식품 첨가제는 식품에 추가적으로 첨가되는 보존료, 살균제, 산화 방지제, 향신료, 조미료, 감미료, 착향료, 팽창제, 강화제, 개량제, 유화제, 여러 가지 영양제, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색료, 발색제, 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 소포제, 용제, 이형제, 방부제, 품질 개량제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등이 있으며, 식품에 침지, 분무 또는 혼합하여 첨가할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 LysSAP26 단백질을 유효성분으로 포함하는 병원성 세균 사멸용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 LysSAP26 단백질은 세균의 감염을 예방 또는 치료하는 목적으로 하는 축산용 사료 및 축산용 음수의 첨가제로서 사용될 수 있으며, 동물의 사료 섭취, 성장, 사료 효율, 생존율, 사양 상태, 생산능 등을 개선시키거나 유지시킬 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1> 박테리오파지 유전체 유래 아미노산 서열로 구성된 재조합 단백질 LysSAP26의 생산 및 정제
황색포도상구균에 특이적 사멸능을 가지는 시포비리대 과(Siphoviridae)의 박테리오파지 SAP26(기탁번호 KCTC 11665BP)의 오픈 리딩 프레임(open reading frame26; ORF26)을 포함하는 단편을 얻기 위해, 박테리오파지 SAP26의 gDNA을 추출하였다. 상기 gDNA를 주형으로 하여 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR)을 수행하였으며, 이때 사용된 프라이머는 다음과 같다: nde1-SAPlys: GGGAATTCCATATGAAAACATACAGTGAAGC, xho1-SAPlys: ATCCGCTCGAGAAACACTTCTTTCACAATC. 상기 PCR 단편은 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 원하는 크기의 밴드를 용리하여 수득하였다.
상기 PCR 단편은 제한효소 NdeI 및 XhoI를 처리하여 절단한 후, 동일한 효소로 절단된 발현 벡터(pET21a)와 라이게이션(ligation)하였다. 대장균 BL21(DE3)을 상기 제작된 벡터로 형질전환(LysSAP26-pET21a)시킨 후, 100 ㎍/ml의 암피실린(ampicillin)이 첨가된 LB 액체 배지에서 세균의 흡광도가 0.6(600 nm 파장)이 될 때 까지 배양하였다. 다음으로 최종 농도가 0.1 mM이 되도록 IPTG(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하고, 18℃에서 16시간 동안 배양하여 단백질이 발현될 수 있도록 유도하였다.
이후, 세균을 수확한 후, 용해 버퍼[50 mM Tris-Cl(pH 8.0), 200 mM NaCl] 및 초음파 파쇄기로 세균을 파쇄하였다. 파쇄된 세균 용해물을 원심분리하여 상등액을 취하고, Ni-NTA 컬럼에 주입하였으며, 용출 버퍼[500 mM 이미다졸(imidazole), 50 mM Tris-Cl(pH 8.0), 200 mM NaCl]를 이용하여 C-말단에 6개의 히스티딘(histidine)이 태그 된 LysSAP26 단백질을 정제하였다.
상기 정제된 LysSAP26 단백질을 확인하기 위하여, SDS-PAGE (12%)를 수행한 후, 쿠마씨 블루(coomassie blue) 염색한 결과, 도 3과 같이 LysSAP26 단백질이 30.1 kD에서 확인되었으며 anti-6xHis monoclonal antibody를 사용하여 웨스턴 분석을 한 결과 30.1 kD의 단백질이 6xHis 태그된 LysSAP26임을 확인하였다.
도 3A에서 M은 단백질 크기 마커, 1, 2는 Ni-NTA 컬럼에서 LysSAP26을 수확한 분획 2 가지 샘플이고, 도 3B는 LysSAP26에 대한 anti-6xHis monoclonal antibody를 사용한 웨스턴 시험결과이다.
LysSAP26의 아미노산 서열과 수는 도 1과 같이 히스티딘 태그 포함 259개의 아미노산으로 구성되며 총 크기가 30.1 kDa이다. 유전자 암호화 서열은 도 2와 같이 777 bp이다.
< 실시예 2> LysSAP26의 세균 사멸능 분석
그람 양성 세균인 황색포도상구균 Staphylococcus aureus ATCC 33591과 그람 음성 세균인 Acinetobacter baumannii 표준균주 2 주(ATCC 17978, ATCC 19606)와 임상균주인 다약제 내성 Acinetobacter baumannii 1656-2, 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니 세균(carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii, CRAB) 16주를 대상으로 LysSAP26의 세균사멸능을 다음과 같이 실행하였다(도 4). CRAB 16주는 아시네토박터 바우마니의 sequence type(ST) 아종별로 다음과 같이 선택되었다: ST357 3주, ST208 3주, ST552 1주, ST191 3주, ST369 3주, 그리고 ST229 3주. 다른 여러 가지 세균에 대한 사멸능도 함께 분석하였는데 그 대상 세균은 다음과 같다: Streptococcus agalactiae ATCC 13813, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis 1주, Corynebacterium diphtheria 1주, Bacillus cereus 1주, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Escherichia coli ATCC 25922.
각 세균은 Luria Bertani(LB) broth를 이용하여 5×10⁴CFU/well 의 세균수가 되도록 준비하고, 여기에 정제된 LysSAP26 단백질을 각각 3.12, 6.25, 12.5, 25, 50 ug/well 이 되도록 가하여 35℃에서 16 시간 동안 반응시킨 다음, 세균의 생장정도(탁도)를 관찰하였다.
그 결과, well plate에서 모든 대조군(-LysSAP26)에서는 세균의 생장이 관찰되는 반면에 시험군(+LysSAP26)에서는 황색포도상구균은 50 ug 이상의 효소량에서 균의 생장이 관찰되지 않은 반면에(도 4A), 아시네토박터 바우마니 세균은 12.5 ug 까지 처리한 반응액에서 세균의 생장이 관찰되지 않은 투명한 액상을 보이며, 이에 사멸 효과를 갖는 것을 확인하였다(도 4B). 또한, 다양한 세균 대상으로 한 세균 사멸능 시험 결과, 50 ug의 LysSAP26 처치에서는 Staphylococcus aureus ATCC 33591, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis 1주(도 4의 C, 2-4번), Salmonella typhimurium ATCC 14028, 그리고 Escherichia coli ATCC 25922(도 4의 C, 7, 8번)가 사멸하였으며, 25 ug의 LysSAP26 처치에서는Corynebacterium diphtheria 1주와 Bacillus cereus ATCC 14579(도 4의 C, 5, 6번), Streptococcus agalactiae 1주와 아시네토박터 바우마니 1주가 6.25 ug의 LysSAP26 효소 처리한 농도까지 사멸되었다(각각 도 4의 C, 1번과 9번).
한편, 하기에 본 발명의 단백질을 이용한 제제예를 예시하나 이는 본 발명을 이에 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
[제제예 1: 산제의 제조]
재조합 단백질 LysSAP26 300 ㎎
유당 100 ㎎
탈크 10 ㎎
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
[제제예 2: 정제의 제조]
재조합 단백질 LysSAP26 300 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
[제제예 3: 캡슐제의 제조]
재조합 단백질 LysSAP26 300 ㎎
결정성 셀룰로오스 3 ㎎
락토오스 14.8 ㎎
마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
[제제예 4: 주사제의 제조]
재조합 단백질 LysSAP26 300 ㎎
만니톨 180 ㎎
주사용 멸균 증류수 2974 ㎎
Na2HPO4·2H2O 26 ㎎
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
[제제예 5: 액제의 제조]
재조합 단백질 LysSAP26 300 ㎎
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 로 조절한 후 갈색 병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
[제제예 6: 식품 첨가제 제조]
시판 중인 S 제조의 우유 200 mL에 본 발명의 재조합 단백질 LysSAP26을 1%(w/v) 첨가하여 본 발명에 따른 우유 조성물을 제조하였다.
[제제예 7: 사료 첨가제 제조]
본 발명의 재조합 단백질 LysSAP26 100 g 및 적량의 부형제를 혼합하여 사료 첨가제의 제조방법에 따라 사료 첨가제를 제조하였다.
[제제예 8: 사료 제조]
본 발명의 재조합 단백질 LysSAP26 50 g, 버섯배지 200 g, 소맥피 30 g, 비트펄프 50 g, 쌀주정박 220 g, 옥수수후레이크 200 g, 전지대두 40 g, 전분박 100 g, 콘싸일리지 200 g, 옥수수속대 180 g, 비지 400 g, 라이그라스 323 g, 지오라이트 14 g 및 타피오카 40 g을 혼합하여 통상의 사료 제조방법에 따라 사료를 제조하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국생명공학연구원 KCTC11665BP 20100311
<110> KYUNGPOOK NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Use of novel recombinant enzyme LysSAP26 killing pathogenic bacteria <130> ADP-2018-0275 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 259 <212> PRT <213> Siphoviridae bacteriophage SAP26 <400> 1 Met Lys Thr Tyr Ser Glu Ala Arg Ala Arg Leu Arg Trp Tyr Gln Gly 1 5 10 15 Arg Tyr Ile Asp Phe Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr Gln Cys Ala Asp Leu 20 25 30 Ala Val Asp Tyr Ile Tyr Trp Leu Leu Glu Ile Arg Met Trp Gly Asn 35 40 45 Ala Lys Asp Ala Ile Asn Asn Asp Phe Lys Asn Met Ala Thr Val Tyr 50 55 60 Glu Asn Thr Pro Ser Phe Val Pro Gln Ile Gly Asp Val Ala Val Phe 65 70 75 80 Thr Lys Gly Ile Tyr Lys Gln Tyr Gly His Ile Gly Leu Val Phe Asn 85 90 95 Gly Gly Asn Thr Asn Gln Phe Leu Ile Leu Glu Gln Asn Tyr Asp Gly 100 105 110 Asn Ala Asn Thr Pro Ala Lys Leu Arg Trp Asp Asn Tyr Tyr Gly Cys 115 120 125 Thr His Phe Ile Arg Pro Lys Tyr Lys Ser Glu Gly Leu Met Asn Lys 130 135 140 Ile Thr Asn Lys Val Lys Pro Pro Ala Gln Lys Ala Val Gly Lys Ser 145 150 155 160 Ala Ser Lys Ile Thr Val Gly Ser Lys Ala Pro Tyr Asn Leu Lys Trp 165 170 175 Ser Lys Gly Ala Tyr Phe Asn Ala Lys Ile Asp Gly Leu Gly Ala Thr 180 185 190 Ser Ala Thr Arg Tyr Gly Asp Asn Arg Thr Asn Tyr Arg Phe Asp Val 195 200 205 Gly Gln Ala Val Tyr Ala Pro Gly Thr Leu Ile Tyr Val Phe Glu Ile 210 215 220 Ile Asp Gly Trp Cys Arg Ile Tyr Trp Asn Asn His Asn Glu Trp Ile 225 230 235 240 Trp His Glu Arg Leu Ile Val Lys Glu Val Phe Leu Glu His His His 245 250 255 His His His <210> 2 <211> 780 <212> DNA <213> Siphoviridae bacteriophage SAP26 <400> 2 atgaaaacat acagtgaagc aagagcaagg ttacgttggt atcaaggtag atatattgat 60 tttgacggtt ggtatggtta ccaatgtgca gatttagcag ttgattacat ttattggttg 120 ttagaaatta gaatgtgggg aaatgcaaaa gatgcaatca ataacgattt taaaaacatg 180 gcaacagtat atgaaaacac accatcgttt gttccacaaa taggtgatgt ggctgtattt 240 accaaaggaa tatataaaca atacggtcat attggtttag tgtttaatgg tggtaataca 300 aaccaatttt taattttgga acagaactat gacggtaacg caaatacgcc tgcaaagtta 360 cgttgggata attattacgg ctgtactcac tttattagac ctaagtataa aagtgagggc 420 ttaatgaata agatcacaaa taaagttaaa ccacctgctc aaaaagcagt cggtaaatct 480 gcaagtaaaa taacagttgg aagtaaagcg ccttataacc ttaaatggtc aaaaggtgct 540 tattttaatg cgaaaatcga cggcttaggt gctacttcag ccactagata cggtgataat 600 cgtactaact atagattcga tgttggacag gctgtatacg cgcctggaac attaatatat 660 gtgtttgaaa ttatagatgg ttggtgtcgc atttattgga acaatcataa tgagtggata 720 tggcatgaga gattgattgt gaaagaagtg tttctcgagc accaccacca ccaccactga 780 780

Claims (9)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 LysSAP26 단백질을 유효성분으로 포함하며, 아시네토박터 바우마니, 살모넬라, 대장균, 코리네박테리움, 바실러스 및 스트렙토코쿠스로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 병원성 세균 감염에 의한 병원성 세균 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 병원성 세균 감염성 질환은 패혈증, 폐렴, 식중독, 감염, 농가진, 화농성 질환, 급성 피부염, 창상 감염, 균혈증, 심내막염 및 장염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 병원성 세균 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 LysSAP26 단백질을 유효성분으로 포함하는 아시네토박터 바우마니, 살모넬라, 대장균, 코리네박테리움, 바실러스 및 스트렙토코쿠스로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 병원성 세균 사멸용 항생제.
  7. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 LysSAP26 단백질을 유효성분으로 포함하는 아시네토박터 바우마니, 살모넬라, 대장균, 코리네박테리움, 바실러스 및 스트렙토코쿠스로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 병원성 세균 사멸용 소독제.
  8. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 LysSAP26 단백질을 유효성분으로 포함하는 아시네토박터 바우마니, 살모넬라, 대장균, 코리네박테리움, 바실러스 및 스트렙토코쿠스로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 병원성 세균 사멸용 식품 첨가제.
  9. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 LysSAP26 단백질을 유효성분으로 포함하는 아시네토박터 바우마니, 살모넬라, 대장균, 코리네박테리움, 바실러스 및 스트렙토코쿠스로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 병원성 세균 사멸용 사료 첨가제.
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