KR102358469B1 - 물봉선 유래 항균 펩타이드 및 이를 함유하는 항균용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 물봉선(Impatiens balsamina) 유래 항균 펩타이드 및 이를 함유하는 항균용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 종래 항진균 활성이 알려진 물봉선 유래 펩타이드 Ib-AMP4 서열을 기반으로 펩타이드 유도체 6종을 제조하였고, 이중 Ib-AMP4에 비해 우수한 항균 및 항진균 활성을 나타내고, 세포 독성 및 용혈성이 미미한 펩타이드 유도체를 확인하였으므로, 상기 펩타이드 유도체는 물봉선 유래 항균 펩타이드로서 의약·화장품·식품 분야에서 항균 또는 항진균용 약학적 조성물, 항생제, 식품 방부제, 화장품 보존제, 의약품 보존제 또는 사료 첨가제 등으로 활용될 수 있다.

Description

물봉선 유래 항균 펩타이드 및 이를 함유하는 항균용 조성물{Antimicrobial peptide derived from Impatiens balsamina and antimicrobial composition comprising the same}
본 발명은 물봉선(Impatiens balsamina) 유래 항균 펩타이드 및 이를 함유하는 항균용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 물봉선으로부터 유래하여 항균 및 항진균 활성을 나타내고, 세포 독성 및 용혈성이 미미한 항균 펩타이드 및 이를 함유하는 항균 또는 항진균용 조성물에 관한 것이다.
항균 또는 항진균 효과가 있는 항생제는 미생물은 죽이면서 인체 또는 동물에게는 독성이 낮고 체내의 효소 등에 의해 비활성화되지 않는 선택적 독성작용(selective toxicity)을 갖는 물질이다. 이는 주로 DNA의 복제, 유전정보의 전사 및 해독, 전사 에너지의 수송, 세포벽의 생합성 등을 저해함으로써 미생물의 증식을 억제하는 기전을 통해 효과를 나타낸다.
그러나 광범위하고 무분별한 항생제 사용으로 인해 항생제 내성을 가지는 균주들이 증가하고 있다. 미국 질병통제센터(CDC)의 AMR(antimicrobial resistance) 병원 항생제 보고서에 따르면, 항생제의 오남용으로 인해 2006년 한해 동안 약 10만명이 MRSA(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)에 감염되었고 그 중 사망자는 약 2만명이었다. 2010년에는 국내에서도 슈퍼박테리아라 일컬어지는 NDM-1(New Delhi metalo-beta-lactamase) 유전자를 함유한 카바페넴 내성 장내균(Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, CRE)이 발견되는 등 내성균에 의한 위험성이 증가하고 있다. 현재 전 세계적으로 이루어지는 감염성 질환에 대한 연구의 대부분은 병원균의 대사나 생합성 경로를 선택적으로 억제 또는 제어하는 항생 물질의 개발과 약독화 병원균의 배양에 의한 백신 개발에 초점이 맞추어져 있다. 기존의 항생 물질의 경우 숙주의 대사 및 생합성 경로를 조절하는 효소도 동시에 억제하여 부작용과 독성을 나타내는 경우가 많고 내성 문제로 사용이 제한되고 있으며, 백신 개발만으로는 신종 병원균에 신속하게 대처할 수 없는 문제점이 있다. 따라서 감염성 질환을 초기에 효과적으로 제어할 수 있는 새로운 패러다임의 감염 치료제의 개발이 시급한 실정이며, 최근 들어 국내외 연구진들은 기존의 문제점을 해결할 수 있는 방안으로 항균 펩타이드(antimicrobial peptide, AMP)에 주목하고 있다.
항균 펩타이드(antimicrobial peptide, AMP)는 감염 과정에서 거의 모든 종의 즉각적인 비특이적 방어 메커니즘의 구성요소이다. 이들은 주로 양전하(+2~+9)를 띠고 있으며, 30% 이상의 소수성 아미노산 잔기를 포함하고 있다. 이러한 특징으로 인해 항균 펩타이드가 음전하를 띤 세균 세포막과 접촉하게 되면 양극성 α-헬릭스(amphipathic α-helix) 혹은 β-시트(β-sheet)를 형성하여 세포막 속으로 들어갈 수 있다. 항균 펩타이드가 표적 세균의 세포막에 들어가게 되면 양전하를 갖는 항균 펩타이드가 음전하를 띠는 박테리아, 바이러스 또는 곰팡이의 지질막과 결합하여 지질막의 불안정화를 일으키고, 세포막의 전위를 소실시켜 세균을 죽이는 것으로 알려져 있다. 천연에 존재하는 항균성 펩타이드는 새로운 항생제의 후보물질로서 대두되었고, 이는 기존에 사용되고 있는 화합물성 항생제와 다른 작용기작을 통하여 항균 활성을 나타내기 때문에 항생제 내성 균주에 대한 문제를 해결할 수 있을 것으로 기대되고 있다.
일예로 물봉선(Impatiens balsamina)의 종자에서는 밀접하게 관련된 4종의 항균 펩타이드가 분리되었고, 각각 Ib-AMP1, Ib-AMP2, Ib-AMP3 및 Ib-AMP4로 명명되어 있다. 이들 펩타이드들은 염기성이며 2개의 분자간 이황화 결합을 형성하는 4개의 시스테인 잔기를 포함한다. 특히, Ib-AMP4는 후자리움 쿨모룸(Fusarium culmorum), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea) 및 마이코스파에렐라 피지엔시스(Mycosphaerella fijiensis)와 같은 다양한 식물병원성 진균을 억제하며 인간 세포에 세포독성이 없다는 주요 이점이 있다. 그러나 대장균과 같은 그람 음성균에 대해 항균 활성이 낮은 것으로 나타나고, 원치 않는 이성질체를 생성하는 이황화 결합의 형성으로 합성이 용이하지 않고 비용이 많이 든다는 단점이 있다.
이에, 본 발명자들은 우수한 항균 및 항진균 활성을 나타내고 합성이 용이한 물봉선 유래 항균 펩타이드를 개발하기 위해 노력한 결과, 물봉선 유래 항균 펩타이드 Ib-AMP4 서열을 기반으로 3차원 구조분석을 수행하여 펩타이드 유도체 6종을 제조하였고, 이중 Ib-AMP4에 비해 항균 및 항진균 활성이 현저히 우수하고, 세포 독성 및 용혈성이 미미한 펩타이드 유도체를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
대한민국 공개특허 제10-2020-0056194호
Tailor RH, Acland DP, Attenborough S, et al. A novel family of small cysteine-rich antimicrobial peptides from seed of Impatiens balsamina is derived from a single precursor protein. J Biol Chem. 1997, 272:24480-24487. Thevissen K, Francois isabelle EJA, Sijtsma L, et al. Antifungal activity of synthetic peptides derived from Impatiens balsamina antimicrobial peptides Ib-AMP1 and Ib-AMP4. Peptides. 2005, 26:1113-1119. Florez-Castillo J.M, Perullini M, Jobbagy M. et al. Enhancing Antibacterial Activity Against Escherichia coli K-12 of Peptide Ib-AMP4 with Synthetic Analogues. Int J Pept Res Ther. 2014, 20:365-369.
기존의 물봉선(Impatiens balsamina) 유래 항균 펩타이드는 항진균 활성을 나타내나 대장균과 같은 그람 음성균에 대해 항균 활성이 낮다는 단점이 있다.
이에, 본 발명의 목적은 물봉선 유래 펩타이드로서 우수한 항균 및 항진균 활성을 나타내고, 세포 독성 및 용혈성이 미미한 항균 펩타이드 및 이를 함유하는 항균 또는 항진균용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 일반식 1의 아미노산 서열로 이루어진 물봉선(Impatiens balsamina) 유래 펩타이드를 제공한다:
[일반식 1]
(N-말단)-GPX1RRYX2RR-(C-말단)
상기 식에서, X1은 G(글리신) 및 W(트립토판)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이고, X2는 C(시스테인), A(알라닌) 및 W(트립토판)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이다.
또한, 본 발명은 상기 물봉선 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균 또는 항진균용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 물봉선 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 물봉선 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 식품 방부제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 물봉선 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 화장품 보존제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 물봉선 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 의약품 보존제를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 물봉선 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명에서는 기존의 항진균 활성이 알려진 물봉선(Impatiens balsamina) 유래 펩타이드 Ib-AMP4 서열을 기반으로 3차원 구조분석을 수행하여 펩타이드 유도체 6종을 제조하였고, 이중 Ib-AMP4에 비해 우수한 항균 및 항진균 활성을 나타내고, 세포 독성 및 용혈성이 미미한 펩타이드 유도체를 확인하였으므로, 상기 펩타이드 유도체는 물봉선 유래 항균 펩타이드로서 의약·화장품·식품 분야에서 항균 또는 항진균용 약학적 조성물, 항생제, 식품 방부제, 화장품 보존제, 의약품 보존제 또는 사료 첨가제로 활용될 수 있다.
도 1은 물봉선(Impatiens balsamina) 유래 항균 펩타이드 Ib-AMP4 및 이의 서열을 기반으로 선정한 6종의 펩타이드 유도체 VESCA-NH2, VESCA-NH4, VESCA1, VESCA2, VESCA3 및 VESCA-OH의 3차원 구조를 나타낸 도이다.
도 2는 벌독 유래 항균 펩타이드인 멜리틴(Melittin), 물봉선 유래 항균 펩타이드 Ib-AMP4 및 VESCA3의 세포생존율(cell viability)을 확인한 도이다.
도 3은 멜리틴, Ib-AMP4 및 VESCA3의 용혈성(Hemolytic activity)을 확인한 도이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 일반식 1의 아미노산 서열로 이루어진 물봉선(Impatiens balsamina) 유래 펩타이드를 제공한다:
[일반식 1]
(N-말단)-GPX1RRYX2RR-(C-말단)
상기 식에서, X1은 G(글리신) 및 W(트립토판)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이고, X2는 C(시스테인), A(알라닌) 및 W(트립토판)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이다.
본 발명에 있어서 상기 X1은 G(글리신) 및 W(트립토판)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이고, X2는 C(시스테인), A(알라닌) 및 W(트립토판)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 구체적으로 X1은 G(글리신) 및 W(트립토판)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이고, X2는 C(시스테인) 및 W(트립토판)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 3 내지 5의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 보다 구체적으로 서열번호 3 또는 5의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 보다 더 구체적으로 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 상기 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성방법에 따라 제조될 수 있다.
또한, 상기 펩타이드는 C-말단이 아미드화(amidation)된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 물봉선 유래 펩타이드는 항균 활성을 가지고, 구체적으로 대장균 속(Escherichia genus) 또는 스타필로코커스 속(Staphylococcus genus)에 대한 항균 활성을 가지며, 보다 구체적으로 대장균 속 미생물로 대장균(Escherichia coli) 또는 스타필로코커스 속 미생물로 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 항균 활성을 가진다.
또한, 상기 물봉선 유래 펩타이드는 항진균 활성을 가지고, 구체적으로 칸디다 속(Candida genus) 또는 아스퍼질러스 속(Aspergillus genus)에 대한 항진균 활성을 가지며, 보다 구체적으로 칸디다 속 미생물로 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 또는 아스퍼질러스 속 미생물로 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)에 대한 항진균 활성을 가진다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 물봉선(Impatiens balsamina) 유래 항균 펩타이드로서 항진균 활성이 우수하다고 보고된 Ib-AMP4(서열번호 8) 서열을 기반으로 3차원 구조분석을 통해 6종의 펩타이드 유도체 VESCA-NH2(서열번호 1), VESCA-NH4(서열번호 2), VESCA1(서열번호 3), VESCA2(서열번호 4), VESCA3(서열번호 5) 및 VESCA-OH3(서열번호 6)을 선정하였다(표 1 및 도 1 참조).
또한, 본 발명자들은 3종의 박테리아 균주, 구체적으로 대장균(Escherichia coli), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 큐티박테리움 아크네(Cutibacterium acnes), 2종의 곰팡이 균주, 구체적으로 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)에 대하여 상기 6종의 펩타이드 유도체 및 Ib-AMP4의 항균 및 항진균 활성을 분석하였다. 그 결과, 대장균 및 스타필로코커스 아우레우스에 대해 Ib-AMP4은 항균 활성이 미미한 반면 VESCA3은 항균 활성이 우수한 것을 확인하였다. 또한, 칸디다 알비칸스 및 아스퍼질러스 나이거에 대해 VESCA1 내지 VESCA3은 Ib-AMP4과 비교하여 동일 또는 우수한 항진균 활성을 가지고, 이중 VESCA3은 가장 우수한 항진균 활성을 가지는 것을 확인하였다(표 2 참조).
아울러, 본 발명자들은 상기 가장 우수한 항진균 활성을 가지는 VESCA3의 세포독성 및 용혈성을 분석한 결과, Ib-AMP4와 유사하게 세포독성 및 용혈성이 미미한 것을 확인하였다(표 3 및 표 4, 도 2 및 도 3 참조).
따라서, 본 발명에서는 6종의 물봉선 유래 펩타이드 유사체를 제조하였고, 이중 Ib-AMP4에 비해 항균 및 항진균 활성이 현저히 우수하고, 세포 독성 및 용혈성이 미미한 펩타이드 유사체를 확인하였으므로, 상기 펩타이드 유사체는 항균 펩타이드로서 의약·화장품·식품 분야에서 항균 또는 항진균용 약학적 조성물, 항생제, 식품 방부제, 화장품 보존제, 의약품 보존제 또는 사료 첨가제로 활용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 물봉선 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균 또는 항진균용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 항균 또는 항진균용 조성물은 균주나 곰팡이와 같은 미생물의 생육을 억제하는 활성을 가진 조성물로서, 항균 또는 항진균 효과가 요구되는 다양한 분야에 사용되는 모든 형태가 포함될 수 있다. 예를 들면 항균 또는 항진균용 조성물은 의약품, 의약외품, 식품첨가제, 화장품첨가제 또는 사료첨가체 등의 형태일 수 있다. 또한 의약에 있어서는 항생제나 오염방지제와 같은 목적으로, 식품에 있어서는 방부나 항균 목적으로, 농업에 있어서는 항균, 살균, 소독의 목적으로 화장품이나 생활용품에 있어서는 비듬억제용, 무좀방지용, 겨드랑이 채취억제용, 세정제 등에 방부나 항균 또는 살균 목적으로 사용되어 질 수 있으며, 전술한 목적으로만 한정되는 것은 아니다. 따라서 본 발명의 제제예에 따른 항균 또는 항진균용 조성물은 약학적 조성물인 항생제, 의약품 보존제, 식품 방부제, 화장품 보존제 또는 사료 첨가제의 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 항균 또는 항진균용 조성물은 구체적으로 대장균 속, 스타필로코커스 속, 칸디다 속 또는 아스퍼질러스 속에 대한 항균 또는 항진균용 조성물일 수 있고 보다 구체적으로 대장균, 스타필로코커스 아우레우스, 칸디다 알비칸스 또는 아스퍼질러스 나이거에 대한 항균 또는 항진균용 조성물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이에 본 발명은 상기 물봉선 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균 또는 항진균용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 항균 또는 항진균용 약학적 조성물은 감염성 질환의 예방 또는 치료 용도이며, 구체적으로 감염성 질환은 장내 병원성 세균, 보다 구체적으로 대장균 또는 스타필로코커스 아우레우스에 의해 발병되는 질환으로, 예를 들어, 식중독, 장티푸스, 복막염, 궤양성 대장염, 크론병, 장관 베체트병, 감염성 설사, 위장염, 염증성 장질환, 신경성 장염 증후군, 소장 미생물 과성장증, 장관 급이성 설사 또는 허혈성 장염을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 구체적으로 감염성 질환은 곰팡이 균주, 보다 구체적으로 칸디다 알비칸스 또는 아스퍼질러스 나이거에 의해 발병되는 질환으로, 예를 들어, 칸디다증, 칸디다성 구내염, 칸디다 과잉증, 무좀 또는 아스페르길루스증을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항균 또는 항진균용 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화 할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 제제예에 따른 항균 또는 항진균용 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 투여량은 개체의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 펩타이드의 일일 투여량은 2~10 mg/kg, 바람직하게는 4~8 mg/kg이나 임상결과에 따라 가감될 수 있으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 물봉선 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제, 식품 방부제, 화장품 보존제 또는 의약품 보존제를 제공한다.
이때, 식품 방부제, 화장품 보존제 및 의약품 보존제는 식품이나 의약품의 변질, 부패, 변색 및 화학변화를 방지하기 위해 사용되는 첨가물로서 살균제, 산화방지제가 이에 포함될 수 있고, 세균, 곰팡이, 효모 등 미생물의 증식을 억제하여 식품 및 의약품에서 부패미생물의 발육저지 또는 살균작용을 하는 등의 기능성 항생제도 포함된다. 이러한 식품 방부제 및 화장품, 의약품 보존제의 이상적인 조건으로는 독성이 없어야 하며, 미량으로도 효과가 있어야 한다.
본 발명의 제제예에 식품 방부제는 공지의 식품 방부제 중 1종 이상 포함하여 제조될 수 있다. 식품 방부제로는 데히드로초산, 소르빈산칼륨, 소르빈산칼슘, 안식향산나트륨, 안식향산칼륨, 안식향산칼슘, 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 프로피온산나트륨, 프로피온산칼슘 등이 사용되고 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 제제예에 따른 식품 방부제는 상기 펩타이드를 식품 방부제 총 중량에 대해 0.01 내지 1중량% 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 제제예에 따른 화장품 보존제는 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태에 포함하여 제조될 수 있다. 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다.
또한, 본 발명의 화장품 보존제는 상기 펩타이드 외에 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 포함함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다. 또한, 적합한 화장품의 제형으로는, 예를 들면 상기 펩타이드를 첨가한 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한 폼(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 포함한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.
아울러, 본 발명은 상기 물봉선 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 제제예에 따른 사료 첨가제는 사료 원료에 적절하게 배합하여 사료로 제공되는데, 상기 사료 원료로 곡물유, 조강류, 식물성 유박류, 동물성 사료 원료, 기타 사료 원료, 정제품 등이 사용되고 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 물봉선( Impatiens balsamina ) 유래 항균 펩타이드 제조
물봉선(Impatiens balsamina) 유래 항진균 단백질로 알려진 Ib-AMP (antimicrobial peptide, 서열번호 7)는 항균 펩타이드 서열이 반복되어 포함되어 있으며, 4가지 (Ib-AMP1, Ib-AMP2, Ib-AMP3, Ib-AMP4)가 보고되어 있다. 그 중 비교적 항진균 활성이 우수하다고 보고된 Ib-AMP4(서열번호 8)를 모티브로 하여 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 6종의 펩타이드 유도체들을 선정하였다.
구체적으로, 6종의 펩타이드 유도체들은 Ib-AMP4 서열에 근거해 In silico prediction computational modeling program (PEP-FOLD3)을 사용하여 구조분석을 수행하고, 생성된 3차원 구조를 바탕으로 분석, 설계 변형하였다.
이를 통해, 도 1에 나타낸 바와 같이, N-말단 헬릭스(N-terminal helix)를 기반으로 한 펩타이드 유도체군(VESCA-NH2, VESCA-NH4), C-말단 헬릭스(C-terminal helix)를 기반으로 한 펩타이드 유도체군(VESCA1, VESCA2, VESCA3) 및 2개의 헬릭스(helix)를 합친 형태의 펩타이드 유도체군(VESCA-OH3)을 선정하였고, 선정한 6종의 펩타이드 유도체들을 합성하였다.
물질명 분자량(Da) 서열번호
Theoretical observed
Ib-AMP4 2542.96 2543.14 8
VESCA-NH2 1080.21 1080.80 1
VESCA-NH4 1270.53 1271.02 2
VESCA1 1119.31 1120.09 3
VESCA2 1087.24 1088.08 4
VESCA3 1331.53 1332.32 5
VESCA4 2142.53 2142.76 6
* 펩타이드는 C-말단이 아미드화(amidation) 됨.
<실험예 1> 물봉선 유래 항균 펩타이드의 항균 및 항진균 활성 확인
상기 <실시예 1>에서 제조한 6종의 펩타이드 유도체들의 항균 및 항진균 활성을 알아보기 위하여, 박테리아(bacteria) 균주 3종 및 곰팡이(fungi) 균주 2종을 이용하여 항균 및 항진균 활성 분석을 수행하였다.
구체적으로, 항균 및 항진균 활성 분석을 위해 최소억제농도(Minimal Inhibitory Concentration, MIC)를 측정하였다. 박테리아 균주 3종으로 대장균(Escherichia coli KCCM 41290), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus KCTC 1621), 큐티박테리움 아크네(Cutibacterium acnes KCTC 3314)를 이용하였고, 곰팡이 균주 2종으로 칸디다 알비칸스(Candida albicans KCTC 17712), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger KCTC 6317)를 이용하였다. 대장균 및 스타필로코커스 아우레우스 배양은 LB 배지(Luria-Bertani Medium, BD Difco), 큐티박테리움 아크네 배양은 RCM 배지(Reinforced Clostridial Medium, BD Difco)에서 진행하였다. 칸디다 알비칸스 및 아스퍼질러스 나이거 배양은 PD 배지(Potato Dextrose Medium, BD Difco)에서 진행하였다. 전 배양한 미생물 또는 포자를 5×103 CFU/mL가 되도록 배지에 희석하고, 상기 <실시예 1>에서 제조한 6종의 펩타이드 유도체들 각각을 정해진 농도로 첨가하였다. 그 후 박테리아 균주는 37℃로, 곰팡이 균주는 25℃로 18~24시간 동안 배양하고, 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 현탁도(OD600)를 측정하였다. 아스퍼질러스 나이거는 배지에 100 μM이 되도록 레자주린(resazurin) 시약을 첨가하여 현탁도 대신 형광값(Ex560, Em600)을 측정하였다. 대조군으로 Ib-AMP4를 이용하였고, 분석 결과는 3번 반복 실험에 의한 평균으로 나타내었다.
그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이, 대표적인 그람-음성 박테리아(Gram-negative bacteria)인 대장균에 대하여 Ib-AMP4는 매우 낮은 활성(>100 ㎍/mL)을 보이는 반면, VESCA3와 VESCA-OH3는 각각 60 ㎍/mL, 40 ㎍/mL의 MIC로 매우 우수한 항균 활성을 보였다.
대표적인 그람-양성 박테리아(Gram-positive bacteria)인 스타필로코커스 아우레우스에 대한 결과에서도 대장균 결과와 유사한 결과가 나타났다. Ib-AMP4(>100 ㎍/mL)와 비교하여 VESCA3와 VESCA-OH3 모두 5 ㎍/mL의 높은 항균 활성이 나타났다.
2종의 곰팡이 균주에 대해서는 칸디다 알비칸스의 경우, VESCA1 내지 VESCA3은 대조군 Ib-AMP4(60 ㎍/mL)와 동일하거나 우수한 항진균 활성이 나타났다. 특히, VESCA3은 대조군 Ib-AMP4에 비하여 3배 낮은 농도(20 ㎍/mL)의 MIC 값으로, 가장 높은 항진균 활성이 나타났다. 아스퍼질러스 나이거의 경우, VESCA1 내지 VESCA3, 및 VESCA-OH3은 Ib-AMP4(80 ㎍/mL)와 동일하거나 우수한 항진균 활성이 나타났다. 특히, VESCA3는 Ib-AMP4(80 ㎍/mL)에 비하여 2배 낮은 농도(40 ㎍/mL)의 MIC 값로, 가장 높은 항진균 활성이 나타났다.
균주 MIC (㎍/mL)
Ib-AMP4 VESCA-NH2 VESCA-NH4 VESCA1 VESCA2 VESCA3 VESCA-OH3
박테리아
대장균
(Escherichia coli)		 >100 >100 >100 >100 >100 60 40
스타필로코커스
아우레우스
(Staphylococcus aureus)		 >100 >100 >100 >100 >100 5 5
큐티박테리움
아크네
(Cutibacterium acnes)		 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100
곰팡이
칸디다 알비칸스
(Candida albicans)		 60 >100 100 40 60 20 100
아스퍼질러스
나이거
(Aspergillus niger)		 80 >100 >100 60 80 40 80
<실험예 2> 물봉선 유래 항균 펩타이드의 세포독성 확인
상기 <실험예 1>에서 항진균 활성이 가장 우수한 VESCA3를 이용하여 피부세포에 대한 세포독성 분석을 수행하였다.
구체적으로, 세포독성은 피부세포주인 L929 세포(Murine fibroblast cell line)을 사용하여 평가하였다. 또한, 비교군으로 Ib-AMP4 및 세포독성이 매우 강한 것으로 알려진 벌독 유래 항균 펩타이드 멜리틴(Melittin)을 이용하였다. L929 세포는 RPMI 1640 배지(Gibco)에 10% FBS (Sigma), 항생제-항진균제 칵테일(antibiotic-antimycotic cocktail, 페니실린 G(penicillin G) 100 IU/mL, 스트렙토마이신(streptomycin) 100 ㎍/mL, 암포테리신 B(amphotericin B) 250 ng/mL, Gibco)을 첨가하고, 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 96-웰 플레이트에 1×104 cell/well로 분주하고 18시간 동안 배양한 후, 펩타이드 각각을 1.25~160 ㎍/mL의 농도로 처리하고 24시간 배양하였다. 100 μL의 배지에 WST-1 reagent를 10 μL 첨가하고 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더를 이용하여 흡광값 450 nm (A450)를 측정하였다. 펩타이드 대신 0.1% 농도의 Triton X-100, PBS를 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용하였고, 세포생존율(Cell viability)은 다음 식에 근거하여 산출하였다: % Cell viability = [(A450 in peptides solution - A450 in PBS) / (A450 in 0.1% Triton X-100 - A450 in PBS)] × 100. 분석 결과는 3번 반복 실험에 의한 평균±표준편차(S.D)로 나타내었다.
그 결과, 표 3 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 멜리틴은 5 ㎍/mL의 매우 낮은 농도에서 2.1%의 세포생존율을 보이는 반면, Ib-AMP4 및 VESCA3는 유사한 패턴을 보이면서 160 ㎍/mL에서도 90% 이상의 세포생존율을 보였다.
펩타이드
농도(㎍/mL)		 Relative cell viability (%)
1.25 2.5 5.0 10 20 40 80 160
멜리틴
(Melittin)		 Mean
(S.D)		 97.4
(3.01)		 51.1
(3.23)		 2.1
(0.86)		 0.2
(0.22)		 0.8
(0.78)		 0.3
(0.57)		 0.5
(0.75)		 0.6
(0.57)
Ib-AMP4 Mean
(S.D)		 95.0
(6.16)		 94.4
(3.62)		 95.1
(3.44)		 95.7
(4.92)		 97.3
(3.56)		 90.4
(1.34)		 92.2
(2.58)		 89.2
(4.69)
VESCA3 Mean
(S.D)		 96.7
(5.85)		 103.8
(3.92)		 103.8
(5.95)		 97.1
(5.24)		 99.7
(6.51)		 91.9
(0.57)		 91.6
(0.22)		 94.9
(2.30)
<실험예 3> 물봉선 유래 항균 펩타이드의 용혈성 확인
상기 <실험예 1>에서 항진균 활성이 가장 우수한 VESCA3를 이용하여 용혈성(Hemolytic activity) 분석을 수행하였다.
구체적으로, 용혈성은 sRBC(sheep Red Blood Cells)를 사용하여 분석하였다. 또한, 비교군으로 Ib-AMP4 및 멜리틴을 이용하였다. Sheep blood defibrinated (MB cell)를 원심분리(4,000 × g, 10분, 4℃)한 후, PBS로 세척하는 과정을 3번 반복하고 PBS에 현탁하여 sRBC 용액(10% sRBC)을 제조하였다. 최종 농도가 5% sRBC 및 각 펩타이드 1.25~160 ㎍/mL가 되도록 혼합하여 상온에서 30분 동안 반응시킨 후 원심분리하여 상층액을 수거하였다. 수거한 상층액 중에 적혈구로부터 용출된 헤모글로빈의 흡광도를 414 nm(A414)에서 측정하였다. 0.1% Triton X-100을 양성대조군, PBS를 음성대조군으로 사용하였고 용혈성(% Hemolysis)은 다음의 식에 근거하여 산출하였다: % Hemolysis = [(A414 in peptides solution - A414 in PBS) / (A414 in 0.1% Triton X-100 - A414 in PBS)] × 100.
그 결과, 표 4 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 멜리틴은 20 ㎍/mL의 매우 낮은 농도에서 이미 100%에 가까운 높은 용혈성을 보이는 반면, Ib-AMP4와 VESCA3는 고농도의 160 ㎍/mL에서도 20% 이하의 낮은 용혈성을 보였다.
펩타이드
농도(㎍/mL)		 Hemolytic Activity (%)
1.25 2.5 5.0 10 20 40 80 160
멜리틴
(Melittin)		 Mean
(S.D)		 0.98
(3.46)		 3.40
(3.60)		 14.0
(1.57)		 25.02
(5.56)		 96.10
(2.69)		 99.36
(0.44)		 100.2
(0.81)		 100.0
(0.60)
Ib-AMP4 Mean
(S.D)		 4.09
(2.02)		 4.47
(2.50)		 7.42
(2.07)		 8.42
(2.71)		 10.15
(1.84)		 15.79
(0.87)		 16.61
(1.21)		 16.75
(1.36)
VESCA3 Mean
(S.D)		 4.41
(3.67)		 5.04
(4.17)		 4.69
(2.30)		 5.21
(2.42)		 6.93
(3.99)		 9.73
(2.33)		 11.62
(0.67)		 12.33
(1.39)
상기 결과를 통해 우수한 항균 및 항진균 활성을 나타내고, 세포 독성 및 용혈성이 미미한 물봉선 유래 펩타이드 유도체를 확인하였으므로, 상기 펩타이드 유도체는 안전한 항생제, 식품 방부제, 화장품 보존제, 의약품 보존제, 사료 첨가제 등으로 사용가능함을 알 수 있다.
<110> V&co <120> Antimicrobial peptide derived from Impatiens balsamina and antimicrobial composition comprising the same <130> P-21-0360 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VESCA-NH2 <400> 1 Asp Glu Trp Gly Arg Arg Cys Cys Gly 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VESCA-NH4 <400> 2 Tyr Glu Trp Lys Arg Arg Cys Cys Lys 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VESCA1 <400> 3 Gly Pro Gly Arg Arg Tyr Cys Arg Arg 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VESCA2 <400> 4 Gly Pro Gly Arg Arg Tyr Ala Arg Arg 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VESCA3 <400> 5 Gly Pro Trp Arg Arg Tyr Trp Arg Arg 1 5 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VESCA4 <400> 6 Glu Trp Val Arg Arg Lys Met Lys Phe Ile Asn Ser Leu Tyr Ser Trp 1 5 10 15 <210> 7 <211> 333 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ib-AMP <400> 7 Met Val Gln Lys Gly Val Val Phe Gly Val Leu Leu Ile Leu Phe Ile 1 5 10 15 Cys Ser Thr Leu Thr Ser Ala Asp Ser Lys Pro Asn Pro Thr Lys Glu 20 25 30 Glu Glu Pro Ala Lys Lys Pro Asp Glu Val Ser Val Lys Ser Gly Gly 35 40 45 Pro Glu Val Ser Glu Asp Gln Tyr Arg His Arg Cys Cys Ala Trp Gly 50 55 60 Pro Gly Arg Lys Tyr Cys Lys Arg Trp Cys Ala Asn Ala Glu Glu Ala 65 70 75 80 Ala Ala Ala Ile Pro Glu Ala Ser Glu Glu Leu Ala Gln Glu Glu Ala 85 90 95 Pro Val Tyr Ser Glu Asp Gln Trp Gly Arg Arg Cys Cys Gly Trp Gly 100 105 110 Pro Gly Arg Arg Tyr Cys Val Arg Trp Cys Gln Asn Ala Glu Glu Ala 115 120 125 Ala Ala Ala Ile Pro Glu Ala Thr Glu Lys Ala Gln Glu Ala Pro Val 130 135 140 Tyr Ser Glu Asp Gln Trp Gly Arg Arg Cys Cys Gly Trp Gly Pro Gly 145 150 155 160 Arg Arg Tyr Cys Val Arg Trp Cys Gln Asn Ala Glu Glu Ala Ala Ala 165 170 175 Ala Val Ala Ile Pro Glu Ala Ser Glu Lys Ala Gln Glu Gly Pro Val 180 185 190 Tyr Ser Glu Asp Gln Trp Gly Arg Arg Cys Cys Gly Trp Gly Pro Gly 195 200 205 Arg Arg Tyr Cys Val Arg Trp Cys Ser Asn Ala Ala Asp Glu Val Ala 210 215 220 Thr Pro Glu Asp Val Glu Pro Gly Gln Tyr Gly Arg Arg Cys Cys Asn 225 230 235 240 Trp Gly Pro Gly Arg Arg Tyr Cys Lys Arg Trp Cys His Asn Ala Ala 245 250 255 Glu Glu Ala Thr Leu Lys Ala Phe Glu Glu Glu Ala Ala Arg Glu Gln 260 265 270 Pro Val Tyr Ser Glu Asp Gln Trp Gly Arg Arg Cys Cys Gly Trp Gly 275 280 285 Pro Gly Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Trp Cys Gln Ser Ala Glu Glu Ala 290 295 300 Ala Ala Phe Gln Ala Gly Glu Val Thr Ala Ser Leu Met Leu Ile Met 305 310 315 320 Phe Lys Ala Cys Pro Cys Met Gly Pro Val Pro Ser Val 325 330 <210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ib-AMP4 <400> 8 Glu Trp Gly Arg Arg Cys Cys Gly Trp Gly Pro Gly Arg Arg Tyr Cys 1 5 10 15 Arg Arg Trp Cys 20

Claims (16)

  1. 일반식 1의 아미노산 서열로 이루어진 물봉선(Impatiens balsamina) 유래 펩타이드:
    [일반식 1]
    (N-말단)-GPX1RRYX2RR-(C-말단)
    상기 식에서, X1은 G(글리신)이고 X2는 C(시스테인)이거나, 또는 X1 및 X2는 모두 W(트립토판)임.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 3 또는 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 펩타이드는 항균 또는 항진균 활성을 가지는 것인 펩타이드.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 펩타이드는 대장균 속(Escherichia genus) 또는 스타필로코커스 속(Staphylococcus genus)에 대한 항균 활성을 가지는 것인 펩타이드.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 대장균 속 미생물은 대장균(Escherichia coli)이고, 스타필로코커스 속 미생물은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)인 펩타이드.
  8. 제 5항에 있어서, 상기 펩타이드는 칸디다 속(Candida genus) 또는 아스퍼질러스 속(Aspergillus genus)에 대한 항진균 활성을 가지는 것인 펩타이드.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 칸디다 속 미생물은 칸디다 알비칸스(Candida albicans)이고, 아스퍼질러스 속 미생물은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)인 펩타이드.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 펩타이드는 C-말단이 아미드화(amidation)된 것인 펩타이드.
  11. 제 1항, 및 제4항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균 또는 항진균용 약학적 조성물.
  12. 제 1항, 및 제4항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제.
  13. 제 1항, 및 제4항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 식품 방부제.
  14. 제 1항, 및 제4항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 화장품 보존제.
  15. 제 1항, 및 제4항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 의약품 보존제.
  16. 제 1항, 및 제4항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 사료 첨가제.
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