WO2019224941A1 - 食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤及びその使用 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a bacteriophage resistance inhibitor for food poisoning bacteria and use thereof. Specifically, the present invention relates to a bacteriophage resistance inhibitor for food poisoning bacteria, a bacteriophage resistance inhibitor for food poisoning bacteria, and a method for inhibiting bacteriophage resistance resistance of food poisoning bacteria.
- Bacteriophages lyse bacteria specifically for bacterial species, but some bacterial populations are resistant to bacteriophages. Therefore, effective measures against bacteriophage resistant bacteria are required. In order to solve this problem, a phage cocktail obtained by mixing a plurality of phage strains is used for the control of food poisoning bacteria. However, bacteriophage-resistant bacteria cannot be reliably controlled using phage cocktails.
- the present invention has been made in view of the above circumstances, and is effective against various types of food poisoning bacteria, and is an effective novel bacteriophage resistance inhibitor for food poisoning bacteria and use thereof, and food poisoning bacteria growth inhibition. And a method for inhibiting bacteriophage resistance of food poisoning bacteria.
- the present invention includes the following aspects.
- the bacteriophage resistance-inhibiting inhibitor of food poisoning bacteria according to the first aspect of the present invention contains a chelating agent or nisin as an active ingredient.
- the chelating agent may be ethylenediaminetetraacetic acid or a salt thereof.
- composition for inhibiting the growth of food poisoning bacteria according to the second aspect of the present invention comprises a bacteriophage and the bacteriophage resistance inhibitor for food poisoning bacteria according to the first aspect.
- the composition for inhibiting the growth of food poisoning bacteria according to the second aspect may be used for food.
- the use of the bacteriophage resistance inhibitor for food poisoning bacteria according to the third aspect of the present invention is the use of a bacteriophage resistance inhibitor for food poisoning bacteria containing a chelating agent or nisin as an active ingredient. Use for suppressing resistance to phages.
- the method for inhibiting bacteriophage resistance of food poisoning bacteria according to the fourth aspect of the present invention is a method using a chelating agent or nisin.
- the bacteriophage resistance inhibitor for food poisoning bacteria and the use thereof, and the bacteriophage resistance suppression method for food poisoning bacteria of the above aspect are effective for various food poisoning bacteria and effectively improve resistance of the food poisoning bacteria to bacteriophage. Can be suppressed.
- the composition for inhibiting the growth of food poisoning bacteria according to the above aspect is effective for various food poisoning bacteria, and can effectively inhibit the growth of food poisoning bacteria.
- C. in chicken skin in Example 3 It is a graph which shows a time-dependent change of viable count of jejuni. It is a graph which shows the time-dependent change of the number of general viable bacteria in the chicken skin in Example 3. Listeria monocytogenes No. 4 in Example 4. L. against 193 strain. Monocytogenes No.
- the bacteriophage tolerance inhibitor of food poisoning bacteria of this embodiment contains a chelating agent or nisin as an active ingredient.
- the bacteriophage resistance-inhibiting agent for food poisoning bacteria according to the present embodiment, as shown in the examples below, can be used in combination with a chelating agent or nisin in the bacteriophage so that the chelating agent or nisin is a food poisoning bacterium. Bacteriophage resistance can be suppressed, and the lytic action of food poisoning bacteria by bacteriophage can be maintained high. Therefore, the growth of food poisoning bacteria can be effectively suppressed.
- the present invention is the use of a bacteriophage resistance-inhibiting inhibitor of food poisoning bacteria containing a chelating agent or nisin as an active ingredient, for inhibiting resistance of food poisoning bacteria to bacteriophage.
- a bacteriophage resistance-inhibiting inhibitor of food poisoning bacteria containing a chelating agent or nisin as an active ingredient, for inhibiting resistance of food poisoning bacteria to bacteriophage.
- bacteriophage resistance inhibitors of food poisoning bacteria Moreover, in one Embodiment, this invention provides the bacteriophage tolerance suppression method of food poisoning bacteria using a chelating agent or nisin.
- the bacteriophage resistance-inhibiting inhibitor of food poisoning bacteria has an excellent resistance-inhibiting effect against bacteriophage in food poisoning bacteria of both Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria, as shown in the Examples below. Have.
- containing as an active ingredient means containing a chelating agent or nisin to such an extent that an effect of suppressing resistance to bacteriophage is exhibited.
- Gram-positive bacteria that cause food poisoning include, but are not limited to, Listeria, Clostridium, Staphylococcus, Bacillus, and the like.
- Listeria include, for example, L. monocytogenes.
- Clostridium include Clostridium perfringens (C. perfringens), botulinum (C. botulinum), and the like.
- Staphylococcus include Staphylococcus aureus and S. epidermis.
- Bacillus include Bacillus cereus and B. subtilis.
- Gram-negative bacteria examples include Salmonella, Escherichia, Campylobacter, Vibrio, Yersinia, and Plesiomonas. (Plesiomonas), Aeromonas genus bacteria (Aeromonas), etc. are mentioned, It is not limited to these.
- Salmonella examples include Salmonella enteritidis, S. Typhimurium, S. Typhi, Salmonella ParatyphiA, and Salmonella A. -Paratyphi B (S. Paratyphi B), Salmonella Paratyphi C (S. Paratyphi C), etc. are mentioned.
- Salmonella enteritidis S. Typhimurium, S. Typhi, Salmonella ParatyphiA, and Salmonella A. -Paratyphi B (S. Paratyphi B), Salmonella Paratyphi C (S. Paratyphi C), etc.
- Salmonella enteritidis S. Typhimurium, S. Typhi, Salmonella ParatyphiA, and Salmonella
- Escherichia bacteria include Escherichia coli (E. coli) and the like.
- Escherichia bacteria include Escherichia coli (E. coli) and the like.
- E. coli include enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), enteropathogenic Escherichia coli (EPEC), enterointestinal E.coli Etocoli E. E. coli: ETEC), enteroaggregative E. coli: EAggEC, EAEC) and the like.
- enterohemorrhagic Escherichia coli include E. coli. coli O157: H7 and the like.
- Vibrio parahemolyticus Vibrio parahemolyticus
- Vibrio cholera Vibrio cholerae
- Vibrio vulnificus V. vulnificus
- Yersinia spp. Include Y. enterocolitica.
- Plesiomonas include P. shigelloides and the like.
- Aeromonas include Aeromonas hydrophila (A. hydrophila), Aeromonas zobria (A. sobria), and the like.
- the bacteriophage resistance-inhibiting inhibitor of food poisoning bacteria of this embodiment can contain at least one of a chelating agent and nisin, and can also contain both a chelating agent and nisin. Subsequently, each component contained in the bacteriophage tolerance inhibitor of food poisoning bacteria of this embodiment is demonstrated in detail below.
- chelating agent contained in the bacteriophage resistance inhibitor of food poisoning bacteria of the present embodiment a compound having a chelating action for capturing a metal can be appropriately selected and used. Moreover, since the bacteriophage tolerance inhibitor of food poisoning bacteria of this embodiment can be used for food etc., the compound approved as a food additive in each country can be used. Examples of such chelating agents include citric acids, phosphoric acids, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), and salts thereof. Examples of phosphoric acids include hexametaphosphoric acid. These chelating agents may be used alone or in combination of two or more.
- EDTA or a salt thereof can be used as the chelating agent.
- Specific examples of the EDTA salt include disodium ethylenediaminetetraacetate and disodium ethylenediaminetetraacetate.
- these chelating agents may use a commercially available thing, and may synthesize
- nisin included in the bacteriophage resistance inhibitor of food poisoning bacteria of this embodiment include, but are not limited to, nisin A, nisin Z, nisin Q, and the like. These nisins may be used alone or in combination of two or more.
- Nisin A is produced by the lactic acid bacterium Lactococcus lactis and has already been approved and used as a food additive in more than 50 countries including Europe and America.
- Nisin Z is a protein similar to nisin A.
- the 27th amino acid residue from the N-terminal is a histidine residue in nisin A, but only asparagine residue in nisin Z.
- Nisin can be obtained by culturing and purifying lactic acid bacteria using known methods. Specifically, for example, first, lactic acid bacteria are cultured using MRS medium (Oxoid). Next, the culture supernatant is treated with Amberlite (Amberlite XAD-16, manufactured by Sigma) to adsorb nisin. The amberlite is then washed with distilled water and 40 v / v% ethanol. The nisin is then eluted with 70 v / v% isopropanol containing 0.1 w / v% trifluoroacetic acid.
- the purified fraction of nisin can be obtained by purifying the eluted fraction using a cation exchange column (SP-Sepharose FF, manufactured by GE Healthcare Bioscience Co., Ltd.). Moreover, the nisin after a cation exchange column can be refine
- a commercially available nisin product may also be used, and specific examples thereof include, but are not limited to, nisin A reagent (containing 2.5% nisin, manufactured by Sigma).
- the bacteriophage resistance-inhibiting inhibitor of food poisoning bacteria of this embodiment may contain other additives other than the chelating agent or the nisin within a range that does not interfere with the bacteriophage resistance-inhibiting effect of food poisoning bacteria.
- compounds that can be used in foods can be used.
- specific examples of such other additives include buffers containing salts, trace amounts of metals, glycerol, saccharides, amino acids, antioxidants, and the like.
- the salts include sodium and potassium.
- Examples of a trace amount of metal include Mg, Mn, and Ca.
- Examples of the saccharide include maltose and glucose.
- Examples of amino acids include glycine, arginine, lysine and the like.
- antioxidants examples include L-ascorbic acid, sodium L-ascorbate, erythorbic acid, dibutylhydroxytoluene, dl- ⁇ -tocopherol, propyl gallate, ⁇ -oryzanol, licorice oily extract, d- ⁇ -tocopherol , Ferulic acid, mixed tocopherol, rosemary extract and the like.
- composition for inhibiting the growth of food poisoning bacteria includes a bacteriophage and the bacteriophage resistance inhibitor for food poisoning bacteria according to the above embodiment.
- bacteriophages contained in the composition for inhibiting the growth of food poisoning bacteria those capable of adsorbing to a specific food poisoning bacteria and specifically lysing and destroying the food poisoning bacteria can be appropriately selected and used.
- Specific examples of bacteriophages include, for example, T-type phages, ⁇ X-174, ⁇ , ⁇ X80, Q ⁇ , P1, etc.
- Examples of the T-type phage include T1, T2, T3, T4, T5, T6, T7 and the like.
- SZP01, SZP02 etc. are mentioned as a bacteriophage which uses a Bacillus genus microbe as a host.
- bacteriophages include, but are not limited to, the following (1) and (2). These bacteriophages may be used alone or in combination of two or more.
- Typhimurium-specific lytic phage SEG5 strain
- E. coli E. coli O157: H7-specific lytic phage PS5 strain
- the bacteriophage can be obtained by infecting the bacteriophage as a host and culturing the bacteriophage using a known and conventional method according to the type.
- the content of the chelating agent in the composition for inhibiting the growth of food poisoning bacteria according to the present embodiment can be greater than 0.01% by volume with respect to the total capacity of the composition for inhibiting the growth of food poisoning bacteria according to the present embodiment. It can be 0.02 volume% or more and 0.5 volume% or less, and can be 0.025 volume% or more and 0.1 volume% or less.
- content of a chelating agent is more than the said lower limit, resistance to the bacteriophage of food poisoning bacteria can be suppressed more effectively.
- the content of the chelating agent is not more than the above upper limit value, when used for food, the content of the chelating agent in the food can be within an appropriate range as a food additive.
- the content of nisin in the composition for suppressing the growth of food poisoning bacteria according to the present embodiment can be set to 100 IU / mL or more and 3000 IU / mL or less with respect to the total capacity of the composition for suppressing the growth of food poisoning bacteria according to the present embodiment. 500 IU / mL or more and 2000 IU / mL or less.
- the content of nisin is not less than the above lower limit value, resistance to bacteriophage of food poisoning bacteria can be more effectively suppressed.
- the content of nisin in the food can be within an appropriate range as a food additive when used for food.
- the composition for inhibiting the growth of food poisoning bacteria according to this embodiment can be liquid, semi-solid, or solid. Specific examples of the shape include, but are not limited to, liquids, emulsions (emulsions), gels, various dosage forms impregnated with them, and the like.
- a liquid form specifically, for example, a spray container, a push container (for example, a type that comes out of liquid), a refill bottle Examples include, but are not limited to.
- composition for inhibiting the growth of food poisoning bacteria is semi-solid or solid, specifically, for example, in a container for spraying or in a push-type container (for example, a type that comes out in a gel) , Oral cleaning and rinsing agents, toothpastes, dipping agents, wipes, paper towels, wet tissues, and the like, but are not limited thereto.
- the composition for inhibiting the growth of food poisoning bacteria includes, for example, food, tools that food comes into contact with, food processing and cooking utensils, equipment for processing and cooking foods, facilities for processing and cooking foods, and people involved in food processing and cooking. It can be used to suppress resistance to bacteriophage of food poisoning bacteria present in the fingers and the like.
- Examples of food include fruit juice, vegetable juice, agricultural products and processed products thereof, seafood and processed products thereof, meat (for example, chicken, beef, pork, mutton, etc.) and processed products thereof, milk (for example, milk) and processed products thereof. Products.
- the composition for inhibiting the growth of food poisoning bacteria according to the present embodiment can be used for edible meat, particularly raw edible meat.
- the food is not limited to food for humans but may include animal feed.
- the animal may be a domestic animal or a pet animal. Examples of domestic animals include birds, pigs, cows and sheep. Examples of pet animals include cats, dogs, and rabbits.
- the composition for inhibiting the growth of food poisoning bacteria according to the present embodiment with bovine feed, the growth of food poisoning pathogenic bacteria living in the bovine intestine can be effectively suppressed.
- cattle bred with a feed containing the composition for inhibiting the growth of food poisoning bacteria according to this embodiment can be processed as raw beef.
- an object such as a food is brought into contact with the food poisoning bacteria growth suppression composition.
- the time for contacting the object such as food with the composition for inhibiting the growth of food poisoning bacteria can be appropriately adjusted according to the amount of food poisoning bacteria contained in the object such as food.
- a direct method or an indirect method may be used as a method for contacting an object such as food with the composition for inhibiting the growth of food poisoning bacteria. Examples of the direct method include spraying, spraying, dipping, and soaking.
- the surface of the tool or food processing cooking utensil that comes into contact with the food is pretreated with the above composition for inhibiting the growth of food poisoning bacteria. And the like.
- the contact between the object such as food and the composition for inhibiting the growth of food poisoning bacteria can be performed at a temperature of 5 ° C. or higher and 45 ° C. or lower, for example.
- the chelating agent or nisin contained in the composition for inhibiting growth of food poisoning bacteria suppresses resistance to bacteriophage of food poisoning bacteria, as shown in the examples described later.
- the bacteriophage contained in the composition for inhibiting the growth of food poisoning bacteria can grow and effectively lyse the food poisoning bacteria.
- the contact amount of the chelating agent can be about 10 ⁇ g / cm 2 or more with respect to the surface area of the food.
- the contact amount of nisin can be about 5 U / cm 2 or more with respect to the surface area of the food.
- the contact amount of the chelating agent or nisin with respect to the surface area of the food is not less than the above lower limit value, the effect of suppressing resistance to bacteriophage can be sufficiently exerted.
- the upper limit of the contact amount of the chelating agent or nisin with respect to the surface area of the food may be an amount that does not exceed the use standard of the chelating agent or nisin contained in the food as a food additive in each country. it can.
- the upper limit of the contact amount of the chelating agent or nisin with respect to the surface area of the object is not particularly limited, and may be an amount that provides an appropriate production cost.
- the object such as food before the contact between the object such as food and the composition for inhibiting the growth of food poisoning bacteria, the object such as food may be sterilized using sodium hypochlorite or the like.
- the bacteriophage contained in the composition for inhibiting the growth of food poisoning bacteria is proliferated while suppressing the increase in the number of viable bacteria other than food poisoning bacteria that are targets of the bacteriophage, thereby effectively lysing the food poisoning bacteria. can do.
- Example 1 Examination of combined effect of bacteriophage and food additive against Campylobacter sp. Confirmation of antibacterial activity with food additive alone
- three food additives that are approved as food additives in Japan and known to have antibacterial activity sodium hexametaphosphate, ethylenediaminetetraacetic acid (Ethylenediaminetetraacetic) acid: EDTA) and sodium acetate were used to confirm the antibacterial activity of each food additive alone.
- a 96-well Cell Culture Cluster 190 ⁇ L each of brain heart infusion medium (BHI medium) containing 1 mM CaCl 2 and 10 mM MgSO 4 was dispensed, and the Campylobacter jejuni culture solution was diluted 10 times. 10 ⁇ L (8.7 ⁇ 10 5 CFU / mL) of the solution was inoculated. 20 ⁇ L of the solution containing each food additive was added to the concentration shown in Table 1 below, and cultured at 42 ° C. under microaerobic conditions. After 0 hours (that is, at the start of culture) and 24 hours later, the culture solution was plated on horse blood agar (HBA) and cultured at 42 ° C.
- BHI medium brain heart infusion medium
- HBA horse blood agar
- a horse blood agar was prepared according to the following procedure. First, Brucella basal medium (BRUCELLA MEDIUM BASE, manufactured by OXOID) was prepared at a predetermined concentration, and autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes. Next, the sterilized Brucella basal medium was cooled to 55 ° C., equine hemolyzed blood (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.) heated to 45 ° C. was added to a final concentration of 5% by volume, and dispensed into a petri dish. Stored at 4 ° C. until use.
- Brucella basal medium BRUCELLA MEDIUM BASE, manufactured by OXOID
- Example 2 Examination of combined use effect of bacteriophage and EDTA against Salmonella genus Next, S. cerevisiae against Salmnella Enteritidis was examined. The combined effect of Enteritidis-specific lytic phage STG2 and EDTA was examined. First, 5 mL of BHI medium containing 1 mM CaCl 2 and 10 mM MgSO 4 was added to S. coli. Inoculate 250 ⁇ L of a 10-fold dilution of Enteritidis culture and add 100 ⁇ L of STG2 (titer: 1.0 ⁇ 10 10 PFU / mL) and 500 ⁇ L of EDTA (final concentration: 0.025 and 0.1 vol%), respectively.
- the cells were cultured at 42 ° C. for 48 hours under microaerobic conditions. After 0 hour (that is, at the start of culture), 4 hours, 8 hours, 12 hours and 24 hours later, the culture solution was plated on HBA and microaerobically cultured at 42 ° C. for 48 hours. The viable cell count was measured. Moreover, what added neither STG2 nor EDTA was set as control. The results are shown in FIG.
- EDTA has been reported to be used as an inhibitor of phage infection against bacteria (for example, “Reference 2: Hungaro HM et al.,“ Use of bacteriophages to reduce Salmonella in chicken skin in comparison with a chemical agents. ”, Food Research International, Vol. 52, Issue 1, p75-81, 2013”).
- concentration of EDTA used in Examples 1 and 2 is lower than the concentration used in the above report, C. jejuni and S. It has been clarified that Enteritidis exhibits an effect of suppressing resistance to phages.
- EDTA is used in canned and bottled foods, and its use standard is 0.25 g / kg. Therefore, a more practical concentration of 0.025% EDTA was used in the following examples.
- the phage grows in the microbial cells using the growth ability of the host fungus and lyses the host fungus. Therefore, in an environment where the host bacteria cannot grow, the phages cannot grow and the host bacteria cannot be lysed.
- MOI MOI of Examples 1 and 2
- the MOI of Examples 1 and 2 the MOI of Examples 1 and 2 is about 10 there were.
- the combined use of phage and a low concentration of EDTA was not an additive effect but a synergistic effect, as is apparent from the results of FIGS. This was presumed to be due to the fact that the bacterial resistance to bacteria was suppressed by a low concentration of EDTA, so that the lytic action worked remarkably even with a small amount of phage.
- Example 3 C.I. Examination of combined effect of PC10 and EDTA against Jejuni Next, in order to examine the practicality of the combined effect of PC10 and EDTA, C. junta actually inoculated into chicken skin. The combined effect of PC10 and EDTA on jejuni was examined. A commercially available domestic chicken skin was used as a sample. The bactericidal treatment with sodium hypochlorite actually used in the poultry treatment process and the sample treatment method with addition at 42 ° C. for phage infection were examined.
- the number of viable jejuni was measured. In the standard agar medium, the number of viable bacteria was measured from the number of colonies after aerobic culture at 37 ° C. for 48 hours. The results are shown in FIG. 3A (C. jejuni viable count) and FIG. 3B (general viable count).
- the Butler medium was prepared by the following procedure. First, a Colombian blood agar basal medium (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.) was prepared at a predetermined concentration, and autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes. Next, the sterilized Colombian blood agar basal medium is cooled to 55 ° C., equine hemolyzed blood (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.) heated to 45 ° C.
- a standard agar medium was prepared by the following procedure. First, a pearl core standard agar medium (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) was prepared at a predetermined concentration, and autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes. Next, a sterilized pearl core standard agar medium was dispensed into a petri dish and used after the agar gelled.
- Sodium hypochlorite has a broad bactericidal effect on Gram-positive and Gram-negative bacteria because hypochlorous acid produced in aqueous solution acts on the bacterial cell membrane to oxidize proteins and so on, thereby inhibiting its function. Indicates. Therefore, it was considered that the growth of bacteria was suppressed even at 42 ° C. due to the action of sodium hypochlorite on the bacteria present on the commercial chicken skin. From these facts, by performing a pretreatment combining a sterilization treatment and an EDTA treatment, the C.I. It has been shown that jejuni control is possible.
- the combination of bacteriophage and EDTA can effectively suppress the resistance of bacteriophage such as Campylobacter and Salmonella to bacteriophage by EDTA, and thereby the lytic effect of bacteriophage on food-toxic bacteria such as Campylobacter and Salmonella. It was shown that the growth can be further inhibited for a long time.
- Example 5 Examination of combined effect of bacteriophage and nisin on mixed culture of food poisoning bacteria
- nisin which is approved as a food additive in Japan and known to have antibacterial activity is used.
- the combined effect of a specific lytic phage cocktail of each bacterium and nisin on a mixed culture of food poisoning bacteria was examined.
- Enteritidis-specific lytic phage STG2 (titer: 0.3 ⁇ 10 10 PFU / mL), Typhimurium-specific lytic phage SEG5 (titer: 0.3 ⁇ 10 10 PFU / mL) and E. coli.
- 100 ⁇ L of phage cocktail solution containing E. coli O157: H7-specific lytic phage PS5 (titer: 0.3 ⁇ 10 10 PFU / mL) and 500 ⁇ L of nisin (final concentrations: 500, 1000 and 2000 IU / mL) (manufactured by Sigma Aldrich) Were added and cultured under shaking at 37 ° C. for 24 hours under aerobic conditions.
- the bacteriophage resistance-inhibiting agent for food poisoning bacteria of this embodiment is effective for various food poisoning bacteria, and can effectively suppress resistance to food bacteriophage bacteria.
- the composition for inhibiting the growth of food poisoning bacteria according to this embodiment includes a bacteriophage and a bacteriophage resistance inhibitor for the food poisoning bacteria, and is suitably used for, for example, foods, cooking utensils and the like.
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Abstract
多種の食中毒細菌に対して有効であって、効果的な新規の食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤及びその使用、食中毒細菌増殖抑制用組成物、並びに、食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制方法を提供する。食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤は、キレート剤又はナイシンを有効成分として含有する。食中毒細菌増殖抑制用組成物は、バクテリオファージと前記食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤とを含む。食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤の使用は、キレート剤又はナイシンを有効成分として含有する食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤の使用であって、食中毒細菌のバクテリオファージに対する耐性化を抑制するための使用である。食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制方法は、キレート剤又はナイシンを用いる方法である。
Description
本発明は、食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤及びその使用に関する。具体的には、本発明は、食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤、食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤の使用及び食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制方法に関する。
バクテリオファージは、細菌種に特異的に、細菌を溶菌するが、一部の細菌集団はバクテリオファージに対する耐性を有する。そのため、バクテリオファージ耐性菌への有効な対策が求められている。これを解決するために、複数のファージ株を混合したファージカクテルが食中毒細菌の制御のために用いられている。しかしながら、ファージカクテルを用いても、確実にバクテリオファージ耐性菌を制御できるわけではない。
これまで、確実に食中毒細菌を制御するために、ファージと抗菌物質との併用について検討されてきた。例えば、サルモネラ特異的溶菌ファージと、アルギン酸ラウリル（Ｌａｕｒｉｃ ａｒｇｉｎａｔｅ：ＬＡＥ）及び塩化セチルピリジニウム（Ｃｅｔｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ：ＣＰＣ）との併用によって鶏肉におけるサルモネラ菌を効果的に殺菌できたという報告がある（例えば、非特許文献１参照）。
Sukumaran AT et al., "Reduction of Salmonella on chicken meat and chicken skin by combined or sequential application of lytic bacteriophage with chemical antimicrobials.", Int J Food Microbiol., Vol. 207, p8-15, 2015.
しかしながら、サルモネラ菌に限定されない多種の食中毒細菌に対して有効であって、バクテリオファージに対する耐性化を抑制しながら、効果的に食中毒細菌の増殖を阻害できるバクテリオファージと抗菌物質との組み合わせについては未だ知られていなかった。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、多種の食中毒細菌に対して有効であって、効果的な新規の食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤及びその使用、食中毒細菌増殖抑制用組成物、並びに、食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制方法を提供する。
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤は、キレート剤又はナイシンを有効成分として含有する。
上記第１態様に係る食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤において、前記キレート剤がエチレンジアミン四酢酸又はその塩であってもよい。
本発明の第１態様に係る食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤は、キレート剤又はナイシンを有効成分として含有する。
上記第１態様に係る食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤において、前記キレート剤がエチレンジアミン四酢酸又はその塩であってもよい。
本発明の第２態様に係る食中毒細菌増殖抑制用組成物は、バクテリオファージと、上記第１態様に係る食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤とを含む。
上記第２態様に係る食中毒細菌増殖抑制用組成物は、食品に対して用いられてもよい。
上記第２態様に係る食中毒細菌増殖抑制用組成物は、食品に対して用いられてもよい。
本発明の第３態様に係る食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤の使用は、キレート剤又はナイシンを有効成分として含有する食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤の使用であって、食中毒細菌のバクテリオファージに対する耐性化を抑制するための使用である。
本発明の第４態様に係る食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制方法は、キレート剤又はナイシンを用いる方法である。
上記態様の食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤及びその使用、並びに、食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制方法は、多種の食中毒細菌に有効であり、食中毒細菌のバクテリオファージに対する耐性化を効果的に抑制することができる。上記態様の食中毒細菌増殖抑制用組成物は、多種の食中毒細菌に有効であり、食中毒細菌の増殖を効果的に抑制することができる。
≪食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤≫
本実施形態の食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤は、キレート剤又はナイシンを有効成分として含有する。
本実施形態の食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤は、キレート剤又はナイシンを有効成分として含有する。
従来のバクテリオファージを用いた食中毒細菌の増殖抑制方法では、食中毒細菌のバクテリオファージに対する耐性化が問題となっていた。これに対し、本実施形態の食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤は、後述の実施例に示すように、バクテリオファージに、キレート剤又はナイシンを併用することで、キレート剤又はナイシンが食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化を抑制し、バクテリオファージによる食中毒細菌の溶菌作用を高く維持することができる。そのため、食中毒細菌の増殖を効果的に抑制することができる。
よって、一実施形態において、本発明は、キレート剤又はナイシンを有効成分として含有する食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤の使用であって、食中毒細菌のバクテリオファージに対する耐性化を抑制するための、食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤の使用を提供する。
また、一実施形態において、本発明は、キレート剤又はナイシンを用いる食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制方法を提供する。
よって、一実施形態において、本発明は、キレート剤又はナイシンを有効成分として含有する食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤の使用であって、食中毒細菌のバクテリオファージに対する耐性化を抑制するための、食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤の使用を提供する。
また、一実施形態において、本発明は、キレート剤又はナイシンを用いる食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制方法を提供する。
また、本実施形態の食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤は、後述の実施例に示すように、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の両方の食中毒細菌における、バクテリオファージに対する優れた耐性化抑制効果を有する。
なお、本明細書における「有効成分として含有する」とは、キレート剤又はナイシンをバクテリオファージに対する耐性化抑制効果が奏される程度に含有することを意味する。
食中毒を起こすグラム陽性菌としては、例えば、リステリア属菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、クロストリジウム属菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、スタフィロコッカス属菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）等が挙げられ、これらに限定されない。
リステリア属菌としては、例えば、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌ. ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）等が挙げられる。
クロストリジウム属菌としては、例えば、ウェルシュ菌（クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ． ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ））、ボツリヌス菌（クロストリジウム・ボツリナム（Ｃ． ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ））等が挙げられる。
スタフィロコッカス属菌としては、例えば、スタフィロコッカス・オーレウス（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミス（Ｓ． ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）等が挙げられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・セレウス（Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・ズブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等が挙げられる。
リステリア属菌としては、例えば、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌ. ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）等が挙げられる。
クロストリジウム属菌としては、例えば、ウェルシュ菌（クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ． ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ））、ボツリヌス菌（クロストリジウム・ボツリナム（Ｃ． ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ））等が挙げられる。
スタフィロコッカス属菌としては、例えば、スタフィロコッカス・オーレウス（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミス（Ｓ． ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）等が挙げられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・セレウス（Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・ズブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等が挙げられる。
食中毒を起こすグラム陰性菌としては、例えば、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エッシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、カンピロバクター属菌（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ビブリオ属菌（Ｖｉｂｒｉｏ）、エルシニア属菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、プレシオモナス属菌（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ）、エロモナス属菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）等が挙げられ、これらに限定されない。
サルモネラ属菌としては、例えば、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓ． Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓ． Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・ティフィ（Ｓ． Ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・パラティフィＡ（Ｓ． ＰａｒａｔｙｐｈｉＡ）、サルモネラ・パラティフィＢ（Ｓ． ＰａｒａｔｙｐｈｉＢ）、サルモネラ・パラティフィＣ（Ｓ． ＰａｒａｔｙｐｈｉＣ）等が挙げられる。
カンピロバクター属菌としては、例えば、カンピロバクター・ジェジュニ （Ｃ． ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・コリ （Ｃ． ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・フェタス（Ｃ． ｆｅｔｕｓ）等が挙げられる。
エッシェリヒア属菌としては、例えば、大腸菌（エッシェリヒア・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ））等が挙げられる。大腸菌としては、例えば、腸管出血性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ＥＨＥＣ）、腸管病原性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ＥＰＥＣ）、腸管侵入性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ Ｅ． ｃｏｌｉ：ＥＩＥＣ）、腸管毒素原性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅ． ｃｏｌｉ：ＥＴＥＣ）、腸管集合性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏａｇｇｒｅｇａｔｉｖｅ Ｅ． ｃｏｌｉ：ＥＡｇｇＥＣ、ＥＡＥＣ）等が挙げられる。腸管出血性大腸菌としては、例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７等が挙げられる。
ビブリオ属菌としては、例えば、ビブリオ・パラヘモリティカス（Ｖ． ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ビブリオ・コレラ（Ｖ． ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・バルニフィカス（Ｖ． ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）等が挙げられる。
エルシニア属菌としては、例えば、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙ． ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）等が挙げられる。
プレシオモナス属菌としては、例えば、プレシオモナス・シゲロイデス（Ｐ．ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ）等が挙げられる。
エロモナス属菌としては、例えば、エロモナス・ヒドロフィラ（Ａ． ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、エロモナス・ゾブリア（Ａ． ｓｏｂｒｉａ）等が挙げられる。
サルモネラ属菌としては、例えば、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓ． Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓ． Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・ティフィ（Ｓ． Ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・パラティフィＡ（Ｓ． ＰａｒａｔｙｐｈｉＡ）、サルモネラ・パラティフィＢ（Ｓ． ＰａｒａｔｙｐｈｉＢ）、サルモネラ・パラティフィＣ（Ｓ． ＰａｒａｔｙｐｈｉＣ）等が挙げられる。
カンピロバクター属菌としては、例えば、カンピロバクター・ジェジュニ （Ｃ． ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・コリ （Ｃ． ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・フェタス（Ｃ． ｆｅｔｕｓ）等が挙げられる。
エッシェリヒア属菌としては、例えば、大腸菌（エッシェリヒア・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ））等が挙げられる。大腸菌としては、例えば、腸管出血性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ＥＨＥＣ）、腸管病原性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ＥＰＥＣ）、腸管侵入性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ Ｅ． ｃｏｌｉ：ＥＩＥＣ）、腸管毒素原性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅ． ｃｏｌｉ：ＥＴＥＣ）、腸管集合性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏａｇｇｒｅｇａｔｉｖｅ Ｅ． ｃｏｌｉ：ＥＡｇｇＥＣ、ＥＡＥＣ）等が挙げられる。腸管出血性大腸菌としては、例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７等が挙げられる。
ビブリオ属菌としては、例えば、ビブリオ・パラヘモリティカス（Ｖ． ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ビブリオ・コレラ（Ｖ． ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・バルニフィカス（Ｖ． ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）等が挙げられる。
エルシニア属菌としては、例えば、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙ． ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）等が挙げられる。
プレシオモナス属菌としては、例えば、プレシオモナス・シゲロイデス（Ｐ．ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ）等が挙げられる。
エロモナス属菌としては、例えば、エロモナス・ヒドロフィラ（Ａ． ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、エロモナス・ゾブリア（Ａ． ｓｏｂｒｉａ）等が挙げられる。
また、本実施形態の食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤は、キレート剤及びナイシンのうち少なくともいずれかを含むことができ、キレート剤及びナイシンの両方を含むこともできる。
次いで、本実施形態の食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤に含まれる各構成成分について以下に詳細を説明する。
次いで、本実施形態の食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤に含まれる各構成成分について以下に詳細を説明する。
＜キレート剤＞
本実施形態の食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤に含まれるキレート剤としては、金属を捕捉するキレート作用を持つ化合物を適宜選択して用いることができる。また、本実施形態の食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤は、食品等を対象として用いることができることから、それぞれの国において食品添加物として認可されている化合物を用いることができる。このようなキレート剤としては、例えば、クエン酸類、リン酸類、エチレンジアミン四酢酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ：ＥＤＴＡ）、及び、これらの塩等が挙げられる。リン酸類としては、例えば、ヘキサメタリン酸等が挙げられる。これらキレート剤を、１種類単独で用いてもよく、２種類以上組み合わせて用いてもよい。
中でも、キレート剤としては、ＥＤＴＡ又はその塩を用いることができる。ＥＤＴＡの塩として具体的には、例えば、エチレンジアミン四酢酸カルシウム二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム等が挙げられる。
また、これらキレート剤は市販のものを用いてもよく、公知の方法を用いて合成してもよい。
本実施形態の食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤に含まれるキレート剤としては、金属を捕捉するキレート作用を持つ化合物を適宜選択して用いることができる。また、本実施形態の食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤は、食品等を対象として用いることができることから、それぞれの国において食品添加物として認可されている化合物を用いることができる。このようなキレート剤としては、例えば、クエン酸類、リン酸類、エチレンジアミン四酢酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ：ＥＤＴＡ）、及び、これらの塩等が挙げられる。リン酸類としては、例えば、ヘキサメタリン酸等が挙げられる。これらキレート剤を、１種類単独で用いてもよく、２種類以上組み合わせて用いてもよい。
中でも、キレート剤としては、ＥＤＴＡ又はその塩を用いることができる。ＥＤＴＡの塩として具体的には、例えば、エチレンジアミン四酢酸カルシウム二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム等が挙げられる。
また、これらキレート剤は市販のものを用いてもよく、公知の方法を用いて合成してもよい。
＜ナイシン＞
本実施形態の食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤に含まれるナイシンとしては、例えば、ナイシンＡ、ナイシンＺ、ナイシンＱ等が挙げられ、これらに限定されない。これらナイシンを、１種類単独で用いてもよく、２種類以上組み合わせて用いてもよい。
なお、ナイシンＡは、乳酸菌Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓにより産生され、欧米等５０カ国以上ですでに食品添加物として認可使用されている。ナイシンＺは、ナイシンＡに類似のタンパク質である。ナイシンＡを構成する３４個のアミノ酸残基のうち、Ｎ末端から２７番目のアミノ酸残基が、ナイシンＡではヒスチジン残基であるのに対し、ナイシンＺではアスパラギン残基である点のみが異なる。
本実施形態の食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤に含まれるナイシンとしては、例えば、ナイシンＡ、ナイシンＺ、ナイシンＱ等が挙げられ、これらに限定されない。これらナイシンを、１種類単独で用いてもよく、２種類以上組み合わせて用いてもよい。
なお、ナイシンＡは、乳酸菌Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓにより産生され、欧米等５０カ国以上ですでに食品添加物として認可使用されている。ナイシンＺは、ナイシンＡに類似のタンパク質である。ナイシンＡを構成する３４個のアミノ酸残基のうち、Ｎ末端から２７番目のアミノ酸残基が、ナイシンＡではヒスチジン残基であるのに対し、ナイシンＺではアスパラギン残基である点のみが異なる。
ナイシンは、公知の方法を用いて、乳酸菌を培養し、精製することによって得ることができる。具体的には、例えば、まず、ＭＲＳ培地（Ｏｘｏｉｄ社製）を用いて、乳酸菌を培養する。次いで、培養上清をアンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ－１６、シグマ社製）処理してナイシンを吸着させる。次いで、アンバーライトを蒸留水及び４０ｖ／ｖ％エタノールで洗浄する。次いで、０．１ｗ／ｖ％のトリフルオロ酢酸を含む７０ｖ／ｖ％イソプロパノールでナイシンを溶出させる。次いで、溶出画分を、陽イオン交換カラム（ＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を用いて精製することで、ナイシンの精製品を得ることができる。また、陽イオン交換カラム後のナイシンを、必要に応じて、逆相クロマトグラフィーを用いて精製することで、さらにナイシンの精製度を高めることができる（参考文献１：Zendo T et al., “Identification of the Lantibiotic Nisin Q, a New Natural Nisin Variant Produced by Lactococcus lactis 61-14 Isolated from a River in Japan”, Biosci. Biotechnol. Biochem., vol.67, No.7, p1616-1619，2003）。
また、ナイシンの市販品を用いてもよく、具体的には、例えば、ナイシンＡ試薬（ナイシン２．５％含有、Ｓｉｇｍａ社製）等が挙げられ、これに限定されない。
また、ナイシンの市販品を用いてもよく、具体的には、例えば、ナイシンＡ試薬（ナイシン２．５％含有、Ｓｉｇｍａ社製）等が挙げられ、これに限定されない。
＜その他添加剤＞
本実施形態の食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤は、食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制効果を妨げない範囲において、上記キレート剤又は上記ナイシン以外のその他の添加剤を含有していてもよい。
本実施形態の食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤は、食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制効果を妨げない範囲において、上記キレート剤又は上記ナイシン以外のその他の添加剤を含有していてもよい。
その他の添加剤としては、食品に使用可能である化合物を用いることができる。そのようなその他の添加剤として具体的には、例えば、塩類を含む緩衝剤、微量の金属、グリセロール、糖類、アミノ酸、酸化防止剤等が挙げられる。
塩類としては、例えば、ナトリウム、カリウム等が挙げられる。
微量の金属としては、例えば、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｃａ等が挙げられる。
糖類としては、例えば、マルトース、グルコース等が挙げられる。
アミノ酸としては、例えば、グリシン、アルギニン、リジン等が挙げられる。
酸化防止剤としては、例えば、Ｌ－アスコルビン酸、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ｄｌ－α－トコフェロール、没食子酸プロピル、γ－オリザノール、カンゾウ油性抽出物、ｄ－α－トコフェロール、フェルラ酸、ミックストコフェロール、ローズマリー抽出物等が挙げられる。
塩類としては、例えば、ナトリウム、カリウム等が挙げられる。
微量の金属としては、例えば、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｃａ等が挙げられる。
糖類としては、例えば、マルトース、グルコース等が挙げられる。
アミノ酸としては、例えば、グリシン、アルギニン、リジン等が挙げられる。
酸化防止剤としては、例えば、Ｌ－アスコルビン酸、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ｄｌ－α－トコフェロール、没食子酸プロピル、γ－オリザノール、カンゾウ油性抽出物、ｄ－α－トコフェロール、フェルラ酸、ミックストコフェロール、ローズマリー抽出物等が挙げられる。
≪食中毒細菌増殖抑制用組成物≫
本実施形態の食中毒細菌増殖抑制用組成物は、バクテリオファージと、上記実施形態に係る食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤と、を含む。
本実施形態の食中毒細菌増殖抑制用組成物は、バクテリオファージと、上記実施形態に係る食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤と、を含む。
＜バクテリオファージ＞
本実施形態の食中毒細菌増殖抑制用組成物に含まれるバクテリオファージとしては、特定の食中毒細菌に吸着して、特異的に該食中毒細菌を溶菌破壊できるものを適宜選択して用いることができる。バクテリオファージとして具体的には、例えば、大腸菌を宿主とするバクテリオファージとしては、Ｔ系ファージ、ΦＸ－１７４、λ、ΦＸ８０、Ｑβ、Ｐ１等が挙げられる。Ｔ系ファージとしては、例えば、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６、Ｔ７等が挙げられる。また、例えば、バチルス属菌を宿主とするバクテリオファージとしては、ＳＺＰ０１、ＳＺＰ０２等が挙げられる。
バクテリオファージとしてより具体的には、例えば、以下の（１）及び（２）に示すもの等が挙げられ、これらに限定されない。これらバクテリオファージを、１種類単独で用いてもよく、２種類以上組み合わせて用いてもよい。
（１）グラム陽性菌に対する特異的溶菌ファージ
Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ Ｎｏ．１９３株特異的溶菌ファージ：１９３－Ｓ３株
（２）グラム陰性菌に対する特異的溶菌ファージ
Ｃ. ｊｅｊｕｎｉ特異的溶菌ファージ：Ｐ１０株
Ｓ． Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ特異的溶菌ファージ：ＳＴＧ２株
Ｓ． Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ特異的溶菌ファージ：ＳＥＧ５株
Ｅ． ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７特異的溶菌ファージ：ＰＳ５株
本実施形態の食中毒細菌増殖抑制用組成物に含まれるバクテリオファージとしては、特定の食中毒細菌に吸着して、特異的に該食中毒細菌を溶菌破壊できるものを適宜選択して用いることができる。バクテリオファージとして具体的には、例えば、大腸菌を宿主とするバクテリオファージとしては、Ｔ系ファージ、ΦＸ－１７４、λ、ΦＸ８０、Ｑβ、Ｐ１等が挙げられる。Ｔ系ファージとしては、例えば、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６、Ｔ７等が挙げられる。また、例えば、バチルス属菌を宿主とするバクテリオファージとしては、ＳＺＰ０１、ＳＺＰ０２等が挙げられる。
バクテリオファージとしてより具体的には、例えば、以下の（１）及び（２）に示すもの等が挙げられ、これらに限定されない。これらバクテリオファージを、１種類単独で用いてもよく、２種類以上組み合わせて用いてもよい。
（１）グラム陽性菌に対する特異的溶菌ファージ
Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ Ｎｏ．１９３株特異的溶菌ファージ：１９３－Ｓ３株
（２）グラム陰性菌に対する特異的溶菌ファージ
Ｃ. ｊｅｊｕｎｉ特異的溶菌ファージ：Ｐ１０株
Ｓ． Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ特異的溶菌ファージ：ＳＴＧ２株
Ｓ． Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ特異的溶菌ファージ：ＳＥＧ５株
Ｅ． ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７特異的溶菌ファージ：ＰＳ５株
バクテリオファージは、その種類に応じて、公知慣用の方法を用いて、バクテリオファージを宿主となる菌体に感染させ、該菌体を培養することで得ることができる。
＜キレート剤の含有量＞
本実施形態の食中毒細菌増殖抑制用組成物中のキレート剤の含有量は、本実施形態の食中毒細菌増殖抑制用組成物の総容量に対して、０．０１容量％より多くすることができ、０．０２容量％以上０．５容量％以下とすることができ、０．０２５容量％以上０．１容量％以下とすることができる。キレート剤の含有量が上記下限値以上であることにより、食中毒細菌のバクテリオファージに対する耐性化をより効果的に抑制することができる。一方、キレート剤の含有量が上記上限値以下であることにより、食品に対して使用した場合に、食品中のキレート剤の含有量を食品添加物として適正な範囲とすることができる。
本実施形態の食中毒細菌増殖抑制用組成物中のキレート剤の含有量は、本実施形態の食中毒細菌増殖抑制用組成物の総容量に対して、０．０１容量％より多くすることができ、０．０２容量％以上０．５容量％以下とすることができ、０．０２５容量％以上０．１容量％以下とすることができる。キレート剤の含有量が上記下限値以上であることにより、食中毒細菌のバクテリオファージに対する耐性化をより効果的に抑制することができる。一方、キレート剤の含有量が上記上限値以下であることにより、食品に対して使用した場合に、食品中のキレート剤の含有量を食品添加物として適正な範囲とすることができる。
＜ナイシンの含有量＞
本実施形態の食中毒細菌増殖抑制用組成物中のナイシンの含有量は、本実施形態の食中毒細菌増殖抑制用組成物の総容量に対して、１００ＩＵ／ｍＬ以上３０００ＩＵ／ｍＬ以下とすることができ、５００ＩＵ／ｍＬ以上２０００ＩＵ／ｍＬ以下とすることができる。ナイシンの含有量が上記下限値以上であることにより、食中毒細菌のバクテリオファージに対する耐性化をより効果的に抑制することができる。一方、ナイシンの含有量が上記上限値以下であることにより、食品に対して使用した場合に、食品中のナイシンの含有量を食品添加物として適正な範囲とすることができる。
本実施形態の食中毒細菌増殖抑制用組成物中のナイシンの含有量は、本実施形態の食中毒細菌増殖抑制用組成物の総容量に対して、１００ＩＵ／ｍＬ以上３０００ＩＵ／ｍＬ以下とすることができ、５００ＩＵ／ｍＬ以上２０００ＩＵ／ｍＬ以下とすることができる。ナイシンの含有量が上記下限値以上であることにより、食中毒細菌のバクテリオファージに対する耐性化をより効果的に抑制することができる。一方、ナイシンの含有量が上記上限値以下であることにより、食品に対して使用した場合に、食品中のナイシンの含有量を食品添加物として適正な範囲とすることができる。
＜形状及び形態＞
本実施形態の食中毒細菌増殖抑制用組成物は、液状、半固形状又は固形状とすることができる。形状として具体的には、例えば、液剤、乳剤（エマルジョン）、ゲル剤、それらを含浸させた種々の剤形等が挙げられ、これらに限定されない。
本実施形態の食中毒細菌増殖抑制用組成物が液状である場合、その形態として具体的には、例えば、噴霧用容器入り、プッシュ式容器入り（例えば、液で出るタイプ等）、詰替用ボトル入り等が挙げられ、これらに限定されない。
本実施形態の食中毒細菌増殖抑制用組成物が半固形状又は固形状である場合、その形態として具体的には、例えば、噴霧用容器入り、プッシュ式容器入り（例えば、ジェルで出るタイプ等）、口腔内洗浄及びリンス剤、歯磨き剤、ディッピング剤、清拭綿、ペーパータオル、ウエットティッシュ等が挙げられ、これらに限定されない。
本実施形態の食中毒細菌増殖抑制用組成物は、液状、半固形状又は固形状とすることができる。形状として具体的には、例えば、液剤、乳剤（エマルジョン）、ゲル剤、それらを含浸させた種々の剤形等が挙げられ、これらに限定されない。
本実施形態の食中毒細菌増殖抑制用組成物が液状である場合、その形態として具体的には、例えば、噴霧用容器入り、プッシュ式容器入り（例えば、液で出るタイプ等）、詰替用ボトル入り等が挙げられ、これらに限定されない。
本実施形態の食中毒細菌増殖抑制用組成物が半固形状又は固形状である場合、その形態として具体的には、例えば、噴霧用容器入り、プッシュ式容器入り（例えば、ジェルで出るタイプ等）、口腔内洗浄及びリンス剤、歯磨き剤、ディッピング剤、清拭綿、ペーパータオル、ウエットティッシュ等が挙げられ、これらに限定されない。
＜使用方法＞
本実施形態の食中毒細菌増殖抑制用組成物は、例えば、食品、食品が接触する道具、食品の加工調理器具、食品を加工調理する装置、食品を加工調理する施設、食品の加工調理に携わる人の手指等に存在する食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化を抑制するために使用することができる。
本実施形態の食中毒細菌増殖抑制用組成物は、例えば、食品、食品が接触する道具、食品の加工調理器具、食品を加工調理する装置、食品を加工調理する施設、食品の加工調理に携わる人の手指等に存在する食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化を抑制するために使用することができる。
食品としては、例えば果汁、野菜汁、農産物及びその加工品、魚介類及びその加工品、肉類（例えば鶏肉、牛肉、豚肉、羊肉等）及びその加工品、乳類（例えば牛乳等）及びその加工品等が挙げられる。中でも、食用の肉類、特に生食用の肉類に本実施形態の食中毒細菌増殖抑制用組成物を使用することができる。また、食品には、ヒト用の食品に限らず、動物用の飼料が含まれていてもよい。動物としては、家畜であってもよく、愛玩動物であってもよい。家畜としては、例えば、トリ、ブタ、ウシ、ヒツジ等が挙げられる。愛玩動物としては、例えば、ネコ、イヌ、ウサギ等が挙げられる。
また、例えば、ウシの飼料に本実施形態の食中毒細菌増殖抑制用組成物を混ぜて摂取させることにより、ウシ腸内に生息する食中毒の病原菌の増殖を効果的に抑制することができる。さらに、本実施形態の食中毒細菌増殖抑制用組成物を含む飼料を与えて飼育したウシは生食用の牛肉として加工することができる。
また、例えば、ウシの飼料に本実施形態の食中毒細菌増殖抑制用組成物を混ぜて摂取させることにより、ウシ腸内に生息する食中毒の病原菌の増殖を効果的に抑制することができる。さらに、本実施形態の食中毒細菌増殖抑制用組成物を含む飼料を与えて飼育したウシは生食用の牛肉として加工することができる。
本実施形態の食中毒細菌増殖抑制用組成物の使用方法について、詳細を以下に説明する。まず、食品等の対象物と、上記食中毒細菌増殖抑制用組成物とを接触させる。食品等の対象物と上記食中毒細菌増殖抑制用組成物とを接触させる時間としては、食品等の対象物に含まれる食中毒細菌の量に応じて適宜調整することができる。食品等の対象物と、上記食中毒細菌増殖抑制用組成物との接触方法としては、直接的な方法でもよく、間接的な方法でもよい。直接的な方法としては、例えば、噴霧、霧吹き、ディッピング、ソーキング等が挙げられる。間接的な方法としては、例えば、食品を加工、調理、保存、包装等する際に、該食品が接触する道具又は食品加工調理器具等の表面を、上記食中毒細菌増殖抑制用組成物で予め処理する方法等が挙げられる。
また、食品等の対象物と、上記食中毒細菌増殖抑制用組成物との接触は、例えば５℃以上４５℃以下の温度で行うことができる。温度が上記範囲内であることにより、後述の実施例に示すように、上記食中毒細菌増殖抑制用組成物に含まれる上記キレート剤又は上記ナイシンにより、食中毒細菌のバクテリオファージに対する耐性化を抑制しながら、上記食中毒細菌増殖抑制用組成物に含まれるバクテリオファージが増殖し、食中毒細菌を効果的に溶菌することができる。
また、例えば、対象物が食品である場合、食品の表面積に対して、キレート剤の接触量を１０μｇ／ｃｍ２以上程度となるようにすることができる。又は、食品の表面積に対して、ナイシンの接触量を５Ｕ／ｃｍ２以上程度となるようにすることができる。食品の表面積に対してキレート剤又はナイシンの接触量が上記下限値以上であることにより、バクテリオファージに対する耐性化抑制効果を充分に発揮することができる。
一方、食品の表面積に対してキレート剤又はナイシンの接触量の上限値としては、それぞれの国において食品添加物として食品に含まれるキレート剤又はナイシンの使用基準を上回らない程度の量とすることができる。
また、対象物が食品以外である場合においても、対象物の表面積に対してキレート剤又はナイシンの接触量が上記下限値以上であることにより、バクテリオファージに対する耐性化抑制効果を充分に発揮することができる。一方、対象物の表面積に対してキレート剤又はナイシンの接触量の上限値としては、特別な限定はなく、適切な製造コストとなる量であってもよい。
また、例えば、対象物が食品である場合、食品の表面積に対して、キレート剤の接触量を１０μｇ／ｃｍ２以上程度となるようにすることができる。又は、食品の表面積に対して、ナイシンの接触量を５Ｕ／ｃｍ２以上程度となるようにすることができる。食品の表面積に対してキレート剤又はナイシンの接触量が上記下限値以上であることにより、バクテリオファージに対する耐性化抑制効果を充分に発揮することができる。
一方、食品の表面積に対してキレート剤又はナイシンの接触量の上限値としては、それぞれの国において食品添加物として食品に含まれるキレート剤又はナイシンの使用基準を上回らない程度の量とすることができる。
また、対象物が食品以外である場合においても、対象物の表面積に対してキレート剤又はナイシンの接触量が上記下限値以上であることにより、バクテリオファージに対する耐性化抑制効果を充分に発揮することができる。一方、対象物の表面積に対してキレート剤又はナイシンの接触量の上限値としては、特別な限定はなく、適切な製造コストとなる量であってもよい。
また、食品等の対象物と、上記食中毒細菌増殖抑制用組成物との接触の前に、食品等の対象物を、次亜塩素酸ナトリウム等を用いて殺菌処理してもよい。これにより、バクテリオファージの標的となる食中毒細菌以外の一般細菌の生菌数の増加を抑制しながら、上記食中毒細菌増殖抑制用組成物に含まれるバクテリオファージが増殖し、食中毒細菌を効果的に溶菌することができる。
以下、実施例及び比較例等を挙げて本発明をさらに詳述するが、本発明はこれらの実施例等に限定されるものではない。
［実施例１］カンピロバクター属菌に対するバクテリオファージと食品添加物との併用効果の検討
１．食品添加物単独での抗菌活性の確認
まず、日本国内で食品添加物として認可されており、抗菌活性を有することが知られている３種の食品添加物（ヘキサメタリン酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ：ＥＤＴＡ）、及び、酢酸ナトリウム）を用いて、各食品添加物単独での抗菌活性を確認した。
具体的には、９６ウェルＣｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ に１ｍＭのＣａＣｌ２及び１０ｍＭのＭｇＳＯ４含有ブレインハートインフュージョン培地（ｂｒａｉｎ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｂｒｏｔｈ：ＢＨＩ培地）を１９０μＬずつ分注し、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ培養液の１０倍希釈液を１０μＬ（８．７×１０５ＣＦＵ／ｍＬ）ずつ接種した。そこに各食品添加物を含有する溶液を２０μＬずつ、下記表１に示す濃度になるように添加し、４２℃、微好気条件下で培養した。０時間後（すなわち、培養開始時）及び２４時間後に、培養液をウマ血液寒天培地（Ｈｏｒｓｅ ｂｌｏｏｄ ａｇａｒ：ＨＢＡ）にプレーティングし、４２℃、４８時間微好気培養した後、コロニー数から生菌数を測定した。また、食品添加物を添加しないものをコントロールとした。結果を以下の表１に示す。
なお、ウマ血液寒天培地（Ｈｏｒｓｅ ｂｌｏｏｄ ａｇａｒ：ＨＢＡ）は、以下の手順で調製した。まず、ブルセラ基礎培地（ＢＲＵＣＥＬＬＡ ＭＥＤＩＵＭ ＢＡＳＥ、ＯＸＯＩＤ社製） を所定の濃度で調製し、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌した。次いで、滅菌したブルセラ基礎培地を５５℃まで冷却し、４５℃に加温したウマ溶血液（関東化学株式会社製）を終濃度５容量％となるように添加し、シャーレに分注した。使用するまで４℃で保存した。
１．食品添加物単独での抗菌活性の確認
まず、日本国内で食品添加物として認可されており、抗菌活性を有することが知られている３種の食品添加物（ヘキサメタリン酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ：ＥＤＴＡ）、及び、酢酸ナトリウム）を用いて、各食品添加物単独での抗菌活性を確認した。
具体的には、９６ウェルＣｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ に１ｍＭのＣａＣｌ２及び１０ｍＭのＭｇＳＯ４含有ブレインハートインフュージョン培地（ｂｒａｉｎ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｂｒｏｔｈ：ＢＨＩ培地）を１９０μＬずつ分注し、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ培養液の１０倍希釈液を１０μＬ（８．７×１０５ＣＦＵ／ｍＬ）ずつ接種した。そこに各食品添加物を含有する溶液を２０μＬずつ、下記表１に示す濃度になるように添加し、４２℃、微好気条件下で培養した。０時間後（すなわち、培養開始時）及び２４時間後に、培養液をウマ血液寒天培地（Ｈｏｒｓｅ ｂｌｏｏｄ ａｇａｒ：ＨＢＡ）にプレーティングし、４２℃、４８時間微好気培養した後、コロニー数から生菌数を測定した。また、食品添加物を添加しないものをコントロールとした。結果を以下の表１に示す。
なお、ウマ血液寒天培地（Ｈｏｒｓｅ ｂｌｏｏｄ ａｇａｒ：ＨＢＡ）は、以下の手順で調製した。まず、ブルセラ基礎培地（ＢＲＵＣＥＬＬＡ ＭＥＤＩＵＭ ＢＡＳＥ、ＯＸＯＩＤ社製） を所定の濃度で調製し、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌した。次いで、滅菌したブルセラ基礎培地を５５℃まで冷却し、４５℃に加温したウマ溶血液（関東化学株式会社製）を終濃度５容量％となるように添加し、シャーレに分注した。使用するまで４℃で保存した。
表１から、０．１％ＥＤＴＡ及び２、３、４％酢酸ナトリウムを添加した場合、培養２４時間後には初発菌数と比較して生菌数が低下したため、Ｃ. ｊｅｊｕｎｉに対する抗菌活性が示された。
２．カンピロバクター属菌に対するバクテリオファージとＥＤＴＡとの併用効果の検討
次に、ＥＤＴＡ存在下で、液体培地中におけるＣ. ｊｅｊｕｎｉに対するＣ. ｊｅｊｕｎｉ特異的溶菌ファージＰＣ１０の効果を調べた。
まず、１ｍＭのＣａＣｌ２及び１０ｍＭのＭｇＳＯ４含有ＢＨＩ培地５ｍＬに、Ｃ. ｊｅｊｕｎｉ培養液の１０倍希釈液２５０μＬを接種して、ＰＣ１０（力価：５．３×１０８ＰＦＵ／ｍＬ）１００μＬ及びＥＤＴＡ５００μＬ（終濃度：０．００１、０．０１、０．０２５及び０．１容量％）をそれぞれ添加し、４２℃、４８時間微好気条件下で培養した。０時間後（すなわち、培養開始時）、４時間後、８時間後、１２時間後及び２４時間後に、培養液をＨＢＡにプレーティングし、４２℃、４８時間微好気培養した後、コロニー数から生菌数を測定した。また、ＰＣ１０及びＥＤＴＡのいずれも添加しないものをコントロールとした。結果を以下の図１に示す。なお、図１には、「コントロール」、「ＰＣ１０単独」、「０．０２５容量％ＥＤＴＡ単独」、「０．１容量％ＥＤＴＡ単独」、「ＰＣ１０と０．０２５容量％ＥＤＴＡとの併用」、「ＰＣ１０と０．１容量％ＥＤＴＡとの併用」の結果を示した。
次に、ＥＤＴＡ存在下で、液体培地中におけるＣ. ｊｅｊｕｎｉに対するＣ. ｊｅｊｕｎｉ特異的溶菌ファージＰＣ１０の効果を調べた。
まず、１ｍＭのＣａＣｌ２及び１０ｍＭのＭｇＳＯ４含有ＢＨＩ培地５ｍＬに、Ｃ. ｊｅｊｕｎｉ培養液の１０倍希釈液２５０μＬを接種して、ＰＣ１０（力価：５．３×１０８ＰＦＵ／ｍＬ）１００μＬ及びＥＤＴＡ５００μＬ（終濃度：０．００１、０．０１、０．０２５及び０．１容量％）をそれぞれ添加し、４２℃、４８時間微好気条件下で培養した。０時間後（すなわち、培養開始時）、４時間後、８時間後、１２時間後及び２４時間後に、培養液をＨＢＡにプレーティングし、４２℃、４８時間微好気培養した後、コロニー数から生菌数を測定した。また、ＰＣ１０及びＥＤＴＡのいずれも添加しないものをコントロールとした。結果を以下の図１に示す。なお、図１には、「コントロール」、「ＰＣ１０単独」、「０．０２５容量％ＥＤＴＡ単独」、「０．１容量％ＥＤＴＡ単独」、「ＰＣ１０と０．０２５容量％ＥＤＴＡとの併用」、「ＰＣ１０と０．１容量％ＥＤＴＡとの併用」の結果を示した。
図１から、ＰＣ１０単独の場合は培養８時間後以降に生菌数が増加した。また、０．００１容量％及び０．０１容量％ＥＤＴＡを併用した場合もＰＣ１０単独の場合と同様に培養８時間後以降に生菌数が増加した（図示せず）。一方、０．０２５容量％及び０．１容量％ＥＤＴＡを併用した場合は、８時間後以降の菌の増殖が抑制され、生菌数をさらに低下させて、培養２４時間後には生菌数が検出下限以下になった。
このことから、ＰＣ１０と０．０２５容量％以上０．１容量％以下のＥＤＴＡとを併用した場合は、ＥＤＴＡによりＣ. ｊｅｊｕｎｉのＰＣ１０に対する耐性化が効果的に抑制され、これにより、効果的にＣ. ｊｅｊｕｎｉの増殖が抑制された。
このことから、ＰＣ１０と０．０２５容量％以上０．１容量％以下のＥＤＴＡとを併用した場合は、ＥＤＴＡによりＣ. ｊｅｊｕｎｉのＰＣ１０に対する耐性化が効果的に抑制され、これにより、効果的にＣ. ｊｅｊｕｎｉの増殖が抑制された。
［実施例２］サルモネラ属菌に対するバクテリオファージとＥＤＴＡとの併用効果の検討
次に、Ｓａｌｍｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓに対するＳ． Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ特異的溶菌ファージＳＴＧ２とＥＤＴＡとの併用効果を調べた。
まず、１ｍＭのＣａＣｌ２及び１０ｍＭのＭｇＳＯ４含有ＢＨＩ培地５ｍＬに、Ｓ． Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ培養液の１０倍希釈液２５０μＬを接種して、ＳＴＧ２（力価：１．０×１０１０ＰＦＵ／ｍＬ）１００μＬ及びＥＤＴＡ５００μＬ（終濃度：０．０２５及び０．１容量％）をそれぞれ添加し、４２℃、４８時間微好気条件下で培養した。０時間後（すなわち、培養開始時）、４時間後、８時間後、１２時間後及び２４時間後に、培養液をＨＢＡにプレーティングし、４２℃、４８時間微好気培養した後、コロニー数から生菌数を測定した。また、ＳＴＧ２及びＥＤＴＡのいずれも添加しないものをコントロールとした。結果を以下の図２に示す。
次に、Ｓａｌｍｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓに対するＳ． Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ特異的溶菌ファージＳＴＧ２とＥＤＴＡとの併用効果を調べた。
まず、１ｍＭのＣａＣｌ２及び１０ｍＭのＭｇＳＯ４含有ＢＨＩ培地５ｍＬに、Ｓ． Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ培養液の１０倍希釈液２５０μＬを接種して、ＳＴＧ２（力価：１．０×１０１０ＰＦＵ／ｍＬ）１００μＬ及びＥＤＴＡ５００μＬ（終濃度：０．０２５及び０．１容量％）をそれぞれ添加し、４２℃、４８時間微好気条件下で培養した。０時間後（すなわち、培養開始時）、４時間後、８時間後、１２時間後及び２４時間後に、培養液をＨＢＡにプレーティングし、４２℃、４８時間微好気培養した後、コロニー数から生菌数を測定した。また、ＳＴＧ２及びＥＤＴＡのいずれも添加しないものをコントロールとした。結果を以下の図２に示す。
図２から、ＳＴＧ２単独の場合は培養６時間後以降に生菌数が増加した。また、０．０２５容量％及び０．１容量％ＥＤＴＡ単独の場合、並びに、０．０２５容量％ＥＤＴＡを併用した場合も、ＳＴＧ２単独の場合と同様に培養６時間後以降に生菌数が増加した。一方、０．１容量％ＥＤＴＡを併用した場合は、６時間後以降の菌の増殖が抑制され、生菌数をさらに低下させて、培養２４時間後には生菌数が検出下限以下になった。
このことから、ＳＴＧ２と０．１容量％のＥＤＴＡとを併用した場合は、ＥＤＴＡによりＳ． ＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓのＳＴＧ２に対する耐性化が効果的に抑制され、これにより、効果的にＳ． Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓの増殖が抑制された。
このことから、ＳＴＧ２と０．１容量％のＥＤＴＡとを併用した場合は、ＥＤＴＡによりＳ． ＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓのＳＴＧ２に対する耐性化が効果的に抑制され、これにより、効果的にＳ． Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓの増殖が抑制された。
これまでに、ＥＤＴＡは細菌に対するファージ感染の阻害剤として使用されるという報告がある（例えば、「参考文献２：Hungaro HM et al., “Use of bacteriophages to reduce Salmonella in chicken skin in comparison with a chemical agents.”, Food Research International, Vol. 52, Issue 1, p75-81, 2013.」参照）。
しかしながら、実施例１及び２で使用したＥＤＴＡの濃度は、上記報告で使用された濃度よりも低いことから、低濃度のＥＤＴＡであれば、Ｃ. ｊｅｊｕｎｉ及びＳ． Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓの、ファージに対する耐性化抑制効果を示すことが明らかになった。
また、現在、ＥＤＴＡは缶詰及び瓶詰食品に使用されており、その使用基準は０．２５ｇ／ｋｇとなっている。そのため、より実用的な濃度である０．０２５％ＥＤＴＡを以降の実施例で使用した。
しかしながら、実施例１及び２で使用したＥＤＴＡの濃度は、上記報告で使用された濃度よりも低いことから、低濃度のＥＤＴＡであれば、Ｃ. ｊｅｊｕｎｉ及びＳ． Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓの、ファージに対する耐性化抑制効果を示すことが明らかになった。
また、現在、ＥＤＴＡは缶詰及び瓶詰食品に使用されており、その使用基準は０．２５ｇ／ｋｇとなっている。そのため、より実用的な濃度である０．０２５％ＥＤＴＡを以降の実施例で使用した。
また、ファージは宿主菌の増殖能を利用して菌体内で増殖し、宿主菌を溶菌する。そのため、宿主菌が増殖できない環境下ではファージも増殖できずに宿主菌を溶菌できない。ＭＯＩを高く設定して１菌体に大量のファージが吸着できる環境にすれば、ファージが増殖しなくても宿主菌を溶菌するという報告があるが、実施例１及び２のＭＯＩは１０程度であった。
これに対し、ファージと低濃度のＥＤＴＡとの併用は、図１及び図２の結果からも明らかなように、相加効果ではなく、相乗効果であった。これは、低濃度のＥＤＴＡにより細菌のファージ耐性化が抑制されたことで、少量のファージであっても、溶菌作用が顕著に働いたためであると推察された。
これに対し、ファージと低濃度のＥＤＴＡとの併用は、図１及び図２の結果からも明らかなように、相加効果ではなく、相乗効果であった。これは、低濃度のＥＤＴＡにより細菌のファージ耐性化が抑制されたことで、少量のファージであっても、溶菌作用が顕著に働いたためであると推察された。
［実施例３］殺菌処理鶏皮におけるＣ． ｊｅｊｕｎｉに対するＰＣ１０とＥＤＴＡとの併用効果の検討
次に、ＰＣ１０とＥＤＴＡとの併用効果の実用性を調べるために、実際に鶏皮に接種したＣ． ｊｅｊｕｎｉに対するＰＣ１０とＥＤＴＡとの併用効果を調べた。試料としては、市販の国産若鶏皮を使用した。実際に食鶏処理過程で使用される次亜塩素酸ナトリウムによる殺菌処理と、ファージ感染のための４２℃での保持を加えた試料処理方法とについて検討した。
次に、ＰＣ１０とＥＤＴＡとの併用効果の実用性を調べるために、実際に鶏皮に接種したＣ． ｊｅｊｕｎｉに対するＰＣ１０とＥＤＴＡとの併用効果を調べた。試料としては、市販の国産若鶏皮を使用した。実際に食鶏処理過程で使用される次亜塩素酸ナトリウムによる殺菌処理と、ファージ感染のための４２℃での保持を加えた試料処理方法とについて検討した。
まず、３ｃｍ×３ｃｍ（９ｃｍ２）にカットした市販鶏皮にＣ． ｊｅｊｕｎｉの培養液の１００倍希釈液（滅菌水で希釈）を２０μＬ接種し、クリーンベンチ内で１５分間静置した。次いで、市販鶏肉でも行われている０．０２％次亜塩素酸ナトリウムによる殺菌を６０秒間行い、純水で洗浄してキムタオルで水気を除去した。次いで、０．１％ＥＤＴＡに６０秒間浸漬し、水気を軽く除去したのち、ＰＣ１０（力価：１．１×１０８ＰＦＵ／ｍＬ）１００μＬを接種して、真空パックした。真空パックした鶏皮は４２℃で１時間保持後、８℃で保存し、０時間後（すなわち、保存開始時）、１時間後、４時間後、８時間後、２４時間後の生菌数を測定した。ＰＣ１０及びＥＤＴＡを添加せずに次亜塩素酸ナトリウムのみで処理し、４２℃で保持せず、８℃で保存したものをコントロールとした。
また、生菌数測定では、ストマッカー袋に採取した鶏皮検体に生理食塩水１０ｍＬを加えて６０秒間ストマッカー処理し、生理食塩水で段階希釈した。バツラー培地と標準寒天培地とにそれぞれプレーティングし、バツラー培地では、３７℃、４８時間微好気培養後のコロニー数からＣ． ｊｅｊｕｎｉ生菌数を測定した。また、標準寒天培地では、３７℃、４８時間好気培養後のコロニー数から一般生菌数を測定した。結果を図３Ａ（Ｃ． ｊｅｊｕｎｉ生菌数）及び図３Ｂ（一般生菌数）に示す。
なお、バツラー培地は、以下の手順で調製した。まず、コロンビア血液寒天基礎培地（関東化学株式会社製）を所定の濃度で調製し、１２１℃、１５分間、オートクレーブ滅菌した。次いで、滅菌したコロンビア血液寒天基礎培地を５５℃まで冷却し、４５℃に加温したウマ溶血液（関東化学株式会社製）を終濃度５容量％となるように添加し、シャーレに分注して、寒天がゲル化後、使用した。
また、標準寒天培地は、以下の手順で調製した。まず、パールコア標準寒天培地（栄研化学株式会社製）を所定の濃度で調製し、１２１℃、１５分間、オートクレーブ滅菌した。次いで、滅菌したパールコア標準寒天培地をシャーレに分注して、寒天がゲル化後、使用した。
また、生菌数測定では、ストマッカー袋に採取した鶏皮検体に生理食塩水１０ｍＬを加えて６０秒間ストマッカー処理し、生理食塩水で段階希釈した。バツラー培地と標準寒天培地とにそれぞれプレーティングし、バツラー培地では、３７℃、４８時間微好気培養後のコロニー数からＣ． ｊｅｊｕｎｉ生菌数を測定した。また、標準寒天培地では、３７℃、４８時間好気培養後のコロニー数から一般生菌数を測定した。結果を図３Ａ（Ｃ． ｊｅｊｕｎｉ生菌数）及び図３Ｂ（一般生菌数）に示す。
なお、バツラー培地は、以下の手順で調製した。まず、コロンビア血液寒天基礎培地（関東化学株式会社製）を所定の濃度で調製し、１２１℃、１５分間、オートクレーブ滅菌した。次いで、滅菌したコロンビア血液寒天基礎培地を５５℃まで冷却し、４５℃に加温したウマ溶血液（関東化学株式会社製）を終濃度５容量％となるように添加し、シャーレに分注して、寒天がゲル化後、使用した。
また、標準寒天培地は、以下の手順で調製した。まず、パールコア標準寒天培地（栄研化学株式会社製）を所定の濃度で調製し、１２１℃、１５分間、オートクレーブ滅菌した。次いで、滅菌したパールコア標準寒天培地をシャーレに分注して、寒天がゲル化後、使用した。
図３Ａから、Ｃ． ｊｅｊｕｎｉ生菌数は４２℃で1 時間保持後には１．２桁減少し、この後８℃で２４時間保存しても生菌数の増加は認められなかった。この結果から、市販鶏皮上においても宿主菌の生育至適温度の４２℃であれば、ファージが感染できることが示された。
また、図３Ｂから、４２℃保持によって一般生菌が増殖することが懸念されたが、１時間程度であればほとんど増殖しないことが確かめられた。次亜塩素酸ナトリウムは水溶液中で生成した次亜塩素酸が細菌の細胞膜に作用してタンパク等を酸化することでその機能を阻害するため、グラム陽性菌及びグラム陰性菌に対して幅広く殺菌効果を示す。そのため、市販鶏皮上に存在する細菌に対して次亜塩素酸ナトリウムが作用したことで、４２℃でも細菌の増殖が抑制されたと考えられた。
これらのことから、殺菌処理とＥＤＴＡ処理とを組み合わせた前処理を行うことで、バクテリオファージを用いて食品のＣ． ｊｅｊｕｎｉ制御が可能であることが示された。
また、図３Ｂから、４２℃保持によって一般生菌が増殖することが懸念されたが、１時間程度であればほとんど増殖しないことが確かめられた。次亜塩素酸ナトリウムは水溶液中で生成した次亜塩素酸が細菌の細胞膜に作用してタンパク等を酸化することでその機能を阻害するため、グラム陽性菌及びグラム陰性菌に対して幅広く殺菌効果を示す。そのため、市販鶏皮上に存在する細菌に対して次亜塩素酸ナトリウムが作用したことで、４２℃でも細菌の増殖が抑制されたと考えられた。
これらのことから、殺菌処理とＥＤＴＡ処理とを組み合わせた前処理を行うことで、バクテリオファージを用いて食品のＣ． ｊｅｊｕｎｉ制御が可能であることが示された。
このようにバクテリオファージとＥＤＴＡとの組み合わせにより、ＥＤＴＡによりカンピロバクター及びサルモネラ等の食中毒細菌のバクテリオファージに対する耐性化を効果的に抑制でき、これにより、カンピロバクター及びサルモネラ等の食中毒細菌に対するバクテリオファージの溶菌効果が高められ、さらにその生育を長時間阻害できることが示された。
［実施例４］リステリア属菌に対するバクテリオファージとＥＤＴＡとの併用効果の検討
次に、グラム陽性菌であるＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ Ｎｏ．１９３株に対するＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ Ｎｏ．１９３株特異的溶菌ファージ１９３－Ｓ３とＥＤＴＡとの併用効果を調べた。
まず、ＬＢ培地５ｍＬに、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ Ｎｏ．１９３株の培養液（ＯＤ６６０＝０．１）の１０倍希釈液２５０μＬを接種して、１９３－Ｓ３（力価：５．７×１０９ＰＦＵ／ｍＬ）１００μＬ及びＥＤＴＡ５００μＬ（終濃度：０．０２５容量％）をそれぞれ添加し、３７℃、４８時間好気条件下で振とう培養した。０時間後（すなわち、培養開始時）、３時間後、６時間後、２４時間後及び４８時間後に、培養液をトリプケースソイ寒天培地（Ｔｒｙｐｃａｓｅ Ｓｏｙ Ａｇａｒ：ＴＳＡ）にプレーティングし、３７℃、４８時間好気培養した後、コロニー数から生菌数を測定した。また、１９３－Ｓ３及びＥＤＴＡのいずれも添加しないものをコントロールとした。結果を以下の図４に示す。
次に、グラム陽性菌であるＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ Ｎｏ．１９３株に対するＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ Ｎｏ．１９３株特異的溶菌ファージ１９３－Ｓ３とＥＤＴＡとの併用効果を調べた。
まず、ＬＢ培地５ｍＬに、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ Ｎｏ．１９３株の培養液（ＯＤ６６０＝０．１）の１０倍希釈液２５０μＬを接種して、１９３－Ｓ３（力価：５．７×１０９ＰＦＵ／ｍＬ）１００μＬ及びＥＤＴＡ５００μＬ（終濃度：０．０２５容量％）をそれぞれ添加し、３７℃、４８時間好気条件下で振とう培養した。０時間後（すなわち、培養開始時）、３時間後、６時間後、２４時間後及び４８時間後に、培養液をトリプケースソイ寒天培地（Ｔｒｙｐｃａｓｅ Ｓｏｙ Ａｇａｒ：ＴＳＡ）にプレーティングし、３７℃、４８時間好気培養した後、コロニー数から生菌数を測定した。また、１９３－Ｓ３及びＥＤＴＡのいずれも添加しないものをコントロールとした。結果を以下の図４に示す。
図４から、１９３－Ｓ３単独の場合は培養３時間後以降に生菌数が増加した。また、０．０２５容量％ＥＤＴＡ単独の場合、培養６時間後までゆるやかに生菌数が増加したが、培養６時間後以降は、生菌数はほぼ一定であった。一方、０．０２５容量％ＥＤＴＡを併用した場合は、６時間後以降の菌の増殖が抑制され、生菌数をさらに低下させて、培養４８時間後には生菌数が１×１０４ＣＦＵ／ｍＬ以下になった。
このことから、１９３－Ｓ３と０．０２５容量％のＥＤＴＡとを併用した場合は、効果的にＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの増殖が抑制された。また、Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対するファージと低濃度のＥＤＴＡとの併用は、図４の結果からも明らかであるが、上記図１及び上記図２の結果と同様に、相加効果ではなく、相乗効果であった。これは、低濃度のＥＤＴＡによりリステリア属菌のファージ耐性化が抑制されたことで、少量のファージであっても、溶菌作用が顕著に働いたためであると推察された。
このことから、１９３－Ｓ３と０．０２５容量％のＥＤＴＡとを併用した場合は、効果的にＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの増殖が抑制された。また、Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対するファージと低濃度のＥＤＴＡとの併用は、図４の結果からも明らかであるが、上記図１及び上記図２の結果と同様に、相加効果ではなく、相乗効果であった。これは、低濃度のＥＤＴＡによりリステリア属菌のファージ耐性化が抑制されたことで、少量のファージであっても、溶菌作用が顕著に働いたためであると推察された。
以上の結果から、ファージと低濃度のＥＤＴＡとを併用することで、グラム陰性菌及びグラム陽性菌のいずれの食中毒細菌についても、増殖を効果的に抑制できることが明らかとなった。
［実施例５］食中毒細菌の混合培養液に対するバクテリオファージとナイシンとの併用効果の検討
次に、日本国内で食品添加物として認可されており、抗菌活性を有することが知られているナイシンを用いて、食中毒細菌の混合培養液に対する各細菌の特異的溶菌ファージのカクテルとナイシンとの併用効果を調べた。
まず、ＬＢ培地５ｍＬに、Ｓ． Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓ． Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７の培養液（ＯＤ６６０＝０．１）の１０倍希釈液２５０μＬを接種して、Ｓ． Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ特異的溶菌ファージＳＴＧ２（力価：０．３×１０１０ＰＦＵ／ｍＬ）、Ｓ． Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ特異的溶菌ファージＳＥＧ５（力価：０．３×１０１０ＰＦＵ／ｍＬ）及びＥ． ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７特異的溶菌ファージＰＳ５（力価：０．３×１０１０ＰＦＵ／ｍＬ）を含むファージカクテル溶液１００μＬ及びナイシン５００μＬ（終濃度：５００、１０００及び２０００ＩＵ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）をそれぞれ添加し、３７℃、２４時間好気条件下で振とう培養した。０時間後（すなわち、培養開始時）、２時間後、４時間後、６時間後及び２４時間後に、培養液をＴＳＡにプレーティングし、３７℃、４８時間好気培養した後、コロニー数から生菌数を測定した。また、ファージカクテル溶液及びナイシンのいずれも添加しないものをコントロールとした。結果を以下の図５に示す。図５において、「Ｐｈａｇｅ」とはファージカクテル溶液を意味する。
次に、日本国内で食品添加物として認可されており、抗菌活性を有することが知られているナイシンを用いて、食中毒細菌の混合培養液に対する各細菌の特異的溶菌ファージのカクテルとナイシンとの併用効果を調べた。
まず、ＬＢ培地５ｍＬに、Ｓ． Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓ． Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７の培養液（ＯＤ６６０＝０．１）の１０倍希釈液２５０μＬを接種して、Ｓ． Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ特異的溶菌ファージＳＴＧ２（力価：０．３×１０１０ＰＦＵ／ｍＬ）、Ｓ． Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ特異的溶菌ファージＳＥＧ５（力価：０．３×１０１０ＰＦＵ／ｍＬ）及びＥ． ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７特異的溶菌ファージＰＳ５（力価：０．３×１０１０ＰＦＵ／ｍＬ）を含むファージカクテル溶液１００μＬ及びナイシン５００μＬ（終濃度：５００、１０００及び２０００ＩＵ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）をそれぞれ添加し、３７℃、２４時間好気条件下で振とう培養した。０時間後（すなわち、培養開始時）、２時間後、４時間後、６時間後及び２４時間後に、培養液をＴＳＡにプレーティングし、３７℃、４８時間好気培養した後、コロニー数から生菌数を測定した。また、ファージカクテル溶液及びナイシンのいずれも添加しないものをコントロールとした。結果を以下の図５に示す。図５において、「Ｐｈａｇｅ」とはファージカクテル溶液を意味する。
図５から、ファージカクテル溶液単独の場合は培養４時間後以降に生菌数が増加した。また、５００、１０００及び２０００ＩＵ／ｍＬナイシン単独の場合、培養２時間後以降に生菌数が増加した。一方、５００、１０００及び２０００ＩＵ／ｍＬナイシンを併用した場合は、４時間後以降の菌の増殖が抑制され、生菌数をさらに低下させて、培養６時間後以降には生菌数が検出下限以下になった。
以上のことから、ＥＤＴＡと同様に、ファージとナイシンとを併用することで、食中毒細菌の増殖を効果的に抑制できることが明らかとなった。
また、Ｓ． Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓ． Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及びＥ． ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７に対するファージカクテルとナイシンとの併用は、図５の結果からも明らかであるが、上記図１、上記図２及び上記図４の結果と同様に、相加効果ではなく、相乗効果であった。これは、ナイシンによりＳ． Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓ． Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及びＥ． ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７の各ファージに対する耐性化が抑制されたことで、少量のファージカクテルであっても、溶菌作用が顕著に働いたためであると推察された。
また、Ｓ． Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓ． Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及びＥ． ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７に対するファージカクテルとナイシンとの併用は、図５の結果からも明らかであるが、上記図１、上記図２及び上記図４の結果と同様に、相加効果ではなく、相乗効果であった。これは、ナイシンによりＳ． Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓ． Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及びＥ． ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７の各ファージに対する耐性化が抑制されたことで、少量のファージカクテルであっても、溶菌作用が顕著に働いたためであると推察された。
本実施形態の食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤は、多種の食中毒細菌に有効であり、食中毒細菌のバクテリオファージに対する耐性化を効果的に抑制することができる。本実施形態の食中毒細菌増殖抑制用組成物は、バクテリオファージと、前記食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤と、を含み、例えば、食品、調理器具等に対して、好適に用いられる。
Claims (6)
- キレート剤又はナイシンを有効成分として含有する食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤。
- 前記キレート剤がエチレンジアミン四酢酸又はその塩である請求項１に記載の食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤。
- バクテリオファージと、請求項１又は２に記載の食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤とを含む食中毒細菌増殖抑制用組成物。
- 食品に対して用いられる請求項３に記載の食中毒細菌増殖抑制用組成物。
- キレート剤又はナイシンを有効成分として含有する食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤の使用であって、食中毒細菌のバクテリオファージに対する耐性化を抑制するための、食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制剤の使用。
- キレート剤又はナイシンを用いる食中毒細菌のバクテリオファージ耐性化抑制方法。
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2018
- 2018-05-23 WO PCT/JP2018/019836 patent/WO2019224941A1/ja active Application Filing
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| CN113528459B (zh) * | 2021-06-03 | 2022-02-11 | 暨南大学 | 一株蜡样芽胞杆菌噬菌体DLn1及其应用 |
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