PT104837A - P?ptidos de fagos enteroc?cicos e m?todos para a sua utiliza??o - Google Patents

Abstract

A PRESENTE INVEN??O REFERE-SE A POLIP?PTIDOS ISOLADOS E QUIM?RICOS ORIGIN?RIOS DE BACTERI?FAGOS DE ENTEROCOCCUS COM ACTIVIDADE ANTIBI?TICA E A SUA UTILIZA??O NO TRATAMENTO E CONTROLO DE INFEC??ES BACTERIANAS. NALGUNS ASPECTOS ESPEC?FICOS, A PRESENTE INVEN??O REFERE-SE ? UTILIZA??O DE UM ANTIBACTERIANO IN?DITO DERIVADO DO BACTERI?FAGO 168 E DAS SUAS CONSTRU??ES QUIM?RICAS, E A SUA UTILIZA??O PARA O TRATAMENTO E O CONTROLO DE INFEC??ES CAUSADAS POR BACT?RIAS GRAM-POSITIVAS, INCLUINDO ENTEROCOCCUS FAECALIS.

Description

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DESCRIÇÃO

"PÉPTIDOS DE FAGOS ENTEROCÓCICOS E MÉTODOS PARA A SUA UTILIZAÇÃO"

Referência a pedido relacionado

Este pedido reivindica os benefícios do Pedido Provisório de Patente Portuguesa No. 104 837, de título "ESTUDO DA ACTIVIDADE DE LISINAS CODIFICADAS POR BACTERIÓFAGOS QUE INFECTAM ENTEROCOCCUS SP", depositado a 24 de Novembro de 2009, o qual é aqui incorporado por referência na sua totalidade. 1. Campo da Invenção A presente invenção refere-se a polipéptidos isolados e quiméricos originários de bacteriófagos de Enterococcus com actividade antibiótica e a sua utilização no tratamento e controlo de infecções bacterianas. Nalguns aspectos específicos, a presente invenção refere-se à utilização de um péptido antibacteriano inédito derivado do bacteriófago 168 e das suas construções quiméricas, incluindo construções quiméricas com péptidos antibacterianos derivados do bacteriófago 170, e a sua utilização para o tratamento e o controlo de infecções causadas por bactérias Gram-positivas, incluindo Enterococcus faecalis. 2. Antecedentes da Invenção

Bacteriófagos (fagos) são vírus que infectam e lisam especificamente bactérias. A terapia com fagos, um método de utilização de vírus fágicos inteiros para o tratamento de doenças infecciosas bacterianas, foi introduzida por Félix d'Herelle, que descobriu os fagos à volta de 1920. No início do século XX, realizaram-se vários estudos da aplicação de fagos para terapia em humanos assim como em 2 animais. Em 1940 a Eli Lilly Company produziu 7 produtos de fagos para utilização humana, incluindo preparações de fagos para o tratamento de diferentes doenças causadas por Staphylococcus sp., E. colí, e outras bactérias patogénicas. Estas preparações foram utilizadas para tratar infecções que causam abcessos, feridas purulentas, vaginites, infecções do tracto respiratório superior crónicas agudas, e mastoidites.

No entanto, com o aparecimento dos antibióticos nos anos 1904, o desenvolvimento de terapêuticas baseadas em fagos declinou no mundo Ocidental. Um dos factores mais importantes que contribuiu para o declínio do interesse na terapia com fagos no mundo Ocidental foi o problema da credibilidade. A redução no número de estudos conduzidos de forma apropriada e a falta de protocolos bem estabelecidos e padronizados interferiu com a documentação rigorosa da valia da terapia com fagos. Muitos problemas relacionados com a produção de amostras/especímenes de fagos também complicaram os estudos ou as investigações iniciais relacionadas com a terapia com fagos. Foram utilizados diversos estabilizantes e conservantes na tentativa de aumentar a viabilidade da terapêutica com fagos. No entanto, sem uma boa compreensão da natureza biológica do fago e da sua estabilidade em resposta a vários agentes físicos e químicos, muitos dos ingredientes adicionados para prolongar a viabilidade das preparações de fagos resultou num efeito negativo na viabilidade do fago, e nalguns casos verificou-se serem tóxicos para humanos. Outro problema relacionado com a produção de fagos foi o grau de pureza das preparações comerciais destes vírus. As preparações de terapia com fagos, incluindo aquelas originárias de empresas bem estabelecidas nos Estados Unidos e noutros países, consistiam em lisados em bruto da 3 bateria hospedeira tratada com o fago de interesse. Assim, as preparações continham componentes bacterianos, incluindo endotoxinas, que poderiam ter efeitos adversos nos pacientes tratados com estas preparações, particularmente aqueles que recebiam administração intravenosa. No entanto, a utilização de bacteriófagos para fins terapêuticos continuou em conjunto com, ou em substituição de, antibióticos, na Europa de Leste e na antiga União Soviética nas quais o acesso a antibióticos era limitado.

Com o aumento de estirpes bacterianas resistentes a antibióticos, o interesse em terapias baseadas em fagos ganhou um interesse mais alargado. Mesmo que se possam desenvolver novas classes de antibióticos, a perspectiva de que bactérias venham eventualmente a desenvolver resistência aos novos fármacos intensificou a investigação para meios não quimioterapêuticos para o controlo e o tratamento de infecções bacterianas. Existem três estratégias gerais para a utilização de terapias baseadas em fagos na aplicação clinica: 1) a utilização de um fago activo, virulento; 2) a utilização de endolisinas ou lisinas purificadas isoladas de bacteriófagos; e 3) a utilização de uma proteínas estrutural do fago identificado como um inibidor metabólico de enzimas chave para a síntese de peptidoglicano bacteriano.

Entre as estratégias mais promissoras actualmente em desenvolvimento estão as lisinas de fagos. Podem ser utilizadas preparações de endolisinas purificadas como agentes terapêuticos, isoladamente, ou combinadas com antibióticos clássicos. A adição de lisinas exógenas a bactérias Gram-positivas pode causar a lise completa na ausência de bacteriófago (Loeffler et al., 2001, Science 294: 2170-2172; Shuch et al., 2002, Nature 418: 884-889). 4

Imagens microscópicas de bactérias tratadas com uma lisina indicam que estas enzimas exercem o seu efeito letal através da digestão do peptidoglicano, conduzindo à formação de orifícios na parede celular. Em comparação com o ambiente externo, o interior de uma bactéria é hipertónico, e quando a parede celular perde a sua integridades estrutural, o resultado é a extrusão da membrana citoplasmática e a lise hipertónica.

Quando a penicilina e os antibióticos da classe das Celfalosporinas inibem a síntese de peptidoglicano causando a lise da parede da célula bacteriana durante a divisão celular, as lisinas do fago destroem directamente o peptidoglicano, exercendo o efeito lítico segundos após terem sido administradas. As lisinas podem também destruir a parede celular das bactérias que não estão a crescer e são insensíveis a muitos antibióticos. Quando administradas simultaneamente, duas lisinas ou dois domínios catalíticos de lisinas que têm alvos diferentes podem atacar o peptidoglicano em múltiplas regiões, apresentando um efeito sinérgico. 0 aumento da resistência a antibióticos voltou a atenção para lisinas de fagos na qualidade de agentes antibacterianos, assim como para o desenvolvimento de construções quiméricas de tais lisinas.

As lisinas quiméricas foram construídas através da recombinação de domínios catalíticos de diferentes lisinas, na tentativa, por exemplo, de produzir lisinas com diferentes especificidades bacterianas e catalíticas (Fischetti VA, 2010, "Bacteriophage endolysins: A novel anti-infective to control Gram-positive pathogens," Intl J. Med. Microbiol. 300(6): 357-62). A técnica anterior com tais construções geralmente focou-se em lisinas dirigidas contra Pneumococcus e Staphylococcus spp. Por exemplo, os 5 domínios catalíticos de enzimas líticos para o fago de 5 pneumoniae foram trocados para criar uma lisina com o mesmo domínio de ligação para pneumococos, mas capaz de quebrar uma ligação de peptidoglicano diferente (Garcia et al., 1990, "Modular organization of the lytic enzymes of Streptococcus pneumoniae and its bacteriophages," Gene 86, 81-88; Weiss et al., 1999, "Group A Streptococcus carriage among close contacts of patients with invasive infections," Am. J. Epidemiol. 149, 863-868). Estudos semelhantes foram levados a cabo mais tarde para lisinas do fago de Staphylococcus (Monoharadas et al., 2009, "Antimicrobial activity of a chmeric enzybiotic towards Staphylococcus aureus," J. Biotechnol. 139, 118-123.). No entanto, a utilização de lisinas de fagos foi apenas muito mais recentemente aplicada ao tratamento de Enterococcus spp., sem terem havido descrições de lisinas de fagos de Enterococcus quiméricos por outros inventores para além dos presentes. (Ver, por exemplo, WO 2010/090542 e WO 2010/041970, cada uma das quais aqui incorporada por referência na sua totalidade). Além disso, a maioria das lisinas investigadas até à data são especificas para a espécie (ou subespécie) de bactéria da qual são derivadas. Por exemplo, mostrou-se que as lisinas isoladas de fagos de estreptococos apenas matarão certos estreptococos e que lisinas produzidas pelo fago de pneumococos apenas matarão pneumococos (Fishcetti, 2005, Trends in Microbio 13: 491-496) .

Os enterococos estão em 4 o lugar na América do Norte e em 5o lugar na Europa dos patogénios que causam infecções no sangue, e a incidência de enterococos resistentes a antibióticos aumentou progressivamente nos Estados Unidos e na Europa ao longo da última década (Deshpande, LM, et al. 2007, "Antimicrobial resistance and molecular epidemiology 6 of vancomycin-resistant enterococci from North America and Europe: a report from SENTRY antimicrobial surveillance program", Diagn. Microbiol. 58: 163-170). De facto, a utilização acrescida da vancomicina para o tratamento de Staphylococcus spp. resistentes à meticilina tem sido a causa principal para o aumento dos enterococos resistentes à vancomicina (VRE) (Chavers, LS, et al., 2003, "Vancomycin-resistant enterococci: 15 years and counting," J. Hosp. Infect. 53: 159-171).

Os enterococos podem causar diversas infecções, incluindo endocardite, bacteremia, meningite, e infecções nas feridas cirúrgicas, e são também capazes de colonizar superfícies ambientais, incluindo equipamento médico, durante períodos prolongados (Arias, CA, et al., 2008, "Emergence and management of drug-resistant enterooccal infections," Expert Rev. Anti Infect. Ther. 6(5): 637-655). Espécies comuns de Enterococcus incluem E. faecalis e E. faecíum, ambos bactérias Gram-positivas que colonizam a boca, a vagina e os intestinos inferiores. Apesar de normalmente não causarem efeitos adversos em humanos, o nível elevado de resistência a antibióticos pode levar a que estes organismos se tornem uma fonte significativa de infecções nosocomiais, particularmente em pacientes imunocomprometidos (Murray, BE, 1990, "The life and times of the enterococcus," Clin. Micorbiol. Rev. 3: 46-65). No entanto, mesmo há cinco anos, não existiam avaliações disponíveis relativamente a quaisquer bacteriófagos de E. faecalis (Uchiyama J., et al., 2008, "In silico and in vivo evaluation of bacteriophage ®EF24C, a candidate for treatment of Enterococcus faecalis infections," Applied and Environmental Microbiology. 74(13): 4149-4163); e a primeira lisina com acção antibacteriana contra Enterococcus foi apenas descoberta há seis anos (Yoong, et 7 al. "Identification of a Broadly Active Phage Lytic Enzyme with Lethal Activity against Antibiotic-Resistance Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium," 2004, J. of Bacteriol. 186(14): 4808-4812).

Deste modo, existe uma clara necessidade para investigação suplementar das lisinas de fagos de enterococos como potenciais agentes terapêuticos e profiláticos para utilização, in vivo, para gerir e tratar bactérias patogénicas, incluindo enterococos patogénicos. Assim, existe uma necessidade crescente para descobrir novas enzimas lisinas que possam ser utilizadas para tratar o número crescente de espécies bacterianas de Enterococcus que desenvolveram resistência a antibióticos, assim como uma necessidade de desenvolver construções de lisina que permitam uma reactividade cruzada entre espécies e ou estirpes. Em particular, seria valioso o isolamento e/ou o desenvolvimento de novas lisinas com actividade lítica letal ou antibacteriana contra enterococos e outras bactérias, para além da espécie especifica da qual as lisinas foram derivadas. 3. Resumo da Invenção

A presente invenção refere-se a polipéptidos isolados e quiméricos originários do bacteriófago de enterococos com a actividade antibiótica e a sua utilização para o tratamento, prevenção e controlo de infecções bacterianas, particularmente infecções de enterococos. Num aspecto, a presente invenção refere-se a polipéptidos quiméricos compreendendo os domínios catalíticos de duas ou mais endolisinas de bacteriófagos de enterococos, em que os polipéptidos quiméricos apresentam um desempenho lítico aumentado relativamente a bactérias Enterococcus em comparação com as endolisinas nativas de bacteriófagos. O desempenho lítico acrescido inclui um espectro de actividade mais alargado contra baterias da espécie e/ou estirpes Enterococcus. Os domínios catalíticos dos polipéptidos quiméricos podem ser de bacteriófagos iguais ou diferentes, que podem ter os mesmos ou diferentes hospedeiros bacterianos, por exemplo, hospedeiros bacterianos da mesma ou de diferentes espécies, ou da mesma ou de diferentes estirpes bacterianas. Nalgumas implementações, as endolisinas nativas são de bacteriófagos que infectam de forma nativa E. faecalis, em particular as estirpes E. faecalis 1518/05 e E. faecalis 926/095.

Nalgumas implementações, os polipéptidos quiméricos da invenção incluem um domínio CHAP de uma endolisina do bacteriófago F 168/08, em particular um domínio CHAP de Lysl68 (SEQ ID NO:7). Nalgumas implementações, o domínio CHAP é combinado com um domínio amidase de uma endolisina do bacteriófago F 170/08, em particular um domínio da amidase-2- de Lysl70 (SEQ ID NO:5).

Nalgumas implementações específicas, o domínio CHAP compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 7 ou um seu fragmento, com actividade antimicrobiana ou antibacteriana contra Enterococcus sp., particularmente E. faecalis e/ou E. faecium. Noutras realizações, utiliza-se um péptido que corresponde ao domínio CHAP e compreende um fragmento, variante ou derivado de SEQ ID NO:7, em que o fragmento, variante ou derivado tem uma actividade antibiótica ou uma actividade antimicrobiana (por exemplo, uma actividade lítica letal) contra uma bactéria Gram-positiva, por exemplo, Enterococcus sp., particularmente, E. faecalis e/ou E. faecium. Num exemplo específico de acordo com esta implementação, a invenção proporciona péptidos com uma sequência de aminoácidos com pelo menos 9 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 95%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou uma identidade de sequência superior em relação a uma sequência de aminoácidos do mesmo comprimento (isto é, que consiste no mesmo número de residuos) e com uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO:7, ou um seu fragmento.

Nalgumas implementações especificas, o dominio amidase compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO:5, ou um seu fragmento, com actividade antimicrobiana ou antibiótica contra E. faecalis. Noutras realizações, utiliza-se um péptido que corresponde ao dominio amidase e compreende um fragmento, variante ou derivado da SEQ ID NO: 5 em que o fragmento, variante ou derivado tem actividade antibiótica ou actividade antimicrobiana (por exemplo, uma actividade litica letal) contra uma bactéria Gram-positiva, por exemplo, Enterococcus sp., particularmente, E. faecalis e/ou E. faecium. Num exemplo específico de acordo com esta implementação, a invenção proporciona péptidos com uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 95%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou uma identidade de sequência superior em relação a uma sequência de aminoácidos do mesmo comprimento (isto é, que consiste no mesmo número de resíduos) e com uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO:5, ou um seu fragmento.

Nalgumas implementações específicas, o polipéptido quimérico compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9, ou um seu fragmento, com actividade antimicrobiana ou antibiótica contra Enterococcus sp., particularmente E. faecalis e/ou E faecium. Noutras realizações, o polipéptido quimérico compreende um fragmento, variante ou derivado da SEQ ID NO:9, em que o fragmento, variante ou derivado tem 10 actividade antibiótica ou actividade antimicrobiana (por exemplo, uma actividade litica letal) contra uma bactéria Gram-positiva, por exemplo, Enterococcus sp., particularmente, E. faecalis e/ou E. faecium. Num exemplo específico de acordo com esta implementação, a invenção proporciona péptidos quiméricos com uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60%, ' 65%, 70%, 75%, 85%, 95 %, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou uma identidade de sequência superior em relação a uma sequência de aminoácidos do mesmo comprimento (isto é, que consiste no mesmo número de resíduos) e com uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO:9, ou um seu fragmento e

Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a péptidos obtidos a partir do bacteriófago F 168/08, péptidos esses que apresentam actividade antibiótica contra uma bactéria gram-positiva, por exemplo, Enterococcus sp.r particularmente, E. faecalis e/ou E. faecium, assim como construções quiméricas com péptidos antibacterianos obtidos a partir do bacteriófago F 170/08. Nalgumas implementações específicas, o péptido da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO:7. Noutras implementações, o péptido da invenção compreende um fragmento, variante, ou derivado de SEQ ID NO:7, em que o referido fragmento, variante ou derivado tem actividade antibiótica (por exemplo, actividade litica letal) contra uma bactéria Gram-positiva, por exemplo, Enterococcus sp., particularmente, E. faecalis e/ou E. faecium. Num exemplo específico de acordo com esta implementação, a invenção proporciona péptidos com uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 95%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou uma identidade de sequência superior em relação a uma segunda sequência de aminoácidos do mesmo comprimento (isto é, que consiste no mesmo número de 11 resíduos) e com uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO:7, ou um seu fragmento. A invenção também engloba polinucleótidos que codificam para os polipéptidos da invenção. A invenção também se refere a um vector compreendendo o referido ácido nucleico. Numa realização específica, o referido vector é um vector de expressão. A invenção proporciona ainda células hospedeiras contendo um vector que compreende polinucleótidos que codificam para os polipéptidos da invenção.

Numa realização específica, a invenção proporciona um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica para um péptido do fago 168, ou um seu fragmento activo, cujo polipéptido ou fragmento apresenta actividade antibiótica (por exemplo, actividade lítica letal) contra uma bactéria Gram-positiva, por exemplo, Enterococcus sp., particularmente, E. faecalis e/ou E. faecium. Num exemplo específico de acordo com esta implementação, a invenção proporciona um ácido nucleico compreendendo ou consistindo na sequência de ácido nucleico SEQ ID NO: 8, ou um seu fragmento. A invenção também se refere a um vector compreendendo o referido ácido nucleico. Numa implementação específica, o referido vector é um vector de expressão. A invenção proporciona ainda células hospedeiras contendo um vector compreendendo polinucleótidos que codificam para os polipéptidos da invenção.

Noutra realização especifica, a invenção proporciona um ácido nucleico quimérico compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica para um péptido do fago 168 correspondente a um domínio catalítico, ou um seu fragmento 12 activo, combinado com um domínio catalítico de uma proteína lisina heteróloga. Num exemplo específico de acordo com esta implementação, a invenção proporciona um ácido nucleico compreendendo ou consistindo na sequência de ácido nucleico SEQ ID NO:10, ou um seu fragmento. A invenção também se refere a um vector compreendendo o referido ácido nucleico quimérico. Numa implementação específica, o referido vector é um vector de expressão. A invenção proporciona ainda células hospedeiras contendo um vector compreendendo polinucleótidos que codificam para os polipéptidos quiméricos da invenção. A invenção engloba métodos para a avaliação da actividade antibiótica de péptidos isolados e polipéptidos quiméricos (por exemplo, letalidade com base na actividade antimicrobiana e/ou lítica dos péptidos e polipéptidos da invenção). A actividade antimicrobiana pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica e/ou aqui descrito. Em certas implementações, a actividade antibiótica é determinada através da cultura de bactérias Gram-positivas de acordo com técnicas convencionais (por exemplo, em cultura líquida ou em placas de agar), fazendo contactar a cultura com péptidos e/ou polipéptidos da invenção e monitorizando o crescimento celular após o referido contacto. Por exemplo, numa cultura líquida, a bactéria, por exemplo, E. faecalis, pode ser crescida até uma densidade óptica ("DO") representativa de um ponto intermédio do crescimento exponencial da cultura; porções da cultura expostas a uma ou mais concentrações de um ou mais péptidos e/ou polipéptidos da invenção e a DO monitorizada em relação a uma cultura controlo. A diminuição da DO relativamente a uma cultura de controlo é representativa de um péptido e/ou polipéptido que apresenta actividade antibiótica (por exemplo, apresenta actividade 13 antimicrobiana e/ou lítica letal). Do mesmo modo, pode-se permitir a formação de colónias bacterianas numa placa de agar, expor a placa a um péptido e/ou polipéptido da invenção, e o crescimento subsequente das colónias avaliado em comparação com placas controlo. Uma dimensão inferior das colónias, ou um número total de colónias inferior indica um péptido e/ou polipéptido com actividade antibiótica. A presente invenção abrange métodos para a produção de péptidos e polipéptidos da invenção ou de seus fragmentos activos, particularmente para utilização em composições farmacêuticas, por exemplo, composições antibióticas ou antimicrobianas. Em certas implementações, os péptidos e polipéptidos da invenção são isolados directamente de culturas celulares (por exemplo, culturas bacterianas) infectadas com o bacteriófago 168 ou o bacteriófago 170, utilizando técnicas convencionais conhecidas na técnica e/ou aqui descritas. Noutras implementações, os péptidos e polipéptidos da presente invenção são produzidos por meios recombinantes utilizando um vector de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica para um péptido ou polipéptido da invenção, por exemplo, SEQ ID NO: 6, 8 ou 10, ou um seu fragmento, derivado, ou variante activo (por exemplo, fragmento esse que tem actividade antibiótica).

Os péptidos e polipéptidos da invenção ou os seus fragmentos podem ser produzidos por qualquer método conhecido na técnica para a produção de um polipéptido, em particular, através técnicas de síntese química ou de expressão recombinante. Numa implementação específica, a invenção refere-se a um método para a produção recombinante de um péptido ou polipéptido quimérico de lisina da 14 invenção, ou de um seu fragmento activo, compreendendo o referido método: (i) a construção de um ácido nucleico que codifica para o referido péptido ou polipéptido; (ii) cultivar num meio uma células hospedeira compreendendo o referido ácido nucleico, sob condições adequadas para a expressão do referido péptido ou polipéptido; e (iii) recuperar o referido péptido ou polipéptido do referido meio. Em certas realizações, a sequência de ácidos nucleicos que codifica para o péptido ou polipéptido quimérico de lisina da invenção está ligado de forma funcional a um promotor heterólogo, uma combinação com um promotor não naturalmente encontrado com a sequência. A presente invenção abrange composições farmacêuticas compreendendo péptidos isolados e/ou péptidos quiméricos derivados do bacteriófago 168, em particular péptidos isolados ou péptidos quiméricos com actividade antimicrobiana e/ou antibiótica. As composições farmacêuticas da invenção podem adicionalmente compreender um veiculo, excipiente ou estabilizante farmaceuticamente aceitável. Em implementações especificas, as composições farmacêuticas compreendem um polipéptido com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. Noutra implementação, as composições farmacêuticas compreendem um polipéptido que é uma variante, derivado ou fragmento de SEQ ID NO: 7, em que a variante, o derivado ou o fragmento retém actividade antimicrobiana contra uma bactéria Gram-positiva, por exemplo, Enterococcus sp., particularmente, E. faecalis e/ou E. faecium. Noutras implementações especificas, as composições farmacêuticas compreendem um polipéptido quimérico com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. Noutra implementação, as composições farmacêuticas compreendem um polipéptido quimérico que é uma variante, um derivado ou um fragmento de SEQ ID NO:9, em que a variante, 15 o derivado ou o fragmento retém actividade antimicrobiana e/ou antibiótica contra uma bactéria Gram-positiva, por exemplo, Enterococcus sp., particularmente, E. faecalis e/ou E. faecium.

Em implementações especificas, as composições farmacêuticas da invenção são composições antibióticas para o tratamento, prevenção e/ou melhoria dos sintomas de uma doença ou distúrbio associados com uma infecção por uma bactéria Gram-positiva num indivíduo que dela necessite. Deste modo, outro aspecto da invenção refere-se a um método para o tratamento de uma infecção bacteriana num indivíduo que dele necessite, compreendendo o método a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica. 0 indivíduo que recebe a composição farmacêutica pode ser um mamífero (por exemplo, bovino, ovino, caprino, equino, primata (por exemplo, humano), roedor, lagomorfo) ou aves (por exemplo, galinhas, patos, gansos) . No contexto da presente invenção, "tratamento" refere-se tanto ao tratamento terapêutico como profilático ou medidas preventivas, em que o objectivo é eliminar, aliviar, diminuir a gravidade de, diminuir a progressão de, ou evitar os sintomas ou causa (por exemplo, infecção bacteriana) associados com a condição ou distúrbio patológico. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser utilizadas no tratamento ou na gestão de infecções associadas com, mas não limitadas a, bactérias Gram-positivas, tais como, Enterococcus, em particular, Enterococcus faecalis e/ou Enterococcus faecium, assim como Staphylococcus aureus (incluindo MRSA), Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Streptococcus grupo, Micrococcus luteus, Escherichia coli, e combinações destes. Em certas implementações, as composições farmacêuticas da 16 invenção são utilizadas no tratamento de condições associadas à infecçâo com estirpes resistentes à vancomicina de Enterococcus (VRE). As composições farmacêuticas podem também ser utilizadas para tratar condições ou distúrbios associados com infecções bacterianas incluindo, mas sem se limitar a, endocardite, bacteremia, diverticulite, meningite, infecçâo do tracto urinário, e infecções de feridas cirúrgicas.

Em certas implementações, a invenção proporciona a utilização de péptidos lisina ou polipéptidos quiméricos como terapia de um único agente. Noutras implementações, os péptidos lisina e os polipéptidos quiméricos da presente invenção podem ser combinados com uma ou mais lisinas de um bacteriófago diferente do bacteriófago 168, e/ou diferentes de lisinas do bacteriófago 170. Ainda noutras implementações, a invenção proporciona a utilização de um péptido lisina ou polipéptido quimérico, ou seu fragmento activo, variante ou derivado, em combinação com um tratamento convencional ou experimental para infecçâo de bactéria Gram-positiva. Ainda noutras implementações, a invenção proporciona a utilização de um péptido lisina, polipéptido quimérico, ou fragmento activo de ambos, que foi conjugado quimicamente a ainda outra molécula terapêutica (por exemplo, citotoxina péptido ou não péptido). Tal terapia de combinação pode aumentar a eficácia do tratamento padrão ou experimental. Exemplos de agentes terapêuticos que são particularmente úteis em combinação com um péptido ou polipéptido da invenção são agentes anti-inflamatórios, agentes antibióticos quimioterapêuticos convencionais (por exemplo, penicilina, penicilinas sintéticas, bacitracina, meticilina, cefalosporina, polimixina, cefaclor, cefadroxil, nafato de cefamandol, cefazolina, cefixima, cefmetazole, cefonicide, 17 cefoperazona, ceforanida, cefotanme, cefotaxima, cefotetano, cefoxitina, cefpodoxima, proxetil, ceftazidima, ceftizoxima, ceftriaxona, moxalactama de cefriaxona, cefuroxima, cefalexina, cefalosporina C, sal de sódio de cefalosporina C, cefalotina, sal de sódio de cefalotina, cefapirina, cefradina, cefuroximeaxetil, di-hidratecefalotina, moxalactama, nafato de loracarbef e agentes quelantes. As terapias de combinação abrangidas pela invenção podem ser formuladas numa composição farmacêutica simples ou podem ser administradas em composições separadas como parte de um regime de tratamento global.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas por qualquer método conhecido na técnica adequado para a administração de um composto antibiótico, por exemplo, através de administração oral ou parenteral (por exemplo, inalação, administração intramuscular, intravenosa, ou epidérmica).

As composições farmacêuticas da presente invenção podem também ser utilizadas para utilização tradicionalmente não terapêuticas tais como agentes antibacterianos em cosméticos, ou em sprays ou soluções para utilização em superfícies sólidas para prevenir a colonização de bactérias Gram-positivas (por exemplo, como um desinfectante ou anti-infectante). A presente invenção refere-se também a métodos para o rastreio de péptidos para actividade antibiótica. Nalgumas implementações o método compreende o rastreio de sequências de aminoácidos contíguas de pelo menos 6, 10, 15, 20 ou 25 resíduos de comprimento da SEQ ID NO: 5, 7 ou 9 relativamente a actividade antimicrobiana, por exemplo, 18 actividade antimicrobiana contra Enterococcus sp., particularmente E. faecalis e/ou E. faecium, sendo a referida actividade antibiótica e/ou de direccionamento medida pela capacidade do péptido ou do polipéptido em inibir o crescimento bacteriano em cultura em agar ou cultura liquida. 4. Breve Descrição dos Desenhos A FIG. 1 mostra a actividade litica das lisinas Lysl68, Lysl70, e Lysl70-168, testadas para quatro quantidades diferentes, em 98 estirpes clínicas de Enterococcus. A FIG. 2 mostra a actividade de Lys 168 e Lysl70 como a percentagem de redução na turbidez para cada uma das três estirpes de E. faecalis, E. faecalis 926/05, E. faecalis 1518/05 e E. faecalis 1915/05, após adição de 5 pg/mL de cada lisina. A FIG. 3 mostra um ensaio de viabilidade celular para cada uma das três estirpes de E. faecalis, E. faecalis 926/05, E. faecalis 1518/05 e E. faecalis 1915/05, medida como UFC/mL no início (To) e no final (Tgo) do ensaio de redução de turbidez. A FIG. 4 mostra uma avaliação terapêutica para Lys 168 e Lysl70 nos corações de 3 ratos Wistar fêmea, em que se utilizou tampão como controlo negativo e o tratamento foi levado a cabo 24 depois da infecção no coração. A FIG. 5 mostra uma avaliação terapêutica de Lys 168 e Lysl70 no sangue de 3 ratos Wistar fêmea, em que se utilizou tampão como controlo negativo e o tratamento foi levado a cabo 24 depois da infecção no coração. 19 A FIG. 6 mostra uma avaliação terapêutica de Lys 168 e

Lysl70 nos corações de 1 rato Wistar macho e 3 fêmeas, em que se utilizaram o rato macho e tampão como controlos negativos e o tratamento foi levado a cabo 19-24 depois da infecção no coração. 5. Descrição Detalhada da Invenção 5.1 Definições

Tal como aqui utilizados, os termos "polipéptido", "péptido" e "proteína" são utilizados indistintamente para se referir uma sequência de aminoácido de qualquer comprimento. No entanto, em geral, "péptido" refere-se a sequências mais curtas, por exemplo, um fragmento de um polipéptido ou proteína inteira, incluindo um fragmento funcional correspondendo a um domínio enzimático que retém a sua função separada do resto do polipéptido ou da proteína da qual é derivado. "Proteína" geralmente refere-se a uma sequência de aminoácido expressa e encontrada naturalmente por um organismo na Natureza; enquanto que "polipéptido" geralmente refere-se a um produto recombinante e/ou quimérico, mas pode também incluir os significados gerais de "proteína" e "péptido".

Tal como aqui utilizado, o termo "fragmento" refere-se a um péptido ou polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácido de pelo menos 5 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 10 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 15 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 20 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 25 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 40 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 50 resíduos de 20 aminoácidos contíguos, pelo menos 60 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 70 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 80 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 90 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 100 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 125 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 150 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 175 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 200 resíduos de aminoácidos contíguos da sequência de aminoácidos de um segundo pol ipéptido. Numa implementação específica, 0 fragmento é um fragmento funcional no sentido em que retém pelo menos uma função do segundo polipéptido (por exemplo, actividade antimicrobiana ou antibiótica; ou actividade de direccionamento).

Tal como aqui utilizado, o termo "isolado" no contexto de um péptido, polipéptido, ou proteína de fusão refere-se a um péptido, polipéptido ou proteína de fusão que é substancialmente livre de material celular ou de proteínas contaminantes da célula ou tecido fonte da qual é derivada, ou substancialmente livres de precursores químicos ou outros químicos quando sintetizados quimicamente. A linguagem "substancialmente livre de material celular" inclui preparações de um péptido, polipéptido, ou proteína de fusão em que o péptido, polipéptido, ou proteína de fusão são separados dos componentes de células a partir das quais são isolados ou produzidos de forma recombinante. Assim, um péptido, polipéptido, ou proteína de fusão que é substancialmente livre de material celular inclui preparações de um péptido, polipéptido, ou proteína de fusão com menos de cerca de 30%, 20%, 10%, ou 5% (em peso seco) de proteínas heterólogas (também aqui referido como "proteína contaminante") . Quando o péptido, polipéptido, ou 21 proteína de fusão são produzidos de forma recombinante, é também preferentemente substancialmente livre de meio de cultura, ou seja, o meio de cultura represente menos de cerca de 20%, 10% ou 5% do volume da preparação de proteínas. Quando o péptido, polipéptido, ou proteína de fusão é produzido por síntese química, é preferentemente livre de precursores químicos ou de outros químicos, ou seja, é separado de precursores químicos ou de outros químicos que estão envolvidos na síntese do péptido, polipéptido, ou proteína de fusão. Deste modo tais preparações de um péptido, polipéptido, ou proteína de fusão têm menos de cerca de 30%, 20%, 10%, 5% (em peso seco) de precursores químicos ou compostos diferentes do péptido, polipéptido, ou proteína de fusão de interesse.

Tal como aqui utilizado, o termo "isolado" no contexto de moléculas de ácidos nucleicos refere-se a uma primeira molécula de ácido nucleico que é preparada a partir de outras moléculas de ácidos nucleicos que estão presentes na fonte natural da primeira molécula de ácido nucleico. Além disso, uma molécula de ácido nucleico "isolada", tal como uma molécula de cADN, é substancialmente livre de outro material celular, ou meio de cultura quando produzida por técnicas recombinantes, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros químicos quando sintetizada quimicamente e pode ser livre de outro cADN ou outras moléculas de ADN genómico, por exemplo, quando foi isolada de outros clones numa biblioteca de ácidos nucleicos. O termo "purificado", no contexto de uma lisina ou lisina quimérica de acordo com a presente invenção, significa que a concentração da construção da lisina ou da lisina quimérica foi notoriamente aumentada por qualquer processo de purificação, incluindo, mas sem limitação a, 22 cromatografia em coluna, HPLC, precipitação, electroforese, etc., removendo assim impurezas de forma parcial, substancial ou completa tais como precursores ou outros químicos envolvidos na preparação da lisina ou da lisina quimérica. Alguém competente na técnica apreciará a quantidade de purificação necessária para uma dada utilização. Por exemplo, proteína isolada que se pretende utilizar em composições terapêuticas para administração humana devem geralmente ser de elevada pureza de acordo com os padrões regulamentares (por exemplo, de pureza mais elevada do que proteínas isoladas para utilização laboratorial).

Tal como aqui utilizado, o termo "derivado" no contexto de polipéptidos refere-se a um polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos que foi alterada pela introdução de substituições, deleções ou adições de resíduos de aminoácidos. 0 termo "derivado" tal como aqui utilizado também se refere a um polipéptido que foi modificado, isto é, por ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao polipéptido. Por exemplo, mas sem qualquer limitação, os polipéptidos podem ser modificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação, pegilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos protectores/bloqueadores conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligando celular ou outra proteína, etc. Um derivado polipeptídico pode ser produzido por modificações químicas utilizando técnicas conhecidas pelos peritos na técnica, incluindo, mas sem limitação a clivagem química, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina específicas, etc. Além disso, um derivado polipeptídico pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos. Um derivado polipeptídico pode possuir uma função similar ou idêntica que o polipéptido do qual foi derivado, ou pode possuir uma 23 função melhorada. 0 termo "derivado" tal como utilizado em referência a um polipéptido "derivado" de um organismo pode também referir-se ao isolamento de um polipéptido directamente do referido organismo (por exemplo células bacterianas ou fagos).

Tal como aqui utilizado, o termo "quimérico" refere-se a uma construção derivada de duas ou mais fontes heterólogas. Um gene quimérico ou um ácido nucleico quimérico, por exemplo, pode compreender sequências derivadas de um primeiro ácido nucleico combinado com sequências derivadas de um segundo ácido nucleico, em que o primeiro e o segundo ácidos nucleicos são nativos a diferentes tipos de bacteriófagos ou ocorrem naturalmente em diferentes polipéptidos de um único tipo de bacteriófago. As sequências de cada ácido nucleico correspondem tipicamente a sequências codificantes para um domínio funcional dos respectivos polipéptidos codificados, por exemplo, um domínio catalisador de uma lisina. As sequências heterólogas de ácidos nucleicos podem ser combinadas na grelha, por exemplo, por meios recombinantes, de modo a codificar para uma proteína de fusão ou um polipéptido quimérico, que pode ser então expresso sob condições apropriadas. Um polipéptido quimérico pode ser desenhado de modo a incluir a totalidade da sequência de duas ou mais proteínas nativas, ou apenas uma porção de ambas. São geralmente criados polipéptidos quiméricos para conferir funcionalidade de cada um das proteínas originais aos polipéptidos quiméricos resultantes. A funcionalidade dual (ou de ordem superior) das proteínas de fusão é tornada possível pelo facto dos domínios da proteína funcional serem geralmente modulares, de modo que uma porção linear de um polipéptido que constitui um dado domínio, tal como um domínio catalítico, pode ser removido do resto da 24 proteína sem destruir a sua capacidade enzimática. Um ácido nucleico quimérico ou polipéptido quimérico compreende sequências derivadas de dois ou mais genes de lisina ou polipéptidos podem ser referidos como uma "lisina quimérica" ou "construção de lisina quimérica".

Tal como aqui utilizado, o termo "endolisina" é utilizado indistintamente com o termo "lisina". Endolisinas são proteínas codificadas por ADN de cadeia dupla de bacteriófagos, produzidas para o final de um ciclo de vida lítico do bacteriófago, e desenhadas para atacar a parede celular de peptidoglicano da bactéria hospedeira, de modo a permitir a libertação da progenitura de partículas de fago. As endolisinas são também capazes de degradar peptidoglicano quando aplicadas de forma exógena a uma parede celular, por exemplo, na forma de polipéptidos isolados e/ou recombinantes, geralmente resultando na lise rápida da parede celular bacteriana. As lisinas de fagos Gram-positivos têm geralmente uma estrutura de domínios modular, em que o domínio N-terminal contendo o domínio catalítico e o domínio C-terminal contendo um domínio de ligação ou de direccionamento que se liga a um substrato específico da parede celular da bactéria hospedeira. As actividades enzimáticas dos domínios catalíticos incluem, por exemplo, uma actividade de endo-β-Ν-acetilglucosaminidase ou N-acetilmuramidase (actividade de lisozima), que actuam na porção de hidratos de carbono da parede celular; uma actividade de endopeptidase, que actua nas pontes peptídicas; ou uma actividade de N-acetilmuramoil-L-alanina amidase (actividade de amidase), que ataca a ligação amida que liga a cadeia de glicano e as porções peptídicas. 25

Tal como aqui utilizado, um "domínio CHAP" refere-se a um dominio amidase conservado encontrado em várias hidrolases do peptidoglicano codificadas por fagos e refere-se a "cysteine, histidine-dependent amidohydrolases/peptidases", ou seja, amido-hidrolases/peptidases dependentes da cisteina, histidina. Ver, por exemplo, Rigden D, et. al., Trends Biochem Sei. 2003 May 28(5): 230-4. Encontra-se numa superfamilia de amidases, incluindo amidase GSP e hidrolases do peptidoglicano. A familia inclui pelo menos dois tipos diferentes de actividades de clivagem de peptidoglicano: actividade de L-muramoil-L-alanina amidase e de D-alanil-glicil endopeptidase. Os domínios CHAP geralmente contêm resíduos cisteina e histidina conservados e hidrolisam substratos contendo γ-glutamilo. Crê-se que estes resíduos cisteina sejam essenciais para a actividade de várias destas amidases, e os seus grupos tiol parecem funcionar como nucleófilos nos mecanismos catalíticos de todas as enzimas contendo este domínio. Os domínios CHAP são frequentemente encontrados em associação com outros domínios que clivam o peptidoglicano, por exemplo, actuando de um modo cooperativo para clivar substratos especializados. Ver também, Bateman A, et al., Trends Biochem Sei. 2003 May 28(5): 234-7.

Tal como aqui utilizado, o termo "célula hospedeira" refere-se à célula particular transfectada com uma moléculas de ácido nucleico e a progenitura ou progenitura potencial de tal célula. Pode também referir-se a uma célula infectada, particularmente infectada naturalmente, com um bacteriófago particular. A progenitura de uma célula hospedeira pode não ser idêntica a uma célula parental transfectada com a molécula de ácido nucleico, ou infectada com o fago, devido a mutações ou influências ambientais que podem ocorrer nas gerações que se sucedem ou integração da 26 molécula de ácido nucleico ou material genético do fago no genoma da célula hospedeira.

Tal como aqui utilizado, o termo "em combinação" refere-se à utilização de mais do que um agente profilático e/ou terapêutico. A utilização do termo "em combinação" não restringe a ordem na qual os agentes profiláticos e/ou terapêuticos são administrados a um indivíduo com uma doença ou distúrbio. Um primeiro agente profilático ou terapêutico pode ser administrado antes de (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, ou 12 semanas antes), concomitantemente com, ou subsequentemente (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, ou 12 semanas depois) da administração de um segundo agente profilático ou terapêutico (diferente do primeiro agente profilático ou terapêutico) a um indivíduo com uma doença ou um distúrbio.

Tal como aqui utilizados, os termos "ácidos nucleicos" e "sequências nucleotídicas" incluem moléculas de ADN (por exemplo, cADN ou ADN genómico), moléculas de ARN (por exemplo, mARN), combinações de moléculas de ADN e ARN, moléculas de ADN e ARN quiméricas, ou moléculas de ADN/ARN híbridas, e análogos de ADN ou ARN. Tais análogos podem ser gerados utilizando, por exemplo, análogos de nucleótidos, que incluem, mas não se limitam a, inosina ou bases tritiladas. Tais análogos podem também compreender moléculas de ADN ou ARN compreendendo esqueletos modificados que conferem atributos benéficos às moléculas 27 tais como, resistência a nucleases ou uma capacidade acrescida de atravessar membranas celulares. Os ácidos nucleicos ou sequências de nucleótidos podem ter uma cadeia simples, uma cadeia dupla, podem conter tanto porções de cadeia simples como de cadeia dupla, e podem conter porções de cadeia tripla, mas são preferentemente ADN de cadeia dupla.

Tal como aqui utilizados, os termos "agente profilático" e "agentes profiláticos" referem-se a péptidos, polipéptidos, e/ou proteínas da invenção que podem ser utilizados na prevenção, no atraso do início de, no retardar da progressão de, na melhoria, ou na gestão de um ou mais sintomas de uma doença ou distúrbio, ou da causa subjacente da doença ou do distúrbio, associado com a infecção por uma bactéria Gram-positiva e, em particular, associada com infecção por uma Enterococcus.

Tal como aqui utilizados, os termos "agente terapêutico" e "agentes terapêuticos" referem-se a péptidos, polipéptidos, e/ou proteínas da invenção que podem ser utilizados no tratamento, na gestão ou na melhoria de um ou mais sintomas de uma doença ou distúrbio, ou da causa subjacente da doença ou do distúrbio, associado com a infecção por uma bactéria Gram-positiva e, em particular, associada com infecção por uma Enterococcus.

Tal como aqui utilizado, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de agente terapêutico suficiente para resultar na melhoria de um ou mais sintomas de uma doença ou distúrbio (por exemplo, uma doença ou distúrbio associado com infecção por uma bactéria Gram-positiva e, em particular, associada com infecção por Enterococcus) num indivíduo; ou resultar numa 28 redução na carga bacteriana total num dado indivíduo, em particular uma redução na carga bacteriana total de Enterococcus.

Tal como aqui utilizado, os termos "tratar" e "tratamento" refere-se a uma melhoria de um ou mais sintomas de associados com uma infecção por uma bactéria Gram-positiva, em particular, associada com infecção por Enterococcus; ou a uma redução na carga bacteriana total, em particular, uma redução na carga bacteriana total de Enterococcus, resultando da administração de um ou mais péptidos, polipéptidos, e/ou proteínas da invenção. 0 termo "actividade antibiótica" refere-se à capacidade de matar e/ou inibir o crescimento ou a reprodução de um microrganismo e pode ser usado indistintamente com "actividade antimicrobiana". Em certas implementações, a actividade antibiótica ou antimicrobiana é avaliada através da cultura de bactérias Gram-positivas de acordo com técnicas convencionais (por exemplo, em cultura líquida ou em placas de agar), contactando a cultura com péptidos, polipéptidos, e/ou proteínas da invenção e monitorizando o crescimento celular após o referido contacto. Por exemplo, numa cultura líquida, as bactérias, por exemplo, E. faecalis ou E. faecium, podem ser crescidas a uma densidade óptica ("DO") representativa de um ponto intermédio no crescimento exponencial da cultura; a cultura exposta a uma ou mais concentrações de um ou mais péptidos e/ou polipéptidos da invenção; e a DO monitorizada em relação a uma cultura controlo. A diminuição da DO relativamente a uma cultura de controlo é representativa de um polipéptido que apresenta actividade antibiótica (por exemplo, que apresenta actividade lítica letal). Do mesmo modo, pode-se permitir a formação de colónias bacterianas numa placa de 29 agar, expor a placa a um polipéptido da invenção, e o crescimento subsequente das colónias avaliado em comparação com placas controlo. Uma dimensão inferior das colónias, ou um número total de colónias inferior indica um polipéptido com actividade antibiótica. Um fragmento, variante, ou derivado de um polipéptido de lisina com actividade antibiótica ou antimicrobiana refere-se a um fragmento com a capacidade catalítica de provocar a morte da célula bacteriana hospedeira e/ou de provocar a inibição do seu crescimento ou da sua reprodução, ou ao fragmento que tem essa capacidade catalítica assim como actividade de direccionamento relativamente a um hospedeiro, tal como definido abaixo. 0 termo "actividade de direccionamento" refere-se à capacidade de um polipéptido de lisina direccionar a actividade catalítica, tal como actividade antibiótica ou antimicrobiana, relativamente a uma dada célula bacteriana hospedeira. A actividade de direccionamento pode estar associada com uma região ou um domínio particular do polipéptido, de tal modo que, por exemplo, uma construção quimérica compreendendo um domínio de direccionamento de um primeiro polipéptido de lisina, nativo de uma primeira espécie hospedeira, pode direccionar a actividade catalítica, tal como a actividade antibiótica, da construção quimérica para células bacterianas da primeira espécie hospedeira. Tal como aqui utilizada, a actividade de direccionamento "relativamente" a uma célula hospedeira ou espécie bacteriana particular é utilizada indistintamente com as expressões relacionadas de actividade de direccionamento "para" ou "contra" a célula hospedeira ou espécie bacteriana. "Domínio de direccionamento" tal como aqui utilizado refere-se a um domínio funcional de um polipéptido de lisina capaz de 30 direccionar o polipéptido de lisina para uma célula hospedeira, por exemplo, E. faecalis, facilitando assim a acção litica sobre a célula hospedeira. Um "domínio de direccionamento", por exemplo, pode corresponder ao domínio de ligação à parede celular de um polipéptido de lisina.

Geralmente, quando se refere a fragmentos, variantes, ou derivados de um polipéptido lisina do fago 168, "actividade antimicrobiana" ou "actividade antibiótica" refere-se a ambas ou a qualquer uma das funcionalidades, ou seja, às actividades catalítica e/ou de direccionamento para causar a morte celular de bactérias Gram-positivas, por exemplo, E. faecalis, o hospedeiro nativo para o fago 168. 5.2 Polipéptidos de lisina

Num aspecto, a invenção refere-se a polipéptidos isolados de um fago que infecta bactérias Gram-positivas. Os polipéptidos apresentam actividade antimicrobiana (por exemplo, litica) e/ou actividade de direccionamento contra uma ou mais estirpes de E. faecalis. Numa implementação, proporcionam-se polipéptidos que apresentam actividade antimicrobiana e/ou de direccionamento contra estirpes resistentes à vancomicina de Enterococcus (VRE). Além disso, são aqui proporcionados polipéptidos com actividade antimicrobiana e/ou de direccionamento contra um ou mais patogénios bacterianos tais como Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, S. haemolyticus, S. epidermidis, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Streptococcus grupo, Micrococcus luteus, e Escherichia coli.

Preferentemente, o polipéptido da invenção é isolado do bacteriófago 168, que infecta o hospedeiro E. faecalis. Aqui, o termo "bacteriófago 168" é usado indistintamente 31 com os termos "bacteriófago F168/08" ou "fago 168". Numa outra implementação, o polipéptido é péptido de lisina isolado do fago 168, compreendendo o péptido de lisina a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7 ou um seu fragmento com actividade antimicrobiana contra E. faecalis. Noutra implementação, o péptido compreende uma sequência de aminoácido com uma identidade de sequência de pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou superior relativamente à SEQ ID NO: 7, ou um seu fragmento, péptido esse que apresenta actividade antibiótica e/ou de direccionamento contra E. faecalis. A identidade de sequência relativamente às sequências de péptido ou polipéptido aqui apresentas é definida como a percentagem de resíduos de aminoácido que são idênticos numa sequência candidata do mesmo comprimento (ou seja, consiste no mesmo número de resíduos) que as sequências de aminoácidos da presente invenção. A presente invenção também abrange variantes, derivados e/ou fragmentos de SEQ ID NO: 7, retendo actividade antimicrobiana e/ou actividade de direccionamento para pelo menos uma estirpe ou espécie bacteriana Gram-positiva.

Noutro aspecto, a invenção refere-se a péptidos, polipéptidos e/ou proteínas isoladas da presente invenção fundida de forma recombinante ou conjugada quimicamente (incluindo tanto as conjugações covalente como não covalente) de agentes terapêuticos, por exemplo, pequenas moléculas, polipéptidos heterólogos, ou domínios catalíticos de polipéptidos heterólogos, para gerar proteínas de fusão ou polipéptidos quiméricos. A fusão na precisa necessariamente ser direccionada, mas pode ocorrer através de sequências de ligação ou através de conjugação química. Exemplos não limitativos de agentes terapêuticos aos quais o péptido, polipéptidos ou proteína da invenção 32 podem estar conjugados são citotoxinas peptídicas ou não peptídicas (incluindo agentes antimicrobianos e/ou antibióticos), moléculas de rastreio/marcação (por exemplo, radionuclidos e fluoróforos), e outros compostos antibióticos tais como conhecidos na técnica.

Nalgumas realizações, a presente invenção refere-se a polipéptidos quiméricos compreendendo domínios catalíticos de duas ou mais endolisinas de bacteriófago de enterococos, em que os polipéptidos quiméricos apresentam um desempenho lítico acrescido relativamente à bactéria Enterococcus em comparação com as endolisinas do bacteriófago nativo. Os domínios catalíticos dos polipéptidos quiméricos podem ser do mesmo bacteriófago ou de bacteriófagos diferentes, os quais podem ter o mesmo ou diferentes hospedeiros bacterianos, por exemplo, hospedeiros bacterianos da mesma ou de diferentes espécies, ou do mesmo ou de diferentes estirpes bacterianas. Nalgumas realizações, as endolisinas nativas são de bacteriófagos que infectam nativamente E. faecalis, em particular estirpes E- faecalis 1518/05 e E. faecalis 926/095.

Numa implementação particular, a invenção refere-se a polipéptidos quiméricos em que pelo menos um domínio de um polipéptido isolado do fago 168, ou um seu fragmento, é combinado com pelo menos um domínio de uma proteína heteróloga. As construções quiméricas preferidas incluem a fusão de um domínio catalítico de uma lisina isolada do fago 168 (por exemplo, Lysl68) com um domínio catalítico de uma lisina isolada do fago 170 (por exemplo, Lysl70) , que infecta hospedeiros da espécie Enterococcus. Aqui, o termo "bacteriófago 170" é utilizado de forma indistinta com os termos "bacteriófago F170/08" ou "fago 170". As construções quiméricas de lisina resultantes são renomeadas Lysl70-168. 33

Preferentemente Lysl70-168 compreende um domínio amidase de Lysl70 e um domínio CHAP de Lysl68.

Numa implementação, o polipéptido quimérico Lysl70-168 compreende uma sequência de aminoácido com uma identidade de sequência de pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou superior relativamente à SEQ ID NO: 9, polipéptido quimérico esse que apresenta actividade antibiótica ou antimicrobiana contra E. faecalis. A identidade de sequência relativamente às sequências de polipéptido quimérico aqui apresentas é também definida como a percentagem de resíduos de aminoácido que são idênticos numa sequência candidata do mesmo comprimento (ou seja, consiste no mesmo número de resíduos) que as sequências de aminoácidos da presente invenção. A presente invenção também abrange variantes, derivados e/ou fragmentos de SEQ ID NO: 9, retendo actividade antimicrobiana e/ou actividade de antibiótica. Em implementações particularmente preferidas, os polipéptidos quiméricos e suas variantes, derivados, e/ou fragmentos melhora as propriedades de Lysl68 e/ou Lysl70, por exemplo, em termos de aumentos de solubilidade, rendimento, estabilidade, e/ou desempenho lítico, tal com incluir um espectro lítico mais alargado de actividade relativamente à espécie Enterococcus e/ou outras bactérias Gram-positivas. 5.3 Composições antibióticas

Os polipéptidos isolados e quiméricos da presente invenção podem ser administrados isoladamente ou incorporados numa composição farmacêutica para utilização no tratamento ou na profilaxia de infecções bacterianas causadas por bactérias Gram-positivas, incluindo Enterococcus faecalis. Nalgumas implementações, a composição farmacêutica pode ser uma 34 composição antibiótica. Os polipéptidos podem ser combinados com um veiculo, excipiente ou estabilizante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de veiculos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não se limitam a, tampões, tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipéptidos de baixo peso molecular; proteínas, tais como albumina do soro e gelatina; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono incluindo glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares álcoois, tais como manitol ou sorbitol; contra-iões formadores de sais tais como sódio; e/ou surfactantes não-iónicos tais como TWEEN™, polietileno glicol (PEG), e PLURONICS™ tal como conhecido na técnica. A composição farmacêutica da presente invenção (por exemplo, composição antibiótica) pode também incluir um lubrificante, um agente molhante, um adoçante, um agente aromatizante, um emulsionante, um agente de suspensão, e um conservante, além dos ingredientes acima.

Um polipéptido da presente invenção pode ser também combinado com um ou mais agentes terapêuticos e/ou profiláticos úteis para o tratamento de infecção com bactérias Gram-positivas (por exemplo, um ou mais antibióticos e/ou lisinas tais como conhecidas na técnica) . Agentes terapêuticos que podem ser utilizados em combinação com o polipéptido da invenção incluem agentes antibióticos, agentes anti-inflamatórios e agentes antivirais convencionais.

Antibióticos convencionais que podem ser utilizados com composições farmacêuticas compreendendo polipéptidos da 35 35 invenção incluem, mas não gentamicina, se limitam a, amicacina, canamicina, neomicina, netilmicina, paromomicma, tobramicina, geldanamicina, meropenem, rodoestreptomicina, estreptomicina, apramicina, rifamicina, naftomicina, ansamitocina, carbacefemes, imipenem, ertapenem, faropenem, doripenem, panipenem/betamipron, biapenem, PZ-601, cefalosporinas, cefacetrilo, cefadroxilo, cefalexina, cefaloglicina, cefalónio, cefaloridina, cefalotina, cefapirina, cefatrizina, cefazaflur, cefazedona, cefazolina, cefradina, cefroxadina, ceftezole, cefaclor, cefonicida, cefprozil, cefuroxime, cefuzonam, cefmetazole, cefotetan, cefoxitina, cefcapeno, cefdaloxima, cefdinir, cefditoren, cefetamet, cefixima, cefmenoxima, cefteram, ceftibuten, ceftiofur, ceftioleno, ceftizoxima, ceftriaxona, cefoperazona, ceftazidima, latamoxef, cefclidina, cefepima, cefluprenam, cefoselis, cefozopran, cefpirome, cefquinome, flomoxef, ceftobiprole, azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, roxitromicina, aztreonam, pencilina e derivados da penicilina, actinomicina, bacitracina, colistina, polimixina B, cinoxacina, flumequina, ácido nalidixico, ácido oxolinic, ácido piromidico, ácido pipemidico, rosoxacina, ciprofloxacina, enoxacina, fleroxacina, lomefloxacina, nadifloxacina, norfloxacina, ofloxacina, pefloxacina, rufloxacina, balofloxacina, gatifloxacina, grepafloxacina, levofloxacina, moxifloxacina, pazufloxacina, esparfloxacin, temafloxacina, tosufloxacina, clinafloxacina, garenoxacina, gemifloxacina, estifloxacina, trovalfloxacina, prulifloxacina, acetazolamida, benzolamida, bumetanida, celecoxib, clortalidona, clopamida, diclorfenamida, dorzolamida, etoxizolamida, furosemida, hidroclorotiazida, indapamida, mafendida, mefrusida, metolazona, probenecid, sulfacetamida, sulfadimetoxina, sulfadoxina, 36 sulfanilamidas, sulfametoxazol, sulfasalazina, sultiama, sumatriptano, xipamida, tetraciclina, clorotetraciclina, oxitetraciclina, doxiciclina, limeciclina, meclociclina, metaciclina, minociclina, rolitetraciclina e qualquer combinação destes. Antibióticos preferidos para utilização na gestão, prevenção, e/ou tratamento de infecções por enterococos, particularmente infecções por enterococos resistentes a antibióticos, incluindo β-lactamas, aminoglicósidos, glicopéptidos, lipoglicopéptidos, lipopéptidos tais como daptomicina, oxazolidinonas tais como linezolida, glicilciclinas tais como tigeciclina, e pristinamicinas tais como quinupristina-dalfopristina. Nalgumas implementações, a combinação com um ou mais polipéptidos da invenção e um ou mais antibióticos tais como conhecidos na técnica pode aumentar (por exemplo, de forma aditiva ou sinérgica) o efeito terapêutico do polipéptido da invenção para uma dada infecção, tal como uma infecção por enterococos.

Os polipéptidos quiméricos da presente invenção compreende uma combinação em que lisinas heterólogas são fundidas de forma recombinante, preferente em que um domínio catalítico de uma lisina isolada do fago 168 é junta a um domínio catalítico de uma lisina heteróloga, tal como uma lisina do fago 170. Preferentemente, a construção de lisina compreende um domínio amidase-2 da lisina do fago 170 e um domínio CHAP da lisina do fago 168, ambos os quais infectam de forma nativa a espécie Enterococcus. Sem se pretender uma ligação estrita à teoria, crê-se que a construção quimérica de acordo com a presente invenção direcciona bactérias Gram-positivas, incluindo Enterococcus faecalis, o hospedeiro nativo para os fagos 170 e 168, em que os domínios catalíticos dos fagos 170 e 168 actuam de forma sinérgica para destruir a parede da célula hospedeira, 37 causando lise e a morte bacteriana, com actividade lítica acrescida assim como um espectro litico acrescido. Deste modo, a presente invenção proporciona construções de lisina quimérica que permitem a reactividade cruzada entre estirpes e espécies de acordo com um objectivo da invenção. Nalgumas implementações particularmente preferidas, esta reactividade cruzada serve para melhorar o desempenho litico dos polipéptidos quiméricos em certas bactérias Gram-positivas, incluindo E. faecalis, em comparação com a actividade litica de Lysl70 e/ou Lysl68.

Os polipéptidos da presente invenção podem também ser combinados com uma ou mais lisinas isoladas de um bacteriófago que não seja o bacteriófago 168 ou 170, em particular outra lisina de um bacteriófago de Enterococcus. Em geral, as lisinas ou têm actividade de amidase, endopeptidase, muramidase ou glucosaminidase. Assim, a combinação de domínios catalíticos de lisinas, especialmente aquelas de diferentes actividades enzimáticas, é contemplada pela presente invenção, a qual em implementações preferidas produz lisinas com um desempenho litico acrescido relativamente a bactérias Enterococcus.

As composições farmacêuticas podem ser administradas usando vários modos de administração. Por exemplo, podem ser administradas por inalação, na forma de um supositório ou de um pessário, por via tópica (por exemplo, na forma de uma loção, solução, creme, unguento, ou pó), por via epidérmica (por exemplo, através da utilização de um adesivo cutâneo), por via oral (por exemplo na forma de um comprimido (por exemplo, um comprimido contendo excipientes tais como amido ou lactose), uma cápsula, um óvulo, um elixir, uma solução ou uma suspensão, opcionalmente 38 contendo agentes aromatizantes ou corantes e/ou excipientes), ou podem ser injectados dor via parentérica, por exemplo, por via intravenosa, intramuscular ou subcutânea. Para a administração parentérica, as composições podem ser melhor usadas na forma de uma solução aquosa estéril que pode conter outras substâncias, por exemplo, sais ou monossacáridos suficientes para tornar a solução isotónica com o sangue. Para administração bucal ou sublingual, as composições podem ser administradas na forma de comprimidos ou pastilhas que podem ser formulados de um modo convencional.

Para aplicação tópica à pele, os polipéptidos da presente invenção podem ser combinados com um ou uma combinação de veículos que incluem, mas não se limitam a, um líquido aquoso, um líquido de base alcoólica, um gel solúvel em água, uma loção, um unguento, uma base líquida não aquosa, uma base de óleo mineral, uma mistura de óleo mineral e petrolato, lanolina, lipossomas, proteínas, veículos tais como albumina do soro ou gelatina, caramelo de celulose em pó, e combinações destes. Um modo de administração tópico pode incluir um esfregaço, um spray, um adesivo de libertação retardada, um toalhete com líquido absorvido, e combinações destes. 0 polipéptido da invenção pode ser aplicado a um adesivo seja directamente ou num dos veículos. Os adesivos podem ser húmidos ou secos, em que a lisina ou a lisina quimérica está numa forma liofilizada no adesivo. Os veículos das composições tópicas podem compreender veículos semi-sólidos e em forma de gel que incluem um espessante polimérico, água, conservantes, surfactantes activos, emulsionantes, antioxidantes, filtros solares, e/ou um solvente ou sistema de mistura de solventes. A Patente U.S. No. 5,863,560 apresenta diversas 39 combinações de veículos diferentes que podem ajudar na exposição da pele a um medicamento.

Tal como indicado, o agente terapêutico da presente invenção pode ser administrado por via intranasal ou por inalação e é convenientemente administrado na forma de um inalador de pó seco ou um spray aerossol, por exemplo, apresentado através de um recipiente pressurizado, uma bomba, um spray, ou um nebulizador com a utilização de um propulsor adequado, por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, um hidrofluoroalcano, tal como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134A.TM.) ou 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano (HFA 227EA.TM.), dióxido de carbono, ou outro cãs adequado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada proporcionando uma válvula para administrar uma dose medida. 0 recipiente pressurizado, bomba, spray ou nebulizador pode conter uma solução ou suspensão do composto activo, por exemplo, utilizando uma mistura de etanol e o propulsor como solvente, que pode conter adicionalmente um lubrificante, por exemplo, trioleato de sorbitano. Cápsulas e cartuchos (feitos, por exemplo, a partir de gelatina) para utilização num inalador ou insuflador podem ser formuladas de modo a conter uma mistura em pó do agente e uma base em pó adequada tal como lactose ou amido.

Para administração na forma de um supositório ou pessário, as composições terapêuticas podem ser aplicadas por via tópica na forma de um gel, hidrogel, loção, solução, creme, unguento, ou pó. 0 agente terapêutico da presente invenção pode também ser administrado por via dérmica ou transdérmica, por exemplo, através da utilização de um adesivo cutâneo. Podem também ser administrados pelas vias 40 pulmonar ou rectal. Podem também ser administrados por via ocular. Para utilização oftálmica, os compostos podem ser formulados na forma de suspensões micronizadas em solução salina isotónica, com pH ajustado, estéreis, ou preferentemente, como soluções em salina isotónica, com pH ajustado, estéreis, opcionalmente em combinação com um conservante tal como cloreto de benzalcónio. Alternativamente, podem ser formulados na forma de um unguento tal como petrolato.

Para administração sob a forma de comprimidos, os comprimidos podem conter excipientes tais como celulose microcristalina, lactose, citrato de sódio, carbonato de cálcio, mono-hidrogeno fosfato de cálcio, e glicina agentes de desintegração de tais como amido (preferentemente milho, batata ou amido de milho), glicolato de amido de sódio, croscarmelose de sódio, certos silicatos complexos, e/ou aglutinantes de granulação tais como polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), hidroxipropilcelulose (HPC), sacarose, gelatina, e acácia. Adicionalmente, pode-se incluir agentes lubrificantes tais como estearato de magnésio, ácido esteárico, behenato de glicerilo, e talco.

As dosagens e concentrações de fármaco desejadas das composições farmacêuticas da presente invenção podem variar dependendo da utilização particular. A determinação da dosagem ou da via de administração apropriada está bem no âmbito da perícia de um médico convencional. Experiências in vitro e in vivo podem proporcionar informações fiáveis para a determinação de doses eficazes para terapia humana, tais como aquelas fornecidas nos Exemplos abaixo. O escalonamento entre espécies das doses eficazes pode ser realizado por alguém de perícia corrente na técnica seguindo os princípios descritos por Mordenti, J. e 41

Chappell, w., "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" em Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, Nova Iorque 1989, pp42-96 (aqui incorporado por referência na sua totalidade). 5.4 Utilização terapêutica

Os polipéptidos da presente invenção têm actividade antibiótica contra diversas bactérias Gram-positivas, incluindo Enterococcus faecalis, e incluindo várias estirpes resistentes à vancomicina de bactérias Enterococcus. Deste modo, os polipéptidos da presente invenção podem ser usados em métodos para o tratamento de infecções associadas com bactérias relativamente às quais têm actividade litica (por exemplo, actividade antibiótica ou antimicrobiana) tanto em humanos como em animais. Numa realização, as composições da presente invenção podem ser utilizadas para tratar uma infecção causada por uma ou mais das seguintes Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus (incluindo MRSA), S. haemolyticus, S. epidermidis, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Streptococcus grupo, Micrococcus luteus, e Escherichia coli. Em certas implementações, os polipéptidos da invenção podem também apresentar actividade antibiótica ou antimicrobiana (por exemplo actividade litica letal) contra bactérias Gram-negativas ou bactérias que não são classificadas nem como Gram-positivas nem como Gram-negativas. Em tais implementações, os polipéptidos da invenção podem ser usados para tratar, prevenir, e/ou gerir infecções associadas com bactérias não Gram-positivas.

Exemplos de doenças que são causadas por infecção de bactérias Gram-positivas que podem ser tratadas com composições farmacêuticas da presente invenção incluem, mas 42 não se limitam a, endocardite, bacteremia, diverticulite, meningite, infecção do tracto urinário, e infecções de feridas cirúrgicas, assim como endoftalmite pós-operatória, outras infecções do sistema nervoso central, outras infecções de feridas (por exemplo, úlceras de pé diabético), pneumonia, osteomielite, sepsia, e mastite. 5.5 Utilização desinfectante e anti-infecciosa

Praticamente todas as bactérias patogénicas infectam num local com membrana mucosa (respiratória superior, respiratória inferior, intestinal, urogenital, e/ou ocular). As próprias membranas mucosas são frequentemente o reservatório, por vezes o único reservatório, para muitas bactérias patogénicas encontradas no ambiente (por exemplo, pneumococos, estafilococos, enterococos e estreptococos). Existem muito poucos anti-infecciosos que são desenhados para controlar a fase de veiculo das bactérias patogénicas. No entanto, estudos mostraram que através da redução ou da eliminação deste reservatório em ambientes tais como hospitais e em casas de saúde, a incidência de infecções por estas bactérias seria marcadamente reduzida.

Os polipéptidos da presente invenção podem ser utilizados como composições anti-infecciosas para o controlo de bactérias Gram-positivas, incluindo E. faecalis, de modo a evitar ou a reduzir o desenvolvimento de infecções graves. Além da utilização em composições para aplicação a membranas mucosas, as lisinas ou construções de lisina da presente invenção podem também ser incorporadas em formulações tais como sprays ou unguentos para o controlo da colonização de bactérias Gram-positivas na pele e noutras superfícies sólidas, incluindo dispositivos médicos tais como cateteres. 43 5.6 Métodos de diagnóstico A presente invenção também abrange métodos de diagnóstico para a determinação do agente causador numa infecção bacteriana. Numa implementação, o método compreende a cultura de bactérias isoladas de uma infecção bacteriana e a medição da susceptibilidade aos polipéptidos antimicrobianos da presente invenção, em que susceptibilidade ao polipéptido indica a presença de certas bactérias Gram-positivas e a perda de susceptibilidade indica a presença de baterias não receptivas (por exemplo, bactérias Gram-negativas não receptivas ou bactérias Gram-positivas não receptivas). As bactérias podem ser recolhidas de pus, urina, exsudados de uma ferida, secreções vaginais, ou qualquer outro fluido corporal infectado com as bactérias. 5.7 Variantes de aminoácidos A invenção também abrange variantes dos polipéptidos de lisina, ou seus fragmentos ou derivados activos, isolados do bacteriófago 168. Em certas implementações, a invenção abrange uma sequência de aminoácidos variante de SEQ ID NO: 7, ou um seu fragmento ou derivado activo. As sequências de aminoácidos variantes dos polipéptidos da invenção podem ser criadas de tal modo que são variantes de substituição, inserção ou deleção. As variantes de deleção não têm um ou mais residuos da proteína nativa que não são essenciais para a função (por exemplo, actividade antimicrobiana e/ou de direccionamento). Os mutantes de inserção envolvem tipicamente a adição de material num local não terminal no polipéptido. Os variantes por substituição contêm tipicamente a permuta de uma aminoácido por outro num ou mais locais da proteína, e podem ser desenhados para modular uma ou mais propriedades do polipéptido, tais como a estabilidade contra clivagem proteolítica, sem a perda de 44 outras funções ou propriedades. As substituições deste tipo são preferentemente conservativas, ou seja, um aminoácido é substituído por um de estrutura e carga semelhantes. As substituições conservativas são bem conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, as substituições de: alanina para serina; arginina para lisina; asparagina para glutamina ou histidina; aspartato para glutamato; cisteína para serina; glutamina para asparagina; glutamato para aspartato; glicina para prolina; histidina para asparagina ou glutamina; isoleucina para leucina ou valina; leucina para valina ou isoleucina; lisina para arginina; metionina para leucina ou isoleucina; fenilalanina para tirosina, leucina ou metionina; serina para treonina; treonina para serina; triptofano para tirosina; tirosina para triptofano ou fenilalanina; e valina para isoleucina ou leucina.

Uma vez identificadas áreas gerais do gene como codificantes para a proteína lisina particular, ou fragmento activo, tal como aqui descrito, pode-se utilizar mutagénese pontual para identificar quais resíduos de aminoácidos particulares são importantes nas actividades antibióticas. Assim, um perito na técnica será capaz de gerar alterações de uma única base na cadeia de ADN para resultar num codão alterado e uma mutação do tipo "missense".

Preferentemente, a mutação dos aminoácidos de uma proteína cria uma molécula de segunda geração equivalente, ou mesmo melhorada. Por exemplo, certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos numa estrutura proteica sem perda detectável de função (por exemplo, actividade antibiótica e/ou de direccionamento). Na realização de tais alterações, o índice hidropático dos aminoácidos pode ser considerado. A importância do índice hidropático do 45 aminoácido em conferir função biológica interactiva na proteína é geralmente percebida na técnica. Aceita-se que o carácter hidropático relativo do aminoácido contribui para a estrutura secundária da proteína resultante, o que por seu lado define a interacção da proteína com outras moléculas, por exemplo, a interacção com um peptidoglicano no interior da cobertura exterior de uma bactéria Gram-positiva. A cada aminoácido foi atribuído um índice hidropático na base das suas características de hidrofobicidade e carga; por exemplo: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (—3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); e arginina (-4.5). É também entendido na técnica que a substituição de aminoácidos semelhantes pode ser realizada eficazmente na base da hidrofilicidade. Tal como hidrofobicidade, foram atribuídos valores de hidrofilicidade a cada aminoácido: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 + 1); glutamato (+3,0 + 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 + 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (- 1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (—1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); e triptofano (-3,4). Podem ser obtidas moléculas equivalentes por substituição de um aminoácido por outro em que os sues índices de hidrofilicidade estão entre + 2, preferentemente + 1, ou mais preferentemente + 0,5 um do outro. 5.8 Construções quiméricas A invenção também abrange polipéptidos quiméricos que compreendem uma sequência correspondente a um domínio 46 catalítico de uma primeira endolisina de bacteriófago enterocócico e uma sequência correspondente a um domínio catalítico de uma segunda endolisina de bacteriófago enterocócico. Os domínios catalíticos podem ser um domínio amidase, preferentemente um domínio amidase-2, e/ou um domínio CHAP, por exemplo um domínio amidase-2 de uma lisina fundida com o domínio CHAP de uma lisina heteróloga.

Em implementações preferidas, o polipéptido quimérico apresenta desempenho lítico acrescido relativamente a bactérias Enterococcus em comparação com a referida primeira e/ou a referida segunda lisina de fago. "Desempenho lítico acrescido" pode referir-se a um espectro de actividade mais alargado, por exemplo, contra um número alargado ou um grupo mais diversificado de espécies de Enterococcus, de estirpes E. faecalis, de estirpes E. faecium, e/ou de outras bactérias Gram-positivas. "Desempenho lítico acrescido" pode também referir-se a uma capacidade acrescida de matar e/ou inibir o crescimento ou a reprodução de um microrganismo, em particular bactérias Enterococcus. 0 polipéptido quimérico pode ser construído utilizando lisinas do mesmo bacteriófago ou de bacteriófagos diferentes. Quando as lisinas provêm de bacteriófagos diferentes, os diferentes bacteriófagos podem ter hospedeiros bacterianos que são da mesma espécie ou de espécies diferentes, ou os diferentes bacteriófagos podem ter hospedeiros bacterianos que são da mesma estirpe bacteriana ou de estirpes bacterianas diferentes. Nalgumas implementações, os polipéptidos quiméricos derivados do bacteriófago F 168/08, polipéptidos quiméricos esses que apresentam actividade antibiótica contra uma bactéria Gram-positiva, por exemplo, contra uma espécie Enterococcus, tal 47 como E. faecalis. 0 polipéptido quimérico pode ser derivado de uma lisina isolada do fago 168, ou um seu fragmento ou variante, que é fundido de forma recombinante a uma lisina heteróloga. Numa implementação particular, a invenção refere-se a polipéptidos quiméricos em que pelo menos um domínio de uma lisina isolada do fago 168, ou seu fragmento ou variante, é combinada com pelo menos um domínio de uma lisina heteróloga, ou um seu fragmento ou variante. Construções quiméricas preferíveis incluem a combinação de um domínio catalítico de uma lisina isolada do fago 168, tal como um domínio catalítico de Lysl68, com um domínio catalítico de uma lisina isolada do fago 170, que tem actividade antimicrobiana ou antibiótica contra E. faecalis, tal como um domínio catalítico de Lysl70. Ainda mais preferentemente, a lisina quimérica compreende um domínio CHAP de Lysl68 fundido de forma recombinante a uma amidase ou um domínio amidase-2 de Lysl70.

Nalgumas implementações específicas, os polipéptidos quiméricos da invenção compreendem domínios catalíticos de lisinas de bacteriófagos com hospedeiros de diferentes estirpes de E. faecalis, tais como de E. faecalis 926/05 e E. faecalis 1518/05. Em implementações particularmente preferidas, um domínio catalítico de endolisina é originário do bacteriófago F 170/08 e o outro do bacteriófago F 168/08. Em implementações ainda mais particularmente preferidas, uma endolisina é Lysl70, correspondendo a SEQ ID NO: 1; e/ou uma endolisina é Lysl68 correspondendo a SEQ ID NO: 3. Noutras implementações, o polipéptido quimérico compreende um domínio catalítico de uma endolisina com uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou superior relativamente a SEQ ID NO: 1, polipéptido esse que apresenta actividade 48 antibiótica e/ou de direccionamento contra Enterococcus sp., particularmente, E. faecalis e/ou E. faecium; e/ou um domínio catalítico de uma ensolisina com uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou superior relativamente a SEQ ID NO: 3, polipéptido esse que apresenta actividade antibiótica e/ou de direccionamento contra Enterococcus sp., particularmente, E. faecalis e/ou E. faecium.

Em certas implementações específicas, o polipéptido quimérico compreende um domínio catalítico compreendendo SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento com actividade antimicrobiana contra Enterococcus sp., particularmente, E. faecalis e/ou E. faecium. Noutras implementações, o domínio catalítico tem uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou superior relativamente a SEQ ID NO: 5, ou a um seu fragmento, e apresenta actividade antibiótica e/ou de direccionamento contra Enterococcus sp., particularmente, E. faecalis e/ou E. faecium. Em certas implementações específicas, o polipéptido quimérico compreende um domínio catalítico compreendendo SEQ ID NO: 7, ou um seu fragmento, com actividade antimicrobiana contra Enterococcus sp., particularmente, E. faecalis e/ou E. faecium. Noutras implementações, o domínio catalítico tem uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou superior relativamente a SEQ ID NO: 7, ou a um seu fragmento, e apresenta actividade antibiótica e/ou de direccionamento contra Enterococcus sp., particularmente, E. faecalis e/ou E. faecium. 49

Em certas implementações, o polipéptido quimérico compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9, ou um seu fragmento com actividade antimicrobiana ou antibiótica contra pelo menos uma espécie de Enterococcus, por exemplo, E. faecalis. Noutras implementações, o polipéptido quimérico compreende um fragmento, variante ou derivado de SEQ ID NO: 9, em que o fragmento, variante ou derivado tem actividade antibiótica ou antimicrobiana contra uma bactéria Gram-negativa, por exemplo Enterococcus sp.r particularmente, E. faecalis e/ou E. faecium. As variantes de sequência de aminoácido dos polipéptidos quiméricos da presente invenção podem ser criadas tal como descrito acima relativamente a polipéptidos isolados da invenção, por exemplo, por substituições, inserções, deleções, e semelhantes, preferentemente para gerar moléculas adicionalmente melhoradas de segunda (ou terceira ou mais) geração. Em certas implementações, o polipéptido quimérico compreende uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou superior relativamente a SEQ ID NO: 9, ou a um seu fragmento, e apresenta actividade antibiótica e/ou de direccionamento contra Enterococcus sp., particularmente, E. faecalis e/ou E. faecium. Em implementações particularmente preferidas, os polipéptidos quiméricos e suas variantes, derivados, e/ou fragmentos, apresentam propriedades melhoradas, por exemplo, relativamente a solubilidade, rendimento, estabilidade e/ou desempenho litico acrescidos, tal como incluindo um espectro litico mais alargado relativamente à espécie Enterococcus e/ou a outras bactérias Gram-positivas, em comparação com os polipéptidos isolados nativos. 5.9 Terapia combinatorial 50 A presente invenção proporciona ainda composições compreendendo um ou mais polipéptidos da invenção e um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos diferentes, e métodos para o tratamento da infecção bacteriana num indivíduo que dele necessite (por exemplo, prevenção, tratamento, atrasar o aparecimento de, retardar a progressão de, ou melhorando um ou mais sintomas associados com uma infecção por bactérias Gram-positivas) compreendendo a administração ao referido indivíduo de um ou mais das referidas composições. Os agentes terapêuticos ou profiláticos incluem, mas não se limitam a, péptidos, polipéptidos, proteínas de fusão, moléculas de ácidos nucleicos, moléculas pequenas, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgânicas e moléculas orgânicas. Qualquer agente que se saiba ser útil, ou que tenha sido utilizado, ou que esteja em uso para a prevenção ou tratamento de infecção por uma bactéria Gram-positiva, ou para a prevenção, tratamento ou melhoria de um ou mais sintomas associados com uma infecção por uma bactéria Gram-positiva, pode ser utilizado em combinação com o polipéptido antibiótico ou antimicrobiano de acordo com a invenção aqui descrita.

Em certas implementações, "em combinação" refere-se à utilização de uma proteína de fusão ou polipéptido quimérico, em que um polipéptido isolado da invenção é ligado de forma covalente ou não covalente a outro polipéptido, tal como descrito acima. Proteínas de fusão preferidas incluem polipéptidos quiméricos de Lysl68 com uma ou mais lisinas, tais como Lysl70 ou outra lisina de fago de Enterococcus. Por exemplo, numa implementação específica, a combinação de um domínio CHAP de Lysl68 com um domínio amidase-2 de Lysl70 produz Lysl70-168. Algumas destas construções quiméricas permitem um acréscimo do 51 desempenho lítico com comparação com o Lysl68 nativo e/ou o Lysl70 nativo, por exemplo, apresentando um espectro litico alargado de actividade relativamente a bactérias Gram-positivas, em particular da espécie Enterococcus, tal como E- faecalis e/ou relativamente a outra bactéria Gram-positiva. 5.10 Polinucleótidos que codificam para polipéptidos A invenção proporciona polinucleótidos que compreendem uma sequência nucleotidica que codifica para um polipéptido da invenção. A invenção também abrange polinucleótidos que hibridam sob condições de hibridação de elevada, intermédia ou baixa restringência, a polinucleótidos que codificam para um polipéptido da invenção. "Condições de elevada restringência" podem incluir, mas não se limitam a, aquelas que (1) utilizam uma baixa força iónica e elevada temperatura para lavagem, por exemplo, 0,015 M de cloreto de sódio/0,0015 M de citrato de sódio/0,1% de dodecil sulfato de sódio a 50°C; (2) empregam, durante a hibridação, um agente desnaturante, tal como formamida, por exemplo, 50% (v/v) de formamida com 0,1% de albumina de soro bovina/0,1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirrolidona/50 nM de tampão fosfato de sódio a pH 6,5 com 750 mM de cloreto de sódio, 75 mM de citrato de sódio a 42°C; ou (3) empregam 50% de formamida, 5x SSC (0,75 M de NaCl, 0,075 M de citrato de sódio), 50 mM de fosfato de sódio (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sódio, 5x solução de Denhardt, ADN de esperma de salmão sonicado (50 pg/mL), 0,1% de SDS, e 10% de sulfato de dextrano a 10% a 42°C, com lavagens a 42°C em 0,2xSSC (cloreto de sódio/citrato de sódio) e 50% de formamida a 55°C, seguido de uma lavagem de elevada restringência consistindo em 0,lxSSC contendo EDTA a 55°C. "Condições moderadamente restringentes" são descritas por, mas não se limitam a, aquelas em Sambrook et al., Molecular 52

Cloning: A Laboratory Manual. 2a Ed., Nova Iorque: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluem a utilização de uma solução de lavagem e condições de hibridação (por exemplo, temperatura, força iónica e %SDS) menos restringentes do que aquelas descritas acima. Um exemplo de condições moderadamente restringentes é a incubação durante a noite a 37°C numa solução compreendendo: 20% de formamida, 5xSSC (150 mM de NaCl, 15 mM de citrato trissódico) , 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,6), 5x solução de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano, e 20 mg/mL de ADN de esperma de salmão cisalhado seguido de lavagem dos filtros em lxSSC a cerca de 37-50°C.

Os polinucleótidos podem ser obtidos, e a sequência nucleotidica dos polinucleótidos determinada, através de qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, u polinucleótido que codifica para um polipéptido da invenção pode ser gerado a partir de ácido nucleico a partir de uma fonte adequada, por exemplo, bacteriófago 168, tal como descrito nos Exemplos abaixo. Se uma fonte contendo um ácido nucleico que codifica para um polipéptido particular não estiver disponível, mas a sequência de aminoácido do polipéptido da invenção for conhecida, o ácido nucleico que codifica para o polipéptido pode ser sintetizado quimicamente e clonado em vectores de clonagem replicáveis utilizando métodos bem conhecidos na técnica.

Uma vez determinada a sequência de nucleótidos do polinucleótido da invenção, a sequência de nucleótidos pode ser manipulada utilizando métodos bem conhecidos na técnica para a manipulação de sequências de nucleótidos, por exemplo, técnicas de ADN recombinante, mutagénese dirigida, PCR, etc. (ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory 53

Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY e Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, ambas as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade), para gerar polipéptidos com sequências de aminoácidos diferentes, por exemplo, para criar variantes, fragmentos e/ou derivados do polipéptido, com, por exemplo, substituições, deleções, e/ou inserções de aminoácidos.

Polinucleótidos quiméricos da invenção abrangem sequências de nucleótidos que codificam para um polipéptido quimérico da invenção, tais como polipéptidos quiméricos compreendendo um domínio catalítico de uma lisina isolada do fago 168 fundida a um domínio catalítico de uma lisina isolada a partir de uma lisina heteróloga, preferentemente uma lisina heteróloga de fago, tal como um domínio catalítico de uma lisina do fago 170. A invenção também abrange polinucleótidos que hibridam sob condições de hibridação de elevada, intermédia ou baixa restringência, por exemplo, tal como definido acima, até polinucleótidos quiméricos que codificam para um polipéptido quimérico da invenção.

Os polipéptidos quiméricos podem ser obtidos a partir de técnicas recombinantes, tais como bem conhecidas e praticadas rotineiramente na técnica. Polinucleótidos quiméricos recombinantes são tipicamente criados através da junção de dois ou mais genes, ou suas porções, que originalmente codificavam para proteínas separadas. As sequências individuais tipicamente correspondem a sequências que codificam para um domínio funcional de cada uma das respectivas proteínas, de tal modo que o polipéptido quimérico codifica para uma proteína de fusão que tem uma funcionalidade dual. Para lisinas quiméricas, 54 os domínios funcionais podem corresponder a domínios catalíticos modulares, tais como domínios com actividade lítica, incluindo, por exemplo, actividade de amidase, e as sequências que codificam para os diferentes domínios catalíticos fundidos um com o outro.

Por exemplo, a primeira sequência codificante, ou sua porção, pode ser juntada em adicionada na grelha de leitura a uma segunda sequência codificante, ou sua porção, o que tipicamente se consegue através de ligação ou por "overlap extension PCR". A ligação é utilizada com o método convencional de criação de genes quiméricos, denominado o "método de mutagénese com cassetes". Neste método, o ADN pode ser cortado em fragmentos específicos através de endonucleases de restrição que actuam em locais de reconhecimento de endonucleases de restrição, e os fragmentos específicos podem então ser ligados. Um fragmento particular pode ser substituído por um heterólogo com extremidades compatíveis de modo a ligá-lo no ADN parental. Ver, por exemplo, Wells et al., Gene 34: 315-23 (1985), aqui incorporado por referência na sua totalidade.

Alternativamente, podem ser utilizadas várias abordagens envolvendo PCR, tais como o método de "overlap extension PCR". Ver, por exemplo, Ho, S.N., et al (1989). Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase Chain reaction. Gene. 77: 51-59, aqui incorporado por referência na sua totalidade. São conhecidas várias variações a esta abordagem de PCR e foram utilizadas para gerar quimeras. Uma destas abordagens, por exemplo, envolve um método modificado de "overlap extension PCR" para criar genes quiméricos na ausência de enzimas de restrição em três passos: (i) um passo de PCR convencional, utilizando oligonucleótidos iniciadores parcialmente 55 complementares nas sua extremidades 5' aos fragmentos adjacentes que se pretendem fundir para criar a molécula quimérica; (ii) um segundo passo de PCR em que os fragmentos de PCR gerados no primeiro passo são fundidos utilizando as extremidades complementares dos oligonucleótidos iniciadores; e (ii i) um terceiro passo envolvendo amplificação por PCR do produto de fusão. 0 produto de PCR final é um gene quimérico construídos com os diferentes fragmentos de PCR amplificados. Ver, por exemplo, Wurch, T. et al (1998) . A modified overlap extension PCR method to create chimeric genes in the absence of restriction enzymes. Biotechnology Techniques. 12(9): 653-657, aqui incorporado por referência na sua totalidade. Quaisquer abordagens recombinantes de ligação e/ou baseadas em PCR podem ser utilizadas para criar os polinucleótidos quiméricos da presente invenção.

Alternativamente, um ácido nucleico que codifique para o polipéptido quimérico pode ser sintetizado quimicamente. Por exemplo, utilizando a sequência de aminoácidos desejada do polipéptido quimérico da invenção, a sequência nucleotídica correspondente pode ser desenhada, sintetizada quimicamente, e clonada em vectores de clonagem replicáveis utilizando, por exemplo, métodos bem conhecidos na técnica. Os Exemplos abaixo proporcionam detalhes adicionais para a criação do polinucleótido quimérico, SEQ ID NO: 10, que codifica para um polipéptido quimérico da invenção. 5.11 Expressão recomblnante de moléculas da invenção

Uma vez obtida uma sequência de ácido nucleico que codifica para uma molécula da invenção (por exemplo, um polipéptido de origem bacteriofágica, ou um seu derivado funcional, construção quimérica, variante, ou fragmento), o vector para a produção das moléculas pode ser produzido por 56 tecnologia de ADN recombinante, utilizando técnicas bem conhecidas na técnica. Métodos que são bem conhecidos pelos peritos na técnica podem ser usados para construir vectores de expressão contendo as sequências que codificam para as moléculas da invenção e sinais de controlo da transcrição e da tradução apropriados. Estes métodos incluem, por exemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, e recombinação genética in vivo (ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; e Ausubel et al. eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY).

Um vector de expressão compreendendo a sequência nucleotidica de uma molécula identificada pelos métodos da invenção pode ser transferido para uma célula hospedeira através de técnicas convencionais (por exemplo, electroporação, transfecção lipossomal, e precipitação com fosfato de cálcio) e as células transfectadas seguidamente cultivadas por técnicas convencionais para produzir as moléculas da invenção. Os exemplos abaixo proporcionam detalhes adicionais para a produção de polipéptidos quiméricos de acordo com SEQ ID NO: 9a partir de polinucleótidos quiméricos que os codificam, após transfecção dos vectores compreendendo SEQ ID NO: 10 para células competentes para expressão.

As células hospedeiras utilizadas para expressar as moléculas identificadas pelos métodos da invenção podem ser ou células bacterianas (não susceptiveis à proteína lisina, à construção de lisina, ou ao seu fragmento da invenção) tais como Escherichia coli nalgumas implementações. Pode ser utilizada uma variedade de sistemas hospedeiro-vector 57 de expressão para expressar moléculas da invenção. Tais sistemas hospedeiro-vector de expressão representam veículos através dos quais as sequências que codificam para as moléculas da invenção podem ser expressas e subsequentemente purificadas; e também representam células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as sequências nucleotídicas codificantes adequadas, expressar as moléculas da invenção in situ. Estas incluem, mas não se limitam a, microrganismos tais como bactérias que não são susceptíveis à proteína lisina, construção de lisina, ou fragmento da invenção (por exemplo, E. coli e B. subtilis nalgumas implementações) transformadas com vectores de expressão de ADN de bacteriófago, ADN plasmídico, ou ADN cosmídico recombinantes contendo sequências codificantes para as moléculas abrangidas pela invenção; leveduras (por exemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas com vectores de expressão de levedura recombinantes contendo sequências codificantes para as moléculas abrangidas pela invenção; sistemas de células de insecto infectados com vectores de expressão virais recombinantes (por exemplo, baculovírus) contendo sequências codificantes para as moléculas abrangidas pela invenção; sistemas de células de plantas infectadas com vectores de expressão virais recombinantes (por exemplo, o vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) e o vírus do mosaico do tabaco (TMV)) ou transformadas com vectores de expressão plasmídicos recombinantes (por exemplo, plasmídeo Ti) contendo sequências que codificam para moléculas abrangidas pela invenção; ou sistemas de células de mamífero (por exemplo, COS, CHO, BHK, células 293, 293T, 3T3, células linfocíticas (ver U.S. 5,807,715), células Per C.6 (células da retina humana desenvolvidas pela Crucell) que contêm construções de expressão recombinantes contendo sequências que codificam para moléculas abrangidas pela invenção ligadas de forma 58 funcional a promotores, por exemplo, promotores derivados do genoma de células de mamíferos (por exemplo, promotor da metalotioneina) ou de virus de mamíferos (por exemplo, o promotor tardio do adenovirus; o promotor 7.5K do virus vaccinia).

Em sistemas bacterianos não susceptiveis à proteína lisina, construção de lisina, ou fragmento da invenção, podem ser seleccionados com vantagem diversos vectores de expressão dependendo da utilização pretendida para a molécula a ser expressa. Por exemplo, quando se pretende produzir uma grande quantidade de tal proteína, por exemplo, para gerar composições farmacêuticas de um polipéptido, podem ser desejáveis vectores que permitem a expressão de elevados níveis de proteína de fusão e que são facilmente purificados. Tais vectores incluem, mas não se limitam a, o vector de expressão de E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2: 1791, aqui incorporado por referência na sua totalidade), no qual a sequência codificante pode ser ligada individualmente num vector na grelha de leitura com uma região codificante LacZ de modo que seja produzida uma proteína de fusão; vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509; sendo cada um dos quais aqui incorporado por referência na sua totalidade); e semelhantes. Os vectores pGEX também podem ser utilizados para expressar polipéptidos estranhos na forma de proteínas de fusão com a glutationa S-transferase (GST). Em geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas a partir de células lisadas por adsorção e ligação a uma matriz de esferas de agarose-glutationa, seguidas de eluição na presença de glutationa livre. Os vectores pGEX são desenhados de forma a incluir locais de clivagem de trombina ou protease factor Xa, de modo que o 59 produto expresso possa ser libertado da porção GST. Os Exemplos abaixo proporcionam detalhes adicionais para a produção de polipéptidos quiméricos de acordo com SEQ ID NO: 9 a partir de polinucleótidos quiméricos que os codificam, utilizando E. coli BL21 como sistema de expressão.

Num sistema de insecto, pode-se utilizar o virus da poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector para expressar genes estranhos. 0 virus cresce em células de Spodoptera frugiperda. A sequência codificante do polipéptido pode ser clonada individualmente em regiões não essenciais (por exemplo, o gene da poliedrina) do virus e colocado sob o controlo de um promotor AcNPV (por exemplo o promotor da poliedrina).

Em células hospedeiras de mamífero, podem ser utilizados diversos sistemas de expressão virais. Em casos em que se utiliza um adenovírus como vector de expressão, a sequência que codifica para o polipéptido pode ser ligada a um complexo de controlo de transcrição/tradução adenoviral, por exemplo o promotor tardio e a sequência líder tripartida. Este gene quimérico, por exemplo, pode então ser inserido no genoma adenoviral por recombinação in vitro ou in vivo. A inserção numa região não essencial do genoma virai (por exemplo, região EI ou E3) resultará num vírus recombinante que é visível e capaz de expressar a molécula polipeptídica inserida em hospedeiros infectados (por exemplo, ver Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 355-359, aqui incorporado por referência na sua totalidade). Podem ser também necessários sinais de iniciação específicos para a tradução eficiente das sequências codificantes inseridas. Estes sinais incluem o codão de iniciação ATG e sequências adjacentes. Além disso, 60 o codão de iniciação pode estar em fase com a grelha de leitura aberta da sequência de codificação desejada para assegurar a tradução da totalidade da inserção. Estes sinais de controlo da tradução e/ou codões de iniciação podem ter uma diversidade de origens, tanto natural como sintética, incluindo fontes exógenas. A eficiência da expressão pode ser aumentada através da inclusão de elementos "enhancer" da transcrição, terminadores da transcrição, etc. (ver, Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544, aqui incorporados por referência na sua totalidade).

Para a produção de proteínas recombinantes em períodos prolongados, com elevado rendimento, prefere-se uma expressão estável. Por exemplo, podem ser desenvolvidas linhas celulares que expressam de forma estável um polipéptido da invenção. Em vez de se utilizar vectores de expressão que contêm origens de replicação virais, as células hospedeiras podem ser transformadas com ADN controlado por elementos de controlo de expressão apropriados (por exemplo, sequências promotoras, sequências "enhancer", terminadores da transcrição, locais de poliadenilação, etc.), e um marcador de selecção. Após a introdução do ADN estranho, as células modificadas podem ser deixadas crescer durante 1-2 dias num meio enriquecido, e depois trocadas para um meio selectivo. O marcador de selecção no plasmídeo recombinante confere resistência à selecção e permite às células integrar de forma estável o plasmídeo nos seus cromossomas e crescer de modo a formar focos que por sue turno podem ser clonados e expandidos em linhas celulares. Este método pode ser utilizado com vantagem para modificar linhas celulares que expressam os polipéptidos da invenção. Tais linhas celulares modificadas podem ser particularmente úteis no rastreio e avaliação de 61 espécies bacterianas susceptíveis aos polipéptidos da invenção.

Podem ser utilizados vários sistemas de selecção, incluindo mas sem limitação, os genes da timidina cinase do virus do herpes simplex (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), da fosforribosiltransferase da hipoxantina-guanidina (Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 48: 202), e da fosforribosiltransferase da adenina (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817), que podem ser utilizados, respectivamente, em células tk-, hgprt- ou aprt-. Além disso, pode ser utilizada resistência anti-metabolito como a base de selecção para os seguintes genes: dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:357; 0'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 1527); gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:2072); neo, que confere resistência ao aminoglicósido G-418 (Clinicai Pharmacy 12: 488-505; Wu e Wu, 1991, 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann.

Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; e Morgan e Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; Maio, 1993, TIBTECH 11(5): 155-215); e hygro, que confere resistência ao higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147). São descritos métodos comummente conhecidos na técnica de tecnologia de ADN recombinante que podem ser utilizados para aplicação de tais sistemas de selecção, por exemplo, em Ausubel et al. (eds.), 1993,

Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A

Laboratory Manual, Stockton Press, NY; e nos Capítulos 12 e 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY.; Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1. 62

Os níveis de expressão de um polipéptido da invenção podem ser aumentados por amplificação do vector (para uma revisão, ver Bebbington e Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3, Academic Press, Nova Iorque, 1987). Brevemente, quando um marcador no sistema de vector que expressa um polipéptido de interesse é amplificável, o aumento do nível do inibidor presente na cultura de célula hospedeira pode aumentar o número de cópias do gene marcador. Uma vez que a região amplificada está associada com a sequência nucleotídica que codifica para o polipéptido de interesse, a produção do polipéptido também aumentará (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 257).

Uma vez tenha sido expresso de forma recombinante um polipéptido da invenção, pode ser purificado por qualquer método na técnica para purificação de polipéptidos, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, cromatografia em coluna de permuta iónica, afinidade, e/ou exclusão molecular), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra técnica convenciona para a purificação de polipéptidos ou anticorpos. Os Exemplos abaixo proporcionam detalhes adicionais para a purificação de lisinas isoladas Lysl70 (SEQ ID NO: 1) e Lysl68 (SEQ ID NO: 3), assim como a construção da lisina quimérica Lysl70-168 (SEQ ID NO: 9) após a sua respectiva expressão em células de E. coli BL21.

Os exemplos seguintes ilustram mas não limitam a invenção. Assim, os exemplos são apresentados com a compreensão que podem ser realizadas modificações e permanecer no espírito e âmbito da invenção. 63 6. Exemplos

Este trabalho teve como objectivo o estudo da actividade lítica de duas lisinas de fagos F 168/08 e F 170/08, respectivamente, ambos os quais infectam Enterococcus sp., assim como uma lisina quimérica construída a partir de um domínio catalítico de cada uma destas duas lisinas. 6.1. Exemplo 1: Isolamento de Bacteriófagos 169 e 170

Isolou-se o bacteriófago 168 de E. faecalis 926/05; isolou-se o bacteriófago 170 de E. faecalis 1518/05. O ADN genómico pode ser isolado a partir de uma reserva de fago 168 e de uma reserva de fago 170, cada uma obtida de um isolado clínico de E. faecalis, e o ADN genómico dos fagos pode ser extraído, clonado e sequenciado de acordo com os seguintes protocolos.

Purificação dos fagos 168 e 170 A preparação do fago 168 de reserva e do fago 170 de reserva pode ser levada a cabo utilizando os protocolos descritos em Carlson K., 2005, "Working with bacteriophages: common techniques and methodological approaches," em Kutter, E. Sulakvelidze, A. (eds.)

Bacteriophages: Biology and Applications, 5th ed. CRC Press ("Carlson"; aqui incorporado por referência na sua totalidade). O fago 168 de reserva e d fago 170 de reserva podem cada um ser concentrado por precipitação com PEG de acordo com o protocolo descrito em Yamamato et al., 2004, PNAS 101: 6415-6420 (aqui incorporado por referência na sua totalidade) e em Carlson.

As reservas do fago 168 e do fago 170 pode ser incubada em NaCl a 1 M durante uma hora a 4°C com agitação. Depois, pode-se adicionar gradualmente PEG 8000 (Applichem, Cheshire, MA) até se atingir uma concentração final de 10% 64 (ρ/ν). As composições podem então ser cada uma incubada durante a noite a 4°C. Após o período de incubação, cada composição pode ser centrifugada a 10000 x g durante 30 minutos a 4°C. Os sedimentos podem então se ressuspendidos em SM (0,05 M Tirs-HCl a pH 7m4, 0,1 M NaCl, 10 mM MgS04 e gelatina a 1% p/v) e de novo centrifugados a 1000 rpm a 4°C durante 10 minutos. O sobrenadante contendo cada fago em suspensão pode ser guardado para purificação suplementar. A purificação dos fagos 168 e 170 pode ser conseguida utilizando um gradiente de CsCl como descrito por Carlson. A remoção de CsCl de cada uma das reservas de fago pode ser conseguida através de diálise. Uma membrana de diálise Cellu.Sep Hl High Grade Regenerated Cellulose Tubular Membrane (Cellu.Sep, River Street, USA) pode ser preparada de acordo com as instruções do fabricante. A diálise pode consistir numa primeira incubação de 30 minutos em Tris-HCl a 100 mM e NaCl a 3 M (pH 7,4) a 4°C. Pode seguir-se uma segunda incubação de 30 minutos em Tris-HCl a 100 mM e NaCl a 3 M (pH 7,4) a 4°C. Após a diálise, cada um dos fagos suspendidos pode ser removido do interior do saco de diálise e armazenado a 4°C.

Extracção do ADN de fago O ADN de fago 168 e de fago 170 pode obtido a partir de, respectivamente, cada reserva de fago, purificado em CsCl. A 5 ml de cada fago purificado, pode-se adicionar EDTA a 20 mM a pH 8,0, SDS a 0,5% (p/v) e Proteinase K a uma concentração final de 40 pg/mL. Cada mistura pode então ser incubada a 56°C durante uma hora. Isto pode ser seguido por extracções sucessivas em fenol:clorofórmil:álcool numa proporção de 25:24:1, até a interface entre as fases aquosa e orgânica se torne translúcida. Cada fase aquosa pode então ser tratada com um volume igual de clorofórmio e 65 centrifugada a 13000 x f durante 10 minutos a 4°C. Cada fase aquosa pode ser de novo removida e o ADN precipitado através da adição de dois volumes de etanol absoluto e incubando durante trinta minutos a 20°C. As amostras podem então ser centrifugadas a 11000 x g durante 30 minutos a 4°C. Os sedimentos podem então ser lavados com etanol a 7'% à temperatura ambiente e ressuspendidos em 50 pL de água ultra-pura (Gibco, Califórnia). A concentração de ADN para cada fago pode então ser determinada através da medição da absorvância a 260 nm num espectrofotómetro ND-1000. A integridade de cada ADN de fago isolado pode então ser analisada por electroforese num gel de agarose a 1%. O ADN de cada um dos fagos 168 e 170 pode ser sequenciado, e depois identificadas as grelhas de leitura aberta (ORFs) que codificam para as sequências de aminoácidos, utilizando as ferramentas descritas na secção de Análise Bioinformática. Além disso, a homologia do ADN dos fagos 168 e 170 pode ser comparada com sequências existentes utilizando o programa FASTA3.

Análise Bioinformática A análise do ADN alvo e das sequências de aminoácidos pode ser levada a cabo utilizando ExPASy (Expert Protein Analysis System) do Swiss Institute of Bioinformatics. Análise adicional pode também ser levada a cabo utilizando os programas Translate Tool, Prosite, e ProtPram. A homologia das sequências de aminoácidos alvo com sequências na base de dados UniProt Knowledgebase pode ser levada a cabo através da utilização de FASTA3. Os alinhamentos de sequências podem ser levados a cabo através da utilização de ClustalW. Ambos os programas podem ser acedidos através da página de internet do European Molecular Biology Laboratory - European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI). 66 A determinação da estrutura secundária da sequência alvo pode ser levada a cabo utilizando o programa Foldlndex. A sequenciação de genomas de bacteriófagos pode permitir a identificação de potenciais grelhas de leitura aberta (ORF) no genoma. As ORFs putativas de bacteriófagos podem ser traduzidas nas suas sequências de aminoácidos correspondentes e as sequências de aminoácidos podem ser utilizadas para utilizar a UniProt Knowledgebase utilizando o programa FASTA3. O alinhamento com outras proteínas lisina conhecidas de outros bacteriófagos podem permitir a identificação das proteínas lisina do fago 170 e do fago 168 (respectivamente, Lysl70, SEQ ID NO: 1 e Lysl68, SEQ ID NO: 3) e das suas sequências de genes correspondentes (respectivamente, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4) . A análise das sequências de aminoácidos de Lysl70 e Lysl68 indicou, respectivamente, um domínio amidase 2 (SEQ ID NO: 5) e um domínio CHAP (SEQ ID NO: 7) , nestas proteínas e foram determinadas as sequências de genes correspondentes (respectivamente, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 8) . Esta informação foi utilizada para construir um polipéptido quimérico, de modo a avaliar a possibilidade de melhorar a actividade lítica das lisinas. A estratégia utilizada para produzir polipéptidos solúveis, os quais foram usados para testar a actividade lítica contra E. faecalis e E. faecium, assim como contra outros Enterococcus sp. e não-Enterococcus sp. 6.2 Exemplo 2: Clonagem de Lysl68 e Lysl70

Isolou-se Lysl68 do bacteriófago 168 e isolou-se Lysl70 do bacteriófago 170. As lisinas podem também ser isoladas a partir de células recombinantes que expressam as proteínas de fago a partir de plasmídeos que para elas codificam. 67

Construção de Plasmídeos

As lisinas Lysl68 (273aa) e Lysl70 (289aa) foram amplificadas utilizando oligonucleótidos iniciadores respectivamente de bacteriófagos F168 e F170; e foram clonados em vectores pIVEZ 2.3d (Roche) e pTrCHisA (Invitrogen) utilizando E. coli MRF' XLl-blue (Stratagene). Utilizou-se E. coli BL21 para expressão.

Os plasmídeos podem ser construídos através da inserção da sequência de cADN correspondente à lisina isolada do fago 168 (Lysl68), ou àquela do fago 170 (Lysl70), nos vectores seleccionados. A reacção de PCR pode ser preparada utilizando as seguintes condições: esferas puReTaq Ready-to-Go PCR Beads (Amersham Biosciences, Reino Unido), 200 ng de ADN genómico do fago 168 ou do fago 170, os oligonucleótidos iniciadores a uma concentração final de 0,4 pmol/pL e água ultra-pura até um volume final de 25 pL. Podem ser utilizadas as seguintes condições no termociclador: 1 minuto a 95°C durante 1 ciclo, 1 minuto a 95°C + 1 minuto a 57°C + 1 minuto a 72°C durante 30 ciclos, e 5 minutos a 72°C durante um ciclo.

Os vectores podem ser digeridos com enzimas de restrição, tais como BamRI, HindIII e BamRI e Xhol (Fermentas). A mistura da digestão de restrição pode ser preparada de acordo com as instruções do fabricante. Os fragmentos de ADN resultantes da digestão dos vectores assim como o ADN amplificado de Lysl68 e Lysl70 podem ser aplicados num gel de agarose a 1%. O ADN pode ser purificado do gel utilizando o High Pure PCR Product Purification Kit (Roche, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. 68 0 vector de ADN purificado e o cADN que codifica para Lysl68 e Lysl70 podem ser combinados numa razão de 1:5 moles em conjunto com 1 de ligase T4 DNA ligase (New England Biolabs, Frankfurt, Alemanha) lOx tampão de ligação (Tris-HCl a 50 mM, MgCl2 a 10 mM, DTT a 10 mM, ATP a 1 mM, pH 7,5 a 25°C) e água ultra-pura a um volume final de 20 pL. A mistura de ligação pode ser incubada durante a noite a 22°C seguida pela transformação de E. coli estirpe BL21. A transformação pode ser levada a cabo de acordo com o protocolo descrito anteriormente.

Os transformantes podem ser seleccionados através do plaqueamento em placa de Petri contendo agar LB e o respectivo marcador de selecção. As colónias dos transformantes podem então ser utilizadas para inocular meio LB contendo o marcador de selecção apropriado e incubadas durante a noite. As culturas podem então ser centrifugadas e o ADN extraído como descrito anteriormente. A inserção correcta do fragmento clonado pode ser determinada através da digestão do plasmídeo recombinante utilizando as mesmas enzimas de restrição utilizadas para construir os plasmídeos. Todos os métodos e procedimentos para clonar o fragmento Lysl68 e Lysl70 podem ser levados a cabo de acordo com protocolos convencionais. Os plasmídeos recombinantes contendo o ADN de interesse correspondendo ao ADN de Lysl68 ou Lysl70 podem ser sequenciados por Macrogen (Coreia do Sul). 6.3 Construção de Lysl70-168

Com o objectivo de construir uma endolisina com um espectro de acçâo mais alargado e sabendo que a actividade catalítica da amidase-2 representa um espectro de acção mais alargado do que várias outras classes de endolisinas, 69 foi construída uma sequência quimérica lysll0-168. Resultou da junção da sequência nucleotídica correspondendo ao domínio amidase-2 de Lysl70 com a sequência nucleotídica correspondente ao domínio CHAP (ligação) de Lysl68.

A pode ser utilizada a técnica "Overlap-Extension by Polymerase Chain Reaction" (OE-PCR). Ver, por exemplo, Ho, S.N., Hunt, H.D., Horton, R.M., Pullen, J.K., e Pease, L.R. (1989). Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene. 77: 51-59. A sequência de aminoácidos codificada e a sequência nucleotídica correspondente do gene quimérico corresponde, respectivamente, a SEQ ID NO: 9 e a SEQ ID NO: 10. 6.4 Expressão de Lysl70, Lysl68 e Lysl70-168

Foram construídos vectores de expressão, cada um expressando Lysl68, Lysl70, e a lisina quimérica Lysl70-168.

Preparação de células competentes

De modo a preparar células competentes, pode ser inoculado meio LB com E. coli competente e incubar-se durante a noite com agitação a 135 rpm a 37°C. No dia seguinte, pode-se adicionar 5 mL do meio LB a 200 mL de meio LB fresco. A cultura pode ser incubada com agitação a 37 °C até se atingir uma densidade óptica (DOêoo) de 0,7-0,8. A densidade óptica pode ser medida num espectrofotómetro UV/Vis UVA (Unicam). As células podem então ser centrifugadas durante 20 minutos a 5000 rpm a 4°C. Após remoção do sobrenadante, o sedimento pode ser ressuspendido em 10 mL de uma solução de glicerol a 10% previamente arrefecida em gelo. O volume pode então ser levado a 50 mL através da adição de mais solução de glicerol a 10% e centrifugado de novo a 5000 rpm durante 20 minutos a 4°C. Após remoção do sobrenadante, o 70 sedimento pode ser ressuspendido como descrito anteriormente e centrifugado mais uma vez. O sedimento pode ser ressuspendido na solução residual de glicerol a 10% que subsiste no tubo após decantação. As amostras podem ser separadas em aliquotas e armazenadas a -80°C.

Transformação de células competentes por electroporação

De modo a transformar as células competentes de E. coli, pode-se remover uma aliquota de células competentes da reserva a -80°C e descongelá-las a 4°C durante 10-20 minutos. Depois, pode-se adicionar 1 pL de ADN plasmídico a 25 pL de células competentes. As células em suspensão podem então ser transferidas para uma cuvete de electroporação (Electroporation Cuvettes Plus modelo No. 610, BTX, Holliston, USA) e submetidas a electroporação num sistema Gene Pulser Xcell System (Bio-Rad, Hertfordshire, Reino Unido). Os parâmetros que podem ser usados para uma cuvete de 1 mm são os seguintes: impulso eléctrico - 10 pF, Resistência - 600 Ohm e Voltagem - 1800 V. Imediatamente após a electroporação, as células podem ser ressuspendidas em 1 mL de meio LB e incubadas a 37°C durante 1 hora com agitação a 135 rpm. Depois as células podem ser centrifugadas a 13000 rpm durante 1 minuto à temperatura ambiente. As células podem ser então ressuspendidas em 50 pL de meio LB e plaqueadas numa placa de Petri contendo agar LB (50 pL/placa) e os marcadores de selecção necessários. As placas podem ser incubadas durante a noite a 37°C.

Expressão de Lysl70, Lysl68 e Lysl70-168

Cada um dos genes lysl70 e lysl68, assim como o gene quimérico lysl70-168, pode ser clonado num vector de expressão sob o controlo de um promotor induzivel. A construção pode ser utilizada para transformar E. coli BL21 71 para expressão. A bactéria transformada pode ser utilizada para inocular 5 mL de meio 2xYT contendo os marcadores de selecção apropriados. As culturas podem ser incubadas durante a noite a 37°C com agitação até se obter uma DO (600 nm) de 0,6. A expressão da lisina pode ser induzida pela adição de 1 mM a 0,5 mM de IPTG. Isto pode ser realizado aproximadamente após incubação durante 4 horas a 37°C com agitação.

Purificação de Lysl68, Lysl70 e Lysl70-168

Após terminada a incubação, a lise das células de E.coli pode ser conseguida pela adição de lisozima (Sigma-Aldrich) a uma concentração final de 0,1 mg/mL e pL de Protease

Inhibitor Cocktail Set I (Calbiochem, EUA) seguida de congelação e descongelação. A amostra pode ser exposta a cinco ciclos de congelação e descongelação. A amostra pode então ser centrifugada a 14000 x g durante 10 minutos a 4°C. Após centrifugação, o sobrenadante pode ser removido e o sedimento ressuspendido em 500 a de PBS lx.

Alternativamente, as culturas liquidas podem ser centrifugadas a 11000 rpm durante 40 minutos a 4°C. O sobrenadante pode ser removido e o sedimento ressuspendido em 5 mL de 5 ml of BugBuster Master mix com Protease Inhibitor Cocktail Set I a uma diluição de 1:1000. As células podem ser lisadas de acordo com as instruções do fabricante. As amostras podem ser centrifugadas a 4°C e 14000 x g durante 10 minutos. Após centrifugação, o sobrenadante pode ser removido e o sedimento ressuspendido em 5 mL de PBS lx. As amostras podem então ser de novo centrifugadas a 4°C e 14000 x g durante 10 minutos. O sedimento contendo Lysl68, Lysl70, ou Lysl70-168 pode ser armazenado a 4°C. As amostras podem ser analisadas e 72

Lysl68, Lysl70, ou Lysl70-168 purificados por SDS-PAGE e "Western Blot".

Purificação utilizando uma coluna Ni-NTA

Pode-se purificar Lysl68, Lysl70, ou Lysl70-168 utilizando uma coluna Ni-NTA (Qiagen). A resina Ni-NTA pode ser armazenada a 4°C antes de ser adicionada à coluna. A coluna pode então ser lavada com 50 mL de tampão de lavagem (Na2HP04 a 50 mM, NaCl a 300 mM, imidazol a 20 mM em 1 L de água destilada a pH 8,0) utilizando uma bomba peristáltica a velocidade média. Os extractos celulares preparados de acordo com os protocolos descritos anteriormente podem ser então carregados com uma bomba peristáltica regulada a baixa velocidade. A coluna pode então ser lavada com 50 mL de tampão de lavagem para remover proteínas não específicas e outras impurezas. A proteína pode então ser eluída da coluna utilizando um tampão de eluição (Na2HP04 a 50 mM, NaCl a 300 mM, imidazole a 250 mM em 1 L de água destilada a pH 8,0) e recolhido em fracções de 1,5 mL. Todas as fracções podem ser analisadas por SDS-PAGE.

Diálise de amostras purificadas por cromatografia Ni-NTA

Uma membrana Cellu.Sep Hl High Grade Regenerated Cellulose Tubular Membrane pode ser preparada de acordo com as instruções do fabricante. As amostras podem ser dialisadas contra 1000 volumes de Tris-HCl a 50 mM, pH 7,5, durante a noite a 4°C com ligeira agitação. O procedimento anterior pode ser de novo repetido até o tempo total de incubação atingir as 24 horas. Após a diálise, a lisina pode ser removida do interior da membrana e armazenada a 4°C. Uma amostra pode ser analisada por SDS-PAGE e "Western Blot" e a quantidade de proteína quantificada pelo método de Bradford. 73

Concentração

As proteínas de interesse podem ser concentradas num dispositivo Amicon Centrifugal Filter Device (Millipore, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. 0 dispositivo Amicon Centrifugal Filter Device pode também ser utilizado para realizar a troca de tampão das amostras de proteína. Neste modo, pode-se adicionar 12 mL de um tampão Tris-HCl a 100 mM a pH 7,0 em conjunto com uma amostra de Lysl68, Lysl70 ou Lysl70-168. A coluna pode então ser centrifugada durante 30 minutos a 5000 rpm a 4°C. A amostra concentrada da lisina pode ser analisada por SDS-PAGE e/ou "Western Blot" de modo a confirmar a integridade da proteína purificada. A concentração pode ser determinada utilizando um espectrofotómetro ND-1000 medindo a absorvância a 280 nm e utilizando o método de Bradford.

SDS-PAGE

Podem utilizar-se geles de poliacrilamida a 15%. O gel de resolução pode ser preparado através da adição de 6,25 mL de Protogel, 3,35 mL de Protogel Resolving Buffer (National Diagnostics, Georgia, EUA). O gel de concentração pode ser preparado utilizando 650 Protogel, 1,25 mL de Protogel Stacking Buffer (National Diagnostics), 3 mL de água destilada, 50 41 APS a 10%, e 7,5 TMED. As amostras de proteína a ser analisadas podem ser desnaturadas colocando-as num tampão de desnaturação 6x (Tris-HCl a 0,35 M a pH 6,8, DS a 10,28%, glicerol a 36%, DTT a 0,6 M e azul de bromofenol a 0,012%) e aquece-se a 100°C durante 10 minutos. O gel pode ser corrido num sistema Mini-PROTEAN Tetra Cell (Bio-Rad). Enquanto as amostras estão no gel de concentração, a voltagem pode ser mantida a 140 V. Após as amostras entrarem no gel de resolução, a voltagem pode ser aumentada a 200 V. Podem utilizar-se como marcadores de pesos moleculares Precision Plus Protein™ Standards Dual 74

Color da Bio-Rad e PageRuler™ Prestained Protein Ladder da Fermentas.

Transferência para Membrana de Nitrocelulose

De modo a visualizar as bandas de proteína no gel de SDS-PAGE, o gel pode ser imerso numa solução de coloração de Coomassie durante 1 hora à temperatura ambiente. 0 gel pode então ser transferido para um tampão de descoloração (ácido acético a 10%, metanol a 10% em 1 L de água destilada) para remover o excesso de corante. O gel pode então ser colocado em lx tampão de transferência (Tris a 48 mM, glicina a 39 mM, SDS a 0,04%, metanol a 10%, e 1L de água destilada) à temperatura ambiente. As proteínas podem ser transferidas do gel para uma membrana de nitrocelulose Hybond C (GE Healthcare, Alemanha) utilizando um dispositivo Mini Transblot Module (Bio-Rad). A transferência pode ser lavada a cabo a 200 mA durante 1 hora.

Western Blot A membrana de nitrocelulose pode ser bloqueada em PBS lx, proteína do leite 5x, Tween 20 a 0,05% à temperatura ambiente. A membrana pode então ser incubada durante 1 hora com agitação à temperatura ambiente numa solução contendo PBS lx, proteína do leite a 2%, Tween 20 a 0,05%, e anticorpo anti-His6 conjugado com peroxidase diluído 1:5000 (Roche). A membrana pode então ser lavada três vezes durante 15 minutos numa solução de PBS lx, 0,05% Tween 20 à temperatura ambiente. A proteína de interesse pode ser detectada utilizando o sistema ECL™ Plus Western Blotting Detection System (GE Healthcare) utilizando as instruções do fabricante. A membrana pode então ser exposta a Amersham Hyperfilm ECL e revelada num processador AGFA Curix 60. 75 6.5 Avaliação da actividade da lisina in vitro

Os péptidos de lisina expressos a partir dos vectores recombinantes foram testados relativamente à actividade litica in vitro em diversas estirpes bacterianas de origem clinica, tal como mostrado na Tabela I abaixo.

Tabela I

Estirpe Espécie Tipo de Amostra 1/06 Enterococcus faecalis Pus 1902/05 Enterococcus faecalis Ascites 344/06 Enterococcus faecalis Exsudado de ferida 363/06 Enterococcus faecalis Liquido pleural 46/06 Enterococcus faecalis pus peritoneal 497/06 Enterococcus faecalis Hemocultura 834/06 Enterococcus faecalis Hemocultura 838/05 Enterococcus faecalis Urina 911/05 Enterococcus faecalis Urina 953/06 Enterococcus faecalis Exsudado 1130/06 Enterococcus faecalis Exsudado 1451/05 Enterococcus faecalis Urina 1665/05 Enterococcus faecalis Pus 76

Estirpe Espécie Tipo de Amostra 1915/05 Enterococcus faecalis Urina 2092/05 Enterococcus faecalis Urina 45/06 Enterococcus faecalis Hemocultura 604/07 Enterococcus faecalis Urina 71/07 Enterococcus faecalis Urina 786/06 Enterococcus faecalis Hemocultura 993/06 Enterococcus faecalis Pus 1553/05 Enterococcus faecalis Urina 556/06 Enterococcus faecalis Urina 73/07 Enterococcus faecalis Urina 857/05 Enterococcus faecalis Urina 882/06 Enterococcus faecalis Urina 926/06 Enterococcus faecalis Urina 958/05 Enterococcus faecalis Urina 1113/06 Enterococcus faecalis Hemocultura 127/06 Enterococcus faecalis Urina 1408/05 Enterococcus faecalis Urina 77

Estirpe Espécie Tipo de Amostra 1409/05 Enterococcus faecalis Urina 1551/05 Enterococcus faecalis Urina 1554/05 Enterococcus faecalis Urina 1558/05 Enterococcus faecalis Urina 1853/05 Enterococcus faecalis Urina 2/06 Enterococcus faecalis Urina 2093/05 Enterococcus faecalis Urina 3/06 Enterococcus faecalis Urina 307/06 Enterococcus faecalis Urina 43/06 Enterococcus faecalis Urina 44/06 Enterococcus faecalis Pus 563/07 Enterococcus faecalis Hemocultura 750/06 Enterococcus faecalis Hemocultura 751/06 Enterococcus faecalis Hemocultura 81/06 Enterococcus faecalis Urina 952/06 Enterococcus faecalis Hemocultura 78

Estirpe Espécie Tipo de Amostra 954/06 Enterococcus faecalis Hemocultura 1/07 Enterococcus faecalis Urina 110/07 Enterococcus faecalis Urina 139/07 Enterococcus faecalis Urina 158/07 Enterococcus faecalis Hemocultura 310/07 Enterococcus faecalis Urina 311/07 Enterococcus faecalis Urina 328/07 Enterococcus faecalis Urina 332/07 Enterococcus faecalis Urina 514/07 Enterococcus faecalis Urina 606/07 Enterococcus faecalis Urina 1000/05 Enterococcus faecium Urina 1131/05 Enterococcus faecium Pus 1132/05 Enterococcus faecium Pus 1607/05 Enterococcus faecium Exsudado de ferida 1729/05 Enterococcus faecium Urina 1793/05 Enterococcus faecium Pus 79

Estirpe Espécie Tipo de Amostra 1795/05 Enterococcus faecium Urina 1866/05 Enterococcus faecium Urina 1903/05 Enterococcus faecium Pus 969/05 Enterococcus faecium Urina 184/06 Enterococcus faecium Pus 185/06 Enterococcus faecium Cateter 186/06 Enterococcus faecium Pus 187/06 Enterococcus faecium Pus 188/06 Enterococcus faecium Hemocultura 198/06 Enterococcus faecium Bilis 226/06 Enterococcus faecium Urina 267/06 Enterococcus faecium Exsudado anal 268/06 Enterococcus faecium Pus 269/06 Enterococcus faecium Hemocultura 388/06 Enterococcus faecium Hemocultura 389/06 Enterococcus faecium Hemocultura 80

Estirpe Espécie Tipo de Amostra 390/06 Enterococcus faecium Hemocultura 729/06 Enterococcus faecium Fluido pleural 515/07 Enterococcus faecium Exsudado vaginal 1040/06 Enterococcus sp. Urina 1041/06 Enterococcus sp. Urina 1271/06 Enterococcus sp. Urina 1285/06 Enterococcus sp. Urina 140/07 Enterococcus sp. Urina 1403/06 Enterococcus sp. Ascites 1404/06 Enterococcus sp. Urina 1405/06 Enterococcus sp. Urina 263/06 Enterococcus sp. Urina 1654/05 Enterococcus sp. Bilis 1710/05 Enterococcus sp. Cateter 264/06 Enterococcus sp. Urina 470/06 Enterococcus sp. Pus 992/06 Enterococcus sp. Urina 81

Estirpe Espécie Tipo de Amostra 1518/05 Enterococcus sp. Pus 926/05 Enterococcus sp. Hemocultura 1020/05 Staphylococcus aureus Fluido sinovial 590/07 Staphylococcus aureus (MRSA) Pus 586/07 Staphylococcus aureus (MSSA) Exsudado 5/06 Staphylococcus haemoliticus Hemocultura 546/06 Staphylococcus epidermidis Urina 1/09 Bacillus subtilis ATCC 2/09 Baclllus llchenlformls ATCC 12/08 Streptococcus grupo A Exsudado faringeal 13/08 Streptococcus grupo A Exsudado faringeal 3/09 Micrococcus luteus ATCC 44/08 Escherichia coli Urina 35/08 Escherichia coli Urina

Teste da actividade lítica A actividade litica das lisinas foi testada em células bacterianas de diferentes estirpes, incluindo as estirpes 82 hospedeiras dos fagos, através da medição da densidade óptica (DO).

Para estudar a actividade litica das endolisinas isoladas ou quiméricas, diferentes quantidades de cada uma das enzimas puras (1, 5, 1 e 0,2 pg), num volume de 5 pL, podem ser aplicadas à superfície de um meio de agar mole contendo bactérias alvo viáveis. As diferentes bactérias alvo podem ser crescidas num meio apropriado até OD60o = 0,8-1,0 e concentradas 100 vezes em meio fresco. Cem microlitros desta suspensão celular pode ser incorporada em 10 mL de agar (tampão fosfato-Na a 25 mM, pH 6,5, NaCl a 250 mM, 0,7% de agar) e vertida numa placa de Petri. Este procedimento pode garantir uma camada densa e homogénea da bactéria alvo. A actividade litica relativa obtida com as várias quantidades de enzima pode ser avaliada qualitativamente através do registo das dimensões e da transparência dos halos, após incubação durante a noite a 37°C. A actividade litica pode também ser avaliada num meio líquido (tampão fosfato-Na a 25 mM, pH 6,5, NaCl a 250 mM). As culturas de Enterococcus, por exemplo, podem ser crescidas até uma fase de crescimento exponencial (DCpoo = 0,3-0,4), recuperadas por centrifugação, e concentradas 2 vezes no meio líquido. Podem ser adicionados dez microgramas de cada enzima purificada a um mL desta suspensão celular e a lise celular pode ser monitorizada registando valores de D06oo a diferentes pontos no tempo após adição de endolisina. Um mililitro da suspensão celular adicionada a 5 pL de tampão de conservação de enzima pode servir como controlo negativo. 83

As estirpes bacterianas testadas podem ser isoladas de amostras clinicas (incluindo sangue, urina, pus, e dispositivos médicos) de diferentes hospitais e estabelecimentos clínicos Portugueses ou, no caso das estirpes Micrococcus e Bacillus, obtidos de estirpes ATCC.

Como mostra a FIG. 1, a actividade lítica das lisinas Lysl68, Lysl70-168, e Lysl70, foi testada para quatro quantidades diferentes de cada lisina em 98 estirpes clínicas de Enterococcus, incluindo E. faecalis e E. faecium. Igualmente, como mostrado em FIG. 2, testou-se a actividade de Lysl68 e Lysl70 como a percentagem de redução na turbidez de cada uma de três estirpes E. faecalis, E. faecalis 926/05, E. faecalis 1518/05, e E. faecalis 1915/05, após adição de 5 pg de cada lisina. "C-" indica um controlo negativo no qual não se adicionou lisina. Os resultados obtidos com lysl68 e Lysl70 mostram que a estirpe E. faecalis 1915/05 é muito mais sensível à actividade de Lysl69 em comparação com Lysl70 (FIG. 2) .

Como se mostra na FIG. 3, foram levados a cabo testes de viabilidade celular para cada uma das três estirpes E. faecalis, E. faecalis 926/05, E. faecalis 1518/05, e E. faecalis 1915/05, medida como UFC/mL no início (To) e no final (Tgo) do teste de redução de turbidez. A viabilidade celular foi determinada através da diluição em série e plaqueamento das mesmas suspensões celulares utilizadas no ensaio de redução de turbidez na ausência (controlo negativo, C-) e na presença de 5 pg/mL de Lysl68 e Lysl70. Este teste provou que durante o ensaio de actividade lítica, as células permaneceram viáveis. Também mostrou que tanto Lysl68 como Lysl70 apresentaram uma actividade inferior contra as estirpes hospedeiras do fago, E. faecalis 926/05 e E. faecalis 1518/05, respectivamente, em 84 comparação com resultados anteriores (FIG. 1). Além disso, Lysl68 apresentou uma actividade lítica superior do que Lysl70 contra E. faecalis 1915/05.

Os resultados globais levaram à conclusão que Lysl68, Lysl70 e Lysl70-168 apresentam actividade antibacteriana contra numerosas Enterococcus sp. Além disso, Lysl70-168 pareceu apresentar um espectro litico acrescido em comparação com as lisinas nativas. 6.6 Avaliação da actividade de lisina in vivo A actividade de lisina das lisinas Lysl68 e Lysl70 foi testada em ratos Wistar, previamente infectados com l,5xl07 células de E. faecalis 1915/05. 30 min após a administração das lisinas, a sua actividade foi medida como UFC/mL de E. faecalis 1915/05 que ocorrem no coração e no sangue dos ratos (FIGs. 4-6) .

Especificamente, FIG. 4 mostra uma avaliação terapêutica para Lysl68 e Lysl70 nos corações de 3 ratos Wistar fêmea, em que o tampão foi utilizado como controlo negativo e o tratamento foi levado a cabo após 24 horas da infecção no coração. A FIG. 5 apresenta uma avaliação terapêutica de Lysl68 e Lysl70 no sangue de 3 ratos Wistar fêmea, em que se utilizou tampão como controlo negativo e o tratamento foi levado a cabo após 24 horas da infecção no coração. A FIG. 6 apresenta uma avaliação terapêutica de Lysl68 e Lysl70 nos corações de 1 rato Wistar macho e de 3 fêmeas, em que o coração do macho e o tampão foram usados como controlo negativo e o tratamento foi levado a cabo após 19-24 horas da infecção no coração.

Tendo descrito a invenção com referência a composições, métodos para detecção, e fontes de actividade, e propostas 85 de eficácia, e semelhantes, particulares, será evidente aos peritos na técnica que não se pretende que a invenção seja limitada por tais implementações ou mecanismos ilustrativos, e que podem ser realizadas modificações sem sair do âmbito ou espirito da invenção, tal como definida pelas reivindicações anexas. Pretende-se que todas estas modificações e variações óbvias sejam incluídas no âmbito a presente invenção tal como definido nas reivindicações anexas. Deverá perceber-se que qualquer elemento ou quaisquer elementos acima descritos de qualquer implementação podem ser combinados com qualquer ou quaisquer elementos em qualquer outra implementação. Além disso, quando se menciona uma gama, deverá entender-se que está contemplado que qualquer número real que se situe no interior da gama é um ponto final contemplado. Por exemplo, se for dada uma gama de 0,9 e 1,1 g/kg, contempla-se que qualquer valor de número real que se situe no interior daquela gama (por exemplo, 0,954 a 1,052 g/kg) está contemplado como uma gama subgénero da invenção, mesmo se tais valores não são explicitamente mencionados. Todas as referências aqui referidas são incorporadas por referência na sua totalidade. Finalmente, a descrição acima não deve ser entendida como limitando a invenção mas a invenção deverá antes ser definida pelas reivindicações abaixo.

Lisboa 10 de Janeiro de 2011

Claims (33)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um polipéptido quimérico caracterizado por compreender uma sequência correspondente a um dominio catalítico de uma primeira endolisina de bacteriófago de Enterococcus e uma sequência correspondente a um domínio catalítico de uma segunda endolisina de bacteriófago de Enterococcus, em que o referido polipéptido quimérico apresenta um desempenho lítico melhorado relativamente a bactérias Enterococcus em comparação com a referida primeira e/ou segunda endolisina de bacteriófago de Enterococcus. 2. 0 polipéptido quimérico da reivindicação 1, caracterizado pelos referidos domínios catalíticos da referida primeira e da referida segunda endolisina de bacteriófago de Enterococcus serem cada um independentemente seleccionado de um domínio amidase-2 e um domínio CHAP. 3. 0 polipéptido quimérico da reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo referido domínio catalítico da referida primeira endolisina de bacteriófago de Enterococcus corresponder a um domínio amidase-2 e o referido domínio catalítico da referida segunda endolisina de bacteriófago de Enterococcus corresponde a um domínio CHAP. 4. 0 polipéptido quimérico de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo referido aumento do desempenho lítico compreender um espectro de actividade alargado contra espécies e/ou estirpes de bactérias Enterococcus. 5. 0 polipéptido quimérico de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo referido aumento do desempenho lítico compreender uma capacidade aumentada de matar e/ou inibir o crescimento ou a reprodução de bactérias Enterococcus. 2 6. 0 polipéptido quimérico de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelas referidas primeira e segunda endolisinas corresponderem a endolisinas do mesmo bacteriófago. 7. 0 polipéptido quimérico de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelas referidas primeira e segunda endolisinas corresponderem a endolisinas de bacteriófagos diferentes. 8. 0 polipéptido quimérico da reivindicação 7, caracterizado pelas referidas primeira e segunda endolisinas corresponderem a endolisinas de bacteriófagos diferentes, tendo os referidos bacteriófagos diferentes hospedeiros da mesma espécie bacteriana. 9. 0 polipéptido quimérico de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pela referida estirpe bacteriana ser E. faecalis ou E. faecium.

10. O polipéptido quimérico da reivindicação 7, caracterizado pelas referidas primeira e segunda endolisinas corresponderem a endolisinas de bacteriófagos diferentes, tendo os referidos bacteriófagos diferentes hospedeiros da mesma estirpe bacteriana.

11. O polipéptido quimérico da reivindicação 7, caracterizado pelas referidas primeira e segunda endolisinas corresponderem a endolisinas de bacteriófagos diferentes, tendo os referidos bacteriófagos diferentes hospedeiros de estirpes bacterianas diferentes.

12. O polipéptido quimérico da reivindicação 11, caracterizado pela referida primeira endolisina ser de um bacteriófago tendo como hospedeiro bacteriano E. faecalis 1518/05 e a referida segunda endolisina ser de um bacteriófago tendo como hospedeiro bacteriano E. faecalis 926/05.

13. O polipéptido quimérico de qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e 7 a 12, caracterizado pela referida 3 primeira endolisina ser do bacteriófago F 170/08 e a referida segunda endolisina ser do bacteriófago F 168/08.

14. O polipéptido quimérico de qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pela referida primeira endolisina ser Lysl70 correspondente a SEQ ID NO: 1.

15. O polipéptido quimérico de qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pela referida segunda endolisina ser Lysl68 correspondente a SEQ ID NO: 3.

16. O polipéptido quimérico de qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo referido domínio catalítico da referida primeira endolisina compreender SEQ ID NO: 5 ou um seu fragmento com actividade antimicrobiana contra E. faecalis.

17. O polipéptido quimérico de qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo referido domínio catalítico da referida primeira endolisina compreender um primeiro péptido com pelo menos 80% de identidade de sequência relativamente a um segundo péptido do mesmo comprimento, em que o primeiro péptido tem actividade antimicrobiana contra E. faecalis e o referido segundo péptido tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 ou um seu fragmento.

18. O polipéptido quimérico da reivindicação 17, caracterizado pelo referido primeiro péptido ter pelo menos 85% de identidade de sequência relativamente ao referido segundo péptido

19. O polipéptido quimérico da reivindicação 17, caracterizado pelo referido primeiro péptido ter pelo menos 90% de identidade de sequência relativamente ao referido segundo péptido

20. O polipéptido quimérico da reivindicação 17, caracterizado pelo referido primeiro péptido ter pelo menos 95% de identidade de sequência relativamente ao referido segundo péptido 4 21. 0 polipéptido quimérico da reivindicação 1, caracterizado pelo referido domínio catalítico da referida segunda endolisina compreender SEQ ID NO: 7 ou um seu fragmento com actividade antimicrobiana contra E. faecalis. 22. 0 polipéptido quimérico da reivindicação 21, caracterizado o referido domínio catalítico da referida segunda endolisina compreender um terceiro péptido com pelo menos 80% de identidade de sequência relativamente a um quarto péptido do mesmo comprimento, em que o terceiro péptido tem actividade antimicrobiana contra E. faecalis e o referido quarto péptido tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou um seu fragmento.

23. O polipéptido quimérico da reivindicação 22, caracterizado pelo referido terceiro péptido ter pelo menos 85% de identidade de sequência relativamente ao referido quarto péptido

24. O polipéptido quimérico da reivindicação 22, caracterizado pelo referido terceiro péptido ter pelo menos 90% de identidade de sequência relativamente ao referido quarto péptido

25. O polipéptido quimérico da reivindicação 22, caracterizado pelo referido terceiro péptido ter pelo menos 95% de identidade de sequência relativamente ao referido quarto péptido

26. O polipéptido quimérico da reivindicação 1, caracterizado pelo referido polipéptido quimérico compreender SEQ ID NO: 9 ou um seu fragmento com actividade antimicrobiana contra E. faecalis.

27. Um primeiro polipéptido quimérico com pelo menos 80% de identidade de sequência relativamente a um segundo polipéptido do mesmo comprimento, caracterizado pelo primeiro polipéptido ter actividade antimicrobiana contra E. faecalis e pelo referido segundo polipéptido ter a 5 sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou um seu fragmento.

28. O polipéptido quimérico da reivindicação 27, caracterizado pelo referido primeiro polipéptido ter pelo menos 85% de identidade de sequência relativamente ao referido segundo polipéptido. 29. 0 polipéptido quimérico da reivindicação 27, caracterizado pelo referido primeiro polipéptido ter pelo menos 90% de identidade de sequência relativamente ao referido segundo polipéptido.

30. O polipéptido quimérico da reivindicação 27, caracterizado pelo referido primeiro polipéptido ter pelo menos 95% de identidade de sequência relativamente ao referido segundo polipéptido.

31. Um péptido de lisina isolado do fago F 168/08, caracterizado por compreender o referido péptido de lisina a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 7 ou um seu fragmento com actividade antimicrobiana contra E. faecalis.

32. Um quinto péptido de lisina isolado com pelo menos 80% de identidade de sequência relativamente a um sexto péptido de lisina do mesmo comprimento, caracterizado pelo referido quinto péptido de lisina tem actividade antimicrobiana contra E. faecalis e pelo referido sexto péptido de lisina tem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 7 ou um seu fragmento.

33. O quinto péptido de lisina isolado da reivindicação 32, caracterizado pelo referido quinto péptido de lisina ter pelo menos 85% de identidade de sequência relativamente ao referido sexto domínio de lisina.

34. O quinto péptido de lisina isolado da reivindicação 32, caracterizado pelo referido quinto péptido de lisina ter pelo menos 90% de identidade de sequência relativamente ao referido um sexto péptido de lisina. 6 35. 0 quinto péptido de lisina isolado da reivindicação 32, caracterizado pelo referido quinto péptido de lisina ter pelo menos 95% de identidade de sequência relativamente ao referido um sexto péptido de lisina.

36. Um ácido nucleico caracterizado por compreender uma sequência de nucleótido que codifica para o polipéptido quimérico ou proteína lisina de qualquer uma das reivindicações 1-35. 37. 0 ácido nucleico da reivindicação 36 caracterizado por compreender a sequência nucleotídica correspondente a SEQ ID NO: 8 ou a um seu fragmento. 38. 0 ácido nucleico da reivindicação 36 caracterizado por compreender a sequência nucleotídica correspondente a SEQ ID NO: 10 ou a um seu fragmento.

39. Um vector caracterizado por compreender o ácido nucleico da reivindicação 36.

40. O vector da reivindicação 39 caracterizado por ser um vector de expressão.

41. Uma célula hospedeira caracterizada por compreender o vector da reivindicação 40.

42. Uma composição farmacêutica caracterizada compreender um veículo farmaceuticamente aceitável e um polipéptido quimérico ou um péptido de lisina de qualquer uma das reivindicações 1-35.

43. Um método para o tratamento de uma infecção bacteriana num indivíduo que dele necessite, caracterizado por compreender o referido método a administração ao referido indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de composição farmacêutica da reivindicação 42.

44. O método da reivindicação 43, caracterizado pela referida infecção bacteriana ser uma infecção por uma bactéria Gram-positiva. O método da revindicação 44, caracterizado pela referida bactéria Gram-positiva ser um Enterococcus, 45. 7 Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Streptococcus grupo, Mlcrococcus luteus, e/ou Escherichia coll.

46. O método da revindicação 45, caracterizado pela referida bactéria Gram-positiva ser um Enterococcus. 47. 0 método da reivindicação 46, caracterizado pela referida bactéria Gram-positiva ser E. faecalis.

48. Um método para o rastreio de péptidos relativamente a actividade antibiótica, caracterizado por esse método compreender o rastreio de sequências de aminoácidos contíguos de pelo menos 6 resíduos de comprimento de SEQ ID NO: 7 ou 9 para actividade antimicrobiana contra culturas líquidas de E. faecalis. 49. 0 método da reivindicação 48, caracterizado pelas referidas sequências de aminoácidos contíguos terem um comprimento de pelo menos 10 resíduos.

50. Um método para produção recombinante do péptido lisina ou polipéptido quimérico de qualquer uma das reivindicações 1-35, caracterizado por esse método compreender: (i) a construção de um ácido nucleico que codifique para o referido péptido ou polipéptido; (ii) crescer num meio uma célula hospedeira compreendendo o referido ácido nucleico, sob condições adequadas para a expressão do referido péptido ou polipéptido; e (iii) recuperar o referido péptido ou polipéptido do referido meio. Lisboa, 10 de Janeiro de 2011