CN105648109B - 一种噬菌体灭菌时化学抗菌剂筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医疗卫生保健技术领域，具体涉及一种噬菌体灭菌时化学抗菌剂筛选方法。该方法具体包括制备双层固体培养基、接种病菌和噬菌体、加入抗菌剂、观察判定等步骤。本申请以部分特定菌株和噬菌体及部分广谱性的抗菌剂为代表，对于噬菌体与化学抗菌剂联用时的相互作用、相互影响进行了初步探讨，所提供的噬菌体灭菌时的化学抗菌剂的筛选方法，为筛选获得噬菌体与抗菌剂的最佳组合，以期获得最佳抗菌效果提供了较好的技术保障。总体而言，本发明所提供的化学抗菌剂的筛选方法，操作简单、结果稳定、可信度高，且容易观察和判断，因而在卫生保健领域具有较好地应用前景。

Description

一种噬菌体灭菌时化学抗菌剂筛选方法

技术领域

本发明属于医疗卫生保健技术领域，具体涉及一种噬菌体灭菌时化学抗菌剂筛选方法。

背景技术

化学抗菌剂通常包括用于体外的消毒剂（如环境消毒和生物体表皮肤黏膜消毒）和用于生物体内治疗感染的天然抗生素或人工合成的抗菌药物。在医疗卫生保健技术领域，为快速、有效控病菌感染，常需大量使用各种类型的化学抗菌剂进行灭菌处理。然而，随着大量广谱类抗菌剂的长期使用，细菌耐药问题逐年加剧，一系列耐药病原菌，如结核杆菌、金萄菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、肠球菌和铜绿假单胞菌等病原菌耐药菌株的出现，引起公众的广泛关注，这也是人们意识到，寻找新的、更为环保和生态的抑制病原菌的用药方式是解决细菌耐药问题根本出路。

噬菌体是一种可以感染并裂解杀灭细菌的天然存在的病毒，最早由Twort和Herelle D两人分别于1915年和1917年发现。由于其对人和动物无害，因此可将杀菌能力强的噬菌体用于自然环境和生物体内环境中的杀菌，以达到防治细菌感染体目的。由于噬菌体灭菌方式的环保性、高效性、特异性，因而使得人们近年对于噬菌体灭菌技术重新产生了浓厚的兴趣。

在化学抗菌剂仍是控制细菌感染主流方法的背景下，采用噬菌体灭菌作为化学抗菌剂的补充具有十分重要的意义。但实际应用过程中，由于噬菌体种类繁多（自然界中超过10⁸种），化学抗菌剂的种类也很多，加之在应用噬菌体杀菌的环境中常常会有化学抗菌剂的残留，而噬菌体与化学抗菌剂杀菌机制又完全不同，因而在噬菌体与化学抗菌剂联合使用时，如何在种类繁多的噬菌体和化学抗菌剂中选择出最佳的组合，是首先需要解决的关键问题。

发明内容

本发明目的是提供一种噬菌体灭菌时，筛选可以联合使用的化学抗菌剂的方法，从而为噬菌体与化学抗菌剂的联合应用提供可靠保障。

本发明所采取的详细技术方案如下所述。

一种噬菌体灭菌时化学抗菌剂筛选方法，具体包括如下步骤：

（1）制备培养基，本发明中采用双层固体培养基，具体为：

首先制备底层固体培养基，即加入1.5%的琼脂粉的LB培养基，灭菌后，无菌环境下倾倒于无菌的9cm平皿中（10mL/平皿），制成固体培养基，凝固后置4℃保存待用，使用前置37℃下预热；

其次制备顶层用半固体培养基，即加入0.5%的琼脂粉的LB培养基，将培养基融化后分装于玻璃试管中（3mL/管），加盖灭菌后，趁热置于45℃水浴中保温以避免凝固；

（2）接种病菌和噬菌体，具体为，将100µL菌液（10⁹ CFU/ml）和100µL噬菌体悬液分别加入到步骤（1）中的半固体培养基中，混合均匀后，倾倒于步骤（1）中的固体培养基中，并铺匀，室温（20~25℃）凝固；

需要解释的是，噬菌体悬液浓度以前期的预实验结果为准，对于噬菌体悬液浓度进行控制主要是控制噬菌体在每个平皿中形成噬菌斑的数量，由于不同噬菌体所形成的噬菌斑的大小不同，因此噬菌体数量（噬菌体悬液浓度）并不是固定的，但以不会构成融合的最大噬菌斑数为最佳；

（3）加入抗菌剂，在步骤（2）中凝固后的双层培养基中滴加5µL化学抗菌剂，培养约8~48h（培养时以所接种病菌的最适生长温度为宜），观察噬菌斑并进行判断；

需要解释的是，滴加化学抗菌剂后培养时间可根据不同细菌生长速度适当做调整，即培养时间等于菌苔的透明度达到稳定所需的时间；

判断时，可依据噬菌体成斑率、噬菌斑大小和形态变化、化学抗菌剂抑菌区透明度变化等单独或者联合对化学抗菌剂与噬菌斑合用的灭菌效果进行判定；

依据噬菌体成斑率进行判断时，观察消毒剂作用区域噬菌体成斑率的变化，成斑率增高即表明化学抗菌剂对噬菌体杀菌起促进作用，成斑率降低即表明化学抗菌剂对噬菌体杀菌起抑制作用；

依据噬菌斑大小或形态变化进行判断时，观察消毒剂作用区域噬菌斑，如果噬菌斑明显增大，或向消毒剂抑菌圈方向局部增大而被“拉长”，表明化学抗菌剂对噬菌体灭菌起促进作用；反之，观察消毒剂作用区域噬菌斑，如果噬菌斑明显减小，或向消毒剂抑菌圈方向局部缩小而被“挤压”，表明化学抗菌剂对噬菌体灭菌起抑制作用；

依据化学抗菌剂抑菌区透明度变化进行判断时，观察与噬菌斑相邻处化学抗菌剂抑菌区透明度的变化，如果与噬菌斑相邻处化学抗菌剂抑菌区透明度增加，表明化学抗菌剂对噬菌体灭菌起促进作用；反之，如果与噬菌斑相邻处化学抗菌剂抑菌区透明度降低，表明化学抗菌剂对噬菌体灭菌起抑制作用。

实际应用过程中，滴加抗菌剂方式也可更改为粘贴具有特定浓度抗菌剂的纸片方式进行实验。

在本发明中，接种的病菌具体例如：肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希菌等；采用的噬菌体为用这些病菌作为指示菌从环境中分离获得的特异性噬菌体。

所述抗菌剂例如：84消毒液、双氧水、苯扎溴铵、石碳酸、碘伏、戊二醛或临床中所用抗生素类药剂等。

现有技术中，针对特定病菌筛选针对性的噬菌体的技术已经较为成熟，而且由于噬菌体灭菌的特异性和环保性，因而实际抗菌、治疗过程中也有一定的应用试验。但由于现有技术中针对病菌的灭菌、抗菌时仍以化学抗菌剂为主，因而在噬菌体与化学抗菌剂联用时，其相互作用、相互影响如何尚缺乏较为系统的研究。

本申请以部分特定菌株和噬菌体及部分广谱性的抗菌剂为代表，对于噬菌体与化学抗菌剂联用时的相互作用、相互影响进行了初步探讨，所提供的噬菌体灭菌时的化学抗菌剂的筛选方法，为筛选获得噬菌体与抗菌剂的最佳组合，以其获得最佳抗菌效果提供了较好的技术保障。

总体而言，本发明所提供的化学抗菌剂的筛选方法，操作简单、结果稳定、可信度高，且容易观察和判断，因而在卫生保健领域具有较好地应用前景。

附图说明

图1为未滴加抗菌剂时噬菌体所形成噬菌斑形态，其中A为噬菌体PL2在铜绿假单胞菌L2菌苔上形成的噬菌斑，B为噬菌体PF8在肺炎克雷伯菌F8菌苔上形成的噬菌斑，C为噬菌体PF2在肺炎克雷伯菌F2菌苔上形成的噬菌斑，D为噬菌体PA1在鲍曼不动杆菌A1菌苔上形成的噬菌斑；

图2为6种抗菌剂在顶层半固体培养基中对不同菌株的菌苔上形成抑菌区的形态（不含有噬菌体），其中A为肺炎克雷伯菌F7，B为肺炎克雷伯菌F4，C为铜绿假单胞菌L3，D为鲍曼不动杆菌A4，1、2、3、4、5、6代表的是6种不同抗菌剂的编号；

图3为抗菌剂与噬菌体联合使用时部分菌株上的噬菌体成斑率变化情况结果，其中左图的噬菌体为PF1，菌株为肺炎克雷伯菌F1；右图的噬菌体为PF12，菌株为肺炎克雷伯菌F12，白色箭头所指的是4号抗菌剂（石炭酸）；

图4为抗菌剂与噬菌体联合使用时部分菌株上的噬菌体成斑率变化情况结果，其中菌株为肺炎克雷伯菌F19，噬菌体为PF19，白色箭头所指抗菌剂的周围区域成斑率均明显降低；

图5为抗菌剂与噬菌体联合使用时部分菌株上的噬菌体成斑率变化情况结果，其中菌株为肺炎克雷伯菌F6，噬菌体为PF18，白色箭头所指抗菌剂的周围区域成斑率均明显降低；

图6为抗菌剂与噬菌体联合使用时部分菌株上的噬菌体成斑率变化情况结果，其中左图噬菌体为PA3，菌株为鲍曼不动杆菌A3；右图噬菌体为PG7，菌株为阴沟肠杆菌G7；两个黑色箭头所指抗菌剂的周围区域成斑率均明显增高；

图7为抗菌剂与噬菌体联合使用时部分菌株上的噬菌体成斑率变化情况结果，其中菌株为肺炎克雷伯菌F13，噬菌体为PF13，黑色箭头所指抗菌剂的周围区域成斑率明显增高；

图8为抗菌剂与噬菌体联合使用时，抗菌剂作用区域噬菌斑的大小和形态变化的部分实验结果，其中左图的噬菌体为PL4，菌株为肺炎克雷伯菌L4；右图的噬菌体为PL1，菌株为肺炎克雷伯菌L1，灰色箭头所指抗菌剂透明圆的周围区域噬菌斑均明显增大；

图9为抗菌剂与噬菌体联合使用时，抗菌剂作用区域噬菌斑的大小和形态变化的部分实验结果，其中左上图的噬菌体为PA5，菌株为肺炎克雷伯菌A5；右上图的噬菌体为PF1，菌株为肺炎克雷伯菌F1；左下图的噬菌体为PF4，菌株为肺炎克雷伯菌F1；右下图的噬菌体为PF7，菌株为肺炎克雷伯菌F7；图中所有箭头指的都是形态发生较大改变的噬菌斑；

图10为抗菌剂与噬菌体联合使用时，与噬菌斑相邻抑菌圆的形态变化的部分实验结果，其中左图的噬菌体为PF14，菌株为肺炎克雷伯菌F9；中图的噬菌体为PD62，菌株为大肠埃希菌D62；右图的噬菌体为PF13，菌株为肺炎克雷伯菌F99，图中白色环所在区域的抑菌圆为双层。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步解释说明，在介绍具体实施例前，对本发明中所涉及的噬菌体、抗菌剂等信息简要介绍如下。

下述实施例中所采用的化学抗菌剂有6种，分别为：84消毒液（1号消毒剂）、双氧水（2号消毒剂）、苯扎溴铵（3号消毒剂）、石碳酸（4号消毒剂）、碘伏（5号消毒剂）、戊二醛（6号消毒剂）。这6种抗菌剂属于常用的化学消毒剂，因而均可从医药商店或者医院常规购买获得。

需要解释的是，因语言习惯问题，本发明中化学抗菌剂、消毒剂、抗菌剂、抑菌剂等名词虽然描述方式不同，但含义相同，均是指常用的人工合成的或天热存在的、物质较为单一的化学类抑菌类物质。

下述实施例中所采用的菌株均来源于临床标本中常见的多重耐药菌或致病菌，包括多株肺炎克雷伯菌(可杀灭这些菌株的噬菌体分别命名为PF1、PF2等)、多株铜绿假单胞菌(可杀灭这些菌株的噬菌体分别命名为PL1、PL2等)和多株鲍曼不动杆菌(可杀灭这些菌株的噬菌体分别命名为PA1、PA2等) 等。对于这些细菌的鉴定采用法国生物梅里埃公司生产的细菌生化鉴定板条进行鉴定。所用噬菌体均为以上述致病菌为宿主菌从环境中分离、鉴定并保存的噬菌体，实验培养表明，上述菌株噬菌体的噬菌谱均存在明显差异，表明噬菌体各自的特异性。同时，每株噬菌体最为敏感的宿主菌均通过噬菌斑大小和成斑率高低的比较来决定，实验过程中，噬菌体的命名序号均与其最为敏感的宿主菌的序号一致。

需要说明的是，上述内容中所述菌株、噬菌体在各医疗场所普遍存在，经常规筛选即可获得，且由于相应菌株、噬菌体并非本发明核心，因而不需进行微生物保藏。

实施例

本发明所提供的噬菌体灭菌时化学抗菌剂筛选方法，其技术原理是：利用化学抗菌剂在含有密度均匀的致病菌的半固体培养基中扩散可形成不同浓度梯度为背景，观察不同浓度抗菌剂的区域内噬菌体的噬菌斑形态以及成斑率变化情况，从而对抗菌剂与噬菌体之间的相互影响做出定性判断，以获得最适噬菌体和化学抗菌剂的浓度组合。详细过程介绍如下。

一种噬菌体灭菌时化学抗菌剂筛选方法，具体包括如下步骤：

（1）制备培养基，本发明中采用双层固体培养基，具体为：

其中底层为固体培养基，即加入1.5%的琼脂粉到LB培养基中加热完全融化后按常规方法高压灭菌，无菌环境倾倒于无菌的9cm平皿中（10mL/平皿），制成固体培养基，凝固后置4℃保存待用，使用前置37℃下预热；

顶层为半固体培养基，即加入0.5%的琼脂粉到LB培养基中加热完全融化后分装于玻璃试管中（3mL/管），加盖后按常规方法高压灭菌，趁热置于45℃水浴中保温以避免凝固。

（2）接种病菌和噬菌体，具体为，将100µL菌液（10⁹ CFU/ml）和100µL噬菌体悬液分别加入到步骤（1）中的半固体培养基中，混合均匀后，倾倒于步骤（1）中的固体培养基中，并铺匀，室温（20~25℃）凝固；

需要解释的是，待测的各种噬菌体悬液浓度应以平皿培养基表面菌苔上噬菌斑不构成相互融合的最大噬菌体浓度为最佳。由于噬菌斑的大小可因噬菌体和菌株种类的不同可呈现较大差异，因此不同噬菌体所需的悬液浓度并不是固定的。

（3）加入抗菌剂，在步骤（2）中凝固后的双层培养基中滴加5µL化学抗菌剂，培养后（培养时以所接种病菌的最适生长温度为宜，培养时间约为8~48h，针对生长缓慢的病菌菌株可延长培养时间），观察噬菌斑并进行判断。需要说明的是，培养时间可根据不同细菌生长速度适当做调整，即培养时间等于菌苔的透明度达到稳定所需的时间。

在本实施例中，接种的病菌有肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希菌；采用的噬菌体为用这些多重耐药菌株作为指示菌从环境中分离获得；具体如后文附表所列。

所加入抗菌剂有：有效氯含量4.0%~5.5%(w/v)的84消毒液（1号消毒剂）、30%的双氧水（2号消毒剂）、0.05g/L的苯扎溴铵（3号消毒剂）、20%的石碳酸（4号消毒剂）、有效碘含量4.5g/L~5.5g/L的碘伏（5号消毒剂）、25%的戊二醛（6号消毒剂）。需要说明的是，下述实施例中抗菌剂的滴加顺序与图2保持一致。

在本实施例中，所用噬菌体悬液浓度范围为500~2000PFU/ml，实际实验中噬菌体悬液浓度可根据不同噬菌体在平皿培养基表面菌苔上形成的噬菌斑大小做适当调整，噬菌斑较大时，应将悬液中噬菌体数应调整的相对少些，噬菌斑较小时，悬液中噬菌体数应调整的相对多些。总之，实际实验中噬菌体悬液浓度应以平皿培养基表面菌苔上噬菌斑不构成相互融合的最大噬菌体浓度为最佳噬菌体悬液浓度。

实际实验中所用各种消毒剂的浓度只要高于有效杀菌浓度即可，一般可采用未经稀释的标准商品出售包装内的消毒剂原液浓度为实验浓度，如果某种抗菌剂商品的原液所形成的抑菌区过大，可根据具体情况先做适当稀释后再使用。

在本发明中，由于采用的为双层固体平皿培养基，在顶层培养基中，含有待抑制的细菌和能够裂解这种细菌并能形成噬菌斑的噬菌体。此时在培养基表面滴加化学抗菌剂后，抗菌剂会以滴加区域为圆心向周围琼脂中扩散，离圆心越近浓度越高，越远便越低，同一个同心圆上的浓度是相似或相同的。在有效杀菌或抑菌浓度下细菌的生长会受到抑制，因此会留下没有细菌生长的圆形透明区（透明圆）。由于顶层培养基中还含有一定数量的噬菌体，在抗菌剂形成透明区的过程中，这些噬菌体也会在菌苔上形成噬菌斑，由于噬菌斑数量多（不会构成噬菌斑融合的最大数量），且在菌苔表面均匀分布，因此，不同浓度抗菌剂的分布区都会有噬菌斑的形成。

如果化学抗菌剂对噬菌体的杀菌有影响，即会影响到噬菌斑的形成过程，使其形态发生改变。因此，通过观察不同区域噬菌斑的形态和成斑率的变化，即可对噬菌体与化学抗菌剂的相互影响作出直观的定性判断。

噬菌斑是噬菌体感染菌苔中的一个细菌后，在细菌体内快速的复制增殖，大量子代噬菌体随细菌破裂后被释放于周围培养基中，再经过扩散感染临近的细菌，这样周而复始，便形成一个无细菌生长的透明区域，即噬菌斑。不同的噬菌体所形成的噬菌斑形态存在差异。图1为未滴加抗菌剂情况下，噬菌体所形成噬菌斑形态。从图1中可以看出，噬菌斑有的大（如B和C）、有的小（如D），有的还带有晕环（如B和C）。

图2为6种抗菌剂在顶层半固体培养基菌苔上形成抑菌区的形态（不含有噬菌体），其中图中A、B、C、D展示的是4种不同的临床菌株对6种抗菌剂的敏感性。在图2中，透明圆形区即是因不同抗菌剂对细菌生长的抑制作用所形成的，其直径与抗菌剂的强弱成正比。比较图中同一编号抗菌剂在不同菌苔上形成的透明圆的直径和透明度即可作为敏感性的评判指标。因为，透明区的直径大小可有效反应抗菌剂的抗菌能力，二者呈正比。即抗菌能力越强，透明区直径越大，反之亦然。

抗菌剂与噬菌体联合使用时，抗菌剂作用区域噬菌体成斑率变化情况的部分实验结果如图3~7所示。对于成斑率（efficiency of plating），常简称为EOP，其含义为噬菌体和指示菌一起涂布在琼脂培养基上所生成的噬菌斑数。噬菌斑数可因指示菌的种类或条件不同而异。如在标准条件下，用某种标准指示菌所得噬菌斑数为1，则将某株菌所得的数值称为成斑率。通常是选取噬菌斑最多的指示菌和条件作为标准。

图3中，白色箭头所指的是4号抗菌剂（石炭酸），其周围噬菌斑的密度均明显低于其他区域，即成斑率降低，说明4号抗菌剂对两种噬菌体的杀菌均起明显抑制作用，因此，这种噬菌体不能与4号抗菌剂合用。

图4中，白色箭头所指抗菌剂的周围区域成斑率均明显降低，即2号（双氧水）和4号（石碳酸）抗菌剂对噬菌体的杀菌起明显抑制作用，因此，这种噬菌体不能与2号和4号抗菌剂合用。

图5中，白色箭头所指抗菌剂的周围区域成斑率均明显降低，即1号（84消毒液）、2号（双氧水）和4号（石碳酸）抗菌剂对噬菌体杀菌均起明显抑制作用，因此，这种噬菌体不能与1号、2号和4号抗菌剂合用。

图6中，两个黑色箭头所指抗菌剂的周围区域成斑率均明显增高，即4号抗菌剂对图中两种噬菌体的杀菌均起明显促进作用，因此，这两种噬菌体都可以与4号抗菌剂合用。

图7中，黑色箭头所指抗菌剂的周围区域成斑率明显增高，即4号抗菌剂对图中噬菌体的杀菌起明显促进作用；两个白色箭头所指抗菌剂的周围区域成斑率均明显降低，即3号（苯扎溴铵）和5号（碘伏）抗菌剂对图中噬菌体的杀菌起明显抑制作用，抑制的不能合用，促进的可以合用。

抗菌剂与噬菌体联合使用时，抗菌剂作用区域噬菌斑的大小和形态变化的部分实验结果如图8~9所示。

图8中，灰色箭头所指抗菌剂透明圆的周围区域噬菌斑均明显增大，即4号抗菌剂对图中两种噬菌体的杀菌均起明显促进作用，因此，这种噬菌体能与4号抗菌剂合用。

图9中，图中所有箭头指的都是形态发生较大改变的噬菌斑，有的被抗菌剂所形成的透明圆“拉长”（如图中白色箭头所指），有的被透明圆“挤压”（黑色箭头所指），“拉长”者为抗菌剂对噬菌体成斑的促进作用，“挤压”者为抗菌剂对噬菌体成斑的抑制作用。

抗菌剂与噬菌体联合使用时，与噬菌斑相邻抑菌圆的形态变化的部分实验结果如图10所示。

图10中，图中白色环所在区域的抑菌圆为双层，外层为半透明环，是对低浓度抗菌剂抵抗的抗性菌生长的区域；半透明环内部则完全透明，是高浓度抗菌剂作用于细菌后留下的无细菌生长的区域。白色环圈住的与抑菌圆毗邻的噬菌斑均改变了抑菌圆外层的形态，使其由半透明变为透明，说明在一定浓度抗菌剂存在条件下，噬菌体可更高效的裂解对此抗菌剂抵抗的细菌，二者合用会降低抗性菌出现的几率。

抗菌剂与噬菌体联合使用时，对于不同菌株的相互影响结果进行汇总，结果如下表所示：

。

上表中，“↓数”表示该行中降低数，“S↑”：代表抗菌剂的存在可使噬菌斑增大；“S↓”：代表抗菌剂的存在可使噬菌斑缩小；“N↑”：代表抗菌剂的存在可增高成斑率；“N↓”：代表抗菌剂的存在可降低成斑率；“—”：代表抗菌剂对噬菌体的成斑影响不明显。

从上表中可以看出，28株噬菌体对其最敏感宿主菌的杀菌受6种常用消毒剂的影响情况各不相同。其中，除PA1、PF5、PF9、PF14、PF16、PL1和PL2这7株噬菌体的杀菌不受6种消毒剂的抑制外，其他噬菌体的杀菌均受1到3种消毒剂的抑制。其中，仅受1种消毒剂抑制的噬菌体最多，为10株，受2种消毒剂抑制的噬菌体为8株，受3种消毒剂抑制的噬菌体仅为3株。抑制这些噬菌体杀菌的消毒剂种类主要集中在苯扎溴铵。

6种消毒剂对噬菌体杀菌影响（仅依据上表数据进行统计）进一步进行统计，结果如下表：

。

上表中，“↑”：代表促进噬菌体杀菌；“↓”：代表抑制噬菌体杀菌；“—”：代表对噬菌体杀菌影响不明显。

从上表可以看出，6种消毒剂中，低浓度苯扎溴铵的存在对噬菌体杀菌的抑制几率最大，约57%的噬菌体杀菌均受其抑制。低浓度戊二醛的存在对噬菌体杀菌的抑制作用最小，所有噬菌体杀菌均未出现明显的抑制作用。另外，6种消毒剂影响28株噬菌体杀菌的所有反应中，仅有21%的噬菌体杀菌受到明显抑制，明显增强的反应达50%，其余29%的反应受消毒剂的影响不明显。

上述结果表明：环境中有低浓度消毒剂残留的情况下，噬菌体杀菌受明显抑制作用的仅占少数。

总体而言，通过采用本发明中所提供的化学抗菌剂筛选方法，可获得噬菌体与抗菌剂的联合应用的最佳组合，为改善抗菌效果、降低化学抗菌剂用量提供了较好的指导。

Claims (3)

1.一种噬菌体灭菌时化学抗菌剂筛选方法，其特征在于，该方法具体包括如下步骤：

（1）制备双层固体培养基，其中底层为固体培养基，顶层为半固体培养基；

（2）接种病菌和噬菌体，在步骤（1）中的顶层的半固体培养基中接种菌液和对应的噬菌体，混合均匀后，将半固体培养基倾倒于步骤（1）中的固体培养基中，并铺匀，室温凝固；

所述菌液中菌体为肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌或大肠埃希菌，所述化学抗菌剂为84消毒液、双氧水、苯扎溴铵、石碳酸、碘伏或戊二醛；

（3）加入化学抗菌剂，在步骤（2）中凝固后的双层培养基中滴加化学抗菌剂或采用粘贴具有一定浓度化学抗菌剂的纸片，培养并观察噬菌斑以进行判断；

所用抗菌剂浓度高于有效杀菌浓度；

判断时，依据噬菌体成斑率、噬菌斑大小和形态变化、化学抗菌剂抑菌区透明度变化三个方面单独或者联合对化学抗菌剂与噬菌斑合用的灭菌效果进行判定；

依据噬菌体成斑率进行判断时，观察化学抗菌剂作用区域噬菌体成斑率的变化，成斑率增高即表明化学抗菌剂对噬菌体杀菌起促进作用，成斑率降低即表明化学抗菌剂对噬菌体杀菌起抑制作用；

依据噬菌斑大小或形态变化进行判断时，观察化学抗菌剂作用区域噬菌斑，如果噬菌斑增大，或向消毒剂抑菌圈方向局部增大而被“拉长”，表明化学抗菌剂对噬菌体灭菌起促进作用；反之，观察化学抗菌剂作用区域噬菌斑，如果噬菌斑减小，或向消毒剂抑菌圈方向局部缩小而被“挤压”，表明化学抗菌剂对噬菌体灭菌起抑制作用；

依据化学抗菌剂抑菌区透明度变化进行判断时，观察与噬菌斑相邻处化学抗菌剂抑菌区透明度的变化，如果与噬菌斑相邻处化学抗菌剂抑菌区透明度增加，表明化学抗菌剂对噬菌体灭菌起促进作用；反之，如果与噬菌斑相邻处化学抗菌剂抑菌区透明度降低，表明化学抗菌剂对噬菌体灭菌起抑制作用。

2.如权利要求1所述噬菌体灭菌时化学抗菌剂筛选方法，其特征在于，步骤（1）中所述固体培养基和半固体培养基均为LB培养基，固体培养基中琼脂粉用量为1.5%的质量比例，半固体培养基中琼脂粉用量为0.5%的质量比例。

3.如权利要求1所述噬菌体灭菌时化学抗菌剂筛选方法，其特征在于，步骤（1）中培养基用10mL/平皿盛放，步骤（2）中菌液浓度为10⁹ CFU/mL，接种量为100µL，步骤（3）中化学抗菌剂滴加量为5µL。