RU2703043C1

RU2703043C1 - Литический фермент бактериофага и антибактериальная композиция на его основе

Info

Publication number: RU2703043C1
Application number: RU2018133312A
Authority: RU
Inventors: Наталия Петровна Антонова; Валентин Владимирович Макаров; Артем Петрович Ткачук; Александр Леонидович Гинцбург; Владимир Алексеевич Гущин
Original assignee: Наталия Петровна Антонова; Валентин Владимирович Макаров; Артем Петрович Ткачук; Александр Леонидович Гинцбург; Владимир Алексеевич Гущин
Priority date: 2018-09-20
Filing date: 2018-09-20
Publication date: 2019-10-15

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению антибактериальных рекомбинантных белков, и может быть использовано в медицине в качестве антибактериальной композиции, проявляющей активность в отношении грамотрицательных бактерий Pseudomonas aeruginosa. Получают рекомбинантный белок, представляющий собой ковалентно сшитые эндолизин антисинегнойного бактериофага КРР10 и модифицированный фрагмент миелоидного антимикробного пептида овцы SMAP-29 [K2,7,13]-SMAP-29(1–17). Изобретение позволяет повысить эффективность антибактериальной терапии в отношении бактерий Pseudomonas aeruginosa. 2 н.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл., 3 пр.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к биохимии, молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано в создании биологических препаратов для профилактики и лечения инфекций.

Уровень техники

Одной из основных проблем современности в области здравоохранения является стремительное увеличение количества штаммов бактерий, устойчивых к существующим антибактериальным средствам. Некоторые из них выработали резистентность даже к наиболее эффективным в настоящее время антибиотикам, таким как цефалоспорины III и IV поколения. Множество механизмов устойчивости, которые выработали бактерии против антибактериальных средств, говорит об острой необходимости бороться с данным явлением.

Альтернативой антибиотикам и синтетическим антибактериальным средствам являются бактериофаги. Применение бактериофагов имеет множество преимуществ: автоматическое дозирование в зависимости от степени заражения, минимальное нарушение естественной микрофлоры, низкая вероятность развития устойчивости, совместимость с антибиотиками, быстрая скорость разработки средств на основе фагов и их низкая стоимость, уничтожение биопленок, возможность единоразового введения и применения низких доз, а также низкая степень нагрузки на окружающую среду.

Существует множество изолированных бактериофагов, которые можно применять для лечения инфекций, вызванных синегнойной палочки. Например, вирулентный фаг Фи 03 (патент РФ № 2112800) обладает способностью действовать на клетки синегнойной палочки, имеющие пили. Однако его спектр действия довольно узкий. Фаг Фи 02 (патент РФ № 2113476) обладает широким спектром действия. Бактериофаг ph57 (патент РФ № 2455355) также обладает широким спектром и может применяться для лечения гнойно-септических инфекций. Также известен ряд патентов, защищающих технические решения, относящиеся к бактериофагам, действующим на синегнойную палочку: патенты США № 7622293, № 8282920, европейские патенты № 2570130, № 2465926 и другие.

Новым классом антибактериальных агентов, являются фаголизины (эндолизины). Фаголизины - это кодируемые бактериофагами специфические ферменты, расщепляющие пептидогликан клеточной стенки бактерий. В ходе своего жизненного цикла бактериофаги выделяют фаголизины для проникновения в клетку фаговой ДНК при инфицировании бактерий, а также для высвобождения новых вирионов из клетки. За счет действия своих каталитических доменов фаголизины способствуют расщеплению различных связей в пептидогликане. Гибель бактерии происходит вследствие гипотонического лизиса из-за различия в осмотическом давлении внутри и снаружи клетки.

Существует ряд неоспоримых преимуществ лизинов по отношению к другим антимикробным агентам. Во-первых, это селективность. Воздействуя на определенный вид бактерий лизины не влияют на представителей нормальной микрофлоры организма. Во-вторых, лизины очень быстро действуют на пептидогликан клеточной стенки, не задействуя длительных метаболических процессов, что приводит к быстрому лизису бактерии. Таким образом, время лечения таким препаратом может значительно снижаться по сравнению с принятой терапией существующими антибактериальными средствами. В-третьих, очень важным аспектом является невозможность развития к ним резистентности. Лизины действуют на специфические молекулы-мишени, которые необходимы для нормальной жизнедеятельности клеток-хозяев, в связи с этим возникновение устойчивых изолятов маловероятно, поскольку должно сопровождаться коренной перестройкой бактериальной клеточной стенки. В-четвертых, лизины действуют на антибиотикоустойчивые штаммы бактерий. И, в-пятых, вследствие своей способности дестабилизировать пептидогликан клеточной стенки лизины способны действовать на бактерии в любых метаболических стадиях, включая дормантные, что позволят разрушать образуемые патогенами биопленки и лизировать находящиеся в них бактерии.

Таким образом, фаголизины обладают огромным потенциалом в борьбе с различными возбудителями, являясь отличной альтернативой антибиотикам. В настоящее время проводится множество исследований по их применению в различных областях: от медицины до нанотехнологий.

Особое место среди устойчивых патогенов занимают бактерии, вызывающие внутрибольничные инфекции. Одним из опаснейших возбудителей внутрибольничных инфекций является синегнойная палочка (P. aeruginosa), борьба с которой сильно затруднена в связи с ее стремительно растущей устойчивостью к антибиотикам, способностью образовывать биопленки, а также разнообразием видов инфекций, вызываемых ею. Данный возбудитель относится к крайне приоритетной в плане разработки новых антибактериальных средств группе, обозначенной в списках ВОЗ.

Фаголизины разрабатываются ко многим наиболее опасным и социально значимым возбудителям, в том числе и к синегнойной палочке. При этом использование лизинов в чистом виде затруднено из-за наличия наружной мембраны, экранирующей пептидогликан от действия фермента, поэтому необходимы вещества, увеличивающие проницаемость наружной мембраны. В качестве таковых могут использоваться полимиксины, полигуанидины и их производные, аминогликозиды, ЭДТА, лимонная кислота и др.

Известен эндолизин EL188 (WO2015071437), проявляющий свою эффективность против исследованных штаммов синегнойной палочки. При этом показано, что данный фермент проявляет свою активность лишь в присутствии веществ, увеличивающих проницаемость наружной мембраны, таких как ЭДТА. Было показано, что в концентрации 50 мкг/мл с добавлением 10 мМ ЭДТА EL188 снижает количество бактерий на 3-4 порядка.

Известен также эндолизин OBPgpLYS (патент США № 8846865). Данный белок обладает широким спектром действия на грамотрицательные бактерии, в том числе активен в отношении синегнойной палочки, и способен снижать количество бактерий на 1 порядок. При этом было показано, что добавление ЭДТА в небольших концентрациях увеличивает антимикробный эффект против синегнойной палочки с множественной лекарственной устойчивостью на 2-3 порядка.

Также известен лизин KZ144 полученный из антисинегнойного бактериофага phiKZ, который также проявляет свои антимикробные свойства в присутствии пермеабилизаторов. (Briers Y, Volckaert G, Cornelissen A, Lagaert S, Michiels CW, Hertveldt K, et al. Muralytic activity and modular structure of theendolysins of Pseudomonas aeruginosa bacteriophages phiKZ and EL. Molecular Microbiology. 2007; 65 (5): 1334–44.).

Для того чтобы не задействовать дополнительные реагенты, увеличивающие проницаемость наружных мембран, создан новый класс лизинов – артилизины. Это соединения, представляющие собой ковалентно сшитые эндолизин и пептид, который позволяет перенести молекулу через наружную мембрану грамотрицательных бактерий. Одним из перспективных пептидов для этих целей является миелоидный антимикробный пептид овцы – SMAP-29. Эта амфифильная молекула связывается с отрицательно заряженными фосфолипидами мембраны и образует в ней поры за счет встраивания своей гидрофобной части.

В частности, SMAP-29 в неизменном виде использовался для создания артилизина Art-175, представляющего собой модифицированную молекулу KZ144. В отличие от KZ144 артилизин Art-175 может проходить через наружную мембрану синегнойной палочки и уничтожать бактерии, в том числе и с множественной резистентностью, и уменьшать их количество на более чем 4 порядка в концентрации 10 мкг/мл (заявка США № 20160281074).

OBPgpLYS также модифицировали с помощью SMAP-29. При этом он начинает проявлять значительно больший антимикробный эффект как на штаммы синегнойной палочки, так и на другие грамотрицательные бактерии (патент США № 8846865). Модифицированный и немодифицированный OBPgpLYS также способны элиминировать бактерии внутри биопленок (международная заявка № WO 2011134998).

Также для лечения инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями, в частности, синегнойной палочкой, исследуют полипептиды на основе лизинов. Такие молекулы сохраняют все свои функции лизинов, могут иметь природное или синтетическое происхождение и обладают выраженным антибактериальным эффектом. Например, к ним можно отнести GN2, GN4, GN14, GN37 и GN43 (международная заявка № WO 2017049233), а также множество полипептидов, указанных в международной заявке № WO 2015155244

Техническая проблема

Техническая проблема состоит в необходимости расширения арсенала средств литического действия на грамотрицательные бактерии, в том числе на бактерии P. aeruginosa.

Сущность изобретения

Указанная техническая проблема с достижением соответствующего технического результата, который заключается в реализации назначения, разрешается созданием литического фермента, в частности, рекомбинантного белка, обладающего антибактериальной активностью, в том числе в отношении бактерии P. aeruginosa. Рекомбинантный белок представляет собой ковалентно сшитые эндолизин (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1; последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 2) антисинегнойного бактериофага КРР10 (Pseudomonas phage KPP10), и модифицированный фрагмент миелоидного антимикробного пептида овцы SMAP-29 [K2,7,13]-SMAP-29(1–17). Указанный белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 4.

Бактериофаг КРР10 обладает широким спектром действия на различные штаммы P. aeruginosa, в связи с чем его рекомбинантный эндолизин (фаголизин L-KPP10 аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1; последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 2) представляется перспективным белком для изучения физикохимических свойств и спектра литической активности, а также для создания на его основе антибактериального средства против P. aeruginosa и других видов бактерий.

Задача переноса фаголизина через наружную мембрану синегнойной палочки может быть решена с использованием миелоидного антимикробного пептида овцы SMAP-29. Однако из-за наличия гидрофобной части SMAP-29 обладает выраженным гемолитическим действием, что ограничивает его применение как антимикробного агента, несмотря на широкий спектр действия.

Авторами было проведено исследование, в котором выявляли зависимость антибактериальной и гемолитической активности от длины пептида и его первичной последовательности. После удаления и замены нескольких аминокислот авторами выявлена структура - [K2,7,13]-SMAP-29(1–17), т.е. последовательность пептида SMAP-29 модифицировали в положениях 2,7 и 13 с введением положительно заряженных остатков лизина. Указанный пептид обладает оптимальной активностью и не проявляет нежелательной цитотоксичности по отношению к эритроцитам человека. При этом авторами выявлено, что SMAP-29 и его производные не являются бактерицидными веществами, они обладают способностью ингибировать рост бактерий. Так, например, минимальная ингибирующая концентрация [K2,7,13]-SMAP-29(1–17) против синегнойной палочки составляет 6 микромоль.

Таким образом, артилизин (AL-KPP10) на основе L-KPP10 (эндолизина антисинегнойного бактериофага КРР10) и фрагмента пептида SMAP-29 благодаря своим структурным составляющим обладает литическим действием на различные штаммы синегнойной палочки и позволяет быстро уничтожать целевые бактерии, не влияя на нормальную микрофлору организма. Он позволяет проводить антимикробную терапию различных видов инфекций, вызванных штаммами синегнойной палочки с множественной лекарственной устойчивостью, а также избавляться от бактерий, образовавших биопленки, внутрь которых доступ существующих антибактериальных средств затруднен.

Инфекции, вызываемые P. aeruginosa, клинически очень разнообразны. Синегнойную палочку часто обнаруживают в таких случаях как инфекции кожи при ожогах, язвах и пролежнях. Также встречается синегнойная инфекция глаз, которая может проявляться в виде появления язв на роговице. Частым случаем являемся воспаление наружного уха, которое характеризуется выделением гноя из слухового канала. При операциях на сердце возможно такое поражение сердечно-сосудистой системы как эндокардит, последствием которого становится появление новых очагов инфекции в различных внутренних органах (мозг, легкие, надпочечники и др.). Также часто после манипуляций на мочевыводящих путях синегнойная палочка обнаруживается в мочеполовой системе. Существенную роль P. aeruginosa играет и при развитии внутрибольничной пневмонии, так как может передаваться при таких медицинских вмешательствах как искусственная вентиляция легких, интубация трахеи и даже использование многоразовых ингаляторов. В случае генерализации инфекционного процесса возникает бактериемия, последствием которой является сепсис, попадание бактерий в другие органы и высокая вероятность смерти.

Лечение и профилактика различных видов инфекций, вызванных синегнойной палочкой и другими чувствительными к действию данных фаголизинов грамотрицательными бактериями, может осуществляться с использованием различных препаратов, содержащих эффективную дозу активного вещества.

В этом случае технический результат достигается использованием антибактериальной композиции, проявляющей активность в отношении грамотрицательных бактерий, преимущественно P. aeruginosa, которая содержит эффективное количество (дозу) рекомбинантного белка (артилизина AL-KPP10) и фармацевтически приемлемый носитель.

Технический результат достигается также использованием антибактериальной композиции, проявляющей активность в отношении грамотрицательных бактерий, преимущественно P. aeruginosa, содержащей эффективное количество эндолизина L-KPP10 антисинегнойного бактериофага КРР10, пермеабилизатор и фармацевтически приемлемый носитель. Эндолизин L-KPP10 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 2 В качестве пермеабилизаторов могут использоваться полимиксины и их производные, аминогликозиды, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), лимонная кислота и др.

Термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые и все растворители, добавки, вспомогательные вещества, дисперсионные среды, солюбилизирующие агенты, покрытия, консерванты, изотонические и абсорбционные агенты, поверхностно-активные вещества, пропелленты и тому подобное, которые являются фармацевтически совместимыми. Носитель должен быть «приемлемым» в плане безвредности для субъекта, которому вводят препарат на основе объектов формулы изобретения в количествах, обычно используемых в лекарственных препаратах. Фармацевтически приемлемые носители совместимы с другими ингредиентами композиции без превращения композиции в непригодную для применения по назначению. Кроме того, фармацевтически приемлемые носители пригодны для использования без проявления серьезных нежелательных реакций (таких как токсичность, раздражение и аллергическая реакция). Побочные эффекты «неоправданы», когда их риск их появления превышает преимущество от применения композиции. Неограничивающие примеры фармацевтически приемлемых носителей или вспомогательных веществ включают в себя любой из стандартных фармацевтических носителей, таких как солевые растворы, вода и эмульсии, такие как эмульсии масло/вода и микроэмульсии.

Термин «эффективное количество» относится к количеству, которое при применении или назначении с соответствующей частотой приема или в определенном режиме дозирования является достаточным для предотвращения или ингибирования роста бактерий или предотвращения развития, улучшения течения, уменьшения тяжести, продолжительности или прогрессирования инфекционного заболевания, вызывает регрессию заболевания или усиливает или улучшает профилактический или терапевтический эффект другого метода лечения, такого как антимикробная терапия.

Термин «биопленка» относится к бактериям, которые прикрепляются к поверхностям и погружены в выделяемый ими внеклеточный матрикс. Биопленка представляет собой совокупность микроорганизмов, где клетки прилипают друг к другу на какой-либо поверхности. Эти адгезивные клетки часто погружены во внеклеточный матрикс из полимерного вещества. Биопленка представляет собой полимерную конгломерацию, обычно состоящую из внеклеточной ДНК, белков и полисахаридов.

Иллюстрации, поясняющие сущность изобретения

На иллюстрациях приведены поясняющие графические материалы, раскрывающие сущность изобретения. Указанные материалы не ограничивают объем притязаний заявителя и должны использоваться для пояснения существа заявленного технического решения.

На фиг. 1 приведены изображения фракций эндолизина (L-KPP10) и артилизина (AL-KPP10) бактериофага KPP10: на фиг. 1 а – приведена фотография двух фракций L-KPP10, полученных в клетках М15; на фиг. 1 б – фракций AL-KPP10, полученных в клетках М15. Молекулярная масса белков составляет 25 кДа.

На фиг. 2 приведена диаграмма, позволяющая сравнить действие эндолизина L-KPP10 в различных концентрациях с контролем на примере штамма P. aeruginosa РА103.

На фиг. 3 приведена диаграмма, показывающая действие различных концентраций L-KPP10 с добавлением 0,5 мМ ЭДТА на P. aeruginosa РА103. Уровень значимости р=0,05 (критерий Манна-Уитни).

На фиг. 4 приведены фотографии, подтверждающие, что добавление 0,5 мМ ЭДТА к L-KPP10 в концентрациях 25 и 50 мкг/мл приводит к появлению антимикробного эффекта.

На фиг. 5 приведен пример бактерицидного действия AL-KPP10 на P. aeruginosa, клинический изолят Ts 49-16. Слева – контроль, справа – эффект белка в концентрациях 50, 25 и 12,5 мкг/мл.

На фиг. 6 – диаграмма суммарной активности AL-KPP10 на пяти чувствительных штаммах/клинических изолятах P. aeruginosa. Уровень значимости составляет р<0,01 (критерий Манна-Уитни).

На фиг. 7 приведены фотографии, где А – клинический изолят P. aeruginosa Ts 43-16 без добавления AL-KPP10; Б, В, Г – лизис бактериальных клеток синегнойной палочки под действием 50 мкг/мл AL-KPP10.

Далее приведены аминокислотные и нуклеотидные последовательности: первая из которых аминокислотная последовательность эндолизина L-KPP10 фага KPP10 (SEQ ID NO: 1); вторая – нуклеотидная последовательность эндолизина фага KPP10 (SEQ ID NO: 2); третья – аминокислотная последовательность артилизина AL-KPP10 – эндолизина фага KPP10 слитого в одной рамке трансляции с модифицированным пептидом SMAP-29 (SEQ ID NO: 3); четвертая – нуклеотидная последовательность артилизина AL-KPP10 – эндолизина фага KPP10 слитого в одной рамке трансляции с модифицированным пептидом SMAP-29 (SEQ ID NO: 4).

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Были получены два рекомбинантных белка: эндолизин L-KPP10 и артилизин AL-KPP10 (фиг. 1), содержащий в своей структуре модифицированный фрагмент миелоидного антимикробного пептида SMAP-29 ([K2,7,13]-SMAP-29(1–17)).

Белок L-KPP10 сам по себе не обладает бактерицидной активностью в исследованных концентрациях по отношению к протестированным штаммам синегнойной палочки при инкубации белка с 10⁶ КОЕ бактерий P. aeruginosa РА103. На фиг. 2 видно, что действие L-KPP10 на штамм РА103 достоверно не отличается от контроля. Известно, что применение для элиминации грамотрицательных патогенов фаголизинов в чистом виде может быть затруднено из-за наличия наружной мембраны, экранирующей пептидогликан от действия фермента, поэтому необходимы вещества, увеличивающие проницаемость наружной мембраны. В качестве пермеабилизаторов могут использоваться полимиксины и их производные, аминогликозиды, ЭДТА, лимонная кислота и др.

Добавление ЭДТА или ее динатриевой соли в концентрации 0,5 мМ способствует проявлению антимикробных свойств L-KPP10 и значительному снижению числа колоний, выросших на чашках Петри после инкубации смеси эндолизина, ЭДТА и бактерий в течение 30 минут (фиг. 3). На фиг. 4 представлены фотографии чашек Петри, на которых можно увидеть, что добавление раствора ЭДТА в концентрации 0,5 мМ приводит к появлению антибактериального эффекта L-KPP10 в концентрациях 25 и 50 мкг/мл на штамме синегнойной палочки РА103.

Бактериолитические свойства AL-KPP10 оценивались на штамме РА103, а также 6 клинических изолятах P. aeruginosa. При этом было обнаружено, что данный белок обладает бактерицидной активностью против 5 из них, что показано в таблице 1.

Таблица 1. Антибактериальный эффект AL-KPP10 на различных штаммах и клинических изолятах синегнойной палочки

Штамм/клинический изолят P. aeruginosa	Наличие эффекта
PA103	+
Ts 38-16	–
Ts 43-16	+
Ts 44-16	+
Ts 47-16	–
Ts 48-16	+
Ts 49-16	+

Инкубация AL-KPP10 с 10⁶ КОЕ чувствительных штаммов синегнойной палочки в течение 30 минут при комнатной температуре значительно снижает количество бактерий, выросших на чашках Петри (фиг. 5), что показано на примере клинического изолята Ts 49-16.

На фиг. 6 представлен график суммарной активности AL-KPP10 на все исследованные чувствительные штаммы и клинические изоляты. Видно, что артилизин проявляет достоверный бактерицидный эффект в концентрациях 12,5 мкг/мл и выше по сравнению с контролем. Также видно, что в концентрации 100 мкг/мл эффект белка ухудшается по сравнению с 25 и 50 мкг/мл. Это может быть связано с тем, что при повышенном содержании белок образует большие агрегаты, препятствующие его действию. Однако в целом количество бактерий снижается на 5 порядков после инкубации AL-KPP10 с 10⁶ КОЕ чувствительных штаммов синегнойной палочки.

Способность AL-KPP10 расщеплять пептидогликан и лизировать бактерии синегнойной палочки была подтверждена с помощью электронной микроскопии (фиг. 7). После инкубации 50 мкг/мл белка с 10⁶ КОЕ чувствительного клинического изолята Ts 43-16 P. aeruginosa в течение 30 минут, были приготовлены препараты для микроскопии и сделаны фотографии.

Таким образом, добавление к молекуле L-KPP10 фрагмента SMAP-29, приводит к тому, что белок AL-KPP10 становится способен проникать через наружную мембрану синегнойной палочки и расщеплять пептидогликан, что в конечном итоге приводит к гибели бактерий. Значительное снижение количества колоний, выросших на чашках Петри, после инкубации бактерий и белка в течение небольшого количества времени, говорит о высокой активности AL-KPP10. Таким образом, данный артилизин является перспективной молекулой для борьбы с внутрибольничными патогенами, включая P. aeruginosa.

Пример 1. Получение генно-инженерных конструкций.

Последовательности генов, кодирующих белки эндолизин L-KPP10 и артилизин AL-KPP10, были получены с использованием коммерческого синтеза (Евроген, Россия) в составе вектора pAL2-T. Последовательность была проверена на отсутствие ошибок с использованием секвенирования по Сэнгеру. В дальнейшем синтезированный ген в векторе pAL2-T, кодирующий последовательность L-KPP10, был расщеплен эндонуклеазами рестрикции по сайтам BamH – SacI и BamHI – PstI соответственно. По тем же сайтам был расщеплен экспрессионный вектор pQE-30. Полученные рестрикционные фрагменты разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле и после визуализации в УФ-свете выделяли необходимые фрагменты с помощью специального набора «Silica Bead DNA Extraction Kit» (Thermo, США). Далее проводили лигирование соответствующих рестрикционных фрагментов вставки и вектора в стандартном лигазном буфере T4 лигазой.

Пример 2

Получение рекомбинантных белков AL-KPP10 и L-KPP10.

Два полученных экспрессионных вектора pQE-30 (несущих гены AL-KPP10 и L-KPP10) помещали в компетентные клетки Escherichia coli штамма М15 с помощью трансформации методом «Heat Shock» для дальнейшей продукции белков. Для этого к компетентным клеткам добавляли полученные лигазные смеси, инкубировали в течение 25 мин на льду, затем нагревали при 42 °С в течение 45 с, помещали на лед на 2 мин, а затем добавляли среду LB, подращивали клетки при 37 °С в течение 1 ч и высевали на чашки Петри. После инкубации чашек Петри при 37 °С в течение ночи, полученные колонии высевали в жидкую среду LB с необходимыми антибиотиками. После наращивания клеток-продуцентов до OD600 = 0,6 и индукции в течение 3 ч с помощью добавления 1 мМ IPTG проводили очистку на колонке с Ni-NTA – агарозой. Для этого индуцированные клетки лизировали буфером, содержащим 6 М гидрохлорида гуанидина, 10 мМ Трис, 100 мМ NaH2PO4•H2O (рН 8,0) в течение 1 ч, а затем лизат, в котором находится целевой белок, наносили на колонку в режиме gravity flow. Белок элюировали с сорбента путем понижения pH в градиенте буферов (состоящем из 8 М мочевины, 10 мМ Трис, 0,1 М NaH2PO4•H2O, при рН от 8,0 до 5,5).

Далее полученные фракции белков AL-KPP10 и L-KPP10 очищали с помощью аффинной хроматографии на колонке HisTrap HP (GE Healthcare, Великобритания). Раствор белка наносили на колонку в буфере, состоящем из 8 М мочевины, 10 мМ Трис, 0,1 М NaH2PO4•H2O, 10 мМ имидазола. Целевой белок элюировали с колонки с помощью буфера, содержащего 8 М мочевину, 10 мМ Трис, 100 мМ Na2HPO4 и 500 мМ имидазола (pH 5,5). Полученные фракции белков диализовали от буфера, в состав которого входят 5 мМ HEPES и 1 мМ DTT (pH 5,5) при 4 °С.

Концентрацию белков измеряли спектрофотометрически. Измерялась оптическая плотность растворов белков при 280 нм. Концентрация рассчитывалась с учетом коэффициента поглощения E^0,1% _280нм, равного 1,455 и рассчитанного с помощью приложения ProtParam.

Пример 3

Изучение бактерицидной активности AL-KPP10 и L-KPP10

Использовали препараты L-KPP10 и AL-KPP10, очищенные на хроматографической колонке и диализованные против буфера, содержащего 5 мМ HEPES и 1 мМ DTT (рН 5,5). Концентрацию белков доводили до необходимой тем же буфером.

Ночную культуру (2 мл в LB) бактериального штамма разбавляли и подращивали до оптической плотности OD600=0,6. Полученную культуру (2 мл) осаждали центрифугированием (3000 g, 10 мин), клетки ресуспендировали в таком же объеме 5 мМ HEPES (рН 5,5); мутность полученной суспензии должна соответствовать стандарту мутности МакФарланда 0,5. Далее бактериальную культуру разбавляли в 100 раз таким же буфером (конечная плотность клеток составляет 106 клеток/мл). В 96-луночном планшете готовли следующие смеси:

1. 100 мкл суспензии бактерий, 50 мкл препарата в нужной концентрации и 50 мкл ЭДТА или ее соли (конечная концентрация 0,5 мМ);

2. 100 мкл суспензии бактерий, 50 мкл препарата в нужной концентрации и 50 мкл лизоцима (конечная концентрация 10 мг/мл);

3. 100 мкл суспензии бактерий и 100 мкл препарата в нужной концентрации;

4. 100 мкл суспензии бактерий и 100 мкл буфера (контроль).

Полученные смеси инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем делали 10-кратные разведения в фосфатном буфере и 100 мкл каждого разведения наносили на чашки Петри с агаризованной средой LB. Колонии на чашках подсчитывали после ночной инкубации при 37°С.

В микробиологических исследованиях был задействован штамм P. aeruginosa РА103, а также клинические изоляты Ts 38-16, Ts 43-16, Ts 44-16, Ts 47-16, Ts 48-16 и Ts 49-16, полученные в ФНИЦЭМ имени Н.Ф. Гамалеи.

Эндолизин L-KPP10 и артилизин AL-KPP10 в чистом виде, а также в комбинациях с различными средствами, увеличивающими проницаемость мембран, антимикробными пептидами и антимикробными средствами (в том числе антибиотиками) можно использовать в различных областях медицины, ветеринарии, сельском хозяйстве и пищевой промышленности.

Данные активные субстанции могут использоваться в виде подходящих лекарственных форм (раствор, аэрозоль, мазь и др.) для лечения и профилактики различных видов инфекций, вызванных синегнойной палочкой и другими чувствительными к действию данных фаголизинов грамотрицательными бактериями. К таким инфекциям относятся эндокардит, респираторные инфекции (пневмонии), инфекции центральной нервной системы (менингит и абсцессы головного мозга), ушные и глазные инфекции (например, отит и кератит), бактериемия, инфекции кожных структур и мягких тканей (в том числе раневые и ожоговые), инфекции костей и суставов, инфекции мочевыводящих путей, инфекции желудочно-кишечного тракта и другие. Также возможно использование препаратов на основе L-KPP10 и AL-KPP10 для лечения пневмоний, сопутствующих муковисцидозу. При введении препарата, содержащего эффективную дозу активного вещества, местно, ингаляционно, внутримышечно, подкожно или внутривенно можно ожидать благоприятный исход течения инфекционного заболевания и быструю элиминацию патогенов.

Также L-KPP10 и AL-KPP10 можно использовать для быстрой и точной диагностики с целью определения возбудителя инфекции и своевременного начала терапии, а также для определения чувствительности различных штаммов бактерии к данным ферментам. Возможно создание различных систем детекции и биосенсоров на их основе.

Одной из наиболее важных проблем в медицине является образование грамотрицательными патогенами биопленок на различных поверхностях (в том числе медицинских инструментов). Бактерии внутри биопленок значительно меньше подвержены воздействию антимикробных средств и дезинфектантов. L-KPP10 и AL-KPP10 в виде раствора или любых других подходящих форм можно использовать для устранения биопленок, а также для дезинфекции инструментов (особенно используемых при различных хирургических манипуляциях), материалов, аппаратуры (в том числе аппаратов для искусственной вентиляции легких) и поверхностей.

В ветеринарии и сельском хозяйстве L-KPP10 и AL-KPP10 также можно использовать для лечения и профилактики инфекций животных, вызываемых синегнойной палочкой и другими чувствительными к действию данных фаголизинов грамотрицательными бактериями. Примером является псевдомоноз у таких пушных зверей как норки, а также у сельскохозяйственных животных (свиньи, коровы, овцы).

В пищевой промышленности L-KPP10 и AL-KPP10 можно использовать для предотвращения контаминации воды и пищевых продуктов чувствительными к действию данных фаголизинов грамотрицательными бактериями, а также для удаления биопленок и дезинфекции различных поверхностей.

Claims

1. Рекомбинантный белок, обладающий антибактериальной активностью в отношении бактерий Pseudomonas aeruginosa, представляющий собой ковалентно сшитые эндолизин антисинегнойного бактериофага КРР10 и модифицированный фрагмент миелоидного антимикробного пептида овцы SMAP-29 [K2,7,13]-SMAP-29(1–17) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3.

2. Антибактериальная композиция, проявляющая активность в отношении грамотрицательных бактерий Pseudomonas aeruginosa, содержащая эффективное количество белка по п. 1 и фармацевтически приемлемый носитель.