CN106659748B - 不动杆菌属溶素 - Google Patents
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Abstract
针对革兰氏阴性细菌具有杀灭活性的不动杆菌属溶素多肽和变体肽。用于使用不动杆菌属溶素多肽治疗细菌性感染或细菌定殖的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本PCT申请要求2014年6月26日提交的美国临时申请序列号62/017,618的优先权，所述美国临时申请的公开内容据此以引用的方式整体并入本文。
序列表
本申请以引用的方式整体并有2015年6月24日创建，并且与此一起电子提交，题为“235932-373399_Sequence_Listing_ST25”的序列表(57KB)。
领域
包含对不动杆菌属(Acinetobacter)具有特异性的噬菌体溶解酶的组合物和用于治疗不动杆菌属感染的方法。
背景
鲍氏不动杆菌-乙酸钙复合体(Acinetobacter baumannii-calcoaceti cuscomplex)和这个种类的其它成员常常在无伤害下定殖于人皮肤。然而，由刮擦、创伤或手术对皮肤所致的损伤可导致不动杆菌属感染创伤、血液、软组织和中枢神经系统。鉴于>80％的不动杆菌属种也具有多重抗药性(MDR)(至少三类抗生素)，这些感染可导致不利临床结果，包括高致病率和致死率、医院停留延长和大量健康护理费用。军事人员和运动员具有增加的将易受不动杆菌属种感染的损伤(从皮肤磨损直至重度创伤)的风险，因此用以将它们快速和有效移除的方法将减少或消除下游并发症。由MDR不动杆菌属引起的暴发已在全世界的医院中被报道；更新近地，它们已成为军事医学机构中的严重问题。由于它的MDR，所以不动杆菌属感染难以治疗，因此由这些生物体达成的感染通常导致不良结果。因此，需要控制这个病原体的新的和更好方式。
现已报道对所有已知抗生素都具有抗性的鲍氏不动杆菌菌株。与这个出现的抗性概况协同起作用的是鲍氏不动杆菌具有在整个医院环境中持续延长时期存活的离奇能力，由此增强它达成医院扩散的能力。所述生物体通常以在皮肤完整性和气道保护方面具有缺口的病危住院受试者为目标。因此，医院获得性肺炎仍然是由鲍氏不动杆菌引起的最常见感染。然而，近来，涉及中枢神经系统、皮肤和软组织以及骨的感染已作为某些机构的高度问题性感染而出现。由于这个抗性问题，所以必须开发用以控制这些病原体的新方法。
已鉴定称为噬菌体编码溶素(lysin)的抗微生物剂。噬菌体是感染细菌的病毒，并且据估计存在106个不同噬菌体种类。噬菌体溶素通常具有属特异性或种特异性，即金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)噬菌体溶素可仅针对金黄色葡萄球菌具有活性，从而提供靶向治疗方法。在一些情况下，溶素可具有针对若干属或种的活性。
噬菌体感染它们的宿主细菌以产生更多病毒粒子。在繁殖周期结束时，它们面临一个问题，即如何释放圈闭在细菌内的子代噬菌体。它们通过产生称为“溶素”的酶来解决这个问题，所述酶降解受感染细菌的细胞壁以释放子代噬菌体。溶解系统由穿孔素(holin)和至少一种能够降解细菌细胞壁的肽聚糖水解酶或溶素组成。通常，穿孔素在噬菌体感染的晚期表达，从而在细胞膜中形成孔，允许溶素到达细胞壁肽聚糖，导致子代噬菌体释放。值得注意的是，外源添加的溶素在不存在穿孔素下可溶解健康未感染细胞的细胞壁，从而产生称为“自外溶解(lysis from without)”的现象。
概述
我们近来已鉴定、纯化和表征特异性攻击不动杆菌属细菌的若干噬菌体溶素。这是一个突破，因为大多数溶素仅针对革兰氏阳性细菌具有抗细菌活性。本发明的纯化噬菌体溶素充分适合于多种应用，诸如治疗细菌性感染和消毒。
附图简述
图1A.显示从鲍氏不动杆菌菌株1790诱导的噬菌体的负染色电子显微照片。
图1B.显示从鲍氏不动杆菌菌株1794诱导的噬菌体的负染色电子显微照片
图1C.显示从鲍氏不动杆菌菌株1796诱导的噬菌体的负染色电子显微照片
图2.使包埋在琼脂中的活体鲍氏不动杆菌清亮的溶素克隆活性的代表性图像。
图3.显示以下四类溶解活性的克隆溶素的氨基酸序列的示意图：i)糖基水解酶家族，ii)噬菌体基板溶菌酶，iii)溶菌酶自溶素，和iv)溶素。
图4.克隆溶素的核苷酸序列的比对。
图5.克隆溶素的氨基酸序列的比对。
图6.是显示21个克隆构建体针对13个不同鲍氏不动杆菌临床分离株的溶解活性的图。
图7A和7B.在用F307处理之后观察到来自鲍氏不动杆菌细胞的含有胞质内含物的细胞质膜的起泡(箭号)。
图8.在用F307多肽处理之前和之后，鲍氏不动杆菌菌株1791的3天生物膜的扫描电子显微照片。
图9.是显示在用F307多肽处理之后，具有不动杆菌生物膜的整个导管块段上的细菌计数降低的图。
图10.是显示相对于对照，用F307多肽处理的被鲍氏不动杆菌感染的小鼠的存活率的图。
图11.F307、不具有以及具有短延伸部分(P307Ex)的P307多肽的序列。
图12.图12A是比较P307、P307SQ-8C和P307AE-8针对鲍氏不动杆菌菌株#1791、S5和ATCC17978的体外杀细菌活性的图。图12B显示P307、P307SQ-8C和P307CS-8针对鲍氏不动杆菌菌株#1791和S5的比较体内杀细菌活性。图12C显示P307SQ-8C和P307CS-8针对鲍氏不动杆菌菌株#1791、S5和ATCC17978的比较体内杀细菌活性的比较。
图13.用以探究pH最优值(13A)和NaCl最优值(13B)的P307和P307SQ-8C针对鲍氏不动杆菌菌株#1791的体外杀细菌活性。除变量之外的相同条件与50mM Tris-HCl(pH 7.5)一起用于测定浓度最优值(13C)和杀灭动力学(13D)。误差棒显示标准偏差，并且黑色水平线标记检测限。
图14.是显示不同细菌物种对P307和P307SQ-8C的敏感性的图。误差棒显示标准偏差，并且黑色水平线标记检测限。
图15.图15A和15B是显示P307和P307SQ-8C针对对数期和静止期鲍氏不动杆菌菌株1791号(15A)和生物膜期(15B)的杀细菌活性的图。
图16.图16显示如通过B细胞存活(16A)和溶血(16B)度量的P307和P307SQ-8C的细胞毒性作用。
图17.图17A显示DTT在0、0.1和1mM下对P307和P307SQ-8C的活性的影响。图17B显示用丙氨酸取代P307SQ-8C的末端半胱氨酸残基(P307SQ-8A)的影响。
图18.是显示对照肽和P307的变动的DNA变动凝胶。
图19.图19A-C显示鲍氏不动杆菌菌株1791号的代表性透射电子显微术图像：未处理对照(19A)，用300μg/mL P307SQ-8C处理5分钟(19B)和2小时(19C)。放大倍数，×2600(左侧，比例尺＝2μm)和×5000(右侧顶部和底部，比例尺＝0.5μm)。图19D显示P307SQ-8C在pH7.5和8.8下对革兰氏阴性细菌肺炎克雷伯氏菌和大肠杆菌的杀细菌活性。
图20.显示用P307和P307SQ-8C处理的鲍氏不动杆菌菌株#1791和S5的膜可渗透性。
图21.显示由羟基自由基清除剂硫脲和厌氧条件对P307或P307SQ-8C的杀细菌活性的抑制。
图22.显示用多粘菌素B和P307SQ-8C治疗皮肤感染的作用。
详述
本发明提供具有抗细菌活性的多肽和用于使用所公开多肽的方法。除非上下文另外明确规定，否则如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述/该”包括复数个提及物。
诸如“包含(comprises/comprised/comprising)”、“含有(contains/containing)”等的术语具有美国专利法中归结的含义；它们是包括性或开放式的，并且不排除另外的未叙述的要素或方法步骤。诸如“基本上由…组成(consisting essentiallyof/consists essentially of)”的术语具有美国专利法中归结的含义；它们允许包括不实质上影响要求保护的发明的基本和新特征的另外的成分或步骤。术语“由…组成(consists of/consisting of)”具有美国专利法中归于它们的含义；即这些术语是封闭式的。
在第一方面，本发明提供多肽或多肽的片段，所述多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20或SEQ ID NO:21具有至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或100％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽或片段具有抗细菌活性。
在第一方面的另一实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ IDNO:21具有至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或100％同一性的氨基酸序列，或多肽的片段，其中所述多肽或片段具有抗细菌活性。
在第一方面的另一实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ IDNO:21具有100％同一性的氨基酸序列，或多肽的片段，其中所述多肽或片段具有抗细菌活性。
在第二方面，本发明提供多肽或多肽的片段，所述多肽由与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21具有至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或100％同一性的氨基酸序列组成，其中所述多肽或片段具有抗细菌活性。
在第二方面的另一实施方案中，多肽由与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21具有至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或100％同一性的氨基酸序列组成，或多肽的片段，其中所述多肽或片段具有抗细菌活性。
在第二方面的另一实施方案中，多肽由与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21具有100％同一性的氨基酸序列组成，或多肽的片段，其中所述多肽或片段具有抗细菌活性。
在第三方面，本发明提供多肽或多肽的片段，所述多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20或SEQ ID NO:21具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或100％同一性的氨基酸序列，其中使所述多肽或片段缀合于抗微生物肽以产生缀合多肽，并且所述缀合多肽具有抗细菌活性。
在第三方面的一个实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ IDNO:21具有至少90％、或至少92％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或100％同一性的氨基酸序列，或多肽的片段，其中使所述多肽或片段缀合于抗微生物肽以产生缀合多肽，并且所述缀合多肽具有抗细菌活性。
在第四方面，本发明提供多肽或多肽的片段，所述多肽由与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或100％同一性的氨基酸序列组成，其中使所述多肽或片段缀合于抗微生物肽以产生缀合多肽，并且所述缀合多肽具有抗细菌活性。
在第四方面的一个实施方案中，多肽由与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21具有至少90％、或至少92％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或100％同一性的氨基酸序列组成，或多肽的片段，其中使所述多肽或片段缀合于抗微生物肽以产生缀合多肽，并且所述缀合多肽具有抗细菌活性。
在第三或第四方面的一些实施方案中，抗微生物肽包含氨基酸序列SQSRESQC(SEQID NO:44)，其中至少一个氨基是半胱氨酸，并且抗微生物肽的0、1、2、3、4、5、6或7个氨基酸被保守取代。抗微生物肽的0、1、2、3、4、5、6或7个氨基酸被保守取代。在第三或第四方面的其它实施方案中，抗微生物肽包含氨基酸序列SQSRESQC(SEQ ID NO:44)。在第三或第四方面的其它实施方案中，抗微生物肽包含氨基酸序列SQSRESQC(SEQ ID NO:44)，其中抗微生物肽的0、1、2、3、4、5、6或7个氨基酸被保守取代，并且抗微生物肽由8个氨基酸组成。在第三或第四方面的其它实施方案中，抗微生物肽由氨基酸序列SQSRESQC(SEQ ID NO:44)组成。
在第三或第四方面的一些实施方案中，抗微生物肽包含氨基酸序列CSQRQSES(SEQID NO:50)，其中至少一个氨基是半胱氨酸，并且抗微生物肽的0、1、2、3、4、5、6或7个氨基酸被保守取代。在第三或第四方面的其它实施方案中，抗微生物肽包含氨基酸序列CSQRQSES(SEQ ID NO:50)。在第三或第四方面的其它实施方案中，抗微生物肽包含氨基酸序列CSQRQSES(SEQ ID NO:50)，其中抗微生物肽的0、1、2、3、4、5、6或7个氨基酸被保守取代，并且抗微生物肽由8个氨基酸组成。在第三或第四方面的其它实施方案中，抗微生物肽由氨基酸序列CSQRQSES(SEQ ID NO:50)组成。
在第三或第四方面的一些实施方案中，使多肽或片段的C末端缀合于抗微生物肽。在第三或第四方面的其它实施方案中，使多肽或片段的C末端缀合于抗微生物肽的N末端。在第三或第四方面的其它实施方案中，使多肽或片段的N末端缀合于抗微生物肽。在第三或第四方面的其它实施方案中，使多肽或片段的N末端缀合于抗微生物肽的C末端。对于第三或第四方面的任何实施方案，可使抗微生物肽经由肽键缀合于多肽或片段。
本公开的肽的另一实施方案是具有氨基酸序列NAKDYKGAAAEFPKWNKAGGRVLAGLVKRRKSQSRESQA(SEQ ID NO:53)的肽。另一实施方案是具有氨基酸序列NAKDYKGAAAEFPKWNKAG GRVLAGLVKRRKCSQRQSES(SEQ ID NO:51)的肽。
在一些实施方案中，多肽、多肽片段或缀合多肽针对革兰氏阴性细菌具有抗细菌活性。在一些实施方案中，革兰氏阴性细菌为不动杆菌属。
在一些实施方案中，多肽、多肽片段或缀合多肽针对大肠杆菌(E.coli)、绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)或鲍氏不动杆菌具有抗细菌活性。
在一些实施方案中，多肽、多肽片段或缀合多肽针对革兰氏阳性细菌具有抗细菌活性。在一些实施方案中，革兰氏阳性细菌是金黄色葡萄球菌或炭疽杆菌(B.anthracis)。
在一些实施方案中，多肽被冻干。
本发明的多肽的特定实施方案提供在表1中。
表1
P307SQ-8C和P307Ex在本文中可互换使用。
本发明也提供包含本发明的多肽、多肽片段或缀合多肽的药物组合物。在一些实施方案中，组合物是药物组合物，其包含药学上可接受的载体、缓冲剂或防腐剂。
在一些实施方案中，药物组合物被配制供局部施用。在其它实施方案中，药物组合物被配制供皮下递送。在其它实施方案中，药物组合物被配制供静脉内递送。在其它实施方案中，药物组合物被配制供口服递送。
在一些实施方案中，组合物进一步包含抗生素。适合抗生素的实例包括但不限于阿莫西林(amoxicillin)、奥格门汀(augmentin)、阿莫西林、氨苄青霉素(ampicillin)、阿洛西林(azlocillin)、氟氯西林(flucloxacillin)、美洛西林(mezlocillin)、甲氧西林(methicillin)、青霉素G(penicillin G)、青霉素V(penicillin V)、头孢氨苄(cephalexin)、头孢西酮(cefazedone)、头孢呋辛(cefuroxime)、氯拉卡比(loracarbef)、头孢美唑(cemetazole)、头孢替坦(cefotetan)、头孢西丁(cefoxitin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、左氧氟沙星(levaquin)和诺氟沙星(floxacin)、四环素(tetracycline)、多西环素(doxycycline)或米诺环素(minocycline)、庆大霉素(gentamycin)、阿米卡星(amikacin)以及妥布霉素(tobramycin)、克拉霉素(clarithromycin)、阿奇霉素(azithromycin)、红霉素(erythromycin)、达托霉素(daptomycin)、新霉素(neomycin)、卡那霉素(kanamycin)或链霉素(streptomycin)。
在一些实施方案中，药物组合物进一步包含凝结剂。
在一些实施方案中，药物组合物被冻干。
本发明也提供用于治疗有需要的受试者的方法，其包括向所述受试者施用包含本发明的多肽、多肽片段或缀合多肽和药学上可接受的载体、缓冲剂或防腐剂的药物组合物。
在一个实施方案中，方法是用于治疗有需要的受试者的方法，其包括向所述受试者施用包含本发明的多肽和药学上可接受的载体、缓冲剂或防腐剂的药物组合物。
在另一实施方案中，方法是用于治疗有需要的受试者的方法，其包括向所述受试者施用包含本发明的多肽片段和药学上可接受的载体、缓冲剂或防腐剂的药物组合物。
在一个实施方案中，方法是用于治疗有需要的受试者的方法，其包括向所述受试者施用包含本发明的缀合多肽和药学上可接受的载体、缓冲剂或防腐剂的药物组合物。
在一个实施方案中，方法是用于治疗患有细菌性感染的方法，并且所述治疗是治疗性治疗，其包括向受试者施用包含本发明的缀合多肽和药学上可接受的载体、缓冲剂或防腐剂的药物组合物。在一些实施方案中，受试者患有不响应于其它治疗模式的细菌性感染。举例来说，细菌性感染可对一种或多种抗生素具有抗性。在一个实施方案中，细菌性感染是创伤感染。
在一个实施方案中，方法是用于防治性治疗有需要的受试者的方法，其包括向所述受试者施用包含本发明的缀合多肽和药学上可接受的载体、缓冲剂或防腐剂的药物组合物。在一些实施方案中，受试者已经受或正经受手术，并且使手术创伤与本发明的药物组合物接触。在某些实施方案中，在闭合创伤之前，用药物组合物冲洗手术创伤。在其它实施方案中，在闭合之后将药物组合物施加于创伤，例如将药物组合物施加于创伤的缝合或卡钉区域。
在一些实施方案中，方法包括与抗生素组合施用本发明的药物组合物。在一些实施方案中，方法包括经局部施用本发明的药物组合物。在其它实施方案中，方法包括皮下施用本发明的药物组合物。在其它实施方案中，方法包括通过静脉内注射来施用本发明的药物组合物。在其它实施方案中，方法包括口服施用本发明的药物组合物。
在一些实施方案中，药物组合物呈单位剂型。在其它实施方案中，药物组合物呈乳膏剂、软膏剂、油膏剂、凝胶剂、糖锭、喷雾剂或气雾剂形式。
也提供用于治疗细菌性感染的方法，其包括抑制细菌生物膜的形成或破坏细菌生物膜，包括以有效杀灭所述生物膜中的细菌的量向有需要的受试者施用包含本发明的多肽、多肽片段或缀合多肽的组合物。
另外提供将物品消毒的方法，其包括使所述物品与包含本发明的多肽、多肽片段或缀合多肽的组合物接触足以将所述物品消毒的时间。在一些实施方案中，物品是坚硬表面。在一些实施方案中，物品是工作台面、键盘、手术仪器或医学装置。
另外提供用于抑制在物品上形成细菌生物膜或破坏物品上的细菌生物膜的方法，其包括使所述物品与有效杀灭所述生物膜中的细菌的量的本发明的多肽、多肽片段或缀合多肽接触。
也提供含有包含本发明的多肽、多肽片段或缀合多肽的组合物的制品。在一些实施方案中，制品是含有本发明的多肽、多肽片段或缀合多肽的喷雾瓶。
在一些实施方案中，制品含有包含本发明的多肽、多肽片段或缀合多肽和载体、缓冲剂或防腐剂的药物组合物。在一些实施方案中，制品是小瓶。在一些实施方案中，制品是递送装置。在一些实施方案中，由制品含有的组合物被冻干。
可在本公开的多肽的结构方面进行修改和变化，并且仍然获得与多肽具有类似特征的分子(例如保守性氨基酸取代)。举例来说，在序列中，某些氨基酸可被取代成其它氨基酸而无可观的活性损失。因为多肽的相互作用能力和性质限定那个多肽的生物功能活性，所以可在多肽序列中进行某些氨基酸序列取代，并且仍然获得具有类似性质的多肽。
所述氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对类似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑各种前述特征的示例性取代为本领域技术人员所熟知，并且包括(原始残基:示例性取代)：(Ala:Gly、Ser)、(Arg:Lys)、(Asn:Gln、His)、(Asp:Glu、Cys、Ser)、(Gln:Asn)、(Glu:Asp)、(Gly:Ala)、(His:Asn、Gln)、(Ile:Leu、Val)、(Leu:Ile、Val)、(Lys:Arg)、(Met:Leu、Tyr)、(Ser:Thr)、(Thr:Ser)、(Tip:Tyr)、(Tyr:Trp、Phe)和(Val:Ile、Leu)。因此，本公开的实施方案涵盖如上阐述的多肽的功能或生物等效物。特定来说，多肽的实施方案可包括与目标多肽具有约50％、60％、70％、80％、90％和95％序列同一性的变体。
如本领域中已知的“同一性”是两个或更多个多肽序列之间的如通过比较序列所确定的关系。“同一性”可易于通过本领域中熟知的已知算法来计算。用以确定同一性的优选方法被设计来给出所测试序列之间的最大匹配。用以确定同一性的方法被编纂在可公开获得的计算机程序中。可使用并有Needelman和Wunsch(J.Mol.Biol.,48:443-453,1970)算法的分析软件(即Genetics Computer Group(Madison Wis.)的序列分析软件包)(例如NBLAST和XBLAST)确定两个序列之间的同一性百分比。
同一性可测量为“局部同一性”或“整体同一性”。局部同一性是指多肽之间的如通过所述序列的串段之间的匹配确定的序列相关程度。整体同一性是指多肽相较于参照多肽的全长的序列相关程度。除非另外指定，否则如本文所用，同一性意指整体同一性。使用通过软件MacVector使用的ClustalW算法，利用缺省设置计算本文整体同一性的百分比；对于局部同一性与整体同一性两者均是如此。
多肽的产生
可通过任何已知方法来产生本发明的多肽。举例来说，可在包括不限于大肠杆菌的细菌中，或在用于获得多肽的其它现有系统(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、使用果蝇Sf9细胞的杆状病毒表达系统、酵母或丝状真菌表达系统、哺乳动物细胞表达系统)中产生多肽，或它们可被化学合成。
如果将在例如大肠杆菌的细菌中产生多肽，那么编码肽的核酸分子也可编码允许成熟肽从细胞分泌的前导序列。因此，编码肽的序列可包括天然存在的细菌ST肽的前序列和原序列。可从培养基纯化分泌的成熟肽。
可将编码本文所述的肽的序列插入能够将核酸分子递送和维持在细菌细胞中的载体中。可将DNA分子插入自主复制载体中(适合载体包括例如pGEM3Z和pcDNA3及其衍生物)。载体可为细菌或噬菌体DNA载体，诸如噬菌体λ或M13及其衍生物。在构建含有本文所述的核酸的载体之后可转化诸如细菌的宿主细胞。适合细菌宿主包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)。除编码核酸分子之外，遗传构建体也包括允许表达的元件，诸如启动子和调控序列。表达载体可含有控制转录起始的转录控制序列，诸如启动子、增强子、操纵子和阻遏物序列。多种转录控制序列为本领域中的人士所熟知。表达载体也可包括翻译调控序列(例如非翻译5'序列、非翻译3'序列或内部核糖体进入位点)。载体可能够自主复制，或它可整合至宿主DNA中以确保在肽产生期间的稳定性。
根据本发明的核酸的一个实施方案是编码多肽或多肽的片段的核酸，所述多肽包含与氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:45具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽或片段具有抗细菌活性。
在另一实施方案中，核酸编码多肽或多肽的片段，所述多肽包含氨基酸序列SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:45，其中所述多肽或片段具有抗细菌活性。
在另一实施方案中，核酸编码多肽或多肽的片段，所述多肽由氨基酸序列核酸SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:45组成，其中所述多肽或片段具有抗细菌活性。
在另一实施方案中，核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41或SEQID NO:42。
在另一实施方案中，核酸由核苷酸序列SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41或SEQID NO:42组成。
另一实施方案是包含核酸的表达载体，所述核酸编码多肽或多肽的片段，所述多肽包含与氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:45具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽或片段具有抗细菌活性。
在另一实施方案中，表达载体包含核酸，所述核酸编码多肽或多肽的片段，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:45，其中所述多肽或片段具有抗细菌活性。
在另一实施方案中，表达载体包含核酸，所述核酸编码多肽或多肽的片段，所述多肽由氨基酸序列核酸SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:45组成，其中所述多肽或片段具有抗细菌活性。
在另一实施方案中，表达载体包含核酸，所述核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42。
在另一实施方案中，表达载体包含核酸，所述核酸由核苷酸序列SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42组成。
表2提供本发明的核酸的特定实施方案，其显示对应于它们编码的多肽的核苷酸SEQ ID NO:。
表2
也可使编码本文所述的多肽的核酸融合于编码肽亲和标签，例如谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、FLAG标签、六组氨酸、myc标签或流感HA标签的核酸以有助于纯化。亲和标签或报道体融合使目标肽的阅读框接合于编码亲和标签的基因的阅读框以致产生翻译融合物。融合基因的表达导致翻译出包括目标肽与亲和标签两者的单一肽。在其中利用亲和标签的一些情况下，编码蛋白酶识别位点的DNA序列将被融合在亲和标签的阅读框与目标肽的阅读框之间。
适于在除细菌以外的蛋白质表达系统中产生本文所述的多肽和变体的不成熟和成熟形式，并且为本领域技术人员所熟知的遗传构建体和方法也可用于在生物系统中产生多肽。
可使用自动肽合成仪，通过固相方法来合成多肽及其变体。举例来说，可使用双重偶联程序在Cyc(4-CH2 Bxl)-OCH2-4-(氧基甲基)-苯基乙酰胺基甲基树脂上合成肽。也可通过许多其它方法来合成肽，包括使用传统FMOC保护的固相合成(即用DCC-HOBt偶联并用哌啶在DMF中脱保护)。
治疗性和防治性组合物和它们的用途
本发明提供治疗方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的本发明的多肽。受试者是人或另一动物，包括但不限于灵长类动物，诸如猴和黑猩猩；家畜动物，诸如母牛、猪、马或鸡；和伴侣动物，诸如狗、猫和啮齿动物。在一特定实施方案中，受试者是人。在另一特定实施方案中，受试者是非人哺乳动物。在一个实施方案中，多肽作为唯一抗细菌剂加以施用。在另一实施方案中，多肽与一种或多种其它抗细菌剂组合施用。
施用所公开药物组合物的方法可为口服或胃肠外方法，并且包括但不限于真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、关节内、滑膜内、皮下、鼻内、硬膜外、局部和口服途径。可通过任何适宜途径，例如通过输注或快速浓注，通过上皮或粘膜皮肤内衬(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)进行吸附来施用化合物，并且可连同其它生物活性剂一起施用。施用可为全身性的或局部的。此外，可合乎需要的是通过包括室内和鞘内注射的任何适合途径将本发明的药物组合物引入中枢神经系统中；室内注射可通过例如连接于储集器(诸如Ommaya储集器)的室内导管来促进。也可采用经肺施用，例如通过使用吸入器或雾化器以及与气雾化剂一起配制。在一特定实施方案中，可合乎需要的是向需要治疗的区域局部施用本发明的药物组合物，诸如在皮肤上局部使用；可使用为本领域所知的任何适合方法。
在一个方面，本发明提供用于治疗性或防治性治疗细菌性感染的包含本公开的多肽的药物组合物。本发明的一实施方案是被配制供局部治疗的药物组合物。本发明的另一实施方案是被配制针对全身感染的药物组合物。
所述组合物包含治疗有效量的本发明的多肽和药学上可接受的载体、缓冲剂或防腐剂。如本文所用的术语“药学上可接受的载体”包括但不限于如适合于所需特定剂型的溶剂、稀释剂、或其它液体媒介物、分散或混悬助剂、表面活性剂、等张剂、增稠剂或乳化剂、固体粘合剂、润滑剂等。所述药物载体可为无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。盐水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。适合药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。组合物也可含有湿润剂或乳化剂、防腐剂或pH缓冲剂。这些组合物可采用溶液、混悬液、乳液、片剂、丸剂、糖锭、胶囊、粉剂、用于局部施用的贴片等形式。对于局部应用，可将药学上可接受的组合物配制成含有混悬或溶解在一种或多种载体中的活性组分的适合软膏剂、洗剂或乳膏剂。用于局部施用的载体包括但不限于矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯-聚氧丙烯化合物、乳化蜡、聚山梨醇酯60、鲸蜡基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。组合物可用传统粘合剂和载体(诸如甘油三酯)配制成栓剂。口服制剂可包括标准载体，诸如药物等级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。本领域技术人员精通对治疗剂的配制。参见例如RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy,第20版,Lippincott Williams&White,Baltimore,Md.(2000)；Remington’s Pharmaceutical Sciences,第19版(MackPublishing Company,1995)。
本发明也提供一种药物包装或试剂盒，其包括一个或多个填充有本发明的药物组合物的一种或多种成分的容器。任选与所述容器相伴的是呈由管制药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构指定的形式的告示，所述告示反映(a)由制造、使用或销售的机构核准用于向人施用，(b)使用说明，或两者。
实施例
提出以下实施例以便向本领域技术人员提供如何制备和使用本文所述的多肽的另外的信息，并且不意图限制本发明者视为他们的发明的发明的范围。已努力确保关于所用数值(例如量、温度等)的准确性，然而，应虑及一些实验误差和偏差。除非另外指示，否则分子量是平均分子量，并且温度以摄氏度计。
实施例1
鉴定具有抗细菌活性的多肽。
从纽约医院获得15个鲍氏不动杆菌的临床分离株。将鲍氏不动杆菌菌株分离并用丝裂霉素C处理以诱导原噬菌体诱导。收集上清液，并且用聚乙二醇(PEG)使噬菌体沉淀。通过负染色EM来检查由3个鲍氏不动杆菌分离株获得的上清液，并且获取噬菌体的图像(图1A、1B和1C)。
通过琼脂糖凝胶电泳和提取高分子量DNA来使噬菌体DNA与共沉淀的化合物分离。由这个DNA，如先前所述构建可表达连接体鸟枪文库(E-LASL)。(Schmitz JE.等,2008,Appl.Environ.Microbiol.74:1649-1652.)简要来说，对于所有样品，用限制酶TSP509I(共有序列AATT)使100ng DNA片段化。在苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀之后，使DNA连接于40ng具有互补5’突出部分的连接体序列(AATTCGGCTCGAG，其中突出部分加下划线(SEQ ID NO:46))。连接混合物用作使用连接体靶向引物CCATGACTCGAGCCGAATT(SEQ ID NO:47)进行的基于Taq的PCR的模板。
根据制造商说明书，使用pBAD
TA表达试剂盒(Invitrogen)将扩增的插入物连接至阿拉伯糖诱导性pBAD质粒中。将重组载体转化至感受态大肠杆菌TOP10(Invitrogen)中。为确定哪些克隆具有溶解活性，将大肠杆菌涂铺在补充有100μg/ml氨苄青霉素和5％去纤维蛋白化绵羊血液的LB琼脂上。在37℃下过夜生长之后，将板放置在连接于商业雾化器的出口的密封容器中。持续1小时将雾化阿拉伯糖连续泵送至容器中。使板返回至37℃，并且鉴定在周围血液琼脂中产生溶血区的菌落。将所选克隆于单独LB-氨苄青霉素板(缺乏阿拉伯糖)上划线，并且使其在不诱导表达下繁殖。(Schmitz JE等,2010Appl.Environ.Microbiol.76:7181-7187)。
为确定对鲍氏不动杆菌的杀灭活性，基本上如Schmitz JE等,2010Appl.Environ.Microbiol.76:7181-7187中所述进行二级筛选。将命中物于补充有0.2％阿拉伯糖的LB-氨苄青霉素板上以约1cm乘2cm片块形式划线。在37℃下过夜孵育之后，使板暴露于氯仿蒸汽以杀灭和可渗透化任何仍然有活力的大肠杆菌。接着用含有鲍氏不动杆菌的熔融软琼脂覆盖片块，并且观察清亮区。鉴定了21个在克隆周围展现清亮区的阳性克隆。图2显示对使包埋在琼脂中的活体鲍氏不动杆菌清亮的溶素克隆活性的代表性筛选。
将阳性克隆的插入物测序并与NCBI蛋白质数据库中的序列进行比较。比对显示在21个克隆之中，存在四类溶解活性：i)9个属于糖基水解酶家族，ii)7个是噬菌体基板溶菌酶，iii)2个是溶菌酶自溶素，并且iv)3个是溶素。(图3)。为便于在本文中引用，无论类别如何，由这些序列编码的多肽都被称为“溶素”。图4显示基于编码21个克隆的核苷酸序列的类似性的序列比对。图5显示基于21个克隆的多肽序列的类似性的序列比对。
实施例2
阳性克隆的活性。
筛选21个不同构建体针对13个不同鲍氏不动杆菌临床分离株的活性。在大肠杆菌中重组表达构建体。使细胞在30℃、200rpm下生长，并且当达到对数中期时，通过添加0.2％阿拉伯糖来诱导它们。诱导持续过夜。在早晨，短暂离心细胞，用50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)洗涤3次，随后在Emulsiflex均质器中均质化。通过离心(16000g，45分钟)来移除细胞碎片，并且使溶解产物穿过0.22um无菌过滤器以产生粗制溶解产物。
使在TSB中生长过夜的鲍氏不动杆菌与50℃软琼脂TSB混合，并且倾于TSB琼脂板上作为顶部琼脂层。使板在室温中固化。添加粗制溶解产物(10ul)至具有鲍氏不动杆菌的软琼脂板中，并且每天在室温下孵育2小时，而在4℃下保持其余时间。将板孵育直至清亮区可见(4-5天)。对大于粗制溶解产物的原始斑点的清亮区评分。各溶素上方的数值指示溶素最高效针对的菌株数。
结果显示于图6中。溶素构建体显示在x轴上，并且溶解的不动杆菌属菌株的百分比显示在y轴上。各棒条上方的数值指示溶素最高效针对的菌株数，无数值指示1个菌株。如可见，溶素F307溶解约90％的测试菌株，并且针对7个菌株最具活性。
实施例3
由F307溶解鲍氏不动杆菌。
图7显示在用F307多肽处理之后鲍氏不动杆菌菌株1791细胞的代表性透射电子显微照片。显微照片显示F307通过将细胞质膜挤出至细胞外部来导致溶解。(参见图7，箭号)。将鲍氏不动杆菌菌株1791的两个100mL培养物起始于BHI培养基中，并且在37℃、200rpm下在500mL烧瓶中生长1.5小时。接着离心细胞，并且用1X PBS缓冲液洗涤一次。接着将它们再混悬于1.2mL 1X PBS中。将EDTA在最终浓度250μM下添加至各样品中。向实验样品中添加300μL溶素(约1.2mg最终浓度)，并且在25℃下孵育对照(单独EDTA)和实验(EDTA+F307溶素)样品。将时间点取在0.5、1、5、10、15和30分钟。将反应淬灭，并且使用含2.5％戊二醛的CAC缓冲液(10mm二甲胂酸钠、0.1m CaCl2，pH 6.5)固定细胞。
实施例4
F307多肽在体外和在体内对导管上鲍氏不动杆菌生物膜的影响。
用F307溶素体外处理导管粘着性鲍氏不动杆菌1791
使用无菌解剖刀将导管(CareFusion参考号72023E)切割成3英寸长的区段。鲍氏不动杆菌1791的过夜培养物用于1:1000接种50mL含0.2％葡萄糖的TSB(约1X105 CFU/mL)。用300-350μL 1:1000稀释培养物接种各3英寸导管。接着钳夹导管，并且于塑料容器中放置在37℃孵育器中3天以允许发生生物膜形成。在3天之后，用PBS或磷酸钠缓冲液(pH 7.5)洗涤导管两次，接着添加300-350μL F307至管中(约1mg最终浓度)。接着钳夹导管。在时间点0、15分钟、30分钟和1时间获取导管。用50mM磷酸钠(pH 7.5)洗涤导管两次，并且切割成小块段。将这些放置至1.5mL ependorff管中，并且添加500μL50mM NaP缓冲液(pH 7.5)。将管超声处理20分钟，并且涡旋1分钟。接着连续稀释样品，并且将20μL涂铺于四分之一BHI琼脂板上并在37℃下孵育过夜。次日早晨计算CFU。
观察到在处理30分钟之后，鲍氏不动杆菌的菌落形成单位(CFU)数下降约4对数。表3显示CFU计数。图8显示在用250μg F307多肽处理之前和之后，鲍氏不动杆菌菌株1791的3天生物膜的扫描电子显微照片。
表3.对导管上鲍氏不动杆菌生物膜的处理。
| 样品 | CFU |
| 不处理 | 1.4x10<sup>7</sup> |
| 不处理平行测定 | 3.0x10<sup>6</sup> |
| 15分钟F307处理 | 9.0x10<sup>4</sup> |
| 30分钟F307处理 | 6.0x10<sup>3</sup> |
实施例5
小鼠导管模型：用鲍氏不动杆菌菌株1791接种(1:1000)若干3英寸导管区段。如上所述来形成鲍氏不动杆菌生物膜。将20只BALB/C小鼠的背部剃毛，使它们的背部灭菌，接着产生切口以将已形成生物膜的1英寸导管区段放置在背部真皮下。接着卡钉闭合切口。在24小时之后，将250μl F307(1mg)(n＝10)或250μl对照媒介物(n＝10)直接注射至小鼠真皮下的导管中。在4小时之后重复处理。在3小时之后，从小鼠移除导管，并且如实验4中所述加以测定。图9显示相较于对照，在用F307多肽处理小鼠时，细菌计数降低约2对数。
实施例6
F307多肽将致死性注射鲍氏不动杆菌之后的小鼠从死亡挽救。
对22只C57BL/6小鼠腹膜内(IP)给予108CFU的鲍氏不动杆菌菌株。2小时后，使2只小鼠安乐死，并且如下所述进行器官检查，10只小鼠用1mg F307腹膜内注射，并且10只小鼠用对照媒介物腹膜内注射。在感染之后14天，所处理动物在这个溶素剂量下显示50％存活率，而对照小鼠仅显示10％存活率(图10)。
检查来自感染之后被安乐死的2只小鼠的器官以确认在用F307多肽处理时，器官被鲍氏不动杆菌感染。从小鼠解剖肝、脾、肾和心脏。接着在500μl 1X PBS中使器官均质化。制备稀释液，并且涂铺于脑心浸液(BHI)板上。将板在37℃下孵育过夜。计数菌落形成单位数。在2小时时间点处死对照小鼠，并且显示不动杆菌处于所有检查器官中，从而指示在处理时，器官被鲍氏不动杆菌感染。
实施例7
一式两份针对鲍氏不动杆菌菌株的18个临床分离株测试P307多肽(SEQ ID NO:43)。过夜培养鲍氏不动杆菌菌株以达到静止期。在20mM Tris(pH 7.5)中洗涤细胞3次，并且再混悬于相同缓冲液中以达到约0.7的OD(595nm)。向这些细胞中，添加P307(250ug/ml)或相应体积的缓冲液，并且使混合物在室温下孵育60分钟。制备混合物的稀释液，并且涂铺在TSB琼脂板上以随后对菌落形成单位计数。
在与250μg P307一起孵育60分钟之后，P307多肽处理导致相对于对照，细菌活力下降1至8对数。结果显示于表4中。当将P307与全长F307多肽(SEQ ID NO:1)进行比较时，P307多肽具有更高活性。
表4.P307针对18个鲍氏不动杆菌菌株的活性。
实施例8
添加短延伸肽导致P307的抗细菌活性增加。
肽SQSRESQC(SEQ ID NO:44)源于丙型肝炎病毒，并且已显示针对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌具有抗微生物活性。我们使这个序列缀合于P307(P307Ex)以测定它对活性的影响。F307、p307和P307Ex的序列(分别是SEQ ID No:1、43和45)提供在图11中，其中一部分F307的序列加下划线以显示P307的位置，并且一部分P307的序列加双下划线以显示抗微生物序列的位置。
一式两份针对6个细菌菌株测定P307和P307Ex。如实施例5中所述测量抗细菌活性。用P307Ex处理导致鲍氏不动杆菌1791下降3.2对数，而用P307处理导致下降2.9对数，从而证明添加抗微生物肽使P307的活性增加。结果显示于表5中。
表5
测试P307和P307Ex针对鲍氏不动杆菌菌株1791、大肠杆菌、绿脓假单胞菌菌株PAO1、金黄色葡萄球菌菌株RN4220、金黄色葡萄球菌菌株8325和炭疽杆菌的活性。如表6中所示，P307和P307针对鲍氏不动杆菌和炭疽杆菌最具活性。
表6.P307和P307Ex针对其它细菌物种。
实施例9
P307对B细胞或红血细胞不具有毒性。
使P307与红血细胞混合以测定它是否将导致溶解。在200μg P307下未观察到溶解。当测试P307对B细胞系的溶解时，发现在24小时之后，它对细胞数目仅具有略微影响。结果显示于表7中。
表7(活细胞％)
化学合成用于实施例10-20中的肽。
使用Protein Technologies SymphonyTM肽合成仪(PTI Tucson,Arizona,USA)在预偶联Wang(对烷氧基-苯甲醇)树脂(Bachem,Torrance,CA,USA)上产生肽。在25μM下装载反应容器，并且使用Fmoc保护的氨基酸(Anaspec,San Jose,CA,USA)使肽伸长(1997.Standard Fmoc protocols.289:44–67)。用20％哌啶(Sigma-Aldrich)在NMP(N-甲基吡咯烷酮)中实现对胺的脱保护。使用0.6M HATU/Cl-HOBT(氮杂苯并三唑四甲基脲六氟磷酸盐/6-氯-1-羟基苯并三唑)(P3 Biosystems,Shelbyville,KY,USA)和0.4M NMM(N-甲基吗啉)，利用NMP(EMD)作为主要溶剂进行反复偶联反应(1989.New Coupling Reagentsin Peptide Chemistry 30:1927–1930.)。通过以下方式来实现树脂裂解和侧链脱保护：转移至100ml圆底烧瓶中，并且历经6小时时限与4.0ml呈95:2:2:1比率的浓缩测序等级三氟乙酸(Fisher)与三异丙基甲硅烷(Fluka)、脱气水和3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇(DODT，Sigma-Aldrich)反应。此继之以柱过滤至50ml圆底烧瓶中，并且使用旋转蒸发器使TFA体积降低至2ml。通过转移至50ml含有40ml冷叔丁基甲基醚(TBME，Sigma-Aldrich)的falcon管中来对个别肽进行标准醚沉淀。将样品放置在冰浴中2小时以辅助沉淀，随后使用离心(3300rpm，5分钟)形成团块。通过真空抽吸来移除过量醚，并且使肽团块在通风橱中干燥过夜。将干燥肽团块溶解于20％乙腈和10ml HPLC等级水中，次级取样以进行LC/MS并冻干。所有粗产物随后都通过使用Waters BEH C18柱进行反相AquityTM UPLC(WatersChromatography,Milford,MA,USA)来分析。通过使用ThermoFinnigan LTQTM(ThermoFisher,Waltham,MA,USA)波谱仪系统进行串联电喷雾质谱测定法来验证个别肽完整性。在Waters 600Prep HPLC上用Vydac C18 RP制备柱实现制备色谱法。以30秒间隔收集个别级分，使用LC/MS表征，并且冻干含有所需产物的级分。将这些储存在-20℃下直至再混悬于高压灭菌处理的Milli-Q水中以进行各种测定。接着在4℃下储存储备溶液。将肽与它们的氨基酸序列、等电点(pI)和分子量(MW)一起概述于表8中。
表8
实施例10
比较本公开的肽的体外杀细菌活性。
为测定肽P307、P307AE-8、P307SQ-8C和P307CS-8的体外杀细菌活性，在室温下用肽处理细菌2小时。连续稀释存活细胞，并且涂铺在TSB琼脂板上以测定活性。
通过处理鲍氏不动杆菌菌株#1791、S5和ATCC17978来比较50μg/mL肽P307、P307AE-8和P307SQ-8C的杀细菌活性。P307SQ-8C最具活性，使约106cfu/mL的细菌降低至低于检测限(<10cfu/mL)。P307比P307AE-8略微更具活性，但两种肽均诱导活细菌降低约3.8对数单位(图12A)。为探究8个氨基酸SQSRESQC如何促成P307SQ-8C的较高活性，单独或与P307组合添加与50μg/mL P307相同摩尔浓度的肽SQSRESQC至鲍氏不动杆菌菌株#1791和S5中。将活性与50μg/mL P307和P307SQ-8C进行比较。组合仅如同P307一样具有活性，而单独SQSRESQC肽不具有活性(图12B)。因此，连接为P307SQ-8C的高杀细菌活性所必需。接着，我们探究顺序和组成的重要性。通过搅乱P307SQ-8C中的最后8个氨基酸，我们合成向P307中C末端添加CSQRQSES的P307CS-8。P307SQ-8C和P307CS-8的活性类似(图12C)。误差棒显示标准偏差，并且黑色水平线标记检测限。因此，我们推断P307SQ-8C的优越活性源于最后8个氨基酸的组成，而与最后8个氨基酸的次序无关。对于进一步探究，我们使用P307SQ-8C，因为它最具活性，并且将它的活性与P307进行比较。
实施例11
P307和P307SQ-8C的杀细菌活性
探究pH和NaCl对P307和P307SQ-8C的体外活性的影响。用50μg/mL肽处理鲍氏不动杆菌菌株#1791以测试各条件。两种缓冲系统(磷酸钠和Tris-HCl)用于测试pH 6.8、7.5、8.0和8.8。肽在Tris-HCl中更具活性，并且较高pH引发较好杀灭(图13A)。因此，我们决定用50mM Tris-HCl(pH 7.5)继续我们的体外实验，所述pH接近生理pH。两种肽的活性均与NaCl的浓度成反比(图13B)。接着，通过处理鲍氏不动杆菌菌株#1791来探究对P307的滴定以及P307和P307SQ-8C的杀灭动力学。P307的活性具有浓度依赖性，开始于4μg/mL(图13C)。P307SQ-8C比P307更快起作用，在5分钟时间点时已导致降低约3.2对数单位(图13D)。在室温或37℃下，在任一肽的活性方面不存在差异(数据未显示)。根据这些体外表征实验，我们决定我们的最优实验条件是50mM Tris-HCl(pH 7.5)、50μg/mL肽和2小时，在室温(22-25℃)下，除非另外指示。
实施例12
接着，我们探究P307和P307SQ-8C针对不同细菌物种的体外杀细菌谱，所述细菌物种是鲍氏不动杆菌(菌株号1775、1776、1777、1788、1789、1790、1791、1792、1793、1794、1796、1797、1798、1799、ATCC 17978和S1、S3、D5)、炭疽杆菌(ΔSterne)、大肠杆菌(DH5α)、绿脓假单胞菌(PA01)、金黄色葡萄球菌(RN4220)和两个肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumonia)菌株(ATCC 700603和ATCC10031)。在室温下用50μg/mL的P307或P307SQ-8C在50mM Tris-HCl(pH 7.5)中处理这些细菌物种2小时以探究肽的特异性。在测试的细菌之中，鲍氏不动杆菌菌株始终对肽最敏感，在P307和P307SQ-8C的情况下分别显示降低平均2.7和6.2对数单位。炭疽杆菌、绿脓假单胞菌和金黄色葡萄球菌具有中度敏感性。P307和P307SQ-8C分别对于这些细菌产生平均约1.3和2.9对数单位降低。然而，大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌对两种肽均具有抗性(图14)。
实施例13.
此外，为探究肽针对处于不同生长期的鲍氏不动杆菌的活性，我们比较处于对数期、静止期和生物膜状态的菌株#1791的敏感性。在室温下用50μg/mL P307或P307SQ-8C处理处于对数期(在新鲜培养基中1:100接种过夜培养物后3小时)和静止期(过夜培养物)的细菌2小时。连续稀释存活细胞，并且涂铺在TSB琼脂板上以测定cfu/mL。(图15A)。通过在37℃下在约2.5cm长的导管内部在具有0.2％葡萄糖的TSB中孵育约105cfu/mL的菌株#179172小时来产生鲍氏不动杆菌生物膜。接着洗涤导管以移除浮游细胞，并且用250μg/mL的P307或P307SQ-8C处理。在室温下2小时和24小时之后，彻底破坏生物膜，并且再混悬存活细胞以涂铺和计数来测定肽针对体外生物膜的杀灭效率。(图15B)对数期生物体比静止期对P307略微更加敏感(约3.7对2.4对数单位降低)。在P307SQ-8C的情况下似乎无所述差异(图15A)。生物膜是所有生长期中最具抗性的。用250μg/mL P307或P307SQ-8C处理生物膜2或24小时。在2小时之后，观察到在P307和P307SQ-8C的情况下，在cfu/mL方面分别降低约3和4对数单位。在24小时之后，P307产生另外的约1.3对数单位降低，而P307SQ-8C并未如此(图15B)。
实施例14
为比较肽P307和P307SQ-8C与一些临床使用的抗生素的效率，我们进行针对两个鲍氏不动杆菌菌株#1791和ATCC17978的最小抑制浓度测定。微量滴定稀释方法用于测定左氧氟沙星(levofloxacin)、头孢他啶(ceftazidime)、多粘菌素B(polymyxin B)、P307和P307SQ-8C对鲍氏不动杆菌菌株#1791、#1798、S5和ATCC17978的MIC。对于抗生素，包括由Etest Lood R等人(2015Antimicrob.Agents Chemother.59:1983–1991.)测定的MIC的1.5–2倍连续稀释度(3个较低以及3个较高)。对于肽，测试两倍连续稀释度(500–31.25μg/mL)。将过夜培养物于穆勒-欣顿肉汤(Mueller-Hinton broth)(pH 7.9)中再混悬至0.001的OD600(约105cfu/mL)。对于各稀释度，添加抗生素或肽以达到最终100μL。使细菌在37℃下在220rpm下生长24小时。接着在SpectraMax Plus读取器(Molecular Devices)中读取在595nm下的吸光度。将MIC测定为抗微生物剂完全抑制细菌生长的最低浓度。
用于确认由OD595获得的数据。一式两份进行实验至少两次。
菌株对所有抗微生物剂都显示不同程度的敏感性(表9)。
表9
P307SQ-8C比P307具有更低MIC，这与体外杀灭活性(图2和3)一致。
实施例15
P307和P307SQ-8C的如通过B细胞存活和溶血度量的细胞毒性作用。
使从洛克斐勒大学医院(The Rockefeller University Hospital)的风湿热患者获得的人B细胞在补充有10％牛血清、青霉素和链霉素的RPMI培养基中生长。通过低速离心来收集细胞，在培养基中洗涤一次，并且于预加温培养基中再混悬至107个细胞/ml的浓度，如通过台盼蓝排除测试所测定。在培养基中连续稀释(80-0.3125μM)肽(P307、P307SQ-8C和蜂毒素(melittin))，并且添加至5x104个活细胞中。在37℃下在含湿气5％CO2氛围中孵育细胞1小时，此后根据制造商说明书将它们染色(CellTiter 96非放射性细胞增殖测定；Promega)。再孵育样品4小时，随后添加溶解/终止溶液，并且孵育过夜。在SpectraMax Plus读取器(Molecular Devices)中测量在570nm下的吸光度。一式三份进行反应两次，并且代表性数据显示为平均值±标准偏差。
将来自健康个体的人血液采集在EDTA管中，并且通过低速离心来收集红血细胞(RBC)。在PBS中洗涤细胞，并且再混悬成10％RBC溶液。在PBS中连续稀释P307和P307SQ-8C(80-0.3125μM)。PBS和1％Triton X-100分别用作阴性对照和阳性对照。混合样品，并且在37℃下孵育1小时。收集上清液，并且通过SpectraMax Plus读取器(Molecular Devices)来记录在405nm下的吸光度。一式三份进行反应两次，并且代表性数据显示为平均值±标准偏差。
使肽的连续稀释液与约5x104个活B细胞一起在37℃下在潮湿的5％CO2氛围中孵育1小时，并且蜂毒素用作阳性对照。根据制造商方案进行CellTiter
非放射性细胞增殖测定(Promega)以定量B细胞的存活。使红血细胞(RBC)与肽的连续稀释液一起孵育，并且通过OD405来度量血红蛋白向上清液中的释放以测定溶血。Triton X-100用作阳性对照。误差棒显示标准偏差。
使用人B细胞和红血细胞(RBC)测试肽的细胞毒性。不同于蜂毒素阳性对照，B细胞的膜不受P307或P307SQ-8C影响。即使在最高测试浓度(80μM)下，细胞的活力仍然与缓冲液对照相同(图16A)。类似地，相较于Triton X-100阳性对照，RBC的完整性也不受任一肽的影响(图16B)。
实施例16
相较于以4.3kD泳动的P307SQ-8A，一部分P307SQ-8C(约25％)以两倍于理论分子量泳动(数据未显示)。为确定二硫键形成对P307SQ-8C的高活性的重要性，在0、0.1和1mM二硫苏糖醇(DTT)存在下比较P307和P307SQ-8C的杀细菌活性。在室温下用50μg/mL P307或10μg/mL P307SQ-8C在50mM Tris-HCl(pH 7.5)中处理鲍氏不动杆菌菌株#1791 2小时。连续稀释存活细胞，并且涂铺在TSB琼脂上。P307SQ-8C在较高DTT浓度下变得具有较小活性，而P307的活性略微增加(图17A)。为进一步确认二硫化物形成对P307SQ-8C活性的重要性，我们合成末个半胱氨酸变为丙氨酸的P307SQ-8A。用10μg/mL的各肽处理鲍氏不动杆菌菌株1791号和ATCC17978。P307SQ-8C和P307SQ-8A的杀细菌测定显示前者比后者略微更具活性(图17B)。这些结果一起指出P307SQ-8C的优越活性的一部分源于在两个分子之间形成二硫键。
实施例17
接着，鉴于肽上的正电荷(净电荷+7)，我们探究P307是否结合DNA。使肽P307与DNA在不同肽:DNA比率(0:1-15:1)下混合，并且孵育1小时，随后在琼脂糖凝胶上分析。相较于阳性对照肽，在肽与测试DNA的任何比率下都未观察到P307的分子量有变动(图18)。
实施例18
因为肽似乎不通过与DNA相互作用来杀灭细菌，所以我们使用透射电子显微术(TEM)探究它们是否影响细菌膜。用缓冲液(对照)或300μg/mL P307SQ-8C处理鲍氏不动杆菌菌株#1791 5分钟或2小时。比较样品的TEM图像揭示内部膜的破坏和细胞内密度的变化(图19A、B和C)。此外，我们发现在pH 7.5下的抗性细菌(图3)在pH 8.8下对P307敏感，包括大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌(图19D)。因为肽上的电荷不随pH从7.5变化至8.8而变化，所以我们推断变化发生在细菌膜上。在较高pH下，细菌膜变得更加带负电荷，从而允许带正电荷肽建立更强烈离子相互作用。
实施例19
在不希望受理论束缚下，我们假设以下作用机理：P307SQ-8C与细菌膜相互作用以获得进入细胞中，并且在所述过程中，破坏细胞质膜。当肽二聚化时，膜可渗透化更有效。破坏诱导产生扰动细胞内内含物的反应性氧物质，诸如羟基自由基。为探究这个假设，我们使用
Green摄取测定来测定膜破坏。
在50mM Tris-HCl(pH 7.5)中洗涤过夜细菌培养物，并且再混悬至0.3的OD600(约107cfu/ml)。添加
核酸酶(25U/ml)(Novagen)和
Green(1μM)(Invitrogen)至细菌细胞中，并且在室温下在黑暗中孵育15分钟。添加肽(50μg/ml；14.7μMP307和11.6μM P307SQ-8C)，并且蜂毒素(14.7μM)(Sigma)用作对照。在室温下在SpectraMax Plus读取器(Molecular Devices)(激发：485nm，发射：520nm)中测量相对荧光单位(RFU)2小时。一式两份进行反应两次，并且代表性数据显示为平均值±标准偏差。
两种肽均使敏感性细菌的膜可渗透，从而导致
Green染料的荧光信号增加，因为它结合细胞内DNA(图20)。通过在羟基自由基清除剂硫脲存在下用P307和P307SQ-8C处理细菌来探究羟基自由基形成。多粘菌素B作为对照加以包括，因为已报道它的杀细菌活性部分依赖于羟基自由基死亡路径。硫脲(300mM)完全抑制P307和P307SQ-8C的活性(图21A)。然而，不能忽视硫脲通过其它路径影响活性。因此，也比较好氧条件和厌氧条件下的杀细菌活性。因为鲍氏不动杆菌是严格好氧细菌，所以大肠杆菌用于用50mM Tris-HCl(pH 8.8)进行的杀细菌测定。两种肽活性均受厌氧条件完全抑制(图21B)。尽管我们不能排除其它可能性，诸如对氧依赖性转运机理的影响，但当前结果支持我们对羟基自由基形成的假设。
实施例20
我们使用小鼠皮肤模型探究P307SQ-8C的体内活性，因为皮肤感染是由鲍氏不动杆菌所致的常见疾病途径。用电动剃刀将40只雌性CD-1小鼠(6至8周龄；Charles RiverLaboratories)的背部剃毛。将NairTM(用于身体和腿部的毛发脱除洗剂，芦荟和羊毛脂)施加于剃毛区域以移除任何剩余毛发。接着用酒精湿巾将区域消毒，并且通过胶带剥离来诱发皮肤磨损。接着标记约1cm2的胶带剥离皮肤区域，并且用10μL约108cfu/mL的鲍氏不动杆菌菌株1791号感染。使细菌定殖16-18小时，此后将受感染区域保持不处理，或用200μgP307SQ-8C或2μg多粘菌素B处理2小时。为收集皮肤上的剩余细菌，将小鼠处死，并且使用微袋(Seward Ltd.,UK)在
80Biomaster中于500μL PBS中处理受感染皮肤1分钟。连续稀释溶液，并且涂铺在含有4μg/mL左氧氟沙星和12μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂上以进行选择。将来自各动物的所得cfu/mL显示为点，并且水平棒条代表平均值。两种处理均使细菌载量显著降低(p值＝0.0023，普通单因素ANOVA)(图22)。
Claims (33)
1.一种多肽片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示。
2.氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽，或者所述多肽的由SEQ ID NO:43所示氨基酸序列组成的片段，其中所述多肽或片段缀合于抗微生物肽，所述抗微生物肽具有氨基酸序列SQSRESQC(SEQ ID NO:44)以产生缀合多肽，并且所述缀合多肽具有抗细菌活性。
3.根据权利要求2所述的多肽或片段，其中所述缀合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示。
4.根据权利要求2所述的多肽或片段，其中所述多肽或片段的C末端缀合于所述抗微生物肽。
5.根据权利要求4所述的多肽或片段，其中经由肽键使所述多肽或片段的C末端缀合于所述抗微生物肽的N末端。
6.根据权利要求2所述的多肽或片段，其中使所述多肽或片段的N末端缀合于所述抗微生物肽。
7.根据权利要求6所述的多肽或片段，其中经由肽键使所述多肽或片段的N末端缀合于所述抗微生物肽的C末端。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的多肽或片段，其中所述多肽或片段针对革兰氏阴性细菌具有抗细菌活性。
9.根据权利要求8所述的多肽或片段，其中所述细菌为不动杆菌属(Acinetobacter)。
10.根据权利要求9所述的多肽或片段，其中所述细菌是大肠杆菌(E.coli)、绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)或鲍氏不动杆菌(A.baumannii)。
11.根据权利要求1-7和9-10中任一项所述的多肽或片段，其中所述多肽或片段被冻干。
12.一种组合物，其包含一种或多种根据权利要求1-11中任一项所述的多肽或片段。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述组合物包含药学上可接受的载体、缓冲剂或防腐剂。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述组合物被配制供局部施用、皮下递送、静脉内递送或口服递送。
15.根据权利要求13所述的组合物，其中所述组合物进一步包含抗生素或凝结剂。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的组合物，其中所述组合物被冻干。
17.一种或多种根据权利要求1-11中任一项所述的多肽或片段在制备用于治疗细菌性感染的药物中的用途，其中所述药物还包含药学上可接受的载体、缓冲剂或防腐剂。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述细菌性感染不响应于其它治疗模式。
19.根据权利要求17所述的用途，其中与包含抗生素、但不包含不动杆菌属溶素多肽的药物组合施用所述药物，其中所述抗生素是阿莫西林、奥格门汀、阿莫西林、氨苄青霉素、阿洛西林、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、青霉素G、青霉素V、头孢氨苄、头孢西酮、头孢呋辛、氯拉卡比、头孢美唑、头孢替坦、头孢西丁、环丙沙星、左氧氟沙星和诺氟沙星、四环素、多西环素或米诺环素、庆大霉素、阿米卡星和妥布霉素、克拉霉素、阿奇霉素、红霉素、达托霉素、新霉素、卡那霉素或链霉素。
20.根据权利要求17所述的用途，其中所述细菌性感染是创伤感染。
21.根据权利要求17所述的用途，其中经局部、皮下、通过静脉内注射或口服施用所述药物。
22.根据权利要求17所述的用途，其中所述药物呈单位剂型。
23.根据权利要求17所述的用途，其中所述药物呈乳膏剂、软膏剂、油膏剂、凝胶剂、糖锭、喷雾剂或气雾剂形式。
24.权利要求17所述的用途，其中所述药物用于治疗细菌性感染的，包括抑制细菌生物膜的形成或破坏细菌生物膜。
25.权利要求17所述的用途，其中所述药物用于冲洗所述创伤。
26.一种将物品消毒的方法，其包括使所述物品与权利要求1-11中任一项所述的SEQID NO:1所示氨基酸序列的多肽或所述多肽的由SEQ ID NO:43所示氨基酸序列组成的片段或者权利要求12-16中任一项所述的包含所述多肽或片段的组合物接触，其中所述多肽或片段缀合于抗微生物肽，其中所述抗微生物肽具有氨基酸序列SQSRESQC(SEQ ID NO:44)。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述物品是坚硬表面。
28.一种用于抑制在物品上形成细菌生物膜或破坏物品上的细菌生物膜的方法，其包括使所述物品与有效杀灭所述生物膜中的细菌的量的根据权利要求1-11中任一项所述的肽或片段接触。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述物品是工作台面、键盘、手术仪器或医学装置。
30.一种制品，其含有包含根据权利要求1-11中任一项所述的多肽或片段的组合物。
31.如权利要求30所述的制品，其中所述组合物是以下组合物：其中所述组合物进一步包含载体、缓冲剂或防腐剂。
32.根据权利要求31所述的制品，其中所述制品是小瓶或递送装置。
33.根据权利要求31或32所述的制品，其中所述组合物被冻干。
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