RU2725809C2 - Лизины ацинетобактеров - Google Patents
Лизины ацинетобактеров Download PDFInfo
- Publication number
- RU2725809C2 RU2725809C2 RU2017102306A RU2017102306A RU2725809C2 RU 2725809 C2 RU2725809 C2 RU 2725809C2 RU 2017102306 A RU2017102306 A RU 2017102306A RU 2017102306 A RU2017102306 A RU 2017102306A RU 2725809 C2 RU2725809 C2 RU 2725809C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- polypeptide
- baumannii
- composition
- paragraphs
- Prior art date
Links
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 title description 26
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 title description 14
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 title description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 237
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 203
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 169
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 49
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 48
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 36
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 27
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 20
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 claims abstract description 18
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 claims abstract description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims abstract 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 42
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 claims description 32
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 claims description 31
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 claims description 31
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 22
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 20
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 claims description 14
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 claims description 14
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims description 14
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 13
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 claims description 13
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 13
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 claims description 13
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 8
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 claims description 8
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 claims description 7
- -1 flyukloksatsillin Chemical compound 0.000 claims description 7
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 6
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 5
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 claims description 4
- 208000002847 Surgical Wound Diseases 0.000 claims description 4
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 claims description 4
- 229960003022 amoxicillin Drugs 0.000 claims description 4
- LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N amoxicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 4
- MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N ciprofloxacin Chemical compound C12=CC(N3CCNCC3)=C(F)C=C2C(=O)C(C(=O)O)=CN1C1CC1 MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N p-Hydroxyampicillin Natural products O=C1N2C(C(O)=O)C(C)(C)SC2C1NC(=O)C(N)C1=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000006071 cream Substances 0.000 claims description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 claims description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 3
- 239000002674 ointment Substances 0.000 claims description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 3
- SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N (4s,4ar,5s,5ar,6r,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@H](C)[C@@H]([C@H](O)[C@@H]3[C@](C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@H]3N(C)C)(O)C3=O)C3=C(O)C2=C1O SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N 0.000 claims description 2
- FFTVPQUHLQBXQZ-KVUCHLLUSA-N (4s,4as,5ar,12ar)-4,7-bis(dimethylamino)-1,10,11,12a-tetrahydroxy-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1C2=C(N(C)C)C=CC(O)=C2C(O)=C2[C@@H]1C[C@H]1[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]1(O)C2=O FFTVPQUHLQBXQZ-KVUCHLLUSA-N 0.000 claims description 2
- HZZVJAQRINQKSD-UHFFFAOYSA-N Clavulanic acid Natural products OC(=O)C1C(=CCO)OC2CC(=O)N21 HZZVJAQRINQKSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010013198 Daptomycin Proteins 0.000 claims description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 claims description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 claims description 2
- 244000062730 Melissa officinalis Species 0.000 claims description 2
- 235000010654 Melissa officinalis Nutrition 0.000 claims description 2
- RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N Methicillin Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C(O)=O)C(C)(C)S[C@@H]21 RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N 0.000 claims description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 claims description 2
- 229930195708 Penicillin V Natural products 0.000 claims description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 claims description 2
- 206010048038 Wound infection Diseases 0.000 claims description 2
- 229960004821 amikacin Drugs 0.000 claims description 2
- LKCWBDHBTVXHDL-RMDFUYIESA-N amikacin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](N)C[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)NC(=O)[C@@H](O)CCN)[C@H]1O[C@H](CN)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LKCWBDHBTVXHDL-RMDFUYIESA-N 0.000 claims description 2
- 229940098164 augmentin Drugs 0.000 claims description 2
- 229960004099 azithromycin Drugs 0.000 claims description 2
- MQTOSJVFKKJCRP-BICOPXKESA-N azithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)N(C)C[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 MQTOSJVFKKJCRP-BICOPXKESA-N 0.000 claims description 2
- 229960003623 azlocillin Drugs 0.000 claims description 2
- JTWOMNBEOCYFNV-NFFDBFGFSA-N azlocillin Chemical compound N([C@@H](C(=O)N[C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C=1C=CC=CC=1)C(=O)N1CCNC1=O JTWOMNBEOCYFNV-NFFDBFGFSA-N 0.000 claims description 2
- 229960005495 cefotetan Drugs 0.000 claims description 2
- SRZNHPXWXCNNDU-RHBCBLIFSA-N cefotetan Chemical compound N([C@]1(OC)C(N2C(=C(CSC=3N(N=NN=3)C)CS[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1SC(=C(C(N)=O)C(O)=O)S1 SRZNHPXWXCNNDU-RHBCBLIFSA-N 0.000 claims description 2
- 229960002682 cefoxitin Drugs 0.000 claims description 2
- WZOZEZRFJCJXNZ-ZBFHGGJFSA-N cefoxitin Chemical compound N([C@]1(OC)C(N2C(=C(COC(N)=O)CS[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)CC1=CC=CS1 WZOZEZRFJCJXNZ-ZBFHGGJFSA-N 0.000 claims description 2
- 229960001668 cefuroxime Drugs 0.000 claims description 2
- JFPVXVDWJQMJEE-IZRZKJBUSA-N cefuroxime Chemical compound N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(N)=O)CS[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)\C(=N/OC)C1=CC=CO1 JFPVXVDWJQMJEE-IZRZKJBUSA-N 0.000 claims description 2
- 229940106164 cephalexin Drugs 0.000 claims description 2
- ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N cephalexin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N 0.000 claims description 2
- 229960003405 ciprofloxacin Drugs 0.000 claims description 2
- 229960002626 clarithromycin Drugs 0.000 claims description 2
- AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N clarithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@](C)([C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)OC)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N 0.000 claims description 2
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 claims description 2
- 229960005484 daptomycin Drugs 0.000 claims description 2
- DOAKLVKFURWEDJ-QCMAZARJSA-N daptomycin Chemical compound C([C@H]1C(=O)O[C@H](C)[C@@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@H](C)CC(O)=O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CCCCCCCCC)C(=O)C1=CC=CC=C1N DOAKLVKFURWEDJ-QCMAZARJSA-N 0.000 claims description 2
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 claims description 2
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 claims description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 claims description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 claims description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 2
- 239000000865 liniment Substances 0.000 claims description 2
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 claims description 2
- 229960003085 meticillin Drugs 0.000 claims description 2
- 229960000198 mezlocillin Drugs 0.000 claims description 2
- YPBATNHYBCGSSN-VWPFQQQWSA-N mezlocillin Chemical compound N([C@@H](C(=O)N[C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C=1C=CC=CC=1)C(=O)N1CCN(S(C)(=O)=O)C1=O YPBATNHYBCGSSN-VWPFQQQWSA-N 0.000 claims description 2
- 229960004023 minocycline Drugs 0.000 claims description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 claims description 2
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 claims description 2
- 229940056367 penicillin v Drugs 0.000 claims description 2
- BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N phenoxymethylpenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)COC1=CC=CC=C1 BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 claims description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 claims description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 claims description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 claims description 2
- 229960000707 tobramycin Drugs 0.000 claims description 2
- NLVFBUXFDBBNBW-PBSUHMDJSA-N tobramycin Chemical compound N[C@@H]1C[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N NLVFBUXFDBBNBW-PBSUHMDJSA-N 0.000 claims description 2
- 244000034356 Aframomum angustifolium Species 0.000 claims 11
- 241000588626 Acinetobacter baumannii Species 0.000 abstract description 69
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 41
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 abstract description 5
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 abstract description 4
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 abstract description 3
- 201000008225 Klebsiella pneumonia Diseases 0.000 abstract description 2
- 206010035717 Pneumonia klebsiella Diseases 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 49
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 33
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 18
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 15
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 13
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 12
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 12
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 11
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 5
- 108010093965 Polymyxin B Proteins 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 229920000024 polymyxin B Polymers 0.000 description 5
- 229960005266 polymyxin b Drugs 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 4
- 108010036176 Melitten Proteins 0.000 description 4
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Natural products NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- VDXZNPDIRNWWCW-JFTDCZMZSA-N melittin Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(N)=O)CC1=CNC2=CC=CC=C12 VDXZNPDIRNWWCW-JFTDCZMZSA-N 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GSDSWSVVBLHKDQ-JTQLQIEISA-N Levofloxacin Chemical compound C([C@@H](N1C2=C(C(C(C(O)=O)=C1)=O)C=C1F)C)OC2=C1N1CCN(C)CC1 GSDSWSVVBLHKDQ-JTQLQIEISA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 3
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 3
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 3
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- TUJKJAMUKRIRHC-UHFFFAOYSA-N hydroxyl Chemical compound [OH] TUJKJAMUKRIRHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 3
- 229960003376 levofloxacin Drugs 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 3
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 2
- 229960000484 ceftazidime Drugs 0.000 description 2
- NMVPEQXCMGEDNH-TZVUEUGBSA-N ceftazidime pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.S([C@@H]1[C@@H](C(N1C=1C([O-])=O)=O)NC(=O)\C(=N/OC(C)(C)C(O)=O)C=2N=C(N)SC=2)CC=1C[N+]1=CC=CC=C1 NMVPEQXCMGEDNH-TZVUEUGBSA-N 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 2
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 206010040872 skin infection Diseases 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000001195 ultra high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCZMHWVFVZAHCR-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(2-sulfanylethoxy)ethoxy]ethanethiol Chemical compound SCCOCCOCCS HCZMHWVFVZAHCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LEACJMVNYZDSKR-UHFFFAOYSA-N 2-octyldodecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCC(CO)CCCCCCCC LEACJMVNYZDSKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TZCYLJGNWDVJRA-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1-hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=C(Cl)C=C2N(O)N=NC2=C1 TZCYLJGNWDVJRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001116389 Aloe Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 241000702224 Enterobacteria phage M13 Species 0.000 description 1
- 101000925662 Enterobacteria phage PRD1 Endolysin Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 239000007821 HATU Substances 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000618467 Hypocrea jecorina (strain ATCC 56765 / BCRC 32924 / NRRL 11460 / Rut C-30) Endo-1,4-beta-xylanase 2 Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 239000004166 Lanolin Substances 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 101150026476 PAO1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241001240958 Pseudomonas aeruginosa PAO1 Species 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000823609 Staphylococcus aureus subsp. aureus RN4220 Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000003875 Wang resin Substances 0.000 description 1
- NERFNHBZJXXFGY-UHFFFAOYSA-N [4-[(4-methylphenyl)methoxy]phenyl]methanol Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1COC1=CC=C(CO)C=C1 NERFNHBZJXXFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000004026 adhesive bonding Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000011399 aloe vera Nutrition 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007621 bhi medium Substances 0.000 description 1
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 1
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229940081733 cetearyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- YQEMORVAKMFKLG-UHFFFAOYSA-N glycerine monostearate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC(CO)CO YQEMORVAKMFKLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SVUQHVRAGMNPLW-UHFFFAOYSA-N glycerol monostearate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO SVUQHVRAGMNPLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001046 green dye Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 229940039717 lanolin Drugs 0.000 description 1
- 235000019388 lanolin Nutrition 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N octadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCO GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 239000001818 polyoxyethylene sorbitan monostearate Substances 0.000 description 1
- 235000010989 polyoxyethylene sorbitan monostearate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002503 polyoxyethylene-polyoxypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229940113124 polysorbate 60 Drugs 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N propylene Natural products CC=C QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 1
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006950 reactive oxygen species formation Effects 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012958 reprocessing Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 201000003068 rheumatic fever Diseases 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 208000037974 severe injury Diseases 0.000 description 1
- 230000009528 severe injury Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 1
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 1
- IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M sodium dimethylarsinate Chemical compound [Na+].C[As](C)([O-])=O IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- RYYKJJJTJZKILX-UHFFFAOYSA-M sodium octadecanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O RYYKJJJTJZKILX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007723 transport mechanism Effects 0.000 description 1
- ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silicon Chemical compound CC(C)[Si](C(C)C)C(C)C ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000007473 univariate analysis Methods 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000003871 white petrolatum Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/503—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/162—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/51—Lyases (4)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
- A61L2/16—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor using chemical substances
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L29/00—Materials for catheters, medical tubing, cannulae, or endoscopes or for coating catheters
- A61L29/04—Macromolecular materials
- A61L29/043—Polysaccharides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L29/00—Materials for catheters, medical tubing, cannulae, or endoscopes or for coating catheters
- A61L29/08—Materials for coatings
- A61L29/085—Macromolecular materials
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L29/00—Materials for catheters, medical tubing, cannulae, or endoscopes or for coating catheters
- A61L29/14—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. lubricating compositions
- A61L29/16—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2202/00—Aspects relating to methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects
- A61L2202/20—Targets to be treated
- A61L2202/24—Medical instruments, e.g. endoscopes, catheters, sharps
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
- A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
- A61L2300/252—Polypeptides, proteins, e.g. glycoproteins, lipoproteins, cytokines
- A61L2300/254—Enzymes, proenzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
- A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
- A61L2300/404—Biocides, antimicrobial agents, antiseptic agents
- A61L2300/406—Antibiotics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/00032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01017—Lysozyme (3.2.1.17)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Mycology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, в частности к полипептиду, который обладает антибактериальной активностью против каждой инфекционной бактерии, выбранной изи. Также раскрыты конъюгат, композиция и набор, содержащие указанный полипептид. Раскрыты способы лечения субъекта, дезинфекции предмета, ингибирования образования или разрушения бактериальной биопленки. Изобретение обладает эффективной антибактериальной активностью против каждой инфекционной бактерии, выбранной изи. 9 н. и 27 з.п. ф-лы, 22 ил, 9 табл., 20 пр.
Description
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящая заявка PCT заявляет приоритет по предварительной заявке США № 62/017618, поданной 26 июня 2014 года, полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0002] Настоящая заявка содержит ссылку в полном объеме на перечень последовательностей в виде файла под названием ʺ235932-373399_Sequence_Listing_ST25ʺ, (57 Кбайт) созданного 24 июня 2015 года, и поданного в электронном виде вместе с ней.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0003] Композиции, содержащей бактериофаговый литический фермент специфичный к видам рода Acinetobacter и способ лечения инфекций, вызванных видами рода Acinetobacter.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0004] Комплекс Acinetobacter baumannii-calcoaceticus и другие представители этого вида часто колонизирует кожу человека не причиняя вреда. Однако, повреждения кожи от ссадин, ран или хирургической операции, могут привести к инфекциям (вызванным бактериями рода Acinetobacter) раны, крови, мягких тканей и центральной нервной системы. Учитывая, что более 80% инфекций, вызванных видами рода Acinetobacter также являются устойчивыми к множеству лекарственных препаратов (МЛУ) (по меньшей мере к трем классам антибиотиков), эти инфекции могут привести к неблагоприятным клиническим исходам, включая высокие показатели заболеваемости и смертности, длительное пребывание в стационаре и значительные расходы здравоохранения. Военнослужащие и спортсмены имеют повышенный риск получения травм (от ссадин до тяжелых ранений), подвергаясь риску заражения инфекциями, вызванными видами рода Acinetobacter. таким образом, способы, быстрого и эффективного их удаления уменьшат или устранят последующие осложнения. Вспышки заболеваний, вызванные МЛУ Acinetobacter, были зарегистрированы в больницах по всему миру; в последнее время, они стали серьезной проблемой в военно-медицинских учреждениях. Из-за своей МЛУ, инфекции, вызванные бактериями рода Acinetobacter трудно лечить, так что заражение вызванное данными организмами, как правило, приводит к неблагоприятному исходу. Таким образом, необходимы новые и более эффективные способы контроля данного возбудителя.
[0005] Уже сообщалось о штаммах Acinetobacter baumannii устойчивых ко всем известным антибиотикам. Действие совместно с этим новым профилем сопротивления является удивительной способностью А. baumannii, выживать в течение длительных периодов в условиях стационара, тем самым усиливая его способность к нозокомиальному распространению. Организм обычно поражает госпитализированных субъектов, которые находятся в критическом состоянии с нарушениями целостности кожи и защиты дыхательных путей. Как таковая, госпитальная пневмония является по-прежнему самой распространенной инфекцией, вызываемой А. baumannii. Однако, в последнее время, инфекции, связанные с центральной нервной системой, кожи и мягких тканей, и кости стали проблемой для некоторых организаций. Из-за данной проблемы резистентности, должны быть разработаны новые способы борьбы с данными патогенами.
[0006] Были определены антимикробные агенты, известные как бактериофаг-кодируемые лизины. Бактериофаги представляют собой вирусы, которые заражают бактерии и предполагается, что существует 106 различных видов бактериофагов. Лизины бактериофагов, как правило, являются родо- или видоспецифичными, т. е. фаговый лизин Staphylococcus aureus проявляет активность только против Staphylococcus aureus обеспечивая целевой терапевтический подход. В некоторых случаях, лизины могут проявлять активность в отношении нескольких родов или видов.
[0007] Бактериофаг заражает бактерию-хозяина для воспроизведения вирусных частиц. В конце репродуктивного цикла они сталкиваются с проблемой, освобождения фагового потомства, заключенного внутри бактерии. Они решают эту проблему, производя фермент, называемый ʺлизинʺ, разрушающий клеточные стенки зараженных бактерий для освобождения фагового потомства. Литическая система состоит из холина и по меньшей мере одной пептидогликангидролазы, или лизина, способных к разрушению клеточной стенки бактерий. Как правило, холин экспрессируется на поздних стадиях развития фаговой инфекции, образуя поры в клеточной мембране, что позволяет лизину(ам), получить доступ к пептидогликану клеточной стенки, что приводит высвобождению фагового потомства. Важно отметить, что экзогенный лизин, при отсутствии холина, способен лизировать клеточные стенки здоровых, неинфицированных клеток, вызывая явление, известное как ʺлизис извнеʺ.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0008] Недавно мы определили, очистили и охарактеризовали несколько фаговых лизинов, специфические поражающих бактерии рода Acinetobacter. Это прорыв, так как большинство лизинов обладают антибактериальной активностью только против грамположительных бактерий. Очищенные фаговые лизины согласно настоящему изобретения хорошо подходят для различных применений, таких как лечение бактериальных инфекций и дезинфекция.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0009] Фигура 1A. Негативно окрашенная электронная микрофотография демонстрирующая фаг, индуцированный из А. baumannii штамм 1790.
[0010] Фигура 1B. Негативно окрашенная электронная микрофотография демонстрирующая фаг, индуцированный из А. baumannii штамм 1794.
[0011] Фигура 1C. Негативно окрашенная электронная микрофотография демонстрирующая фаг, индуцированный из А. baumannii штамм 1796.
[0012] Фигура 2. Репрезентативное изображение литической активности клона в просветлении живого A. baumannii заключенного в агар.
[0013] Фигура 3. Схемы аминокислотных последовательностей клонированных лизинов демонстрирующие четыре класса литической активности: i) семейство гликозилгидролаз, ii) лизоцимы базальной пластинки фага, iii) лизоцимные автолизины и iv) лизины.
[0014] Фигура 4. Выравнивание нуклеотидных последовательностей для клонированных лизинов.
[0015] Фигура 5. Выравнивание аминокислотных последовательностей клонированных лизинов.
[0016] Фигура 6. Представляет собой график, демонстрирующий литическую активность 21 клонированного конструкта против тринадцати различных клинических изолятов А. baumannii.
[0017] Фигуры 7A и 7B. Пузырение цитоплазматической мембраны, содержащей цитозольное содержимое клеток A. baumannii, наблюдаемое после обработки F307 (стрелки).
[0018] Фигура 8. Сканирующая электронная микрофотография 3-суточных биопленок штамма 1791 А. baumannii до и после обработки полипептидом F307.
[0019] Фигура 9. Представляет собой график, демонстрирующий уменьшение количества бактерий на всех отрезках катетеров с биопленкой Acinetobacter после обработки полипептидом F307.
[0020] Фигура 10. Представляет собой график, демонстрирующий выживаемость мышей, зараженных A. baumannii и обработанных полипептидом F307 по сравнению с контролем.
[0021] Фигура 11. Последовательность полипептида F307, P307 без короткого удлиняющего сегмента и с коротким удлиняющим сегментом (P307Ex).
[0022] Фигура 12. Фигура 12A представляет собой график сравнения in vitro бактерицидных активностей P307, P307SQ-8C и P307AE-8 против штаммов A. baumannii № 1791, S5 и ATCC17978. На Фигуре 12B представлена сравнительная in vivo бактерицидная активность P307, P307SQ-8C и P307CS-8 против штаммов A. baumannii № 1791 и S5. На Фигуре 12C представлено сравнение сравнительной in vivo бактерицидной активности P307SQ-8C и P307CS-8 против штаммов A. baumannii № 1791, S5 и ATCC17978.
[0023] Фигура 13. in vitro бактерицидная активность P307 и P307SQ-8C против штамма A. baumannii № 1791 для исследования оптимального pH (13A) и оптимальной концентрации NaCl (13B). Те же условия, за исключением переменных, были использованы с 50 мМ Трис-HCl, pH 7,5 для определения концентрационного оптимума (13C) и лизисной кинетики (13D). Планки погрешностей показывают стандартное отклонение, а черная горизонтальная линия обозначает предел обнаружения.
[0024] Фигура 14. Представляет собой график, демонстрирующий чувствительность различных бактерий к P307 и P307SQ-8С. Планки погрешностей показывают стандартное отклонение, а черная горизонтальная линия обозначает предел обнаружения.
[0025] Фигура 15. Фигуры 15А и 15В представляют собой графики, которые демонстрируют бактерицидную активность P307 и P307SQ-8С на логарифмической и стационарной фазе A. baumannii штамм 1791 (15A) и фазе биопленки (15B).
[0026] Фигура 16. На фигуре 16 представлены цитотоксические эффекты P307 и P307SQ-8С, измеренные на основании выживаемости (16A) и гемолиза (16B) B клеток.
[0027] Фигура 17. На фигуре 17A представлено влияние ДТТ, при концентрации 0, 0,1 и 1 мМ, на активность P307 и P307SQ-8C. На фигуре 17B представлено влияние замены концевого остатка цистеина у P307SQ-8С на аланин (P307SQ-8А).
[0028] Фигура 18. Сдвиг ДНК в геле демонстрирующий сдвиг для контрольного пептида и P307.
[0029] Фигура 19. На фигурах 7 A-C представлены репрезентативные изображения полученные при помощи трансмиссионной электронной микроскопии A. baumanii штамм № 1791: необработанный контроль (19A), обработанный 300 мкг/мл P307SQ-8C в течение 5 минут (19B) и 2-х часов (19C). Увеличение, ×2600 (левая, масштабная полоска=2 мкм) и ×5000 (правая верхняя и нижняя, масштабная полоска=0,5 мкм). На фигуре 7D представлена бактерицидная активность P307SQ-8C на грамотрицательные бактерии K. pneumoniae и E. coli при pH 7,5 и 8,8.
[0030] Фигура 20. Продемонстрирована проницаемость мембраны A. baumannii штаммы № 1791 и S5 обработанные P307 и P307SQ-8C.
[0031] Фигура 21. Представлено ингибирование бактерицидной активности P307 или P307SQ-8С с помощью утилизации гидроксильного радикала, тиомочевины и анаэробных условий.
[0032] Фигура 22. Представлен эффект лечения кожной инфекции полимиксином B и P307SQ-8С.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0033] В настоящем изобретении предложены полипептиды, имеющие антибактериальную активность и способы применения предложенных полипептидов. Как используют в данном документе формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если из контекста явно не следует иное.
[0034] Такие термины, как ʺсодержитʺ, ʺсодержащийʺ и т. п. имеют значение, приписываемое в патентном законодательстве Соединенных Штатов; они являются охватывающими или открытыми и не исключают дополнительные, не перечисленные элементы или стадии способа. Такие термины, как ʺсостоящий по существу изʺ и ʺсостоит по существу изʺ имеют значение, приписываемое в патентном законодательстве Соединенных Штатов; они позволяют включение дополнительных ингредиентов или действий, которые существенно не влияют на основные и новые характеристики изобретения. Термины ʺсостоит изʺ и ʺсостоящий изʺ имеют значение, приписываемое в патентном законодательстве Соединенных Штатов; а именно, что эти термины являются закрытыми.
[0035] В первом аспекте, в настоящем изобретении предложены полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94% или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99% или 100% идентичности с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 или SEQ ID NO:21, или фрагмент полипептида, причем полипептид или фрагмент обладает антибактериальной активностью.
[0036] В другом варианте реализации первого аспекта, полипептиды содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99% или 100% идентичности с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 или SEQ ID NO:21, или фрагмент полипептида, причем полипептид или фрагмент обладает антибактериальной активностью.
[0037] В другом варианте реализации первого аспекта, полипептиды содержат аминокислотную последовательность, имеющую 100% идентичности с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 или SEQ ID NO:21, или фрагмент полипептида, причем полипептид или фрагмент обладает антибактериальной активностью.
[0038] Во втором аспекте, в настоящем изобретении предложены полипептиды, состоящие из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94% или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99% или 100% идентичности с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 или SEQ ID NO:21, или фрагмента полипептида, причем полипептид или фрагмент обладает антибактериальной активностью.
[0039] В другом варианте реализации второго аспекта, полипептиды состоят из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99% или 100% идентичности с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 или SEQ ID NO:21, или фрагмента полипептида, причем полипептид или фрагмент обладает антибактериальной активностью.
[0040] В еще одном другом варианте реализации второго аспекта, полипептиды состоят из аминокислотной последовательности, имеющей 100% идентичности с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 или SEQ ID NO:21, или фрагмента полипептида, причем полипептид или фрагмент обладает антибактериальной активностью.
[0041] В третьем аспекте, в настоящем изобретении предложены полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94% или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99% или 100% идентичности с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 или SEQ ID NO:21, или фрагмент полипептида, причем полипептид или фрагмент конъюгирован с антимикробным пептидом для получения конъюгированного полипептида, и конъюгированный полипептид обладает антибактериальной активностью.
[0042] В одном варианте реализации третьего аспекта полипептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 94% или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99% или 100% идентичности с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 или SEQ ID NO:21, или фрагмент полипептида, причем полипептид или фрагмент конъюгирован с антимикробным пептидом для получения конъюгированного полипептида, и конъюгированный полипептид обладает антибактериальной активностью.
[0043] В четвертом аспекте, в настоящем изобретении предложены полипептиды, состоящие из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94% или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99% или 100% идентичности с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 или SEQ ID NO:21, или фрагмента полипептида, причем полипептид или фрагмент конъюгирован с антимикробным пептидом для получения конъюгированного полипептида, и конъюгированный полипептид обладает антибактериальной активностью.
[0044] В одном варианте реализации четвертого аспекта полипептид состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 94% или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99% или 100% идентичности с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 или SEQ ID NO:21, или фрагмента полипептида, причем полипептид или фрагмент конъюгирован с антимикробным пептидом для получения конъюгированного полипептида, и конъюгированный полипептид обладает антибактериальной активностью.
[0045] В некоторых вариантах реализации третьего или четвертого аспекта, антимикробный пептид содержит аминокислотную последовательность SQSRESQC (SEQ ID NO:44), причем по меньшей мере одна аминокислота представляет собой цистеин и 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислот антимикробного пептида являются консервативно замененными. 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислот антимикробного пептида являются консервативно замененными. В других вариантах третьего или четвертого аспекта, антимикробный пептид содержит аминокислотную последовательность SQSRESQC (SEQ ID NO:44). В еще одних других вариантах третьего или четвертого аспекта, антимикробный пептид содержит аминокислотную последовательность SQSRESQC (SEQ ID NO:44), причем 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислот антимикробного пептида являются консервативно замененными, и антимикробный пептид состоит из 8 аминокислот. В еще одних других вариантах третьего или четвертого аспекта, антимикробный пептид состроит из аминокислотной последовательности SQSRESQC (SEQ ID NO:44).
[0046] В некоторых вариантах реализации третьего или четвертого аспекта, антимикробный пептид содержит аминокислотную последовательность CSQRQSES (SEQ ID NO:50), причем по меньшей мере одна аминокислота представляет собой цистеин и 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислот антимикробного пептида являются консервативно замененными. В других вариантах реализации третьего или четвертого аспекта, антимикробный пептид содержит аминокислотную последовательность CSQRQSES (SEQ ID NO:50). В еще одних других вариантах реализации третьего или четвертого аспекта, антимикробный пептид содержит аминокислотную последовательность CSQRQSES (SEQ ID NO:50), причем 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислот антимикробного пептида являются консервативно замененными, и антимикробный пептид состоит из 8 аминокислот. В еще одних других вариантах реализации третьего или четвертого аспекта, антимикробный пептид состроит из аминокислотной последовательности CSQRQSES (SEQ ID NO:50).
[0047] В некоторых вариантах реализации третьего или четвертого аспекта, C-конец полипептида или фрагмента конъюгирован с противомикробным пептидом. В других вариантах реализации третьего или четвертого аспекта, C-конец полипептида или фрагмента конъюгирован с N-концом антимикробного пептида. В еще одних других вариантах реализации третьего или четвертого аспекта, N-конец полипептида или фрагмента конъюгирован с антимикробным пептидом. В еще одних других вариантах реализации третьего или четвертого аспекта, N-конец полипептида или фрагмента конъюгирован с C-концом антимикробного пептида. Для любого из вариантов третьего или четвертого аспекта антимикробный пептид может быть, конъюгирован с полипептидом или фрагментом через пептидную связь.
[0048] Еще один вариант реализации пептидов настоящего раскрытия представляет собой пептид, имеющий аминокислотную последовательность NAKDYKGAAAEFPKWNKAGGRVLAGLVKRRKSQSRESQA (SEQ ID NO: 53). Другой вариант реализации представляет собой пептид, имеющий аминокислотную последовательность NAKDYKGAAAEFPKWNKAGGRVLAGLVKRRKCSQRQSES (SEQ ID NO:51).
[0049] В некоторых вариантах реализации изобретения полипептид или фрагмент полипептида или конъюгированные полипептиды обладают антибактериальной активностью против грамотрицательной бактерии. В некоторых вариантах реализации изобретения грамотрицательные бактерии представляют собой бактерию рода Acinetobacter.
[0050] В некоторых вариантах реализации изобретения полипептид или фрагмент полипептида или конъюгированные полипептиды обладают антибактериальной активностью против E. coli, P. aeruginosa или A. baumannii.
[0051] В некоторых вариантах реализации изобретения полипептид или фрагмент полипептида или конъюгированные полипептиды обладают антибактериальной активностью против грамположительной бактерии. В некоторых вариантах реализации изобретения грамположительная бактерия представляют собой S. aureus или B. anthracis.
[0052] В некоторых вариантах реализации изобретения полипептид является лиофилизированным.
[0053] Конкретные варианты реализации полипептидов по изобретению представлены в Таблице 1.
Таблица 1
SEQ ID NO:1 | F307 | SEQ ID NO:11 | F330 | SEQ ID NO:21 | F311 | ||
SEQ ID NO:2 | F376 | SEQ ID NO:12 | F328 | SEQ ID NO:43 | P307 | ||
SEQ ID NO:3 | F351 | SEQ ID NO:13 | F324 | SEQ ID NO:44 | SQSRESQC | ||
SEQ ID NO:4 | F347 | SEQ ID NO:14 | F321 | SEQ ID NO:45 | P307SQ-8C (P307Ex) | ||
SEQ ID NO:5 | F344 | SEQ ID NO:15 | F320 | SEQ ID NO:48 | AEMLFLK | ||
SEQ ID NO:6 | F340 | SEQ ID NO:16 | F315 | SEQ ID NO:49 | P307AE-8 | ||
SEQ ID NO:7 | F338 | SEQ ID NO:17 | F306 | SEQ ID NO:50 | CSQRQSES | ||
SEQ ID NO:8 | F336 | SEQ ID NO:18 | F303 | SEQ ID NO:51 | P307CS-8 | ||
SEQ ID NO:9 | F334 | SEQ ID NO:19 | F301 | SEQ ID NO:52 | SQSRESQA | ||
SEQ ID NO:10 | F332 | SEQ ID NO:20 | F309 | SEQ ID NO:53 | P307SQ-8A |
[0054] P307SQ-8C и P307Ex используются взаимозаменяемо в данном документе.
[0055] В настоящем изобретении также предложены фармацевтические композиции, содержащие полипептиды, фрагменты полипептида или конъюгированные полипептиды по изобретению. В некоторых вариантах реализации изобретения композиции представляют собой фармацевтические композиции, содержащие фармацевтически приемлемый носитель, буферный агент или консервант.
[0056] В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция создана для местного применения. В других вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция создана для подкожной доставки. В еще одних других вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция создана для внутривенной доставки. В еще одних других вариантах реализации, фармацевтическая композиция создана для пероральной доставки.
[0057] В некоторых вариантах реализации изобретения композиция дополнительно содержит антибиотик. Примеры пригодных антибиотиков включают, без ограничения, амоксициллин, аугментин, амоксициллин, ампициллин, азлоциллин, флюклоксациллин, мезлоциллин, метициллин, пенициллин G, пенициллин V, цефалексин, цефазедон, цефуроксим, лорацарбеф, цеметазол, цефотетан, цефокситин, ципрофлоксацин, левакин и флоксацин, тетрациклин, доксициклин или миноциклин, гентамицин, амикацин, и тобрамицин, кларитромицин, азитромицин, эритромицин, даптомицин, неомицин, канамицин или стрептомицин.
[0058] В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция дополнительно содержит коагулирующий агент.
[0059] В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция является лиофилизированной.
[0060] В настоящем изобретении также предложены способы лечения субъекта, нуждающегося в этом, включающие введение субъекту фармацевтической композиции, содержащей полипептид, фрагмент полипептида или конъюгированный полипептид согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, буферный агент или консервант.
[0061] В одном варианте реализации изобретения способ представляет собой способ лечения субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту фармацевтической композиции, содержащей полипептид согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, буферный агент или консервант.
[0062] В другом варианте реализации изобретения способ представляет собой способ лечения субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту фармацевтической композиции, содержащей фрагмент полипептида согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, буферный агент или консервант.
[0063] В одном варианте реализации изобретения способ представляет собой способ лечения субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту фармацевтической композиции, содержащей конъюгированный полипептид согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, буферный агент или консервант.
[0064] В одном варианте реализации изобретения способ представляет собой способ лечения субъекта, имеющего бактериальную инфекцию, а лечение представляет собой терапевтическое лечение, включающее введение субъекту фармацевтической композиции, содержащей конъюгированный полипептид согласно изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель, буферный агент или консервант. В некоторых вариантах реализации субъект имеет бактериальную инфекцию, резистентную к другим способам лечения. Например, бактериальная инфекция может быть устойчивой к одному или более антибиотикам. В одном варианте реализации изобретения, бактериальная инфекция представляет собой раневую инфекцию.
[0065] В одном варианте реализации изобретения способ представляет собой способ профилактического лечения субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту фармацевтической композиции, содержащей конъюгированный полипептид согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, буферный агент или консервант. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект претерпел или претерпевает оперативное вмешательство, а операционная рана контактирует с фармацевтической композиции согласно изобретению. В некоторых вариантах реализации изобретения хирургическую рану орошают фармацевтической композицией до закрытия раны. В других вариантах реализации изобретения фармацевтическую композицию наносят на рану, после закрытия, например, фармацевтическую композицию наносят на зашитую или скрепленную степлером область раны.
[0066] В некоторых вариантах реализации изобретения способ включает введение фармацевтической композиции согласно изобретению в сочетании с антибиотиком. В некоторых вариантах реализации изобретения способ включает местное применение фармацевтической композиции по изобретению. В других вариантах реализации изобретения способ включает введение фармацевтической композиции согласно изобретению подкожно. В еще одних других вариантах реализации изобретения способ включает введение фармацевтической композиции согласно изобретению путем внутривенной инъекции. В еще одних других вариантах реализации изобретения способ включает введение фармацевтической композиции согласно изобретению в перорально.
[0067] В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция представлена в виде единичной дозы. В других вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция представлена в форме крема, мази, бальзама, геля, пастилки, спрея или аэрозоля.
[0068] Также представлены способы лечения бактериальной инфекции, включающий ингибирование формирования или нарушение бактериальной биопленки, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, композиции, содержащей полипептид, фрагмент полипептида или конъюгированный полипептид согласно изобретению в количестве, эффективном для уничтожения бактерий в биопленке.
[0069] Дополнительно представлены способы дезинфекции предмета включающие приведение в контакт предмета с композицией, содержащей полипептид, фрагмент полипептида или конъюгированный полипептид согласно изобретению с предметом в течение времени, достаточного для дезинфекции предмета. В некоторых вариантах реализации изобретения предмет представляет собой твердую поверхность. В некоторых вариантах реализации изобретения предмет представляет собой рабочую поверхность, клавиатуру, хирургический инструмент или медицинское устройство.
[0070] Дополнительно, представлены способы ингибирования образования или разрушения бактериальной биопленки на предмете включающие приведение в контакт предмета с полипептидом, фрагментом полипептида или конъюгированным полипептидом согласно изобретению, в количестве, эффективном для уничтожения бактерий в биопленке.
[0071] Также представлены изделия, содержащие композиции, содержащие полипептид, фрагмент полипептида или конъюгированный полипептид согласно изобретению. В некоторых вариантах реализации изобретения изделие представляет собой аэрозольный баллончик, содержащий полипептид, фрагмент полипептида или конъюгированный полипептид согласно изобретению.
[0072] В некоторых вариантах реализации изобретения изделие содержит фармацевтическую композицию, содержащую полипептид, фрагмент полипептида или конъюгированный полипептид согласно изобретению и носитель, буферный агент или консервант. В некоторых вариантах реализации изобретения изделие представляет собой флакон. В некоторых вариантах реализации изобретения изделие представляет собой устройство доставки. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция, содержащаяся в изделии является лиофилизированной.
[0073] Модификации и изменения могут быть произведены в структуре полипептидов данного раскрытия и получатся молекулы, имеющие сходные характеристики, как у полипептида (например, консервативная аминокислотная замена). Например, некоторые аминокислоты могут быть заменены другими аминокислотами в последовательности без заметной потери активности. Потому как интерактивная возможность и природа полипептида определяют биологическую функциональную активность полипептида некоторые замены в аминокислотной последовательности замены могут быть проведены в последовательности полипептида и тем не менее получится полипептид с желаемыми свойствами.
[0074] Такие аминокислотные замены, как правило, основаны на относительном сходстве заместителей аминокислотных боковых цепей, например, их гидрофобности, гидрофильности, заряде, размере и тому подобном. Типичные замен, которые принимают различные из вышеприведенных характеристик во внимание, хорошо известны специалистам в данной области и включают (оригинальный остаток: типичная замена): (Ala: Gly, Ser), (Arg: Lys), (Asn: Gln, His), (Asp: Glu, Cys, Ser), (Gln: Asn), (Glu: Asp), (Gly: Ala), (His: Asn, Gln), (Ile: Leu, Val), (Leu: Ile, Val), (Lys: Arg), (Met: Leu, Tyr), (Ser: Thr), (Thr: Ser), (Tip: Tyr), (Tyr: Trp, Phe) и (Val: Ile, Leu). Варианты реализации настоящего раскрытия, таким образом, рассматривают функциональные или биологические эквиваленты полипептида, как описано выше. В частности, варианты реализации полипептидов могут включать варианты имеющие около 50%, 60%, 70%, 80%, 90% и 95% идентичности последовательности с интересующим полипептидом.
[0075] "Идентичность" как известно в данной области техники, представляет собой связь между двумя или более полипептидными последовательностями, как это определено путем сравнения последовательностей. "Идентичность" может быть легко рассчитана с помощью известных алгоритмов, хорошо известных в данной области техники. Предпочтительные способы определения идентичности разработаны с целью обеспечения наилучшего совпадения между исследуемыми последовательностями. Способы определения идентичности кодируются в общедоступных компьютерных программах. Процент идентичности между двумя последовательностями может быть определен с помощью программного обеспечения для анализа (например, Sequence Analysis Software Package от Genetics Computer Group, Мадисон, штат Висконсин) который включает алгоритм Needelman and Wunsch, (J. Mol. Biol., 48: 443-453, 1970) (например, NBLAST и XBLAST).
[0076] Идентичность можно определить, как ʺлокальную идентичностьʺ или ʺглобальную идентичностьʺ. Под локальной идентичностью понимается степень родства последовательностей между полипептидами, как определено соответствием между цепочками таких последовательностей. Под глобальной идентичностью понимается степень родства последовательность полипептида по сравнению с полной длиной эталонного полипептида. Если не указано другое, используемая в настоящем документе идентичность, означает глобальную идентичность. Проценты глобальной идентичности в данном документе рассчитываются с использованием алгоритма ClustalW при помощи программы MacVector, используя параметры по умолчанию, как для локальной, так и глобальной идентичности.
Получение полипептидов
[0077] Полипептиды согласно настоящему изобретению могут быть получены любым известным способом. Например, полипептиды могут быть получены в бактерии, включая, без ограничения, E. coli, или в другой существующей системе для полипептида (например, Bacillus subtilis, бакуловирусной экспрессионной системе с использованием клеток дрозофилы Sf9, экспрессионных системах дрожжей или мицелиальных грибов, экспрессионной системе млекопитающих), или они могут быть химически синтезированы.
[0078] Если полипептид должен быть получен в бактерии, например, E. coli, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая пептид может также кодировать лидерную последовательность, позволяющую секрецию зрелого пептида из клетки. Таким образом, последовательность кодирующая пептид может содержать препоследовательность и пропоследовательность, к примеру, естественный бактериальный пептид ST. Секретированный, зрелый пептид может быть очищен от культуральной среды.
[0079] Последовательность, кодирующая пептид, описанный в настоящем документе, может быть вставлена в вектор, способный доставить и обеспечить функционирование молекулы нуклеиновой кислоты в бактериальной клетке. Молекула ДНК может быть вставлена в самовоспроизводящийся вектор (подходящие векторы включают, например, pGEM3Z и pcDNA3, и их производные). Вектор может представлять собой бактериальный ДНК вектор или ДНК вектор бактериофага, например бактериофага лямбда или М13, и их производные. Конструирование вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, описанную в настоящем документе, может сопровождаться трансформацией клетки-хозяина, такой как бактерия. Подходящие бактерии-хозяева включают, без ограничения, E. coli, B subtilis, Pseudomonas, Salmonella. Генетический конструкт также содержит, в дополнение к кодирующей молекуле нуклеиновой кислоты, элементы, которые обеспечивают экспрессию, такие как промотор и регуляторные последовательности. Экспрессионные векторы могут содержать последовательности контроля транскрипции, которые контролируют инициацию транскрипции, такие как последовательности промотора, энхансера, оператора и репрессора. Разнообразные последовательности контроля транскрипции хорошо известны в данной области техники. Экспрессионные вектор может также содержать последовательности контроля трансляции (например, нетранслируемую 5'-последовательность, нетранслируемую 3'-последовательность или участок внутренней посадки рибосомы). Вектор может быть способен к автономному воспроизведению или он может интегрироваться в ДНК хозяина, чтобы обеспечить стабильность во время продуцирования пептида.
[0080] Один вариант реализации нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 или SEQ ID NO:45, или фрагмент полипептида, причем полипептид или фрагмент обладает антибактериальной активностью.
[0081] В другом варианте реализации изобретения нуклеиновая кислота кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 или SEQ ID NO:45, или фрагмент полипептида, причем полипептид или фрагмент обладает антибактериальной активностью.
[0082] В еще одном другом варианте реализации изобретения нуклеиновая кислота кодирует полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 или SEQ ID NO:45, или фрагмент полипептида, причем полипептид или фрагмент обладает антибактериальной активностью.
[0083] В еще одном варианте реализации изобретения нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41 или SEQ ID NO:42.
[0084] В еще одном варианте реализации изобретения нуклеиновая кислота состоит из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41 или SEQ ID NO:42.
[0085] Другой вариант реализации изобретения представляет собой экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 или SEQ ID NO:45, или фрагмент полипептида, причем полипептид или фрагмент обладает антибактериальной активностью.
[0086] В другом варианте реализации изобретения экспрессионный вектор содержит нуклеиновую кислоту кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 или SEQ ID NO:45, или фрагмент полипептида, причем полипептид или фрагмент обладает антибактериальной активностью.
[0087] В еще одном другом варианте реализации изобретения экспрессионный вектор содержит нуклеиновую кислоту кодирующую полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 или SEQ ID NO:45, или фрагмент полипептида, причем полипептид или фрагмент обладает антибактериальной активностью.
[0088] В еще одном варианте реализации изобретения экспрессионный вектор содержит нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41 или SEQ ID NO:42.
[0089] В еще одном варианте реализации изобретения экспрессионный вектор содержит нуклеиновую кислоту, состоящую из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41 или SEQ ID NO:42.
[0090] В таблице 2 приведены конкретные варианты реализации нуклеиновых кислот согласно изобретению демонстрирующие нуклеотидные SEQ ID NO:, которые соответствуют полипептидам, которые они кодируют.
Таблица 2
Нуклеотидные SEQ ID NO: | Соответствующие аминокислотные SEQ ID NO: |
Нуклеотидные SEQ ID NO: | Соответствующие аминокислотные SEQ ID NO: |
|
22 | 1 | 33 | 12 | |
23 | 2 | 34 | 13 | |
24 | 3 | 35 | 14 | |
25 | 4 | 36 | 15 | |
26 | 5 | 37 | 16 | |
27 | 6 | 38 | 17 | |
28 | 7 | 39 | 18 | |
29 | 8 | 40 | 19 | |
30 | 9 | 41 | 20 | |
31 | 10 | 42 | 21 | |
32 | 11 |
[0091] Нуклеиновая кислота, которая кодирует полипептид, описанная в настоящем документе, может также быть слита с нуклеиновой кислотой, кодирующей пептидный аффинный маркер, например, глутатион S-трансферазу (ГСТ), мальтозо-связывающий белок E, белок A, FLAG-маркер, гекса-гистидин, myc-маркер или маркер HA гриппа, для облегчения очистки. Аффинный маркер или репортерная склейка соединяет рамку считывания пептида, представляющего интерес, с рамкой считывания гена, кодирующего аффинный маркер, таким образом, что создается трансляционное слияние. Экспрессия слитого гена приводит к трансляции одного пептида, содержащего и интересующий пептид, и аффинную метку. В некоторых случаях, когда метки аффинности используются, последовательность ДНК, кодирующая сайт узнавания протеазы будут слита между рамками считывания для аффинной метки и пептида, представляющего интерес.
[0092] Генетические конструкты и способы, подходящие для производства незрелых и зрелых форм полипептидов и вариантов, описанных в настоящем документе в системах экспрессии белка, отличных от бактерий, и хорошо известных специалистам в данной области техники, могут также быть использованы для получения полипептидов в биологической системе.
[0093] Полипептиды и их варианты могут быть синтезированы твердофазным методом, с использованием автоматического пептидного синтезатора. Например, пептид может быть синтезирован на Cyc(4-CH2 Bxl)-OCH2-4-(оксиметил)-фенилацетамидометиловой смоле с использованием программы двойного сцепления. Пептиды также могут быть синтезированы с помощью многих других способов, включая твердофазный синтез с использованием традиционной защиты FMOC (т.е. соединение с DCC-HOBt и снятие защиты при помощи пиперидина в ДМФА).
Терапевтические и профилактические композиции, и их применение
[0094] В настоящем изобретении предложены способы лечения, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества полипептида согласно изобретению. Субъект представляет собой человека или другое животное, включая, без ограничения, приматов, таких как обезьяны и шимпанзе; сельскохозяйственных животных, таких как коровы, свиньи, лошади или куры; и животных-компаньонов, таких как собаки, кошки и грызуны. В конкретном варианте реализации изобретения субъект представляет собой человека. В другом конкретном варианте реализации изобретения субъект представляет собой млекопитающее, не являющееся человеком. В одном варианте реализации изобретения полипептиды вводят в качестве единственного антибактериального агента. В другом варианте реализации изобретения полипептиды вводят в комбинации с одним или более другим антибактериальным агентом.
[0095] Способы введения описанных фармацевтических композиций могут быть следующими: пероральный или парентеральный и включать, без ограничений, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, внутрисуставной, интрасиновиальный, подкожный, интраназальный, эпидуральный, местный и пероральные пути. Соединения могут вводиться любым удобным путем, например путем инфузии или болюсной инъекции, путем всасывания через эпителиальные или кожно-слизистые оболочки (например, слизистую оболочку полости рта, прямой кишки и слизистую оболочку кишечника и т.д.) и могут вводиться вместе с другими биологически активными веществами. Введение может быть системным или местным. Кроме того, может быть желательным введение фармацевтических композиций по изобретению в центральную нервную систему любым подходящим вариантом, включая внутрижелудочковое и интратекальное введение; внутрижелудочковая инъекция может быть облегчена с помощью внутрижелудочкового катетера, например, присоединенного к резервуару, такому как резервуар Оммайя. Также может быть использовано ингаляционное введение, например, с помощью ингалятора или небулайзера и смешивание с аэрозольным агентом. В конкретном варианте реализации изобретения может быть желательным применение фармацевтической композиции согласно изобретению локально на зоны, нуждающиеся в лечении, такое как местное применение на коже; при этом может быть использован любой подходящий способ, известный в данной области техники.
[0096] В одном аспекте настоящего изобретения предложены фармацевтические композиции, содержащие полипептиды согласно настоящему раскрытию для терапевтического или профилактического лечения бактериальных инфекций. Вариант реализации изобретения представляет собой фармацевтическую композицию, разработанную для местного лечения. Другой вариант реализации изобретения представляет собой фармацевтическую композицию, разработанную для системных инфекций.
[0097] Такие композиции содержат терапевтически эффективное количество полипептида согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, буферный агент или консервант. Термин ʺфармацевтически приемлемый носительʺ, используемый в настоящем документе, включает, без ограничения, растворители, разбавители или другие жидкие средства, дисперсионные или суспензионные вспомогательные вещества, поверхностно-активные агенты, изотонические агенты, загустители или эмульгаторы, твердые связующие вещества, лубриканты и тому подобное, пригодные для желаемой конкретной лекарственной формы. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая нефтяные масла, масла животного, растительного или синтетического происхождения, такие как ореховое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также могут быть использованы в качестве жидких носителей, особенно для инъекционных препаратов. Подходящие фармацевтические вспомогательные вещества включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикатный гель, стеарат натрия, глицеролмоностеарат, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерол, пропилен, гликоль, воду, этанол и тому подобное. Композиция может также содержать смачивающие или эмульгирующие агенты, консерванты или рН-буферные агенты. Данные композиции могут иметь форму раствора, суспензии, эмульсии, таблетки, пилюли, пастилки, капсулы, порошка, пластырей для местного применения и тому подобного. Для местного применения, фармацевтически приемлемые композиции могут быть приготовлены в виде соответствующей мази, лосьона или крема, содержащих активный компонент взвешенный или растворенный в одном или более носителей. Носители для местного применения включают, без ограничения, минеральное масло, жидкий вазелин, белый вазелин, пропиленгликоль, соединения полиоксиэтилен-полиоксипропилена, эмульгированный воск, полисорбат 60, воск цетиловых эфиров, цетеариловый спирт, 2-октилдодеканол, бензиловый спирт и воду. Композиция может быть приготовлена в виде суппозитория с традиционными связующими веществами и носителями, такими как триглецириды. Состав для перорального применения может содержать стандартные носители, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлозу, карбонат магния и т.д., фармацевтической степени чистоты. Специалист в данной области техники хорошо разбирается в разработке терапевтических агентов. См. например Remington The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Lippincott Williams & White, Baltimore, Md. (2000); Remingtonʹs Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company, 1995).
[0098] В настоящем изобретении предложены также фармацевтические комплект или набор, содержащий один или более контейнер, заполненный одним или более ингредиентами фармацевтической композиции согласно изобретению. При необходимости, могут предоставляться связанные с таким контейнером(ами) уведомление в форме, предписанной правительственным агентством, регулирующим производство, использование или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, которое отражает (а) утвержденное агентством по производству, применение или продажу для введения человеку, (б) рекомендации по применению, или оба пункта.
ПРИМЕРЫ
[0099] Следующие примеры используются, чтобы предоставить дополнительную информацию для специалиста в данной области техники, о приготовлении и использовании полипептидов, описанных в настоящем документе, и не предназначены для ограничения объема того, что изобретатели рассматривают как свое изобретение. Были предприняты усилия для обеспечения точности в отношении используемых чисел (например, количества, температуры и т.д.), но следует учесть некоторые экспериментальные ошибки и отклонения. Если не указано иное, молекулярная масса представляет собой среднюю молекулярную массу, а температура указана в градусах Цельсия.
Пример 1
[00100] Идентификация полипептидов, имеющих антибактериальную активность.
[00101] Пятнадцать клинических изолятов A. baumannii были получены в Нью-Йоркской больнице. Штаммы А. baumannii были изолированы и обработаны митомицином C, для инициации индукции профага. Были собраны супернатанты, и фаг был осажден при помощи полиэтиленгликоля (ПЭГ). Супернатанты из трех изолятов A. baumannii изучались при помощи электронной микроскопии (ЭМ) с негативным контрастированием, и были сделаны снимки фагов (Фигуры 1A, 1B и 1C).
[00102] Фаговая ДНК была выделена из совместно осажденных соединений при помощи электрофореза на агарозном геле и экстракции высокомолекулярных ДНК. Из этой ДНК, была создана, как описано выше, экспрессионная шот-ган библиотека, амплифицированная с помощью линкеров (E-LASL). (Schmitz JE. et al., 2008, Appl. Environ. Microbiol. 74:1649-1652.) Кратко, для всех образцов, 100 нг ДНК были фрагментированы при помощи рестрикционного фермента TSP509I (консенсусная последовательность AATT). Затем следовала экстракция фенол-хлороформом и осаждение этанолом, ДНК лигировали с 40 нг линкерной последовательности, с комплементарными 5ʹ липким концом (AATTCGGCTCGAG, где липкий конец подчеркнут (SEQ ID NO:46). Смесь для лигирования использовали в качестве шаблона для Taq ПЦР, используя нацеленный на линкер праймер CCATGACTCGAGCCGAATT (SEQ ID NO:47).
[00103] Амплифицированные вставки были лигированы в арабинозо-индуцибельную pBAD плазмиду, используя набор для экспрессии pBAD TOPO® TA; Invitrogen, в соответствии с инструкциями производителя. Рекомбинантные векторы были трансформированы в компетентные E. coli TOP10 (Invitrogen). Для определения, какой клон обладает литической активностью, E. coli поместили на агар LB дополненный 100 мкг/мл ампициллина и 5% дефибринированной овечьей крови. После роста в течение ночи при 37°C, чашки были помещены в герметичный контейнер, который был прикреплен к выходному отверстию коммерческого небулайзера. Небулизированная арабиноза непрерывно закачивалась в контейнер в течение 1 часа. Чашки были возвращены на 37°C и колонии определяли по образованию зоны гемолиза в окружающем кровяном агаре. Выбранные клоны были высеяны штрихом на разные чашки с LB-ампициллином (без арабинозы) и оставили размножаться без индуцированной экспрессии. (Schmitz JE, et al., 2010 Appl. Environ. Microbiol.76:7181-7187).
[00104] Для определения лизисной активности A. baumannii, вторичный скрининг был осуществлен по существу как у Schmitz JE, et al., 2010 Appl. Environ. Microbiol.76:7181-7187. Колонии были высеяны штрихом с очагами примерно 1 см на 2 см на чашки с LB-ампициллином дополненные 0,2% арабинозы. После инкубирования в течение ночи при 37°C, чашки обрабатывали парами хлороформа для уничтожения и пермеабилизирования любых живых E. coli. Затем очаги были покрыты расплавленным мягким агаром, содержащим А. baumannii и наблюдали для выявления зон просветления. Был выявлен двадцать один положительный клон, проявлявшие четкие зоны вокруг клона. На Фигуре 2 представлено репрезентативное наблюдение литической активности клона в просветлении живого A. baumannii заключенного в агар.
[00105] Вставки положительных клонов были подвергнуты секвенированию и сравнены с последовательностями из базы данных белков NCBI. Участки выравнивания продемонстрировали, что среди 21 клона имеется четыре класса литической активности: i) девять принадлежало к семейству гликозилгидролаз, ii) семь принадлежало к лизоцимам базальной пластинки фага, iii) два являлись лизоцимными автолизинами и iv) три являлись лизинами. (Фиг. 3). Для удобства пользования в настоящем документе, независимо от класса, полипептиды, кодируемые этими последовательностями называются ʺлизиныʺ. На Фигуре 4 показано выравнивание последовательностей на основе сходства нуклеотидных последовательностей, кодирующих 21 клон. На Фигуре 5 показано выравнивание последовательностей на основе схожести полипептидных последовательностей 21 клона.
Пример 2
[00106] Активность положительных клонов.
[00107] Был исследован двадцать один различный конструкт для выяснения активности против клинических изолятов A. baumannii. Конструкты были рекомбинантно экспрессированы в E. coli. Клетки выращивали при 30°C 200 об/мин, а при достижении середины логарифмической фазы роста они были индуцированы путем добавления 0,2% арабинозы. Индукция продолжалась всю ночь. Утром, клетки осаждали центрифугированием, промывали 3 раза 50 мМ натрий-фосфатным буфером рН 7,0, прежде чем гомогенизировать в гомогенизаторе Emulsiflex. Клеточный дебрис удаляли путем центрифугирования (16000 g, 45 мин), а лизат пропускали через стерильный фильтр 0,22 мкм для создания сырых лизатов.
[00108] А. baumannii, выращенный в течение ночи на TSB (триптон-соевый бульон), были смешаны при 50°С с мягким агаром TSB и залиты на агаровые пластины TSB в качестве верхнего слоя агара. Пластины оставили затвердевать при комнатной температуре. Сырые лизаты (10 мкл) добавляли в мягкую агаровую пластину с A. baumannii, и инкубировали 2 часа при комнатной температуре каждый день, в то же время хранили при 4°C в течение оставшегося времени. Пластины инкубировали до тех пор, пока не становились видны зоны просветления (4-5 суток). Подсчитывались зоны просветления, которые были больше, чем исходное пятно сырого лизата. Число над каждым лизином отображает, сколько существует штаммов, против которых лизин был наиболее эффективен.
[00109] Результаты представлены на Фигуре 6. Лизирующие конструкты приведены по оси X, а процент лизированных штаммов Acinetobacter, приведен по оси Y. Цифры над каждой шкалой указывают на количество штаммов, против которых данный лизин был наиболее эффективен, отсутствие цифр означает один штамм. Как можно видеть, Лизин F307 лизирует около 90% протестированных штаммов и является наиболее активным против семи штаммов.
Пример 3
[00110] Лизис A. baumannii вызываемый F307.
[00111] На Фиг. 7 показаны репрезентативные трансмиссионные электронные микрофотографии клеток A. baumannii штамм 1791 после обработки полипептидом F307. На микрофотографии показано, что F307 вызывает лизис посредством экструзии цитоплазматической мембраны наружу клетки. (См. Фиг. 7, стрелки). Две 100 мл культуры A. baumannii штамм 1791 созданы на среде в BHI (ʺBrain Heart Infusionʺ - бульон с сердечно-мозговым экстрактом) и выращивались в 500 мл колбе в течение 1,5 ч при 37 °C, 200 об./мин. Затем клетки центрифугировали и промывали один раз буфером 1х PBS. Затем они были ресуспендированы в 1,2 мл 1х PBS. ЭДТК в конечной концентрации 250 мкМ была добавлена в каждый образец. Для экспериментального образца 300 мкл лизина (конечная концентрация ~1,2 мг), и инкубировали контроль (только ЭДТК) и экспериментальный образец (ЭДТК+F307 лизина) при 25 °C. Временные точки составляли 0,5, 1, 5, 10, 15 и 30 минут. Реакции останавливали и клетки фиксировали с помощью 2,5% глютарового альдегида в CAC буфере (10 мМ какодилата натрия, 0,1 М СаСl2, рН 6,5).
Пример 4
[00112] Влияние полипептида F307 на биопленки A. baumannii на катетерах in vitro и in vivo.
[00113] Обработка in vitro катетера облепленного A. baumannii 1791 при помощи лизина F307
[00114] Трубка катетера (CareFusion Ref № 72023E) была разрезана при помощи стерильного скальпеля на 3-дюймовые (7,62 см) отрезки. Ночная культура A. baumannii 1791 использовалась для инокулирования 1:1000 50 мл TSB 0,2% глюкозы (~1X105 КОЕ/мл). Каждый 3-дюймовый отрезок трубки катетера был засеян 300-350 мкл 1:1000 разведенной культуры. Затем катетеры были зажаты и помещены в пластиковые контейнеры в инкубатор на 37 °С на 3 суток для образования биопленки. После 3 суток катетеры были дважды промыты с помощью PBS или натрий-фосфатного буфера рН 7,5, а затем 300-350 мкл F307 добавляли в трубку (конечная концентрация ~1 мг). Затем катетеры были зажаты. Катетеры изымали во временные точки 0, 15 минут, 30 минут и 1 час. Катетеры были дважды промыты 50 мМ фосфатом натрия рН 7,5 и нарезаны небольшими кусочками. Их помещали в 1,5 мл пробирки эпендорф и добавляли 500 мкл 50 мМ буфера NaP pH 7,5. Пробирки обрабатывали ультразвуком в течение 20 минут, и перемешивали на вортексе в течение 1 минуты. Затем образцы были серийно разбавлены и 20 мкл высеивали на сектор BHI-агаровой пластинки, и инкубировали при 37°C в течение ночи. КОЕ рассчитывали на следующее утро.
[00115] Приблизительное 4-х кратное логарифмическое уменьшение числа колониеобразующих единиц (КОЕ A. baumannii наблюдалось после 30 минут обработки. В таблице 3 представлено число КОЕ. На Фигуре 8 представлены сканирующие электронные микрофотографии 3-суточных биопленок A. baumannii штамм 1791 до и после обработки 250 мкг полипептида F307.
Таблица 3. Обработка биопленок A. baumannii на катетерах.
Образец | КОЕ |
без обработки | 1,4×107 |
без повторной обработки | 3,0×106 |
15 минут обработки F307 | 9,0×104 |
30 минут обработки F307 | 6,0×103 |
Пример 5
[00116] Мышиная модель катетера: Несколько 3-дюймовых отрезков трубки катетера был засеяны (1:1000) штаммом 1791 A. baumannii. Биопленки A. baumannii формировались как описано выше. Спины двадцати белых мышей (BALB/C) были выбриты, их спины были стерилизованы, а затем был сделан надрез и помещен под дерму спины 1-дюймовый (2,54 см) катетер с уже образованной биопленкой. Разрезы затем были сшиты скобами. Через 24 часа, 250 мкл F307 (1 мг) (n=10) или 250 мкл контрольной несущей среды (n=10) вводили непосредственно в катетер, расположенный под дермой мыши. Обработку повторяли спустя 4 часа. Через 3 часа катетеры были удалены из мышей и проанализированы, как описано в эксперименте 4. На Фигуре 9 показано приблизительно 2-х кратное логарифмическое уменьшение количества бактерий у мышей, обработанных полипептидом F307 по сравнению с контролем.
Пример 6
[00117] Полипептид F307 предотвращает смерть мышей после летальной инъекции A. baumannii.
[00118] Двадцати двум мышам C57BL/6 ввели108 КОЕ штамма A. baumannii интраперитонеально (IP). Спустя два часа, две мыши были умерщвлены и органы, изучены, как описано ниже, десяти мышам вводили IP 1 мг F307 и десяти мышам вводили IP несущую среду. Обработанные животные продемонстрировали 50% выживаемость при данной дозе лизина, в то время, как контрольные мыши продемонстрировали только 10% выживаемость после 14 суток инфицирования (Фигура 10).
[00119] Органы у двух мышей, которые были усыплены после инфицирования, были обследованы для подтверждения того, что органы были инфицированы А. baumannii на момент обработки полипептидом F307. Печень, селезенка, почка и сердце были извлечены из мышей. Органы затем гомогенизировали в 500 мкл 1x PBS. Растворы были изготовлены и высеяны на чашки Петри с бульоном с сердечно-мозговым экстрактом (BHI). Чашки инкубировали в течение ночи при температуре 37 °С. Количество колониеобразующих единиц было подсчитано. Контрольные мыши были умерщвлены в точке времени, равной двум часам и продемонстрировали наличие Acinetobacter во всех осмотренных органах, что указывает на то, что органы были инфицированы А. baumannii во время обработки.
Пример 7
[00120] Полипептид P307 (SEQ ID NO:43) был протестирован в двух повторностях против 18 клинических изолятов штаммов A. baumannii. Штаммы A. baumannii культивировали в течение ночи до достижения стационарной фазы. Клетки были промыты 3 раза в 20 мМ Трис рН 7,5 и ресуспендированы в том же буфере до ОП (595 нм) около 0,7. К этим клеткам был добавлен P307 (250 мкг/мл) или соответствующий объем буфера, и смесь инкубировали 60 минут при комнатной температуре. Были проведены и высеяны на агаровые пластины TSB разведения смесей для последующего подсчета колониеобразующих единиц.
[00121] Обработка полипептидом P307 привела к 1-8 кратному логарифмическому уменьшению жизнеспособности бактерий по сравнению с контролем после инкубации в течение 60 минут с 250 мкг P307. Результаты приведены в Таблице 4. При сравнении P307 с полноразмерным полипептидом F307 (SEQ ID NO:1), полипептид P307 имел более высокую активность.
Таблица 4. Активность P307 против 18 штаммов A. baumannii.
Штамм | Контроль 1 | Контроль 2 | Контроль среднее | P307 1 | P307 2 | P307 Среднее | Разница | Логарифмическое уменьшение |
1775 | 1,00E+ 08 |
4,50E+ 08 |
2,75E+08 | 1,00E+ 07 |
1,50E+07 | 1,25E+07 | 2,20E+01 | 1,34 |
1776 | 5,50E+08 | 3,50E+08 | 4,50E+08 | 8,80E+05 | 7,50E+05 | 8,15E+05 | 5,52E+02 | 2,74 |
1777 | 7,00E+08 | 4,00E+08 | 5,50E+08 | 6,50E+06 | 9,00E+06 | 7,75E+06 | 7,10E+01 | 1,85 |
1788 | 2,00E+08 | 3,00E+08 | 2,50E+08 | 1,50E+07 | 1,20E+07 | 1,35E+07 | 1,85E+01 | 1,27 |
1789 | 4,50E+08 | 3,50E+08 | 4,00E+08 | 1,10E+07 | 1,30E+07 | 1,20E+07 | 3,33E+01 | 1,52 |
1790 | 1,50E+08 | 2,00E+08 | 1,75E+08 | 5,50E+05 | 1,80E+05 | 3,65E+05 | 4,79E+02 | 2,68 |
1791 | 9,0E+08 | 4,5E+08 | 6,8E+08 | 2,2E+05 | 2,2E+05 | 2,2E+05 | 3,1E+03 | 3,49 |
1792 | 1,2E+09 | 8,5E+08 | 1,0E+09 | 7,1E+05 | 7,5E+05 | 7,3E+05 | 1,4E+03 | 3,15 |
1793 | 3,5E+08 | 5,0E+08 | 4,3E+08 | 6,5E+05 | 5,6E+05 | 6,1E+05 | 7,0E+02 | 2,85 |
1794 | 7,5E+08 | 4,0E+08 | 5,8E+08 | 7,0E+05 | 6,0E+05 | 6,5E+05 | 8,8E+02 | 2,95 |
1795 | 9,5E+08 | 1,3E+09 | 1,1E+09 | 9,0E+06 | 2,5E+07 | 1,7E+07 | 6,6E+01 | 1,82 |
1796 | 1,0E+09 | 7,0E+08 | 8,5E+08 | 8,2E+05 | 8,2E+05 | 8,2E+05 | 1,0E+03 | 3,02 |
1797 | 1,2E+09 | 9,0E+08 | 1,1E+09 | 6,7E+05 | 6,5E+05 | 6,6E+05 | 1.6E+03 | 3,20 |
1798 | 4,0E+08 | 4,0E+08 | 4,0E+08 | 2,7E+05 | 6,5E+05 | 4,6E+05 | 8,7E+02 | 2,94 |
1799 | 5,5E+08 | 3,5E+08 | 4,5E+08 | 2,9E+07 | 7,0E+06 | 1,8E+07 | 2,5E+01 | 1,40 |
S1 | 1,4E+09 | 1,1E+09 | 1,3E+09 | 4,2E+07 | 3,0E+07 | 3,6E+07 | 3,5E+01 | 1,54 |
S3 | 2,5E+08 | 2,0E+08 | 2,3E+08 | 6,8E+05 | 6,5E+05 | 6,7E+05 | 3,4E+02 | 2,53 |
S5 | 1,1E+09 | 8,5E+08 | 9,8E+08 | 1,0E+00 | 1,0E+00 | 1,0E+00 | 9,8E+08 | 8,99 |
Пример 8
[00122] Добавление пептида с коротким удлинением приводит к усилению антибактериальной активности P307.
[00123] Пептид SQSRESQC (SEQ ID NO:44) получен от вируса гепатита С и было показано, что он обладает антибактериальной активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий. Мы конъюгировали данную последовательность с P307 (P307Ex), чтобы определить ее влияние на активность. Последовательность F307, p307 и P307Ex (SEQ ID NO: 1, 43 и 45 соответственно) представлены на Фиг. 11, в которых часть последовательности F307 подчеркнута, чтобы показать расположение P307, а часть последовательности P307 отмечена двойным подчеркиванием, чтобы показать расположение противомикробной последовательности.
[00124] P307 и P307Ex были исследованы в двух повторностях против шести штаммов бактерий. Антибактериальные активность измеряли, как описано в Примере 5. Обработка P307Ex привела к логарифмическому уменьшению А. baumannii 1791 в 3,2 раза, в то время как обработка P307 привела к логарифмическому уменьшению в 2,9 раз, продемонстрировав, что добавление антибактериального пептида увеличило активность P307. Результаты представлены в Таблице 5.
Таблица 5
Штамм | Контроль 1 | P307 EX1 | P307 EX 2 | P307Ex среднее | Разница | Логарифмическое уменьшение |
1775 | 5,00E+08 | 1,60E+05 | 1,10E+05 | 1,35E+05 | 3,70E+03 | 3,5 |
1776 | 5,00E+08 | 5,50E+05 | 6,50E+05 | 6,00E+05 | 8,33E+02 | 2,9 |
1777 | 6,50E+08 | 6,50E+04 | 2,80E+05 | 1,73E+05 | 3,77E+03 | 3,5 |
1788 | 3,50E+08 | 8,80E+05 | 5,80E+05 | 7,30E+05 | 4,79E+02 | 2,6 |
1789 | 4,00E+08 | 1,10E+07 | 1,30E+07 | 1,20E+07 | 3,33E+01 | 1,5 |
1790 | 2,00E+08 | 1,50E+04 | 2,00E+04 | 1,75E+04 | 1,14E+04 | 4,0 |
1791 | 3,50E+08 | 4,00E+04 | 4,50E+04 | 4,25E+04 | 8,24E+03 | 3,9 |
1792 | 1,00E+08 | 4,00E+04 | 5,00E+03 | 2,25E+04 | 4,44E+03 | 3,6 |
1793 | 1,50E+08 | 3,50E+04 | 2,00E+04 | 2,75E+04 | 5,45E+03 | 3,7 |
1794 | 5,00E+07 | 1,40E+05 | 1,00E+05 | 1,20E+05 | 4,17E+02 | 2,6 |
1795 | 4,00E+08 | 5,50E+04 | 1,30E+05 | 9,25E+04 | 4,32E+03 | 3,6 |
1796 | 2,50E+08 | 3,80E+05 | 2,50E+05 | 3,15E+05 | 7,94E+02 | 2,8 |
1797 | 2,50E+08 | 5,50E+06 | 8,50E+06 | 7,00E+06 | 3,57E+01 | 1,5 |
1798 | 3,50E+08 | 3,40E+05 | 3,70E+05 | 3,55E+05 | 9,86E+02 | 3,0 |
1799 | 3,50E+08 | 5,00E+03 | 3,00E+04 | 1,75E+04 | 2,00E+04 | 4,3 |
S1 | 8,50E+08 | 5,90E+05 | 7,00E+05 | 6,45E+05 | 1,32E+03 | 3,1 |
S3 | 3,00E+08 | 1,60E+07 | 1,40E+07 | 1,50E+07 | 2,00E+01 | 1,3 |
S5 | 1,50E+09 | 5,00E+05 | 2,90E+05 | 3,95E+05 | 3,80E+03 | 3,57 |
[00125] P307 и P307Ex были протестированы на активность против A. baumannii штамм 1791, E. coli, P. aeruginosa штамм PAO1, S. aureus штамм RN4220, S. aureus штамм 8325 и B. anthracis. Как представлено в Таблице 6, P307 и P307 являлись наиболее активными против A. baumannii и B. anthracis.
Таблица 6. P307 и P307Ex против других видов бактерий.
Образец | A. baumannii 1791 | E. coli | B. anthracis Δsterne | Pseudomonas aeruginosa PAO1 | S. aureus RN4220 | S. aureus 8325 |
контроль 1 | 5,50E+08 | 5,50E+08 | 2,40E+07 | 1,30E+09 | 1,50E+09 | 6,50E+08 |
контроль 2 | 2,60E+08 | 4,50E+08 | 2,80E+07 | 4,50E+08 | 7,50E+08 | 9,50E+08 |
P307EX 1 | 1,10E+05 | 3,50E+08 | 2,60E+03 | 4,70E+07 | 5,20E+07 | 3,20E+07 |
P307EX 2 | 3,90E+05 | 3,00E+08 | 2,90E+03 | 3,70E+07 | 5,80E+07 | 3,60E+07 |
P307 1 | 5,80E+05 | 3,50E+08 | 3,10E+03 | 5,60E+07 | 8,00E+08 | 4,80E+07 |
P307 2 | 3,70E+05 | 3,50E+08 | 4,00E+03 | 4,00E+07 | 4,50E+08 | 4,40E+07 |
контроль среднее | 4,05E+08 | 5,00E+08 | 2,60E+07 | 8,75E+08 | 1,13E+09 | 8,00E+08 |
P307EX среднее | 2,50E+05 | 3,25E+08 | 2,75E+03 | 4,20E+07 | 5,50E+07 | 3,40E+07 |
P307 среднее | 4,75E+05 | 3,50E+08 | 3,55E+03 | 4,80E+07 | 6,25E+08 | 4,60E+07 |
P307EX разница | 1,62E+03 | 1,54E+00 | 9,45E+03 | 2,08E+01 | 2,05E+01 | 2,35E+01 |
P307 разница | 8,53E+02 | 1,43E+00 | 7,32E+03 | 1,82E+01 | 1,80E+00 | 1,74E+01 |
P307EX логарифмическое уменьшение | 3,2 | 0,2 | 4,0 | 1,3 | 1,3 | 1,4 |
P307 логарифмическое уменьшение | 2,9 | 0,2 | 3,9 | 1,3 | 0,3 | 1,2 |
Пример 9
[00126] P307 не является токсичным для B-лимфоцитов или эритроцитов.
[00127] P307 был смешан с эритроцитами, чтобы определить, будет ли он вызывать лизис. Лизис не наблюдался при концентрации P307 равной 200 мкг. При тестировании влияния P307 на лизис B-лимфоцитов было выявлено только незначительное влияние на количество клеток после 24 часов. Результаты представлены в Таблице 7.
Таблица 7 (% жизнеспособных)
Образец | 0 мин | 5 мин | 30 мин | 1 час | 2 часа | 3 часа | 24 часа |
Только инициальные клетки | 97% | 83,60% | 85% | 88,20% | |||
Трис-HCl pH=6,8 | 97,20% | 89,70% | 94,70% | 81,50% | 90,90% | 89,90% | |
200 мкг P307 | 94,60% | 1100% | 71,40% | 71,90% | 58,60% | 76,30% | |
20 мкг P307 | 97,20% | 88,60% | 89,70% | 90,30% | 91,00% | 94,20% | |
2 мкг P307 | 95,20% | 76,90% | 89,30% | 92,50% | 93,80% | 96,30% |
[00128] Пептиды, использованные в Примерах 10-20 были химически синтезированы.
[00129] Пептиды были созданы с помощью установки для синтеза пептидов Protein Technologies Symphony™ peptide synthesizer (PTI Tucson, штат Аризона, США) на предварительно связанной смоле Ванга (П-алкокси-бензиловый спирт) (Bachem, Торранс, штат Калифорния, США). Реакционные емкости были загружены в концентрации 25 мкМ, и пептиды были удлинены, с использованием защищенных аминокислот Fmoc (Anaspec, Сан-Хосе, штат Калифорния, США) (1997.StandardFmocprotocols.289:44-67). Снятие защиты с амина было выполнено с помощью 20% пиперидина (Sigma-Aldrich) в NMP (Н-метилпирролидиноне). Повторяющиеся реакции связывания были проведены с использованием 0,6 М HATU/Cl-HOBT (азабензотриазол тетраметилурониум гексафторфосфата/6-хлор-1-гидроксибензотриазола) (P3 Biosystems, Шелбивилл, штат Кентукки, США) и 0,4 М НММ (н-метилморфолина) с помощью NMP (EMD) в качестве основного растворителя (1989.NewCouplingReagentsinPeptideChemistry30:1927-1930.). Расщепление смолы и снятие защиты с боковых цепей было достигнуто за счет переноса в 100 мл круглодонную колбу и реагирования с 4,0 мл концентрированной, трифторуксусной кислоты, с классом чистоты для секвенирования (Fisher) с триизопропилсиланом (Fluka), дегазированной водой и 3,6-диокса-1,8-октанедитиолом (DODT, Sigma-Aldrich) в соотношении 95:2:2:1 в течение 6 часов. Затем проводили фильтрацию на колонке в 50 мл круглодонную колбу и объем TFA уменьшали до 2 мл с помощью роторного испарителя. Была проведено стандартное осаждение эфиром для индивидуальных пептидов путем переноса в 50 мл пробирки фирмы Falcon, содержащие 40 мл холодного трет-бутилового метилового эфира (TBME, Sigma-Aldrich). Образцы были помещены на ледяную баню на 2 часа, для осуществления осаждения с последующим формированием осадка с помощью центрифугирования (3300 об/мин, 5 мин). Избыток эфира был удален при помощи вакуумной-аспирации, а пептидный осадок оставляли сушиться в течение ночи в вытяжном шкафу. Высушенные осадки пептидов были растворены в 20% ацетонитриле и 10 мл воды для ВЭЖХ, аликвотированы для ЖХ/МС и лиофилизированы. Все сырые продукты были впоследствии проанализированы с помощью обращенно-фазовой СВЭЖХ (сверхэффективной жидкостной хроматографии) Aquity™ (Waters Chromatography, Милфорд, штат Массачусетс, США) с использованием колонки Waters BEH C18. Целостности отдельных пептидов была проверена тандемной масс-спектрометрией с электрораспылением с использованием спектрометрической системы ThermoFinnigan LTQ™ (Thermo Fisher, Уолтем, штат Массачусетс, США). Препаративная хроматография была выполнена на препаративной колонке Vydac C18 RP с использованием ВЭЖХ Waters 600 Prep. Отдельные фракции были собраны с 30-ти секундными интервалами, охарактеризованные с использованием ЖХ/МС и фракции, содержащие желаемый продукт был лиофилизированы. Их поместили на хранение при температуре -20°C до ресуспендирования в автоклавированной воде Milli-Q для различных анализов. Затем исходные растворы хранили при 4 °C. Пептиды кратко изложены с учетом их аминокислотных последовательностей, изоэлектрической точки (pI) и молекулярной массы (MW) в таблице 8.
Таблица 8
Названия | Аминокислотная последовательность | pI | Молек. Масса |
SEQ ID NO: |
F307 | 10,12 | 16 кДа | 1 | |
P307 | NAKDYKGAAAEFPKWNKAGGRVLAGLVKRRK | 10,71 | 3,4 кДа | 43 |
P307AE-8 | NAKDYKGAAAEFPKWNKAGGRVLAGLVKRRK AEMELFLK | 10,21 | 4,4 кДа | 49 |
P307SQ-8C | NAKDYKGAAAEFPKWNKAGGRVLAGLVKRRK SQSRESQC | 10,38 | 4,3 кДа | 45 |
P307CS-8 | NAKDYKGAAAEFPKWNKAGGRVLAGLVKRRK CSQRQSES | 10,38 | 4,3 кДа | 51 |
P307SQ-8A | NAKDYKGAAAEFPKWNKAGGRVLAGLVKRRK SQSRESQA | 10,69 | 4,3 кДа | 53 |
Пример 10
[00130] Сравнение in vitro бактерицидной активности пептидов настоящего раскрытия.
[00131] Для определения in vitro бактерицидной активности пептидов, P307, P307AE-8, P307SQ-8C и P307CS-8, бактерии обрабатывали пептидами в течение 2 часов при комнатной температуре. Выжившие клетки серийно разводили и высевали на чашки с TSB агаром для определения активности.
[00132] Бактерицидную активность 50 мкг/мл пептидов P307, P307AE-8 и P307SQ-8C сравнивали путем обработки A. baumannii, штаммы № 1791, S5 и ATCC17978. P307SQ-8C являлся самым активным, снижая около 106 кое/мл бактерий до уровня ниже предела обнаружения (<10 кое/мл). P307 был чуть более активен, чем P307AE-8, однако оба пептида вызывали снижение жизнеспособности бактерий равное около 3,8 логарифмических единиц (Фиг. 2A). Чтобы выяснить, как восемь аминокислот, SQSRESQC, способствовали увеличению активности P307SQ-8C, одинакова молярная концентрация пептида SQSRESQC эквивалентная 50 мкг/мл P307 была добавлена отдельно или в комбинации с P307 к A. baumannii, штаммы № 1791 и S5. Активность сравнивали с 50 мкг/мл P307 и P307SQ-8C. Комбинация была так же активна, как P307 в то время, как пептид SQSRESQC, взятый отдельно не проявлял активности (Фиг. 2B). Следовательно, связь имеет важное значение для высокой бактерицидной активности P307SQ-8С. Далее мы исследовали важность последовательности и состава. Путем перестановки последних восьми аминокислот P307SQ-8C мы синтезировали P307CS-8 с C-концевым добавлением CSQRQSES к P307. Активности P307SQ-8C и P307CS-8 были сопоставимы (Фиг. 2C). Планки погрешностей показывают стандартное отклонение, а черная горизонтальная линия обозначает предел обнаружения. Таким образом, мы пришли к выводу, что превосходящая активность P307SQ-8С зависит от состава последних восьми аминокислот, вне зависимости от последовательности последних восьми аминокислот. Для дальнейших исследований мы использовали P307SQ-8С потому что он обладал наибольшей активностью, и сравнивали его активность с P307.
Пример 11
[00133] Бактерицидная активность P307 и P307SQ-8C
[00134] Было исследовано влияние pH и NaCl на in vitro активность P307 и P307SQ-8C. A. baumannii штамм № 1791 обрабатывали 50 мкг/мл пептидов для проверки каждого условия. Две буферные системы (фосфат натрия и Трис-HCl) использовали для тестирования pH равного 6,8, 7,5, 8,0 и 8,8. Пептиды были более активны в Трис-HCl, а более высокий pH вызывал улучшенный лизис (Фиг. 13A). Таким образом, мы решили продолжить наши in vitro эксперименты с 50 мм Трис-HCl, рН 7,5, что соответствует физиологическому рН. Активность обоих пептидов была обратно пропорциональна концентрации NaCl (Фиг. 13B). Далее титрование P307 и лизисная кинетика P307 и P307SQ-8С были исследованы путем обработки A. baumannii, штамм № 1791. Активность P307 находилась в зависимости от концентрации, начиная с 4-х мкг/мл (Фиг. 13C). P307SQ-8С действовал быстрее, чем P307, в результате чего наблюдалось уменьшение равное около 3,2 логарифмических единиц уже в 5-минутный момент времени (Фиг. 13D). Не было никакой разницы в активности любого пептида при комнатной температуре или 37 °С (данные не представлены). Из этих in vitro характеризующих экспериментов, мы решили, что наши оптимальные экспериментальные условия должны быть следующими: 50 мм Трис-HCl, рН 7,5, 50 мкг/мл пептидов и 2 часа при комнатной температуре (22-25 °С), если не указано иное.
Пример 12
[00135] Далее мы исследовали in vitro бактерицидные спектры P307 и P307SQ-8С против различных видов бактерий - А. baumannii (штаммы № 1775, 1776, 1777, 1788, 1789, 1790, 1791, 1792, 1793, 1794, 1796, 1797, 1798, 1799, ATCC 17978 и S1, S3, D5), Bacillus anthracis (ΔSterne), Escherichia coli (DH5α), Pseudomonas aeruginosa (PA01), Staphylococcus aureus (RN4220) и двух штаммов Klebsiella pneumonia (ATCC 700603 и ATCC10031). Эти виды бактерий обрабатывали 50 мкг/мл P307 или P307SQ-8С в 50 мм Трис-HCl, рН 7,5 в течение 2 часов при комнатной температуре для исследования специфичности пептидов. Среди исследованных бактерий, штаммы А. baumannii были последовательно наиболее чувствительны к пептидам, демонстрируя среднее уменьшение равное 2,7 и 6,2 логарифмических единиц с P307 и P307SQ-8С соответственно. Bacillus anthracis, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus являются умеренно чувствительными. P307 и P307SQ-8C вызвали среднее уменьшение равное около 1,3 и 2,9 логарифмических единиц, соответственно, для данных бактерий. Однако Escherichia coli и Klebsiella pneumoniae являются устойчивыми к обоим пептидам (Фиг. 14).
Пример 13.
[00136] Кроме того, чтобы исследовать активность пептидов против A. baumannii на разных фазах роста, мы сравнили чувствительность штамма № 1791 в лог фазу, стационарную фазу и при состоянии биопленки. Бактерии в лог фазе (3 часа после инокуляции 1:100 ночной культуры на свежей среде) и стационарной фазе (ночная культура) обрабатывали 50 мкг/мл P307 или P307SQ-8С в течение 2 часов при комнатной температуре. Выжившие клетки серийно разводили и высевали на чашки с TSB агаром для определения соотношения кое/мл. (Фигура 15A). Биопленки A. baumannii были созданы путем инкубации около 105 кое/мл штамм № 1791 в TSB с 0,2% глюкозы внутрь катетеров длиной около 2,5 см в течение 72 часов при 37 °С. Затем катетеры промывали для удаления планктонных клеток и обрабатывали 250 мкг/мл P307 или P307SQ-8С. Спустя 2 часа и 24 часа при комнатной температуре, биопленки был полностью разрушены, а выжившие клетки ресуспендировали для посева и подсчета, с целью определения лизисной эффективности пептидов против in vitro биопленки. (Фиг. 15B) Организмы, находящиеся в лог фазе были несколько более чувствительны к P307, чем те, что находились в стационарной фазе (около 3,7 против 2,4 логарифмических единиц снижения). Похоже, что не существовало такой разницы в случае P307SQ-8С (Фиг. 15А). Биопленки являлись наиболее устойчивыми из всех фаз роста. Биопленки обрабатывали 250 мкг/мл P307 или P307SQ-8C в течение 2 или 24 ч. Через 2 часа наблюдалось снижение, равное около 3 и 4 логарифмических единиц кое/мл с P307 и P307SQ-8С соответственно. После 24 часов, P307 производил дополнительно снижение, равное около 1,3 логарифмических единиц, а P307SQ-8С не вызывал такого эффекта. (Фиг. 15Б).
Пример 14
[00137] Для того, чтобы сравнить эффективность пептидов P307 и P307SQ-8С с клинически используемым антибиотиками, мы провели исследование минимальный ингибирующее концентрации для двух штаммов А. baumannii № 1791 и ATCC17978. Способ микротитровального разведения был использован для определения МИК (максимальных ингибирующих концентраций) левофлоксацина, цефтазидима, полимиксина B, P307 и P307SQ-8C на А. baumanni штаммы № 1791, № 1798, S5 и ATCC17978. Для антибиотиков были включены 1,5-2 кратные серийные разведения (три нижних и три верхних) МИК, определенные при помощи системы EtestLoodR,etal.,2015Antimicrob.AgentsChemother.59:1983-1991.). Для пептидов были протестированы 2-х кратные серийные разведения (500-31,25 мкг/мл). Ночную культуру ресуспендировали до OD600 равной 0,001 (около 105 КОЕ/мл) в бульоне Мюллера-Хинтона (pH 7,9). Антибиотики или пептиды были добавлены для достижения разведения, равного 100 мкл. Бактерии оставляли расти в течение 24 часов при 37°C и 220 об/мин. Поглощение при длине волны равной 595 нм затем регистрировали при помощи SpectraMax Plus Reader (Molecular Devices). МИК были определены как самые низкие концентрации антимикробных препаратов, которые полностью подавляют рост бактерий. Для подтверждения данных, полученных при измерении OD595 был использован Alamar®Blue. Эксперименты проводились как минимум дважды с двумя повторностями.
[00138] Штаммы продемонстрировали различную степень чувствительности ко всем антибактериальным препаратам (таблица 9).
Таблица 9
Штаммы A. baumannii | Левофлоксацин | Цефтазидим | Полимиксин B | P307 | P307SQ-8C | |||||
мкг/мл | мкМ | мкг/мл | мкМ | мкг/мл | мкМ | мкг/мл | мкМ | мкг/мл | мкМ | |
№ 1791 | 6 | 16,6 | 250 | 457 | 0,25 | 0,19 | 375 | 110 | 125 | 29 |
ATCC17978 | ≤0,1 | 0,3 | 12 | 21,9 | 0,25 | 0,19 | 750 | 220 | ≤500 | ≤116 |
[00139] P307SQ-8C имел более низкую МИК по сравнению с P307, который соответствовал in vitro лизирующей активности (Фиг. 2 и 3).
Пример 15
[00140] Цитотоксические эффекты P307 и P307SQ-8C измеренная на основании выживаемости и гемолиза B клеток.
[00141] B-клетки человека, полученные от пациента, больного ревматической лихорадкой в больнице университета Рокфеллера были выращены на среде RPMI с добавлением 10% бычьей сыворотки, пенициллина и стрептомицина. Клетки собирали при помощи низкоскоростного центрифугирования, промывали один раз в среде, и ресуспендировали в предварительно прогретой среде в концентрации 107 клеток/мл, как определено при помощи теста на вытеснение трипанового синего. Пептиды (P307, P307SQ-8C и мелиттин) серийно разводили (80-0,3125 мкМ) в культуральной среде, и добавляли к 5×104 живым клеткам. Клетки инкубировали 1 час при 37 °С В увлажненной атмосфере с 5% CO2, после чего их окрашивали в соответствии с инструкциями производителя (нерадиоактивный анализ пролиферации клеток CellTiter 96; Promega). Образцы инкубировали дополнительно 4 часа, прежде чем добавляли солюбилизирующий/стоп раствор и инкубировали в течение ночи. Поглощение при 570 нм измеряли при помощи SpectraMax Plus Reader (Molecular Devices). Реакции проводили дважды с тремя повторностями, а репрезентативные данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.
[00142] Человеческую кровь от здорового человека собирали в ЭДТК-вакутейнеры, и красные кровяные клетки (RBC), собирали при помощи центрифугирования на низкой скорости. Клетки промывали в PBS, и ресуспендировали до получения до 10% раствора RBC. P307 и P307SQ-8C последовательно разводили в PBS (80-0,3125 мкM). PBS и 1% Тритон X-100 использовали в качестве отрицательного и положительного контроля, соответственно. Образцы смешивали, и инкубировали 1 час при 37 °С. Супернатант собирали, и поглощение при 405 нм записывали с помощью SpectraMax Plus Reader (Molecular Devices). Реакции проводили дважды с тремя повторностями, а репрезентативные данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.
[00143] Серийные разведения пептидов инкубировали с около 5×104 живых B-клеток в течение 1 ч при 37 °С в увлажненной атмосфере содержащей 5% CO2, и мелиттин был использован в качестве положительного контроля. Нерадиоактивный анализ пролиферации клеток CellTiter 96 ® (Promega) проводили согласно протоколу производителя для количественной оценки выживаемости B-клеток. Красные клетки крови (RBC) инкубировали с серийными разведениями пептидов, а высвобождение гемоглобина в супернатант измеряли при OD405 для определения гемолиза. Тритон X-100 использовали в качестве положительного контроля. Планки погрешностей показывают стандартное отклонение.
[00144] Пептиды были протестированы на цитотоксичность с использованием человеческих B-клеток и красных клеток крови (эритроцитов) (RBC). В отличие от положительного контроля с мелиттином, мембраны B-клеток не поражались ни P307, ни P307SQ-8С. Даже при самой высокой протестированной концентрации (80 мкM), жизнеспособность клеток оставалась такой же, как в контроле с буфером (Фигура 16A). Аналогично, на целостность эритроцитов также не влиял пептид в сравнении с положительным контролем с Тритоном X-100 (рис. 16Б).
Пример 16
[00145] Часть P307SQ-8C (около 25%) имеет подвижность в геле характерную для двойной теоретической молекулярной массы в сравнении с P307SQ-8A, который имеет подвижность характерную для 4,3 кДа (данные не представлены). Для определения важности образования дисульфидной связи для высокой активности P307SQ-8С бактерицидная активность P307 и P307SQ-8С, была сравнена в присутствии 0, 0,1 и 1 мМ дитиотреитола (ДТТ). A. baumannii штамм № 1791 обрабатывали 50 мкг/мл P307 или 10 мкг/мл P307SQ-8C в 50 мМ Трис-HCl, pH 7,5 в течение 2 часов при комнатной температуре. Выжившие клетки серийно разводили и высевали на TSB агар. P307SQ-8С становился менее активным при более высокой концентрации ДТТ, тогда как активность P307 незначительно увеличивалась (Фиг. 17А). Для дальнейшего подтверждение важности формирования дисульфидных связей для активности P307SQ-8С, мы синтезировали P307SQ-8А с заменой последнего цистеина на аланин. Штаммы A. baumannii №. 1791 и ATCC17978 обрабатывали 10 мкг/мл каждого пептида. Бактерицидные анализ P307SQ-8C и P307SQ-8А показал, что первый был немного более активным, чем второй (Фиг. 17Б). Данные результаты в целом указывают, что часть повышенной активности P307SQ-8С возникает из-за образования дисульфидной связи между двумя молекулами.
Пример 17
[00146] Далее мы исследовали, может ли P307 связывается с ДНК, учитывая положительные заряды на пептидах (суммарный заряд +7). Пептид P307 смешивали с ДНК на разных соотношениях пептид:ДНК (0:1-15:1) и инкубировали в течение 1 часа, после чего анализировали на агарозном геле. В сравнении с положительным пептидным контролем, не наблюдалось никаких сдвигов молекулярной массы для P307 в любом из протестированных соотношений пептида к ДНК (Фиг. 18).
Пример 18
[00147] Так как пептиды, по-видимому, не лизируют бактерии, взаимодействуя с ДНК, мы исследовали, могут ли они повлиять на бактериальную мембрану с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (TEM). A. baumannii штамм № 1791 обрабатывали буфером (контроль) или 300 мкг/мл P307SQ-8C в течение 5 минут или 2 часов. Сравнение микрофотографий TEM образцов продемонстрировало разрушение внутренней мембраны и изменение плотности межклеточной среды (Фиг. 19А, B и C). Кроме того мы обнаружили, что бактерии устойчивые при pH 7,5 (Фиг 3) были чувствительны к P307 при pH 8,8, включая E. coli и K. pneumoniae (Фиг. 19D). Поскольку заряды на пептиде не изменяются при изменении рН от 7,5 до 8,8, мы полагали, что изменения происходят на бактериальной мембране. При повышенном рН, бактериальная мембрана становится более отрицательно заряженной, что позволяет положительно заряженным пептидам устанавливать более прочные ионные взаимодействия.
Пример 19
[00148] Не желая быть связанными теорией, мы предполагаем следующий механизм действий: P307SQ-8С взаимодействует с бактериальной мембраной, чтобы попасть в клетку, и в этом процессе разрушает цитоплазматическую мембрану. Пермеабилизация мембраны является более эффективной, когда пептид является димеризованым. Нарушение индуцирует образование активных форм кислорода, таких как гидроксильные радикалы, которые разрушают внутриклеточное содержимое. Чтобы исследовать данную гипотезу, мы определили разрушение мембраны с помощью анализа поглощения SYTOX® зеленого.
[00149] Ночные культуры бактерий промывали в 50 мМ Трис-HCl pH 7,5, и ресуспендировали до OD600 равной 0,3 (около 107 КОЕ/мл). Бензоназ® нуклеазу (25 Ед/мл)(Novagen) и SYTOX® зеленый (1 мкМ)(Invitrogen) добавляли к клеткам бактерий и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. Добавляли пептиды (50 мкг/мл; 14,7 мкM P307 и 11,6 мкM P307SQ-8C), а мелиттин (14,7 мкM)(Sigma) использовали в качестве контроля. Относительные единицы флуоресценции (RFU) были измерены с помощью SpectraMax Plus reader (Molecular Devices) при комнатной температуре (возбуждение, 485 нм, эмиссия: 520 нм) в течение 2 часов. Реакции проводили дважды с двумя повторностями, а репрезентативные данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.
[00150] Оба пептида пермабилизируют мембраны чувствительных бактерий, что приводит к увеличению флуоресцентного сигнала красителя SYTOX® зеленый когда он связывается с внутриклеточной ДНК (Фиг. 20). Образование гидроксильных радикалов исследовали путем обработки бактерий P307 и P307SQ-8С в присутствии акцептора гидроксильного радикала, тиомочевины. Полимиксин B был включен в качестве контроля, поскольку сообщалось, что его бактерицидная активность частично связана с путем деструкции гидроксильным радикалом. Тиомочевина (300 мМ) ингибирует активность P307 и P307SQ-8С полностью (Фиг. 21A). Однако, нельзя забывать, что тиомочевина влияет на активность другими путями. Поэтому, бактерицидную активность также сравнивали в аэробных и анаэробных условиях. Так как A. baumannii представляет собой облигатно аэробный вид бактерий, для бактерицидных анализов использовали E. coli с 50 мМ Трис-HCl, pH 8,8. Обе пептидных активности были полностью ингибированы в анаэробных условиях (Фиг. 21B). Хотя мы не можем исключать другие возможности, такие как влияние на кислород-зависимый транспортный механизм, текущие результаты подтверждают нашу гипотезу об образовании гидроксильных радикалов.
Пример 20
[00151] Мы исследовали in vivo активность P307SQ-8C с использованием модели кожи мыши, потому что кожная инфекция является широко распространенным путем заболевания A. baumannii. Спины 40 CD-1 самок мышей (возрастом 6-8 недель; Charles River Laboratories) были побриты при помощи электробритвы. NairTM (лосьон для удаления волос для тела и ног, алоэ и ланолин) наносили на побритые участки для удаления оставшихся волос. Затем эти участки были продезинфицированы спиртовыми салфетками, и ссадины на коже были созданы при помощи соскоба липкой лентой. Область кожи размером ~ 1 см2 на которой проводили соскоб липкой лентой затем отмечали и инфицировали 10 мкл с около 108 КОЕ/мл A. baumannii штамм № 1791. Бактерии оставляли для образования колоний в течение 16-18 часов, после чего инфицированные участки оставляли необработанными или обрабатывали 200 мкг P307SQ-8C или 2 мкг полимиксина B в течение 2 часов. Для сбора оставшихся бактерии с поверхности кожи, мышей умерщвляли и инфицированную кожу обрабатывали в 500 мкл PBS в течение 1 минуты в Stomacher® 80 Biomaster с применением микросумки (Seward Ltd., Великобритания). Раствор последовательно разбавляли и высеивали на LB агар, содержащий 4 мкг/мл левофлоксацина и 12 мкг/мл ампициллина для селекции. Итоговые значения КОЕ/мл от каждого животного изображены как точка, а горизонтальные черта представляют собой среднее значение. Обе обработки значительно снизили бактериальную нагрузку (p-значение=0,0023, обычный однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA)) (Фиг. 22).
Claims (36)
1. Полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21, причем полипептид обладает антибактериальной активностью против каждой инфекционной бактерии, выбранной из А. baumannii, E. coli, P. aeruginosa, S. aureus, B. anthracis и K. pneumonia.
2. Полипептид по п. 1, отличающийся тем, что состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21.
3. Конъюгат, содержащий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21, причем полипептид конъюгирован с антимикробным пептидом, и конъюгат обладает антибактериальной активностью против каждой инфекционной бактерии, выбранной из A. baumannii, E. coli, P. aeruginosa, S. Aureus, B. Anthracis и K. pneumonia.
4. Конъюгат по п. 3, отличающийся тем, что состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21.
5. Конъюгат по любому из пп. 3 или 4, отличающийся тем, что антимикробный пептид имеет аминокислотную последовательность AEMLFLK (SEQ ID NO: 48) или SQSRESQA (SEQ ID NO: 52).
6. Конъюгат по п. 3 или 4, отличающийся тем, что антимикробный пептид имеет аминокислотную последовательность SQSRESQC (SEQ ID NO: 44) или CSQRQSES (SEQ ID NO: 50).
7. Конъюгат по п. 3 или 4, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45 или SEQ ID NO: 51.
8. Конъюгат по любому из пп. 3-7, отличающийся тем, что C-конец полипептида конъюгирован с антимикробным пептидом.
9. Конъюгат по п. 8, отличающийся тем, что C-конец полипептида конъюгирован с N-концом антимикробного пептида посредством пептидной связи.
10. Конъюгат по любому из пп. 3-7, отличающийся тем, что N-конец полипептида конъюгирован с антимикробным пептидом.
11. Конъюгат по п. 10, отличающийся тем, что N-конец полипептида конъюгирован с С-концом антимикробного пептида посредством пептидной связи.
12. Полипептид по п. 1 или 2 или конъюгат по любому из пп. 3-11, отличающийся тем, что является лиофилизированным.
13. Композиция для лечения бактериальной инфекции, вызванной A. baumannii, E. coli, P. aeruginosa, S. aureus, B. anthracis или K. pneumonia, содержащая один или более полипептидов по п. 1 или 2 или конъюгатов по любому из пп. 3-11 в эффективном количестве для проявления антибактериальной активности против каждой инфекционной бактерии, выбранной из A. baumannii, E. coli, P. aeruginosa, S. aureus, B. anthracis и K. pneumonia.
14. Композиция по п. 13, отличающаяся тем, что содержит фармацевтически приемлемый носитель, буферный агент или консервант.
15. Композиция по п. 14, отличающаяся тем, что составлена в форме для местного применения, подкожной доставки, внутривенной доставки или пероральной доставки.
16. Композиция по п. 14, дополнительно содержащая антибиотик или коагулирующий агент.
17. Композиция по любому из пп. 13-16, отличающаяся тем, что является лиофилизированной.
18. Способ лечения субъекта, имеющего бактериальную инфекцию, вызванную A. baumannii, E. coli, P. aeruginosa, S. aureus, B. anthracis или K. pneumonia, включающий введение субъекту композиции, содержащей один или более полипептид по п. 1 или 2 или конъюгат по любому из пп. 3-11 и фармацевтически приемлемый носитель, буферный агент или консервант.
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что бактериальная инфекция является резистентной к другим способам лечения.
20. Способ по п. 18, отличающийся тем, что композицию вводят в комбинации с антибиотиком.
21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что антибиотик представляет собой амоксициллин, аугментин, амоксициллин, ампициллин, азлоциллин, флюклоксациллин, мезлоциллин, метициллин, пенициллин G, пенициллин V, цефалексин, цефазедон, цефуроксим, лорацарбеф, цеметазол, цефотетан, цефокситин, ципрофлоксацин, левакин и флоксацин, тетрациклин, доксициклин или миноциклин, гентамицин, амикацин, тобрамицин, кларитромицин, азитромицин, эритромицин, даптомицин, неомицин, канамицин или стрептомицин.
22. Способ по любому из пп. 18-21, отличающийся тем, что бактериальная инфекция представляет собой раневую инфекцию.
23. Способ по любому из пп. 18-22, отличающийся тем, что композицию применяют местно, вводят подкожно, путем внутривенной инъекции или перорально.
24. Способ по любому из пп. 18-23, отличающийся тем, что композиция представлена в виде единичной лекарственной формы.
25. Способ по п. 18, отличающийся тем, что композиция представлена в форме крема, мази, бальзама, геля, пастилки, спрея или аэрозоля.
26. Способ лечения бактериальной инфекции, вызванной A. baumannii, E. coli, P. aeruginosa, S. aureus, B. anthracis или K. pneumonia, включая ингибирование образования или разрушение бактериальной биопленки, включающий стадию введения субъекту, нуждающемуся в этом, композиции, содержащей полипептид по п. 1 или 2 или конъюгат по любому из пп. 3-11, в количестве, эффективном для уничтожения бактерий в биопленке.
27. Способ дезинфекции предмета, инфицированного A. baumannii, E. coli, P. aeruginosa, S. aureus, B. anthracis или K. pneumonia, включающий контактирование предмета с композицией, содержащей полипептид по п. 1 или 2 по любому из пп. 3-11.
28. Способ по п. 27, отличающийся тем, что предмет представляет собой твердую поверхность.
29. Способ ингибирования образования или разрушения бактериальной биопленки на предмете, где бактерии в биопленке представляют собой A. baumannii, E. coli, P. aeruginosa, S. aureus, B. Anthracis или K. Pneumonia, включающий контактирование предмета с полипептидом по п. 1 или 2 или конъюгатом по любому из пп. 3-11, в количестве, эффективном для уничтожения бактерий в биопленке.
30. Способ по любому из пп. 27-29, отличающийся тем, что предмет представляет собой рабочую поверхность, клавиатуру, хирургический инструмент или медицинское устройство.
31. Набор для лечения бактериальной инфекции, вызванной A. baumannii, E. coli, P. aeruginosa, S. aureus, B. anthracis или K. pneumonia, содержащий один или более контейнеров, содержащих композицию, содержащую полипептид по п. 1 или 2 или конъюгат по любому из пп. 3-11, где полипептид или конъюгат имеют антибактериальную активность против каждой инфекционной бактерии, выбранной из A. baumannii, E. coli, P. aeruginosa, S. aureus, B. anthracis и K. pneumonia.
32. Набор по п. 31, отличающийся тем, что композиция дополнительно содержит носитель, буферный агент или консервант.
33. Набор по п. 32, отличающийся тем, что представляет собой флакон или устройство доставки.
34. Набор по п. 32 или 33, отличающийся тем, что композиция является лиофилизированной.
35. Способ лечения субъекта, имеющего бактериальную инфекцию операционной раны, вызванную A. baumannii, E. coli, P. aeruginosa, S. aureus, B. anthracis или K. pneumonia, включающий орошение раны композицией, содержащей полипептид по п. 1 или 2 или конъюгат по любому из пп. 3-11 и фармацевтически приемлемый носитель, буферный агент или консервант.
36. Способ по п. 35, отличающийся тем, что операционную рану орошают до хирургического закрытия раны.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201462017618P | 2014-06-26 | 2014-06-26 | |
US62/017,618 | 2014-06-26 | ||
PCT/US2015/037962 WO2015200783A2 (en) | 2014-06-26 | 2015-06-26 | Acinetobacter lysins |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2017102306A RU2017102306A (ru) | 2018-07-26 |
RU2017102306A3 RU2017102306A3 (ru) | 2019-02-26 |
RU2725809C2 true RU2725809C2 (ru) | 2020-07-06 |
Family
ID=54938953
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017102306A RU2725809C2 (ru) | 2014-06-26 | 2015-06-26 | Лизины ацинетобактеров |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10590403B2 (ru) |
EP (1) | EP3164146B1 (ru) |
JP (1) | JP6818349B2 (ru) |
KR (1) | KR102441211B1 (ru) |
CN (1) | CN106659748B (ru) |
AU (1) | AU2015279705B2 (ru) |
BR (1) | BR112016030580B1 (ru) |
CA (1) | CA2953446A1 (ru) |
ES (1) | ES2767294T3 (ru) |
GB (1) | GB2543453A (ru) |
IL (1) | IL249636A0 (ru) |
RU (1) | RU2725809C2 (ru) |
WO (1) | WO2015200783A2 (ru) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BR112016030580B1 (pt) * | 2014-06-26 | 2023-12-19 | The Rockefeller University | Polipeptídeo de lisina e fragmento de polipeptídeo com atividade para matar bactérias gram-negativas |
US10988520B2 (en) | 2018-03-29 | 2021-04-27 | Contrafect Corporation | Lysin-antimicrobial peptide (AMP) polypeptide constructs, lysins, isolated polynucleotides encoding same and uses thereof |
CA3095484A1 (en) | 2018-03-29 | 2019-10-03 | Contrafect Corporation | Lysin-antimicrobial peptide (amp) polypeptide constructs, lysins, isolated polynucleotides encoding same and uses thereof |
MX2020010076A (es) * | 2018-08-23 | 2021-01-08 | Contrafect Corp | Construcciones de polipeptido de lisina-peptido anti-microbiano (amp), lisinas, polinucleotidos aislados que codifican para estas, y sus usos. |
US20220160843A1 (en) * | 2019-04-05 | 2022-05-26 | Contrafect Corporation | Lysins and derivatives thereof with bactericidal activity against pseudomonas aeruginosa, in the presence of human serum |
CN111909917B (zh) * | 2019-05-10 | 2022-10-14 | 中国科学院微生物研究所 | 一种内溶素Lysmeta1及其编码基因与应用 |
CN115605587A (zh) | 2020-03-11 | 2023-01-13 | 特卢姆治疗有限公司(Es) | 新型重组溶素及其在治疗革兰氏阴性菌感染中的用途 |
KR102604590B1 (ko) * | 2020-09-28 | 2023-11-23 | 경북대학교 산학협력단 | 아시네토박터 바우마니에 대한 사멸능을 가지는 박테리오파지 및 이를 포함하는 조성물 |
KR102419028B1 (ko) * | 2021-01-06 | 2022-07-08 | 주식회사 리신바이오 | 박테리오파지 유래 신규 재조합 엔도라이신 및 이의 용도 |
WO2022236088A1 (en) * | 2021-05-06 | 2022-11-10 | Bioharmony Therapeutics Inc. | Lysin polypeptide compositions and methods of use |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2325398C2 (ru) * | 1999-07-08 | 2008-05-27 | Байотек Аса | Антибактериальный белок хламизин в, ген, кодирующий его, и экспрессирующая его система |
US20120122766A1 (en) * | 2008-11-28 | 2012-05-17 | Anges Mg, Inc. | Novel Polypeptide Having Angiogenesis-Inducing Activity And Antibacterial Activity, And Use Thereof For Medical Purposes |
RU2468033C2 (ru) * | 2006-07-10 | 2012-11-27 | Пба3 БиоМед ГмбХ | Антибактериальные пептиды |
CN102940874A (zh) * | 2012-12-12 | 2013-02-27 | 中国科学院昆明动物研究所 | 小分子多肽cw14在制备山羊抗菌药物中的应用 |
Family Cites Families (40)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6056954A (en) * | 1997-10-31 | 2000-05-02 | New Horizons Diagnostics Corp | Use of bacterial phage associated lysing enzymers for the prophylactic and therapeutic treatment of various illnesses |
US5997862A (en) * | 1997-10-31 | 1999-12-07 | New Horizons Diagnostics Corporation | Therapeutic treatment of group A streptococcal infections |
US20060292135A1 (en) * | 1997-10-31 | 2006-12-28 | Lawrence Loomis | Use of bacterial phage-associated lysing proteins for preventing and treating bacterial infections in humans, animals and fowl |
US20030113298A1 (en) * | 1997-10-31 | 2003-06-19 | Vincent Fischetti | Use of bacterial phage associated lysing proteins for the prophylactic and therapeutic treatment of various illnesses |
US6562958B1 (en) * | 1998-06-09 | 2003-05-13 | Genome Therapeutics Corporation | Nucleic acid and amino acid sequences relating to Acinetobacter baumannii for diagnostics and therapeutics |
US20100233146A1 (en) * | 2002-09-09 | 2010-09-16 | Reactive Surfaces, Ltd. | Coatings and Surface Treatments Having Active Enzymes and Peptides |
US7604975B2 (en) * | 2002-10-01 | 2009-10-20 | The Rockefeller University | Glycosylated LPXTGases and uses thereof |
AU2004260665B2 (en) * | 2003-07-30 | 2007-11-15 | Vlp Biotech, Inc. | Hepatitis virus core proteins as vaccine platforms and methods of use thereof |
US7320795B2 (en) * | 2003-07-30 | 2008-01-22 | Vaccine Research Institute Of San Diego | Rodent hepatitis B virus core proteins as vaccine platforms and methods of use thereof |
US7144712B2 (en) * | 2003-07-30 | 2006-12-05 | Vaccine Research Institute Of San Diego | Human hepatitis B virus core proteins as vaccine platforms and methods of use thereof |
US20070077235A1 (en) * | 2004-01-16 | 2007-04-05 | Lawrence Loomis | Composition and method of treating mastitis |
US9999635B2 (en) * | 2007-01-16 | 2018-06-19 | Realm Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for treating inflammatory disorders |
US20110262508A1 (en) * | 2007-11-07 | 2011-10-27 | Paul Michael Watt | Antimicrobial compositions, formulations and uses thereof |
EP2157100A1 (en) | 2008-08-19 | 2010-02-24 | Profos AG | Artificial peptidoglycan lysing enzymes and peptidoglycan binding proteins |
GB0815484D0 (en) | 2008-08-26 | 2008-10-01 | Univ Leuven Kath | Antibacterial agents |
WO2010036938A2 (en) * | 2008-09-26 | 2010-04-01 | Nanobio Corporation | Nanoemulsion therapeutic compositions and methods of using the same |
KR101016918B1 (ko) * | 2009-01-08 | 2011-02-25 | 주식회사 인트론바이오테크놀로지 | 박테리아 특이적 넓은 항균 활성을 갖는 신규한 리신 단백질 |
KR20170024129A (ko) * | 2009-06-26 | 2017-03-06 | 카톨리에케 유니버시테이트 루벤 | 항균제 |
CN102575240B (zh) | 2009-08-24 | 2016-01-13 | 勒芬天主教大学,K.U.勒芬R&D | 新的细胞内溶素OBPgpLYS |
US9005579B2 (en) * | 2010-01-05 | 2015-04-14 | Contrafect Corporation | Methods and compositions for enhanced immunological therapy and targeting of gram-positive bacteria |
CN103119158B (zh) | 2010-04-27 | 2015-04-08 | 莱桑多公司 | 减少生物膜的方法 |
CN103732235B (zh) * | 2010-09-17 | 2018-01-02 | 药物技术业制药技术股份有限公司 | 抗菌噬菌体、噬菌体肽及其使用方法 |
EP2468856A1 (en) * | 2010-12-23 | 2012-06-27 | Lysando Aktiengesellschaft | Antimicrobial Agents |
GB201103780D0 (en) * | 2011-03-04 | 2011-04-20 | Hansa Medical Ab | Treatment for ige-mediated disease |
CN107189997A (zh) * | 2011-04-21 | 2017-09-22 | 洛克菲勒大学 | 用于革兰氏阳性菌检测和治疗的链球菌属细菌噬菌体溶素 |
US9872843B2 (en) * | 2011-10-08 | 2018-01-23 | Next Science, Llc | Antimicrobial compositions and methods employing same |
KR20230113404A (ko) * | 2012-05-09 | 2023-07-28 | 콘트라펙트 코포레이션 | 그람 양성 박테리아에 대한 박테리오파지 리신과 항생제의병용물 |
MX369056B (es) * | 2012-05-09 | 2019-10-28 | Contrafect Corp | Prevención, interrupción y tratamiento de biopelículas con lisina de bacteriófago. |
KR101391332B1 (ko) * | 2012-05-18 | 2014-05-07 | 연세대학교 산학협력단 | 카바페넴 제제에 내성을 보이는 아시네토박터 속의 균을 용균하는 박테리오파아지 |
MX2015001817A (es) * | 2012-08-08 | 2015-09-23 | Avacyn Pharmaceuticals Inc | Inhibicion de objetivos antimicrobianos con potencial reducido para la resistencia. |
EP2986115A4 (en) * | 2013-02-06 | 2017-03-01 | Academia Sinica | Antimicrobial peptides derived from hepatitis b virus core protein arginine-rich domain |
BR112016030580B1 (pt) * | 2014-06-26 | 2023-12-19 | The Rockefeller University | Polipeptídeo de lisina e fragmento de polipeptídeo com atividade para matar bactérias gram-negativas |
WO2017032303A1 (zh) * | 2015-08-25 | 2017-03-02 | 厦门大学 | 一种用于展示目的多肽的多肽载体及其用途 |
CA2998484A1 (en) * | 2015-09-17 | 2017-03-23 | Contrafect Corporation | Use of lysin to restore/augment antibacterial activity in the presence of pulmonary surfactant of antibiotics inhibited thereby |
CN109152822B (zh) * | 2016-05-12 | 2023-12-05 | 抗非特公司 | 用于评估和确定抗菌多肽的最小抑制浓度的肉汤微量稀释法 |
CN117018170A (zh) * | 2016-06-20 | 2023-11-10 | Isa制药有限公司 | 肽疫苗制剂 |
US10988520B2 (en) * | 2018-03-29 | 2021-04-27 | Contrafect Corporation | Lysin-antimicrobial peptide (AMP) polypeptide constructs, lysins, isolated polynucleotides encoding same and uses thereof |
CA3095484A1 (en) * | 2018-03-29 | 2019-10-03 | Contrafect Corporation | Lysin-antimicrobial peptide (amp) polypeptide constructs, lysins, isolated polynucleotides encoding same and uses thereof |
US20210198644A1 (en) * | 2018-05-23 | 2021-07-01 | The Rockefeller University | Recombinant lysins |
MX2020010076A (es) * | 2018-08-23 | 2021-01-08 | Contrafect Corp | Construcciones de polipeptido de lisina-peptido anti-microbiano (amp), lisinas, polinucleotidos aislados que codifican para estas, y sus usos. |
-
2015
- 2015-06-26 BR BR112016030580-9A patent/BR112016030580B1/pt active IP Right Grant
- 2015-06-26 EP EP15812120.2A patent/EP3164146B1/en active Active
- 2015-06-26 WO PCT/US2015/037962 patent/WO2015200783A2/en active Application Filing
- 2015-06-26 CA CA2953446A patent/CA2953446A1/en active Pending
- 2015-06-26 RU RU2017102306A patent/RU2725809C2/ru active
- 2015-06-26 GB GB1701187.5A patent/GB2543453A/en not_active Withdrawn
- 2015-06-26 US US15/321,905 patent/US10590403B2/en active Active
- 2015-06-26 ES ES15812120T patent/ES2767294T3/es active Active
- 2015-06-26 CN CN201580040211.0A patent/CN106659748B/zh active Active
- 2015-06-26 KR KR1020177002048A patent/KR102441211B1/ko active IP Right Grant
- 2015-06-26 AU AU2015279705A patent/AU2015279705B2/en active Active
- 2015-06-26 JP JP2016574989A patent/JP6818349B2/ja active Active
-
2016
- 2016-12-19 IL IL249636A patent/IL249636A0/en unknown
-
2019
- 2019-06-26 US US16/454,045 patent/US11180744B2/en active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2325398C2 (ru) * | 1999-07-08 | 2008-05-27 | Байотек Аса | Антибактериальный белок хламизин в, ген, кодирующий его, и экспрессирующая его система |
RU2468033C2 (ru) * | 2006-07-10 | 2012-11-27 | Пба3 БиоМед ГмбХ | Антибактериальные пептиды |
US20120122766A1 (en) * | 2008-11-28 | 2012-05-17 | Anges Mg, Inc. | Novel Polypeptide Having Angiogenesis-Inducing Activity And Antibacterial Activity, And Use Thereof For Medical Purposes |
CN102940874A (zh) * | 2012-12-12 | 2013-02-27 | 中国科学院昆明动物研究所 | 小分子多肽cw14在制备山羊抗菌药物中的应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2953446A1 (en) | 2015-12-30 |
KR102441211B1 (ko) | 2022-09-07 |
EP3164146A2 (en) | 2017-05-10 |
KR20170026505A (ko) | 2017-03-08 |
CN106659748A (zh) | 2017-05-10 |
RU2017102306A3 (ru) | 2019-02-26 |
IL249636A0 (en) | 2017-02-28 |
AU2015279705B2 (en) | 2021-04-01 |
US20170130214A1 (en) | 2017-05-11 |
JP2017526627A (ja) | 2017-09-14 |
AU2015279705A1 (en) | 2017-01-19 |
US20190345467A1 (en) | 2019-11-14 |
EP3164146A4 (en) | 2018-03-21 |
JP6818349B2 (ja) | 2021-01-20 |
GB2543453A (en) | 2017-04-19 |
ES2767294T3 (es) | 2020-06-17 |
CN106659748B (zh) | 2021-08-31 |
BR112016030580A2 (pt) | 2018-06-19 |
WO2015200783A3 (en) | 2016-03-03 |
GB201701187D0 (en) | 2017-03-08 |
WO2015200783A2 (en) | 2015-12-30 |
US11180744B2 (en) | 2021-11-23 |
RU2017102306A (ru) | 2018-07-26 |
EP3164146B1 (en) | 2019-12-25 |
US10590403B2 (en) | 2020-03-17 |
BR112016030580B1 (pt) | 2023-12-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2725809C2 (ru) | Лизины ацинетобактеров | |
AU2019222918B2 (en) | Antimicrobial peptides and methods of use thereof | |
JP7386905B2 (ja) | Romo1由来抗菌ペプチドおよびその変異体 | |
KR102415725B1 (ko) | 신규한 항균 펩타이드 h123 및 이의 용도 | |
CN112543595A (zh) | 抗微生物组合物,其制备方法和用途 | |
CN115397994A (zh) | 新型多肽、融合多肽和包含其的抗革兰氏阴性菌的抗生素 | |
KR20180117793A (ko) | 왕귀뚜라미에서 유래한 항균 펩타이드 테레오그릴루신 2 및 그의 조성물 | |
AU2004212179A1 (en) | Antimicrobial agents from Streptococcus mitis and Streptococcus oralis | |
RU2813626C1 (ru) | Модифицированный эндолизин и антибактериальные композиции на его основе для лечения инфекций, вызванных бактериями Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli | |
KR102492397B1 (ko) | 흰점박이꽃무지 유충으로부터 분리한 프로테티아마이신-4 펩타이드 및 이의 용도 | |
KR102496847B1 (ko) | 흰점박이꽃무지 유충으로부터 분리한 프로테티아마이신-5 펩타이드 및 이의 용도 |