CN109152822B - 用于评估和确定抗菌多肽的最小抑制浓度的肉汤微量稀释法 - Google Patents

用于评估和确定抗菌多肽的最小抑制浓度的肉汤微量稀释法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于评估抗菌效力和确定杀灭细菌的多肽(包括溶素多肽)的最小抑制浓度(MIC)的组分、测定和方法。提供了改良的肉汤微量稀释组分和方法，包括补充剂以使得模拟人基质(包括血清和血液)中的溶素多肽活性的精确MIC测定成为可能。

Description

用于评估和确定抗菌多肽的最小抑制浓度的肉汤微量稀释法
技术领域
本发明一般涉及用于评估抗菌效力和确定杀灭细菌的多肽(包括溶素多肽)的最小抑制浓度(MIC)的组分、测定和方法。
背景技术
耐药细菌的发展是医疗中的主要问题，因为更多的抗生素用于广泛的疾病和其他状况。新型抗微生物治疗方法包括基于酶的抗生素(“酶抗生素(enzybiotics)”)，例如噬菌体溶素。噬菌体使用这些溶素消化其细菌宿主的细胞壁，通过低渗裂解释放病毒后代。溶素对革兰氏阳性病原体的高致死活性使其成为作为治疗剂开发的有吸引力的候选者(Fischetti,V.A.(2008)Curr Opinion Microbiol 11:393-400；Nelson,D.L.等(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98:4107-4112)。最初提出噬菌体溶素是用于根除病原性链球菌的鼻咽携带(Loeffler,J.M.等(2001)Science 294:2170-2172；Nelson,D.et al(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98:4107-4112)。
已建立噬菌体裂解酶作为可用于通过各种给药途径评估和特异性治疗受试者中各种类型的感染。例如，美国专利5,604,109(Fischetti等)涉及通过半纯化的C组链球菌噬菌体相关的溶素酶的酶促消化来快速检测临床标本中的A组链球菌。这种酶作用成为进一步研究的基础，导致治疗疾病的方法。Fischetti和Loomis的专利(美国专利5,985,271，6,017,528和6,056,955)公开了由C1噬菌体感染的C组链球菌细菌产生的溶素酶的用途。美国专利6,248,324(Fischetti和Loomis)公开了用于皮肤病学感染的组合物，其通过在适于局部施用于真皮组织的载体中使用裂解酶。美国专利6,254,866(Fischetti和Loomis)公开了治疗消化道细菌感染的方法，其包括施用对感染细菌具有特异性的裂解酶。美国专利6,264,945(Fischetti和Loomis)公开了通过肠胃外引入(肌肉内、皮下或静脉内)至少一种裂解酶和用于将裂解酶递送至患者的合适载体来治疗细菌感染的方法和组合物，所述裂解酶由被对该细菌具有特异性的噬菌体感染的细菌产生。
美国专利7,402,309，7,638,600和已公布PCT申请WO2008/018854提供了不同的噬菌体相关裂解酶，其可用作治疗或减少炭疽杆菌感染的抗菌剂。美国专利7,569,223描述了用于肺炎链球菌的裂解酶。可用于肠球菌(粪肠球菌和屎肠球菌，包括耐万古霉素菌株)的溶素描述于美国专利7,582291中。US2008/0221035描述了高效杀灭B组链球菌的突变PlyGBS溶素。在WO2010/002959中详述了称为ClyS的嵌合溶素，其具有针对葡萄球菌(包括金黄色葡萄球菌)的活性。在WO2012/145630和美国专利9,034,322中描述了从猪链球菌分离并有效杀灭链球菌、葡萄球菌、肠球菌和李斯特菌菌株的PlySs2溶素。
PlySs2溶素(CF-301)是第一个进入并完成FDA允许的I期临床试验的溶素。该溶素可与标准治疗抗生素(例如，万古霉素或达托霉素)组合以治疗由甲氧西林敏感和耐药的金黄色葡萄球菌引起的血流感染，包括心内膜炎。为了支持临床试验，体外抗生素易感性测试(AST)用于评估和标准化细菌试剂。
肉汤微量稀释(BMD)可用于测试溶素，例如针对金黄色葡萄球菌分离物的PlySs2/CF-301活性，然而标准方法(CLSI方法)不是可靠的测定法，并且当应用于溶素多肽例如PlySs2(CF-301)时表现出各种问题。这些问题包括拖尾效应，人体血液、血清或血浆中易感性发现的脱节或变化，以及冷冻药物稀释组中酶活性的丧失。
鉴于与用于评估抗菌剂如溶素多肽的标准肉汤微量稀释法相关的缺陷和问题，本领域需要可应用于临床测试和评估，并且适当模拟体内活动和效果的，有效、可靠和可重复的用于在体外测定中评估细菌易感性的方法。
本文对参考文献的引用不应被解释为承认那些是本发明的现有技术。
发明内容
本申请涉及使用独特组分测定肽的最小抑制浓度和评估肽的抗菌杀伤效力的改良方法和测定，特别是抗细菌有效肽，特别是裂解肽。
本发明涉及提供用于确定抗菌肽，特别是裂解肽的MIC的系统或测定，其中使用补充有哺乳动物血清和还原剂的肉汤或培养基进行测定。在本发明的一个方面，提供了用于确定抗菌肽的细菌杀灭效力的测定，其精确地反映了哺乳动物或患者(特别是人)中的抗菌肽(例如裂解肽或溶素)的细菌杀灭效力。
根据本发明，提供了一种用于确定抗菌肽(例如裂解多肽或溶素)的细菌杀灭活性的方法，其中杀灭活性精确地模拟人中的所述抗菌肽的细菌杀灭，包括评估补充有动物血清和还原剂的肉汤中的抗菌肽。在本发明的一个方面，在补充有马血清、狗血清、兔血清或小鼠血清和还原剂的肉汤中针对易感细菌评估抗菌肽，例如裂解多肽或溶素。在本发明的一个方面，在补充有马血清和还原剂的肉汤中针对易感细菌评估抗菌肽，例如裂解多肽或溶素。
根据本发明，提供了改良和改进的肉汤微量稀释(BMD)法和测定，用于测试肽，特别是抗细菌有效的肽，特别是裂解肽或溶素肽。在本发明的一个方面，提供了改良BMD，其利用肉汤或培养基进行评估，其中所述培养液或培养基补充有哺乳动物血清和还原剂。
在一个方面，提供了改良BMD，其利用肉汤或培养基进行评估，其中所述肉汤或培养基补充有动物血清。在一个方面，提供了改良BMD，其利用肉汤或培养基进行评估，其中所述肉汤或培养基补充有脊椎动物血清。在一个方面，提供了改良BMD，其利用肉汤或培养基进行评估，其中所述肉汤或培养基补充有哺乳动物血清。一方面，提供了改良BMD，其利用肉汤或培养基进行评估，其中所述肉汤或培养基补充有选自马血清、人血清、狗血清、兔血清、小鼠血清、牛血清的动物血清。在一个方面，提供了肉汤微量稀释(BMD)法，其利用肉汤或培养基进行评估，其中所述肉汤或培养基补充有选自马血清、狗血清、兔血清、小鼠血清、牛血清的动物血清。在一个方面，提供了肉汤微量稀释(BMD)法，其利用肉汤或培养基进行评估，其中所述肉汤或培养基补充有马血清。
在本发明的BMD方法的一个方面，肉汤或培养基补充有哺乳动物血清和还原剂。在一个方面，肉汤或培养基补充有马血清和还原剂。在一个方面，还原剂是DL-二硫苏糖醇(DTT)。在一个方面，还原剂是三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)。
在一个方面，适合于细菌生长的肉汤或培养基补充有哺乳动物血清和还原剂。在一个方面，阳离子调节的肉汤或培养基补充有哺乳动物血清和还原剂。在一个方面，阳离子调节的肉汤或培养基补充有马血清和还原剂。在一个方面，还原剂是DL-二硫苏糖醇(DTT)。在一个方面，还原剂是三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)。
用于补充血清的量可以通过与人血清比较来确定。补充的血清的量可以在10％血清和80％血清之间。在一个方面，补充的血清的量可以在10％血清和60％血清之间。在一个方面，补充的血清的量可以在10％血清和50％血清之间。在一个方面，补充的血清的量可以在15％血清和40％血清之间。在一个方面，补充的血清的量可以在15％血清和30％血清之间。在一个方面，补充的血清的量可以在20％血清和30％血清之间。在一个方面，补充的血清的量可以是约25％血清。在一个方面，补充的血清的量在20％血清和30％血清之间。在一个方面，补充的血清的量为约25％血清。在一个方面，补充的血清的量是25％动物血清。在一个方面，补充的血清的量是约25％马血清。
在一个方面，肉汤或培养基补充有马血清和还原剂。在一个方面，肉汤或培养基补充有约20％至30％的马血清和还原剂。在一个方面，肉汤或培养基补充有约25％的马血清和还原剂。在一个方面，肉汤或培养基补充有25％马血清和还原剂。在一个方面，阳离子调节的肉汤补充有马血清和还原剂。在一个方面，阳离子调节的肉汤补充有约20％至30％的马血清和还原剂。在一个方面，阳离子调节的肉汤补充有25％马血清和还原剂。
在一个方面，适合细菌生长的肉汤或培养基补充有25％马血清和二硫苏糖醇(DTT)。在一个方面，阳离子调节的Mueller Hinton肉汤(CA-MHB)补充有25％马血清和二硫苏糖醇(DTT)。在一个方面，阳离子调节的Mueller Hinton肉汤(CA-MHB)补充有25％马血清和三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)。在一个方面，阳离子调节的Mueller Hinton肉汤(CA-MHB)补充有25％马血清和0.5mM DL-二硫苏糖醇(DTT)。
在一个方面，还原剂的量在0.1mM和10mM之间。在一个方面，还原剂的量在0.1mM和5mM之间。在一个方面，还原剂的量在0.1mM和2mM之间。在一个方面，还原剂的量在0.1mM和1mM之间。在一个方面，还原剂的量在0.1mM和0.9mM之间。在一个方面，还原剂的量在0.1mM和0.6mM之间。在一个方面，还原剂的量在0.2mM和0.6mM之间。在一个方面，还原剂的量在0.3mM和0.6mM之间。在一个方面，还原剂的量在0.4mM和0.6mM之间。在一个方面，还原剂的量为约0.5mM。在一个方面，还原剂的量在0.25mM和1mM之间。在一个方面，还原剂的量小于1mM。
在一个实施方式中，本发明的测定和方法用于裂解多肽的评估和分析。在本发明的一个方面，具有补充物的BMD方法用于确定对链球菌细菌有活性的裂解多肽的细菌杀灭效力。在本发明的一个方面，具有补充物的BMD方法用于确定对链球菌和葡萄球菌细菌有活性的裂解多肽的细菌杀灭效力。在本发明的一个方面，具有补充物的BMD方法用于对链球菌细菌有活性的裂解多肽的MIC测试。在本发明的一个方面，具有补充物的BMD方法用于对葡萄球菌细菌有活性的裂解多肽的MIC测试。在本发明的一个方面，具有补充物的BMD方法用于对链球菌和葡萄球菌细菌有活性的裂解多肽的MIC测试。在本发明的一个方面，具有补充物的BMD方法用于针对革兰氏阳性细菌的裂解多肽的MIC测试。在本发明的一个方面，具有补充物的BMD方法用于针对多于一种物种的革兰氏阳性细菌的裂解多肽的MIC测试。革兰氏阳性细菌可选自链球菌、葡萄球菌、肠球菌和李斯特菌细菌。
在一个方面，本发明的组分、方法或测定用于评估针对革兰氏阳性细菌的裂解多肽，例如并包括PlySs2多肽(CF-301)或其变体或衍生物。在一个方面，本发明的组分、方法或测定用于评估针对抗生素耐药细菌的裂解多肽，包括PlySs2多肽(CF-301)或其变体或衍生物。在一个方面，本发明的组分、方法或测定用于评估针对链球菌和葡萄球菌细菌的裂解多肽，包括PlySs2多肽(CF-301)或其变体或衍生物。在一个方面，本发明的组分、方法或测定用于评估针对抗生素耐药链球菌和/或葡萄球菌细菌的裂解多肽，包括PlySs2多肽(CF-301)或其变体或衍生物。在一个方面，裂解多肽是PlySs2或其衍生物或变体。在一个方面，多肽包含图1中提供的序列(SEQ ID NO:1)。
哺乳动物血清如马血清的包含是根据本文所述的发现，即肽，特别是裂解多肽，特别是示例性裂解多肽PlySs2，在人血清/血液(以及一些其他哺乳动物物种，包括马)中比在单独的测定肉汤或培养基中更具活性。已经发现多肽，特别是示例性裂解多肽PlySs2，在人血清/血液(以及一些其他物种，包括马)中的活性显著高于在没有添加血清的阳离子调节的肉汤中。抗菌多肽，特别是示例性裂解多肽PlySs2，在人血清/血液(以及一些其他物种，包括马)中比在没有添加血清的肉汤(例如阳离子调节的肉汤)中更具活性(特别是高达32倍至64倍更具活性)。当以25％补充到CA-MHB中时，马血清防止拖尾效应并且使得与100％人血清中获得的MIC值接近相同的MIC值成为可能。采用DTT进行补充起到使溶素多肽稳定化并使得能够使用冷冻微量肉汤稀释板进行MIC测。DTT是常用的还原剂，用于在储存期间或在体外测定的情况下防止酶的氧化和失活。
在本发明的一个方面，衍生自链球菌或葡萄球菌细菌的噬菌体溶素用于本发明的方法和组合物中。用于本发明的示例性溶素多肽，特别是本文和图1(SEQ ID NO:1)中提供的PlySs2溶素，在证明对多种细菌，特别是革兰氏阳性细菌，包括葡萄球菌、链球菌、肠球菌和李斯特菌细菌菌株的广泛杀灭活性方面是独特的。在一个这样的方面，PlySs2溶素能够杀灭金黄色葡萄球菌菌株和细菌，如本文所证明的。在一个方面，PlySs2溶素能够杀灭葡萄球菌和链球菌细菌。PlySs2对抗生素耐药性金黄色葡萄球菌有效，如甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌(MRSA)，万古霉素耐药性金黄色葡萄球菌(VRSA)，达托霉素耐药性金黄色葡萄球菌(DRSA)和利奈唑胺耐药性金黄色葡萄球菌(LRSA)。PlySs2对万古霉素中度敏感性金黄色葡萄球菌(VISA)有效。
分离的PlySs2溶素多肽可包含图1中提供的氨基酸序列或其变体，其与图1的多肽具有至少80％同一性，85％同一性，90％同一性，95％同一性或99％同一性并且有效杀灭革兰氏阳性菌。分离的PlySs2溶素多肽可包含图1中提供的氨基酸序列或其变体，其与图1的多肽具有至少80％同一性，85％同一性，90％同一性，95％同一性或99％同一性并且有效杀灭葡萄球菌和链球菌细菌。
在任何这样的上述一种或多种方法中，细菌可选自金黄色葡萄球菌，单核细胞增生李斯特菌，模拟葡萄球菌，猪链球菌，表皮葡萄球菌，马链球菌，动物园马链球菌(Streptococcus equi zoo)，无乳链球菌(GBS)，酿脓链球菌(GAS)，血链球菌，格氏链球菌，停乳链球菌，G组链球菌，E组链球菌，粪肠球菌和肺炎链球菌。
根据本发明的任何方法，细菌可以是抗生素耐药细菌。细菌可以是甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌(MRSA)，万古霉素中度敏感性金黄色葡萄球菌(VISA)，万古霉素耐药性金黄色葡萄球菌(VRSA)，达托霉素耐药性金黄色葡萄球菌(DRSA)或利奈唑胺耐药性金黄色葡萄球菌(LRSA)。易感细菌可以是临床相关或致病细菌，特别是针对人类。在方法的一个方面，溶素多肽有效杀灭葡萄球菌、链球菌、肠球菌和李斯特菌细菌菌株。
在本文提供的方法和组合物的另外的方面或实施方式中，另一种不同的葡萄球菌特异性溶素在本文中单独使用或与本文提供和描述的PlySs2溶素组合使用。在本文提供的方法和组合物的一个这样的方面或实施方式中，葡萄球菌特异性溶素ClyS在本文中单独使用或与本文提供和描述的PlySs2溶素组合使用。
通过阅读以下参考以下说明性附图的描述，本领域技术人员将清楚其他目的和优点。
附图说明
图1描绘了(A)PlySs2(CF-301)溶素多肽的氨基酸序列，其中标示了活性位点残基，和包括CHAP家族催化结构域和SH3家族细胞壁结合结构域的结构域结构；和(B)预测的三维结构(由I-TASSER表示)。
图2描绘了(A)金黄色葡萄球菌中的细胞壁靶；(B)在结构稳定性所需的肽聚糖网状结构中的葡萄球菌细胞壁中的D-Ala-L-Gly键的切割(改编自Capot-Chartier,FrontMicrobiol 22:2104)；和(C)细胞壁水解和渗透裂解。在(C)中，显示肽聚糖水解导致细菌的渗透裂解。(C)提供未处理的细菌，在加入CF-301 15秒(15秒)后，和在加入CF-301 15分钟后的细菌。
图3提供了BMD测定中的拖尾和血液效应的实例。(A)拖尾或伊格尔效应模糊了MHBII中的精确MIC测定。(B)描绘了金黄色葡萄球菌菌株的血液效应。使用的人血清(HuS)和血浆(HuP)如下：HuS1＝汇集的雄性AB，Innovative Research,Inc；HuS2＝汇集的正常，Innovative Research,Inc；HuS3＝个体正常，BioreclamationIVT；HuS4＝汇集的雄性AB，Sigma-Aldrich。
图4描绘了针对一组30个金黄色葡萄球菌菌株的易感性测试结果。描述了与某些测定方法相关的问题。
图5描绘了使用来自14种不同来源的25％马血清的新方法对PlySs2/CF301的BMD分析的列表结果，以评估金黄色葡萄球菌ATCC 29213和粪肠球菌ATCC 29212。
图6提供了使用新BMD方法对冷冻CF-301样品进行MIC测定的时间进程。
图7描绘了在不同条件下MRSA菌株ATCC 29213的MIC测定。(A)单独的MHBII(MIC＝16μg/ml，具有轻微的拖尾效应)；(B)100％人血清(MIC＝1μg/ml)；和(C)MHBII，25％马血清，0.5mM DTT(MIC＝0.5μg/ml)。
图8描绘了在具有25％马血清和0.5mM DTT的CA-MHB中金黄色葡萄球菌菌株ATCC700699的MIC测定(MIC＝1μg/ml)。
图9描绘了使用补充有马血清和DTT的BMD方法对各种易感革兰氏阳性细菌的CF-301MIC活性的评估，所述革兰氏阳性细菌包括MRSA，MSSA，表皮葡萄球菌，酿脓链球菌，无乳链球菌，肺炎链球菌和粪肠球菌。
图10描绘了使用改良BMD方法评估的万古霉素活性与未作补充的标准CAMHB肉汤的方法的比较。评估了包括MSSA和MRSA菌株的各种金黄色葡萄球菌菌株。
图11提供了基于BMD分析使用具有25％马血清和0.5mM DTT的MHB II在5天内对(A)金黄色葡萄球菌ATCC 29213和(B)粪肠球菌ATCC 29212进行的MIC测定的质量控制分析。连续数天对每个菌株分析5个重复。显示了实验室1和实验室2的两个不同实验室的评估的比较。万古霉素和苯唑西林分别用作CA-MHB和CA-MHB＝2％盐水中的对照剂。
图12描绘了范围发现研究，评估(A)各种量的马血清补充物(12.5％至30％)和(B)不同量的还原剂DTT补充物(0-1mM)。质量被指定为深色调或较浅色调。如果是深色，则该方法基于拖尾效应、高MIC值(与人血清(HuS)相比)，或不能被冷冻而被取消资格。较浅色调表示该方法提供HuS样活性水平。
具体实施方式
根据本发明，可以使用本领域技术范围内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有充分说明。参见，例如，Sambrook et al,"Molecular Cloning:ALaboratory Manual"(1989)；"Current Protocols in Molecular Biology"Volumes I-III[Ausubel,R.M.,ed.(1994)]；"Cell Biology:A Laboratory Handbook"Volumes I-III[J.E.Celis,ed.(1994))]；"Current Protocols in Immunology"Volumes I-III[Coligan,J.E.,ed.(1994)]；"Oligonucleotide Synthesis"(M.J.Gait ed.1984)；"Nucleic Acid Hybridization"[B.D.Hames&S.J.Higgins eds.(1985)]；"TranscriptionAnd Translation"[B.D.Hames&S.J.Higgins,eds.(1984)]；"Animal Cell Culture"[R.I.Freshney,ed.(1986)]；"Immobilized Cells And Enzymes"[IRL Press,(1986)]；B.Perbal,"A Practical Guide To Molecular Cloning"(1984)。
因此，如果出现在此，以下术语应具有下列定义。
术语“PlySs溶素”，“PlySs2溶素”，“PlySs2”，“CF-301”，“CF301”和未具体列出的任何变体可以互换使用，并且如本申请和权利要求通篇所用，是指包括单个或多个蛋白质的蛋白质材料，并且扩展至具有本文所述和图1和SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列数据，以及本文和权利要求中所述的活性谱的那些蛋白质。因此，同样考虑了显示基本上相同或改变的活性的蛋白质。这些修饰可以是有意的，例如，通过定点诱变获得的修饰，或者可以是偶然的，例如通过作为复合物或其指定亚基的生产者的宿主中的突变获得的那些。此外，术语“PlySs溶素”，“PlySs2溶素”，“PlySs2”，“CF-301”，“CF301”旨在在其范围内包括本文中具体列举的蛋白质以及所有基本上同源的类似物、片段或截断，和等位基因变体。PlySs2溶素描述于美国专利9,034,322和PCT申请PCT/US2012/34456中。Gilmer等也描述了PlySs2溶素(Gilmer DB et al(2013)Antimicrob Agents Chemother Epub 2013 April 9[PMID23571534])。
术语“ClyS”，“ClyS溶素”是指嵌合溶素ClyS，其具有针对葡萄球菌细菌的活性，包括金黄色葡萄球菌，在WO2010/002959中详述并且也在Daniel等中描述(Daniel,A et al(2010)Antimicrobial Agents and Chemother 54(4):1603-1612)。ClyS的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:2中提供。
“裂解酶”或“裂解多肽”包括细菌细胞壁裂解酶，其在合适的条件下和相关的时间段内杀灭一种或多种细菌。裂解酶的实例包括但不限于各种酰胺酶细胞壁裂解酶。在一个特定方面，裂解酶是指噬菌体裂解酶。“噬菌体裂解酶”是指从噬菌体提取或分离的裂解酶，或具有维持裂解酶功能的类似蛋白质结构的合成裂解酶。
裂解酶或裂解多肽能够特异性切割存在于细菌细胞的肽聚糖中的键以破坏细菌细胞壁。目前还假定细菌细胞壁肽聚糖在大多数细菌中是高度保守的，并且只有少数键的切割可以破坏细菌细胞壁。切割这些键的裂解酶的实例是溶菌酶(muramidase)，氨基葡萄糖苷酶，内肽酶或N-乙酰基-胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶。Fischetti等(1974)报道C1链球菌噬菌体溶素酶是酰胺酶。Garcia等(1987，1990)报道来自Cp-1噬菌体的肺炎链球菌的Cpl溶素是溶菌酶(lysozyme)。Caldentey和Bamford(1992)报道来自phi 6假单胞菌噬菌体的裂解酶是内肽酶，分裂由中间-二氨基庚二酸和D-丙氨酸形成的肽桥。大肠杆菌T1和T6噬菌体裂解酶是酰胺酶，如来自李斯特菌噬菌体的裂解酶(ply)(Loessner等，1996)。还有本领域已知的其他裂解酶能够切割细菌细胞壁。
“由噬菌体遗传编码的裂解酶”包括能够杀灭宿主细菌的多肽，例如通过具有针对宿主细菌的至少一些细胞壁裂解活性。多肽可具有包含天然序列裂解酶及其变体的序列。多肽可以从多种来源分离，例如从噬菌体(“噬菌体”)，或者通过重组或合成方法制备。多肽可以例如在羧基末端侧包含胆碱结合部分，并且可以通过能够在氨基末端侧切割细胞壁肽聚糖的酶活性(例如作用于肽聚糖中的酰胺键的酰胺酶活性)来表征。已经描述了包括多种酶活性的裂解酶，例如两个酶结构域，例如PlyGBS溶素。此外，已经描述了仅含有催化结构域而没有细胞壁结合结构域的其他裂解酶。
“天然序列噬菌体相关裂解酶”包括具有与衍生自细菌基因组(即原噬菌体)的酶相同的氨基酸序列的多肽。可以分离这种天然序列酶，或者可以通过重组或合成方法产生。
术语“天然序列酶”包括天然存在的形式(例如，选择性剪接或改变形式)和酶的天然存在变体。在本发明的一个实施方式中，天然序列酶是成熟或全长多肽，其由来自对猪链球菌特异的噬菌体的基因进行遗传编码。当然，许多变体是可能的和已知的，如出版物中认可的，如Lopez et al.,Microbial Drug Resistance 3:199-211(1997)；Garcia et al.,Gene 86:81-88(1990)；Garcia et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:914-918(1988)；Garcia et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:914-918(1988)；Garcia et al.,Streptococcal Genetics(J.J.Ferretti and Curtis eds.,1987)；Lopez et al.,FEMSMicrobiol.Lett.100:439-448(1992)；Romero et al.,J.Bacteriol.172:5064-5070(1990)；Ronda et al.,Eur.J.Biochem.164:621-624(1987)和Sanchez et al.,Gene 61:13-19(1987)。这些参考文献中的每一篇的内容，特别是比较序列的序列表和相关文本，包括关于序列同源性的陈述，通过引用全文明确并入本文。
“变体序列裂解酶”包括特征在于多肽序列不同于裂解酶，但保留功能活性的裂解酶。在一些实施方式中，裂解酶可以通过特异于细菌的噬菌体进行遗传编码，例如在PlySs2的情况下的猪链球菌，与裂解酶序列(如本文提供的示例性溶素(图1中提供的PlySs2))具有特定的氨基酸序列同一性。例如，在一些实施方式中，功能活性裂解酶可以通过破坏细菌的细胞壁来杀灭猪链球菌细菌和如本文提供的其他易感细菌，包括如本文所示的。活性裂解酶可以与本文的裂解酶序列(如图1中提供的)具有60，65，70，75，80，85，90，95，97，98，99或99.5％的氨基酸序列同一性。这样的噬菌体相关裂解酶变体包括，例如，裂解酶多肽，其中在本文的裂解酶序列(如图1中提供的)的序列的N或C末端添加或缺失一个或多个氨基酸残基。
在一个特定的方面，噬菌体相关裂解酶将与天然噬菌体相关裂解酶序列具有至少约80％或85％的氨基酸序列同一性，特别是至少约90％(例如90％)的氨基酸序列同一性。最特别地，噬菌体相关裂解酶变体将与天然噬菌体相关裂解酶序列具有至少约95％(例如95％)的氨基酸序列同一性。图1中提供了溶素PlySs2的示例性噬菌体天然序列。
关于鉴定的噬菌体相关裂解酶序列的“百分比氨基酸序列同一性”在本文中定义为在在相同阅读框中比对序列后，候选序列中与噬菌体相关裂解酶序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，并且如果需要，引入缺口以实现最大百分比序列同一性，并且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分。
“多肽”包括包含以线性方式连接的多个氨基酸的聚合物分子。在一些实施方式中，多肽可以对应于由天然存在的多核苷酸序列编码的分子。多肽可以包括保守置换，其中天然存在的氨基酸被具有相似性质的氨基酸置换，其中这种保守置换不改变多肽的功能。
术语“改变的裂解酶”包括拼接的(shuffled)和/或嵌合的裂解酶。
已发现对被特定噬菌体感染的细菌特异的噬菌体裂解酶有效且高效地分解讨论中的细菌的细胞壁。据信裂解酶缺乏蛋白水解酶活性，因此当在细菌细胞壁的消化过程中存在时，对哺乳动物蛋白质和组织是非破坏性的。此外，因为已发现噬菌体裂解酶的作用与抗生素不同，对靶病原体具有相当的特异性，很可能正常菌群将保持基本上完整(M.J.Loessner,G.Wendlinger,S.Scherer,Mol Microbiol 16,1231-41.(1995)，通过引用并入本文)。事实上，如本文所述，PlySs2溶素虽然表现出独特的广泛细菌种类和菌株杀灭，但对包含正常菌群(包括大肠杆菌)的细菌相对且特别无活性。
用于本发明的裂解酶或多肽可以在被特定噬菌体感染后由细菌生物体产生，或者可以重组或合成产生或制备，作为用于阻止已经暴露于具有感染症状的其他人的人生病的预防性治疗，或者作为已经由于感染而变得生病的那些人的治疗性治疗。既然本文描述和提到溶素多肽序列和编码溶素多肽的核酸，优选使用本领域的标准方法，通过来自噬菌体基因组的裂解酶的分离的基因，将该基因导入转移载体，并将所述转移载体克隆到表达系统中，包括如本文示例的，产生裂解酶/多肽。裂解酶或多肽可以是截短的，嵌合的，拼接的或“天然的”，并且可以是组合的。相关美国专利No.5,604,109通过引用整体并入本文。“改变的”裂解酶可以以多种方式产生。在一个优选的实施方式中，将来自噬菌体基因组的改变的裂解酶的基因放入转移或可移动的载体，优选质粒中，并将质粒克隆到表达载体或表达系统中。用于产生本发明的溶素多肽或酶的表达载体可适用于大肠杆菌、芽孢杆菌或许多其他合适的细菌。载体系统也可以是无细胞表达系统。所有这些表达基因或基因集的方法在本领域中是已知的。裂解酶也可以通过用特异于猪链球菌的噬菌体感染猪链球菌而产生，其中所述至少一种裂解酶排他地裂解所述猪链球菌的细胞壁，对存在的其他(例如天然或共生)细菌菌群具有至多最小化影响。
如本文所述，实施方式的蛋白质或肽片段的生物活性部分包括包含与本公开的溶素蛋白的氨基酸序列充分相同或从其衍生的氨基酸序列的多肽，其包括比溶素蛋白的全长蛋白更少的氨基酸，并且表现出相应的全长蛋白质的至少一种活性。通常，生物活性部分包含具有相应蛋白质的至少一种活性的结构域或基序。例如，如图1所示，PlySs2溶素包括N末端CHAP结构域和C末端SH3结构域。蛋白质或蛋白质片段的生物活性部分可以是多肽，其例如在长度上为10，25，50，100更少或更多个氨基酸。此外，其他生物活性部分，其中蛋白质的其他区域缺失或添加，可以通过重组技术制备，并评估实施方式的多肽的天然形式的一种或多种功能活性。
突变可以在氨基酸序列中，或在编码本文方法中使用的多肽和溶素的核酸序列中进行，包括在图1中所示的溶素序列中，或在其活性片段或截短中，使得特定密码子改变为编码不同氨基酸的密码子，氨基酸置换另一个氨基酸，或缺失一个或多个氨基酸。通常通过使最少的氨基酸或核苷酸变化成为可能来进行这种突变。可以作出这种置换突变以以非保守方式(例如，通过将属于具有特定大小或特征的氨基酸组的氨基酸的密码子改变为属于另一组的氨基酸)或以保守方式(例如，通过将属于具有特定大小或特征的氨基酸组的氨基酸的密码子改变为属于同一组的氨基酸)改变所得蛋白质中的氨基酸。这种保守变化通常导致所得蛋白质的结构和功能的较小变化。非保守性变化更可能改变所得蛋白质的结构、活性或功能。应认为本发明包括含有保守变化的序列，其不显著改变所得蛋白质的活性或结合特征。
可预测这样的突变体或其变体的功能或测试杀灭细菌(包括葡萄球菌，链球菌，李斯特菌或肠球菌细菌)的功能或能力，和/或具有与本文所述和特别提供的溶素相当的活性。因此，可以对溶素序列进行改变，并且可以使用本文描述和示例的测定和方法(包括在实施例中)测试具有序列变化的突变体或变体。基于本文的溶素的结构域结构，本领域技术人员可以预测适合置换或替代的一种或多种、一种或几种氨基酸和/或不适合置换或替代的一种或多种氨基酸，包括合理的保守或非保守置换。
PlySs2溶素显示出杀灭许多不同菌株和物种的革兰氏阳性菌的活性和能力，包括葡萄球菌，链球菌，李斯特菌或肠球菌细菌。特别且重要的是，PlySs2具有杀灭葡萄球菌菌株的活性，包括金黄色葡萄球菌，尤其是抗生素敏感菌株和不同的抗生素耐药菌株两者。PlySs2还具有杀灭链球菌菌株的活性，并且显示出对A组和B组链球菌菌株的特别有效的杀灭。基于体外使用分离菌株的对数杀灭评估，下表1中描述了PlySs2溶素针对细菌的能力。本文提供的易感细菌可用于本发明的改良BMD方法中，用于确定和比较MIC值。
表1
PlySs2减少不同细菌的生长(部分清单)
术语“包括”通常以包括的含义使用，也就是说允许存在一个或多个特征或组分。
术语“基本上由......组成”是指具有确定数量的不与更大产物共价连接的残基的产物，特别是肽序列，其。在本发明的肽的情况下，本领域技术人员将理解，可以考虑对肽的N-或C-末端进行微小修饰，例如对末端进行化学修饰以添加保护基团等，例如。C末端的酰胺化。
术语“分离的”是将是根据本发明的本发明的溶素多肽或编码这样的多肽的核酸的状态。多肽和核酸将不含或基本上不含它们与之天然相关的物质，例如在其天然环境中，或当这样的制备是通过体外或体内实施的重组DNA技术时在其中制备它们的环境(例如细胞培养物)中，与它们一并发现的其他多肽或核酸。多肽和核酸可以与稀释剂或佐剂一起配制，并且仍然为了实际目的而分离-例如，多肽通常与聚合物或粘膜粘附剂或其他载体混合，或者在用于诊断或治疗时与药学上可接受的载体或稀释剂混合。
包含本发明提供的方法和应用中使用的裂解酶/多肽的治疗或药物组合物可以用于或包括在本文的方法中。治疗或药物组合物可包含一种或多种裂解多肽，并且任选地包含天然的，截短的，嵌合的或拼接的裂解酶，与一种或多种抗生素组合，任选地与合适的赋形剂、载体或赋形剂组合。本发明包括评估与抗生素组合的包括PlySs2的溶素的治疗组合物或药物组合物用于杀灭、减轻、去殖化、预防或治疗革兰氏阳性细菌，包括细菌感染或相关病症。本发明包括评估与万古霉素，利奈唑胺或达托霉素组合的包括PlySs2的溶素的治疗组合物或药物组合物。
包含在治疗组合物中的酶或多肽可以是未改变的噬菌体相关裂解酶，截短的裂解多肽，变体裂解多肽和嵌合和/或拼接裂解酶的一种或多种或任何组合。另外，可以使用由不同噬菌体遗传编码的不同裂解多肽处理相同细菌。这些裂解酶也可以是“未改变的”裂解酶或多肽，截短的裂解多肽，变体裂解多肽和嵌合和拼接裂解酶的任何组合。用于革兰氏阳性细菌(包括链球菌，葡萄球菌，肠球菌和李斯特菌)的治疗或药物组合物中的裂解酶/多肽可单独使用或与抗生素组合使用，或者，如果存在其他侵入性细菌生物待处理，则与对被靶向的其他细菌特异性的其他噬菌体相关裂解酶组合。裂解酶，截短酶，变体酶，嵌合酶和/或拼接裂解酶可以与穴蛋白(holin protein)结合使用。穴蛋白的量也可以变化。各种抗生素可任选地与酶或多肽一起包含在治疗组合物中，并且存在或不存在溶葡萄球菌素。治疗组合物中可包含多于一种裂解酶或多肽。
药物组合物还可包含一种或多种改变的裂解酶，包括通过化学合成或DNA重组技术产生的同工酶，其类似物或变体。特别地，改变的裂解蛋白可以通过氨基酸置换，缺失，截短，嵌合，拼接或其组合产生。药物组合物可含有一种或多种天然裂解蛋白和一种或多种截短的，变体的，嵌合的或拼接的裂解蛋白的组合。药物组合物还可含有衍生自相同或不同细菌物种的至少一种裂解蛋白的肽或肽片段，任选加入一种或多种互补剂，和药学上可接受的载体或稀释剂。
治疗或药物组合物可包含与多种载体组合的裂解多肽，以治疗由易感革兰氏阳性细菌引起的疾病。载体适当地含有少量添加剂，例如增强等渗性和化学稳定性的物质。这样的物质在所用剂量和浓度下对接受者无毒，包括缓冲剂，如磷酸盐，柠檬酸盐，琥珀酸盐，乙酸和其他有机酸或其盐；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽，例如聚精氨酸或三肽；蛋白质，如血清白蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；甘氨酸；氨基酸，如谷氨酸，天冬氨酸，组氨酸或精氨酸；单糖，二糖和其他碳水化合物，包括纤维素或其衍生物，葡萄糖，甘露糖，海藻糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨糖醇；抗衡离子如钠；非离子表面活性剂，如聚山梨醇酯，泊洛沙姆或聚乙二醇(PEG)；和/或中性盐。甘油或甘油(1,2,3-丙三醇)可商购用于药物用途。DMSO是非质子溶剂，具有增强许多局部应用药物的渗透的卓越能力。载体载体还可包括林格氏溶液，缓冲溶液和右旋糖溶液，特别是当制备静脉内溶液时。
裂解酶/多肽应该在具有允许裂解酶/多肽的活性的pH的环境中。稳定化缓冲液可以允许溶素酶/多肽的最佳活性。稳定化缓冲液也可以是或包含金属螯合剂，例如乙二胺四乙酸二钠盐，或者它也可以含有磷酸盐或柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液，或其他合适的缓冲液。
术语“试剂”是指任何分子，包括多肽，抗体，多核苷酸，化学化合物和小分子。特别地，术语试剂包括化合物，例如测试化合物，添加的额外化合物，或溶素酶化合物。
术语“激动剂”是指在最广泛的意义上刺激配体结合的受体的配体。
术语“测定”是指用于测量化合物的特定性质的任何过程。“筛选测定”是指用于基于化合物的活性而从一批化合物中表征或选择化合物的方法。
术语“预防(preventing)”或“预防(prevention)”是指降低可能暴露于疾病引发剂或者在疾病发作之前有患病倾向的受试者获得或发生疾病或病症的风险(即，导致疾病的至少一种临床症状不发生)。
术语“疾病预防(prophylaxis)”与术语“预防(prevention)”有关并且包含在其中，并且是指其目的是预防而不是治疗或治愈疾病的措施或程序。疾病预防措施的非限制性实例可包括疫苗的施用；低分子量肝素对处于由于例如活动受限而造成血栓形成的风险的住院患者的施用；在访问疟疾流行的地区或感染疟疾风险高的地区之前，抗疟剂如氯喹的施用。
“治疗有效量”是指药物，化合物，抗微生物剂，抗体，多肽或试剂的量，其将引起医生或其他临床人员正在寻求的受试者的生物或医学响应。特别地，关于革兰氏阳性细菌感染和革兰氏阳性细菌的生长，术语“有效量”旨在包括有效量的化合物或试剂，其将导致革兰氏阳性细菌的量或感染程度的生物学上有意义的减少，包括具有杀菌和/或抑菌作用。短语“治疗有效量”在本文中用于表示足以预防并且优选使感染性细菌的生长或量或病理学的其他特征(例如高烧或可能参加其存在和活动的白细胞计数)减少至少约30％、更优选至少50％、最优选至少90％、临床显著变化的量。
术语任何疾病或感染的“治疗”或“治疗”在一个实施方式中是指改善疾病或感染(即，阻止疾病或感染剂或细菌的生长或减少其至少一种临床症状的表现、程度或严重度)。在另一个实施方式中，“治疗”或“治疗”是指改善至少一种物理参数，其可以是受试者无法辨别的。在另一个实施方式中，“治疗”或“治疗”是指在身体上(例如，可辨别的症状的稳定化)，生理学上(例如，物理参数的稳定化)或两者上调节疾病或感染。在进一步的实施方式中，“治疗”或“治疗”涉及减缓疾病的进展或减少感染。
术语“革兰氏阳性细菌”，“革兰氏阳性细菌”，“革兰氏阳性”和未具体列出的任何变体可以互换使用，并且如本申请和权利要求通篇所用，是指已知和/或可通过某些细胞壁和/或细胞膜特征的存在和/或通过用革兰氏染色染色来鉴定的革兰氏阳性细菌。革兰氏阳性细菌是已知的并且可以容易地鉴定，并且可以选自但不限于李斯特菌属，葡萄球菌属，链球菌属，肠球菌属，分枝杆菌属，棒状杆菌属和梭菌属，并且包括其任何和所有识别的或未识别的物种或菌株。在本发明的一个方面，PlyS溶素敏感性革兰氏阳性细菌包括选自李斯特菌，葡萄球菌，链球菌和肠球菌中的一种或多种的细菌。
革兰氏阳性细菌被含有多肽和多糖的细胞壁包围。革兰氏阳性细菌包括但不限于放线菌属，芽孢杆菌属，李斯特菌属，乳球菌属，葡萄球菌属，链球菌属，肠球菌属，分枝杆菌属，棒状杆菌属和梭菌属。医学相关物种包括酿脓链球菌，肺炎链球菌，金黄色葡萄球菌和粪肠球菌。芽孢杆菌物种，其是孢子形成性的，引起炭疽和肠胃炎。孢子形成梭菌物种是肉毒中毒，破伤风，气性坏疽和假膜性结肠炎的原因。棒状杆菌物种引起白喉，并且李斯特菌物种引起脑膜炎。
术语“杀菌”是指能够杀灭细菌细胞。
术语“抑菌”是指能够抑制细菌生长，包括抑制生长中的细菌细胞。
短语“药学上可接受的”是指生理上可耐受的分子实体和组合物，并且当施用于人时，通常不产生过敏或类似的不良反应，例如胃部不适、头晕等。
术语“还原剂”是指并包括使另一种物质经历还原并在该过程中被氧化的物质。还原剂可用于使酶或蛋白质保持还原状态并防止其氧化。在一个方面，还原剂维持多肽或酶的稳定性，包括在一段时间内或在不同条件下储存。
本领域技术人员将知道已确定或已承认的还原剂，特别是用于和接受用于测定的那些，包括临床测定。还原剂的实例包括二硫苏糖醇(DTT)，三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)，氢化铝锂(LiAlH4)，硼氢化钠(NaBH4)，乙硼烷，β-巯基乙醇(BME)和二异丁基氢化铝(DIBAL-H)。
适合在本发明的方法和测定中使用和应用的肉汤或培养基包括如本领域技术人员所接受和已知的用于细菌的生长和维持的肉汤或培养基，或者可用于培养各种各样的微生物并且包括但不限于本文使用和/或描述的肉汤或培养基的任何这样的通用培养基。示例性肉汤或培养基包括适用于抗微生物易感性测试的定量程序的阳离子调节的肉汤。
实施例
通过参考以下非限制性实施例可以更好地理解本发明，这些实施例作为本发明的示例提供。提供以下实施例是为了更全面地说明本发明的优选实施方式，但决不应将其解释为限制本发明的广泛范围。
实施例1
溶素是抗微生物酶，其为常规抗生素提供了新的替代品。溶素是由噬菌体编码的蛋白质，用于在自然环境中杀灭细菌。生物圈中约有1031个噬菌体，噬菌体每天杀灭所有细菌的约三分之一，其中溶素家族是杀灭宿主细菌的主要手段(Hatful GF(2015)J Virol 89(16):8107-8110)。纯化的溶素表现出称为“自外裂解(lysis from without)”的现象(Fischetti VA et al(20016)Nature Biotechnology 24:1508-1511)，并且可进行合成重组制造。纯化的溶素通过细胞壁水解而在接触时表现出有效细菌溶解作用。溶素多肽通常是20-30kDa蛋白质。
PlySs2溶素(也称为CF-301)代表着第一个也是唯一一个进入美国人体临床试验的溶素。CF-301被FDA授予针对金黄色葡萄球菌菌血症的快速通道状态，并且I期试验在2015年完成。PlySs2最初来源于猪中的猪链球菌携带的原噬菌体。PlySs2溶素已被证实杀灭临床上重要的革兰氏阳性细菌的各种菌株，包括抗生素耐药菌株，如金黄色葡萄球菌的甲氧西林和万古霉素耐药和敏感菌株(MRSA，MSSA，VRSA，VISA)，达托霉素耐药金黄色葡萄球菌(DRSA)和利奈唑胺耐药金黄色葡萄球菌(LRSA)。PlySs2是一种独特的溶素，具有相对广泛但确定的物种杀灭活性，可以杀灭多种细菌，特别是革兰氏阳性细菌，包括葡萄球菌，链球菌，肠球菌和李斯特菌菌株，同时对天然肠道菌群中的细菌无活性。
临床级PlySs2/CF-301已在大肠杆菌中重组产生，并且在宽的pH(pH 6-9.7)和温度(16-55℃)范围上有活性(Gilmer et al(2013)Antimicrob Agents Chemother 57:2743-2750；Scuch et al(2014)J Infect Dis 209:1469-78)。它在各种人类基质中具有活性，包括血液，血清，血浆，唾液，滑液，肺表面活性物质和支气管灌洗液。PlySs2(CF-301)的氨基酸序列和结构在图1中提供。
PlySs2(CF-301)靶向敏感细菌的细胞壁，包括金黄色葡萄球菌。它是半胱氨酸-组氨酸氨肽酶，其靶向细胞壁肽聚糖中的D-Ala-L-Gly键并在细胞壁的D-丙氨酸(茎肽)和L-甘氨酸(横桥)之间切割(图2)。细菌裂解是迅速的(图2C)。CF-301具有限定的物种特异性并杀灭抗生素耐药细菌，包括MSSA、MRSA、VRSA、DRSA和LRSA，对甲氧西林、万古霉素、达托霉素、利奈唑胺抗生素有耐药的细菌(Schich R et al(2014)J Infect Dis 209:1469-1478)。杀灭是快速且有效的，并且看到对裂解肽的低耐药特征。CF-301根除生物膜并杀灭顽固细菌。已经观察到与抗生素的协同作用。
为了提供对裂解多肽对细菌的作用的可重复且一致的评估，包括在临床试验环境中，我们已经评估了各种方法并开发了肉汤微量稀释(BMD)法，该方法是根据如Clinicaland Laboratory Standards Institute(CLSI)文件M07-A9中描述的标准的BMD方法(用于有氧生长的细菌的稀释抗微生物敏感性测试的方法)的改变。第32卷(Wayne[PA]:Clinicaland Laboratory Standards Institute[US],2012)。
我们已经发现必须改良标准CLSI方法以消除裂解多肽(特别是包括PlySs2(CF-301))的MIC测定的问题，包括以下三个主要问题：1)拖尾效应；2)与人体血液、血清或血浆中的易感性发现明显脱节；3)冷冻药物稀释组中酶活性的丧失。在大量的测定开发之后，已经开发出改良BMD方法以提供精确、可重复和稳健的易感性测试。新方法尽可能贴近CLSI标准，并针对在日常的临床实验室中使用进行了优化。
裂解多肽，例如并包括PlySs2(CF-301)，已经对易感性测试提出了挑战。PlySs2/CF-301是一种大型溶菌酶，在物理特性、作用方式和新陈代谢方面与抗生素不同。有多个因素可能妨碍精确的易感性试验：化合物大小(26kDa)和电荷(pI为9.2)限制了在固体表面上的扩散；硫醇基团(活性位点半胱氨酸)可被氧化和失活(MHB中的半衰期为～5h)；净正电荷介导“粘附”在聚苯乙烯表面上(对聚丙烯没那么高)；使用肉汤微量稀释(BMD)对～70％的金黄色葡萄球菌菌株的拖尾(或伊格尔)效应；MIC在CA-MHB(64μg/ml的MIC90)和人血液/血清/血浆(MIC90＝1μg/ml)之间脱节。因此，寻求替代的BMD方法以使得对裂解多肽(例如并包括PlySs2/CF-301)的精确易感性测试成为可能。
标准CLSI BMD测定中的拖尾和血液效应的问题的实例显示在图3中。金黄色葡萄球菌ATCC 700699的标准BMD分析在CA-MHB(图3A)和人血液基质(图3B)中进行。发现拖尾或伊格尔效应模糊了标准肉汤Mueller Hinton Broth II(MHBII)中的精确MIC测定(图3A)。尽管在这些标准条件下MIC值为64μg/ml，但观察到拖尾和伊格尔效应高达512μg/ml。发现CF-301在人血液、血浆和血清中比在MHBII中更有效(图3B)。人血液中的MIC值为1μg/ml。因此，证明了MHBII不足以进行易感性测试，而对标准肉汤微量稀释测试的补充或修改可以有助于获得与人基质中相似的MIC值。
最初开发了两种改良BMD方法来测试PlySs2/CF-301。在第一种方法中，主要的改动是使用聚丙烯板并且MHBII补充有1mM DTT。DTT(DL-二硫苏糖醇)是一种常用的分子生物学试剂，用于使酶保持还原状态。使用这种暂时的方法，检测223种同时代的临床MSSA和MRSA菌株，测定MIC90＝8μg/ml(范围＝1-16μg/ml)。由于聚丙烯的使用、与人体血液MIC值的剩余脱节，以及冷冻板的问题，该程序是权宜之计。
为了确定下一种方法，使用了优异的方法，聚苯乙烯板和CA-MHB。使用许多程序变化和补充物(已知影响AST性能)筛选一组30个金黄色葡萄球菌菌株的支持人血液样活性并使得能够使用冷冻板的能力。评估如下：
不同的动物血清(5-50％)-狗，兔，马，小鼠血清
已溶马血(laked horse blood)(1-5％)
DTT(0.05-5mM)
动物血清(5-50％)+DTT(0.5mM)
吐温80(0.002％)
BSA(0.05-0.5％)
NaCl(1-5％)
BSA 0.1％，NaCl 2％，在200rpm2下振动
BSA 0.1％，NaCl 2％
CaCl2(至50μg/ml)
MgCl2(至50μg/ml)
CaCl2(至50μg/ml)+MgCl2(至50μg/ml)
TCEP(0.01-5mM)
各种肉汤和培养基-LB，TSB，BHI，1/4MHB，1/2MHB
pH、接种物和气氛变化
程序变化的结果在下面的表2中提供。
*区分使用新鲜稀释的CF-301板和冷冻解冻的CF-301稀释板
在上述评估的基础上，确定了新BMD方法的补充物。使用马血清和还原剂(DTT)，其使得人血清样活性水平成为可能，并允许使用冷冻的溶素多肽(CF-301)稀释板。特别是补充25％的马血清和0.5mM的DTT获得令人满意的MIC结果。针对一组30个金黄色葡萄球菌菌株的相关易感性测试结果列于图4中。对于冻融，在指定的培养基中使用用于CF-301的标准2倍稀释方案，解冻之前在-70℃下冷冻24小时，加入细菌，并测定MICS。所使用的BMD方法在下面提供的程序中进一步详述。
为了验证马血清/DTT方法，使用各种BMD条件和供应来源对25个金黄色葡萄球菌菌株评估新鲜和解冻的CF-301稀释板。条件和来源的改动如下：
连续5天分析，由2个不同的个体进行
各种来源的马血清(Sigma，Corning，Gibco，BioreclamationIVT，Mediatech，RAMBIO，ATCC，Central Biomedia，Lampire)
粉末CA-MHB/MHB II(BD和Sigma)和预制液体MHB II(BD和Teknova)各自的各种来源
多种来源的DTT(Sigma(液体，粉末)，G-Biosciences)
生长温度在环境空气中为30-37℃，在5％CO2中为37℃，板振动至多200rpm
测定最终/最佳培养基pH范围为7.4±0.6
最终/最佳接种物(CFU/ml)范围为5×105±1-log10
来源和条件评估的一些示例性结果在下面的表3、4和5中提供。图5中提供了使用14种不同来源的马血清在连续5天对金黄色葡萄球菌ATCC 29213和粪肠球菌ATCC 29212的比较性BMD分析的研究。
测试的所有改动产生与0.5/1μg/ml(范围＝0.25-2)的MIC50/90为≤2倍的变化。此外，-80℃下的CF-301板的延长培养没有显著影响(目前测定至多365天)(表6)。图6中提供了冷冻样品的活性的时间过程。
在不同条件下使用MRSA菌株ATCC 29213，进行使用单独的MHBII、单独的100％马血清和补充有马血清和DTT的BHBII的MIC测定(图7)。单独的MHBII给出MIC为16μg/ml，具有轻微的拖尾效应。100％人血清中的BMD测定给出MIC＝1μg/ml，并且在补充有25％马血清、0.5mM DTT的MHBII中，MIC接近人血清的MIC，MIC为0.5μg/ml。
在补充有0.25％马血清和0.5mM DTT的CA-MHB中使用新方法分析金黄色葡萄球菌ATCC 70069的类似MIC测定显示没有拖尾或伊格尔效应和1μg/ml的MIC，模仿人血清的MIC(图8)。
为了进一步评估使用补充有25％马血清、0.5mM DTT的MHBII的BMD方法，评估了大量临床MSSA和MRSA分离物，并与100％人血清对MIC测定进行比较。该分析还扩展到先前证明对PlySs2溶素(CF-301)易感的各种革兰氏阳性病原体(Schich et al(2014)J InfectDis 209:1469-1478)，包括表皮葡萄球菌，化脓性链球菌，无乳链球菌，肺炎链球菌和粪肠球菌。结果如图9所示。使用新方法，CF-301维持其活性谱。
在改良BMD方法中评估标准抗生素万古霉素。使用标准CA-MHB相对于补充有马血清和DTT的CA-MHB，MIC50、MIC90和范围是等同的(图10)。
为了进一步评估新的BMD方法，在不同的测试位置进行分析，包括发明人实验室和临床微生物学研究所(CMI；Wilsonville，OR)的次要位置以由其他人确认结果的可重复性。用于评估的QC菌株包括金黄色葡萄球菌ATCC 29213和粪肠球菌ATCC 29212。使用具有25％马血清和0.5mM DTT的MHBII的BMD分析在5天内用金黄色葡萄球菌ATCC 29213和粪肠球菌ATCC 29212(图11)进行。连续5天分析每个菌株5个重复。该测定在连续5天和在实验室之间是可重复的。
进行范围发现实验，评估不同量的血清和还原剂补充剂。评估12.5％至30％的马血清和评估0至1mM的DTT的补充剂的结果如图12所示。条件是基于模拟人血清样活性的能力。在血清测定中，每种条件使用相同组的30个金黄色葡萄球菌菌株。在DTT测定中，单一金黄色葡萄球菌菌株用于一系列条件。评估质量并指明。马血清补充水平为20％至30％是合适的。12.5％的马血清给出不令人满意的结果。DTT适合在0.25和1mM之间，0.5mM和1mM是最理想的，因为拖尾效应或高MIC或不能在0.25mM DTT或更低下冷冻。研究还使用替代还原剂TCEP进行，并给出了与DTT类似的结果。
总之，裂解多肽(例如且特别是PlySs2(CF-301))的精确体外BMD测试需要两种补充物：血清和还原剂。在本实例中，使用来自各种来源的马血清和DTT作为补充物的BMD评估提供了众多细菌菌株的精确结果，包括各种金黄色葡萄球菌菌株和粪肠球菌。所添加的哺乳动物血清，特别是马血清，去除拖尾效应，并且使得与在人血液、血清或血浆中观察到的活性可比较的活性的定量成为可能。还原剂(例如特别是DTT)的添加使溶素稳定化并且起到防止氧化和使得能够使用冷冻裂解多肽稀释板的作用。本改良BMD方法是精确的、可重复的和稳健的。
下面更详细地描述用于改良BMD测定的详细示例性方法和程序。
肉汤微量稀释程序：
本节提供了进行肉汤微量稀释易感性测试的一般程序。该程序是CLSI方法(文件M07-A9，2015)的变化形式，并且是基于Wiegand等，2008(参见附录D，第D1节)描述的方法，以检查高度带电荷的抗微生物肽的MIC。
制备稀释的裂解多肽用于分析：裂解多肽(PlySs2)作为在Demo缓冲液中以10.74mg/ml的浓度悬浮的冷冻储备溶液提供。Demo缓冲液是磷酸二氢钠二水合物(7.67mM)、磷酸氢二钠二水合物(7.33mM)和氯化钠(150mM)，pH为7.22。为了建立PlySS2稀释液，使用的稀释剂是补充有25％马血清和0.5mM DTT的MHB II。每个菌株或分离物一式三份检测，每个板有两个菌株或分离物。
1.通过在24℃水浴中悬浮5分钟来解冻冷冻的溶素多肽(例如CF-301)储备溶液。在不超过30分钟内将解冻的样品储存在冰上直至使用。丢弃未使用的多肽(CF-301)。
2.确定测定所需的期望双倍溶素多肽(例如CF-301)稀释范围。对于大多数金黄色葡萄球菌菌株，该范围将从8或16μg/ml的最终期望浓度开始。对于一些万古霉素中度金黄色葡萄球菌菌株，该范围将以512μg/ml开始。
3.对于每种稀释，以期望最终浓度的两倍制备溶素多肽(例如CF-301)主稀释储备液，并用0.05ml填充第1-10列的适当孔。用移液管将0.1ml肉汤移入第12列的孔中以用作无菌对照，并用移液管将0.05ml移入第11列的孔中以用作生长对照。
接种物制备和接种：为了使接种物密度标准化以进行易感性测试，使用McFarland等效浊度标准品(Remel，目录号R20421)。在测试的每一天，使用质量控制菌株，例如以下质量控制菌株：金黄色葡萄球菌ATCC 29213(CFS-581)，金黄色葡萄球菌ATCC 43300(CFS-553)和粪肠球菌ATCC 29212(CFS-806)。
1.通过制备选自18-24小时血琼脂平板的分离菌落的直接肉汤悬浮液来制备接种物。肉汤悬浮液可以在BBLTM Mueller Hinton Broth，2ml管(BD Diagnostic Systems，目录号296164)中进行。
2.使用Grant Instruments的DEN-1密度计调节悬浮液以达到相当于0.5McFarland标准的浊度。
3.在制备的15分钟内，将调节的接种物稀释到肉汤中，因此，在接种后，每个孔将含有约5×105CFU/ml的终浓度。由于第1-11列的每个孔的接种体积将为0.05ml，0.5McFarland悬浮液应以1:100稀释以得到1×106CFU/ml。当将0.05ml的该悬浮液接种到微量滴定板孔(已经含有0.05ml)中时，细菌的最终测试浓度约为5×105CFU/ml。
4.在接种物已经被如上所述标准化后15分钟内，用0.05ml接种第1-11列的每个孔。每个孔的最终体积现在为0.1ml。
5.通过将等分试样再次培养到血琼脂平板上进行同时培养，对接种物悬浮液进行纯度检查。
培养：将接种的托盘在加入接种物的15分钟内在环境空气培养箱中于37℃培养16至18小时。建议不要堆叠板超过四个高。
确定MIC终点：
1.将含有CF-301的孔中的生长量与生长对照孔中的生长量进行比较。为使测试被认为有效，必须在生长控制孔中出现可接受的增长。通过眼睛确定MIC值。
2.作为独立记录，读取并保存在Molecular Devices SpectraMax M3平板读数器中测定的每个托盘的孔的OD600值。
培养基和补充物
补充物
来自粉末的DL-二硫苏糖醇(DTT)储备溶液(1M)
1.将1.5g DTT溶解于1ml H2O(UltraPure DNase/RNase-free Distilled Water)中。
2.用蒸馏水将体积调至10ml，并通过0.22μm过滤器除菌。
3.在使用当天准备(不要存储和重复使用)。
DL-二硫苏糖醇(DTT)溶液(在H2O中为1M)
1.无菌地打开玻璃瓶并分配适量。
2.在使用当天准备(不要存储和重复使用)。
马血清(100％)
1.将冷冻的马血清在4℃下过夜解冻或在24℃下孵育1小时解冻。
2.无菌地将适量的血清加入高压灭菌和冷却的MHB II肉汤中。
3.在-20℃下以50ml等分试样冷冻保存。
琼脂培养基
含有5％羊血的胰蛋白酶大豆琼脂
从可商购来源获得预制的胰蛋白酶大豆琼脂平板(补充有5％羊血)。
肉汤培养基
阳离子调节的Mueller Hinton肉汤
从可商购来源获得脱水的Mueller Hinton II肉汤(阳离子调节的)。
该形式应含有20-25mg的Ca2+/L和10-12.5mg的Mg2+/L。
1.完全按照制造商的建议准备MHB II，高压灭菌，冷却至55℃ 1小时，通过0.22μm膜无菌过滤，并在2至8℃冷却过夜。
2.检查pH值。最终的pH值应为7.2-7.4。
3.避光储存在2至8℃不超过1周。
含25％马血清和0.5mM DTT的阳离子调节的Mueller Hinton肉汤
1.按照B3.1节的描述制备阳离子调节的Mueller Hinton肉汤。
2.在2至8℃下将肉汤冷却过夜后，对于每份需要的100ml，将25ml马血加入75ml肉汤中。有关马血的准备，请参阅第B1.2节。
3.轻轻旋转以混合。
4.混合后，对于每份需要的100ml的Broth+25％马血清，加入0.05ml的1M DTT储备液。根据DTT的来源，请参阅B1.1或B1.2节进行准备。
5.最终的pH值应为7.4。
6.仅在使用当天准备新鲜培养基。不要存储培养基和重复使用。
试剂和设备
细菌生长培养基
BBLTM Mueller Hinton II肉汤，阳离子调节，通过高压灭菌灭菌(BDDiagnostics，目录号#212322，批号#5257869，到期日期05/31/2019)
Mueller Hinton Broth 2，阳离子调节，通过高压灭菌灭菌(Sigma-Aldrich，目录号#90922，批号#BCBR3303V，到期日期11/2020)
BBLTM Mueller HintonII肉汤，阳离子调节，400ml，无菌(BD Diagnostics，目录号#297963，批号#6014547，到期日期1/12/2017)
Mueller Hinton II肉汤，阳离子调节，1000mL，无菌(Teknova，目录号#M5860，批号#M586012B1601，到期日期12/9/2016)
TrypticaseTM大豆琼脂平板，含5％羊血(TSA II)(BD Diagnostics，目录号#221239，批号#6049996，到期日期6/10/2016)
动物和人血液制品
马血清，供体畜群，无菌过滤(Sigma-Aldrich，目录号#H1270，批号#15G382，到期日期6/2016，在-20℃冷冻保存)
马血清，无菌过滤(BioreclamationIVT，目录号#HSESRM，批号#HSE1225，到期日期10/2016，在-20℃冷冻保存)
马血清，新西兰血来源，供体畜群，无菌过滤(Gibco，目录号#16050-122，批号#1671315，到期日期2/2019，在-20℃冷冻保存)
供体马血清，美国来源，无菌过滤(Corning，目录号#35-030-CV，批号#35030105，到期日期7/2018，在-20℃冷冻保存)
供体马血清，美国来源，无菌过滤(Sigma-Aldrich，目录号12449C，批号#14A277，2/28/2018，在-20℃冷冻保存)
来自人类男性AB血浆的人血清，美国来源，无菌过滤(Sigma-Aldrich，目录号#SLBN4664V，到期日期4/2018，在-20℃冷冻保存)
汇集的正常人类男性AB血清，无菌过滤(Innovative Research Inc.，目录号#IPLA-SERAB，批号#19799，在-20℃冷冻保存)
汇集的正常人类男性血浆，NA-柠檬酸盐抗凝剂，无菌过滤(Innovative ResearchInc.，目录号#IPLA-N，批号#18944，在-20℃冷冻保存)
兔血清，美国来源，无菌过滤(Sigma-Aldrich，目录号#R7136，批号#13E108，到期日期5/2017，在-20°冷冻保存)
Innovative Grade US Origin Beagle血清(Innovative Research Inc.，目录号#IBG-SER，批号#17654，到期日期6/2018，在-20℃保存)
RemelTM已溶马血(Laked Horse Blood)(Thermo Scientific，目录号#R54072，在-20℃冷冻保存)
化学试剂
DL-二硫苏糖醇溶液，在H2O中为1M(Sigma-Aldrich，目录号646563-10X.5ML，批号#MKBW5575V，在24℃未开封保存)
DL-二硫苏糖醇BioUltra，用于分子生物学，≥99.5％(RT)(Sigma-Aldrich，目录号43815-25G，批号#BCBBD7009V，在2-8℃保存)
DL-二硫苏糖醇(G-Biosciences，目录号#RC-046，批号#151106，在2-8℃保存)
三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液，0.5M，pH 7.0(Sigma-Aldrich，目录号#646547-10X1ML，批号#MKBW8503V，在24℃未开封保存)
80(Sigma-Aldrich，目录号#P4780-100ML，批号#MKBW2896V，在24℃保存)
氯化钠(NaCl)(Fisher BioReagents，目录号#BP358-10，批号#150661，在24℃保存)
氯化钙(Fisher Bioreagents，目录号#C77-212，批号#110651，在24℃保存)
氯化镁，无水，≥98％(Sigma-Aldrich，目录号M8266-100G，批号120M0094V，在24℃保存)
牛血清白蛋白，冻干粉，≥96％(Sigma-Aldrich，目录号#A2153，批号#SLBL5462V，在2-8℃保存)
供应物和设备
96孔细胞培养板，聚苯乙烯，无菌，U型底，低蒸发盖(Corning，目录号#351177，批号#6026023)
BBLTM Mueller Hinton肉汤，2ml管(BD Diagnostic Systems，目录号#296164，批号#6054984)
DEN-1台式密度计(Grant Biosciences，目录号#DEN-1，批号#050102-1111-0426)
SpectraMax M3多模式微板读数器(Molecular Devices Inc.)
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在不脱离本发明的精神或必要特性的情况下，本发明可以以其他形式体现或以其他方式实施。因此，本公开内容被认为是在所有方面中是说明性的而非是限制性的，本发明的范围由所附权利要求指示，并且在等同含义和范围内的所有变化都旨在被包含在其中。
在整个说明书中引用了各种参考文献，其各自以其全文通过引用并入本文。

Claims (18)

1.一种用于革兰氏阳性细菌的肉汤微量稀释(BMD)易感性测试的方法，所述方法包括评估补充有哺乳动物血清和还原剂的肉汤中的抗菌肽，其中所述抗菌肽是溶素多肽，其中所述哺乳动物血清是浓度为15％-50％的马血清。
2.权利要求1所述的方法，其中所述肉汤补充有浓度为15％-30％的马血清。
3.权利要求1所述的方法，其中所述肉汤补充有浓度为20％-30％的马血清。
4.权利要求1所述的方法，其中所述肉汤是阳离子调节的肉汤。
5.权利要求1所述的方法，其中所述肉汤是Mueller Hinton Broth(MHB)。
6.权利要求1所述的方法，其中所述还原剂选自二硫苏糖醇(DTT)和三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)。
7.权利要求1所述的方法，其中所述还原剂的量为0.1-1mM。
8.权利要求1所述的方法，其中所述还原剂的量为0.25-1mM。
9.权利要求1所述的方法，其中所述溶素多肽是PlySs2(CF-301)或其有效杀灭革兰氏阳性细菌的变体或衍生物。
10.权利要求1所述的方法，用于评估包含抗菌肽并且还包含一种或多种抗菌剂的组合物，所述抗菌肽是溶素多肽。
11.权利要求10所述的方法，其中所述一种或多种抗菌剂是抗生素。
12.权利要求1所述的方法，其中所述溶素多肽由SEQ ID NO.1的氨基酸序列表示。
13.权利要求1所述的方法，其中所述溶素多肽由以下氨基酸序列表示：其中相对于SEQID NO.1在所述氨基酸序列N末端处缺失一个氨基酸残基，和其中所述溶素多肽包含半胱氨酸,组氨酸依赖性氨基水解酶/肽酶CHAP结构域和SH3结构域。
14.权利要求1所述的方法，还包括将抗菌肽与肉汤接触，其中所述抗菌肽在与肉汤接触之前冷冻。
15.权利要求14所述的方法，其中在将抗菌肽与肉汤接触之前冷冻所述抗菌肽至多365天。
16.权利要求1所述的方法，其中所述革兰氏阳性细菌是金黄色葡萄球菌。
17.权利要求1所述的方法，其中所述革兰氏阳性细菌是表皮葡萄球菌。
18.权利要求1所述的方法，其中所述方法的培养条件包含5％CO2并且生长温度为37℃。
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