JP2022058682A - グラム陽性菌に対するバクテリオファージ溶解素と抗生物質との組み合わせ - Google Patents

グラム陽性菌に対するバクテリオファージ溶解素と抗生物質との組み合わせ Download PDF

Info

Publication number
JP2022058682A
JP2022058682A JP2022007043A JP2022007043A JP2022058682A JP 2022058682 A JP2022058682 A JP 2022058682A JP 2022007043 A JP2022007043 A JP 2022007043A JP 2022007043 A JP2022007043 A JP 2022007043A JP 2022058682 A JP2022058682 A JP 2022058682A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
plyss2
antibiotic
antibiotics
identity
gram
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022007043A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2022058682A5 (ja
Inventor
シューフ レイモンド
Schuch Raymond
シー． ノウィンスキー ロバート
C Nowinski Robert
ウィッテキンド マイケル
Wittekind Michael
リー ハン
Hung Lee
シュナイダー ブレント
Schneider Brent
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Contrafect Corp
Original Assignee
Contrafect Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Contrafect Corp filed Critical Contrafect Corp
Publication of JP2022058682A publication Critical patent/JP2022058682A/ja
Publication of JP2022058682A5 publication Critical patent/JP2022058682A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425—Thiazoles
    • A61K31/429—Thiazoles condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/43—Compounds containing 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula, e.g. penicillins, penems
    • A61K31/431—Compounds containing 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula, e.g. penicillins, penems containing further heterocyclic rings, e.g. ticarcillin, azlocillin, oxacillin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4188—1,3-Diazoles condensed with other heterocyclic ring systems, e.g. biotin, sorbinil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/14—Peptides containing saccharide radicals; Derivatives thereof, e.g. bleomycin, phleomycin, muramylpeptides or vancomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/085—Staphylococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/503—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01017—Lysozyme (3.2.1.17)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

【課題】グラム陽性菌、特に、ブドウ球菌の防止、回復および処置のための組成物および方法を提供する。【解決手段】グラム陽性菌を殺滅する方法であって、該方法は、ＰｌｙＳｓ２溶解素と１つまたは複数の抗生物質との組み合わせと該細菌とを接触させる工程を含む。抗生物質、特に、ダプトマイシン、バンコマイシン、リネゾリドまたはオキサシリンを含む抗生物質とＰｌｙＳｓ２溶解素との組み合わせは、いずれか単独よりも低用量または低ＭＩＣで、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含むグラム陽性菌を殺滅するのに有効である。【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、概して、溶解素、特に、連鎖球菌の溶解素、特に、溶解素ＰｌｙＳｓ２と１つまたは複数の抗生物質との組み合わせを用いた、ブドウ球菌を含むグラム陽性菌の防止、回復および処置に関する。
発明の背景
多種多様の疾病および他の状態に対して使用する抗生物質が増えるにつれ、薬物耐性菌が発生することが、医療における大きな問題である。より多くの抗生物質を使用することおよび耐性を示す細菌の数のせいで、処置時間が長くなる。さらに、広域の非特異的抗生物質が、現在、頻繁に使用されているが、そのうちのいくつかは、患者に有害作用を及ぼす。この使用の増加に関連する問題は、多くの抗生物質が、粘液内層（ｍｕｃｕｓ ｌｉｎｉｎｇ）を容易に透過しないということである。
グラム陽性菌は、ポリペプチドおよび多糖を含む細胞壁に囲まれている。グラム陽性菌としては、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属が挙げられるがこれらに限定されない。医学的に関連性のある種としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓが挙げられる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ種は、胞子形成性であり、炭疽および胃腸炎の原因となる。胞子形成性のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種は、ボツリヌス、破傷風、ガス壊疽および偽膜性大腸炎に関与する。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種は、ジフテリアの原因となり、Ｌｉｓｔｅｒｉａ種は、髄膜炎の原因となる。
新規抗菌療法アプローチには、酵素ベースの抗生物質（「エンザイバイオティクス（ｅｎｚｙｂｉｏｔｉｃｓ）」）、例えば、バクテリオファージ溶解素が含まれる。ファージは、これらの溶解素を使用して、それらの細菌宿主の細胞壁を消化し、低浸透圧性溶解によってウイルス子孫を放出する。精製された組換え溶解素を外部からグラム陽性菌に加えたときも、同様の結果を生じる。溶解素がグラム陽性病原体に対して高致死活性であることにより、それらは治療薬として開発するための魅力的な候補になる（Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ，Ｖ．Ａ．（２００８）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １１：３９３－４００；Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ｌ．ら（２００１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：４１０７－４１１２）。バクテリオファージ溶解素は、当初、病原性連鎖球菌の鼻咽頭保因を根絶するために提案された（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４：２１７０－２１７２；Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．ら（２００１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：４１０７－４１１２）。溶解素は、宿主溶解をウイルス構築の完成と連携させるために二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ファージが使用する溶解機構の一部である（Ｗａｎｇ，Ｉ．Ｎ．ら（２０００）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５４：７９９－８２５）。溶解素は、細菌細胞壁（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｗａｌｌ）内の結合を壊し、ペプチドグリカンの完全性に不可欠な共有結合を迅速に加水分解し、細菌の溶解およびそれに伴う子孫ファージの放出を引き起こす、ペプチドグリカン加水分解酵素である。
溶解素ファミリーのメンバーは、触媒ドメインが特異性ドメインまたは結合ドメインに融合されているモジュール構造を示す（Ｌｏｐｅｚ，Ｒ．ら（１９９７）Ｍｉｃｒｏｂ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ ３：１９９－２１１）。溶解素は、細菌ゲノム内のウイルスプロファージ配列からクローニングされ得、処置のために使用され得る（Ｂｅｒｅｓ，Ｓ．Ｂ．ら（２００７）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２（８）：１－１４）。溶解素は、外部から加えられると、グラム陽性細胞壁の結合に到達することができる（Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ，Ｖ．Ａ．（２００８）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １１：３９３－４００）。バクテリオファージ溶解酵素は、被験体における様々なタイプの感染の評価および様々な投与経路による特異的処置において有用と立証された。例えば、米国特許第５，６０４，１０９号（Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉら）は、半精製されたＣ群連鎖球菌ファージ関連溶解素酵素による酵素消化を介した臨床検体中のＡ群連鎖球菌の迅速な検出に関する。この酵素の働きは、さらなる研究の基礎となり、疾患を処置する方法に至った。ＦｉｓｃｈｅｔｔｉおよびＬｏｏｍｉｓの特許（米国特許第５，９８５，２７１号、同第６，０１７，５２８号および同第６，０５６，９５５号）には、Ｃ１バクテリオファージに感染したＣ群連鎖球菌によって産生される溶解素酵素の使用が開示されている。米国特許第６，２４８，３２４号（ＦｉｓｃｈｅｔｔｉおよびＬｏｏｍｉｓ）には、皮膚組織への局所的適用に適したキャリア中での溶解酵素の使用による皮膚科学的感染症に対する組成物が開示されている。米国特許第６，２５４，８６６号（ＦｉｓｃｈｅｔｔｉおよびＬｏｏｍｉｓ）には、感染している細菌に特異的な溶解酵素を投与する工程を含む、消化管の細菌感染症を処置するための方法が開示されている。その消化管に少なくとも１つの溶解酵素を送達するためのキャリアは、坐剤浣腸、シロップ剤または腸溶性丸剤からなる群より選択される。米国特許第６，２６４，９４５号（ＦｉｓｃｈｅｔｔｉおよびＬｏｏｍｉｓ）には、その細菌に特異的なバクテリオファージに感染した細菌によって産生される少なくとも１つの溶解酵素および患者にその溶解酵素を送達するための適切なキャリアの非経口導入（筋肉内、皮下または静脈内）による、細菌感染症を処置するための方法および組成物が開示されている。
ファージ関連溶解酵素は、様々なバクテリオファージから同定され、クローニングされており、それらの各々が、特定の菌株の殺滅において有効であると示されている。米国特許第７，４０２，３０９号、同第７，６３８，６００号および公開ＰＣＴ出願ＷＯ２００８／０１８８５４は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ感染症の処置または減少のための抗菌剤として有用な別々のファージ関連溶解酵素を提供している。米国特許第７，５６９，２２３号には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する溶解酵素が記載されている。米国特許第７，５８２２９１号には、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ（バンコマイシン耐性菌株を含む、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓおよびＥ．ｆａｅｃｉｕｍ）に対して有用な溶解素が記載されている。ＵＳ２００８／０２２１０３５には、Ｂ群連鎖球菌の殺滅において非常に有効な変異体Ｐｌｙ ＧＢＳの溶解素が記載されている。ＷＯ２０１０／００２９５９には、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを含むブドウ球菌に対する活性を有するＣｌｙＳと表示されるキメラ溶解素が詳述されている。
溶解素は、その迅速、強力かつ特異的な細胞壁分解特性および殺菌特性に基づいて、露出したペプチドグリカン細胞壁を細胞の外側から攻撃することによってグラム陽性病原体と闘う抗微生物治療法として提案されている（Ｆｅｎｔｏｎ，Ｍら（２０１０）Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｂｕｇｓ １：９－１６；Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄら（２００１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：４１０７－４１１２）。単剤としての様々な溶解素の効能は、咽頭炎（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄら（２００１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：４１０７－４１１２）、肺炎（Ｗｉｔｚｅｎｒａｔｈ，Ｍら（２００９）Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ３７：６４２－６４９）、中耳炎（ＭｃＣｕｌｌｅｒｓ，Ｊ．Ａ．ら（２００７）ＰＬＯＳ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ３：０００
１－０００３）、膿瘍（Ｐａｓｔａｇｉａ，Ｍら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ５５：７３８－７４４）、菌血症（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら（２００３）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７１：６１９９－６２０４）、心内膜炎（Ｅｎｔｅｎｚａ，Ｊ．Ｍ．ら（２００５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４９：４７８９－４７９２）および髄膜炎（Ｇｒａｎｄｇｉｒａｒｄ，Ｄら（２００８）Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １９７：１５１９－１５２２）のげっ歯類モデルにおいて実証されている。さらに、溶解素は、一般に、その細菌宿主種に特異的であって、胃腸管ホメオスタシスにとって有益であり得るヒト共生細菌を含む非標的生物を溶解しない（Ｂｌａｓｅｒ，Ｍ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７６：３９３－３９４；Ｗｉｌｌｉｎｇ，Ｂ．Ｐ．ら（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ９：２３３－２４３）。
臨床行為における抗生物質としては、グラム陽性菌の細胞壁ペプチドグリカンの生合成に通常影響するいくつかのものが挙げられる。これらには、Ｎ－アセチルムラミン酸（ＮＡＭ）およびＮ－アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）ペプチドサブユニットをペプチドグリカンマトリックスに組み込むことを妨げることによってペプチドグリカン合成を阻害する１クラスとしてのグリコペプチドが含まれる。利用可能なグリコペプチドとしては、バンコマイシンおよびテイコプラニンが挙げられ、バンコマイシンは、菌血症、特に、ブドウ球菌感染症における一次選択薬であり、臨床適用される。ペニシリンは、ペプチドグリカン架橋の形成を阻害することによって作用する。一般的なペニシリン類には、オキサシリン、アンピシリンおよびクロキサシリンが含まれる。リネゾリド（Ｚｙｖｏｘ）は、タンパク質合成阻害剤であり、オキサゾリジノンと呼ばれる抗菌薬のクラスに属する（Ｆｏｒｄ ＣＷら（１９９６）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈ ４０（６）：１５０８－１５１３；Ｓｗａｎｅｙ ＳＭら（１９９８）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈ ４２（１２）：３２５１－３２５５；米国特許第６，４４４，８１３号）。
ＬＹ１４６０３２とも表示されるダプトマイシン（Ｃｕｂｉｃｉｎ）は、１０炭素の親油性テイルに連結した１３員のアミノ酸ペプチドからなるリポペプチド抗菌剤である（Ｍｉａｏ Ｖら（２００５）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５１（Ｐｔ５）：１５０７－１５２３；Ｓｔｅｅｎｂｅｒｇｅｎ ＪＮら（２００５）Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５５（３）：２８３－２８８；および米国特許第５，９１２，２２６号に記載）。この構造は、細胞内のイオンを漏出させて、細胞膜を脱分極させ、高分子合成を阻害する、膜貫通チャネルの形成による細菌膜の破壊という新規作用機序をもたらす。ダプトマイシンの活性スペクトルは、いくつかの高度に耐性の種（メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン中間感性（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＶＩＳＡ）、バンコマイシン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＶＲＳＡ）、バンコマイシン耐性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ（ＶＲＥ））を含むグラム陽性細菌に限定されている。研究において、ダプトマイシンは、バンコマイシンよりも迅速な殺菌性であるようである。その承認されている投与レジメンは、毎日１回の４ｍｇ／ｋｇ ＩＶである。腎機能障害のときは用量の調整が必要である。ダプトマイシンの主要な毒性は、用量依存的な可逆性の筋痛および衰弱である。ダプトマイシンは、グラム陽性菌が原因の複雑性皮膚軟部組織感染症、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ菌血症およびＳ．ａｕｒｅｕｓ右心内膜炎の処置について承認されている。複雑性尿路感染症および心内膜炎／菌血症の処置におけるダプトマイシンの効能を評価する治験が進行中である。その承認されている投与レジメンは、毎日１回の４ｍｇ／ｋｇ ＩＶである。腎機能障害のときは用量の調整が必要である。ダプトマイシンの主要な毒性は、用量依存的な可逆性の筋痛および衰弱である。ダプトマイシンに対する耐性は、ダプトマイシンに曝した後に、インビトロとインビボの両方において遭遇する。耐性の機序（複数可）は、完全
に定義されていないが、おそらく、細胞膜の変化に関係する。阻害以下の薬物濃度でブドウ球菌および腸球菌を複数回継代すると、段階的な様式でＭＩＣが上昇した。ダプトマイシンは、肺サーファクタントに強く結合するので、肺炎の処置において効果的に使用できない（Ｂａｌｔｚ ＲＨ（２００９）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １３（２）：１４４－１５１）。
グラム陽性感染症を処置するために臨床で使用する際の広域スペクトルの抗生物質（特に、バンコマイシンなどの救命抗生物質を含む）は、胃腸の不調および下痢というそれらの副作用ならびに特に継続使用または長期間使用に関連した耐性の発生によって、使用および適用が制限されている。
現行の従来の抗菌剤に関連する不十分な点および問題から、特に耐性獲得の高リスクを伴わない、さらなる特異的な細菌用の薬剤、組み合わせおよび治療様式に対するニーズがなおも当該分野に存在することは明らかである。したがって、新しい抗菌アプローチ、特に、新しい様式を介して機能するか、または病原菌を効果的に殺滅する新しい組み合わせを提供する新しい抗菌アプローチに対する商業的ニーズが存在する。
本明細書中の参考文献の引用は、それらが本発明に対する従来技術であることを認めるものとして解釈されるものではない。
米国特許第５，９８５，２７１号明細書 米国特許第６，０１７，５２８号明細書 米国特許第６，０５６，９５５号明細書 米国特許第６，２４８，３２４号明細書 米国特許第６，２５４，８６６号明細書 米国特許第６，２６４，９４５号明細書 米国特許第７，４０２，３０９号明細書 米国特許第７，６３８，６００号明細書 国際公開第２００８／０１８８５４号 米国特許第７，５６９，２２３号明細書 米国特許第７，５８２２９１号明細書 米国特許出願公開第２００８／０２２１０３５号明細書 国際公開第２０１０／００２９５９号
発明の要旨
本願は、グラム陽性菌の迅速かつ有効な殺滅のためのバクテリオファージ溶解素（複数可）と抗生物質との組み合わせに関する。本発明によると、複数の細菌、特に、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの菌株を含むグラム陽性菌に対する広範な殺滅活性を示す溶解素ＰｌｙＳｓ２は、抗生物質（複数可）との併用において、注目すべき相乗作用を提供し、抗生物質（複数可）に対して必要とされる有効ＭＩＣ用量を有意に減少させ得る。
上記溶解素は、バンコマイシン、ダプトマイシン、リネゾリドまたはオキサシリンのうちの１つまたは複数を含むグラム陽性広域スペクトル抗生物質（ｂｒｏａｄ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｇｒａｍ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ）（関連または類似の抗生物質を含む）と併用され得る。特定の態様において、ＰｌｙＳｓ２溶解素は、ダプトマイシンと併用されることにより、ブドウ球菌、特に、ＭＲＳＡを含むグラム陽性菌に対する
相乗的な殺滅活性を提供する。特定の態様において、ＰｌｙＳｓ２溶解素は、バンコマイシンと併用されることにより、ＭＲＳＡを含む連鎖球菌に対する相乗的な殺滅活性を提供する。特定の態様において、ＰｌｙＳｓ２溶解素は、リネゾリドと併用されることにより、ＭＲＳＡを含む連鎖球菌に対する相乗的な殺滅活性を提供する。本発明のある態様において、ＰｌｙＳｓ２溶解素との併用は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓなどのグラム陽性菌を殺滅するために必要とされる抗生物質の用量を有意に減少させる。
本発明によると、異なるタイプまたはクラスの抗生物質を含み、特に、ダプトマイシン、バンコマイシン、リネゾリドまたはオキサシリンを含む抗生物質とＰｌｙＳｓ２溶解素との組み合わせは、いずれか単独よりも低用量または低ＭＩＣで、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含むグラム陽性菌を殺滅するのに有効である。本発明のある態様において、同時にまたは順番に、組み合わせてまたは別々に投与するのに適したものを含む、溶解素の、および抗生物質の低用量製剤が提供され、ここで、グラム陽性感染の有効な殺滅または除菌のための用量は、いずれかが単独で提供される場合に必要とされる用量よりも少ない。特に、抗生物質の低用量製剤は、同時にまたは順番に投与される溶解素、特に、ＰｌｙＳｓ２溶解素と併用して投与するために提供され、ここで、その抗生物質のグラム陽性感染の有効な殺滅または除菌のための用量は、溶解素との併用では、抗生物質が単独で提供されるかまたは投与される場合に必要とされる用量よりも少ない。
本発明のある態様において、ブドウ球菌に対して有効な溶解素は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含むグラム陽性菌を殺滅するために、ダプトマイシン、バンコマイシン、リネゾリドもしくはオキサシリンまたは関連抗生物質化合物のうちの１つまたは複数と、いずれかの単独よりも低用量または低ＭＩＣで、併用される。本発明のある態様において、ブドウ球菌に対して有効な溶解素は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含むグラム陽性菌を殺滅するために、ダプトマイシンまたは関連抗生物質化合物と、いずれかの単独よりも低用量または低ＭＩＣで、併用される。本発明のある態様において、ブドウ球菌に対して有効な溶解素は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含むグラム陽性菌を殺滅するために、バンコマイシンまたは関連抗生物質化合物のうちの１つまたは複数と、いずれかの単独よりも低用量または低ＭＩＣで、併用される。特定の態様において、抗生物質は、ＰｌｙＳｓ２溶解素またはそのバリアントと併用される。本発明のある態様において、溶解素とダプトマイシンとの併用は、ダプトマイシン活性を低下させるサーファクタントの影響を回避する。ＰｌｙＳｓ２溶解素などの溶解素との併用において、ダプトマイシンは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの殺滅および動物における菌血症の処置または回復において有効になる。したがって、本発明のある態様において、動物におけるＳ．ａｕｒｅｕｓ感染の除菌、阻害または処置のための方法が提供され、その方法は、ＰｌｙＳｓ２溶解素およびダプトマイシンを含む組成物またはそれらの組み合わせを動物に投与する工程を含む。
本発明によると、ＰｌｙＳｓ２および１つまたは複数の抗生物質を含む組成物および方法が、細菌の感染または集落形成の防止、破壊および処置のために提供される。その最も広範な態様において、本発明は、グラム陽性菌またはグラム陽性菌感染症の防止、回復または処置のための、抗生物質との併用、特に、ダプトマイシン、バンコマイシン、リネゾリドもしくはオキサシリンまたは関連抗生物質との併用における、複数の細菌、特に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａ菌株を含むグラム陽性菌に対して広範な殺滅活性を有する溶解素の使用および適用を提供する。したがって、本発明は、ＰｌｙＳｓ２溶解素と１つまたは複数の抗生物質との組み合わせの投与または接触による、細菌の処置、除菌および／または除染を企図し、ここで、１つまたは複数のグラム陽性菌、特に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａ菌のうちの１つまたは複数が、存在すると疑われるかまたは存在する。１つのそのような態様において、ＰｌｙＳｓ２溶解素は、ダプトマイシンと併用される。さらなる態様
において、ＰｌｙＳｓ２溶解素は、バンコマイシンと併用される。別の態様において、ＰｌｙＳｓ２溶解素は、リネゾリドと併用される。さらなる態様において、ＰｌｙＳｓ２溶解素は、オキサシリンと併用される。各場合において、抗生物質は、同じクラスもしくはファミリーのものまたは類似もしくは関連する構造を有するものを含む関連抗生物質を含むかまたは包含する。
本発明によると、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ菌に由来するバクテリオファージ溶解素が、本発明の方法および組成物において利用される。本発明において有用な溶解素ポリペプチド、特に、本明細書中および図２９（配列番号１）に提供されるようなＰｌｙＳｓ２溶解素（複数可）は、複数の細菌、特に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａ菌株を含むグラム陽性菌に対して広範な殺滅活性を示すという点において独特である。１つのそのような態様において、ＰｌｙＳｓ２溶解素は、本明細書中で実証されるように、抗生物質と併用して、特に、ダプトマイシン、バンコマイシン、オキサシリンまたはリネゾリドと併用して、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ菌株および菌を殺滅することができる。ＰｌｙＳｓ２は、抗生物質耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（例えば、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＶＲＳＡ）、ダプトマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＤＲＳＡ）およびリネゾリド耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＬＲＳＡ））に対して有効である。ＰｌｙＳｓ２は、バンコマイシン中間感性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＶＩＳＡ）に対して有効である。
本発明のある態様において、グラム陽性菌を殺滅する方法が提供され、その方法は、ＰｌｙＳｓ２溶解素と１つまたは複数の抗生物質との組み合わせとその細菌を接触させる工程を含み、その組み合わせは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含むグラム陽性菌を殺滅するのに有効な量の単離された溶解素ポリペプチドを含み、その単離された溶解素ポリペプチドは、ＰｌｙＳｓ２溶解素ポリペプチドまたはグラム陽性菌を殺滅するのに有効なそのバリアントを含み、ここで、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含むグラム陽性菌を抗生物質の存在下で殺滅するのに有効であるために必要とされるＰｌｙＳｓ２の量は、抗生物質の非存在下より有意に少ない。単離されたＰｌｙＳｓ２溶解素ポリペプチドは、図２９に提供されているアミノ酸配列（配列番号１）、または図２９のポリペプチド（配列番号１）に対して少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性もしくは９９％の同一性を有し、グラム陽性菌を殺滅するのに有効である、そのバリアントを含み得る。
本発明のある態様において、グラム陽性菌を殺滅する方法が提供され、その方法は、ＰｌｙＳｓ２溶解素と１つまたは複数の抗生物質との組み合わせとその細菌を接触させる工程を含み、その組み合わせは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含むグラム陽性菌を殺滅するのに有効な量の単離された溶解素ポリペプチドを含み、その単離された溶解素ポリペプチドは、ＰｌｙＳｓ２溶解素ポリペプチドまたはグラム陽性菌を殺滅するのに有効なそのバリアントを含み、ここで、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含むグラム陽性菌をＰｌｙＳｓ２の存在下で殺滅するのに有効であるために必要とされる抗生物質の量は、ＰｌｙＳｓ２の非存在下より有意に少ない。
本発明に従って実証されるように、特に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ菌およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ菌に対する活性を有する溶解素（特に、ＰｌｙＳｓ２を含む）を含む本明細書中に提供されるような溶解素は、抗生物質、特に、異なるクラスおよび抗菌機序の抗生物質と相乗的に作用する。したがって、本発明によると、ＰｌｙＳｓ２溶解素またはその活性なバリアントは、細胞壁合成に影響する抗生物質（例えば、グリコペプチド類、ペプチドグリカンの形成を阻害するペニシリン類、タンパク質合成阻害剤およびリ
ポペプチド系抗生物質）の各々を含む抗生物質との併用において活性の増大を示す。各場合において、溶解素と抗生物質の両方の抗菌活性は、併用において有意に高まる。グリコペプチド系抗生物質との併用は、バンコマイシンによって証明され、ペニシリンクラスとの併用は、オキサシリンによって証明され、オキサゾリジノンのクラスを含むタンパク質合成阻害剤の抗生物質との併用は、リネゾリドによって証明され、リポペプチド系抗生物質との併用は、ダプトマイシンによって証明される。本発明は、実証された抗生物質ならびにそれらのクラスの代替メンバーまたは関連抗生物質との併用およびそれらによる活性の増大を含み、企図する。
したがって、本発明のある態様において、グラム陽性菌を殺滅する方法が提供され、その方法は、溶解素とダプトマイシンまたは関連抗生物質との組み合わせとその細菌を接触させる工程を含み、その組み合わせは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含むグラム陽性菌を殺滅するのに有効な量の単離された溶解素ポリペプチドを含み、ここで、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含むグラム陽性菌を溶解素の存在下で殺滅するのに有効であるために必要とされるダプトマイシンまたは関連抗生物質の量は、溶解素の非存在下より有意に少ない。
さらなる態様において、グラム陽性菌を殺滅する方法が提供され、その方法は、溶解素とバンコマイシンまたは関連抗生物質との組み合わせとその細菌を接触させる工程を含み、その組み合わせは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含むグラム陽性菌を殺滅するのに有効な量の単離された溶解素ポリペプチドを含み、ここで、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含むグラム陽性菌を溶解素の存在下で殺滅するのに有効であるために必要とされるバンコマイシンまたは関連抗生物質の量は、溶解素の非存在下より有意に少ない。
さらなる態様において、グラム陽性菌を殺滅する方法が提供され、その方法は、溶解素とオキサシリンまたは関連抗生物質との組み合わせとその細菌を接触させる工程を含み、その組み合わせは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含むグラム陽性菌を殺滅するのに有効な量の単離された溶解素ポリペプチドを含み、ここで、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含むグラム陽性菌を溶解素の存在下で殺滅するのに有効であるために必要とされるオキサシリンまたは関連抗生物質の量は、溶解素の非存在下より有意に少ない。
さらなる態様において、グラム陽性菌を殺滅する方法が提供され、その方法は、溶解素とリネゾリドまたは関連抗生物質との組み合わせとその細菌を接触させる工程を含み、その組み合わせは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含むグラム陽性菌を殺滅するのに有効な量の単離された溶解素ポリペプチドを含み、ここで、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含むグラム陽性菌を溶解素の存在下で殺滅するのに有効であるために必要とされるリネゾリドまたは関連抗生物質の量は、溶解素の非存在下より有意に少ない。
本発明は、抗生物質耐性グラム陽性菌を殺滅する方法も提供し、その方法は、ブドウ球菌を殺滅することができる溶解素とその抗生物質耐性菌を接触させる工程を含む。１つのそのような態様において、その抗生物質耐性細菌を、その細菌が感性である抗生物質と併用して、またはその細菌が耐性である抗生物質と併用して、溶解素、特に、ＰｌｙＳｓ２と接触させる。その方法の１つのそのような態様において、溶解素は、ＰＬｙＳｓ２である。１つのそのような態様において、溶解素は、図２９に提供されているアミノ酸配列（配列番号１）、または図２９のポリペプチド（配列番号１）に対して少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性もしくは９９％の同一性を有し、グラム陽性菌、特に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを殺滅するのに有効である、そのバリアントを含むポリペプチドである。
本発明は、ダプトマイシン耐性グラム陽性菌を殺滅する上記のような方法を提供し、その方法は、ブドウ球菌を殺滅することができる溶解素とそのダプトマイシン耐性菌とを接
触させる工程を含む。そのような方法は、溶解素とダプトマイシンとの、および／または別の抗生物質との併用を含み得る。その方法の１つのそのような態様において、溶解素は、本明細書中に提供されるようなＰＬｙＳｓ２である。
本発明は、バンコマイシン耐性グラム陽性菌を殺滅する上記のような方法をさらに提供し、その方法は、ブドウ球菌を殺滅することができる溶解素とそのバンコマイシン耐性菌とを接触させる工程を含む。そのような方法は、溶解素とバンコマイシンとの、および／または別の抗生物質との併用を含み得る。その方法の１つのそのような態様において、溶解素は、ＰＬｙＳｓ２である。
上記方法のある態様において、それらの方法は、特に、ヒトによるまたはヒトにおける使用が意図された、溶液、材料またはデバイスを滅菌するためまたは除染するために、インビトロで、エキソビボで、またはインビボにおけるデバイスの埋め込みもしくは留置とともに、行われる。
さらなる態様において、グラム陽性菌を殺滅または除菌する際の抗生物質の有効性を高める方法が提供され、その方法は、溶解素、特に、ＰｌｙＳｓ２と１つまたは複数の抗生物質との組み合わせとその細菌とを接触させる工程を含み、ここで、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含むグラム陽性菌を溶解素の存在下で殺滅するかまたは除菌するのに有効であるために必要とされる抗生物質の量は、溶解素の非存在下より有意に少ない。１つのそのような態様において、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｐｎｅｕｍｏｎｉａに対するダプトマイシンまたは関連抗生物質の有効性を高めるためまたは促進するための方法が提供され、その方法は、溶解素、特に、ＰｌｙＳｓ２をダプトマイシンと併用して投与する工程を含む。特定のそのような方法または態様において、ダプトマイシンは、溶解素、特に、ＰｌｙＳｓ２の投与と併用してまたはその投与に続いて、溶解素、特に、ＰｌｙＳｓ２の非存在下では無効であるダプトマイシン用量で投与されるとき、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｐｎｅｕｍｏｎｉａに対して有効である。
本発明は、グラム陽性菌の集団を減少させるための方法を提供し、その方法は、単独ではグラム陽性菌を殺滅するのに無効な量の単離された溶解素ポリペプチドおよび単独ではグラム陽性菌を殺滅するのに無効な量の抗生物質を含む組成物とその細菌とを接触させる工程を含む。その抗生物質は、グリコペプチド、ペニシリン、タンパク質合成阻害剤、オキサゾリジノン（ｏｚａｌｉｄｉｎｏｎｅ）またはリポペプチドであり得る。そのような方法は、バンコマイシン、ダプトマイシン、リネゾリドおよびオキサシリンから選択される抗生物質を含み得る。ある態様において、単離された溶解素ポリペプチドは、図２９のアミノ酸配列すなわち配列番号１）、または図２９のポリペプチドすなわち配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有し、グラム陽性菌を殺滅するのに有効である、そのバリアントを含む。
本発明は、グラム陽性菌の集団を減少させるための方法を提供し、その方法は、単独ではグラム陽性菌を殺滅するのに無効な量の単離された溶解素ポリペプチドおよび単独ではグラム陽性菌を殺滅するのに無効な量のダプトマイシンを含む組成物とその細菌を接触させる工程を含む。ある態様において、単離された溶解素ポリペプチドは、図２９のアミノ酸配列（配列番号１）、または図２９のポリペプチド（配列番号１）に対して少なくとも８０％の同一性を有し、グラム陽性菌を殺滅するのに有効である、そのバリアントを含む。
そのような上記の任意の１つまたは複数の方法では、感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ）であるか、殺滅されるか、分散されるか、または処置される細菌は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｚｏｏ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ＧＢＳ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＧＡＳ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｇ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａから選択され得る。
本発明のいずれかの方法によると、感受性細菌は、抗生物質耐性菌であり得る。その細菌は、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン中間感性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＶＩＳＡ）、バンコマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＶＲＳＡ）、ダプトマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＤＲＳＡ）またはリネゾリド耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＬＲＳＡ）であり得る。その感受性細菌は、特にヒトに対する、臨床的に関与性の細菌または病原菌であり得る。上記方法（複数可）のある態様において、溶解素ポリペプチド（複数可）は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａ菌株を殺滅するのに有効である。
本明細書中に提供される方法および組成物のさらなる態様または実施形態において、別の異なるブドウ球菌特異的溶解素が、本明細書中において単独でまたは本明細書中に提供されるおよび記載されるようなＰｌｙＳｓ２溶解素と併用して使用される。本明細書中に提供される方法および組成物のそのような１つの態様または実施形態において、ブドウ球菌特異的溶解素ＣｌｙＳが、本明細書中において単独でまたは本明細書中に提供されるおよび記載されるようなＰｌｙＳｓ２溶解素と併用して使用される。
本発明は、抗生物質の活性を高めるためまたは促進するための方法を提供し、その方法は、溶解素、特に、ＰｌｙＳｓ２溶解素と１つまたは複数の抗生物質との組み合わせを一緒にまたは順番に投与する工程を含む。そのある態様において、抗生物質の活性は、少なくとも１０倍、少なくとも１６倍、少なくとも２０倍、少なくとも２４倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも１００倍、１０倍超、２０倍超、５０倍超、１００倍超、高められるかまたは促進される。本発明は、溶解素の活性、特に、ＰｌｙＳｓ２溶解素の活性を高めるためまたは促進するための方法を提供し、その方法は、溶解素、特に、ＰｌｙＳｓ２溶解素と１つまたは複数の抗生物質との組み合わせを一緒にまたは順番に投与する工程を含む。そのある態様において、溶解素、特に、ＰｌｙＳｓ２の活性は、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、最大１０倍、最大１６倍、最大２０倍高められる。
本発明は、サーファクタント様活性を有する生物学的流体中のグラム陽性菌に対する抗生物質の活性を増強する方法を含み、その方法は、図２９に提供されているアミノ酸配列（配列番号１）、または図２９のポリペプチド（配列番号１）に対して少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性もしくは９９％の同一性を有し、グラム陽性菌を殺滅するのに有効である、そのバリアントを含むＰｌｙＳｓ２溶解素と併用して抗生物質を投与する工程を含み、ここで、その抗生物質は、その抗生物質がＰｌｙＳｓ２の非存在下では無効である用量でも、ＰｌｙＳｓ２との併用では有効である。その方法のある態様において、抗生物質は、ダプトマイシンまたは関連化合物である。ある態様において、細菌は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである。
他の目的および利点は、以下の例証的な図面を参照して進められる以下の記載の精査から当業者に明らかになる。
図１は、ダプトマイシン、バンコマイシンまたはＰｌｙＳｓ２溶解素が加えられた状態での様々なＭＲＳＡ菌株の時間殺菌曲線（ｔｉｍｅ ｋｉｌｌ ｃｕｒｖｅ）を示している。
図２は、ダプトマイシン、バンコマイシン、オキサシリンまたはＰｌｙＳｓ２溶解素が加えられた状態での様々なＭＳＳＡ菌株の時間殺菌曲線を示している。
図３は、ダプトマイシン、バンコマイシンまたはＰｌｙＳｓ２溶解素が加えられた状態での様々なＭＲＳＡおよびＭＳＳＡ菌株の時間殺菌曲線のまとめのプロットを提供している。
図４Ａ～４Ｆは、インビトロのＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞におけるＰｌｙＳＳ２および抗生物質の複合の（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）時間殺菌曲線を提供している。（Ａ、Ｂ）それぞれ２０個のＭＳＳＡおよび４２個のＭＲＳＡ菌株のセットに対する、オキサシリン（ＯＸＡ）、バンコマイシン（ＶＡＮ）およびダプトマイシン（ＤＡＰ）と比較した、ＰｌｙＳＳ２の複合の時間殺菌曲線。各個別の解析において、薬物濃度は、菌株特異的な１×ＭＩＣ値に対応する。各時点についての平均値（±平均の標準誤差）を示している。（Ｃ、Ｄ）それぞれ１５個の最近のＭＳＳＡおよびＭＲＳＡ臨床分離菌のセットに対するＰｌｙＳＳ２の滴定解析。各個別の解析において、ＰｌｙＳＳ２濃度は、菌株特異的なＭＩＣ値に対応する。４×、１×および０．２５×ＭＩＣ濃度を使用した。（Ｅ，Ｆ）８ｇ／ｍＬ ＰｌｙＳＳ２での３秒間の処置の前後のＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞（菌株ＭＷ２）の透過型電子顕微鏡像（３３００×倍率）。スケールバーは、２μＭに対応する。溶解によって、濃く染色された細胞質成分が失われる。
図５は、記述されているＭＩＣ未満用量でのＰｌｙＳｓ２およびバンコマイシンの単独または併用で処理されたＭＲＳＡ菌株についての時間殺菌曲線を示している。
図６は、記述されているＭＩＣ未満用量でのＰｌｙＳｓ２およびダプトマイシンの単独または併用で処理されたＭＲＳＡ菌株についての時間殺菌曲線を示している。
図７は、記述されているＭＩＣまたは用量でダプトマイシンおよびＰｌｙＳｓ２溶解素の単独が、または併用で加えられた状態でのＭＲＳＡ菌株６５０（Ｏ５２Ｃ Ｔｏｍａｓｚ）についての時間殺菌曲線を示している。
図８Ａ～８Ｆは、ＰｌｙＳｓ２が、インビトロにおいて複数の菌株にわたって抗生物質と相乗作用を示すことを示しており、ＰｌｙＳｓ２およびオキサシリンで処理されたＭＳＳＡ菌株（Ａ，Ｂ）；Ｐｌｙｓｓ２およびバンコマイシンで処理されたＭＲＳＡ菌株（Ｃ，Ｄ）、ＰｌｙＳｓ２およびダプトマイシンで処理されたＭＲＳＡ菌株（Ｅ，Ｆ）についての時間－殺菌の結果を示している。パネルＡ、ＣおよびＥでは、それぞれ３つの個別の菌株、ＭＳＳＡ菌株ＪＭＩ７１４０、ＭＲＳＡ菌株ＪＭＩ３３４０およびＭＲＳＡ菌株ＪＭＩ３３４５についての時間－殺菌データが示されている。（Ａ）増殖、増殖コントロール（ＰｌｙＳｓ２も抗生物質もなし）、ＰｌｙＳｓ２ ０．１３×ＭＩＣ、オキサシリン（ＯＸＡ）０．５×ＭＩＣ、示されている薬物濃度のＰｌｙＳＳ２＋ＯＸＡ併用に対する値が示されている。（Ｃ）増殖、増殖コントロール（ＰｌｙＳｓ２も抗生物質もなし）、ＰｌｙＳｓ２ ０．１３×ＭＩＣ、バンコマイシン（ＶＡＮ）０．５×ＭＩＣ、示されている薬物濃度のＰｌｙＳＳ２＋ＶＡＮ併用に対する値が示されている。（Ｅ）増殖、増殖コントロール（ＰｌｙＳｓ２も抗生物質もなし）、ＰｌｙＳｓ２ ０．２５×ＭＩＣ、ダプトマイシン（ＤＡＰ）０．５×ＭＩＣ、示されている薬物濃度のＰｌｙＳＳ２＋ＤＡＰ併用に対する値が示されている。パネルＢ、ＤおよびＦでは、菌株のコレクションに対する６時間にわたる併用処理の培養物と無処理の増殖コントロールとの間のｃｆｕ／ｍｌのｌｏｇ変化が、示されている。水平の点線は、時間－殺菌の相乗作用をスコア付けするために必要な２ｌｏｇカットオフを示している。薬物の組み合わせで６時間処理された培養物に対するｌｏｇ１０コロニー数の減少（またはΔＬｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬ）が、最も活性な単剤で処理された培養物と比較して示されている。相乗作用は、ＣＬＳＩによってＣＦＵ／ｍＬの≧２ｌｏｇ１０減少と定義されており、破線によって図中に表示されている。略語一覧：ΔＬｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬ＝ｌｏｇ１０コロニー形成単位の変化。 図８Ａ～８Ｆは、ＰｌｙＳｓ２が、インビトロにおいて複数の菌株にわたって抗生物質と相乗作用を示すことを示しており、ＰｌｙＳｓ２およびオキサシリンで処理されたＭＳＳＡ菌株（Ａ，Ｂ）；Ｐｌｙｓｓ２およびバンコマイシンで処理されたＭＲＳＡ菌株（Ｃ，Ｄ）、ＰｌｙＳｓ２およびダプトマイシンで処理されたＭＲＳＡ菌株（Ｅ，Ｆ）についての時間－殺菌の結果を示している。パネルＡ、ＣおよびＥでは、それぞれ３つの個別の菌株、ＭＳＳＡ菌株ＪＭＩ７１４０、ＭＲＳＡ菌株ＪＭＩ３３４０およびＭＲＳＡ菌株ＪＭＩ３３４５についての時間－殺菌データが示されている。（Ａ）増殖、増殖コントロール（ＰｌｙＳｓ２も抗生物質もなし）、ＰｌｙＳｓ２ ０．１３×ＭＩＣ、オキサシリン（ＯＸＡ）０．５×ＭＩＣ、示されている薬物濃度のＰｌｙＳＳ２＋ＯＸＡ併用に対する値が示されている。（Ｃ）増殖、増殖コントロール（ＰｌｙＳｓ２も抗生物質もなし）、ＰｌｙＳｓ２ ０．１３×ＭＩＣ、バンコマイシン（ＶＡＮ）０．５×ＭＩＣ、示されている薬物濃度のＰｌｙＳＳ２＋ＶＡＮ併用に対する値が示されている。（Ｅ）増殖、増殖コントロール（ＰｌｙＳｓ２も抗生物質もなし）、ＰｌｙＳｓ２ ０．２５×ＭＩＣ、ダプトマイシン（ＤＡＰ）０．５×ＭＩＣ、示されている薬物濃度のＰｌｙＳＳ２＋ＤＡＰ併用に対する値が示されている。パネルＢ、ＤおよびＦでは、菌株のコレクションに対する６時間にわたる併用処理の培養物と無処理の増殖コントロールとの間のｃｆｕ／ｍｌのｌｏｇ変化が、示されている。水平の点線は、時間－殺菌の相乗作用をスコア付けするために必要な２ｌｏｇカットオフを示している。薬物の組み合わせで６時間処理された培養物に対するｌｏｇ１０コロニー数の減少（またはΔＬｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬ）が、最も活性な単剤で処理された培養物と比較して示されている。相乗作用は、ＣＬＳＩによってＣＦＵ／ｍＬの≧２ｌｏｇ１０減少と定義されており、破線によって図中に表示されている。略語一覧：ΔＬｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬ＝ｌｏｇ１０コロニー形成単位の変化。 図８Ａ～８Ｆは、ＰｌｙＳｓ２が、インビトロにおいて複数の菌株にわたって抗生物質と相乗作用を示すことを示しており、ＰｌｙＳｓ２およびオキサシリンで処理されたＭＳＳＡ菌株（Ａ，Ｂ）；Ｐｌｙｓｓ２およびバンコマイシンで処理されたＭＲＳＡ菌株（Ｃ，Ｄ）、ＰｌｙＳｓ２およびダプトマイシンで処理されたＭＲＳＡ菌株（Ｅ，Ｆ）についての時間－殺菌の結果を示している。パネルＡ、ＣおよびＥでは、それぞれ３つの個別の菌株、ＭＳＳＡ菌株ＪＭＩ７１４０、ＭＲＳＡ菌株ＪＭＩ３３４０およびＭＲＳＡ菌株ＪＭＩ３３４５についての時間－殺菌データが示されている。（Ａ）増殖、増殖コントロール（ＰｌｙＳｓ２も抗生物質もなし）、ＰｌｙＳｓ２ ０．１３×ＭＩＣ、オキサシリン（ＯＸＡ）０．５×ＭＩＣ、示されている薬物濃度のＰｌｙＳＳ２＋ＯＸＡ併用に対する値が示されている。（Ｃ）増殖、増殖コントロール（ＰｌｙＳｓ２も抗生物質もなし）、ＰｌｙＳｓ２ ０．１３×ＭＩＣ、バンコマイシン（ＶＡＮ）０．５×ＭＩＣ、示されている薬物濃度のＰｌｙＳＳ２＋ＶＡＮ併用に対する値が示されている。（Ｅ）増殖、増殖コントロール（ＰｌｙＳｓ２も抗生物質もなし）、ＰｌｙＳｓ２ ０．２５×ＭＩＣ、ダプトマイシン（ＤＡＰ）０．５×ＭＩＣ、示されている薬物濃度のＰｌｙＳＳ２＋ＤＡＰ併用に対する値が示されている。パネルＢ、ＤおよびＦでは、菌株のコレクションに対する６時間にわたる併用処理の培養物と無処理の増殖コントロールとの間のｃｆｕ／ｍｌのｌｏｇ変化が、示されている。水平の点線は、時間－殺菌の相乗作用をスコア付けするために必要な２ｌｏｇカットオフを示している。薬物の組み合わせで６時間処理された培養物に対するｌｏｇ１０コロニー数の減少（またはΔＬｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬ）が、最も活性な単剤で処理された培養物と比較して示されている。相乗作用は、ＣＬＳＩによってＣＦＵ／ｍＬの≧２ｌｏｇ１０減少と定義されており、破線によって図中に表示されている。略語一覧：ΔＬｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬ＝ｌｏｇ１０コロニー形成単位の変化。 図８Ａ～８Ｆは、ＰｌｙＳｓ２が、インビトロにおいて複数の菌株にわたって抗生物質と相乗作用を示すことを示しており、ＰｌｙＳｓ２およびオキサシリンで処理されたＭＳＳＡ菌株（Ａ，Ｂ）；Ｐｌｙｓｓ２およびバンコマイシンで処理されたＭＲＳＡ菌株（Ｃ，Ｄ）、ＰｌｙＳｓ２およびダプトマイシンで処理されたＭＲＳＡ菌株（Ｅ，Ｆ）についての時間－殺菌の結果を示している。パネルＡ、ＣおよびＥでは、それぞれ３つの個別の菌株、ＭＳＳＡ菌株ＪＭＩ７１４０、ＭＲＳＡ菌株ＪＭＩ３３４０およびＭＲＳＡ菌株ＪＭＩ３３４５についての時間－殺菌データが示されている。（Ａ）増殖、増殖コントロール（ＰｌｙＳｓ２も抗生物質もなし）、ＰｌｙＳｓ２ ０．１３×ＭＩＣ、オキサシリン（ＯＸＡ）０．５×ＭＩＣ、示されている薬物濃度のＰｌｙＳＳ２＋ＯＸＡ併用に対する値が示されている。（Ｃ）増殖、増殖コントロール（ＰｌｙＳｓ２も抗生物質もなし）、ＰｌｙＳｓ２ ０．１３×ＭＩＣ、バンコマイシン（ＶＡＮ）０．５×ＭＩＣ、示されている薬物濃度のＰｌｙＳＳ２＋ＶＡＮ併用に対する値が示されている。（Ｅ）増殖、増殖コントロール（ＰｌｙＳｓ２も抗生物質もなし）、ＰｌｙＳｓ２ ０．２５×ＭＩＣ、ダプトマイシン（ＤＡＰ）０．５×ＭＩＣ、示されている薬物濃度のＰｌｙＳＳ２＋ＤＡＰ併用に対する値が示されている。パネルＢ、ＤおよびＦでは、菌株のコレクションに対する６時間にわたる併用処理の培養物と無処理の増殖コントロールとの間のｃｆｕ／ｍｌのｌｏｇ変化が、示されている。水平の点線は、時間－殺菌の相乗作用をスコア付けするために必要な２ｌｏｇカットオフを示している。薬物の組み合わせで６時間処理された培養物に対するｌｏｇ１０コロニー数の減少（またはΔＬｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬ）が、最も活性な単剤で処理された培養物と比較して示されている。相乗作用は、ＣＬＳＩによってＣＦＵ／ｍＬの≧２ｌｏｇ１０減少と定義されており、破線によって図中に表示されている。略語一覧：ΔＬｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬ＝ｌｏｇ１０コロニー形成単位の変化。 図８Ａ～８Ｆは、ＰｌｙＳｓ２が、インビトロにおいて複数の菌株にわたって抗生物質と相乗作用を示すことを示しており、ＰｌｙＳｓ２およびオキサシリンで処理されたＭＳＳＡ菌株（Ａ，Ｂ）；Ｐｌｙｓｓ２およびバンコマイシンで処理されたＭＲＳＡ菌株（Ｃ，Ｄ）、ＰｌｙＳｓ２およびダプトマイシンで処理されたＭＲＳＡ菌株（Ｅ，Ｆ）についての時間－殺菌の結果を示している。パネルＡ、ＣおよびＥでは、それぞれ３つの個別の菌株、ＭＳＳＡ菌株ＪＭＩ７１４０、ＭＲＳＡ菌株ＪＭＩ３３４０およびＭＲＳＡ菌株ＪＭＩ３３４５についての時間－殺菌データが示されている。（Ａ）増殖、増殖コントロール（ＰｌｙＳｓ２も抗生物質もなし）、ＰｌｙＳｓ２ ０．１３×ＭＩＣ、オキサシリン（ＯＸＡ）０．５×ＭＩＣ、示されている薬物濃度のＰｌｙＳＳ２＋ＯＸＡ併用に対する値が示されている。（Ｃ）増殖、増殖コントロール（ＰｌｙＳｓ２も抗生物質もなし）、ＰｌｙＳｓ２ ０．１３×ＭＩＣ、バンコマイシン（ＶＡＮ）０．５×ＭＩＣ、示されている薬物濃度のＰｌｙＳＳ２＋ＶＡＮ併用に対する値が示されている。（Ｅ）増殖、増殖コントロール（ＰｌｙＳｓ２も抗生物質もなし）、ＰｌｙＳｓ２ ０．２５×ＭＩＣ、ダプトマイシン（ＤＡＰ）０．５×ＭＩＣ、示されている薬物濃度のＰｌｙＳＳ２＋ＤＡＰ併用に対する値が示されている。パネルＢ、ＤおよびＦでは、菌株のコレクションに対する６時間にわたる併用処理の培養物と無処理の増殖コントロールとの間のｃｆｕ／ｍｌのｌｏｇ変化が、示されている。水平の点線は、時間－殺菌の相乗作用をスコア付けするために必要な２ｌｏｇカットオフを示している。薬物の組み合わせで６時間処理された培養物に対するｌｏｇ１０コロニー数の減少（またはΔＬｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬ）が、最も活性な単剤で処理された培養物と比較して示されている。相乗作用は、ＣＬＳＩによってＣＦＵ／ｍＬの≧２ｌｏｇ１０減少と定義されており、破線によって図中に表示されている。略語一覧：ΔＬｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬ＝ｌｏｇ１０コロニー形成単位の変化。 図８Ａ～８Ｆは、ＰｌｙＳｓ２が、インビトロにおいて複数の菌株にわたって抗生物質と相乗作用を示すことを示しており、ＰｌｙＳｓ２およびオキサシリンで処理されたＭＳＳＡ菌株（Ａ，Ｂ）；Ｐｌｙｓｓ２およびバンコマイシンで処理されたＭＲＳＡ菌株（Ｃ，Ｄ）、ＰｌｙＳｓ２およびダプトマイシンで処理されたＭＲＳＡ菌株（Ｅ，Ｆ）についての時間－殺菌の結果を示している。パネルＡ、ＣおよびＥでは、それぞれ３つの個別の菌株、ＭＳＳＡ菌株ＪＭＩ７１４０、ＭＲＳＡ菌株ＪＭＩ３３４０およびＭＲＳＡ菌株ＪＭＩ３３４５についての時間－殺菌データが示されている。（Ａ）増殖、増殖コントロール（ＰｌｙＳｓ２も抗生物質もなし）、ＰｌｙＳｓ２ ０．１３×ＭＩＣ、オキサシリン（ＯＸＡ）０．５×ＭＩＣ、示されている薬物濃度のＰｌｙＳＳ２＋ＯＸＡ併用に対する値が示されている。（Ｃ）増殖、増殖コントロール（ＰｌｙＳｓ２も抗生物質もなし）、ＰｌｙＳｓ２ ０．１３×ＭＩＣ、バンコマイシン（ＶＡＮ）０．５×ＭＩＣ、示されている薬物濃度のＰｌｙＳＳ２＋ＶＡＮ併用に対する値が示されている。（Ｅ）増殖、増殖コントロール（ＰｌｙＳｓ２も抗生物質もなし）、ＰｌｙＳｓ２ ０．２５×ＭＩＣ、ダプトマイシン（ＤＡＰ）０．５×ＭＩＣ、示されている薬物濃度のＰｌｙＳＳ２＋ＤＡＰ併用に対する値が示されている。パネルＢ、ＤおよびＦでは、菌株のコレクションに対する６時間にわたる併用処理の培養物と無処理の増殖コントロールとの間のｃｆｕ／ｍｌのｌｏｇ変化が、示されている。水平の点線は、時間－殺菌の相乗作用をスコア付けするために必要な２ｌｏｇカットオフを示している。薬物の組み合わせで６時間処理された培養物に対するｌｏｇ１０コロニー数の減少（またはΔＬｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬ）が、最も活性な単剤で処理された培養物と比較して示されている。相乗作用は、ＣＬＳＩによってＣＦＵ／ｍＬの≧２ｌｏｇ１０減少と定義されており、破線によって図中に表示されている。略語一覧：ΔＬｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬ＝ｌｏｇ１０コロニー形成単位の変化。
図９は、還元剤（ＢＭＥ）の存在下のＭＲＳＡ菌株５５３に対する、記述されている濃度におけるダプトマイシンとＰｌｙＳｓ２とのペア（ｐａｉｒｉｎｇ）の用量希釈のパネルを提供している。
図１０は、還元剤（ＢＭＥ）の非存在下のＭＲＳＡ菌株５５３に対する、記述されている濃度におけるダプトマイシンとＰｌｙＳｓ２とのペアの用量希釈のパネルを提供している。
図１１は、ＢＭＥの存在下のＭＲＳＡ菌株２２３に対する、記述されている濃度におけるダプトマイシンとＰｌｙＳｓ２とのペアの用量希釈のパネルを提供している。
図１２は、ＢＭＥの非存在下のＭＲＳＡ菌株２２３に対する、記述されている濃度におけるダプトマイシンとＰｌｙＳｓ２とのペアの用量希釈のパネルを提供している。
図１３は、ＢＭＥの存在下および非存在下のＭＲＳＡ菌株２７０に対する、記述されている濃度におけるダプトマイシンとＰｌｙＳｓ２とのペアの用量希釈のパネルを提供している。
図１４は、ＢＭＥの存在下および非存在下のＭＲＳＡ菌株２６９に対する、記述されている濃度におけるダプトマイシンとＰｌｙＳｓ２とのペアの用量希釈のパネルを提供している。
図１５は、ＢＭＥの存在下および非存在下のＭＲＳＡ菌株２４１に対する、記述されている濃度におけるダプトマイシンとＰｌｙＳｓ２とのペアの用量希釈のパネルを提供している。
図１６は、ＢＭＥの存在下および非存在下のＭＲＳＡ菌株２６３に対する、記述されている濃度におけるダプトマイシンとＰｌｙＳｓ２とのペアの用量希釈のパネルを提供している。
図１７は、ＢＭＥの存在下および非存在下のＭＲＳＡ菌株６５０に対する、記述されている濃度におけるダプトマイシンとＰｌｙＳｓ２とのペアの用量希釈のパネルを提供している。
図１８は、ＢＭＥの存在下および非存在下のＭＲＳＡ菌株８２８に対する、記述されている濃度におけるダプトマイシンとＰｌｙＳｓ２とのペアの用量希釈のパネルを提供している。
図１９は、溶解素ＰｌｙＳｓ２のＦＩＣ値 対 抗生物質のＦＩＣ値を示している代表的なアイソボログラムを示している。ＰｌｙＳｓ２ 対 抗生物質オキサシリン、バンコマイシンおよびダプトマイシンが、記述されているとおりのＭＳＳＡ菌株およびＭＲＳＡ菌株に対して示されている。オキサシリンおよびＰｌｙＳｓ２を、ＭＳＳＡ菌株ＪＭＩ３３６１１に対して評価している。ＰｌｙＳｓ２およびバンコマイシンを、ＭＳＳＡ菌株ＪＭＩ９３６５およびＭＲＳＡ菌株ＪＭＩ６４５６に対して評価している。ダプトマイシンおよびＰｌｙＳｓ２を、ＭＳＳＡ菌株ＪＭＩ３３６１１およびＭＲＳＡ ＪＭＩ３３４５に対して評価している。
図２０Ａおよび２０Ｂは、ＭＩＣ未満の量のＰｌｙＳｓ２の非存在下および存在下における、ＢＯＤＩＰＹ標識されたダプトマイシン（Ａ）およびバンコマイシン（Ｂ）によるＳ．ａｕｒｅｕｓ染色の時間経過を提供している。
図２１は、様々な量の界面活性物質（１．２５～１５％界面活性物質）の存在下においてＰｌｙＳｓ２またはダプトマイシンで処理されたＭＲＳＡ菌株ＭＷ２およびＭＳＳＡ菌株ＡＴＣＣ２９２１３に対するＭＩＣ値の倍率変化を示している。
図２２は、１５％界面活性物質（Ｓｕｒｖａｎｔａ）の存在下のＭＲＳＡ菌株２６９に対する、記述されている濃度におけるダプトマイシンとＰｌｙＳｓ２とのペアの用量希釈のパネルを提供している。
図２３は、１．１～３．１×１０６ＣＦＵの細菌接種強度（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｓｔｒｅｎｇｔｈ）を有するＭＲＳＡ菌株２６９（ＭＷ２）をチャレンジして、ダプトマイシンまたはＰｌｙＳｓ２の単独または併用で処置した、いくつかの実験におけるマウス（５０匹）の％生存をまとめたグラフを提供している。
図２４は、ＭＲＳＡ菌株２２０を２．６５×１０６ＣＦＵでチャレンジし、示されている用量のダプトマイシンまたはＰｌｙＳｓ２の単独または併用で処置したマウスの％生存を示している。
図２５は、ＭＲＳＡ菌株８３３を１．４×１０６ＣＦＵでチャレンジし、示されている用量のダプトマイシンまたはＰｌｙＳｓ２の単独または併用で処置したマウスの％生存を示している。
図２６は、ＭＲＳＡ菌株８３３を２．０×１０６ＣＦＵでチャレンジし、示されている用量のダプトマイシンまたはＰｌｙＳｓ２の単独または併用で処置したマウスの％生存を示している。
図２７Ａ～２７Ｆは、菌血症のマウスモデルにおける併用療法の生存曲線を単独療法と比較して示している。マウスを、時間０において、７．５×１０６ｃｆｕ／マウスｉ．ｐ．（低チャレンジモデル－パネルａ）または１０９ｃｆｕ／マウスｉ．ｐ．（高チャレンジモデル－パネルｂ～ｆ）にチャレンジし、抗生物質、ＰｌｙＳｓ２、ＰｌｙＳｓ２と抗生物質との組み合わせ、またはコントロールで処置し、得られた生存データをカプラン・マイヤー形式で示している。最初の２４時間にわたって複数回用量として投与されたバンコマイシン（ＢＩＤ，パネルｅ）およびオキサシリン（ＱＩＤ，パネルｆ）を除く、すべての用量を単回のボーラス用量として投与した。投与経路は、ＰｌｙＳｓ２（ｉ．ｐ．）、ダプトマイシンおよびバンコマイシン（皮下）およびオキサシリン（筋肉内）だった。抗生物質単独に対する併用についてＰ値を計算した。（Ａ）２ｍｇ／ｋｇのダプトマイシンおよび１．２５ｍｇ／ｋｇのＰｌｙＳｓ２とともにＭＲＳＡ菌株ＭＷ２を使用した低チャレンジモデル。接種の４時間後に投与、ｎ＝３０，Ｐ＜０．０００１。（Ｂ）５０ｍｇ／ｋｇのダプトマイシンおよび５．２５ｍｇ／ｋｇのＰｌｙＳｓ２とともにＭＲＳＡ菌株ＭＷ２を使用した高チャレンジモデル。接種の２時間後に投与、ｎ＝４５，Ｐ＜０．０００１。（Ｃ）ＭＲＳＡ菌株７３８を使用してＢと同じ、ｎ＝３０，Ｐ＜０．０００１。（Ｄ）ＭＲＳＡ菌株８３２を使用してＢと同じ、ｎ＝３０，Ｐ＜０．０００１。（Ｅ）１１０ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤのバンコマイシンおよび５．２５ｍｇ／ｋｇのＰｌｙＳｓ２とともにＭＲＳＡ菌株ＭＷ２を使用した高チャレンジモデル。投与を接種の２時間後に開始、ｎ＝３０，Ｐ＜０．０００１。（Ｆ）２００ｍｇ／ｋｇ ＱＩＤのオキサシリンおよび５．２５ｍｇ／ｋｇのＰｌｙＳｓ２とともにＭＳＳＡ菌株ＡＴＣＣ２５９２３を使用した高チャレンジモデル。投与を接種の２時間後に開始、ｎ＝３０ Ｐ＜０．０００１。
図２８は、ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡ菌株におけるダプトマイシンおよびＰｌｙＳｓ２のＭＩＣを、継代数およびダプトマイシン耐性の発生とともに示している。ＰｌｙＳｓ２のＭＩＣは低下し、ダプトマイシン耐性が高まるにつれてＰｌｙＳｓ２感性は増加を示す。
図２９は、溶解素ＰｌｙＳｓ２のアミノ酸配列（配列番号１）およびコード核酸配列（配列番号２）を提供している。ＰｌｙＳｓ２溶解素のＮ末端のＣＨＡＰドメインおよびＣ末端のＳＨ－３ドメインは、網掛けされており、ＣＨＡＰドメイン（配列番号３）は、ＬＮＮ．．．から始まり、．．．ＹＩＴで終わり、ＳＨ－３ドメイン（配列番号４）は、ＲＳＹ．．．から始まり、．．．ＶＡＴで終わる。ＰＤＢ ２Ｋ３Ａ（Ｒｏｓｓｉ Ｐら（２００９）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ７４：５１５－５１９）に対する相同性によって同定されたＣＨＡＰドメインの活性部位残基（Ｃｙｓ２６、Ｈｉｓ１０２、Ｇｌｕ１１８およびＡｓｎ１２０）に下線が引かれている。
図３０は、複数の培養物（３つの独立した培養物の各々）に対するダプトマイシン単独またはＭＩＣ未満の量のＰｌｙＳｓ２溶解素を伴うダプトマイシンの存在下における耐性選択条件下での連続継代日数に応じたダプトマイシンＭＩＣ値の倍率変化を示している。
図３１は、複数の培養物（３つの独立した培養物の各々）に対するダプトマイシン単独またはＭＩＣ未満の量のＰｌｙＳｓ２溶解素を伴うダプトマイシンの存在下における耐性選択条件下での連続継代日数に応じたバンコマイシンＭＩＣ値の倍率変化を示している。
詳細な説明
本発明によると、当該分野の技術範囲内の従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡの技法が使用されることがある。そのような技法は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（１９８９）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ［Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）］；“Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ［Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ，ｅｄ．（１９９４））］；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ［Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）］；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５）］；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）］；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６）］；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ”［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”（１９８４）を参照のこと。
ゆえに、以下の用語が本明細書中に現れた場合、それらは、以下に示される定義を有するものとする。
用語「ＰｌｙＳｓ溶解素（複数可」、「ＰｌｙＳｓ２溶解素」、「ＰｌｙＳｓ２」および具体的に列挙されない任意の変化形は、本明細書中で交換可能に使用されてもよく、本願全体および特許請求の範囲全体で使用されるとき、単一または複数のタンパク質を含むタンパク質性材料のことを指し、本明細書中に記載され、図２９および配列番号１に提示されるアミノ酸配列データ、ならびに本明細書中および特許請求の範囲に示される活性のプロファイルを有するタンパク質にまで及ぶ。したがって、実質的に等価な活性または変更された活性を示すタンパク質が、同様に企図される。これらの改変は、例えば、部位特異的変異誘発によって得られる改変などの計画的なものであり得るか、または複合体もしくはその指定されたサブユニットの産生者である宿主内での変異によって得られる改変などの偶発的なものであり得る。また、用語「ＰｌｙＳｓ溶解素（複数可）」、「ＰｌｙＳｓ２溶解素」、「ＰｌｙＳｓ２」は、本明細書中に具体的に列挙されるタンパク質、ならびに実質的に相同なアナログ、フラグメントまたは短縮化物（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）および対立遺伝子バリエーションのすべてをそれらの範囲内に含むと意図される。ＰｌｙＳｓ２溶解素は、米国特許出願６１／４７７，８３６およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／３４４５６に記載されている。より最近の論文でＧｉｌｍｅｒらは、ＰｌｙＳｓ２溶解素を記載している（Ｇｉｌｍｅｒ ＤＢら（２０１３）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｅｐｕｂ ２０１３ Ａｐｒｉｌ ９［ＰＭＩＤ ２３５７１５３４］）。
用語「ＣｌｙＳ」、「ＣｌｙＳ溶解素」とは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを含むブドウ球菌に対する活性を有するキメラ溶解素ＣｌｙＳのことを指し、それは、ＷＯ２０１０／００２９５９に詳述されており、Ｄａｎｉｅｌら（Ｄａｎｉｅｌ，Ａら（２０１０）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅ
ｒ ５４（４）：１６０３－１６１２）にも記載されている。例示的なＣｌｙＳアミノ酸配列は、配列番号５に提供されている。
「溶解酵素」は、好適な条件下で、適切な期間の間に、１つまたは複数の細菌を殺滅する任意の細菌細胞壁溶解酵素を含む。溶解酵素の例としては、様々なアミダーゼ細胞壁溶解酵素が挙げられるがこれに限定されない。特定の態様において、溶解酵素とは、バクテリオファージ溶解酵素のことを指す。「バクテリオファージ溶解酵素」とは、バクテリオファージから抽出されるかもしくは単離される溶解酵素、または溶解酵素の機能を維持する類似のタンパク質構造を有する合成された溶解酵素のことを指す。
溶解酵素は、細菌細胞のペプチドグリカンに存在する結合を特異的に切断して、細菌細胞壁を破壊することができる。細菌細胞壁ペプチドグリカンがほとんどの細菌の間で高度に保存されていること、およびほんのいくつかの結合の切断だけで細菌細胞壁が破壊され得ることも現在、自明のこととみなされている。これらの結合を切断する溶解酵素の例は、ムラミダーゼ、グルコサミニダーゼ、エンドペプチダーゼまたはＮ－アセチル－ムラモイル－Ｌ－アラニンアミダーゼである。Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉら（１９７４）は、Ｃ１連鎖球菌ファージ溶解素酵素がアミダーゼであることを報告した。Ｇａｒｃｉａら（１９８７，１９９０）は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＣｐ－１ファージ由来のＣｐｌ溶解素がリゾチームであることを報告した。ＣａｌｄｅｎｔｅｙおよびＢａｍｆｏｒｄ（１９９２）は、ｐｈｉ６ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓファージ由来の溶解酵素が、メソ－ジアミノピメリン酸（ｍｅｌｏ－ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｉｌｉｃ ａｃｉｄ）およびＤ－アラニンによって形成されたペプチド架橋を開裂するエンドペプチダーゼであることを報告した。大腸菌Ｔ１およびＴ６ファージの溶解酵素は、リステリアファージ由来の溶解酵素（ｐｌｙ）と同様のアミダーゼである（Ｌｏｅｓｓｎｅｒら、１９９６）。細菌細胞壁を切断することができる当該分野で公知の他の溶解酵素も存在する。
「バクテリオファージによって遺伝的にコードされる溶解酵素」は、例えば、宿主細菌に対する少なくともいくらかの細胞壁溶解活性を有することによって、宿主細菌を殺滅することができるポリペプチドを含む。そのポリペプチドは、天然配列の溶解酵素およびそのバリアントを包含する配列を有し得る。そのポリペプチドは、バクテリオファージ（「ファージ」）などの種々の起源から単離され得るか、または組換え法もしくは合成法によって調製され得る。そのポリペプチドは、例えば、カルボキシル末端側にコリン結合部分を含み得、アミノ末端側における、細胞壁ペプチドグリカンを切断することができる酵素活性（例えば、ペプチドグリカン中のアミド結合に対して作用するアミダーゼ活性）を特徴とし得る。複数の酵素活性、例えば、２つの酵素ドメインを含む溶解酵素、例えば、ＰｌｙＧＢＳ溶解素が報告されている。さらに、触媒ドメインだけを含み、細胞壁結合ドメインを含まない他の溶解酵素も報告されている。
「天然配列のファージ関連溶解酵素」は、細菌ゲノム（すなわち、プロファージ）に由来する酵素と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列の酵素は、単離され得るか、または組換え手段もしくは合成手段によって作製され得る。
用語「天然配列の酵素」は、その酵素の天然に存在する形態（例えば、選択的スプライシングされた形態または変更された形態）および天然に存在するバリアントを包含する。本発明の１つの実施形態において、天然配列の酵素は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓに特異的なバクテリオファージ由来の遺伝子によって遺伝的にコードされる、成熟ポリペプチドまたは完全長ポリペプチドである。当然のことながら、Ｌｏｐｅｚら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ３：１９９－２１１（１９９７）；Ｇａｒｃｉａら、Ｇｅｎｅ ８６：８１－８８（１９９０）；Ｇａｒｃｉａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：９１４－９１８（１９８８）；Ｇａｒｃ
ｉａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：９１４－９１８（１９８８）；Ｇａｒｃｉａら、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊ．Ｊ．Ｆｅｒｒｅｔｔｉ ａｎｄ Ｃｕｒｔｉｓ ｅｄｓ．，１９８７）；Ｌｏｐｅｚら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１００：４３９－４４８（１９９２）；Ｒｏｍｅｒｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：５０６４－５０７０（１９９０）；Ｒｏｎｄａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６４：６２１－６２４（１９８７）およびＳａｎｃｈｅｚら、Ｇｅｎｅ ６１：１３－１９（１９８７）などの刊行物において認められているように、いくつかのバリアントが存在し得、公知である。これらの参考文献の各々の内容、特に、配列表、および配列相同性に関する記載を含むそれらの配列を比較する付属のテキストは、それらの全体が明確に参照により援用される。
「バリアント配列の溶解酵素」は、溶解酵素のポリペプチド配列と異なるポリペプチド配列を特徴とするが機能活性を保持している溶解酵素を含む。その溶解酵素は、いくつかの実施形態において、図２９および配列番号１に提供されるようなその溶解酵素配列（複数可）と特定のアミノ酸配列同一性を有するＰｌｙＳｓ２の場合のように、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓに特異的なバクテリオファージによって遺伝的にコードされ得る。例えば、いくつかの実施形態において、機能的に活性な溶解酵素は、細菌の細胞壁を破壊することによって、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ菌、ならびに表１、２および３に示されているような細菌を含む本明細書中に提供されるような他の感受性細菌を殺滅し得る。活性な溶解酵素は、図２９（配列番号１、配列番号３または配列番号４）に提供されるような本明細書の溶解酵素配列（複数可）と６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９または９９．５％のアミノ酸配列同一性を有し得る。そのようなファージ関連溶解酵素バリアントは、例えば、図２９（配列番号１）に提供されるような本明細書の溶解酵素配列（複数可）の配列のＮまたはＣ末端において１つまたは複数のアミノ酸残基が付加されているかまたは欠失されている溶解酵素ポリペプチドを含む。
特定の態様において、ファージ関連溶解酵素は、天然のファージ関連溶解酵素配列と少なくとも約８０％または８５％のアミノ酸配列同一性、特に、少なくとも約９０％（例えば、９０％）のアミノ酸配列同一性を有する。最も詳細には、ファージ関連溶解酵素バリアントは、ＰｌｙＳｓ２溶解素について図２９（配列番号１）に提供されるような、またはＣｌｙＳについて以前に記載されたような（ＷＯ２０１０／００２９５９およびＤａｎｉｅｌら（Ｄａｎｉｅｌ，Ａら（２０１０）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ
ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５４（４）：１６０３－１６１２）ならびに配列番号５に記載されているようなものを含む）、本明細書の天然のファージ関連溶解酵素の配列（複数可）と少なくとも約９５％（例えば、９５％）のアミノ酸配列同一性を有し得る。
同定されたファージ関連溶解酵素配列に関する「パーセントアミノ酸配列同一性」は、該配列を同じ読み枠でアラインメントし、必要であればギャップを導入して、最大パーセント配列同一性を得た後、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮せずに、ファージ関連溶解酵素配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして本明細書中で定義される。
本明細書中で同定されたファージ関連溶解酵素配列に関する「パーセント核酸配列同一性」は、該配列をアラインメントし、必要であればギャップを導入して、最大パーセント配列同一性を得た後の、ファージ関連溶解酵素配列中のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセンテージと定義される。
２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性パーセントを決定するために、それらの配列を最適な比較目的でアラインメントする（例えば、第１のヌクレオチド配列の
配列にギャップが導入され得る）。次いで、対応するヌクレオチドまたはアミノ酸の位置におけるヌクレオチドまたはアミノ酸を比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドまたはアミノ酸によって占められているとき、それらの分子は、その位置において同一である。２つの配列の間の同一性パーセントは、それらの配列が共有する同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。
２つの配列の間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。２つの配列を比較するために利用される数学的アルゴリズムの非限定的な例は、本発明のヌクレオチド配列と所望の同一性を有する配列を同定するために使用され得るＮＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている、Ｋａｒｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３－５８７７（１９９３）のアルゴリズムである。比較目的でギャップが導入されたアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２５：３３８９－３４０２（１９９７）に記載されているようなＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータが使用され得る。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって提供されるプログラムを参照のこと。
「ポリペプチド」は、直鎖状の様式でつながった複数のアミノ酸からなるポリマー分子を含む。ポリペプチドは、いくつかの実施形態において、天然に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされる分子に対応し得る。そのポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸が類似の特性を有するもので置き換えられた保存的置換を含み得、ここで、そのような保存的置換は、そのポリペプチドの機能を変化させない。
用語「変更された溶解酵素」は、シャフリングした（ｓｈｕｆｆｌｅｄ）および／またはキメラの溶解酵素を含む。
特定のファージが感染する細菌に特異的なファージ溶解酵素は、問題の細菌の細胞壁を効果的および効率的に壊すことが見出されている。その溶解酵素は、タンパク分解性の酵素活性を欠いていると考えられ、ゆえに、細菌細胞壁の消化中に存在しても、哺乳動物のタンパク質および組織に対して非破壊性である。さらに、ファージ溶解酵素の作用は、抗生物質とは異なって、標的病原体（複数可）に特異的であることが見出されているので、正常な細菌叢は、本質的にインタクトなままである（参照により本明細書中に援用されるＭ．Ｊ．Ｌｏｅｓｓｎｅｒ，Ｇ．Ｗｅｎｄｌｉｎｇｅｒ，Ｓ．Ｓｃｈｅｒｅｒ，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １６，１２３１－４１．（１９９５））。実際に、ＰｌｙＳｓ２溶解素は、独特の広範な細菌種および菌株の殺滅を示しつつ、本明細書中に記載されるような、大腸菌を含む正常な細菌叢を構成する細菌に対して比較的および特に不活性である。
本発明において有用な溶解酵素またはポリペプチドは、感染の徴候を有する他の者に曝された者が病気になることを妨げるための予防的処置として、またはその感染によってすでに病気になった者に対する治療的処置として、特定のバクテリオファージに感染した後の細菌生物によって産生され得るか、または組換え的にもしくは合成的に産生され得るかもしくは調製され得る。溶解素ポリペプチド配列およびその溶解素ポリペプチドをコードする核酸は、本明細書中に記載され、言及されている限り、その溶解酵素（複数可）／ポリペプチドは、好ましくは、本明細書中に例証されるような方法を含む当該分野の標準的な方法を用いて、ファージゲノム由来の溶解酵素に対する遺伝子を単離し、その遺伝子をトランスファーベクターに入れ、上記トランスファーベクターを発現系にクローニングす
ることを介して、生成され得る。その溶解酵素またはポリペプチドは、短縮化された、キメラ、シャフリングした、または「天然」のものであり得、組み合わせであり得る。関連性のある米国特許第５，６０４，１０９号は、その全体が参照により本明細書に援用される。「変更された」溶解酵素は、いくつかの方法で生成され得る。好ましい実施形態において、ファージゲノム由来の、変更された溶解酵素用の遺伝子は、トランスファーベクターまたは移動可能なベクター、好ましくは、プラスミドに入れられ、そのプラスミドは、発現ベクターまたは発現系にクローニングされる。本発明の溶解素ポリペプチドまたは溶解素酵素を生成するための発現ベクターは、大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓまたは他のいくつかの好適な細菌に好適なものであり得る。そのベクター系は、無細胞発現系でもあり得る。遺伝子または遺伝子セットを発現させるこれらの方法のすべてが、当該分野で公知である。溶解酵素は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓをＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｕｉｓに特異的なバクテリオファージに感染させることによっても作製され得、ここで、上記少なくとも１つの溶解酵素は、上記Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓの細胞壁をもっぱら溶解し、他のもの、例えば、存在する天然または共生の細菌叢に対して多くとも最小効果しか有しない。
「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、異種ポリペプチドに作動可能に連結された、本発明において有用なポリペプチドの全部または（好ましくは、生物学的に活性な）一部を含む。キメラタンパク質またはキメラペプチドは、例えば、２つ以上の活性部位を有する２つ以上のタンパク質を組み合わせることによって、生成される。キメラタンパク質およびキメラペプチドは、同じ分子または異なる分子に対して独立して作用し得るがゆえに、２つ以上の異なる細菌感染症を同時に処置する潜在能力を有する。キメラタンパク質およびキメラペプチドは、細胞壁を２つ以上の位置において切断することによって、細菌感染症を処置するためにも使用され得、単一の溶解素分子またはキメラペプチドから潜在的により迅速または効果的な（または相乗的な）殺滅を提供する。
ＤＮＡ構築物またはペプチド構築物の「異種」領域は、より大きなＤＮＡ分子内のＤＮＡまたはより大きなペプチド分子内のペプチドの同定可能なセグメントであって、天然には、そのより大きな分子と会合した状態で見出されない、セグメントである。したがって、異種領域が、哺乳動物遺伝子をコードするとき、その遺伝子は、通常、起源の生物のゲノムではその哺乳動物ゲノムＤＮＡと隣接しないＤＮＡに隣接している。異種コード配列の別の例は、そのコード配列自体が天然では見出されない構築物（例えば、ゲノムコード配列がイントロンを含むｃＤＮＡ、または天然の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）である。対立遺伝子バリエーションまたは天然に存在する変異イベントは、本明細書中で定義されるようなＤＮＡまたはペプチドの異種領域を生じさせない。
用語「作動可能に連結された」は、本開示のポリペプチドと異種ポリペプチドとがインフレームで融合されていることを意味する。異種ポリペプチドは、本開示のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。キメラタンパク質は、化学合成または組換えＤＮＡ技術によって、酵素的に生成される。いくつかのキメラ溶解酵素が、生成されており、研究されている。有用な融合タンパク質の１つの例は、本開示のポリペプチドがＧＳＴ配列のＣ末端に融合されたＧＳＴ融合タンパク質である。そのようなキメラタンパク質は、本開示の組換えポリペプチドの精製を促進し得る。
別の実施形態において、キメラタンパク質またはキメラペプチドは、そのＮ末端に異種のシグナル配列を含む。例えば、本開示のポリペプチドの天然のシグナル配列が、除去されて、別の公知のタンパク質由来のシグナル配列で置き換えられ得る。
融合タンパク質は、異なる能力を有するかまたは追加の能力を提供するかまたは溶解素ポリペプチドに特色を付加するタンパク質またはポリペプチドと、溶解素ポリペプチドを
組み合わせ得る。融合タンパク質は、本開示のポリペプチドの全部または一部が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合されている、免疫グロブリン融合タンパク質であり得る。その免疫グロブリンは、抗体、例えば、感受性細菌または標的細菌の表面タンパク質またはエピトープに向けられた抗体であり得る。その免疫グロブリン融合タンパク質は、本開示のポリペプチドの同族リガンドのバイオアベイラビリティを変化させ得る。リガンド／レセプター相互作用の阻害は、細菌に関連する疾患および障害の処置と、細胞生存の調整（すなわち、促進または阻害）との両方にとって、治療的に有用であり得る。融合タンパク質は、特定の組織もしくは器官または表面（例えば、デバイス、プラスチック、膜）に対して溶解素を方向づけるまたは標的化する手段を含み得る。本開示のキメラタンパク質および融合タンパク質ならびにキメラペプチドおよび融合ペプチドは、標準的な組換えＤＮＡ法によって生成され得る。
本明細書中に開示されるようなタンパク質またはペプチドおよびペプチドフラグメントの改変された形態または変更された形態は、化学的に合成されたもしくは組換えＤＮＡ法によって調製されたまたはその両方のタンパク質またはペプチドおよびペプチドフラグメントを含む。これらの技法としては、例えば、キメラ化およびシャフリングが挙げられる。本明細書中で使用されるとき、２つ以上の関係するファージタンパク質またはタンパク質ペプチドフラグメントに対するシャフリングしたタンパク質もしくはペプチド、遺伝子産物またはペプチドは、ランダムに切断され、より活性または特異的なタンパク質に再構成される。シャフリングしたオリゴヌクレオチド、ペプチドまたはペプチドフラグメント分子を選択するかまたはスクリーニングすることにより、所望の機能特性を有する分子が同定される。シャフリングを用いることにより、鋳型タンパク質よりも活性な、例えば、最大１０～１００倍活性なタンパク質を作製することができる。鋳型タンパク質は、種々の様々な溶解素タンパク質の中から選択される。シャフリングしたタンパク質またはペプチドは、例えば、１つまたは複数の結合ドメインおよび１つまたは複数の触媒ドメインを構成する。そのタンパク質またはペプチドが、化学合成によって生成されるとき、それは、好ましくは、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まず、すなわち、それは、そのタンパク質の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離される。したがって、タンパク質のそのような調製物は、目的のポリペプチド以外の化学前駆体または化合物を約３０％、２０％、１０％、５％未満（乾燥重量基準）しか有しない。
本発明は、本発明において有用なポリペプチドの他のバリアントにも関する。そのようなバリアントは、アゴニスト（模倣物）またはアンタゴニストとして機能し得る変更されたアミノ酸配列を有し得る。バリアントは、変異誘発、すなわち、不連続な点変異または短縮化によって、作製され得る。アゴニストは、そのタンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性の実質的に同じ生物学的活性またはサブセットを保持し得る。タンパク質のアンタゴニストは、例えば、目的のタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または上流のメンバーと競合的に結合することによって、そのタンパク質の天然に存在する形態の活性の１つまたは複数を阻害し得る。したがって、特異的な生物学的効果は、限られた機能のバリアントで処理することによって誘導され得る。そのタンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性のサブセットを有するバリアントによる被験体の処置は、そのタンパク質の天然に存在する形態による処置と比べて少ない副作用を被験体にもたらし得る。アゴニスト（模倣物）またはアンタゴニストとして機能する本開示において有用なタンパク質のバリアントは、本開示のタンパク質の短縮化変異体などの変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定され得る。１つの実施形態において、変化に富んだバリアントライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発によって作製され、それは、変化に富んだ遺伝子ライブラリーによってコードされる。本開示のポリペプチドの潜在的なバリアントのライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から作製するために使用され得る種々の方法が存在する。本開示のポリペプチドのコード配列のフラグメントのライブラリーは、バリアント、活性なフラグメントまたは短
縮化物をスクリーニングし、その後に選択するための、変化に富んだポリペプチド集団を作製するために使用され得る。点変異または短縮化によって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技法が、当該分野で公知である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするためのハイスループット解析に適用できる最も広く使用されている技法は、代表的には、複製可能な発現ベクターへの遺伝子ライブラリーのクローニング、得られたベクターのライブラリーによる適切な細胞の形質転換、およびある条件下でのコンビナトリアル遺伝子の発現を含み、その条件は、所望の活性の検出によって、遺伝子（その産物が検出される）をコードしているベクターの単離が促進される条件である。この文脈において、実施形態によるタンパク質（またはそのタンパク質をコードする核酸）の最も小さい部分は、溶解素タンパク質を生成するファージに特異的なものとして認識可能なエピトープである。したがって、標的またはレセプターに結合すると予想され得、いくつかの実施形態にとって有用な最小のポリペプチド、例えば、抗体（およびそのポリペプチドをコードする関連核酸）は、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７５、８５または１００アミノ酸長であり得る。８、９、１０、１１、１２または１５アミノ酸長もの短い小さい配列は、標的またはエピトープとして作用するのに十分な構造を確かに含むが、５、６または７アミノ酸長のより短い配列が、いくつかの条件において標的またはエピトープの構造を示し得、ある実施形態では価値があり得る。したがって、図２９に示されるようなもの（配列番号１）を含む本明細書中に提供されるタンパク質（複数可）または溶解素ポリペプチドの最も小さい部分は、５、６、７、８、９、１０、１２、１４または１６アミノ酸長もの小さいポリペプチドを含む。
本明細書中に記載されるように、実施形態のタンパク質またはペプチドフラグメントの生物学的に活性な部分は、本開示の溶解素タンパク質のアミノ酸配列と十分に同一であるかまたはそれに由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、それは、溶解素タンパク質の完全長タンパク質よりも少ないアミノ酸を含み、対応する完全長タンパク質の少なくとも１つの活性を示す。代表的には、生物学的に活性な部分は、対応するタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。本発明の溶解素のＮ末端のＣＨＡＰドメインについての例示的なドメイン配列は、図２９および配列番号３に提供されている。本発明の溶解素のＣ末端のＳＨ３ドメインについての例示的なドメイン配列は、図２９および配列番号４に提供されている。本開示のタンパク質またはタンパク質フラグメントの生物学的に活性な部分は、例えば、１０、２５、５０、１００程度の（ｌｅｓｓ ｏｒ ｍｏｒｅ）アミノ酸長であるポリペプチドであり得る。さらに、タンパク質の他の領域が欠失されているかまたは付加されている他の生物学的に活性な部分は、組換え法によって調製され得、実施形態のポリペプチドの天然の形態の機能活性の１つまたは複数について評価され得る。
当業者によって認識されているように、そのような低分子タンパク質および／または核酸（またはより大きな分子のタンパク質領域および／もしくは核酸領域）と機能を共有する相同タンパク質および相同核酸が調製され得る。特に相同であり得る、より大きな分子のそのような小分子および短い領域が、実施形態として意図されている。好ましくは、そのような有益な領域の相同性は、図２９に示されているものを含む本明細書中に提供される溶解素ポリペプチドと比べて、少なくとも５０％、６５％、７５％、８０％、８５％、好ましくは、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または少なくとも９９％である。これらのパーセント相同性の値は、保存的アミノ酸置換に起因する変更を含まない。
２つのアミノ酸配列は、アミノ酸残基の少なくとも約７０％（好ましくは、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、好ましくは、少なくとも約９０または９５％）が同一であるかまたは保存的置換を示すとき、「実質的に相同」である。比較可能な溶解素（例え
ば、比較可能なＰｌｙＳｓ２溶解素または比較可能なＣｌｙＳ溶解素）の配列は、溶解素ポリペプチドのアミノ酸の１つまたは複数またはいくつかまたは最大１０％または最大１５％または最大２０％が、類似のまたは保存的なアミノ酸置換で置換されるとき、実質的に相同であり、ここで、それらの比較可能な溶解素は、本明細書中に開示される溶解素（例えば、ＰｌｙＳｓ２溶解素および／またはＣｌｙＳ溶解素）の活性、抗菌効果および／または細菌特異性のプロファイルを有する。
本明細書中に記載されるアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体であることが好ましい。しかしながら、免疫グロブリン結合に関する所望の機能（ｆｕｃｔｉｏｎａｌ）特性がそのポリペプチドによって保持される限り、「Ｄ」異性体である残基も、任意のＬ－アミノ酸残基の代わりに用いることができる。ＮＨ２とは、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基のことを指す。ＣＯＯＨとは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基のことを指す。標準的なポリペプチド命名法であるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：３５５２－５９（１９６９）に一致して、アミノ酸残基に対する省略形を以下の対応表に示す：
対応表
記号 アミノ酸
１文字 ３文字
Ｙ Ｔｙｒ チロシン
Ｇ Ｇｌｙ グリシン
Ｆ Ｐｈｅ フェニルアラニン
Ｍ Ｍｅｔ メチオニン
Ａ Ａｌａ アラニン
Ｓ Ｓｅｒ セリン
Ｉ Ｉｌｅ イソロイシン
Ｌ Ｌｅｕ ロイシン
Ｔ Ｔｈｒ トレオニン
Ｖ Ｖａｌ バリン
Ｐ Ｐｒｏ プロリン
Ｋ Ｌｙｓ リジン
Ｈ Ｈｉｓ ヒスチジン
Ｑ Ｇｌｎ グルタミン
Ｅ Ｇｌｕ グルタミン酸
Ｗ Ｔｒｐ トリプトファン
Ｒ Ａｒｇ アルギニン
Ｄ Ａｓｐ アスパラギン酸
Ｎ Ａｓｎ アスパラギン
Ｃ Ｃｙｓ システイン
特定のコドンが、異なるアミノ酸をコードするコドンに変更されるか、あるアミノ酸が別のアミノ酸の代わりに使用されるか、または１つまたは複数のアミノ酸が欠失されるように、アミノ酸配列において、もしくは本明細書中のポリペプチドおよび溶解素をコードする核酸配列（図２９（配列番号１）に示される溶解素配列を含む）またはそれらの活性なフラグメントもしくは短縮化物において変異が作製され得る。そのような変異は、通常、最も少ないアミノ酸またはヌクレオチドの変更を可能にすることによって、作製される。この種の置換変異は、非保存的様式で（例えば、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸から別の分類に属するアミノ酸にコドンを変更することによって）または保存的様式で（例えば、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸から同じ分類に属するアミノ酸にコドンを変更することによって）、生じるタンパク質においてアミノ酸を変化させることができる。そのような保存的変更は、通
常、生じるタンパク質の構造および機能をそれほど変化させない。非保存的変更は、生じるタンパク質の構造、活性または機能を変化させる可能性が高い。本発明は、生じるタンパク質の活性または結合特性を有意に変化させない保存的変更を含む配列を含むと考えられるべきである。
したがって、当業者は、本明細書中に提供されるＰｌｙＳｓ２溶解素ポリペプチドの配列の精査ならびに他の溶解素ポリペプチドについての当業者の知識および入手可能な公的な情報に基づいて、溶解素ポリペプチド配列においてアミノ酸の変更または置換を行うことができる。アミノ酸の変更を行って、本明細書中に提供される溶解素（複数可）の配列中の１個または複数個、１個または数個、１個またはいくつか、１～５個、１～１０個またはそのような他の数のアミノ酸を置き換えるかまたは置換することにより、それらの変異体またはバリアントが作製され得る。そのようなそれらの変異体またはバリアントは、ブドウ球菌、連鎖球菌、リステリア菌もしくは腸球菌を含む細菌を殺滅するための、および／または本明細書中に記載されるような、特に本明細書中に提供されるような溶解素（複数可）に匹敵する活性を有するための機能について予測され得るか、または機能もしくは能力について試験され得る。したがって、変更は、溶解素の配列に対して行われ得、配列中に変更を有する変異体またはバリアントは、本明細書中に記載されるおよび例証されるアッセイおよび方法（実施例中のものを含む）を用いて試験され得る。当業者は、本明細書の溶解素（複数可）のドメイン構造に基づいて、合理的な保存的置換もしくは非保存的置換を含む、置換もしくは置き換えに適した、１個または複数個のアミノ酸、１個もしくはいくつかのアミノ酸、および／または置換や置き換えに適さない１つまたは複数のアミノ酸を予測し得る。
この点において、例示としてＰｌｙＳｓ２溶解素に関して、ＰｌｙＳｓ２ポリペプチド溶解素は、多岐にわたるクラスのプロファージ溶解酵素であるが、その溶解素は、図２９に示されているように、Ｎ末端のＣＨＡＰドメイン（システイン－ヒスチジンアミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼ）（配列番号３）およびＣ末端のＳＨ３－タイプ５ドメイン（配列番号４）を含むことに注目する。それらのドメインは、別々の色の網掛け領域のアミノ酸配列中に示されており、ここで、ＣＨＡＰドメインは、ＬＮＮ．．．から始まる最初の網掛けアミノ酸配列領域に対応し、ＳＨ３－タイプ５ドメインは、ＲＳＹ．．．から始まる２番目の網掛け領域に対応する。ＣＨＡＰドメインは、以前に特徴付けられたいくつかの連鎖球菌およびブドウ球菌のファージ溶解素に含まれている。したがって、当業者は、ＰｌｙＳｓ２のＣＨＡＰドメインおよび／またはＳＨ－３ドメインについての置換または置き換えを合理的に作製し得、試験し得る。Ｇｅｎｂａｎｋデータベースとの配列の比較は、例えば、置換のためのアミノ酸を同定するために、ＣＨＡＰおよび／もしくはＳＨ－３ドメイン配列のいずれかもしくは両方、またはＰｌｙＳｓ２溶解素の完全アミノ酸配列でなされ得る。例えば、ＣＨＡＰドメインは、保存されたシステインおよびヒスチジンアミノ酸配列（ＣＨＡＰドメイン中の最初のシステインおよびヒスチジン）を含み、それらは、特徴的であり、種々のポリペプチドのＣＨＡＰドメインにおいて保存されている。例えば、保存されたシステイン残基およびヒスチジン残基が、活性または能力を維持するためにＰｌｙＳｓ２の変異体またはバリアントにおいて維持されているはずであると予測することは合理的である。図２９（配列番号１）のＰｌｙＳｓ２アミノ酸配列中のバリンアミノ酸１９においてバリンの代わりに置き換えられたアラニンを有する変異体またはバリアントが、活性であり、図２９（配列番号１）のＰｌｙＳｓ２溶解素に類似の様式で、それと同程度に効果的にグラム陽性菌を殺滅することができることは、注目すべきである。
以下は、アミノ酸の様々な分類の一例である：
非極性のＲ基を有するアミノ酸
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン
無電荷極性のＲ基を有するアミノ酸
グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン
荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸（Ｐｈ６．０において負に帯電）
アスパラギン酸、グルタミン酸
塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０において正に帯電）
リジン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０において）
別の分類は、フェニル基を有するアミノ酸であり得る：
フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン
別の分類は、分子量（すなわち、Ｒ基のサイズ）に従った分類であり得る：
グリシン ７５ アラニン ８９
セリン １０５ プロリン １１５
バリン １１７ トレオニン １１９
システイン １２１ ロイシン １３１
イソロイシン １３１ アスパラギン １３２
アスパラギン酸 １３３ グルタミン １４６
リジン １４６ グルタミン酸 １４７
メチオニン １４９ ヒスチジン（ｐＨ６．０において） １５５
フェニルアラニン １６５ アルギニン １７４
チロシン １８１ トリプトファン ２０４
特に好ましい置換は、以下である：
正電荷が維持され得るような、Ａｒｇの代わりのＬｙｓおよびその逆；
負電荷が維持され得るような、Ａｓｐの代わりのＧｌｕおよびその逆；
遊離－ＯＨが維持され得るような、Ｔｈｒの代わりのＳｅｒ；および
遊離ＮＨ２が維持され得るような、Ａｓｎの代わりのＧｌｎ。
例示的なおよび好ましい保存的アミノ酸置換としては、グルタミン酸（Ｅ）の代わりのグルタミン（Ｑ）およびその逆；バリン（Ｖ）の代わりのロイシン（Ｌ）およびその逆；トレオニン（Ｔ）の代わりのセリン（Ｓ）およびその逆；バリン（Ｖ）の代わりのイソロイシン（Ｉ）およびその逆；グルタミン（Ｑ）の代わりのリジン（Ｋ）およびその逆；メチオニン（Ｍ）の代わりのイソロイシン（Ｉ）およびその逆；アスパラギン（Ｎ）の代わりのセリン（Ｓ）およびその逆；メチオニン（Ｍ）の代わりのロイシン（Ｌ）およびその逆；グルタミン酸（Ｅ）の代わりのリジン（Ｌ）およびその逆；セリン（Ｓ）の代わりのアラニン（Ａ）およびその逆；フェニルアラニン（Ｆ）の代わりのチロシン（Ｙ）およびその逆；アスパラギン酸（Ｄ）の代わりのグルタミン酸（Ｅ）およびその逆；イソロイシン（Ｉ）の代わりのロイシン（Ｌ）およびその逆；アルギニン（Ｒ）の代わりのリジン（Ｋ）およびその逆のいずれかが挙げられる。
アミノ酸の置換は、特定の好ましい特性を有するアミノ酸を置換するためにも導入され得る。例えば、Ｃｙｓは、別のＣｙｓとのジスルフィド架橋のための潜在的な部位として導入され得る。Ｈｉｓは、特定の「触媒」部位として導入され得る（すなわち、Ｈｉｓは、酸または塩基として作用することができ、生化学的な触媒における最も一般的なアミノ酸である）。Ｐｒｏは、タンパク質の構造内にβ－ターンを誘導するその特定の平面構造を理由に、導入され得る。
本発明によると、組成物および方法は、バクテリオファージ溶解素（複数可）と抗生物質との組み合わせに基づいて、グラム陽性菌の迅速かつ有効な殺滅のために提供される。本発明によると、複数の細菌、特に、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓおよびＳｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓの菌株を含むグラム陽性菌に対する広範な殺滅活性を明らかに示す溶解素ＰｌｙＳｓ２は、抗生物質（複数可）との併用において、注目すべき相乗作用を提供し、抗生物質（複数可）に対して必要とされる有効ＭＩＣ用量を有意に減少させ得る。
本明細書中で実証され、提供されるように、溶解素、特に、ＰｌｙＳｓ２溶解素は、改善された殺菌活性、より迅速な抗生物質の透過、および耐性の抑制を特徴とするプロセスにおいて、バンコマイシン、ダプトマイシン、リネゾリドおよびオキサシリンを含む種々のタイプおよびクラスの抗生物質を含む抗生物質と相乗作用を示すことができる。本明細書中で実証されるように、マウス菌血症モデルでは、ＰｌｙＳｓ２と抗生物質とのペアワイズ組み合わせは、単剤処置と比べて高度に有意な生存時間の延長をもたらす。したがって、溶解素／抗生物質の組み合わせは、現行の標準的な処置と比べて、診療所での菌血症の処置のための、より有効な治療である。
本発明はさらに、ヒトでの使用をシミュレートした用量（ｈｕｍａｎ－ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｄｏｓｅｓ）の単剤抗生物質では成功しない条件下のＳ．ａｕｒｅｕｓ誘発性菌血症のマウスモデルとインビトロアッセイとの両方を介して、併用での抗生物質のＰｌｙＳｓ２依存性増強を実証する。抗生物質の活性のＰｌｙＳｓ２媒介性増強の機序を例証し、溶解素と抗生物質との間の全般的な相乗作用を示すデータが本明細書中に提示される。相乗作用は、溶解素と抗生物質との共投与に基づく、効果的な新しい一般的な抗感染症ストラテジーに対する示唆を有する。特に、溶解素および抗生物質の各々および両方の作用物質は、有意に減少させた用量および量で投与して、殺菌活性および静菌活性を増強し、抗生物質耐性または薬剤のリスクを低下させることができる。
溶解素、特に、ＰｌｙＳｓ２溶解素は、単剤として認識されているが、本発明は、溶解素、特に、ＰｌｙＳｓ２溶解素が、様々な抗生物質との有意な程度のインビトロおよびインビボにおける相乗作用を驚くべきことに明らかに示すことを示す。本実施例では、相乗作用は、複数の菌株および抗生物質を用いた時間－殺菌曲線およびチェッカーボードアッセイによって検証されるが、そのインビトロでの相乗作用の程度は特に、二剤ＭＩＣアッセイを使用して例証され、そのアッセイでは、０．２５×ＭＩＣという低さのＰｌｙＳｓ２が、ダプトマイシンＭＩＣを１μｇ／ｍＬから０．００７５μｇ／ｍＬに減少させた（１２８倍減少）。この相乗効果は、６４～２５６倍の範囲の効力増強の程度で１２個のＭＲＳＡ菌株にわたって認められた。ゆえに、７．５ｎｇ／ｍｌダプトマイシンは、単剤として殺滅するためには極めて不十分であるので、２種の抗微生物薬である抗生物質＋溶解素の併用は、単純に順番に殺滅する（溶解素によるバルク集団の減少に続く、抗生物質による残留細菌の殺滅）よりも多く殺滅する。
本明細書中に提供され、実証される菌血症モデルでは、併用療法の処置は、一貫して、ヒトでの使用をシミュレートした完全強度の（ｆｕｌｌ ｓｔｒｅｎｇｔｈ）用量の単剤抗生物質での処置より優れていた。これは、ＭＲＳＡ菌血症を処置するための現在の標準的治療であるバンコマイシンとダプトマイシンの両方、ならびにＭＳＳＡ菌血症を処置するための現在の標準的治療であるオキサシリン、ベータ－ラクタムについて実証される。これらの結果は、明らかな臨床的意味を有し、菌血症ならびに他の重大な感染症を処置するために溶解素（複数可）および抗生物質（複数可）を使用する新しい有効な併用療法レジメンを提供する。効能が高く、耐性のリスクがより低い、より低用量の溶解素および抗生物質を使用した、これらの薬剤の併用療法に基づく方法および組成物が提供される。実際に、本方法および組成物は、抗生物質耐性ブドウ球菌を含む耐性菌に対して有効である。
臨床適用において、本発明は、溶解素／抗生物質の組み合わせ、特に、ＰｌｙＳｓ２／抗生物質の組み合わせを投与することによって菌血症を処置する方法を提供する。速効性
の溶解素は、そのＭＩＣより高い間、病原体集団を効果的に減少させる。いったん、溶解素の濃度がＭＩＣ未満に低下したら、併用パートナーである抗生物質の活性は、その溶解素が存在することによって、およそ１または２溶解素薬物動態学的半減期分だけ長く相乗的に高められ、その相乗作用によって高められた殺滅が活性である時間が延長する。したがって、ＰｌｙＳｓ２／抗生物質の併用は、現在利用可能な単剤の選択肢よりも強力かつ有効な抗菌治療を提供する。
ＰｌｙＳｓ２溶解素は、ブドウ球菌、連鎖球菌、リステリア菌または腸球菌を含むグラム陽性菌の数多くの異なる菌株および種を殺滅する活性および能力を示す。特におよび有意なことに、ＰｌｙＳｓ２は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、特に、抗生物質感性菌株および異なる抗生物質耐性菌株の両方を含むブドウ球菌の菌株の殺滅において活性である。ＰｌｙＳｓ２は、連鎖球菌の菌株の殺滅においても活性であり、Ａ群およびＢ群連鎖球菌株に対して特に有効な殺滅を示す。細菌に対するＰｌｙＳｓ２溶解素の能力は、単離された菌株をインビトロで使用する対数殺滅評価（ｌｏｇ ｋｉｌｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｓ）に基づいて下記の表１に示される。
表１
ＰｌｙＳｓ２による種々の細菌の増殖の低減（部分的な列挙）
Figure 2022058682000001
様々な文法上の形態での句「モノクローナル抗体」とは、特定の抗原と免疫反応することができるただ１つの種の抗体結合部位を有する抗体のことを指す。したがって、モノクローナル抗体は、代表的には、それと免疫反応する任意の抗原に対して単一の結合親和性を示す。ゆえに、モノクローナル抗体は、その各部位が異なる抗原に免疫特異的である、複数の抗体結合部位を有する抗体分子；例えば、二重特異性（キメラ）モノクローナル抗体を含んでもよい。
用語「特異的」は、特異的結合対の１つのメンバーが、その特異的結合パートナー（複数可）以外の分子に対して有意な結合を示さない状況のことを指すために使用され得る。その用語は、例えば、抗原結合ドメインが、いくつかの抗原によって保持される特定のエピトープに特異的である場合にも当てはまり、その場合、その抗原結合ドメインを保持す
る特異的結合メンバーは、そのエピトープを保持する様々な抗原に結合することができる。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）の意味において広く使用され、換言すると、１つまたは複数の特長または成分の存在を可能にするものである。
用語「～から本質的になる」とは、より大きな生成物に共有結合していない生成物、特に、定義された数の残基のペプチド配列のことを指す。しかしながら、本明細書の本発明のペプチドの場合、当業者は、ペプチドのＮまたはＣ末端に対する軽微な改変（例えば、保護基などを付加する末端の化学修飾、例えば、Ｃ末端のアミド化）が、企図され得ることを認識する。
用語「単離された」とは、本発明によれば、本発明の溶解素ポリペプチド（複数可）またはそのようなポリペプチドをコードする核酸が存在する状況のことを指す。ポリペプチドおよび核酸は、それらが天然に会合する材料（例えば、それらの天然の環境またはそれらが調製される環境（例えば、細胞培養）（そのような調製がインビトロまたはインビボにおいて実施される組換えＤＮＡ技術によるとき）においてそれらとともに見出される他のポリペプチドまたは核酸）を含まないかまたは実質的に含まない。ポリペプチドおよび核酸は、希釈剤またはアジュバントとともに製剤化され得、なおも実際的な目的のために単離され得、例えば、ポリペプチドは、通常、ポリマーもしくは粘膜接着剤（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅｓ）もしくは他のキャリアと混合されるか、または診断もしくは治療において使用されるとき、薬学的に許容され得るキャリアもしくは希釈剤と混合される。
本発明において有用かつ適用可能なＳ．ｓｕｉｓのＰｌｙＳｓ２溶解素ポリペプチド（複数可）をコードすることができる核酸が、本明細書中に提供される。この文脈における代表的な核酸配列は、図２９のポリペプチド（配列番号１）をコードするポリヌクレオチド配列、および図２９のＤＮＡ（配列番号２）配列（複数可）の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列である。これらの配列および図に示される配列とハイブリダイズする核酸配列のさらなるバリアントもまた、本開示による溶解酵素の生成において使用するために企図される（得られる可能性がある天然のバリアントを含む）。ファージ関連溶解酵素をコードする多種多様の単離された核酸配列またはｃＤＮＡ配列、およびそのような遺伝子配列とハイブリダイズする部分配列は、本発明の溶解素酵素（複数可）または溶解素ポリペプチド（複数可）の組換え生成にとって有用である。
「レプリコン」は、インビボにおけるＤＮＡ複製の自律的単位として機能する；すなわち、それ自体の制御下において複製することができる、任意の遺伝的エレメント（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。
「ベクター」は、結合したセグメントの複製をもたらすように別のＤＮＡセグメントが結合し得るレプリコン（例えば、プラスミド、ファージまたはコスミド）である。
「ＤＮＡ分子」とは、その一本鎖の形態または二本鎖のへリックスのいずれかでの、デオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン）の重合体のことを指す。この用語は、その分子の一次構造および二次構造のことだけを指し、それをいかなる特定の三次の形態にも限定しない。したがって、この用語は、とりわけ、線形のＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、ウイルス、プラスミドおよび染色体に見出される二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を記述する際、配列は、転写されないＤＮＡ鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’への方向で１つの配列だけを与えるという通常の慣習に従って本明細書中に記載され得る。
「複製起点」とは、ＤＮＡ合成に関与するＤＮＡ配列のことを指す。
ＤＮＡ「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれたとき、インビボにおいて転写され、ポリペプチドに翻訳される、二本鎖ＤＮＡ配列である。コード配列の境界線は、５’（アミノ）末端における開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端における翻訳終止コドンによって決定される。コード配列には、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）のＤＮＡのゲノムＤＮＡ配列、および合成のＤＮＡ配列までもが含まれ得るが、これらに限定されない。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常、コード配列に対して３’に配置される。
転写制御配列および翻訳制御配列は、宿主細胞においてコード配列の発現を提供するＤＮＡ調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなど）である。
「プロモーター配列」は、細胞においてＲＮＡポリメラーゼに結合することができ、下流の（３’方向の）コード配列の転写を開始することができる、ＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的のため、プロモーター配列は、その３’末端で転写開始部位と境界を接し、上流（５’方向）に伸びて、バックグラウンドより高い検出可能なレベルで転写を開始させるのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列の中には、転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングによって慣習的に定義される）、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。真核生物のプロモーターは、常にではないがしばしば、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含む。原核生物のプロモーターは、－１０および－３５のコンセンサス配列に加えてシャイン・ダルガノ配列を含む。
「発現制御配列」は、別のＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御し、調節するＤＮＡ配列である。ＲＮＡポリメラーゼが、コード配列をｍＲＮＡに転写し、次いでそれが、そのコード配列によってコードされるタンパク質に翻訳されるとき、そのコード配列は、細胞において転写制御配列および翻訳制御配列の「制御下」にある。
「シグナル配列」は、コード配列の前に含まれ得る。この配列は、ポリペプチドを細胞表面に方向づけるようにまたはポリペプチドを培地中に分泌するように宿主細胞に伝える、そのポリペプチドに対してＮ末端のシグナルペプチドをコードし、このシグナルペプチドは、そのタンパク質が細胞を離れる前に宿主細胞によって削り取られる。シグナル配列は、原核生物および真核生物を起源とする種々のタンパク質と会合した状態で見出され得る。
用語「オリゴヌクレオチド」は、本発明のプローブについて言及する際に本明細書中で使用されるとき、２つ以上、好ましくは、３つより多いリボヌクレオチドからなる分子として定義される。その正確なサイズは、多くの因子に依存し、言い換えればその因子は、そのオリゴヌクレオチドの最終的な機能および用途に依存する。
本明細書中で使用されるとき、用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」とは、細菌の酵素のことを指し、その各々は、特定のヌクレオチド配列において、または特定のヌクレオチド配列付近で、二本鎖ＤＮＡを切断する。
外来性または異種ＤＮＡが、細胞の内部に導入されているとき、その細胞は、そのようなＤＮＡによって「形質転換されている」。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成している染色体ＤＮＡに組み込まれて（共有結合的に連結されて）いてもよいし、そうでなくてもよい。原核生物、酵母および哺乳動物の細胞において、例えば、形質転換ＤＮＡは、
プラスミドなどのエピソームエレメント上に維持され得る。真核細胞に関して、安定に形質転換された細胞は、形質転換ＤＮＡが、染色体複製を介して娘細胞に受け継がれるように染色体に組み込まれた細胞である。この安定性は、その真核細胞が、形質転換ＤＮＡを含む娘細胞の集団からなる細胞系またはクローンを確立する能力によって実証される。「クローン」は、有糸分裂による単一の細胞または共通の祖先に由来する細胞の集団である。「細胞系」は、多くの世代にわたってインビトロで安定して成長することができる初代細胞のクローンである。
ヌクレオチドの少なくとも約７５％（好ましくは、少なくとも約８０％、最も好ましくは、少なくとも約９０または９５％）が、そのＤＮＡ配列の定義された長さにわたってマッチするとき、それらの２つのＤＮＡ配列は、「実質的に相同」である。実質的に相同な配列は、配列データバンクにおいて利用可能な標準的なソフトウェアを使用して、または例えば、特定の系について定義されるようなストリンジェントな条件下での、サザンハイブリダイゼーション実験において、それらの配列を比較することによって同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は、当該分野の技術範囲内である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、上掲；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｓ．Ｉ ＆ ＩＩ，上掲；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，上掲を参照のこと。
本明細書中に具体的に開示されるものの誘導体であり、溶解素ポリペプチド（複数可）の機能特性を有するタンパク質をなおもコードするがヌクレオチドの欠失、付加または置換によって開示されているものと異なる、ＤＮＡ分子およびヌクレオチド配列が、本開示によって企図される。開示されるＤＮＡ分子に由来する小さいＤＮＡ分子も含まれる。そのような小さいＤＮＡ分子には、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとしての使用に適したオリゴヌクレオチドが含まれる。したがって、これらの小さいＤＮＡ分子は、少なくとも、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓのバクテリオファージによって遺伝的にコードされる溶解酵素のセグメントを含み、ＰＣＲの目的のために、その遺伝子の少なくとも１０～１５ヌクレオチド配列、より好ましくは、１５～３０ヌクレオチド配列を含む。上に記載されたような開示されるＤＮＡ分子に由来するＤＮＡ分子およびヌクレオチド配列は、開示されるＤＮＡ配列またはそのフラグメントとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列としても定義され得る。
本開示の好ましい実施形態において、ストリンジェントな条件は、２５％超の配列バリエーション（「ミスマッチ」とも呼ばれる）を有するＤＮＡ分子がハイブリダイズしない条件として定義され得る。より好ましい実施形態において、ストリンジェントな条件は、１５％超のミスマッチを有するＤＮＡ分子がハイブリダイズしない条件であり、より好ましくはなおも、ストリンジェントな条件は、１０％超のミスマッチを有するＤＮＡ配列がハイブリダイズしない条件である。好ましくは、ストリンジェントな条件は、６％超のミスマッチを有するＤＮＡ配列がハイブリダイズしない条件である。
遺伝暗号の縮重は、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を維持する一方、ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列中の主要なバリエーションを可能にするので、その縮重は、実施形態の範囲をさらに広げる。したがって、遺伝子のヌクレオチド配列は、コードされるタンパク質のアミノ酸組成またはタンパク質の特徴に影響せずに、この位置において、これらの３つのコドンのうちのいずれかに変更され得る。特定のアミノ酸についての遺伝暗号およびヌクレオチドコドンにおけるバリエーションは、当業者に周知である。遺伝暗号の縮重に基づくと、バリアントＤＮＡ分子は、上に記載されたような標準的なＤＮＡ変異誘発法を使用して、またはＤＮＡ配列の合成によって、本明細書中に開示されるｃＤＮＡ分子から得られ得る。遺伝暗号の縮重に基づく配列バリエーションのせいで、開示されるｃＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないＤＮＡ配列は、本明細書中
において、本開示によって包含される。
したがって、ＰｌｙＳｓ２およびＰｌｙＳｓ１を含む本発明の溶解素をコードするＤＮＡ配列もまた、本発明の範囲内であると認識されるべきであり、その配列は、図２９に提供されるもの（配列番号１）と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするが、それに対して縮重であるか、または図２９に提供される例示的な核酸配列（配列番号２）に対して縮重である。「～に対して縮重」とは、異なる３文字コドンを使用することにより、特定のアミノ酸が特定されることを意味する。特定の各アミノ酸をコードするために交換可能に使用され得るコドンは、当該分野で周知である。
当業者は、本明細書に記載されるおよび当該分野で公知であるＤＮＡ変異誘発法が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓのバクテリオファージ溶解素をコードするが、本明細書中に記載され、提供される溶解ポリペプチドの不可欠な特徴を維持する、多種多様のＤＮＡ分子を生成し得ることを認識する。新しく得られるタンパク質はまた、下記でさらに十分に記載されるように、溶解ポリペプチド（複数可）の特徴についてバリエーションを得るために選択され得る。そのような誘導体は、アミノ酸配列中に軽微な欠失、付加および置換を含むバリエーションを有する誘導体を含む。
アミノ酸配列のバリエーションを導入するための部位は、予め決定され得る一方で、変異自体が予め決定される必要はない。アミノ酸置換は、代表的には、単一残基に由来するか、または１個または複数個、１個もしくは数個、１、２、３、４、５、６もしくは７個の残基に由来し得；挿入は、通常、およそ約１～１０アミノ酸残基であり得；欠失は、約１～３０残基の範囲であり得る。欠失または挿入は、単一の形態で存在し得るが、好ましくは、隣接した対で行われる（すなわち、２残基の欠失または２残基の挿入）。置換、欠失、挿入またはそれらの任意の組み合わせが組み合わされて、最終的な構築物に到達し得る。置換バリアントは、アミノ酸配列中の少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入されたバリアントである。そのような置換は、タンパク質の特徴に対して有意な影響をもたらさないように、またはタンパク質の特徴の細かい調整が望まれるとき、行われ得る。タンパク質中の元のアミノ酸の代わりに用いられてもよく、かつ、保存的置換とみなされるアミノ酸は、上に記載されており、当業者によって認識される。
当該分野で周知であるように、ＤＮＡ配列は、適切な発現ベクター内の発現制御配列にそれらを作動可能に連結し、その発現ベクターを使用して、適切な単細胞宿主を形質転換することによって、発現され得る。当然のことながら、発現制御配列への本発明のＤＮＡ配列のそのような作動可能な連結は、すでにそのＤＮＡ配列の一部でない場合、そのＤＮＡ配列の上流への正確な読み枠での開始コドンＡＴＧの提供を含む。多種多様の宿主／発現ベクターの組み合わせが、本発明のＤＮＡ配列を発現させる際に使用され得る。例えば、有用な発現ベクターは、染色体の、非染色体の、および合成のＤＮＡ配列のセグメントからなり得る。任意の多種多様の発現制御配列、すなわち、それに作動可能に連結されるＤＮＡ配列の発現を制御する配列が、これらのベクター内で使用されることにより、本発明のＤＮＡ配列が発現し得る。多種多様の単細胞宿主細胞もまた、本発明のＤＮＡ配列を発現させる際に有用である。これらの宿主には、周知の真核生物宿主および原核生物宿主（例えば、大腸菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、酵母などの真菌の菌株、ならびに組織培養中の動物細胞、ヒト細胞および植物細胞）が含まれ得る。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく所望の発現を達成するために、過度の実験を行うことなく、適切なベクター、発現制御配列および宿主を選択することができる。
本発明に提供される方法および適用において有用な溶解酵素（複数可）／ポリペプチド（複数可）を含む治療用組成物または薬学的組成物、ならびに関連する使用方法が、本明
細書中に提供される。治療用組成物または薬学的組成物は、１つまたは複数の溶解ポリペプチド（複数可）を含み得、１つまたは複数の抗生物質と併用され、好適な賦形剤、キャリアまたはビヒクルと必要に応じて組み合わされる、天然、トランケート型、キメラまたはシャフリングした溶解酵素を必要に応じて含み得る。本発明は、細菌感染症または関連する状態を含むグラム陽性菌の殺滅、軽減、除菌、予防または処置において使用するための、抗生物質と組み合わされる、ＰｌｙＳｓ２を含む溶解素の治療用組成物または薬学的組成物を提供する。本発明は、細菌感染症または関連する状態を含むグラム陽性菌の殺滅、軽減、除菌、予防または処置において使用するための、バンコマイシン、リネゾリドまたはダプトマイシンと組み合わされる、ＰｌｙＳｓ２を含む溶解素の治療用組成物または薬学的組成物を提供する。本発明は、細菌感染症または関連する状態を含むグラム陽性菌の殺滅、軽減、除菌、予防または処置において使用するための、ダプトマイシンと組み合わされる、ＰｌｙＳｓ２を含む溶解素の治療用組成物または薬学的組成物を提供する。ダプトマイシンを含む抗生物質と組み合わせてＰｌｙＳｓ２溶解素（その短縮化物またはバリアントを含む）を含む組成物は、特に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓおよび抗生物質耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓまたはＬｉｓｔｅｒｉａの細菌感染症または関連する状態を含むグラム陽性菌の殺滅、軽減、除菌、予防または処置において使用するために本明細書中に提供される。
治療用組成物中に含められる酵素（複数可）またはポリペプチド（複数可）は、変更されていないファージ関連溶解酵素（複数可）、トランケート型の溶解ポリペプチド、バリアント溶解ポリペプチド（複数可）ならびにキメラおよび／またはシャフリングした溶解酵素のうちの１つまたは複数または任意の組み合わせであり得る。さらに、同じ細菌の処置のために、異なるファージによって遺伝的にコードされる異なる溶解ポリペプチド（複数可）が使用され得る。これらの溶解酵素は、「変更されていない」溶解酵素またはポリペプチド、トランケート型の溶解ポリペプチド（複数可）、バリアント溶解ポリペプチド（複数可）、ならびにキメラおよびシャフリングした溶解酵素の任意の組み合わせでもあり得る。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａを含むグラム陽性菌用の治療用組成物または薬学的組成物中の溶解酵素（複数可）／ポリペプチド（複数可）は、単独で、または抗生物質と併用して、または処置されるべき他の侵襲性細菌生物が存在する場合、標的化されている他の細菌に特異的な他のファージ関連溶解酵素と併用して、使用され得る。その溶解酵素、トランケート型酵素、バリアント酵素、キメラ酵素および／またはシャフリングした溶解酵素は、ホリンタンパク質（ｈｏｌｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）とともに使用され得る。そのホリンタンパク質の量も変動し得る。様々な抗生物質が、酵素（複数可）またはポリペプチド（複数可）とともに、およびリゾスタフィンありまたはなしで、治療用組成物中に必要に応じて含められ得る。２つ以上の溶解酵素またはポリペプチドが、治療用組成物中に含められ得る。
薬学的組成物は、化学合成またはＤＮＡ組換え法によって生成される１つまたは複数の変更された溶解酵素（そのアイソザイム、アナログまたはバリアントを含む）も含み得る。特に、変更された溶解タンパク質は、アミノ酸の置換、欠失、短縮化、キメラ化、シャフリングまたはそれらの組み合わせによって生成され得る。薬学的組成物は、１つまたは複数の天然の溶解タンパク質と１つまたは複数のトランケート型、バリアント、キメラまたはシャフリングした溶解タンパク質との組み合わせを含み得る。薬学的組成物は、１つまたは複数の補完的な作用物質および薬学的に許容され得るキャリアまたは希釈剤の任意選択の添加と組み合わせた、同じまたは異なる細菌種に由来する少なくとも１つの溶解タンパク質のペプチドまたはペプチドフラグメントも含み得る。
本発明の薬学的組成物は、特に本明細書中に提供されるような補完的な作用物質、すな
わち、１つまたは複数の従来の抗生物質を含む。抗生物質は、細胞壁ペプチドグリカン生合成に影響するものおよびグラム陽性菌におけるＤＮＡ合成またはタンパク質合成に影響するものに広く下位分類され得る。ペニシリンおよびそのような抗生物質を含む細胞壁合成阻害剤は、堅い外側の細胞壁を破壊し、その結果、相対的に支えられていない細胞は膨張し、最終的には破裂する。補完的な作用物質は、溶解酵素の治療効果を相乗的に増強するのに有効である量の、抗生物質（例えば、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、ロキシスロマイシン、マクロライドファミリーの他のメンバー、ペニシリン類、セファロスポリン類およびそれらの任意の組み合わせ）であり得る。実質的に他の任意の抗生物質が、変更されたおよび／または変更されていない溶解酵素とともに使用され得る。細胞壁ペプチドグリカン生合成に影響する抗生物質には：Ｎ－アセチルムラミン酸（ＮＡＭ）およびＮ－アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）ペプチドサブユニットをペプチドグリカンマトリックスに組み込むことを妨げることによってペプチドグリカン合成を阻害するグリコペプチド類が含まれる。利用可能なグリコペプチド類としては、バンコマイシンおよびテイコプラニン；ペプチドグリカン架橋の形成を阻害することによって作用するペニシリン類が挙げられる。ペニシリン類の官能基であるβ－ラクタム部分は、細菌中でペプチドグリカン分子を連結するＤＤ－トランスペプチダーゼに結合して、それを阻害する。加水分解酵素は、細胞壁を壊し続け、浸透圧に起因して、細胞溶解または細胞死をもたらす。一般的なペニシリン類には、オキサシリン、アンピシリンおよびクロキサシリン；ならびに原形質膜の外側にペプチドグリカン基本要素を有する分子であるＣ５５－イソプレニルピロホスフェートの脱リン酸化に干渉するポリペプチドが含まれる。細胞壁に悪影響を及ぼすポリペプチドは、バシトラシンである。他の有用なおよび関与性の抗生物質としては、バンコマイシン、リネゾリドおよびダプトマイシンが挙げられる。
他の溶解酵素も、他の細菌感染症を処置するためにキャリア中に含められ得る。薬学的組成物は、補完的な作用物質および好適なキャリアまたは希釈剤の任意選択の添加と組み合わせた、少なくとも１つの溶解タンパク質、１つのホリンタンパク質、または少なくとも１つのホリンタンパク質および１つの溶解タンパク質のペプチドまたはペプチドフラグメント（その溶解タンパク質およびホリンタンパク質の各々は、同じまたは異なる細菌種に由来する）も含み得る。
単独でまたは他の核酸分子と組み合わせて、有効量の溶解ポリペプチド（複数可）または溶解ポリペプチド（複数可）のペプチドフラグメントをインビボで発現することができる核酸分子を含む組成物も提供される。これらの核酸分子、ポリヌクレオチド、およびこれらの分子を有し、インビトロまたはインビボで発現するベクターを含む細胞培養物もまた提供される。
治療用組成物または薬学的組成物は、感受性グラム陽性菌が原因となる疾病を処置するために、種々のキャリアと組み合わせた溶解ポリペプチドおよび抗生物質を含み得る。そのキャリアは、少量の添加物（例えば、等張性および化学安定性を高める物質）を適切に含む。そのような材料は、使用される投与量および濃度ではレシピエントにとって無毒性であり、それらとしては、バッファ（例えば、リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸および他の有機酸またはそれらの塩）；酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド、例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；グリシン；アミノ酸（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジンまたはアルギニン）；単糖類、二糖類および他の炭水化物（セルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノース、トレハロースまたはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；対イオン（例えば、ナトリウム）；非イオン性界面活性物質（例えば、ポリソルベート、ポロキサマーまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））；および／または
中性の塩が挙げられる。グリセリンまたはグリセロール（１，２，３－プロパントリオール）は、薬学的使用のために商業的に入手可能である。ＤＭＳＯは、局所的に適用される多くの薬物の透過を高める注目すべき能力を有する非プロトン性溶媒である。特に、静脈内溶液が調製されるとき、キャリアビヒクルには、リンガー溶液、緩衝液およびデキストロース溶液も含まれ得る。
本発明において有用なおよび本発明において使用するための変更されたまたは変更されていない溶解酵素／ポリペプチド（複数可）の有効な投与速度または投与量は、その溶解酵素／ポリペプチド（複数可）が治療的に使用されるのかまたは予防的に使用されるのか、感染性細菌にレシピエントを曝す期間、個体のサイズおよび体重などに部分的に依存する。酵素／ポリペプチド（複数可）を含む組成物を使用するための期間もまた、その使用が予防目的であるか（ここで、その使用は、短期間にわたる、１時間ごとに、毎日または１週間ごとであり得る）、またはその使用が治療目的であるか（ここで、使用が、数時間、数日間もしくは数週間続けられ得、かつ／または毎日もしくはその日のうちに間隔を空けて続けられ得るような、組成物を使用するより集中的なレジメンが、必要であり得る）にも依存する。使用されるいずれの剤形も、最短時間にわたって最小数の単位を提供すべきである。「長期」放出キャリアまたは「緩徐」放出キャリア（例えば、ある特定の鼻スプレーまたは舐剤など）として分類されるキャリアは、より長い期間にわたるが、１ｍｌあたりより低い濃度の活性な（酵素）単位を有し得るかまたは提供し得るのに対し、「短期」放出キャリアまたは「速」放性キャリア（例えば、含嗽剤など）は、より短い期間にわたるが、１ｍｌあたりより高い濃度の活性な（酵素）単位を有し得るかまたは提供し得る。１ｍｌあたりの活性な単位の量およびそれに曝す期間は、感染の性質、処置が予防的であるべきかまたは治療的であるべきか、および他の可変事項に依存する。上記よりもかなり高い単位／ｍｌの投与量または低い単位／ｍｌの投与量を有する必要があり得る状況も存在する。
溶解酵素／ポリペプチド（複数可）は、その溶解酵素／ポリペプチド（複数可）の活性を可能にさせるｐＨを有する環境に存在するべきである。安定化バッファが、溶解素酵素／ポリペプチド（複数可）の最適な活性を可能にさせ得る。そのバッファは、還元試薬（例えば、ジチオトレイトールまたはベータメルカプトエタノール（ＢＭＥ））を含み得る。その安定化バッファはまた、金属キレート試薬（例えば、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩）であり得るかもしくはそれを含み得るか、あるいはリン酸バッファもしくはクエン酸－リン酸バッファまたは他の任意のバッファも含み得る。
処置の位置の環境およびある特定の態様が抗生物質の有効性に影響し得ることは注目すべきことである。例えば、ダプトマイシンは、肺サーファクタントに強く結合するので、ブドウ球菌性肺炎を含む細菌性肺炎の処置において有効でない。本発明は、感受性細菌に対して、併用でのＰｌｙＳｓ２およびダプトマイシンの注目すべき有効性および相乗作用を実証する。さらに、併用でのＰｌｙＳｓ２溶解素およびダプトマイシンは、肺サーファクタントを模倣する商業的に入手可能な界面活性物質の存在下でも非常に有効なままである。したがって、ＰｌｙＳｓ２は、抗生物質、特に、ダプトマイシンの有効性を促進し、高め、界面活性物質の存在下でさえダプトマイシンの有効性および活性を可能にするように働く。
弱い界面活性物質が、溶解酵素／ポリペプチド（複数可）の治療効果を増強するのに有効な量で治療用組成物または薬学的組成物に含められ得、組成物中で使用され得る。好適な弱い界面活性物質としては、とりわけ、ポリオキシエチレンソルビタンと脂肪酸とのエステル（Ｔｗｅｅｎシリーズ）、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘシリーズ）、ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－オクチル－β－Ｄ－チオグルコピラノシド、ｎ－デシル－β－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ドデシル－β－
Ｄ－グルコピラノシド、および生物学的に存在する界面活性物質、例えば、脂肪酸、グリセリド、モノグリセリド、デオキシコレートおよびデオキシコレートのエステルが挙げられる。
保存剤もまた、本発明において使用され得、好ましくは、全組成物の約０．０５重量％～０．５重量％を構成し得る。保存剤の使用は、生成物が微生物で汚染された場合、その製剤が微生物の増殖を防止するかまたは減少させることを確実にする。本発明において有用ないくつかの保存剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、クロロキシレノール、安息香酸ナトリウム、ＤＭＤＭヒダントイン、３－ヨード－２－プロピルブチルカルバメート、ソルビン酸カリウム、クロルヘキシジンジグルコネートまたはそれらの組み合わせが挙げられる。
治療用組成物は、感受性グラム陽性菌とともに存在する任意のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ菌を処置するための酵素リゾスタフィンなどの他の酵素をさらに含み得る。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｍｕｌａｎｓの遺伝子産物であるリゾスタフィンは、細胞壁のポリグリシン架橋を酵素的に分解することによって、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対して静菌効果および殺菌効果を発揮する（Ｂｒｏｗｄｅｒら、Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１９：３９３－４００（１９６５））。その後、リゾスタフィンに対する遺伝子は、クローニングされ、配列決定された（Ｒｅｃｓｅｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：１１２７－１１３１（１９８７）。治療用組成物は、ムタノリシン（ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ）およびリゾチームも含み得る。
溶解酵素／ポリペプチド（複数可）および抗生物質（複数可）を含む治療用組成物を適用する手段としては、直接的、間接的、キャリアおよび特別な手段または任意の組み合わせの手段が挙げられるが、これらに限定されない。溶解酵素／ポリペプチド（複数可）の直接的な適用は、ポリペプチドを感染または細菌集落形成の部位に直接接触させる任意の好適な手段による適用であり得る（例えば、鼻腔領域への適用（例えば、鼻スプレー）、皮膚（ｄｅｒｍａｌ）または皮膚（ｓｋｉｎ）への適用（例えば、局所的軟膏または製剤）、坐剤、タンポン適用など）。鼻への適用としては、例えば、鼻スプレー、点鼻剤、鼻用軟膏、鼻洗浄剤、鼻注射、鼻パッキング（ｎａｓａｌ ｐａｃｋｉｎｇｓ）、気管支スプレーおよび吸入器、あるいは咽頭用舐剤、うがい薬もしくは含嗽薬の使用によるか、または外鼻孔もしくは顔面に適用される軟膏の使用による間接的なもの、またはこれらおよび類似の適用方法の任意の組み合わせが挙げられる。溶解酵素が投与され得る形態としては、舐剤、トローチ剤、キャンディ、注入物質、チューインガム、錠剤、散剤、スプレー、液体、軟膏およびエアロゾルが挙げられるがこれらに限定されない。
溶解酵素および抗生物質の適用様式は、いくつかの異なるタイプおよびキャリアの組み合わせを含み、それらとしては、水性液体、アルコールベースの液体、水溶性ゲル、ローション、軟膏、非水性液体基剤、鉱油基剤、鉱油とワセリンとの混和物、ラノリン、リポソーム、タンパク質キャリア（例えば、血清アルブミンまたはゼラチン）、粉末セルロースカーメル（ｃａｒｍｅｌ）およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。治療薬を含むキャリアの送達様式としては、塗抹、噴霧、時間放出（ｔｉｍｅ－ｒｅｌｅａｓｅ）パッチ、液体を吸収した布状物（ｗｉｐｅ）およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。溶解酵素は、そのまま、または他のキャリアのうちの１つの中に入った状態で、包帯に適用され得る。その包帯は、湿った状態または乾燥した状態（ここで、その酵素は、凍結乾燥された形態でその包帯に存在する）で販売されていてよい。この適用方法は、感染した皮膚を処置するために最も有効である。局所用組成物のキャリアは、ポリマー増粘剤、水、保存剤、活性な界面活性剤または乳化剤、酸化防止剤、日焼け止め剤、および溶媒または混合溶媒系を含む、半固体およびゲル様のビヒクルを含み得る。使用され得るポリマー増粘剤には、当業者に公知のもの、例えば、化
粧品業界および製薬業界において頻繁に使用される親水性およびハイドロアルコール（ｈｙｄｒｏａｌｃｏｈｏｌｉｃ）のゲル化剤が含まれる。他の好ましいゲル化ポリマーとしては、ヒドロキシエチルセルロース、セルロースガム、ＭＶＥ／ＭＡデカジエンクロスポリマー、ＰＶＭ／ＭＡ共重合体またはそれらの組み合わせが挙げられる。
溶解酵素／ポリペプチド（複数可）および抗生物質（複数可）を含む組成物は、上気道の疾病に関連する細菌感染症の防止または処置のために、キャンディ、チューインガム、舐剤、トローチ剤、錠剤、散剤、エアロゾル、液体、液体スプレーまたは練り歯磨きの形態で投与され得る。溶解酵素／ポリペプチド（複数可）が加えられる舐剤、錠剤またはガムは、糖、コーンシロップ、種々の色素、ノンシュガー甘味料、香料、任意の結合剤またはそれらの組み合わせを含み得る。同様に、任意のガムベースの生成物は、アカシア、カルナウバロウ、クエン酸、コーンスターチ、食品着色料、香料、ノンシュガー甘味料、ゼラチン、グルコース、グリセリン、ガムベース、シェラック、サッカリンナトリウム、糖、水、白ロウ、セルロース、他の結合剤およびそれらの組み合わせを含み得る。舐剤はさらに、スクロース、コーンスターチ、アカシア、トラガカントゴム、アネトール、アマニ、オレオレジン、鉱油およびセルロース、他の結合剤、ならびにそれらの組み合わせを含み得る。デキストロース、スクロースまたは他の糖の代わりに、代替糖も使用され得る。溶解酵素またはそれらのペプチドフラグメントを含む組成物は、粘膜内層に方向づけられ得、そこで、その組成物は、残存して集落形成している疾患細菌を殺滅する。本明細書中に開示されるおよび記載されるような粘膜内層は、例えば、上気道および下気道、眼、口腔前庭、鼻、直腸、膣、歯周ポケット、腸および結腸を含む。粘膜組織の天然の除去機構または浄化機構に起因して、従来の剤形は、任意の有意な時間の長さにわたって、適用部位に保持されない。
１つまたは複数のファージ酵素および他の補完的な作用物質とともにある期間にわたって投与されるためには、粘膜組織への接着を示す材料を有することが有益である場合がある。放出調節能力を有する材料が特に望ましく、徐放性粘膜接着剤の使用が、かなりの程度の注目を集めている。親水性材料と疎水性材料との組み合わせである粘膜接着剤に関する他のアプローチが公知である。ミセルおよび多重膜（ｍｕｌｔｉｌａｍｉｌｌａｒ）ミセルもまた、酵素の放出を調節するために使用され得る。例えば、カテーテル、バルブ、補綴デバイス、薬物または化合物のポンプ、ステント、整形材料などの、特に、身体内に留置され、細菌が接着しやすいかまたはバイオフィルムが発生しやすい任意の材料または構成要素を含む、表面、例えば、臨床行為において利用されるプラスチック、膜、デバイスを標的化するかまたはそれに接着する能力を有する材料が、本発明において有用な溶解素（複数可）と併用されるか、混合されるか、または融合され得る。
本発明の治療用組成物または薬学的組成物は、生物学的に活性な作用物質を調節放出するための、親水性の主鎖および疎水性のグラフト鎖を含むグラフト共重合体を含む重合体粘膜接着剤も含み得る。本願の組成物は、必要に応じて、他の重合体材料（例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリ－（ビニルピロリドン）およびカルボキシメチルセルロースナトリウム可塑剤）および他の薬学的に許容され得る賦形剤を、その組成物の粘膜接着性（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｉｔｙ）に悪影響を及ぼさない量で含み得る。
本発明の溶解酵素／ポリペプチド（複数可）および抗生物質（複数可）は、局所的、経口的または非経口的を含む任意の薬学的に適用され得るまたは許容され得る手段によって、本発明に従って使用するために投与され得る。例えば、溶解酵素／ポリペプチド（複数可）は、グラム陽性菌による感染症を処置するために筋肉内に、髄腔内に、真皮下に（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）、皮下にまたは静脈内に投与され得る。非経口注射が、選択される投与様式である場合、好ましくは、等張製剤が使用される。通常、等張性のための添加物としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラク
トースが挙げられ得る。場合によっては、リン酸緩衝食塩水などの等張液が好ましい。安定剤には、ゼラチンおよびアルブミンが含まれる。製剤に、血管収縮剤が加えられ得る。本願による薬学的調製物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）は、滅菌された状態かつ発熱物質を含まない状態で、提供される。
いずれの化合物の場合も、治療的に有効な用量は、最初に、細胞培養アッセイにおいて、または動物モデル、通常、マウス、ウサギ、イヌもしくはブタにおいて、推定され得る。動物モデルは、望ましい濃度範囲および投与経路を得るためにも使用される。次いで、そのような情報は、ヒトにおける有用な用量および投与経路を決定するために使用され得る。正確な投与量は、処置される患者を考慮して、個別の医師によって選択される。投与量および投与は、十分なレベルの活性な部分を提供するように、または所望の効果を維持するように、調整される。考慮され得るさらなる因子としては、疾患状態の重症度、患者の年齢、体重および性別；食事、所望の処置期間、投与方法、投与時間および投与頻度、薬物の組み合わせ（複数可）、反応感度、ならびに治療に対する寛容／応答が挙げられる。長時間作用性の薬学的組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、３～４日間ごとに、１週間ごとに、または２週間ごとに１回、投与され得る。
投与される溶解酵素／ポリペプチド（複数可）の有効な投与速度または量および処置期間は、感染の深刻さ、患者、特に、ヒトの体重、感染性細菌にレシピエントが曝された期間、感染している皮膚または組織の平方センチメートル数、感染の深さ、感染の深刻さ、および種々のいくつかの他の可変事項に部分的に依存する。組成物は、１日または１週間に１回から数回、いずれかの場所に適用され得、数日間または数週間までなどの短期間にわたって、または何週間ももしくは数ヶ月間までなどの長期間にわたって、適用され得る。使用は、数日間または数週間にわたって続き得る。使用されるいずれの剤形も、最短時間にわたって最小数の単位を提供するべきである。有効量または有効な投与量の酵素を提供すると考えられる活性な単位の酵素の濃度は、適切に選択され得る。
本発明の組成物および方法において使用および適用される溶解素および抗生物質は、同時にまたは続いて投与され得る。その溶解素および抗生物質は、単回用量または複数回用量で、個々にまたは併用で、投与され得る。その溶解素および抗生物質は、同じ投与様式または異なる投与様式によって投与され得、併用でまたは個別に、１回、２回または複数回、１回または複数回、投与され得る。したがって、溶解素は、特に、応答および細菌の殺滅または除菌に応じて、初回量に続いて、その次の単一用量または複数用量で投与され得、抗生物質の投与（複数可）と併用または抗生物質の投与（複数可）で交替され得る。本発明の特定の態様において、抗生物質とともに溶解素、特に、ＰｌｙＳｓ２を投与することによって抗生物質に対する耐性の発生を減少させるという観点において、抗生物質と溶解素との組み合わせが、より長い期間にわたって投与され得、その投与は、耐性のリスクなしに延長され得る。さらに、抗生物質および溶解素の各々の効能のために必要とされる用量は、それらの作用物質を同時にまたは順番に併用するかまたは共投与することによって有意に減少するので、患者は、耐性のリスクなくまたは耐性のリスクが低い状態で、より積極的かつより継続的に処置され得る。
用語「作用物質」は、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、化学的化合物および小分子を含む任意の分子を意味する。特に、作用物質という用語は、被験化合物、添加されるさらなる化合物（複数可）または溶解素酵素化合物などの化合物を含む。
用語「アゴニスト」とは、最も広い意味において、リガンドが結合するレセプターを刺激するリガンドのことを指す。
用語「アッセイ」は、化合物の特定の特性を測定するために使用される任意のプロセス
のことを意味する。「スクリーニングアッセイ」は、化合物のコレクションからその活性に基づいて化合物を特徴付けるかまたは選択するために使用されるプロセスのことを意味する。
用語「防止する」または「防止」とは、疾患の発生の前に、疾患を引き起こす病原体に曝される可能性があるかまたはその疾患にかかりやすい可能性がある被験体における、疾患または障害を獲得するかまたは発症する（すなわち、発症すべきでない疾患の臨床徴候の少なくとも１つを引き起こす）リスクの低下のことを指す。
用語「予防」は、用語「防止」に関係し、その中に包含され、その目的が疾患の処置または治癒ではなく防止である措置または手技のことを指す。予防的な措置の非限定的な例としては、ワクチンの投与；例えば、動かないことに起因して血栓症のリスクがある、入院患者への低分子量ヘパリンの投与；およびマラリアが蔓延しているかまたはマラリアにかかるリスクが高い地理的領域への訪問に先だったクロロキンなどの抗マラリア剤の投与が挙げられ得る。
「治療有効量」は、医師または他の臨床医が探索している被験体の生物学的または医学的応答を誘発する、薬物、化合物、抗微生物薬、抗体、ポリペプチドまたは医薬品（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｇｅｎｔ）の量を意味する。特に、グラム陽性菌の感染症およびグラム陽性菌の増殖に関して、用語「有効量」は、殺菌効果および／または静菌効果を有することを含む、グラム陽性菌の感染の量または程度の生物学的に重要な減少をもたらす化合物または作用物質の有効量を含むと意図される。句「治療有効量」は、感染性細菌の増殖もしくは量または病態の他の特性の臨床的に有意な変化（例えば、その存在および活性に伴い得るような、発熱または白血球数の増加）を、少なくとも約３０パーセント、より好ましくは、少なくとも５０パーセント、最も好ましくは、少なくとも９０パーセント妨げる、好ましくは、減少させるのに十分な量を意味するために本明細書中で使用される。
任意の疾患または感染症を「処置する」またはそれらの「処置」という用語は、１つの実施形態において、その疾患または感染症を回復させること（すなわち、その疾患または感染性病原体もしくは感染性細菌の増殖を停止すること、またはそれらの臨床徴候の少なくとも１つの発現、程度もしくは重症度を減少させること）を指す。別の実施形態において、「処置する」または「処置」とは、被験体が識別できないかもしれない少なくとも１つの身体的パラメータの回復のことを指す。なおも別の実施形態において、「処置する」または「処置」とは、疾患または感染症を身体的に（例えば、可能な徴候の安定化）、生理的に（例えば、身体的パラメータの安定化）またはその両方で調整することを指す。さらなる実施形態において、「処置する」または「処置」は、疾患の進行の遅延または感染症の減少に関する。
本願および特許請求の範囲による、インビボで行われる処置方法または医学的および臨床的処置方法の文脈において、被験体、患者または個体という用語は、ヒトのことを指すと意図されていることに注意されたい。
用語「グラム陽性菌（ｇｒａｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）」、「グラム陽性菌（Ｇｒａｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）」、「グラム陽性」および具体的に列挙されてない任意の変化形は、本明細書中で交換可能に使用され得、本願全体および請求項全体にわたって使用されるとき、公知であり、かつ／あるいはある特定の細胞壁および／もしくは細胞膜の特徴の存在によって、ならびに／またはグラム染色による染色によって同定され得るグラム陽性菌のことを指す。グラム陽性菌は、公知であり、容易に同定され得、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属から選択され得るがこれらに限定されず、認識されているまたは認識されていない任意およびすべてのその種または菌株を含む。本発明のある態様において、ＰｌｙＳ溶解素感性グラム陽性菌には、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓのうちの１つまたは複数から選択される細菌が含まれる。
用語「殺菌性」とは、細菌細胞を殺滅できることを指す。
用語「静菌性」とは、細菌細胞の増殖の阻害を含む、細菌の増殖を阻害できることを指す。
句「薬学的に許容され得る」とは、ヒトに投与されたとき、生理的に耐えられ、通常、アレルギー性反応や類似の有害反応（例えば、胃の不調、眩暈など）をもたらさない、分子実体および組成物のことを指す。
本発明は、本発明の例示として提供される以下の非限定的な実施例を参照することにより、よりよく理解され得る。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより十分に例証するために提示されるが、しかしながら、決して、本発明の広い範囲を限定すると解釈されるべきでない。
実施例１
ＰｌｙＳｓ２溶解素は、抗生物質耐性菌株（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのメチシリンおよびバンコマイシン耐性および感性菌株（ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＶＲＳＡ、ＶＩＳＡ）、ダプトマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＤＲＳＡ）、ならびにリネゾリド耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＬＲＳＡ））を含む臨床的に重要なグラム陽性菌の様々な菌株を殺滅する能力を明らかに示す。ＰｌｙＳｓ２は、広範な種殺滅活性を有する点において独特の溶解素であり、複数の種の細菌、特に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａの菌株を含むグラム陽性菌を殺滅し得る。ＰｌｙＳｓ２溶解素および様々な抗生物質に対するブドウ球菌の感性（ＭＩＣ値およびμＭ濃度を使用して表されるような感性）の作表を表２に示す。最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、基準に従って、およびＣｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）の文書Ｍ０７－Ａ９（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｆｏｒ ｄｉｌｕｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｈａｔ ｇｒｏｗ ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ．Ｖｏｌｕｍｅ ３２（Ｗａｙｎｅ［ＰＡ］：Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ［ＵＳ］，２０１２）に記載されているように、ブロス微量希釈法を使用して決定した。この値は、ＭＩＣアッセイにおいて還元剤（例えば、ＤＴＴまたはＢＭＳ）の存在下で決定されるＭＩＣである。還元剤は、ＭＩＣ値を決定する際のアッセイ間の再現性を改善する目的で加えられる。
表２
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ菌株に対するＰｌｙＳｓ２および抗生物質の活性
Figure 2022058682000002
 ＊ＭＩＣは、ブロス微量希釈法を使用し、ＣＬＳＩ法（Ｍ０７－Ａ９）に従って８０％増殖阻害を評価して、決定した。
＊赤色／太字＝薬物失敗（ＭＩＣ値が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓにおいて、示されている薬物に対するＥＵＣＡＳＴブレイクポイントより高い）
様々なグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌に対するＰｌｙＳｓ２の活性を、種々の細菌に対するＭＩＣの値および範囲を含む表３に作表する。抗生物質耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに対するＰｌｙＳｓ２の活性を表４に提供する。ＰｌｙＳｓ２は、１０３個のＭＳＳＡおよび１２０個のＭＲＳＡ分離菌（ＭＩＣ＝８μｇ／ｍＬ）を含む試験されたすべてのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ菌株ならびにＡおよびＢ群連鎖球菌ならびにＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｉｅｎｓｉｓに対して強力な増殖阻害活性を有する（表３）。他のグラム陽性菌のコレクションならびに試験されたすべてのグラム陰性細菌に対しては、ほとんどまたはまったく活性は観察されなかった。ＰｌｙＳｓ２は、抗生物質耐性および感性Ｓ．ａｕｒｅｕｓならびに数多くの他の臨床的に有意なグラム陽性菌を効果的に殺滅するが、上記の表１ならびにヒト腸細菌の感性およびＰｌｙＳｓ２のＭＩＣを提供する下記の表５に示されるように、ＰｌｙＳｓ２は、大腸菌などの数多くの共生細菌に対しては著しく無効である。
表３
グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌に対するＰｌｙＳｓ２の活性
Figure 2022058682000003
 表４
抗生物質耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに対するＰｌｙＳｓ２の活性
Figure 2022058682000004
 表５
ＰｌｙＳｓ２に対するヒト腸細菌の感性
Figure 2022058682000005
ＰｌｙＳｓ２は、多くの異なる臨床的に関与性の細菌に対して有効であるが、広域スペクトルの細菌殺滅の欠如という多くの溶解素の有益な特性を保持するので、多くの抗生物質で認められる腸内細菌叢の乱れなどの副作用は、最小である。さらに、溶解素は、低い確率の細菌耐性しか示さなかった。ＰｌｙＳｓ２は、その著しく広い臨床的に関与性の殺滅能力のおかげで、完全には特徴付けられていない細菌感染または混合細菌感染が存在する場合を含む臨床実践場面に独自に適用可能になる。
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓは、いくつかの重大な感染症の原因物質であり、抗生物質耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ菌株の出現によって、重大な処置の困難がもたらされたことから、新しい抗微生物剤のニーズが高まった。現在、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの院内感染症の４０～６０％は、オキサシリンに耐性であり（Ｍａｓｓｅｙ ＲＣら（２００６）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４：９５３－９５８）、それらの分離菌の６０％超は、メチシリンに耐性である（Ｇｉｌｌ ＳＲら（２００５）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８７：２４２６－２４３８）。いくつかの新しい抗微生物剤（例えば、リネゾリド、キヌプリスチン・ダルホプリスチン、ダプトマイシン、テラバンシン、新しいグリコペプチド系、セフタロリン（ｃｅｆｔａｒｏｌｉｎｅ）およびセフトビプロール（ｃｅｆｔｏｂｉｐｒｏｌｅ））が、導入されたか、または臨床開発中である（Ａｋｓｏｙ ＤＹ ａｎｄ Ｓ Ｕｎａｌ（２００８）Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ １４：４１１－４２０）。選択肢として、ＭＲＳＡなどの菌株が耐性になっている現行の抗生物質が、他の薬剤と併用して使用されると、ＭＲＳＡの処置における実用的な候補として復活して、新しい次元の潜在的な抗感染薬が提供され得る。溶解素成分に対する耐性が非常に低い確率でしか発生しないことから、抗生物質と溶解素を組み合わせて適用および使用することは、細菌の耐性を回避する潜在性を有する。
臨床でのブドウ球菌感染症に対するＰｌｙＳｓ２の適用可能性をより完全に評価するために、メチシリン耐性菌株およびメチシリン感性菌株を含む数多くのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ菌株に対して時間殺菌研究を行った。ＣＬＳＩ法（ＣＬＳＩ文書Ｍ０７－Ａ９のカラム３２の第２番）に従って、４２個のメチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）菌株および２０個のメチシリン感性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）菌株に対して、時間殺菌アッセイを行った。各菌株の培養物（５．５×１０５～１×１０６開始接種材料）を、６時間にわたって通気しながら、比較のためにＰｌｙＳｓ２溶解素で、および抗生物質ダプトマイシン、オキサシリンまたはバンコマイシンで処理した。ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡ菌株を、ＰｌｙＳｓ２、ダプトマイシンおよびバンコマイシンで処理した。ＭＳＳＡ菌株は、オキサシリンでも処理した。公開されており、確立されている抗生物質のＭＩＣ値に基づいて、１×ＭＩＣ濃度の種々の抗生物質を利用した。ＰｌｙＳｓ２溶解素処理は、先に決定されたようなおよそ１×ＭＩＣにおいて行った（上記の表２を参照のこと）。培養物のアリコートを、６時間後まで１時間ごとに取り出し（採取した時点
は１５および３０分後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後および６時間後）、ＰＢＳ／チャコール溶液に加え（各薬物を不活性化するために）、次いでそれを段階希釈し、細菌の生存能を調べるためにプレーティングした。得られたｌｏｇ ＣＦＵ／ｍＬを各培養物についてプロットした。各菌株に対して増殖コントロールを含め、そのコントロールは、いかなる抗菌剤も存在しない状態での細菌の増殖を表す。選択されたＭＲＳＡ菌株についての例示的なｌｏｇ殺菌曲線を図１に示す。選択されたＭＳＳＡ菌株についての例示的なｌｏｇ殺菌曲線を図２に示す。ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡ菌株を用いた時間殺菌研究のまとめのプロットを図３に示す。
認識されているおよび利用可能な菌株の名称に対する相互参照を含む、本明細書中に提供される、本研究において使用された菌株のリストを下記の表６に提供する。
表６
菌株のリスト
Figure 2022058682000006
 ＊ＮＡＲＳＡ（「ＮＲＳ」）およびＡＴＣＣ（「ＡＴＣＣ」および「ＢＡＡ」）菌株の呼称が必要に応じて示されている。さらなる名称は、文献において入手可能な菌株の呼称を反映している。
ＰｌｙＳｓ２は、インビトロにおいて迅速な殺滅動態を有する。
迅速な殺滅動態は、劇症細菌感染症を有する患者を処置する臨床実践場面において望ましい。インビトロにおいて抗微生物活性の速度を試験するために、本発明者らは、２０個
の異なるＭＳＳＡおよび４２個のＭＲＳＡ菌株にわたって１×ＭＩＣ薬物濃度を試験する時間－殺菌アッセイ（Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｍら（２００４）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４８：３６９－３７７）を使用した。ＰｌｙＳｓ２は、３０分以内に殺菌レベルに達した（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｈａｔ ｇｒｏｗ ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ．Ｖｏｌ．３２（Ｗａｙｎｅ（ＰＡ）：Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＵＳ），２０１２）（ＣＦＵの≧３ｌｏｇ１０減少）（図４ＡおよびＢ）。対照的に、ダプトマイシンは、殺菌レベルに達するために６時間を要し、バンコマイシンおよびオキサシリンは、６時間以内に２ｌｏｇ１０の殺滅しか達成しなかった。迅速な殺滅動態は、１５個の異なる最近のＭＳＳＡ分離菌（図４Ｃ）またはＭＲＳＡ分離菌（図４Ｄ）のセットに対するＰｌｙＳｓ２の場合にも得られ、関与性の臨床分離菌に対するＰｌｙＳｓ２の効率的な殺菌活性が例証された。ＰｌｙＳｓ２の強力な活性は、処理のわずか１５秒後にＳ．ａｕｒｅｕｓ ｃｏｃｃｉの広範な溶菌を示す電子顕微鏡検査によってさらに例証され；ＰｌｙＳｓ２の作用の速度は、接触直後の殺菌効果と一致する（図４Ｅ）。
試験されたすべてのＭＲＳＡおよびＭＳＳＡ菌株が、ＰｌｙＳｓ２で迅速に殺滅され、最大殺滅（すなわち、≧３ｌｏｇ減少）は、概して、溶解素とのインキュベーションの最初の１時間以内に観察され、ほとんどの場合、ｌｏｇは、１ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ（試験の有効な下限）にまで減少する。ダプトマイシンまたはバンコマイシンは、ほとんどのＭＲＳＡおよびＭＳＳＡ菌株の増殖を２～３ｌｏｇ減少させ、それは、概してインキュベーションの数時間以上にわたって観察され、ダプトマイシンが、ほとんどの菌株に対して最も有効である。オキサシリンは、ＭＳＳＡ菌株に対する抗生物質の中で最も有効でなかった。すべての場合において、ＰｌｙＳｓ２の殺滅は、いずれの抗生物質よりも大きく、速かった。
上記研究を拡張させることにより、上に記載されたような方法を使用し、ＰｌｙＳｓ２溶解素、ダプトマイシン、バンコマイシンおよびリネゾリドを用いた、バンコマイシン中間感性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＶＩＳＡ）、バンコマイシン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＶＲＳＡ）、リネゾリド耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＬＲＳＡ）およびダプトマイシン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＤＲＳＡ）を含む様々なＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株の試験を含めた。様々な菌株に対して提供されるＰｌｙＳｓ２および様々な抗生物質（ａｎｔｉｂｏｄｙ）の最小阻止濃度（ＭＩＣ）とともに、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのＭＳＳＡ、ＭＲＳＡ、ＶＩＳＡ、ＶＲＳＡ、ＬＲＳＡおよびＤＲＳＡ菌株を用いて行われた研究の作表を上記の表２に提供する。
実施例２
上に示されたように、ＰｌｙＳｓ２溶解素単独は、抗生物質単独よりも迅速に殺滅するが、抗生物質との併用でのＰｌｙＳｓ２の能力または有効性に関する情報は、公知でないし、入手可能でもない。インビトロにおいてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに対するＰｌｙＳｓ２溶解素と抗生物質との併用を評価するために、細菌殺滅研究を行った。
時間殺菌アッセイを、様々な濃度における、ＰｌｙＳｓ２または抗生物質の単独または併用を加えて、いくつかのＭＲＳＡ菌株に対して、上に記載されたように行った。各菌株の培養物（５．５×１０５～１×１０６開始接種材料）を、通気しながら６時間にわたって、ＰｌｙＳｓ２溶解素、抗生物質（ダプトマイシンまたはバンコマイシン）またはＰｌｙＳｓ２と抗生物質との組み合わせで処理した。各場合において、ＭＩＣ未満の用量のＰｌｙＳｓ２および抗生物質を、相乗作用を観察するために使用したところ、併用剤の有効
性が高められた。各菌株に対して増殖コントロールを含め、そのコントロールは、いかなる抗菌剤も存在しない状態での細菌の増殖を表す。１／２ＭＩＣのＰｌｙＳｓ２および１／４ＭＩＣのバンコマイシンを加えた２つのＭＲＳＡ菌株の時間殺菌曲線を図５に示す。これらのＭＩＣ未満の用量において、バンコマイシンまたはＰｌｙＳｓ２は、単独では６時間後まで無効であるかまたは不十分にしか有効でない。１／２ＭＩＣのＰｌｙＳｓ２と１／４ＭＩＣのバンコマイシンとの併用は、６時間以内に、培養中のＭＲＳＡの最大４ｌｏｇの殺滅をもたらす。
１／４ＭＩＣのＰｌｙＳｓ２および１／８ＭＩＣのダプトマイシンを加えた２つのＭＲＳＡ菌株のＬｏｇ殺滅曲線を図６に示す。１／４ＭＩＣのＰｌｙＳｓ２と１／８ＭＩＣのダプトマイシンとの併用は、６時間以内に、培養中のＭＲＳＡのおよそ４ｌｏｇの殺滅をもたらす。図７は、ＭＲＳＡ菌株６５０（Ｏ５２Ｃ Ｔｏｍａｓｚ菌株－１×１０９開始接種材料）に対する、１×ＭＩＣ値のＰｌｙＳｓ２およびダプトマイシンに基づく別の併用研究を示している。１６μｇ／ｍｌのＰｌｙＳｓ２溶解素を加え、１μｇ／ｍｌのダプトマイシンを加える。各単剤の単独は、加えられた濃度において４～５ｌｏｇの殺滅をもたらすが、ＰｌｙＳｓ２とダプトマイシンとの併用は、２時間以内に完全な殺滅（このアッセイの検出限界までのｌｏｇ殺滅）を提供する。
実施例３
併用療法は、薬物が相乗的に作用するとき、特に有効である（Ｃｏｔｔａｒｅｌ Ｇ ＆ Ｗｉｅｒｚｂｏｗｓｋｉ Ｊ（２００７）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５：５４７－５５５）。ＰｌｙＳｓ２と細胞エンベロープに活性な抗生物質との間の相乗作用の評価を、相乗的な抗菌活性をインビトロにおいて調査するために好ましい方法である時間殺菌アッセイによって行った（Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｍら（２００４）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４８：３６９－３７７；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｈａｔ ｇｒｏｗ
ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ，Ｖｏｌ．３２（Ｗａｙｎｅ（ＰＡ）：Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＵＳ），２０１２）。ペニシリンファミリーのメンバーであり、バンコマイシンまたはダプトマイシンのいずれとも異なる様式で細菌を殺滅する抗生物質オキサシリンを用いて、相乗作用研究をさらに調べた。単独または溶解素ＰｌｙＳｓ２の存在下でのオキサシリン研究の結果を図８に示す。臨床ＭＲＳＡ分離菌（図８Ｃ～８Ｆ）またはＭＳＳＡ分離菌（図８Ａ～８Ｂ）に対して、ＭＩＣ未満の濃度のＰｌｙＳｓ２、ダプトマイシン、バンコマイシンおよびオキサシリンを単独または併用で使用して、時間殺菌曲線を作成した。相乗作用は、最も活性な単剤と比較したときの、併用についての、６時間の時点におけるＣＦＵ／ｍＬの≧２ｌｏｇ１０減少と定義された。この基準に基づくと、ＰｌｙＳｓ２は、評価したすべての代表的なＭＲＳＡおよびＭＳＳＡ菌株に対して評価したすべての抗生物質と相乗的に作用した（図４～８を参照のこと）。拡大した分離菌セットを同様に調査したところ、オキサシリン、バンコマイシンおよびダプトマイシンを含む異なる抗生物質と併用されたＰｌｙＳｓ２を用いたとき、ＭＳＳＡについては４９個の解析中４５個において、ＭＲＳＡについては２６個の解析中２４個において、相乗作用が観察された（下記に提供される表７～１１）。
表７
オキサシリンとの相乗作用の時間殺菌の結果（ＭＳＳＡ）
Figure 2022058682000007
 表７～１１に対する凡例：
１ＡＴＣＣ品質管理菌株およびＪＭＩ分離菌の番号が示されている。
２相乗作用時間殺菌実験において使用されたＰｌｙＳｓ２および抗生物質の濃度。値は、範囲調査研究において慎重に決定され、その値は、理想的なレベルのＰｌｙＳｓ２（つまり、増殖コントロールと比べて、約２ｌｏｇ１０の生存率減少がもたらされる）および抗生物質（つまり、増殖コントロールと比べて、＜１ｌｏｇの生存率減少がもたらされる）の最も近くに近似する濃度に相当する。
３ｌｏｇ１０コロニー数の減少（またはΔＬｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬ）は、最も活性な単剤で処理された培養物と比較したときの、薬物の組み合わせで６時間処理された培養物に対して示されている。
４相乗作用は、ＣＬＳＩ２１によって、ＣＦＵ／ｍＬの≧２ｌｏｇ１０の減少と定義される。相加的な相互作用は、ＣＦＵ／ｍＬの＜２ｌｏｇ１０の減少と定義される。
５ｘＭＩＣは、各濃度によって表されるＭＩＣのパーセンテージを表す。例えば、０．５というｘＭＩＣ値は、特定の薬物についての最適な相乗作用濃度が、特定の分離菌または菌株の特定のＭＩＣ値の１／２であることを意味する。ゆえに、ｘＭＩＣ値は、相乗作用時間殺菌アッセイにおいて使用された薬物濃度を、還元剤の非存在下の特定の菌株に対するその薬物のＭＩＣで除算した値である。
略語一覧：ΔＬｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬ＝ｌｏｇ１０コロニー形成単位の変化；ＭＩＣ＝最小阻止濃度。
表８
バンコマイシンとの相乗作用時間殺菌の結果（ＭＳＳＡ）
Figure 2022058682000008
 表９
ダプトマイシンとの相乗作用時間殺菌の結果（ＭＳＳＡ）
Figure 2022058682000009
 表１０
バンコマイシンとの相乗作用時間殺菌の結果（ＭＲＳＡ）
Figure 2022058682000010
 表１１
ダプトマイシンとの相乗作用時間殺菌の結果（ＭＲＳＡ）
Figure 2022058682000011
 実施例４
ブロス微量希釈ＭＩＣ試験を、実施例１について上に記載された方法（ＣＬＳＩ法，ＣＬＳＩ文書Ｍ０７－Ａ９，カラム３２の第２番）に従って９６ウェルパネルを使用して行った。しかしながら、本研究では、ＰｌｙＳｓ２溶解素と抗生物質ダプトマイシンとの両方が、異なる開始濃度で各ウェルに一緒に存在する。１２個の異なるＭＲＳＡ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ菌株を用いて、研究を完了させた。各場合において、まず、その菌株に対するＰｌｙＳｓ２のＭＩＣを決定した。各菌株に対するＤＡＰ ＭＩＣは、公開されている方法に従うブロス微量希釈ＭＩＣ試験に基づき、試験された分離菌に対する公開されていて、入手可能なデータを用いて確認した。５．５×１０５～１×１０６細胞を各ウェルに加え、様々な量のＰｌｙＳｓ２溶解素およびダプトマイシンの存在下、３７℃において２４時間、通気せずに増殖させた。ＭＩＣ値を、目測で決定し、細菌をプレーティングして９６ウェルプレートの各ウェル内の生細胞数を測定することによって確認した。還元剤（例えば、ベータメルカプトエタノール（ＢＭＥ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ））の存在下および非存在下において、培養物を評価した。ＭＩＣ値は、還元剤の存在下では相対的に低く、還元剤ありでは反復性が改善された。
二剤でのＭＩＣ決定。二剤ＭＩＣアッセイは、標準的なブロス微量希釈法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｈａｔ ｇｒｏｗ ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ（２０１２）Ｖｏｌ．３２（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＵＳ），Ｗａｙｎｅ（ＰＡ））に由来する。ＭＩＣアッセイは、１つの薬物をｘ軸にわたって希釈するのに対し、ＭＩＣコンボアッセイは、２つの薬物を一緒にｘ軸にわたって希釈する。２～４枚の９６ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレート（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）を組み合わせることにより、所望の希釈スキームを得る。まず、ＰｌｙＳｓ２を、カラム１において垂直の下向きに２倍希釈して、２，０４８～１μｇ／ｍＬの濃度範囲を得る。次に、ダプトマイシンを一定濃度（４μｇ／ｍＬ）でカラム１の各ウェルに加える。その結果、カラム１のすべてのウェルが、４μｇ／ｍＬダプトマイシンのバックグラウンドに対して、ＰｌｙＳｓ２の希釈範囲を含む。次に、カラム１１のすべてのウェルが０．００３７μｇ／ｍＬのダプトマイシン濃度を有するように、カラム１をｘ軸全体にわたって２倍希釈する。薬物の希釈の後、細胞を加え（約５×１０５ＣＦＵ／ｍＬ）、３５℃、周囲空気において２４時間インキュベーションした後、ＭＩＣを、細菌の増殖を阻害する最も希釈した薬物濃度として記録した。
８つのＭＲＳＡ菌株を用いたときの例示的な結果を、図９～１８に示す。図９～１８の各々において、１２ウェルの２倍希釈の範囲は、各パネルの行に対して右に進む。各パネルは、９６ウェルプレートのウェルを表す。次いで、示されている菌株を各ウェルに接種し、２４時間インキュベートし、その時点において増殖を調査した。網掛けなしのパネルは、薬物の併用によって増殖が阻害されたウェルを示している。黄色の（薄い）網掛けパネルは、増殖を阻害した最も低い薬物併用濃度（本質的にはＭＩＣに対応する）を示している。赤色の（濃い）網掛けパネルは、細菌の増殖を示している（換言すれば、増殖を阻害しなかった作用物質の併用）。還元剤の存在下および非存在下において研究を行った。還元剤有りまたは無しの各場合において、溶解素と抗生物質との両方が併用して提供されたときに必要とされるその両方の量の複数倍の低下（ｍｕｌｔｉ－ｆｏｌｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）を伴う、有意な相乗作用が観察された。必要とされる抗生物質の減少は、溶解素が加えられたとき、特に有意だった。
１２個のＭＲＳＡ菌株を用いた全体的な実験結果を下記の表１２にまとめる。下に示され、図９～１８に示されるように、ＰｌｙＳｓ２と抗生物質（ダプトマイシン）との併用は、相乗的にＰｌｙＳｓ２の有効なＭＩＣを２～４倍減少させ得る。著しいことに、ＰｌｙＳｓ２とダプトマイシンとの併用は、抗生物質ダプトマイシンの有効なＭＩＣの１６～
２５６の感性増加（倍率の低下（ｆｏｌｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ））を相乗的にもたらし得る。
表１２
Figure 2022058682000012
 １「ＭＩＣ単独」の値は、各薬物に対する単剤ＭＩＣ（単位はμｇ／ｍＬ）である。
２「ＭＩＣ併用」の値は、併用されたときに増殖を阻害した各作用物質の最も希釈した濃度（単位はμｇ／ｍＬ）である。
３倍率の低下（感性増加）は、各作用物質に対するＭＩＣ併用／ＭＩＣ単独に対応する。
実施例５
チェッカーボードアッセイを行い、部分阻害濃度指数（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）（ＦＩＣＩ）値を計算することによって、相乗作用のさらなる評価を行った（Ｔａｌｌａｒｉｄａ ＲＪ（２０１２）Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ３４２：２－８）。これらの研究は、例示的な抗生物質ダプトマイシン、バンコマイシンおよびオキサシリンを使用して行った。この評価を使用して、相乗作用は、２つの薬物を一緒に加えることによる、予測される阻害活性より高い阻害活性と定義される（≦０．５のＦＩＣＩ）。ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡ菌株に対する種々の抗生物質の代表的なアイソボログラムを図１９に提供する。２９個のＭＳＳＡ菌株の７９％（ダプトマイシン）、８６％（バンコマイシン）および１００％（オキサシリン）、ならびに２６個のＭＲＳＡ菌株の８９％（ダプトマイシン）および６９％（バンコマイシン）について、相乗作用が観察された。結果を下記の表１３～１５に作表する。
表１３
オキサシリン、バンコマイシンまたはダプトマイシンと併用されたＰｌｙＳｓ２のチェッカーボード解析（ＭＳＳＡ）
Figure 2022058682000013
 略語一覧：ＦＩＣｍｉｎ＝最小部分阻害濃度
表１４
バンコマイシンまたはダプトマイシンと併用されたＰｌｙＳｓ２のチェッカーボード解析（ＭＲＳＡ）
Figure 2022058682000014
 略語一覧：ＦＩＣｍｉｎ＝最小部分阻害濃度
表１５
チェッカーボードアッセイおよび計算されたＦＩＣ値に基づく抗微生物剤とのＰｌｙＳｓ２の相互作用のまとめ
Figure 2022058682000015
 略語一覧：ＦＩＣ＝部分阻害濃度；ＮＡ＝該当なし。
チェッカーボードアッセイでは、薬物相互作用を、各組み合わせについてのＦＩＣｍｉｎに基づいて、相乗作用、相加作用または拮抗作用のいずれかと定義する。薬物についてのＦＩＣは、併用の薬物のＭＩＣを、単独で使用された薬物のＭＩＣで除算したものと定義される。ＦＩＣｍｉｎは、各薬物についてのＦＩＣの合計に基づく。ＦＩＣｍｉｎが≦０．５である場合、その併用は、相乗作用と解釈され；＞０．５～≦２の場合、相加作用と解釈され；＞２の場合、拮抗作用と解釈される。
実施例６
ＰｌｙＳｓ２は、細胞エンベロープへの抗生物質の結合性を増進する
相乗作用研究に対する補完として、ダプトマイシンおよびバンコマイシンの細胞エンベロープ結合性を、ＭＩＣ未満レベルのＣＦ－３０１の存在下および非存在下において、ＢＯＤＩＰＹ－フルオレセイン標識された抗生物質を使用して調査した。ダプトマイシン結合の経時的解析（図２０Ａ）は、ＣＦ－３０１なしの３時間に対して、ＣＦ－３０１（１／３２ＭＩＣ）の存在下においてわずか１５分後に抗生物質の透過を示す。同様に、バンコマイシンによる細胞壁の標識は、ＣＦ－３０１なしの３０分に対して、ＣＦ－３０１（１／８ＭＩＣ）の存在下において５分以内に生じる（図２０Ｂ）。両方の抗生物質について、標識は、最初に、細菌の分裂面において観察された。
実施例７
ダプトマイシンは、肺サーファクタントに強く結合するので、ブドウ球菌性肺炎の処置において有効でない。感受性細菌に対するＰｌｙＳｓ２とダプトマイシンとの併用での有効性を考慮して、上で示されたＰｌｙＳｓ２溶解素およびダプトマイシンを、肺サーファクタントを模倣する商業的に入手可能な界面活性物質の存在下において、単独および併用で評価した。
ＭＲＳＡ菌株ＭＷ２およびＭＳＳＡ菌株ＡＴＣＣ２９２１３をこれらの研究において使用した。まず、ダプトマイシンおよびＰｌｙＳｓ２溶解素を、界面活性物質（Ｓｕｒｖａｎｔａ，Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の存在下において単独で評価した。各菌株に対するダプトマイシンおよびＰｌｙＳｓ２のＭＩＣを、ブロス微量希釈法を使用して、Ｓｕｒｖａｎｔａの存在下において決定した。２倍段階希釈を、０％から最大１５％の範囲の濃度において、界面活性物質の存在下および非存在下において確立した。ＭＩＣを２４時間後に目測でスコア付けし、すべてのウェルにおいてＣＦＵ数によって確認した。ＭＳＳＡ菌株５８１を使用した類似の研究が、Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、２００５（ＪＩＤ，ｖｏｌｕｍｅ １９１，２１４９－５２）によって報告されている。次いで、各界面活性物質濃度におけるダプトマイシンおよびＣＦ３０１についてのＭＩＣの倍率変化（界面活性物質の非存在下において得られたＭＩＣと比較）を計算した。各菌株に対する界面活性物質濃度におけるＭＩＣの倍率変化を図２１に示す。界面活性物質としてのＳｕｒｖａｎｔａの存在下において、ダプトマイシンＭＩＣは、最大２５６倍抑制される。１．２５％の界面活性物質濃度において、ダプトマイシンは、２０倍超抑制される。対照的に、ＰｌｙＳｓ２のＭＩＣは、１．２５～１５％の界面活性物質の範囲にわたって一貫して
、８倍抑制される。
ＰｌｙＳｓ２溶解素とダプトマイシンとの併用の効果を、併用ＭＩＣ研究において、１５％界面活性物質（Ｓｕｒｖａｎｔａ）の存在下で評価した。実験の設定は、界面活性物質なしの併用ＭＩＣ研究について上に記載されたものと類似である（実施例３を参照のこと）。界面活性物質の存在下で相乗作用を評価した結果を図２２に示す。簡潔には、最も左のウェルに示されるＰｌｙＳｓ２溶解素＋ダプトマイシン濃度を、各行の１２ウェルすべてにわたって２倍希釈した。次いで、ＭＲＳＡ菌株２６９（ＭＷ２）細胞（５．５×１０５～１×１０６）を各ウェルに加え、２４時間インキュベートした後、増殖を評価した。網掛けなしのウェルは、増殖の阻害を示している。黄色の（薄い）網掛けウェルは、なおも増殖を阻害する最も希釈した薬物の併用（すなわち、ＭＩＣ）を示している。赤色の（濃い）網掛けウェルは、増殖を可能にする薬物併用を示している。ＰｌｙＳｓ２相乗作用用量は、２μｇ／ｍｌまたは試験された菌株に対するＭＩＣの１／８である。この研究において、ダプトマイシンは、０．２５μｇ／ｍｌまで有効であり、それは、ダプトマイシンの１／１０２４ＭＩＣに対応する。
実施例８
菌血症のマウスモデルにおける併用療法 対 単剤療法
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染に対する、抗生物質との併用でのＰｌｙＳｓ２の効果を、菌血症のマウスモデルにおいてインビボで評価するために動物研究を行った。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、種々のレベルのＭＲＳＡ菌株の接種材料をＩＰ注射し、次いで、その動物に、抗生物質、ＰｌｙＳｓ２溶解素または抗生物質とＰｌｙＳｓ２との組み合わせのいずれかの薬物を投与する。
１０６の細菌の範囲の接種材料を使用する第１セットの研究では、細菌感染の５時間後に単回用量で３５μｇのダプトマイシンを皮下に（ｓｃ）注射した。この用量は、２０グラムのマウスの場合、１．７５ｍｇ／ｋｇ用量のダプトマイシンと等価であるが、マウスにおけるダプトマイシンのヒトで等価な用量は、５０ｍｇ／ｋｇであり得る。マウスにおける１．７５ｍｇ／ｋｇのダプトマイシンの投与は、ヒトで等価な用量の約３．５％と等価である。１５μｇのＰｌｙＳｓ２を、細菌感染の５時間後、９時間後および１３時間後に投与することで、ＰｌｙＳｓ２を１日に３回（ＴＩＤ）ＩＰ注射した（１５μｇは、２０グラムのマウスに対する０．８ｍｇ／ｋｇの用量とほぼ等しい）。その動物をモニターし、感染の２４時間後まで３時間毎に生存パーセントを記録する。１．８×１０６、１．１×１０６、３．０×１０６および３．１×１０６細菌のＭＲＳＡ（菌株２６９またはＭＷ２）用量での動物の生存を評価し、このＭＲＳＡ菌株に対する生存データをまとめたグラフを図２３に提供する。他のＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株（菌株２２０および８３３）を用いて、類似の研究を行ったところ、匹敵する結果だった（図２４～２６）。すべての場合において、動物の生存率は、ＰｌｙＳｓ２溶解素と抗生物質ダプトマイシンとを併用投与することによって、著しく高められた。これらの研究は、ＰｌｙＳｓ２溶解素または抗生物質ダプトマイシンの単独と比較した、ＰｌｙＳｓ２溶解素と抗生物質ダプトマイシンとの併用療法の効能のインビボエビデンスを提供する。
高用量接種研究
標準的治療である抗生物質の効能をＰｌｙＳｓ２がインビボにおいて高める能力を評価するために、マウス菌血症モデルにおいてさらなる動物研究を行った。低チャレンジモデル（４時間後に投与する最大７×１０６ＣＦＵ接種材料）において、単回用量として１．２５ｍｇ／ｋｇ ＰｌｙＳｓ２または２ｍｇ／ｋｇダプトマイシンのいずれかを投与する単剤治療は、７２時間後にそれぞれ１３％および２３％の生存率をもたらした（図２７Ａ）。ＰｌｙＳｓ２とダプトマイシンとを併用すると、７２時間後に７３％の生存率という
有意な増強が観察された（Ｐ＜０．０００１）。ゆえに、ＰｌｙＳｓ２とダプトマイシンとの併用は、低チャレンジ条件下では、各作用物質単独よりも優れていた。
ＰｌｙＳｓ２併用療法がどれくらいロバストであり得るかを試験するために、本発明者らは、ヒトでの使用をシミュレートした用量の単剤抗生物質が不十分にしか効果的でない点まで、細菌の接種材料を増加させた。この高チャレンジモデル（２時間後に投与する１０９ＣＦＵ接種材料）では、ヒトでの使用をシミュレートした用量の、単剤としてのダプトマイシン（毎日１回の５０ｍｇ／ｋｇ）２６またはバンコマイシン（毎日２回の１１０ｍｇ／ｋｇ）２７によって、それぞれ４７％および２０％という２４時間後の生存率、ならびにそれぞれ３１％および３％という７２時間後の生存率が得られた（図２７Ｂおよび２７Ｅ）。単剤として投与されたＰｌｙＳｓ２も同様に、２４および７２時間後にそれぞれ５６／６０％および１８／３％という生存率をもたらした。対照的に、ダプトマイシンまたはバンコマイシンのいずれかと併用されたＰｌｙＳｓ２は、それぞれ、２４時間後に８７％および９３％という２４時間の生存率、ならびに７２時間後に８２％および６７％をもたらしたことから、これらのチャレンジ感染条件下では単剤レジメンよりも併用療法のほうが優れていると実証された。さらなるＰｌｙＳｓ２／ダプトマイシン併用実験を、２つのさらなるＭＲＳＡ菌株を用いて行ったところ、類似の結果が得られた（図２７Ｃおよび２７Ｄ）。接種材料としてＭＳＳＡ菌株を使用して、ＰｌｙＳｓ２をオキサシリンと併用してさらに試験したとき、その併用処置は、やはり、単剤の処置よりも優れていた（図２７Ｆ）。まとめると、それらの結果は、ＰｌｙＳｓ２／抗生物質の併用が、菌血症を処置するためには、単剤レジメンよりも効果的であること、ならびに様々な標準的治療の抗生物質にわたって、および複数のＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株にわたって、統計学的に有意な結果が得られること（すべての場合においてＰ＜０．０００１）を実証している。
溶解素ＰｌｙＳｓ２は、インビボにおいて用量応答性の迅速な殺滅動態を示す
マウス菌血症モデルにおいて、ＰｌｙＳｓ２は、明らかな用量反応を示し、０．２５ｍｇ／ｋｇもの低い用量でも、ｍｏｃｋ注射のコントロールについて観察される生存にまさる生存の増加、および５ｍｇ／ｋｇの用量での有意な保護を示す（データ示さず）。インビボにおいてＰｌｙＳｓ２の殺菌活性の速度を評価するために、ＰｌｙＳｓ２の投与の前後の感染マウスの血液中のＭＲＳＡ ＣＦＵを測定した。５．２５ｍｇ／ｋｇのＰｌｙＳｓ２を感染の２時間後に投与したとき、ＣＦＵの０．５ｌｏｇ１０減少が、１５分で生じ、２ｌｏｇ１０のｌｏｇ減少が、処置の６０分以内に観察されたことから、感染動物の血流中におけるＰｌｙＳｓ２の迅速な殺菌活性が実証された（データ示さず）。
マウス菌血症モデル。
５～７週齢の１６．０～１９．５ｇの体重の雌ＢＡＬＢ／ｃ（近交系）マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅから購入し、すべてのマウス実験において使用した。細菌細胞を６００ｎｍにおいて約０．５の光学濃度まで増殖させることによって、対数期の細菌接種材料を作製し、回収し、洗浄し、１．５×１０７～２×１０９ＣＦＵ／ｍｌに濃縮した。その細菌ペレットを適切な体積の５％（ｗ／ｖ）ムチン（Ｓｉｇｍａ Ｌｏｔ＃ ＳＬＢＤ５６６６ＶまたはＳＬＢＤ５６６６Ｖ）に懸濁して、特定の接種材料を得て、湿った氷上に置いた。５００μＬ（約７．５×１０６～１×１０９ＣＦＵ）をマウスにｉ．ｐ．注射した。その研究薬物用量は、１６０～２００μＬの注射体積で体重に合わせて調整した。感染後の生存を、最初の２４時間は３または６時間毎に、次いで、４８および７２時間後に評価した。１０～２０匹のマウスを含む各処置群を用いて、その実験を２～３回繰り返した。感染性病原体を使用するすべての実験操作をＢＳＬ－２フード内で行った。死亡した動物は、死亡を観察した際に除外した。
実施例９
ＭＲＳＡ菌株ＡＴＣＣ７００６９９およびＭＳＳＡ菌株ＡＴＣＣ２５９２３を用いて連続継代実験を行って、ダプトマイシン耐性を作製し、ダプトマイシン耐性およびＰｌｙＳｓ２溶解素評価した。これらの研究は、ダプトマイシン耐性が溶解素の耐性または感性（ＰｌｙＳｓ２溶解素に対する特定の耐性または感性を含む）と相関するかを評価し、決定するために行った。まず、２１日間のインビトロ増殖にわたって段階的な様式で、ダプトマイシン耐性クローンを作製した（ＭＩＣ値の増加を伴った）。次いで、ＰｌｙＳｓ２溶解素のＭＩＣを評価することによって、その一連のダプトマイシン耐性クローンを溶解素ＭＩＣ値に関して評価した。結果を図２８に示す。ダプトマイシン耐性クローンでは、ダプトマイシンＭＩＣは、１から１８μｇ／ｍＬに上昇する。ＰｌｙＳｓ２溶解素のＭＩＣは、８から２～４μｇ／ｍＬに低下する。これらの研究は、ダプトマイシン耐性が、ＰｌｙＳｓ２溶解素感性と相関することを示している。これらは、ダプトマイシン耐性および溶解素感性を評価した最初の研究である。著しいことに、これらの条件では、ダプトマイシンに対する耐性は、溶解素に対する応答を高め、併用または連続の投与および治療についての論理的根拠を増強した。
実施例１０
連続継代耐性研究を行って、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ感染症を処置するために使用される様々な標準的治療の抗生物質と組み合わせて使用したときにＰｌｙＳｓ２が抗生物質耐性の出現を抑制する能力を評価した。単剤および併用の連続継代実験を行うために使用される方法は、それぞれＰａｌｍｅｒら（Ｐａｌｍｅｒら（２０１１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ５５：３３４５－５６）およびＢｅｒｔｉら（Ｂｅｒｔｉら（２０１２）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ５６：５０４６－５３）に記載されている。抗生物質についてのＭＩＣ値の増加を、抗生物質単独の存在下または抗生物質＋ＭＩＣ未満の値のＰｌｙＳｓ２の存在下のいずれかにおいて増殖させたＭＲＳＡ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ菌株（ＭＷ２）に対して３つ組で評価した。菌株ＭＷ２に対するＰｌｙＳｓ２のＭＩＣは、３２μｇ／ｍｌである（ＤＴＴなし）。したがって、４μｇ／ｍｌ（１／８ＭＩＣに対応）または８μｇ／ｍｌ（１／４ＭＩＣに対応）というＭＩＣ未満の値を、これらの実験のためのＰｌｙＳｓ２の濃度として選択した。ダプトマイシンとバンコマイシンの両方を、この研究において例示的な抗生物質として試験した。
ダプトマイシン実験については、３０日間の研究過程にわたって、ダプトマイシン耐性が、３つすべてのダプトマイシンのみの培養物について有意に増加したことが見出された（図３０）。これらの培養物では、ダプトマイシンＭＩＣ値は、１μｇ／ｍｌという開始値から、１２８、１２８および６４μｇ／ｍｌという３つの終了値に増加した（６４～１２８倍の増加）。ＭＩＣ未満の量のＰｌｙＳｓ２（４μｇ／ｍｌ）＋ダプトマイシンの存在下において継代された培養物については、３０日間の連続継代実験の終わりのダプトマイシンのＭＩＣ値は、有意に低かった（４、４および４μｇ／ｍｌ（４倍の増加））。ゆえに、ＭＩＣ未満の濃度のＰｌｙＳｓ２は、ダプトマイシン単独の条件と比べて、ＭＲＳＡ菌株がダプトマイシン耐性を増加させる能力を８～１６倍抑制した。ダプトマイシンに対する耐性は、ＰｌｙＳｓ２溶解素の存在下では、たった約４倍しか増加しなかった。
バンコマイシン実験については、２５日間の研究過程にわたって、バンコマイシン耐性が、３つすべてのバンコマイシンのみの培養物について有意に高まったことが見出された。これらの培養物では、バンコマイシンＭＩＣ値は、１μｇ／ｍｌという開始値から、１６、１６および１６μｇ／ｍｌという３つの終了値に増加した（１６倍上昇）。ＭＩＣ未満の量のＰｌｙＳｓ２（８μｇ／ｍｌ）＋バンコマイシンの存在下において継代された培
養物については、２５日間の連続継代実験の終わりのバンコマイシンのＭＩＣ値は、有意に低かった（４、４および２μｇ／ｍｌ（２～４倍増加））。ゆえに、ＭＩＣ未満の濃度のＰｌｙＳｓ２は、バンコマイシン単独の条件と比べて、ＭＲＳＡ菌株がバンコマイシン耐性を増加させる能力を４～８倍抑制した。ダプトマイシンに対する耐性は、ＰｌｙＳｓ２溶解素の存在下では、たった約４倍しか増加しなかった。
参考文献
Figure 2022058682000016
Figure 2022058682000017
Figure 2022058682000018
本発明は、その精神または必須の特徴から逸脱することなく、他の形態で具体化されてもよいし、他の方法で行われてもよい。ゆえに、本開示は、すべての態様において、例証するものであって、限定するものではないと見なされるべきであり、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって示され、等価な意味および範囲に入るすべての変更が、その中に包含されると意図される。
様々な参考文献が、本明細書全体にわたって引用されてきたが、それらの各々は、その全体が参照により本明細書中に援用される。

Claims (27)

  1. グラム陽性菌を殺滅する方法であって、該方法は、ＰｌｙＳｓ２溶解素と１つまたは複数の抗生物質との組み合わせと該細菌とを接触させる工程を含み、ここで、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含むグラム陽性菌を抗生物質の存在下で殺滅するのに有効であるために必要とされるＰｌｙＳｓ２の量は、抗生物質の非存在下より有意に少なく、かつ／またはＳ．ａｕｒｅｕｓを含むグラム陽性菌をＰｌｙＳｓ２の存在下で殺滅するのに有効であるために必要とされる抗生物質の量は、ＰｌｙＳｓ２の非存在下より有意に少ない、方法。
  2. Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含むグラム陽性菌をＰｌｙＳｓ２の存在下で殺滅するのに有効であるために必要とされる抗生物質の量が、ＰｌｙＳｓ２の非存在下より有意に少ない、請求項１に記載の方法。
  3. Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含むグラム陽性菌を抗生物質の存在下で殺滅するのに有効であるために必要とされるＰｌｙＳｓ２の量が、抗生物質の非存在下より有意に少ない、請求項１に記載の方法。
  4. 前記ＰｌｙＳｓ２溶解素が、図２９に提供されているアミノ酸配列（配列番号１）、または図２９のポリペプチド（配列番号１）に対して少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性もしくは９９％の同一性を有し、前記抗生物質の存在下で前記グラム陽性菌を殺滅するのに有効である、そのバリアントを含む、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記抗生物質が、バンコマイシンまたは関連抗生物質、リネゾリドまたは 関連抗生物質、ダプトマイシンまたは関連抗生物質およびオキサシリンまたは関連抗生物質のうちの１つまたは複数から選択される、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  6. 前記抗生物質が、ダプトマイシン、バンコマイシン、リネゾリドまたはオキサシリンである、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  7. 抗生物質耐性グラム陽性菌を阻害する方法であって、該方法は、グラム陽性菌を殺滅することができる溶解素および１つまたは複数の抗生物質と該細菌とを接触させる工程を含む、方法。
  8. 前記溶解素が、ＰｌｙＳｓ２である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記溶解素が、図２９に提供されているアミノ酸配列（配列番号１）、または図２９のポリペプチド（配列番号１）に対して少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性もしくは９９％の同一性を有し、グラム陽性菌を殺滅するのに有効である、そのバリアントを含む、請求項７に記載の方法。
  10. 前記細菌が、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓから選択される、請求項７に記載の方法。
  11. 前記細菌が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓである、請求項７に記載の方法。
  12. グラム陽性広域スペクトル抗生物質とグラム陽性菌を殺滅することができる溶解素との組み合わせを投与することによって、該広域スペクトル抗生物質を投与した際の抗生物質耐性の発生を減少させる方法。
  13. 前記抗生物質と前記溶解素の両方が、最小有効量より少ない用量で投与される、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記抗生物質が、推奨用量より低い（ｌｏｗｅｒ ｔｈａｔ）用量で投与される、請求項１２に記載の方法。
  15. 前記溶解素が、図２９に提供されているアミノ酸配列（配列番号１）、または図２９のポリペプチド（配列番号１）に対して少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性もしくは９９％の同一性を有し、グラム陽性菌を殺滅するのに有効である、そのバリアントを含む、請求項１２に記載の方法。
  16. グラム陽性抗生物質（ｇｒａｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ）の有効性を高める方法であって、該方法は、図２９に提供されているアミノ酸配列（配列番号１）、または図２９のポリペプチド（配列番号１）に対して少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性もしくは９９％の同一性を有し、グラム陽性菌を殺滅するのに有効である、そのバリアントを含むＰｌｙＳｓ２溶解素とともに該抗生物質を投与する工程を含み、ここで、該抗生物質は、Ｐｌｙｓｓ２との併用において少なくとも１０倍有効である、方法。
  17. 前記抗体が、ＰｌｙｓＳ２溶解素との併用において少なくとも１６倍有効である、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記抗体が、ＰｌｙｓＳ２溶解素との併用において少なくとも５０倍有効である、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記ＰｌｙＳｓ２溶解素が、抗体との併用において少なくとも２倍有効である、請求項１６に記載の方法。
  20. 前記ＰｌｙＳｓ２溶解素が、抗体との併用において少なくとも４倍有効である、請求項１６に記載の方法。
  21. サーファクタント様活性を有する生物学的流体中のグラム陽性菌に対する抗生物質活性を増強する方法であって、該方法は、図２９に提供されているアミノ酸配列（配列番号１）、または図２９のポリペプチド（配列番号１）に対して少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性もしくは９９％の同一性を有し、グラム陽性菌を殺滅するのに有効である、そのバリアントを含むＰｌｙＳｓ２溶解素と併用して抗生物質を投与する工程を含み、ここで、該抗生物質は、該抗生物質がＰｌｙＳｓ２の非存在下では無効である用量でもＰｌｙＳｓ２との併用において有効である、方法。
  22. 前記抗生物質が、ダプトマイシンまたは関連化合物である、請求項１９に記載の方法。
  23. 前記細菌が、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである、請求項１９または２０に記載の方法。
  24. Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａから選択されるグラム陽性菌を阻害する際に使用するための、ＰｌｙＳｓ２溶解素ポリペプチドおよび１つまたは複数の抗生物質を含む組成物。
  25. 前記抗生物質が、バンコマイシンまたは関連抗生物質、リネゾリドまたは関連抗生物質、オキサシリンまたは関連抗生物質およびダプトマイシンまたは関連抗生物質から選択され
    る、請求項２４に記載の組成物。
  26. 前記抗生物質が、ダプトマイシン、バンコマイシン、オキサシリンまたはリネゾリドである、請求項２４または２５に記載の組成物。
  27. 前記抗生物質の用量が、通常の臨床用量より少なくともＸ倍低い、請求項２４または２５に記載の組成物。
JP2022007043A 2012-05-09 2022-01-20 グラム陽性菌に対するバクテリオファージ溶解素と抗生物質との組み合わせ Pending JP2022058682A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261644944P 2012-05-09 2012-05-09
US61/644,944 2012-05-09
US201261737239P 2012-12-14 2012-12-14
US61/737,239 2012-12-14
JP2019221319A JP2020054370A (ja) 2012-05-09 2019-12-06 グラム陽性菌に対するバクテリオファージ溶解素と抗生物質との組み合わせ

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019221319A Division JP2020054370A (ja) 2012-05-09 2019-12-06 グラム陽性菌に対するバクテリオファージ溶解素と抗生物質との組み合わせ

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022058682A true JP2022058682A (ja) 2022-04-12
JP2022058682A5 JP2022058682A5 (ja) 2023-01-04

Family

ID=49551273

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015511698A Active JP6608697B2 (ja) 2012-05-09 2013-05-09 グラム陽性菌に対するバクテリオファージ溶解素と抗生物質との組み合わせ
JP2018086685A Withdrawn JP2018138045A (ja) 2012-05-09 2018-04-27 グラム陽性菌に対するバクテリオファージ溶解素と抗生物質との組み合わせ
JP2019221319A Pending JP2020054370A (ja) 2012-05-09 2019-12-06 グラム陽性菌に対するバクテリオファージ溶解素と抗生物質との組み合わせ
JP2022007043A Pending JP2022058682A (ja) 2012-05-09 2022-01-20 グラム陽性菌に対するバクテリオファージ溶解素と抗生物質との組み合わせ

Family Applications Before (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015511698A Active JP6608697B2 (ja) 2012-05-09 2013-05-09 グラム陽性菌に対するバクテリオファージ溶解素と抗生物質との組み合わせ
JP2018086685A Withdrawn JP2018138045A (ja) 2012-05-09 2018-04-27 グラム陽性菌に対するバクテリオファージ溶解素と抗生物質との組み合わせ
JP2019221319A Pending JP2020054370A (ja) 2012-05-09 2019-12-06 グラム陽性菌に対するバクテリオファージ溶解素と抗生物質との組み合わせ

Country Status (16)

Country Link
US (5) US10813983B2 (ja)
EP (2) EP2849782B1 (ja)
JP (4) JP6608697B2 (ja)
KR (3) KR20230113404A (ja)
CN (1) CN104736172A (ja)
AU (3) AU2013259512B2 (ja)
BR (1) BR112014027842A2 (ja)
CA (1) CA2872902A1 (ja)
DK (1) DK2849782T3 (ja)
ES (1) ES2784136T3 (ja)
HK (2) HK1208799A1 (ja)
IL (3) IL308477A (ja)
IN (1) IN2014MN02437A (ja)
MX (2) MX2014013586A (ja)
RU (2) RU2018121290A (ja)
WO (1) WO2013170015A1 (ja)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10813983B2 (en) 2012-05-09 2020-10-27 Contrafect Corporation Bacteriophage lysin and antibiotic combinations against gram positive bacteria
KR20230135161A (ko) 2012-05-09 2023-09-22 콘트라펙트 코포레이션 박테리오파지 리신을 이용한 생물막의 예방, 붕괴 및 치료
BR112016030580B1 (pt) * 2014-06-26 2023-12-19 The Rockefeller University Polipeptídeo de lisina e fragmento de polipeptídeo com atividade para matar bactérias gram-negativas
JP2018509415A (ja) * 2015-03-12 2018-04-05 マイクレオス ヒューマン ヘルス ビー．ブイ．Ｍｉｃｒｅｏｓ Ｈｕｍａｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｂ．Ｖ． 細菌感染の治療方法
RU2728682C2 (ru) * 2015-09-17 2020-07-31 Контрафект Корпорейшн Применение лизина для восстановления/увеличения антибактериальной активности антибиотиков в присутствии легочного сурфактанта, который ингибирует указанные антибиотики
KR20190004799A (ko) * 2016-05-12 2019-01-14 콘트라펙트 코포레이션 항균 폴리펩티드의 최소 억제 농도를 평가 및 탐지하기 위한 배지미량희석법
EP3641753B1 (en) * 2017-06-19 2022-09-21 Syddansk Universitet Bacitracin and/or daptomycin combined with cannabidiol for treatment of bacterial infections
CN111295183A (zh) * 2017-07-10 2020-06-16 康特拉费克特公司 裂解蛋白抗菌活性的血液组分强化及其方法和用途
BR112020017219A2 (pt) * 2018-02-26 2020-12-22 Contrafect Corporation Lisinas plyss2 modificadas e usos das mesmas
BR112020026267A2 (pt) * 2018-06-22 2021-04-06 Contrafect Corporation Lisinas e seus derivados resensibilizam novamente staphylococcus aureus e bactérias gram-positivas aos antibióticos
CN109668873B (zh) * 2018-12-05 2021-03-16 山东恒业生物技术有限公司 一种活载体疫苗活性检测装置及其使用方法
CA3127806A1 (en) * 2019-02-05 2020-08-13 Elanco Us Inc. Probiotic compositions comprising lactobacillus reuteri strains and methods of use
AU2020244764A1 (en) * 2019-03-22 2021-10-14 Contrafect Corporation Method of treating infective endocarditis
CA3136461A1 (en) * 2019-04-11 2020-10-15 Contrafect Corporation Method of treating and preventing bone and joint infections
US20230105108A1 (en) * 2019-12-19 2023-04-06 Georgia State University Research Foundation, Inc. Compounds for the treatment of bacterial infections and potentiation of antibiotics
RU2755817C1 (ru) * 2020-07-22 2021-09-21 Федеральное Государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий российской академии наук" Способ снижения грамположительной микрофлоры в кишечнике птицы
KR102528412B1 (ko) * 2020-09-08 2023-05-04 클립스비엔씨 주식회사 신규한 포도상구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2022261360A1 (en) * 2021-06-09 2022-12-15 Contrafect Corporation Plyss2 lysins and variants thereof for use against multidrug resistant gram-positive bacteria
CN115105491B (zh) * 2022-07-08 2023-12-22 东北农业大学 丝氨酸在制备抑制猪链球菌药物中的用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012145573A2 (en) * 2011-04-21 2012-10-26 Universiteit Utrecht Holding Bv Streptococcus bacteriophage lysins for treatment of gram positive bacteria in companion animals and livestock

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU8108587A (en) 1986-10-08 1988-05-06 David Bernstein Method for exposing group a streptococcal antigens and an improved diagnostic test for the identification of group a streptococci
ZA883887B (en) 1987-06-10 1990-02-28 Lilly Co Eli Chromatographic purification process
CA2251724A1 (en) * 1996-04-15 1997-10-23 Paul Averback Compositions containing bacteriophages and methods of using bacteriophages to treat infections
US6254866B1 (en) 1997-10-31 2001-07-03 New Horizons Diagnostics Corporation Use of phage associated lytic enzymes for treating bacterial infections of the digestive tract
US6248324B1 (en) 1997-10-31 2001-06-19 Vincent Fischetti Bacterial phage associated lysing enzymes for treating dermatological infections
US20060292135A1 (en) 1997-10-31 2006-12-28 Lawrence Loomis Use of bacterial phage-associated lysing proteins for preventing and treating bacterial infections in humans, animals and fowl
US6264945B1 (en) 1997-10-31 2001-07-24 Vincent A Fischetti Parenteral use of bacterial phage associated lysing enzymes for the therapeutic treatment of bacterial infections
US5997862A (en) 1997-10-31 1999-12-07 New Horizons Diagnostics Corporation Therapeutic treatment of group A streptococcal infections
KR20020000217A (ko) 1999-02-25 2002-01-05 뉴 호라이즌스 다이아그노스틱스, 인코포레이티드 스트렙토코커스 감염의 예방 및 치료 방법
US6056955A (en) 1999-09-14 2000-05-02 Fischetti; Vincent Topical treatment of streptococcal infections
US6444813B2 (en) 2000-02-02 2002-09-03 Pharmacia & Upjohn Company Linezolid-crystal form II
WO2004027020A2 (en) 2002-05-17 2004-04-01 New Horizons Diagnostics Corporation Identification of a phage associated lytic enzyme to rapidly and specifically detect and kill bacillus anthracis
US7569223B2 (en) 2004-03-22 2009-08-04 The Rockefeller University Phage-associated lytic enzymes for treatment of Streptococcus pneumoniae and related conditions
WO2005089527A2 (en) 2004-03-24 2005-09-29 The Rockefeller University Lytic enzymes and spore surface antigen for detection and treatment of bacillus anthracis bacteria and spores
US8389469B2 (en) 2005-06-06 2013-03-05 The Rockefeller University Bacteriophage lysins for Bacillus anthracis
US7582291B2 (en) 2005-06-30 2009-09-01 The Rockefeller University Bacteriophage lysins for Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium and other bacteria
EP2360248A1 (en) 2005-08-24 2011-08-24 The Rockefeller University Ply-GBS mutant lysins
US20090053149A1 (en) 2007-08-24 2009-02-26 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Surfactant-based antimicrobial solution for inhalation
US8840900B2 (en) 2008-07-03 2014-09-23 The Rockefeller University Chimeric bacteriophage lysin with activity against Staphylococci bacteria
KR101016918B1 (ko) 2009-01-08 2011-02-25 주식회사 인트론바이오테크놀로지 박테리아 특이적 넓은 항균 활성을 갖는 신규한 리신 단백질
EP2539446B1 (en) 2010-01-25 2017-11-01 Alere Scarborough Inc. A25 bacteriophage lysin
WO2012145530A2 (en) * 2011-04-20 2012-10-26 Visa International Service Association Managing electronic tokens in a transaction processing system
AU2012245357B2 (en) 2011-04-21 2017-06-08 The Rockefeller University Streptococcus bacteriophage lysins for detection and treatment of gram positive bacteria
WO2012145693A1 (en) 2011-04-22 2012-10-26 Rks Design, Inc. Instrument retention assembly
EP2702070B1 (en) 2011-04-27 2015-09-30 Lysando AG New antimicrobial agents
KR20230135161A (ko) * 2012-05-09 2023-09-22 콘트라펙트 코포레이션 박테리오파지 리신을 이용한 생물막의 예방, 붕괴 및 치료
US10813983B2 (en) 2012-05-09 2020-10-27 Contrafect Corporation Bacteriophage lysin and antibiotic combinations against gram positive bacteria

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012145573A2 (en) * 2011-04-21 2012-10-26 Universiteit Utrecht Holding Bv Streptococcus bacteriophage lysins for treatment of gram positive bacteria in companion animals and livestock

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, vol. 54, no. 4, JPN6017003982, 2010, pages 1603 - 1612, ISSN: 0005012795 *
JONATHAN EDWARD SHIMITZ: "Expanding the Horizons of Enzybiotic Identification", STUDENT THESES AND DISSERTATIONS, JPN6017003983, 2011, pages 49 - 51, ISSN: 0005012796 *

Also Published As

Publication number Publication date
IL308477A (en) 2024-01-01
KR20210121313A (ko) 2021-10-07
AU2020233683A1 (en) 2020-10-08
AU2018202845A1 (en) 2018-05-10
WO2013170015A1 (en) 2013-11-14
KR102310387B1 (ko) 2021-10-13
EP2849782A1 (en) 2015-03-25
AU2018202845B2 (en) 2020-06-18
MX2014013586A (es) 2015-06-05
IL235527B1 (en) 2023-06-01
ES2784136T3 (es) 2020-09-22
IL235527A0 (en) 2015-01-29
IL235527B2 (en) 2023-10-01
JP2020054370A (ja) 2020-04-09
AU2013259512B2 (en) 2018-01-25
MX2021011843A (es) 2021-10-22
EP2849782A4 (en) 2016-01-20
EP2849782B1 (en) 2020-03-18
CA2872902A1 (en) 2013-11-14
US20130302306A1 (en) 2013-11-14
DK2849782T3 (da) 2020-06-22
RU2018121290A (ru) 2019-03-06
HK1208799A1 (en) 2016-03-18
KR20150035587A (ko) 2015-04-06
US9889181B2 (en) 2018-02-13
JP2015523964A (ja) 2015-08-20
IN2014MN02437A (ja) 2015-07-10
US20150290299A1 (en) 2015-10-15
BR112014027842A2 (pt) 2017-08-08
US20180221456A1 (en) 2018-08-09
CN104736172A (zh) 2015-06-24
IL274832A (en) 2020-07-30
JP2018138045A (ja) 2018-09-06
RU2659208C2 (ru) 2018-06-28
US10813983B2 (en) 2020-10-27
RU2014149351A (ru) 2016-07-10
US20210128696A1 (en) 2021-05-06
JP6608697B2 (ja) 2019-11-20
US20210008175A1 (en) 2021-01-14
EP3685851A1 (en) 2020-07-29
KR20230113404A (ko) 2023-07-28
AU2013259512A1 (en) 2014-12-11
HK1211484A1 (en) 2016-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2022058682A (ja) グラム陽性菌に対するバクテリオファージ溶解素と抗生物質との組み合わせ
JP7368018B2 (ja) バクテリオファージ溶解素によるバイオフィルムの防止、破壊および処置

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220218

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20220218

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20221220

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230314

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20230613

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20230810

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230914

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20231220