BR112016030580B1 - Polipeptídeo de lisina e fragmento de polipeptídeo com atividade para matar bactérias gram-negativas - Google Patents
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Abstract
lisinas de acinetobacter. polipeptídeo de lisina e peptídeos variantes de acinetobacter com atividade para matar bactérias gram-negativas. métodos para tratamento de infecções bacterianas ou colonização bacteriana usando polipeptídeo de lisina de acinetobacter.
Description
[0001] Este pedido PCT reivindica prioridade do pedido de patente US Pedido Provisório N° de série 62 / 017.618, depositado em 26 de junho de 2014, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade.
[0002] Este pedido incorpora por referência na sua totalidade a listagem de sequências intitulada "235932-373399_Sequence_Listing_ST25", (57KB), que foi criada em 24 de junho de 2015, e arquivada eletronicamente em anexo.
[0003] As composições que compreendem uma enzima lítica de bacteriófago específico para Acinetobacter e método para o tratamento de infecções por Acinetobacter.
[0004] O complexo Acinetobacter baumannii-calcoaceticus e outros membros desta espécie frequentemente colonizam a pele humana, sem danos. No entanto, lesões na pele por arranhões, feridas ou cirurgia podem resultar em infecção por Acinetobacter da ferida, sangue, tecidos moles e no sistema nervoso central. Dado que >80% de Acinetobacter sp. são também resistentes a múltiplas drogas (MDR) (pelo menos três classes de antibióticos), estas infecções podem resultar em resultados clínicos adversos, incluindo altas taxas de morbidade e mortalidade, hospitalização prolongada e despesas significativas de saúde. Militares e atletas têm um risco maior de lesões (de abrasões da pele para feridas graves) que seriam suscetíveis à infecção por Acinetobacter spp. Portanto, métodos para removê-las de forma rápida e eficaz reduziriam ou eliminariam complicações posteriores. Surtos causados por Acinetobacter MDR foram relatados em hospitais de todo o mundo; mais recentemente, eles tornaram-se um problema sério em instalações médicas militares. Devido à sua característica MDR (Resistente a Múltiplas Drogas), as infecções por Acinetobacter são difíceis de tratar de modo que infecções por estes organismos geralmente resultam em um mau desfecho. Assim, são necessárias formas novas e melhoradas de controlar este patógeno.
[0005] As cepas de Acinetobacter baumannii resistentes a todos os antibióticos conhecidos têm sido recentemente relatadas. Agindo em sinergia com este perfil de resistência emergente está a incrível capacidade de A. baumannii para sobreviver por longos períodos por todo um ambiente hospitalar, potencializando assim a sua capacidade de disseminação nosocomial. O organismo normalmente tem como alvo indivíduos hospitalizados que estão criticamente doentes com violações na integridade da pele e proteção das vias aéreas. Como tal, a pneumonia adquirida no hospital ainda é a infecção mais comum causada por A. baumannii. Recentemente, no entanto, as infecções que envolvem o sistema nervoso central, pele, tecido mole e ósseo surgiram como altamente problemáticas para certas instituições. Devido a este problema de resistência, devem ser desenvolvidos novos métodos para controlar estes patógenos.
[0006] Foram identificados agentes antimicrobianos conhecidos como lisinas codificadas por bacteriófagos. Os bacteriófagos são vírus que infectam bactérias e estima-se que existem 106 espécies distintas de bacteriófagos. As lisinas de bacteriófagos são geralmente específicas de gênero ou espécie, ou seja, uma lisina de fago de Staphylococcus aureus pode ter atividade apenas contra Staphylococcus aureus fornecendo uma abordagem terapêutica direcionada. Em alguns casos, as lisinas podem ter atividade contra vários gêneros e espécies.
[0007] O bacteriófago infecta suas bactérias hospedeiras para produzir mais partículas de vírus. No final do ciclo reprodutivo elas se deparam com um problema: como liberar o fago de progênie preso no interior da bactéria. Elas resolvem este problema através da produção de uma enzima chamada "lisina" que degrada a parede celular das bactérias infectadas para liberar o fago de progênie. O sistema lítico consiste de uma holina e, pelo menos, uma hidrolase de peptidoglicano, ou lisina, capaz de degradar a parede celular bacteriana. Tipicamente, a holina é expressa nas fases avançadas da infecção do fago que forma um poro na membrana celular, permitindo que a(s) lisina(s) obtenha(m) acesso ao peptidoglicano da parede celular, resultando na liberação de fagos de progênie. Significativamente, as lisinas adicionadas de forma exógena na ausência de uma holina podem lisar a parede celular das células saudáveis, não infectadas, produzindo um fenômeno conhecido como "lise exógena".
[0008] Recentemente, identificamos, purificamos e caracterizamos várias lisinas de fagos que atacam especificamente as bactérias do gênero Acinetobacter. Isto é um avanço revolucionário, visto que a maioria das lisinas tem atividade antibacteriana apenas contra bactérias gram-positivas. As lisinas de fagos purificados da presente invenção são bem adequadas para uma variedade de aplicações, tais como tratamento de infecções bacterianas e desinfecção.
[0009] Figura 1A. Eletromicrografia com coloração negativa mostrando fago induzido a partir da cepa 1790 de A. baumannii.
[0010] Figura 1B. Eletromicrografia com coloração negativa mostrando fago induzido a partir da cepa 1794 de A. baumannii.
[0011] Figura 1C. Eletromicrografia com coloração negativa mostrando fago induzido a partir da cepa 1796 de A. baumannii.
[0012] Figura 2. Uma imagem representativa da atividade de clone de lisina no clareamento de A. baumannii viva embutida no ágar.
[0013] Figura 3. Representação esquemática das sequências de aminoácidos de lisinas clonadas mostrando quatro classes de atividade lítica: i) família glicosil hidrolase, ii) lisozimas de fago da placa de base, iii) autolisinas de lisozima, e iv) lisinas.
[0014] Figura 4. Alinhamento de sequências de nucleotídeos para lisinas clonadas.
[0015] Figura 5. Alinhamento de sequências de aminoácidos de lisinas clonadas.
[0016] Figura 6. É um gráfico que mostra a atividade lítica de 21 construtos clonados contra treze diferentes isolados clínicos de A. baumannii.
[0017] Figura 7A e 7B. Vesiculação da membrana citoplasmática que contém conteúdos citosólicos de células de A. baumannii observadas após o tratamento com F307 (setas).
[0018] Figura 8. Eletromicrografia de varredura de biofilmes de 3 dias de cepa n° 1791 de A. baumannii antes e após tratamento com polipeptídeo F307.
[0019] Figura 9. É um gráfico que mostra a redução nas contagens bacterianas em pedaços inteiros de cateter com biofilme de Acinetobacter após o tratamento com polipeptídeo F307.
[0020] Figura 10. É um gráfico que mostra a sobrevivência de camundongos infectados com A. baumannii tratados com polipeptídeo F307 versus controle.
[0021] Figura 11. Sequência de polipeptídeo F307, P307 sem e com extensão curta (P307Ex).
[0022] Figura 12. A Figura 12A é um gráfico de uma comparação de atividades bactericidas in vitro de P307, P307SQ-8C e P307AE-8 contra cepas n° 1791, S5 e ATCC17978 de A. baumannii. A Figura 12B mostra a atividade bactericida comparativa in vivo de P307, P307SQ-8C e P307CS-8 contra cepas n° 1791 e S5 de A. baumannii. A Figura 12C mostra uma comparação da atividade bactericida in vivo de P307SQ-8C e P307CS-8 contra cepas n° 1791, S5 e ATCC17978 de A. baumannii.
[0023] Figura 13. As atividades bactericidas in vitro de P307 e P307SQ-8C contra cepa n° 1791 de A. baumannii para investigar o pH ótimo (13A) e NaCI ótimo (13B). As mesmas condições, exceto para as variáveis, foram utilizadas com 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5 para determinar a concentração ótima (13C), e a cinética de morte (13D). As barras de erro mostram o desvio padrão e a linha horizontal preta marca o limite de detecção.
[0024] Figura 14. É um gráfico que mostra a sensibilidade de diversas espécies bacterianas para P307 e P307SQ-8C. As barras de erro mostram o desvio padrão e a linha horizontal preta marca o limite de detecção.
[0025] Figura 15. As Figuras 15A e 15B são gráficos que mostram as atividades bactericidas de P307 e P307SQ-8C contra a fase log e fase estacionária da cepa n° 1791 de A. baumannii (15A) e a fase de biofilme (15B).
[0026] Figura 16. A Figura 16 mostra os efeitos citotóxicos de P307 e P307SQ- 8C como determinado pela sobrevivência de células B (16A) e hemólise (16B).
[0027] Figura 17. A Figura 17A mostra o efeito de DTT a 0, 0,1 e 1 mM sobre a atividade de P307 e P307SQ-8C. A Figura 17 B mostra o efeito da substituição do resíduo de cisteína terminal de P307SQ-8C com alanina (P307SQ-8A).
[0028] Figura 18. É um gel de alteração de DNA mostrando a mudança para o peptídeo de controle e P307.
[0029] Figura 19. As Figuras 7 A-C mostram imagens representativas de eletromicroscopia de transmissão de cepa n° 1791 de A. baumanii. controle não tratado (19A), tratada com 300 μg/mL de P307SQ-8C durante 5 minutos (19B) e durante 2 horas (19C). Ampliação, *2600 (esquerda, barra de escala = 2 μm) e *5000 (superior e inferior direita, barra de escala = 0,5 μm). A Figura 7D mostra a atividade bactericida de P307SQ-8C sobre as bactérias gram-negativas K. pneumoniae e E. coli em pH 7,5 e 8,8.
[0030] Figura 20. Mostra a permeabilidade da membrana das cepas n° 1791 e S5 de A. baumannii tratadas com P307 e P307SQ-8C.
[0031] Figura 21. Mostra a inibição da atividade bactericida de P307 ou P307SQ-8C pelo depurador do radical hidroxil, tioureia e condição anaeróbica.
[0032] Figura 22. Mostra o efeito do tratamento de uma infecção de pele com polimixina B e P307SQ-8C.
[0033] A presente invenção fornece polipeptídeos que possuem atividade antibacteriana e métodos para a utilização dos polipeptídeos divulgados. Como utilizado aqui, a forma singular "uma", "um" e "a/o" inclui referências no plural, a menos que o contexto claramente dite de outra forma.
[0034] Termos como "compreende", "composto", "compreendendo", "contém", "contendo" e semelhantes têm o significado atribuído na lei de patentes dos Estados Unidos; eles são inclusivos ou abertos e não excluem elementos não recitados adicionais ou etapas do método. Termos tais como "consistindo essencialmente em" e "consiste essencialmente em" tem o significado atribuído na lei de patentes dos Estados Unidos; eles permitem a inclusão de ingredientes adicionais ou etapas que não afetem materialmente as características básicas e novas da invenção reivindicada. Os termos "consiste em" e "consistindo em" têm o significado atribuído a eles na lei de patentes dos Estados Unidos; ou seja, que estes termos são objetivos.
[0035] Em um primeiro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos que compreendem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, ou pelo menos 91%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 93%, ou pelo menos 94%, ou pelo menos 95 %, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, ou SEQ ID NO: 21, ou um fragmento do polipeptídeo, em que o polipeptídeo ou fragmento tem atividade antibacteriana.
[0036] Em outra modalidade do primeiro aspecto, os polipeptídeos compreendem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, ou SEQ ID NO: 21, ou um fragmento do polipeptídeo, em que o polipeptídeo ou fragmento tem atividade antibacteriana.
[0037] Em ainda outra modalidade do primeiro aspecto, os polipeptídeos compreendem uma sequência de aminoácidos que tem 100% de identidade com SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, ou SEQ ID NO:21, ou um fragmento do polipeptídeo, em que o polipeptídeo ou fragmento tem atividade antibacteriana.
[0038] Em um segundo aspecto, a invenção fornece polipeptídeos que consistem em uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, ou pelo menos 91%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 93%, ou pelo menos 94%, ou pelo menos 95 %, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, ou 100%, de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, ou SEQ ID NO: 21, ou um fragmento do polipeptídeo, em que o polipeptídeo ou fragmento tem atividade antibacteriana.
[0039] Em outra modalidade do segundo aspecto, os polipeptídeos consistem em uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos, 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, ou SEQ ID NO: 21, ou um fragmento do polipeptídeo, em que o polipeptídeo ou fragmento tem atividade antibacteriana.
[0040] Em ainda outra modalidade do segundo aspecto, os polipeptídeos consistem em uma sequência de aminoácidos que tem 100% de identidade com SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, ou SEQ ID NO:21, ou um fragmento do polipeptídeo, em que o polipeptídeo ou fragmento tem atividade antibacteriana.
[0041] Em um terceiro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos que compreendem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, ou pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 91%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 93 %, ou pelo menos 94%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, ou SEQ ID NO: 21, ou um fragmento do polipeptídeo, em que o polipeptídeo ou fragmento é conjugado a um peptídeo antimicrobiano para produzir um polipeptídeo conjugado e o polipeptídeo conjugado tem atividade antibacteriana.
[0042] Em uma modalidade do terceiro aspecto, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 94%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, ou SEQ ID NO: 21, ou um fragmento do polipeptídeo, em que o polipeptídeo ou fragmento é conjugado a um peptídeo antimicrobiano para produzir um polipeptídeo conjugado e o polipeptídeo conjugado tem atividade antibacteriana.
[0043] Em um quarto aspecto, a invenção fornece polipeptídeos que consistem em uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, ou pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 91%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 93 %, ou pelo menos 94%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, ou SEQ ID NO: 21, ou um fragmento do polipeptídeo, em que o polipeptídeo ou fragmento é conjugado a um peptídeo antimicrobiano para produzir um polipeptídeo conjugado e o polipeptídeo conjugado tem atividade antibacteriana.
[0044] Em uma modalidade do quarto aspecto, o polipeptídeo consiste em uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 94%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, ou SEQ ID NO: 21, ou um fragmento do polipeptídeo, em que o polipeptídeo ou fragmento é conjugado a um peptídeo antimicrobiano para produzir um polipeptídeo conjugado e o polipeptídeo conjugado tem atividade antibacteriana.
[0045] Em algumas modalidades do terceiro ou quarto aspecto, o peptídeo antimicrobiano compreende a sequência de aminoácidos SQSRESQC (SEQ ID NO: 44) em que pelo menos um aminoácido é cisteína e 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 aminoácidos do peptídeo antimicrobiano são substituídos de forma conservativa. 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 aminoácidos do peptídeo antimicrobiano são substituídos de forma conservativa. Em outras modalidades do terceiro ou quarto aspectos, o peptídeo antimicrobiano compreende a sequência de aminoácidos SQSRESQC (SEQ ID NO: 44). Em ainda outras modalidades do terceiro ou quarto aspecto, o peptídeo antimicrobiano compreende a sequência de aminoácidos SQSRESQC (SEQ ID NO: 44) em que 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 aminoácidos do peptídeo antimicrobiano são substituídos de forma conservativa e o peptídeo antimicrobiano consiste em 8 aminoácidos. Em ainda outras modalidades do terceiro ou quarto aspecto, o peptídeo antimicrobiano consiste na sequência de aminoácidos SQSRESQC (SEQ ID NO: 44).
[0046] Em algumas modalidades do terceiro ou quarto aspecto, o peptídeo antimicrobiano compreende a sequência de aminoácidos CSQRQSES (SEQ ID NO: 50) em que pelo menos um aminoácido é cisteína e 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 aminoácidos do peptídeo antimicrobiano são substituídos de forma conservativa. Em outras modalidades do terceiro ou quarto aspectos, o peptídeo antimicrobiano compreende a sequência de aminoácidos CSQRQSES (SEQ ID NO: 50). Em ainda outras modalidades do terceiro ou quarto aspecto, o peptídeo antimicrobiano compreende a sequência de aminoácidos CSQRQSES (SEQ ID NO: 50) em que 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 aminoácidos do peptídeo antimicrobiano são substituídos de forma conservativa e o peptídeo antimicrobiano consiste em 8 aminoácidos. Em ainda outras modalidades do terceiro ou quarto aspecto, o peptídeo antimicrobiano consiste na sequência de aminoácidos CSQRQSES (SEQ ID NO: 50).
[0047] Em algumas modalidades do terceiro ou quarto aspecto, o terminal C do polipeptídeo ou o fragmento é conjugado com o peptídeo antimicrobiano. Em outras modalidades do terceiro ou quarto aspecto, o terminal C do polipeptídeo ou o fragmento é conjugado com o terminal N do peptídeo antimicrobiano. Em ainda outras modalidades do terceiro ou quarto aspecto, o terminal N do polipeptídeo ou fragmento é conjugado com o peptídeo antimicrobiano. Em ainda outras modalidades do terceiro ou quarto aspecto, o terminal N do polipeptídeo ou fragmento é conjugado com o terminal C do peptídeo antimicrobiano. Para qualquer das modalidades do terceiro ou quarto aspecto, o peptídeo antimicrobiano pode ser conjugado com o polipeptídeo ou fragmento através de uma ligação peptídica.
[0048] Outras modalidades dos peptídeos da presente invenção é um peptídeo que tem a sequência de aminoácidos NAKDYKGAAAEFPKWNKAGGRVLAGLVKRRKSQSRESQA (SEQ ID NO: 53). Outra modalidade é um peptídeo que tem a sequência de aminoácidos NAKDYKGAAAEFPKWNKAGGRVLAGLVKRRKCSQRQSES (SEQ ID NO: 51).
[0049] Em algumas modalidades, os polipeptídeos, fragmentos de polipeptídeos ou polipeptídeos conjugados têm uma atividade antibacteriana contra uma bactéria gram-negativa. Em algumas modalidades, a bactéria gram-negativa é do gênero Acinetobacter.
[0050] Em algumas modalidades, os polipeptídeos, fragmentos de polipeptídeos ou polipeptídeos conjugados têm atividade antibacteriana contra E. coli, P. aeruginosa e A. baumannii.
[0051] Em algumas modalidades os polipeptídeos, fragmentos de polipeptídeos ou polipeptídeos conjugados possuem uma atividade antibacteriana contra uma bactéria gram-positiva. Em algumas modalidades, a bactéria gram-positiva é S. aureus ou B. anthracis.
[0052] Em algumas modalidades, o polipeptídeo é liofilizado.
[0053] As modalidades específicas dos polipeptídeos da invenção são fornecidas na Tabela 1. Tabela 1
[0054] P307SQ-8C e P307Ex são aqui utilizados intercambiavelmente.
[0055] A invenção também fornece composições farmacêuticas que compreendem os polipeptídeos, fragmentos de polipeptídeo ou polipeptídeos conjugados da invenção. Em algumas modalidades, as composições são composições farmacêuticas que compreendem um transportador, agente de tamponamento ou conservante farmaceuticamente aceitáveis.
[0056] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é formulada para administração tópica. Em outras modalidades, a composição farmacêutica é formulada para distribuição subcutânea. Em ainda outras modalidades, a composição farmacêutica é formulada para distribuição intravenosa. Em ainda outras modalidades, a composição farmacêutica é formulada para a distribuição oral.
[0057] Em algumas modalidades, a composição compreende ainda um antibiótico. Exemplos de antibióticos adequados incluem, mas não estão limitados a, amoxicilina, augmentin, amoxicilina, ampicilina, azlocilina, flucloxacilina, mezlocilina, meticilina, penicilina G, penicilina V, cefalexina, cefazedona, cefuroxima, loracarbef, cemetazole, cefotetano, cefoxitina, ciprofloxacina, levaquina e floxacina, tetraciclina, doxiciclina, minociclina ou, gentamicina, amicacina, tobramicina e, claritromicina, azitromicina, eritromicina, daptomicina, neomicina, canamicina ou estreptomicina.
[0058] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende ainda um agente de coagulação.
[0059] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é liofilizada.
[0060] A presente invenção também fornece métodos para o tratamento de um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica que compreende um polipeptídeo, fragmento de polipeptídeo ou polipeptídeo conjugado da invenção, e um transportador, agente de tamponamento ou conservante farmaceuticamente aceitável.
[0061] Em uma modalidade, o método é um método para tratamento de um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica compreendendo um polipeptídeo da invenção e um transportador, agente de tamponamento ou conservante farmaceuticamente aceitáveis.
[0062] Em outra modalidade, o método é um método para tratamento de um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica compreendendo um fragmento de polipeptídeo da invenção e um transportador, agente de tamponamento ou conservante farmaceuticamente aceitáveis.
[0063] Em uma modalidade, o método é um método para tratamento de um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica que compreende um polipeptídeo conjugado da invenção, e um transportador, agente de tamponamento ou conservante farmaceuticamente aceitáveis.
[0064] Em uma modalidade, o método é um método para o tratamento com uma infecção bacteriana e o tratamento é o tratamento terapêutico, compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica que compreende um polipeptídeo conjugado da invenção e um transportador, agente de tamponamento ou conservante farmaceuticamente aceitáveis. Em algumas modalidades, o indivíduo tem uma infecção bacteriana que é não responsiva a outras modalidades de tratamento. Por exemplo, a infecção bacteriana pode ser resistente a um ou mais antibióticos. Em uma modalidade, a infecção bacteriana é uma infecção de ferida.
[0065] Em uma modalidade, o método é um método de tratar profilaticamente um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica que compreende um polipeptídeo conjugado da invenção e um transportador, agente de tamponamento ou conservante farmaceuticamente aceitáveis. Em algumas modalidades, o indivíduo foi submetido a ou é submetido a uma cirurgia e a ferida cirúrgica é colocada em contato com uma composição farmacêutica da invenção. Em certas modalidades, a ferida cirúrgica é irrigada com a composição farmacêutica antes do fechamento da ferida. Em outras modalidades, a composição farmacêutica é aplicada na ferida após o fechamento, por exemplo, a composição farmacêutica é aplicada na área suturada ou grampeada da ferida.
[0066] Em algumas modalidades, o método compreende a administração de uma composição farmacêutica da invenção que é administrada em combinação com um antibiótico. Em algumas modalidades, o método compreende a administração tópica de uma composição farmacêutica da invenção. Em outras modalidades, o método compreende a administração de uma composição farmacêutica da invenção por via subcutânea. Em ainda outras modalidades, o método compreende a administração de uma composição farmacêutica da presente invenção por injeção intravenosa. Em ainda outras modalidades, o método compreende a administração de uma composição farmacêutica da presente invenção por via oral.
[0067] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica está na forma de uma dosagem unitária. Em outras modalidades, a composição farmacêutica está na forma de um creme, unguento, pomada, gel, pastilha, spray ou aerossol.
[0068] São fornecidos também métodos para tratar uma infecção bacteriana que compreende a inibição da formação de ou interrupção de um biofilme bacteriano, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo de uma composição que compreende um polipeptídeo, fragmento de polipeptídeo ou polipeptídeo conjugado da invenção em uma quantidade eficaz para matar bactérias no biofilme.
[0069] Adicionalmente, são fornecidos métodos de desinfecção de um artigo compreendendo o contato do artigo com uma composição compreendendo um polipeptídeo, fragmento de polipeptídeo ou polipeptídeo conjugado da invenção para o artigo durante um tempo suficiente para desinfetar o artigo. Em algumas modalidades, o artigo é uma superfície dura. Em algumas modalidades, o artigo é uma bancada, teclado, instrumento cirúrgico ou dispositivo médico.
[0070] Adicionalmente, são fornecidos métodos para inibir a formação ou a interrupção de um biofilme bacteriano sobre um artigo, compreendendo o contato do artigo com um polipeptídeo, fragmento de polipeptídeo ou polipeptídeo conjugado da invenção, em uma quantidade eficaz para matar as bactérias no biofilme.
[0071] São fornecidos também artigos de fabricação que contêm uma composição que compreende um polipeptídeo, fragmento de polipeptídeo ou polipeptídeo conjugado da invenção. Em algumas modalidades, o artigo de fabricação é um frasco de spray que contém um polipeptídeo, fragmento de polipeptídeo ou polipeptídeo conjugado da invenção.
[0072] Em algumas modalidades, o artigo de fabricação contém uma composição farmacêutica compreendendo um polipeptídeo, fragmento de polipeptídeo ou polipeptídeo conjugado da invenção e um transportador, agente de tamponamento ou conservante. Em algumas modalidades, o artigo de fabricação é um frasco. Em algumas modalidades, o artigo de fabricação é um dispositivo de distribuição. Em algumas modalidades, a composição contida pelo artigo de fabricação é liofilizada.
[0073] As modificações e alterações podem ser feitas na estrutura dos polipeptídeos da divulgação e ainda obter uma molécula com características semelhantes às do polipeptídeo (por exemplo, um aminoácido de substituição conservativa). Por exemplo, certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos em uma sequência sem perda apreciável de atividade. Uma vez que é a capacidade interativa e a natureza de um polipeptídeo que define a atividade funcional biológica do polipeptídeo, certas substituições de sequências de aminoácidos podem ser feitas na sequência de polipeptideos e, no entanto, obter um polipeptídeo com propriedades semelhantes.
[0074] Tais substituições de aminoácidos são geralmente baseadas na semelhança relativa dos substituintes de cadeia lateral de aminoácido, por exemplo, a sua hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho, e semelhantes. As substituições exemplificativas que levam em consideração várias das características antecedentes são bem conhecidas dos versados na técnica e incluem (resíduo original: substituição exemplificativa): (Ala: Gly, Ser), (Arg: Lys), (Asn: Gln, His), (Asp: Glu, Cys, Ser), (Gln: Asn), (Glu: Asp), (Gli: Ala), (sua: Asn, Gln), (Ile: Leu, Val), (Leu: lie, Vai), (Lys: Arg), (Met: Leu, Tyr), (Ser: Thr), (Thr: Ser), (Tip: Tyr), (Tir: Trp, Phe), e (Val Ile, Leu). As modalidades da presente divulgação contemplam, portanto, equivalentes funcionais ou biológicos de um polipeptídeo como definido acima. Em particular, as modalidades dos polipeptídeos podem incluir variantes com cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90% e 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo de interesse.
[0075] “Identidade”, tal como é conhecido na técnica, é a relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeos, tal como determinado por comparação das sequências. A “Identidade” pode ser facilmente calculada por meio de algoritmos bem conhecidos na técnica. Os métodos preferenciais para determinar identidade são concebidos para dar a maior correspondência entre as sequências testadas. Métodos para determinar identidade estão codificados em programas de computador publicamente disponíveis. A percentagem de identidade entre duas sequências pode ser determinada utilizando um software de análise (por exemplo, Pacote de Software de Análise de Sequências da Genetics Computer Group, Madison Wis.) que incorpora o algoritmo (por exemplo., NBLAST e XBLAST) de Needelman e Wunsch, (J. Mol. Biol., 48: 443-453, 1970).
[0076] A identidade pode ser medida como "identidade local" ou "identidade global". A identidade local refere-se ao grau de relação de sequências entre os polipeptídeos como determinado pela correspondência entre cadeias de tais sequências. A identidade global refere-se ao grau de parentesco de sequência de um polipeptídeo em comparação com o comprimento total de um polipeptídeo de referência. A menos que especificado de outro modo, como aqui utilizado, identidade significa identidade global. As percentagens de identidade global aqui são calculadas utilizando o algoritmo ClustalW utilizado através do software MacVector, utilizando as configurações padrão, tanto para a identidade local como global.
[0077] Os polipeptídeos da presente invenção podem ser produzidos por qualquer método conhecido. Por exemplo, os polipeptídeos podem ser produzidos em bactérias, incluindo, sem limitação, E. coli ou em outro sistema existente para polipeptídeo (por exemplo, Bacillus subtilis, sistemas de expressão de baculovírus utilizando células de Drosophila Sf9, sistemas de expressão de levedura ou fungos filamentosos, sistemas de expressão de células de mamífero) ou podem ser quimicamente sintetizados.
[0078] Se o polipeptídio for produzido em bactérias, por exemplo, E. coli, a molécula de ácido nucleico que codifica o peptídeo pode também codificar uma sequência líder que permita a secreção do peptídeo maduro da célula. Assim, a sequência que codifica o peptídeo pode incluir a pré-sequência e a pró-sequência de, por exemplo, um peptídeo ST bacteriano que ocorre naturalmente. O peptídeo maduro secretado pode ser purificado a partir do meio de cultura.
[0079] A sequência que codifica um peptídeo aqui descrito pode ser inserida em um vetor capaz de distribuir e manter a molécula de ácido nucleico em uma célula bacteriana. A molécula de DNA pode ser inserida em um vetor de replicação de modo autônomo (os vetores adequados incluem, por exemplo, pGEM3Z e pcDNA3, e derivados dos mesmos). O vetor pode ser um vetor de DNA bacteriano ou bacteriófago, tais como o bacteriófago lambda ou M13 e derivados dos mesmos. A construção de um vetor contendo um ácido nucleico descrito neste documento pode ser seguida por transformação de uma célula hospedeira, tal como uma bactéria. Os hospedeiros bacterianos adequados incluem, mas não estão limitados a, E. coli, B subtilis, Pseudomonas, Salmonella. O construto genético também inclui, para além da molécula de ácido nucleico de codificação, elementos que permitem a expressão, tal como um promotor e sequências reguladoras. Os vetores de expressão podem conter sequências de controle de transcrição que controlam a iniciação da transcrição, tais como promotor, potencializador, operador e sequências repressoras. Uma variedade de sequências de controle da transcrição é bem conhecida dos versados na técnica. O vetor de expressão também pode incluir uma sequência reguladora de tradução (por exemplo, uma sequência 5' não traduzida, uma sequência 3' não traduzida, ou um local interno de entrada de ribossomo). O vetor pode ser capaz de replicação autônoma ou pode integrar-se no DNA hospedeiro para assegurar a estabilidade durante a produção do peptídeo.
[0080] Uma modalidade de um ácido nucleico de acordo com a presente invenção é um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, ou SEQ ID NO:21, ou SEQ ID NO:45 ou um fragmento do polipeptídeo, em que o polipeptídeo ou fragmento tem atividade antibacteriana.
[0081] Em outra modalidade, o ácido nucleico codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, ou SEQ ID NO:21, ou SEQ ID NO:45, ou um fragmento do polipeptídeo, em que o polipeptídeo ou fragmento tem atividade antibacteriana.
[0082] Em ainda outra modalidade, o ácido nucleico codifica um polipeptídeo consistindo de um ácido nucleico de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, ou SEQ ID NO:21, ou SEQ ID NO:45 ou um fragmento do polipeptídeo, em que o polipeptídeo ou fragmento tem atividade antibacteriana.
[0083] Em ainda outra modalidade, o ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 42.
[0084] Em ainda outra modalidade, o ácido nucleico consiste na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 42.
[0085] Outra modalidade é um vetor de expressão que compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, ou SEQ ID NO:21 ou SEQ ID NO:45 ou um fragmento do polipeptídeo, em que o polipeptídeo ou fragmento tem atividade antibacteriana.
[0086] Em outra modalidade, o vetor de expressão compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, ou SEQ ID NO:21, ou SEQ ID NO:45, ou um fragmento do polipeptídeo, em que o polipeptídeo ou fragmento tem atividade antibacteriana.
[0087] Em ainda outra modalidade, o vetor de expressão compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo consistindo de um ácido nucleico de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, ou SEQ ID NO:21, ou SEQ ID NO:45 ou um fragmento do polipeptídeo, em que o polipeptídeo ou fragmento tem atividade antibacteriana.
[0088] Em ainda outra modalidade, o vetor de expressão compreende um ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 42.
[0089] Em ainda outra modalidade, o vetor de expressão compreende um ácido nucleico que consiste na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, ou SEQ ID NO: 42.
[0090] A Tabela 2 fornece modalidades específicas dos ácidos nucleicos da invenção que mostra as sequências de nucleotídeos SEQ ID NO: que correspondem aos polipeptídeos que eles codificam. Tabela 2
[0091] O ácido nucleico que codifica um polipeptídeo descrito neste documento também pode ser fundido com um ácido nucleico que codifica um marcador de afinidade de peptídeos, por exemplo, glutationa-S-transferase (GST), proteína de ligação à maltose E, proteína A, marcador FLAG, hexa-histidina, marcador myc ou marcador de influenza HA, de modo a facilitar a purificação. O marcador de afinidade ou fusão relator une a estrutura de leitura do peptídeo de interesse a estrutura de leitura do gene que codifica o marcador de afinidade de modo que uma fusão de tradução é gerada. A expressão do gene de fusão resulta na tradução de um único peptídeo que inclui tanto o peptídeo de interesse como o marcador de afinidade. Em alguns casos em que os marcadores de afinidade são utilizados, a sequência de DNA que codifica um sítio de reconhecimento de protease será fundida entre as estruturas de leitura para o marcador de afinidade e o peptídeo de interesse.
[0092] Os construtos genéticos e métodos adequados para a produção de formas imaturas e maduras dos polipeptídeos e as variantes descritas neste documento em sistemas de expressão de proteínas, exceto bactérias, e bem conhecidos pelos versados na técnica, também podem ser utilizados para produzir polipeptídeos em um sistema biológico.
[0093] Os polipeptídeos e as suas variantes podem ser sintetizados pelo método em fase sólida utilizando um sintetizador de peptídeos automatizado. Por exemplo, o peptídeo pode ser sintetizado em resina deCyc(4-CH2Bxl)-OCH2-4- (oximetil)-fenilacetamidometil utilizando um programa de acoplamento duplo. Os peptídeos também podem ser sintetizados por vários outros métodos, incluindo síntese em fase sólida, utilizando proteção FMOC tradicional (isto é, acoplamento com DCC-HOBT e desproteção com piperidina em DMF).
[0094] Esta invenção fornece métodos de tratamento que compreendem a administração a um sujeito em necessidade dos mesmos de uma quantidade eficaz de um polipeptídeo da invenção. O sujeito é um ser humano ou outro animal, incluindo, mas não se limitando a, primatas tais como macacos e chimpanzés; animais de criação em fazendo, como vacas, porcos, cavalos ou galinhas; e animais de companhia tais como cães, gatos e roedores. Em uma modalidade específica, o sujeito é um ser humano. Em outra modalidade específica, o sujeito é um mamífero não humano. Em uma modalidade, os polipeptídeos são administrados como o único agente antibacteriano. Em outra modalidade, os polipeptídeos são administrados em combinação com um ou mais de outros agentes antibacterianos.
[0095] Os métodos de administração das composições farmacêuticas divulgadas podem ser orais ou parenterais e incluem, mas não estão limitados a, administração intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, intra articular, intra-sinovial, subcutânea, intranasal, epidural, vias tópicas e orais. Os compostos podem ser administrados por qualquer via conveniente, por exemplo, por injeção de infusão ou em bolus, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc.) e podem ser administrados juntamente com outros agentes ativos biologicamente. A administração pode ser local ou sistêmica. Além disso, pode ser desejável introduzir as composições farmacêuticas da invenção no sistema nervoso central por qualquer via apropriada, incluindo intraventricular e injeção intratecal; a injeção intraventricular pode ser facilitada por um cateter intraventricular, por exemplo, ligado a um reservatório, como um reservatório de Ommaya. A administração pulmonar também pode ser utilizada, por exemplo, pelo uso de um nebulizador ou inalador e uma formulação com um agente aerossolização. Em uma modalidade específica, pode ser desejável administrar as composições farmacêuticas da invenção localmente à área com necessidade de tratamento, tais como a utilização tópica sobre a pele; qualquer método adequado conhecido na técnica pode ser utilizado.
[0096] Em um aspecto da invenção, são fornecidas composições farmacêuticas que compreendem os polipeptídeos da presente invenção para o tratamento terapêutico ou profilático de infecções bacterianas. Uma modalidade da invenção é uma composição farmacêutica formulada para tratamento tópico. Outra modalidade da invenção é uma composição farmacêutica formulada para infecções sistêmicas.
[0097] Tais composições compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo da invenção e um transportador, agente de tamponamento ou conservante farmaceuticamente aceitáveis. O termo "transportador farmaceuticamente aceitável" tal como aqui utilizado, inclui, mas não está limitado a, solventes, diluentes ou outro veículo líquido, mecanismos de dispersão ou suspensão, agentes tensioativos, agentes isotônicos, agentes espessantes ou emulsificantes, ligantes sólidos, lubrificantes e semelhantes, conforme adequado para a forma de dosagem específica desejada. Esses transportadores farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, como água e óleos, incluindo os de petróleo, animal, vegetal ou de origem sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e afins. Soluções salinas e soluções de glicerol e dextrose aquosa também podem ser empregadas como líquidos transportadores, particularmente para soluções injetáveis. Excipientes farmacêuticos adequados também incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de sílica, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e similares. A composição pode também conter agentes umidificantes ou emulsionantes, conservantes ou agentes de tamponamento do pH. Estas composições podem tomar a forma de uma solução, suspensão, emulsão, comprimido, pílula, pastilha, cápsula, pó, emplastros para administração tópica e semelhantes. Para aplicações tópicas, as composições farmaceuticamente aceitáveis podem ser formuladas em uma pomada, loção ou creme apropriado que contém o componente ativo suspenso ou dissolvido em uma ou mais transportadores. Os transportadores para administração tópica incluem, mas não estão limitados a, óleo mineral, petrolato líquido, petrolato branco, propilenoglicol, compostos de polioxietileno-polioxipropileno, cera emulsionante, polissorbato 60, cera de ésteres cetílicos, álcool cetearílico, 2-octildodecanol, álcool benzílico e água. A composição pode ser formulada como um supositório com ligantes e transportadores tradicionais tais como triglicerídeos. A formulação oral pode incluir transportadores padrões tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio etc. Um perito na técnica está bem versado na formulação de agentes terapêuticos. Vide , por exemplo, Remington The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Lippincott Williams & White, Baltimore, Md. (2000); Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company, 1995).
[0098] A invenção também fornece um pacote ou kit farmacêutico composto por um ou mais recipientes cheios com um ou mais dos ingredientes das composições farmacêuticas da invenção. Opcionalmente associado a tal(is) recipientes(s) pode estar um aviso na forma prescrita por uma agência governamental que regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, cujo aviso reflete em (a) aprovação pela agência para a fabricação, uso ou venda para administração em seres humanos, (b) direções para uso, ou ambos.
[0099] Os exemplos seguintes são apresentados de modo a fornecer informações adicionais para um versado na técnica de como fazer e utilizar os polipeptídeos descritos neste documento, e não se destinam a limitar o escopo daquilo que os inventores consideram como a sua invenção. Esforços têm sido feitos para garantir a precisão com respeito a números utilizados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros e desvios experimentais devem ser considerados. A menos que indicado de outra forma, o peso molecular é o peso molecular médio e a temperatura é em graus centígrados.
[00100] Identificação de polipeptídeos que têm atividade antibacteriana.
[00101] Quinze isolados clínicos de A. baumannii foram obtidos a partir de um hospital de Nova Iorque. Cepas de A. baumannii foram isoladas e tratadas com mitomicina C para induzir a indução de profago. Os sobrenadantes foram recolhidos e os fagos foram precipitados com polietilenoglicol (PEG). Os sobrenadantes a partir de três dos isolados de A. baumannii foram examinados por coloração negativa EM e imagens do fago foram tiradas (Figuras 1A, 1B e 1C).
[00102] O DNA do fago foi separado a partir de compostos co-precipitados por eletroforese em gel de agarose e extração do DNA de elevado peso molecular. A partir deste DNA, uma biblioteca shotgun de ligante expressável (E-LASL) foi construída conforme descrito anteriormente. (Schmitz JE. et al., 2008, Appl. Environ. Microbiol. 74:1649-1652.) Resumidamente, para todas as amostras, 100 ng de DNA foram fragmentadas com a enzima de restrição TSP509I (sequência de consenso AATT) após a extração com fenol-clorofórmio e precipitação com etanol, o DNA foi ligado a 40 ng de sequência de ligante com uma extremidade 5' complementar (AATTCGGCTCGAG, onde a extremidade é sublinhada (SEQ ID NO: 46). A mistura de ligação foi utilizada como molde para PCR com base em Taq utilizando o iniciador induzido por ligante CCATGACTCGAGCCGAATT (SEQ ID NO: 47).
[00103] As inserções amplificadas foram ligadas ao plasmídeo pBAD induzível por arabinose utilizando o kit de expressão pBAD TOPO® TA; Invitrogen, de acordo com as instruções do fabricante. Os vetores recombinantes foram transformados em E. Coli TOP10 competente (Invitrogen). Para determinar quais clones tinham atividade lítica, E. coli foi colocado em placas sobre ágar LB suplementado com 100 μg/ml de ampicilina e 5% de sangue de ovelha desfibrinado. Após o crescimento durante a noite a 37°C, as placas foram colocadas em um recipiente vedado que foi ligado à saída de um nebulizador comercial. A arabinose nebulizada foi continuamente bombeada para o recipiente durante 1 hora. As placas foram devolvidas a temperatura de 37°C e as colônias foram identificadas como tendo desenvolvido uma zona de hemólise no ágar de sangue circundante. Os clones escolhidos foram semeados em placas de LB-ampicilina separadas (sem arabinose) e deixou-se propagar sem expressão induzida. (Schmitz JE, et al., 2010 Appl. Environ. Microbiol.76:7181-7187).
[00104] Para determinar a atividade de morte por A. baumannii, uma tela secundária foi feita essencialmente como descrita em Schmitz JE, et al., 2010 Appl. Environ. Microbiol.76:7181-7187. Foram riscados acessos como manchas de aproximadamente 1 cm por 2 cm nas placas de LB-ampicilina suplementadas com 0,2% de arabinose. Após a incubação durante a noite a 37°C, as placas foram expostas a vapor de clorofórmio para matar e permeabilizar qualquer E. coli ainda viável. As manchas foram então cobertas com ágar mole fundido contendo A. baumannii e observaram-se as zonas de limpeza. Vinte e um clones positivos foram identificados que exibiram uma zona limpa em torno do clone. A Figura 2 mostra uma tela representativa da atividade do clone de lisina na limpeza de A. baumannii vivo embutido no ágar.
[00105] As inserções dos clones positivos foram sequenciadas e comparadas com as sequências na base de dados de proteínas NCBI. Os alinhamentos mostraram que entre os 21 clones existem quatro classes de atividade lítica: i) nove estavam na família glicosil hidrolase, ii) sete eram lisozimas de fago placa de base, iii) dois eram autolisinas de lisozima, e iv) três eram lisinas. (Fig. 3). Para facilidade de referência deste documento, independentemente da classe, os polipeptídeos codificados por estas sequências são mencionados como "lisinas". A Figura 4 mostra um alinhamento de sequências com base na semelhança das sequências de nucleotídeos que codificam os 21 clones. A Figura 5 mostra um alinhamento de sequências com base na semelhança das sequências polipeptídicas dos 21 clones.
[00106] Atividade dos clones positivos.
[00107] Vinte e um construtos diferentes foram triados quanto à atividade contra treze isolados clínicos diferentes de A. baumannii. Os construtos foram expressos de forma recombinante em E. coli. As células foram cultivadas a 30°C a 200 rpm e quando atingiram a fase mid-log foram induzidas pela adição de 0,2% de arabinose. A indução prosseguiu durante a noite. Na manhã seguinte, as células foram centrifugadas, lavadas 3x com 50 mM de tampão de fosfato de sódio com pH 7,0, antes de serem homogeneizadas em um homogeneizador Emulsiflex. Os detritos celulares foram removidos por centrifugação (16000 g, 45 min) e o lisado passado através de um filtro estéril de 0,22 um para gerar o lisado bruto.
[00108] A. baumannii crescidos durante a noite em TSB foram misturados em ágar mole TSB a 50°C e vertidos sobre uma placa de ágar TSB como uma camada de ágar de topo. A placa foi deixada para solidificar em temperatura ambiente. Os lisados brutos (10 ul) foram adicionados a uma placa com ágar mole com A. baumannii e incubados durante 2 horas à temperatura ambiente em cada dia, ao mesmo tempo em que eram mantidos a 4°C durante o restante do tempo. As placas foram incubadas até que as zonas de limpeza ficaram visíveis (4-5 dias). Uma zona de limpeza maior do que o local original do lisado bruto foi marcada. O número sobre cada lisina indica quantas das manchas para quais lisinas foram as mais eficientes.
[00109] Os resultados são mostrados na Figura 6. O construto de lisina é mostrado no eixo de x e a percentagem de cepas lisadas de Acinetobacter é mostrada no eixo de y. Os números acima de cada barra indicam o número de cepas para quais a lisina foi a mais eficiente, sendo que nenhum número indica uma cepa. Como pode ser visto, a Lisina F307 lisou cerca de 90% das cepas ensaiadas e foi a mais ativa contra sete cepas.
[00110] Lise de A. baumannii por F307.
[00111] A Figura 7 mostra Eletromicrografias de Transmissão representativas de células n° 1791 de cepa de A. baumannii após o tratamento com o polipeptídeo F307. As micrografias mostram que F307 causou a lise através da extrusão da membrana citoplasmática para o exterior da célula. (Ver Figura 7, setas). Duas culturas de 100 mL de n° 1791 de cepa de A. baumannii foram iniciadas em meio de BHI e cultivadas em um frasco de 500 ml, durante 1,5 h a 37°C, 200 rpm. As células foram então centrifugadas e lavadas uma vez com tampão 1X PBS. Em seguida, elas foram ressuspensas em 1,2 mL de 1X PBS. EDTA a uma concentração final de 250 μM foi adicionado em cada amostra. Para a amostra experimental, 300 μL de lisina (~1,2 mg de concentração final) e incubou-se o controle (EDTA sozinho) e experimental (lisina EDTA+F307) a 25°C. Os pontos de tempo foram medidos em 0,5, 1, 5, 10, 15, e 30 minutos. As reações foram paradas e as células foram fixadas utilizando 2,5% de Glutaraldeído em tampão de CAC (cacodilato de sódio 10 mM, CaCl2 0,1 m, pH 6,5).
[00112] Efeito do polipeptídeo F307 sobre biofilmes de A. baumannii em cateteres in vitro e in vivo.
[00113] Tratamento in vitro de A. baumannii n° 1791 aderente a cateter com lisina F307
[00114] A tubagem do cateter (CareFusion Ref#72023E) foi cortada com um bisturi estéril em seções longas de 3 polegadas. Uma cultura realizada durante a noite de A. baumannii n° 1791 foi utilizada para inocular 1:1000 a 50 ml de TSB 0,2% de Glicose (~1x105 CFU/mL). Cada tubo de cateter de 3 polegadas foi semeado com 300-350 μL de cultura diluída 1:1000. Os cateteres foram então fixados e colocada em recipientes de plástico em uma incubadora a 37°C durante 3 dias para permitir a formação de biofilme. Após 3 dias, os cateteres foram lavados duas vezes com PBS ou tampão de Fosfato de Sódio com pH 7,5 e, em seguida, obteve- se 300-350 μL de F307 adicionados ao tubo (~ 1 mg de concentração final). Os cateteres foram então apertados. Os cateteres foram retirados nos pontos de tempo 0, 15 minutos, 30 minutos e 1 hora. Os cateteres foram lavados duas vezes com 50 mM de Fosfato de Sódio com pH 7,5 e foram cortados em pequenos pedaços. Estes foram colocados em um tubo ependorff de 1,5 mL e 500 μL de tampão NaP 50 mM com pH 7,5 foi adicionado. Os tubos foram passados em sonicação durante 20 minutos e agitados em vórtice durante 1 minuto. As amostras foram então diluídas em série e 20 μL foram plaqueadas em um quadrante de uma placa de ágar BHI e incubadas durante a noite a 37°C. CFUs foram calculados na manhã seguinte.
[00115] Uma queda aproximada de 4-log no número de unidades formadoras de colônias (CFUs de A. baumannii foram observados após 30 minutos de tratamento. A Tabela 3 mostra as contagens de CFU. A Figura 8 mostra Eletromicrografias de Varredura de biofilmes com 3 dias de cepa n° 1791 de A. baumannii antes e após o tratamento com 250 μg de polipeptídeo F307. Tabela 3. Tratamento de biofilmes de A. baumannii em cateteres.
[00116] Modelo de Cateter de Camundongo: Várias seções de 3 polegadas de tubagem de cateter foram semeadas (1:1000), com cepa n° 1791 de A. baumannii. Os biofilmes de A. baumannii foram formados conforme descrito acima. Os pelos da parte posterior de vinte camundongos BALB/C foram retirados, as costas foram esterilizadas e, em seguida, foi feita uma incisão para colocar uma seção de 1 polegada do cateter com um biofilme já formado sob a derme da parte posterior. As incisões foram fechadas. Após 24 horas, 250 μl de F307 (1 mg) (n=10) ou 250 μl de veículo de controle (n=10) foram injetados diretamente no interior do cateter que estava sob a derme do camundongo. O tratamento foi repetido após 4 horas. Após 3 horas, os cateteres foram removidos dos camundongos e ensaiados conforme descrito no Experimento 4. A Figura 9 mostra a redução das contagens bacterianas em aproximadamente 2-logs de tratamento de camundongos com polipeptídeo F307 em comparação com o controle.
[00117] O polipeptídeo F307 previne a morte dos camundongos após uma injeção letal de A. baumannii.
[00118] Vinte e dois camundongos C57BL/6 receberam 108 CFU de cepa de A. baumannii por via intraperitoneal (IP). Duas horas mais tarde, dois camundongos foram sacrificados e o exame dos órgãos foi feito conforme descrito abaixo, dez camundongos receberam injeção de IP com 1 mg de F307 e dez camundongos receberam injeção de IP com veículo de controle. Os animais tratados apresentaram sobrevivência de 50% com esta dose de lisina, enquanto que os camundongos de controle apresentavam apenas 10% de sobrevivência 14 dias após a infecção (Figura 10).
[00119] Os órgãos de dois camundongos que foram sacrificados após a infecção foram examinados para confirmar que os órgãos foram infectados com A. baumannii no momento do tratamento com o polipeptídeo F307. Fígado, baço, rim e coração foram dissecados a partir dos camundongos. Os órgãos foram em seguida homogeneizados em 500 μl de 1X PBS. As diluições foram feitas e foram plaqueadas em placas de infusão de cérebro e coração (BHI). As placas foram incubadas a 37°C durante a noite. O número de unidades formadoras de colônias foi contado. Os camundongos de controle foram sacrificados no ponto de tempo de duas horas e exibiram Acinetobacter em todos os órgãos examinados indicando que os órgãos foram infectados com A. baumannii no momento do tratamento.
[00120] O polipeptídeo P307 (SEQ ID NO: 43) foi testado em duplicata contra 18 isolados clínicos de cepas de A. baumannii. As cepas de A. baumannii foram cultivadas ATIVAS para chegar a fase estacionária. As células foram lavadas 3x em Tris 20 mM, pH 7,5, e ressuspensas no mesmo tampão a uma OD (595 nm) de cerca de 0,7. Para estas células, P307 (250 ug/ml) ou um volume correspondente de tampão, foi adicionado, e a mistura foi deixada para incubar durante 60 minutos à temperatura ambiente. As diluições das misturas foram feitas e plaqueadas em placas de ágar TSB para subsequente contagem de unidades formadoras de colônias.
[00121] O tratamento com polipeptídeo P307 resultou em uma queda de 1 a 8- log na viabilidade bacteriana, versus controle, após incubação durante 60 minutos com 250 μg de P307. Os resultados são mostrados na Tabela 4. Quando P307 foi comparado com o polipeptídeo F307 de comprimento completo (SEQ ID NO: 1) o polipeptídeo P307 tinha uma atividade mais elevada. Tabela 4. Atividade de P307 contra 18 cepas de A. baumannii.
[00122] A adição de um peptídeo de extensão curta resultou num aumento da atividade antibacteriana de P307.
[00123] O peptídeo SQSRESQC (SEQ ID NO: 44) é derivado do vírus da hepatite C e tem demonstrado possuir uma atividade antimicrobiana contra bactérias gram-positivas e gram-negativas. Conjugamos esta sequência para P307 (P307Ex) para determinar o seu efeito sobre a atividade. A sequência de F307, P307 e a P307Ex (SEQ ID NOS: 1, 43 e 45, respectivamente) são fornecidas na Figura 11, onde uma porção da sequência de F307 está sublinhada para mostrar a localização de P307 e uma porção da sequência de P307 é sublinhada duplamente para mostrar a localização da sequência antimicrobiana.
[00124] P307 e P307Ex foram testados em duplicata contra seis cepas bacterianas. A acidez antibacteriana foi medida como descrito no Exemplo 5. O tratamento com P307Ex resultou em uma queda de 3,2 log em A. baumannii n° 1791 enquanto que o tratamento com P307 resultou em uma queda de 2,9 log demonstrando que a adição do peptídeo antimicrobiano aumentou a atividade de P307. Os resultados são mostrados na tabela 5. Tabela 5
[00125] P307 e P307Ex foram testados para a atividade contra cepa n° 1791 de A. baumannii, cepa PAO1 de E. coli, P. aeruginosa, cepa RN4220 de S. aureus, cepa 8325 de S. aureus e B. anthracis. Conforme mostrado na Tabela 6, P307 e P307 eram mais ativos contra A. baumannii e B. anthracis. Tabela 6. P307 e P307Ex contra outras espécies bacterianas.
[00126] P307 não é tóxico para as células B ou células vermelhas do sangue.
[00127] P307 foi misturado com as células vermelhas do sangue para determinar se ele iria causar lise. Não foi observada a lise em 200 μg de P307. Quando P307 foi testado para a lise de uma linha de células B, verificou-se ter somente um ligeiro efeito no número de células após 24 horas. Os resultados são mostrados na Tabela 7. Tabela 7 (% viável)
[00128] Os peptídeos utilizados nos Exemplos 10-20 foram sintetizados quimicamente.
[00129] Os peptídeos foram criados utilizando um sintetizador de peptídeos da Protein Technologies SymphonyTM (PTI Tucson, Arizona, EUA) sobre resina de Wang pré-acoplada (álcool p-alcoxi-benzil)(Bachem, Torrance, CA, EUA). Os recipientes de reação foram carregados em 25 μM e os peptídeos foram alongados utilizando aminoácidos protegidos por Fmoc (Anaspec, San Jose, CA, EUA) (1997. Standard Fmoc protocols. 289:44-67). A desproteção da amina foi realizada com piperidina a 20% (Sigma-Aldrich) em NMP (N-metilpirrolidinona). As reações de acoplamento repetitivas foram realizadas utilizando 0,6 M de HATU/Cl-HOBT (azabenzotriazol tetrametilurônio/6-cloro-1-hidroxibenzotriazol) (P3 Biosystems, Shelbyville, KY, EUA) e 0,4 M de NMM (N-metilmorfolina) utilizando NMP (EMD) como solvente primário (1989. New Coupling Reagents in Peptide Chemistry 30:1927-1930.). A clivagem da resina e desproteção da cadeia lateral foram obtidas através da transferência para um frasco de fundo redondo de 100 ml e reagidas com 4,0 ml da solução concentrada, de grau de sequenciação, ácido trifluoroacético (Fisher) com triisopropilsilano (Fluka), água degaseificada, e 3,6- dioxa-1,8-octaneditiol (Dodt, Sigma-Aldrich) em uma proporção de 95:2:2:1 ao longo de um período de tempo de 6 horas. Isto foi seguido por filtração da coluna em um balão de fundo redondo de 50 ml e o volume de TFA reduzido para 2 ml utilizando um evaporador rotativo. Uma precipitação com éter padrão foi realizada nos peptídeos individuais através da transferência para um tubo Falcon de 50 ml contendo 40 ml de éter metil terc-butílico frio (TBME, Sigma-Aldrich). As amostras foram colocadas em um banho de gelo durante 2 horas para auxiliar a precipitação, seguido de formação de peletes utilizando centrifugação (3300 rpm, 5 min). Éter em excesso foi removido por aspiração a vácuo e os sedimentos de peptídeos foram deixados a secar durante uma noite em uma capela. Os peletes de peptídeos secos foram resolvidos em 20% de acetonitril e 10 ml de água de grau HPLC, subamostrados por LC/MS e liofilizados. Todos os produtos brutos foram posteriormente analisados Aquity™ UPLC de fase reversa (Waters Chromatography, Milford, MA, EUA) utilizando uma coluna Waters BEH C18. A integridade individual dos peptídeos foi verificada por espectrometria de massa por ionização em eletrospray em tandem utilizando um sistema de espectrômetro ThermoFinnigan LTQ™ (Thermo Fisher, Waltham, MA, EUA). A cromatografia preparativa foi realizada em uma coluna preparativa Vydac C18 RP em HPLC de Waters Prep 600. As frações individuais foram recolhidas em intervalos de 30 segundos, caracterizadas por LC/MS e as fracções contendo o produto desejado foram liofilizadas. Estas foram armazenadas a -20°C até serem ressuspensas em água Milli-Q autoclavada para vários ensaios. As soluções de reserva foram então armazenadas a 4°C. Os peptídeos estão resumidos com as suas sequências de aminoácidos, os pontos isoelétricos (pl) e pesos moleculares (PM) na tabela 8. Tabela 8
[00130] Comparação de atividades bactericidas in vitro dos peptídeos da presente divulgação.
[00131] Para determinar as atividades bactericidas in vitro dos peptídeos, P307, P307AE-8, P307SQ-8C, e P307CS-8, as bactérias foram tratadas com os peptídeos durante 2 horas a temperatura ambiente. As células sobreviventes foram diluídas seriadamente e plaqueadas em placas ágar TSB para determinar a atividade.
[00132] As atividades bactericidas de 50 μg/mL dos peptídeos, P307, P307AE- 8 e P307SQ-8C foram comparadas por tratamento de cepas n° 1791, S5 e ATCC17978 de A. baumannii. P307SQ-8C foi o mais ativo, reduzindo cerca de 106 cfu/ml de bactérias para abaixo do limite de detecção (<10 cfu/ml). P307 foi ligeiramente mais ativo do que P307AE-8, mas ambos os peptídeos induziram uma diminuição de cerca de 3,8 log-unidade em bactérias viáveis (Fig. 2A). Para investigar como os oito aminoácidos, SQSRESQC, contribuíram para a atividade mais elevada de P307SQ-8C, a mesma concentração molar do peptídeo SQSRESQC como 50 μg/ml P307 foi adicionada por si só ou em combinação com a P307 em cepas n° 1791 e S5 de A. baumannii. As atividades foram comparadas com 50 μg/mL de P307 e P307SQ-8C. A combinação foi apenas tão ativa como P307, enquanto que o peptídeo SQSRESQC sozinho não tem atividade (Fig. 2B). Por isso, a ligação é essencial para a alta atividade bactericida de P307SQ-8C. Em seguida, investigamos a importância da sequência e composição. Por misturar os últimos oito aminoácidos em P307SQ-8C, sintetizamos P307CS-8 com uma adição de terminal C de CSQRQSES para P307. As atividades de P307SQ-8C e P307CS- 8 foram comparáveis (Fig. 2C). As barras de erro mostram o desvio padrão e a linha horizontal preta marca o limite de detecção. Assim, concluímos que a atividade superior do P307SQ-8C deriva a partir da composição dos últimos oito aminoácidos, independentemente da ordem dos últimos oito aminoácidos. Para uma investigação mais aprofundada, utilizamos P307SQ-8C porque é o mais ativo e comparamos a sua atividade com P307.
[00133] Atividades bactericidas de P307 e P307SQ-8C
[00134] Os efeitos do pH e da salinidade sobre as atividades in vitro P307 e P307SQ-8C foram investigados. A cepa n° 1791 de A. baumannii foi tratada com 50 μg/ml de peptídeos para testar cada condição. Dois sistemas de tampão (fosfato de sódio e de Tris-HCl) foram utilizados para testar o pH 6,8, 7,5, 8,0 e 8,8. Os peptídeos eram mais ativos em Tris-HCl e o pH mais elevado provocou melhor morte (Fig. 13A). Assim, decidimos por continuar os nossos experimentos in vitro com Tris-HCl a 50 mM, pH 7,5, que se aproxima do pH fisiológico. As atividades de ambos os peptídeos foram inversamente proporcionais à concentração de NaCl (Fig. 13B). Em seguida, a titulação de P307 e a cinética de morte de P307 e P307SQ-8C foram investigadas pelo tratamento da cepa n° 1791 de A. baumannii. A atividade de P307 foi dependente da concentração, a partir de 4 μg/ml (Fig. 13C). P307SQ-8C agiu mais rápido do que P307, resultando em diminuição de cerca de 3,2 log-unidade já no ponto de tempo de 5 minutos (Fig. 13D). Não houve diferença nas atividades de qualquer um dos peptídeos à temperatura ambiente ou a 37°C (dados não apresentados). A partir destes experimentos de caracterização in vitro, decidimos nossas condições experimentais ótimas como sendo 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 50μg/mL de peptídeos e 2 horas à temperatura ambiente (22-25°C), salvo indicação em contrário.
[00135] Em seguida, investigamos os espectros bactericidas in vitro de P307 e P307SQ-8C contra diferentes espécies bacterianas, A. baumannii (tensão N° 1775, 1776, 1777, 1788, 1789, 1790, 1791, 1792, 1793, 1794, 1796, 1797, 1798, 1799, ATCC 17978 e S1, S3, D5), Bacillus anthracis (ΔSterne), Escherichia coli (DH5α), Pseudomonas aeruginosa (PA01), Staphylococcus aureus (RN4220) e duas cepas de Klebsiella pneumonia (ATCC 700603 e ATCC10031). Estas espécies bacterianas foram tratadas com 50 μg/mL de P307 ou P307SQ-8C em Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 a durante 2 horas à temperatura ambiente para investigar a especificidade dos peptídeos. Entre as bactérias testadas, as cepas de A. baumannii foram consistentemente mais sensíveis aos peptídeos, mostrando uma média de 2,7- e 6,2-log-unidade de diminuição com P307 e P307SQ-8C, respectivamente. Bacillus anthracis, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus são moderadamente sensíveis. P307 e P307SQ-8C produziram uma média de cerca de 1.3- e 2,9-log unidade de diminuição, respectivamente, para essas bactérias. No entanto, Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae são resistentes a ambos os peptídeos (Fig. 14).
[00136] Além disso, para investigar as atividades dos peptídeos contra A. baumannii em diferentes fases de crescimento, comparamos as sensibilidades da cepa n° 1791 na fase log, fase estacionária e estado do biofilme. As bactérias em fase log (3 horas após a inoculação de 1:100 de cultura durante a noite em meio fresco) e fase estacionária (cultura durante a noite) foram tratadas com 50 μg/mL de P307 ou P307SQ-8C durante 2 horas à temperatura ambiente. As células sobreviventes foram diluídas seriadamente e plaqueadas em placas de ágar TSB para determinar cfu/mL. (Figura 15A). Os biofilmes de A. baumannii foram estabelecidos através da incubação de cerca de 105 cfu/mL de cepa n° 1791 em TSB com 0,2% de glicose dentro de cerca de cateteres de 2,5 cm de comprimento durante 72 horas a 37 °C. Os cateteres foram então lavados para remover as células planctônicas e tratados com 250 μg/mL de P307 ou P307SQ-8C. Após 2 horas e 24 horas à temperatura ambiente, o biofilme foi cuidadosamente interrompido e as células sobreviventes foram ressuspensas para serem plaqueadas e contadas para determinar a eficiência de morte dos peptídeos contra o biofilme in vitro. (Figura 15B) Os organismos em fase log foram ligeiramente mais sensíveis a P307 do que na fase estacionária (redução de cerca de 3.7- contra 2,4- log-unidade). Não parece haver nenhuma diferença com P307SQ-8C (Figura 15A). Os biofilmes foram os mais resistentes de todas as fases de crescimento. Os biofilmes foram tratados com 250 μg/ml de P307 ou P307SQ-8C durante 2 ou 24 horas. Depois de 2 horas, uma redução de cerca de 3- e 4-log-unidade em cfu/ml foi observada com P307 e P307SQ-8C, respectivamente. Após 24 horas, P307 produziu uma diminuição adicional de cerca de 1,3-log-unidade, enquanto que P307SQ-8C não produziu tal diminuição (figura 15B).
[00137] A fim de comparar a eficácia dos peptídeos P307 e P307SQ-8C com alguns antibióticos utilizados clinicamente, realizamos um ensaio de concentração inibitória mínima para cepas de A. baumannii cepas, n° 1791 e ATCC17978. O método de diluição de microtitulação foi utilizado para determinar as MICs de levofloxacina, ceftazidima, polimixina B, P307 e P307SQ-8C para as cepas n° 1791, 1798, S5 e ATCC17978 de A. baumannii. Para os antibióticos, diluições em série de 1,5-2 drobras (três menores e três maiores) dos MICs determinadas pelo Etest Lood R, et al., 2015 Antimicrob. Agents Chemother. 59:1983-1991.) foram incluídas. Para os peptídeos, diluições em série de duas dobras (500-31,25 μg/ml) foram testadas. As culturas durante a noite foram ressuspensas a OD600 de 0,001 (cerca de 105 cfu/mL) em caldo de Mueller-Hinton (pH 7,9). Os antibióticos ou peptídeos foram adicionados a um volume final de 100 μL para cada diluição. As bactérias foram deixadas crescer a 37°C durante 24 horas a 220 rpm. A absorvância a 595 nm foi então lida em um Leitor SpectraMax Plus (Molecular Devices). As MICs foram determinadas como as concentrações mais baixas de agentes antimicrobianos que inibem completamente o crescimento bacteriano. Alamar®Blue foi utilizado para confirmar os dados obtidos a partir de OD595. Os experimentos foram realizados pelo menos duas vezes em duplicata.
[00138] As cepas exibiram vários graus de sensibilidade para todos os agentes antimicrobianos (Tabela 9). Tabela 9
[00139] P307SQ-8C tem uma MIC inferior a P307, o que está em conformidade com a atividade de morte in vitro (Fig. 2 e 3).
[00140] Efeitos citotóxicos de P307 e P307SQ-8C conforme medidos pela sobrevivência de células B e hemólise.
[00141] As células B humanas obtidas a partir de um paciente com febre reumática no Hospital da Universidade Rockefeller foram cultivadas em meio RPMI suplementado com soro bovino a 10%, penicilina e estreptomicina. As células foram colhidas por centrifugação em baixa velocidade, lavadas uma vez no meio, e ressuspensas em meio pré-aquecido a uma concentração de 107 células/ml, conforme determinado por testes de exclusão de azul de tripano. Os peptídeos (P307, P307SQ-8C e melitina) foram diluídos em série (80-0,3125 μM) em meios de cultura e adicionados em 5x104 de células vivas. As células foram incubadas durante 1 hora a 37°C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 ambiente, após o que foram coradas (Ensaio de proliferação celular não radioativo de CellTiter 96; Promega) de acordo com as instruções do fabricante. As amostras foram incubadas durante 4 horas adicionais antes de uma solução de Solubilização/Parada ser adicionada, e incubadas durante a noite. A absorvância a 570 nm foi medida em Leitor SpectraMax Plus (Molecular Devices). As reações foram realizadas duas vezes em triplicata e os dados representativos são apresentados como média ± desvio padrão.
[00142] O sangue humano de um indivíduo saudável foi reunido em um tubo de EDTA e glóbulos vermelhos (RBC) recolhidos através de centrifugação em baixa velocidade. As células foram lavadas em PBS e ressuspensas a uma solução a 10% de RBC. P307 e P307SQ-8C foram diluídos em série em PBS (80-0,3125 μH). PBS e 1% de Triton X-100 foram utilizados como controles negativos e positivos, respectivamente. As amostras foram misturadas e incubadas durante 1 hora a 37°C. O sobrenadante foi recolhido e a absorvância a 405 nm registrada através de Leitor SpectraMax Plus (Molecular Devices). As reações foram realizadas duas vezes em triplicata e os dados representativos são apresentados como média ± desvio padrão.
[00143] As diluições em série de peptídeos foram incubadas com cerca de 5x104 de células B vivas durante 1 hora a 37°C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2, e melitina foi utilizada como um controle positivo. O Ensaio de Proliferação Celular Não Radioativo CellTiter 96® (Promega) foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante para quantificar a sobrevivência de células B. Os glóbulos vermelhos (RBC) foram incubados com diluições em série dos peptídeos e a liberação de hemoglobina no sobrenadante foi medida por OD405 para determinar a hemólise. Triton X-100 foi utilizado como um controle positivo. As barras de erro mostram o desvio padrão.
[00144] Os peptídeos foram testados por sua citotoxicidade utilizando células B humanas e glóbulos vermelhos (RBCs). Em contraste com o controle positivo de melitina, as membranas das células B não são afetadas por P307 ou P307SQ-8C. Mesmo na maior concentração testada (80 μM), a viabilidade das células permanece a mesma conforme o tampão de controle (Figura 16A). Do mesmo modo, a integridade RBCs também não é afetada por qualquer um dos peptídeos em comparação com o controle positivo de Triton X-100 (figura 16B).
[00145] Uma porção de P307SQ-8C (cerca de 25%) é processada duas vezes no peso molecular teórico em comparação com P307SQ-8A, que processa a 4,3 kD (dados não apresentados). Para determinar a importância da formação de ligações de dissulfeto para a elevada atividade de P307SQ-8C, as atividades bactericidas do P307 e P307SQ-8C foram comparadas na presença de ditiotreitol (DTT) em 0, 0,1 e 1 mM. A cepa n° 1791 de A. baumanniifoi tratada com 50 μg/mL de P307 ou 10 μg/mL de P307SQ-8C em Tris-HCl a 50 mM, pH 7,5 durante 2 horas à temperatura ambiente. As células sobreviventes foram diluídas em série e plaqueadas em ágar de TSB. P307SQ-8C torna-se menos ativo com maior concentração de DTT, enquanto que a atividade de P307 aumenta ligeiramente (Figura 17a). Para confirmar ainda mais a importância da formação de dissulfeto para a atividade de P307SQ-8C, sintetizamos P307SQ-8A com a última cisteína alterada para alanina. As cepas n° 1791 e ATCC17978 de A. baumannii foram tratadas com 10 μg/mL de cada peptídeo. Os ensaios bactericidas de P307SQ-8C e P307SQ-8A mostraram que o primeiro é ligeiramente mais ativo do que o segundo (figura 17B). Estes resultados em conjunto indicaram que parte da atividade superior de P307SQ-8C deriva da formação de ligações de dissulfeto entre as duas moléculas.
[00146] Em seguida, investigamos se P307 se liga ao DNA, tendo em conta as cargas positivas sobre os peptídeos (carga líquida de +7). O peptídeo P307 foi misturado com DNA em diferentes peptídeos: proporções de DNA (0:1-15:1) e incubados durante 1 hora antes de serem analisados em gel de agarose. Em comparação com o peptídeo de controlo positivo, não observamos nenhuma mudança no peso molecular para P307 em qualquer uma das proporções de peptídeo para o DNA testado (Fig. 18).
[00147] Uma vez que os peptídeos não parecem matar as bactérias através da interação com DNA, investigamos se eles afetam a membrana bacteriana utilizando microscopia eletrônica de transmissão (TEM). A cepa n° 1791 de A. braumannii foi tratada com tampão (controle) ou 300 μg/mL de P307SQ-8C durante 5 minutos ou 2 horas. A comparação das imagens de TEM das amostras revela ruptura de membrana interna e alterações na densidade intracelular (Figuras 19A, B e C). Além disso, verificamos que as bactérias resistentes a pH 7,5 (Figura 3) foram sensíveis ao P307 a pH 8,8, incluindo E. coli e K. pneumoniae (Figura 19D). Uma vez que as cargas sobre o peptídeo não variam conforme o pH muda de 7,5 para 8,8, concluímos que as mudanças ocorrem na membrana bacteriana. Em pH mais elevado, a membrana bacteriana torna-se mais carregada negativamente, permitindo que os peptídeos carregados positivamente estabeleçam interações iônicas mais fortes.
[00148] Sem desejar permanecermos limitados pela teoria, nossa hipótese é o seguinte mecanismo de ação: P307SQ-8C interage com a membrana bacteriana para ganhar entrada na célula e, no processo, rompe a membrana citoplasmática. A membrana de permeabilização é mais eficaz quando o peptídeo é dimerizado. A interrupção induz a produção de espécies reativas de oxigênio como os radicais hidroxil, o que perturba o conteúdo intracelular. Para investigar esta hipótese, determinamos a ruptura da membrana utilizando ensaio de absorção de SYTOX® Verde.
[00149] As culturas de bactérias durante a noite foram lavadas em 50 mM de Tris-HCl a pH 7,5, e ressuspendidas em OD600 de 0,3 (cerca de 107 fcu/ml). Benzonase® nuclease (25 U/mL) (Novagen) e SYTOX® Verde (1 μH) (Invitrogen) foi adicionado às células bacterianas e incubado durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. Os peptídeos foram adicionados (50 μg/ml; 14,7 μM P307 e 11,6 μM P307SQ-8C, e a melitina (14,7μ M) (Sigma) foi utilizada como um controle. As unidades de fluorescência relativas (RFU) foram medidas em um leitor SpectraMax Plus (Molecular Devices) à temperatura ambiente (ex: 485 nm, em: 520 nm) durante 2 horas. As reações foram realizadas duas vezes em duplicata e os dados representativos são apresentados como média ± desvio padrão.
[00150] Ambos os peptídeos permeabilizam as membranas de bactérias sensíveis, dando origem a um aumento nos sinais de fluorescência do corante SYTOX® Verde, pois ele se liga ao DNA intracelular (Figura 20). A formação de radicais hidroxil foi investigada pelo tratamento das bactérias com P307 e P307SQ- 8C na presença de eliminador de radical hidroxil, tioureia. A polimixina B foi incluída como um controle visto que foi relatado que a sua atividade bactericida se baseia parcialmente na via de morte de radical hidroxil. A tioureia (300 mM) inibe a atividade de P307 e P307SQ-8C completamente (Fig. 21A). No entanto, não pode ser desconsiderado que a tiourea afeta as atividades por outras vias. Por conseguinte, as atividades bactericidas foram também comparadas em condições aeróbicas e anaeróbicas. Visto que A. baumannii é uma bactéria estritamente aeróbica, E. coli foi utilizada para o ensaio bactericida com Tris-HCl 50 mM, pH 8,8. Ambas as atividades de peptídeos foram completamente inibidas pela condição anaeróbica (Fig. 21B). Embora não possamos descartar outras possibilidades como efeito no mecanismo de transporte dependente de oxigênio, os resultados atuais suportam nossa hipótese de formação de radicais hidroxil.
[00151] Investigamos a atividade in vivo de P307SQ-8C utilizando modelo de pele de camundongo porque a infecção da pele é uma via comum de doença por A. baumannii. Os pelos da parte posterior de 40 camundongos CD-1 fêmeas (6 a 8 semanas de idade; Charles River Laboratories) foram raspados com um barbeador elétrico. NairTM (loção removedora de pelos para o corpo e as pernas, de aloé e lanolina), foi aplicada às áreas raspadas para remover qualquer pelo remanescente. As áreas foram, em seguida, desinfetadas com algodão embebido em álcool e a abrasão da pele foi induzida por desbastamento com fita. Uma área de ~ 1 cm2 da pele desbastada por fita foi então marcada e infectada com 10 μL de cerca de 108 cfu/mL de cepa n° 1791 de A. baumannii. As bactérias foram deixadas para colonizar durante 16-18 horas, após o que a área infectada foi deixada tratada ou não tratada com 200 μg de P307SQ-8C ou 2 μg de polimixina B durante 2 horas. Para colher as bactérias remanescentes sobre a pele, os camundongos foram sacrificados e a pele infectada foi processada em 500 μL PBS durante 1 minuto em Stomacher® 80 Biomaster utilizando uma microbag (Seward Ltd., Reino Unido). A solução foi diluída em série e plaqueada em ágar LB contendo 4 μg/ml de levofloxacina e 12 μg/ml de ampicilina para seleção. O fcu/mL resultante de cada animal é mostrado como um ponto e as barras horizontais representam as médias. Ambos os tratamentos reduzem significativamente a carga bacteriana (valor de p = 0,0023, ANOVA de via única comum) (Figura 22).
Claims (6)
1. Polipeptídeo, caracterizado por consistir em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 21, ou um fragmento do polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43 (P307), em que o polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo está conjugado a um peptídeo antimicrobiano que consiste na sequência de aminoácidos SQSRESQC (SEQ ID NO: 44) para produzir um polipeptídeo conjugado e em que o polipeptídeo conjugado possui atividade antibacteriana.
2. Polipeptídeo conjugado ou fragmento conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por: a) o terminal C do polipeptídeo ou fragmento ser conjugado ao peptídeo antimicrobiano; b) o terminal C do polipeptídeo ou fragmento ser conjugado ao terminal N do peptídeo antimicrobiano por meio de uma ligação peptídica; c) o terminal N do polipeptídeo ou fragmento ser conjugado ao peptídeo antimicrobiano; ou d) o terminal N do polipeptídeo ou fragmento ser conjugado ao terminal C do peptídeo antimicrobiano por meio de uma ligação peptídica.
3. Polipeptídeo conjugado ou fragmento conjugado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo conjugado ou fragmento conjugado tem atividade antibacteriana contra uma bactéria gram-negativa.
4. Polipeptídeo conjugado ou fragmento conjugado, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a bactéria é do gênero Acinetobacter.
5. Polipeptídeo conjugado ou fragmento conjugado, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a bactéria é E. coli, P. aeruginosa ou A. baumannii.
6. Fragmento de polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo conjugado tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45.
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