KR20210121313A - 그람 양성 박테리아에 대한 박테리오파지 리신과 항생제의 병용물 - Google Patents

그람 양성 박테리아에 대한 박테리오파지 리신과 항생제의 병용물 Download PDF

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로버트 씨. 노윈스키
마이클 위터킨드
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Abstract

본 발명은, 리신, 특히, 스트렙토코커스 리신, 특히, 리신 PlySs2와 답토마이신, 반코마이신, 옥사실린, 리네졸리드 또는 관련 항생제(들)를 포함하는 하나 이상의 항생제와의 병용물로 그람 양성 박테리아, 특히, 스태필로코커스 박테리아를 예방, 경감, 및 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

그람 양성 박테리아에 대한 박테리오파지 리신과 항생제의 병용물{BACTERIOPHAGE LYSIN AND ANTIBIOTIC COMBINATIONS AGAINST GRAM POSITIVE BACTERIA}
본 발명은, 일반적으로, 리신(lysin), 특히, 스트렙토코커스 리신(Streptococcal lysin), 특히, 리신 PlySs2와 하나 이상의 항생제와의 병용물을 이용한 스태필로코커스 박테리아(Staphylococcal bacteria)를 포함하는 그람 양성 박테리아의 예방, 경감, 및 치료에 관한 것이다.
보다 많은 항생제들이 매우 다양한 질병 및 다른 병태들에 대해 사용되고 있으므로, 약물 내성 박테리아의 개발은 의학에서 중대한 과제이다. 보다 많은 항생제의 사용 및 내성을 보이는 박테리아의 수는 보다 긴 치료 시간을 유도하여 왔다. 추가로, 지금은 광범위하고 비특이적인 항생제들이 보다 더 빈번하게 사용되고 있고, 이들 항생제들 중 일부는 환자에게 유해한 영향을 갖는다. 이러한 증가된 사용과 관련된 문제는, 많은 항생제들이 점막 내층(mucus lining)을 쉽게 관통하지 못한다는 점이다.
그람-양성 박테리아는, 폴리펩타이드 및 다당류를 함유하는 세포벽으로 둘러싸여 있다. 그람-양성 박테리아로는 액티노마이세스(Actinomyces), 바실러스(Bacillus), 리스테리아(Listeria), 락토코커스(Lactococcus), 스태필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 엔테로코커스(Enterococcus), 마이코박테리움(Mycobacterium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 및 클로스트리디움(Clostridium)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 의학적으로 관련된 종으로는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 및 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis)가 포함된다. 포자-형성 바실러스 종은 탄저병 및 위장염을 야기한다. 포자-형성 클로스트리디움 종은 보툴리눔 식중독, 파상풍, 가스 괴저병, 및 위막성 결장염(pseudomembranous colitis)에 관여한다. 코리네박테리움 종은 디프테리아를 야기하고, 리스테리아 종은 뇌수막염을 야기한다.
새로운 항균 치료요법들은 박테리오파지 리신과 같은 효소-기반 항생제("엔지바이오틱스(enzybiotics)")를 포함한다. 파지는 박테리오파지 리신을 이용하여 자신의 박테리아 숙주의 세포벽을 소화시키고, 저장성 용해(hypotonic lysis)를 통해 바이러스 자손을 방출시킨다. 정제된 재조합 리신을 그람-양성 박테리아에 외부에서 첨가한 경우, 유사한 결과가 수득된다. 그람-양성 병원체에 대한 리신의 높은 치사 활성은, 리신이 치료제로서의 개발을 위한 매력적인 후보물질이 되게 한다(Fischetti, V.A.(2008) Curr Opinion Microbiol 11:393-400; Nelson, D.L. et al (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:4107-4112). 박테리오파지 리신은, 처음에 병원성 스트렙토코커스의 비인두 운반을 근절시키기 위해 제안되었다(Loeffler, J. M. et al (2001) Science 294:2170-2172; Nelson, D. et al (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:4107-4112). 리신은, 이중 가닥의 DNA(dsDNA) 파지가 숙주 용해를 바이러스 어셈블리의 완성과 함께 조정하기 위해 이용하는 용해 기전의 일부이다(Wang, I. N. et al (2000) Annu Rev Microbiol 54:799-825). 리신은, 박테리아 벽 내의 결합들을 파괴하고, 펩티도글리칸 온전성(integrity)에 필수적인 공유결합성 결합을 급속하게 가수분해시켜, 박테리아 용해 및 동시에 자손 파지를 방출을 야기하는, 펩티도글리칸 하이드롤라제이다.
리신 계열 구성원들은, 촉매성 도메인이 특이성 또는 결합성 도메인에 융합되는 모듈식 디자인을 나타낸다(Lopez, R. et al (1997) Microb Drug Resist 3:199-211). 리신은, 박테리아 게놈 내의 바이러스 프로파지 서열로부터 클로닝되어 치료에 사용할 수 있다(Beres, S.B. et al (2007) PLoS ONE 2(8):1-14). 리신은, 외부에서 첨가된 경우, 그람-양성 세포벽의 결합에 접근할 수 있다(Fischetti, V.A. (2008) Curr Opinion Microbiol 11:393-400). 박테리오파지 용해 효소는, 각종 투여 경로를 통한 대상체에서의 각종 유형의 감염의 평가 및 특이적 치료에 유용한 것으로 확립되었다. 예를 들면, 미국 특허 제5,604,109호(Fischetti et al.)는, 반(semi)-정제된 C 그룹 스트렙토코커스 파지 연관된 리신 효소에 의한 효소적 소화를 통한 임상 표본 중의 A 그룹 스트렙토코커스의 신속한 검출에 관한 것이다. 이 효소 작업은, 추가 연구의 기초가 되어 질환의 치료 방법을 유도한다. Fischetti 및 Loomis 특허(미국 특허 제5,985,271호, 제6,017,528호, 및 제6,056,955호)는, C1 박테리오파지로 감염된 C 그룹 스트렙토코커스 박테리아에 의해 생성된 리신 효소의 용도를 개시한다. 미국 특허 제6,248,324호(Fischetti 및 Loomis)는, 피부 조직에의 국소 적용에 적합한 담체 내의 용해 효소를 사용함에 의한 피부 감염용 조성물을 개시한다. 미국 특허 제6,254,866호(Fischetti 및 Loomis)는, 감염성 박테리아에 특이적인 용해 효소를 투여하는 단계를 포함하는, 소화관의 박테리아 감염을 치료하는 방법을 개시한다. 소화관에 하나 이상의 용해 효소를 전달하기 위한 담체는, 관장 좌제, 시럽, 또는 장용정(enteric coated pill)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 미국 특허 제6,264,945호(Fischetti 및 Loomis)는, 환자에게의 박테리아에 대해 특이적인 박테리오파지로 감염된 박테리아에 의해 생성된 하나 이상의 용해 효소 및 이 용해 효소를 전달하기 위한 적절한 담체의 비경구(근육내, 피하, 또는 정맥내) 도입에 의해 박테리아 감염의 치료하기 위한 방법 및 조성물을 개시한다.
다양한 박테리오파지로부터, 파지 연관된 용해 효소가 동정되었고 클로닝되었으며, 각각의 효소는 특정 박테리아 균주를 사멸시키는데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 미국 특허 제7,402,309호 및 제7,638,600호 및 공개된 PCT 출원 제WO2008/018854호는, 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 감염의 치료 또는 완화를 위한 항균제로서 유용한 별개의 파지-연관된 용해 효소를 제공한다. 미국 특허 제7,569,223호는 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)에 대한 용해 효소를 기술한다. 미국 특허 제7,582,291호에는 엔테로코커스(Enterococcus)(반코마이신 내성 균주를 포함하는 이. 파에칼리스 및 이. 파에시움)에 유용한 리신이 기술되어 있다. 미국 특허 제2008/0221035호는, B 그룹 스트렙토코커스를 사멸시키는데 고도로 효과적인 돌연변이체 Ply GBS 리신을 기술한다. 제WO 2010/002959호에는 스태필로코커스 아우레우스를 포함하는 스태필로코커스 박테리아에 대해 활성을 갖는 키메라 리신(ClyS로 표기함)이 상세히 설명되어 있다.
리신의 신속하고, 강력하며, 특정적인 세포벽-분해 및 살균 특성을 기초로 하여, 리신은, 세포 외부로부터 노출된 펩티도글리칸 세포벽을 공격함으로써 그람-양성 병원체를 방지하는 항균 치료제로서 제시되어 왔다(Fenton, M et al (2010) Bioengineered Bugs 1:9-16; Nelson, D et al (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:4107-4112). 단일 작용제(agent)로서의 다양한 리신의 효능은, 인두염(Nelson, D et al (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:4107-4112), 폐렴(Witzenrath, M et al (2009) Crit Care Med 37:642-649), 중이염(McCullers, J.A. et al (2007) PLOS pathogens 3:0001-0003), 농양(Pastagia, M et al Antimicrobial agents and chemotherapy 55:738-744), 균혈증(Loeffler, J.M. et al (2003) Infection and Immunity 71:6199-6204), 심내막염(Entenza, J.M. et al (2005) Antimicrobial agents and chemotherapy 49:4789-4792), 및 뇌수막염(Grandgirard, D et al (2008) J Infect Dis 197:1519-1522)의 설치류 모델에서 입증되어 왔다. 또한, 리신은, 일반적으로, 자신의 박테리아 숙주 종에 대해 특이적이고, 사람 공생 박테리아를 포함하는 비-표적 유기체를 용해시키지 않고, 이는, 위장 항상성에 유리할 수 있다(Blaser, M. (2011) Nature 476:393-394; Willing, B.P. et al (2011) Nature reviews. Microbiology 9:233-243).
임상 시험 중인 항생제들로는, 그람 양성 박테리아의 세포벽 펩티도글리칸 생합성에 보통 영향을 미치는 몇몇의 항생제들이 포함된다. 이들로는, 펩티도글리칸 매트릭스 내로 N-아세틸뮤라민산(NAM)과 N-아세틸글루코사민(NAG) 펩타이드 아단위의 혼입을 방지함으로써 펩티도글리칸 합성을 저해하는 한 부류로서의 글리코펩타이드가 포함된다. 입수가능한 글리코펩타이드로는, 반코마이신 및 테이코플라닌이 포함되며, 반코마이신의 경우는 균혈증, 특히, 스태필로코커스 감염에서의 임상 응용으로 우선적으로 선택되는 약물이다. 페니실린은 펩티도글리칸 가교-연결의 형성을 저해함으로써 작용한다. 통상의 페니실린으로는 옥사실린, 암피실린 및 클록사실린이 포함된다. 리네졸리드(Zyvox)는 단백질 합성 저해제이고, 옥사졸리디논이라고 칭하는 한 부류의 항균제에 속한다(Ford CW et al (1996) Antimicrob Agents Chemoth 40(6):1508-1513; Swaney SM et al (1998) Antimicrob Agents Chemoth 42(12):3251-3255; 미국 특허 제6,444,813호).
답토마이신(Cubicin)(LY 146032로서도 표기됨)은, 10-탄소 친유성 테일(tail)에 연결된 13-원(member) 아미노산 펩타이드로 이루어진 리포펩타이드 항균제이다(Miao V et al (2005) Microbiology 151(Pt5):1507-1523; Steenbergen JN et al (2005) J Antimicrob Chemother 55(3):283-288; 및 미국 특허 제5,912,226호에 기술되어 있음). 이러한 구조는, 새로운 작용 기전을 초래하고, 막관통(transmembrane) 채널의 형성을 통해 박테리아 막을 붕괴시키고, 이러한 붕괴는 세포내 이온의 누출을 야기하고, 이러한 이온 누출은 세포 막의 탈분극화 및 거대 분자 합성의 저해를 유도한다. 답토마이신의 활성 스펙트럼은, 다수의 고도의 내성 종(메티실린-내성 에스. 아우레우스(MRSA), 반코마이신 중간-민감성 에스. 아우레우스(VISA), 반코마이신-내성 에스. 아우레우스(VRSA), 반코마이신-내성 엔테로코커스(VRE))을 포함하는 그람-양성 유기체에 한정된다. 연구에서, 답토마이신은 반코마이신보다 더욱 신속한 살균성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이의 승인된 투약 용법은 1일 1회 IV 4mg/kg이다. 신장 기능이상시 용량 조정이 필요하다. 답토마이신의 1차 독성은 가역적 용량-관련 근육통 및 쇠약(weakness)이다. 답토마이신은, 그람 양성 박테리아에 의해 야기된 피부 및 연조직 감염 합병증, 스태필로코커스 아우레우스 균혈증, 및 에스. 아우레우스 우측 심내막염의 치료에 대해 승인되었다. 요도 감염 합병증과 심내막염/균혈증을 치료하는데 있어서의 답토마이신의 효능을 평가하는 실험이 진행 중이다. 이의 승인된 투약 용법은 1일 1회 IV 4mg/kg이다. 신장 기능이상시 용량 조정이 필요하다. 답토마이신의 1차 독성은 가역적 용량-관련 근육통 및 쇠약이다. 답토마이신에의 노출 후 시험관내 및 생체내 둘 다에서 답토마이신에 대한 내성이 발생하였다. 내성 기전(들)은 완전히 규명되지 않지만, 아마도 세포 막의 변경과 관련되어 있을 것이다. 아저해(subinhibitory) 약물 농도에서의 스태필로코커스와 엔테로코커스의 다중 계대는 단계적 방식으로 MIC 증가를 초래하였다. 답토마이신은 폐 계면활성제와 격렬히 결합하고, 폐렴 치료에 효과적으로 사용될 수 없다(Baltz RH (2009) Curr Opin Chem Biol 13(2):144-151).
그람 양성 감염의 치료를 위한 임상학적 사용시 넓은 스펙트럼 항생제들, 특히, 반코마이신과 같은 중환자 관리 항생제들은, 위장 장애 및 설사의 부작용, 및 특히, 연속 또는 장기간 사용과 연관된 내성의 발생에 의해 사용 및 응용에 한계가 있다.
현행의 전통적인 항생제와 연관된 결함 및 문제점으로부터, 당해 분야에서는, 특히, 획득 내성의 높은 위험이 없는, 추가의 특이적인 박테리아 작용제, 병용물 및 치료 방식에 대한 필요성이 여전히 존재함이 명백하다. 따라서, 새로운 항균 접근법, 특히, 병원성 박테리아를 효과적으로 사멸시키기 위해, 새로운 방식을 통해 작동하거나 새로운 병용물을 제공하는 항균적 접근이 상업적으로 필요하다.
본원에서 참조문헌의 인용은, 이러한 문헌들이 본 발명보다 선행하는 기술임을 인정하는 것으로 해석되지 않아야만 한다.
본 발명의 요약
본 발명은, 그람 양성 박테리아를 신속하고 효과적으로 사멸시키기 위한 박테리오파지 리신(들)과 항생제와의 병용물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 다수의 박테리아, 특히, 스태필로코커스 및 스트렙토코커스 박테리아 균주를 포함하는 그람-양성 박테리아에 대해 광범위한 사멸 활성을 입증하는 리신 PlySs2는, 항생제(들)과 병용하여 현저한 상승작용을 제공하고, 항생제(들)에 필요한 유효 MIC 용량을 유의하게 감소시킬 수 있다.
리신은, 관련 또는 유사 항생제를 포함하는, 반코마이신, 답토마이신, 리네졸리드, 또는 옥사실린 중 하나 이상을 포함하는 광범위 스펙트럼 그람 양성 항생제(들)와 병용될 수 있다. 특정 양상에서, PlySs2 리신은 답토마이신과 병용되어 스태필로코커스, 특히, MRSA를 포함하는 그람 양성 박테리아에 대해 상승작용적인 사멸 활성을 제공한다. 특정 양상에서, PlySs2 리신은 반코마이신과 병용되어 MRSA를 포함하는 스트렙토코커스에 대해 상승작용적인 사멸 활성을 제공한다. 특정 양상에서, PlySs2 리신은 리네졸리드와 병용되어 MRSA를 포함하는 스트렙토코커스에 대해 상승작용적인 사멸 활성을 제공한다. 본 발명의 양상에서, PlySs2 리신과의 병용물은 에스. 아우레우스와 같은 그람 양성 박테리아를 사멸시키는데 필요한 항생제 용량을 유의하게 감소시킨다.
본 발명에 따르면, 특정 유형 또는 부류의 항생제, 특히, 답토마이신, 반코마이신, 리네졸리드 또는 옥사실린을 포함하는 항생제와 PlySs2 리신의 병용물은 단독 물질에 비해 더 낮은 용량 또는 더 낮은 MIC로 에스. 아우레우스를 포함하는 그람 양성 박테리아를 사멸시키는데 효과적이다. 본 발명의 양상에서, 리신과 항생제를 병용하여 투여하거나 별도로 동시에 또는 연속적으로 투여하기에 적합한 것을 포함하는, 그람 양성 감염균을 효과적으로 사멸 또는 탈콜로니화(decolonization)시키는 용량이 단독으로 제공될 때에 필요한 용량보다 더 낮은 리신과 항생제의 저용량 제형이 제공된다. 특히, 리신, 특히, PlySs2 리신과 병용되어 동시에 또는 연속적으로 투여되는 항생제의 저용량 제형이 제공되는데, 여기서, 항생제는 리신과 병용되어 그람 양성 감염균을 효과적으로 사멸 또는 탈콜로니화시키는 용량이 항생제 단독으로 제공되거나 투여될 때에 필요한 용량보다 더 낮다.
본 발명의 양상에서, 스태필로코커스에 대해 효과적인 리신은 답토마이신, 반코마이신, 리네졸리드, 또는 옥사실린, 또는 관련된 항생제 화합물들 중 하나 이상과 병용되어 각각 단독으로 투여될 때보다 더 낮은 용량 또는 더 낮은 MIC로 에스. 아우레우스를 포함하는 그람 양성 박테리아를 사멸시킨다. 본 발명의 양상에서, 스태필로코커스에 대해 효과적인 리신은 답토마이신 또는 관련된 항생제 화합물과 병용되어 각각 단독으로 투여될 때보다 더 낮은 용량 또는 더 낮은 MIC로 에스. 아우레우스를 포함하는 그람 양성 박테리아를 사멸시킨다. 본 발명의 양상에서, 스태필로코커스에 대해 효과적인 리신은 반코마이신 또는 관련된 항생제 화합물 중 하나 이상과 병용되어 각각 단독으로 투여될 때보다 더 낮은 용량 또는 더 낮은 MIC로 에스. 아우레우스를 포함하는 그람 양성 박테리아를 사멸시킨다. 특정 양상에서, 항생제는 PlySs2 리신 또는 이의 변이체와 병용된다. 본 발명의 양상에서, 리신과 답토마이신의 병용물은 계면활성제가 답토마이신 활성을 감소시키는 효과를 회피할 수 있다. 답토마이신은 PlySs2 리신과 같은 리신과의 병용으로 에스. 아우레우스를 사멸시키고 동물의 균혈증을 치료 또는 완화시키는데 효과를 나타내게 된다. 따라서, 본 발명의 양상에서, PlySs2 리신과 답토마이신의 병용물 또는 이를 함유하는 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하여 동물의 에스. 아우레우스 감염을 탈콜로니화, 저해 또는 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명에 따라, 박테리아 감염 또는 콜로니화를 예방, 붕괴 및 치료하는 PlySs2와 하나 이상의 항생제를 포함하는 조성물 및 방법이 제공된다. 가장 넓은 양상에서, 본 발명은 항생제와 병용되어, 특히, 답토마이신, 반코마이신, 리네졸리드, 또는 옥사실린, 또는 관련 항생제와 병용되어, 그람-양성 박테리아 또는 그람 양성 박테리아 감염을 예방, 경감 또는 치료하는데 사용하기 위한, 다수의 박테리아, 특히, 스태필로코커스, 스트렙토코커스, 엔테로코커스 및 리스테리아 박테리아 균주를 포함하는 그람 양성 박테리아에 대해 광범위한 사멸 활성을 갖는 리신의 용도 및 응용을 제공한다. 따라서, 본 발명은, 1종 이상의 그람 양성 박테리아, 특히, 스태필로코커스, 스트렙토코커스, 엔테로코커스 및 리스테리아 박테리아 중 1종 이상이 의심되거나 존재하는 경우 PlySs2 리신과 하나 이상의 항생제와의 병용물의 투여 또는 이 병용물과의 접촉에 의한 박테리아의 치료, 탈콜로니화 및/또는 탈오염을 고려한다. 이러한 한 양상에서, PlySs2 리신은 답토마이신과 병용된다. 추가의 양상에서, PlySs2 리신은 반코마이신과 병용된다. 다른 양상에서, PlySs2 리신은 리네졸리드와 병용된다. 추가의 양상에서, PlySs2 리신은 옥사실린과 병용된다. 각 경우에 항생제는 동일한 부류 또는 계열의 항생제 또는 유사 또는 관련 구조를 갖는 항생제를 포함하는 관련 항생제를 포함하거나 포괄한다.
본 발명에 따라, 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis) 박테리아로부터 유도된 박테리오파지 리신이 본 발명의 방법 및 조성물에 사용된다. 본 발명에서 사용되는 리신 폴리펩타이드(들), 특히, 본원 명세서 및 도 29(서열번호 1)에 제공되는 바와 같은 PlySs2 리신은 다수의 박테리아, 특히, 스태필로코커스, 스트렙토코커스, 엔테로코커스 및 리스테리아 박테리아 균주를 포함하는 그람-양성 박테리아에 대한 광범위한 사멸 활성을 입증하는데 특별한 물질이다. 이러한 한 양상에서, PlySs2 리신은 본원에서 입증되는 바와 같이 항생제와 병용되어, 특히, 답토마이신, 반코마이신, 옥사실린 또는 리네졸리드와 병용되어 스태필로코커스 아우레우스 균주 및 박테리아를 사멸시킬 수 있다. PlySs2는 메티실린-내성 스태필로코커스 아우레우스(MRSA), 반코마이신-내성 스태필로코커스 아우레우스(VRSA), 답토마이신-내성 스태필로코커스 아우레우스(DRSA) 및 리네졸리드-내성 스태필로코커스 아우레우스(LRSA)와 같은 항생제-내성 스태필로코커스 아우레우스에 대해 효과적이다. PlySs2는 반코마이신 중간-민감성 스태필로코커스 아우레우스(VISA)에 대해 효과적이다.
본 발명의 양상에서, PlySs2 리신과 하나 이상의 항생제와의 병용물과 그람 양성 박테리아를 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 병용물은 에스. 아우레우스를 포함하는 그람 양성 박테리아를 사멸시키는데 유효한 양의 단리된 리신 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 단리된 리신 폴리펩타이드는 그람-양성 박테리아를 사멸시키는데 효과적인 PlySs2 리신 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 포함하고, 여기서, 에스. 아우레우스를 포함하는 그람 양성 박테리아를 효과적으로 사멸시키는데 필요한 PlySs2의 양은 항생제 부재의 경우보다 항생제 존재의 경우에 유의하게 더 적은, 그람-양성 박테리아를 사멸시키는 방법이 제공된다. 단리된 PlySs2 리신 폴리펩타이드는 도 29에 제공된 아미노산 서열(서열번호 1)을 포함하거나, 또는 상기 단리된 PlySs2 리신 폴리펩타이드가, 상기 도 29의 폴리펩타이드(서열번호 1)와 적어도 80%의 동일성, 85%의 동일성, 90%의 동일성, 95%의 동일성 또는 99%의 동일성을 갖고, 또한, 그람 양성 박테리아를 사멸시키는데 효과적인 상기 단리된 PlySs2 리신 폴리펩타이드의 변이체를 포함할 수 있다.
본 발명의 양상에서, PlySs2 리신과 하나 이상의 항생제와의 병용물과 그람 양성 박테리아를 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 병용물은 에스. 아우레우스를 포함하는 그람 양성 박테리아를 사멸시키는데 유효한 양의 단리된 리신 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 단리된 리신 폴리펩타이드는, 그람 양성 박테리아를 사멸시키는데 효과적인 PlySs2 리신 폴리펩타이드 또는 PlySs2 리신 폴리펩타이드의 변이체를 포함하고, 에스. 아우레우스를 포함하는 그람 양성 박테리아를 효과적으로 사멸시키는데 필요한 항생제의 양은 PlySs2 부재의 경우보다 PlySs2 존재의 경우에 유의하게 더 적은, 그람 양성 박테리아를 사멸시키는 방법이 제공된다.
본 발명에 따라 입증된 바와 같이, 특히, 스태필로코커스 및 스트렙토코커스 박테리아에 대한 활성을 갖는 리신을 포함하고, 특히, PlySs2를 포함하는 본원에 제공된 리신은, 항생제, 특히, 다른 부류 및 항균 기전의 항생제와 함께 상승작용적으로 작용한다. 따라서, 본 발명에 따른 PlySs2 리신 또는 이의 활성 변이체는 글리코펩타이드와 같이 세포벽 합성에 영향을 미치는 각각의 항생제, 펩티도글리칸의 형성을 저해하는 페니실린, 단백질 합성 저해제 및 리포펩타이드 항생제를 포함하는 항생제와 병용되어 향상된 활성을 입증한다. 각 경우에서, 리신과 항생제 둘 다의 항균 활성은 병용되었을 때 유의하게 향상된다. 글리코펩타이드 항생제와의 병용은 반코마이신에 의해 증명되고, 페니실린 부류와의 병용은 옥사실린에 의해 증명되고, 옥사졸리디논 부류를 포함하는 단백질 합성 저해제 항생제와의 병용은 리네졸리드에 의해 증명되고, 리포펩타이드 항생제와의 병용은 답토마이신에 의해 증명된다. 본 발명은 상기 증명된 항생제뿐만 아니라 이들 부류의 대안의 일원 또는 관련 항생제와의 병용 및 향상된 활성을 포함하고 고려한다.
따라서, 본 발명의 양상에서, 리신과 답토마이신 또는 관련 항생제와의 병용물을 박테리아와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 병용물은 에스. 아우레우스를 포함하는 그람 양성 박테리아를 사멸시키는데 유효한 양의 단리된 리신 폴리펩타이드를 포함하고, 에스. 아우레우스를 포함하는 그람 양성 박테리아를 효과적으로 사멸시키는데 필요한 답토마이신 또는 관련 항생제의 양은 리신 부재의 경우보다 리신 존재의 경우에 유의하게 더 적은, 그람 양성 박테리아를 사멸시키는 방법이 제공된다.
추가의 양상에서, 리신과 반코마이신 또는 관련 항생제와의 병용물을 박테리아와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 병용물은 에스. 아우레우스를 포함하는 그람 양성 박테리아를 사멸시키는데 유효한 양의 단리된 리신 폴리펩타이드를 포함하고, 에스. 아우레우스를 포함하는 그람 양성 박테리아를 효과적으로 사멸시키는데 필요한 반코마이신 또는 관련 항생제의 양은 리신 부재의 경우보다 리신 존재의 경우에 유의하게 더 적은, 그람 양성 박테리아를 사멸시키는 방법이 제공된다.
추가의 양상에서, 리신과 옥사실린 또는 관련 항생제와의 병용물을 박테리아와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 병용물은 에스. 아우레우스를 포함하는 그람-양성 박테리아를 사멸시키는데 유효한 양의 단리된 리신 폴리펩타이드를 포함하고, 에스. 아우레우스를 포함하는 그람 양성 박테리아를 효과적으로 사멸시키는데 필요한 옥사실린 또는 관련 항생제의 양은 리신 부재의 경우보다 리신 존재의 경우에 유의하게 더 적은, 그람 양성 박테리아를 사멸시키는 방법이 제공된다.
추가의 양상에서, 리신과 리네졸리드 또는 관련 항생제와의 병용물을 박테리아와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 병용물은 에스. 아우레우스를 포함하는 그람 양성 박테리아를 사멸시키는데 유효한 양의 단리된 리신 폴리펩타이드를 포함하고, 에스. 아우레우스를 포함하는 그람 양성 박테리아를 효과적으로 사멸시키는데 필요한 리네졸리드 또는 관련 항생제의 양은 리신 부재의 경우보다 리신 존재의 경우 유의하게 더 적은, 그람 양성 박테리아를 사멸시키는 방법이 제공된다.
또한, 본 발명은, 항생제-내성 박테리아를 스태필로코커스 박테리아를 사멸시킬 수 있는 리신과 접촉시키는 단계를 포함하는 항생제-내성 그람 양성 박테리아를 사멸시키는 방법을 제공한다. 이러한 한 양상에서, 항생제-내성 박테리아는, 이 박테리아가 민감성을 나타내는 항생제와 병용되거나 그 박테리아가 내성을 나타내는 항생제와 병용되는 리신, 특히, PlySs2와 접촉된다. 상기 방법의 이러한 한 양상에서, 리신은 PlySs2이다. 이러한 한 양상에서, 리신은 도 29에 제공된 아미노산 서열(서열번호 1)을 포함하거나, 또는 상기 리신은, 상기 도 29의 폴리펩타이드(서열번호 1)와 적어도 80%의 동일성, 85%의 동일성, 90%의 동일성, 95%의 동일성, 또는 99%의 동일성을 갖고, 또한, 그람-양성 박테리아, 특히, 에스. 아우레우스를 사멸시키는데 효과적인 상기 리신의 변이체를 포함하는 폴리펩타이드이다.
본 발명은, 답토마이신 내성 그람 양성 박테리아를 스태필로코커스 박테리아를 사멸시킬 수 있는 리신과 접촉시키는 단계를 포함하는, 답토마이신 내성 그람 양성 박테리아를 사멸시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 리신과 답토마이신 및/또는 다른 항생제와의 병용물을 포함할 수 있다. 상기 방법의 이러한 한 양상에서, 리신은, 본원에 제공된 PlySs2이다.
추가로, 본 발명은, 반코마이신 내성 그람 양성 박테리아를 스태필로코커스 박테리아를 사멸시킬 수 있는 리신과 접촉시키는 단계를 포함하는, 반코마이신 내성 그람 양성 박테리아를 사멸시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 리신과 반코마이신 및/또는 다른 항생제와의 병용물을 포함할 수 있다. 상기 방법의 이러한 한 양상에서, 리신은 PlySs2이다.
상기 방법들의 양상에서, 이들 방법은 시험관내 또는 생체외에서 수행되거나, 특히, 사람이 사용하거나 인체내에서 사용할 목적의 용액, 물질 또는 기구의 무균 또는 탈오염을 위해 생체내 기구의 이식 또는 배치에 따라 수행된다.
추가의 양상에서, 그람 양성 박테리아를 리신, 특히, PlySs2와 하나 이상의 항생제와의 병용물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 에스. 아우레우스를 포함하는 그람 양성 박테리아를 효과적으로 사멸 또는 탈콜로니화시키는데 필요한 항생제의 양은 리신 부재의 경우보다 리신 존재의 경우에 유의하게 더 적은, 그람 양성 박테리아를 사멸 또는 탈콜로니화시키는 항생제의 효능을 향상시키는 방법이 제공된다. 이러한 한 양상에서, 리신, 특히, PlySs2를 답토마이신과 병용하여 투여하는 단계를 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니아에에 대한 답토마이신 또는 관련 항생제의 효능을 향상 또는 촉진시키는 방법이 제공된다. 특정된 이러한 방법 또는 양상에서, 답토마이신은 리신, 특히, PlySs2가 부재시에 효과를 나타내지 않는 용량에서, 리신, 특히, PlySs2와 병용되어 투여되거나 이 리신이 투여된 후에 이어서 투여될 때 스트렙토코커스 뉴모니아에에 대해 효과적이다.
본 발명은, 단독 투여시 그람 양성 박테리아를 사멸시키는 효과를 나타내지 않는 양의 단리된 리신 폴리펩타이드와 단독 투여시 그람 양성 박테리아를 사멸시키는 효과를 나타내지 않는 양의 항생제를 포함하는 조성물과 그람 양성 박테리아를 접촉시키는 단계를 포함하는, 그람 양성 박테리아의 군체(population)를 감소시키는 방법을 제공한다. 항생제는 글리코펩타이드, 페니실린, 단백질 합성 저해제, 오잘리디논(ozalidinone) 또는 리포펩타이드일 수 있다. 이와 같은 방법은 반코마이신, 답토마이신, 리네졸리드 및 옥사실린으로부터 선택된 항생제를 포함할 수 있다. 한 양상에서, 단리된 리신 폴리펩타이드는 도 29의 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 상기 단리된 리신 폴리펩타이드가, 상기 도 29의 또는 서열번호 1의 폴리펩타이드와 적어도 80%의 동일성을 갖고, 또한, 그람 양성 박테리아를 효과적으로 사멸시키는 상기 단리된 리신 폴리펩타이드의 변이체를 포함한다.
본 발명은 단독 투여시 그람 양성 박테리아를 사멸시키는 효과를 나타내지 않는 양의 단리된 리신 폴리펩타이드와 단독 투여시 그람 양성 박테리아를 사멸시키는 효과를 나타내지 않는 양의 답토마이신을 포함하는 조성물과 그람 양성 박테리아를 접촉시키는 단계를 포함하는, 그람 양성 박테리아의 군체를 감소시키는 방법을 제공한다. 한 양상에서, 단리된 리신 폴리펩타이드는 도 29의 아미노산 서열(서열번호 1)을 포함하거나, 또는 상기 단리된 리신 폴리펩타이드가, 상기 도 29의 폴리펩타이드(서열번호 1)와 적어도 80%의 동일성을 갖고, 또한, 그람 양성 박테리아를 효과적으로 사멸시키는 상기 단리된 리신 폴리펩타이드의 변이체를 포함한다.
이러한 상기 방법들 중 임의의 하나에 있어서, 민감성, 사멸된, 해체된 또는 치료된 박테리아는 스태필로코커스 아우레우스, 리스테리아 모노사이토게네스, 스태필로코커스 시물란스(Staphylococcus simulans), 스트렙토코커스 수이스, 스태필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스트렙토코커스 에퀴(Streptococcus equi), 스트렙토코커스 에퀴 쥬(Streptococcus equi zoo), 스트렙토코커스 아갈락티아에(GBS), 스트렙토코커스 피오게네스(GAS), 스트렙토코커스 샌귀니스(Streptococcus sanguinis), 스트렙토코커스 고르도니이(Streptococcus gordonii), 스트렙토코커스 디스갈락티아에(Streptococcus dysgalactiae), G 그룹 스트렙토코커스, E 그룹 스트렙토코커스, 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis) 및 스트렙토코커스 뉴모니아에로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 방법들 중 임의의 하나에 따르면, 민감성 박테리아는 항생제 내성 박테리아일 수 있다. 이 박테리아는 메티실린-내성 스태필로코커스 아우레우스(MRSA), 반코마이신 중간 민감성 스태필로코커스 아우레우스(VISA), 반코마이신 내성 스태필로코커스 아우레우스(VRSA), 답토마이신-내성 스태필로코커스 아우레우스(DRSA) 또는 리네졸리드-내성 스태필로코커스 아우레우스(LRSA)일 수 있다. 민감성 박테리아는 임상적 관련성 또는 병원성 박테리아일 수 있고, 특히, 사람에 대한 임상적 관련성 또는 병원성 박테리아일 수 있다. 방법(들)의 양상에서, 리신 폴리펩타이드(들)는 스태필로코커스, 스트렙토코커스, 엔테로코커스 및 리스테리아 박테리아 균주를 사멸시키는데 효과적이다.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 추가적인 양상 또는 실시형태에 있어서, 다른 특정적인 스태필로코커스 특이적 리신이 단독으로 사용되거나 본원에 제공되고 기술된 PlySs2 리신과 병용되어 사용된다. 본원에 제공된 방법 및 조성물의 이러한 한 양상 또는 실시형태에 있어서, 스태필로코커스 특이적 리신 ClyS가 단독으로 사용되거나 본원에 제공되고 기술된 PlySs2 리신과 병용되어 사용된다.
본 발명은 리신, 특히, PlySs2 리신과 하나 이상의 항생제와의 병용물로 함께 투여하거나 각각 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는, 항생제 활성을 향상 또는 촉진하는 방법을 제공한다. 본 발명의 양상에서, 항생제 활성은 적어도 10배, 적어도 16배, 적어도 20배, 적어도 24배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 100배, 10배 초과, 20배 초과, 50배 초과, 100배 초과로 향상 또는 촉진된다. 본 발명은 리신, 특히, PlySs2 리신과 하나 이상의 항생제를 병용물로 함께 투여하거나 각각 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는, 리신 활성, 특히, PlySs2 리신 활성을 향상 또는 촉진하는 방법을 제공한다. 본 발명의 양상에서, 리신, 특히, PlySs2의 활성은 적어도 2배, 적어도 4배, 적어도 8배, 적어도 10배, 10배 이하, 16배 이하, 20배 이하 증가된다.
본 발명은, 도 29에 제공된 아미노산 서열(서열번호 1)을 포함하거나, 또는 상기 도 29의 폴리펩타이드(서열번호 1)와 적어도 80%의 동일성, 85%의 동일성, 90%의 동일성, 95%의 동일성 또는 99%의 동일성을 갖고, 또한, 그람 양성 박테리아를 사멸시키는데 효과적인 PlySs2 리신의 변이체를 포함하는, PlySs2 리신과 병용된 항생제를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 항생제는 PlySs2와 병용되지 않은 경우 효과를 나타내지 않는 용량에서 PlySs2와 병용될 때 효과적인, 계면활성제-유사 활성을 갖는 생물학적 유액에서 그람 양성 박테리아에 대한 항생제 활성을 증강시키는 방법을 제공한다. 상기 방법의 양상에서, 항생제는 답토마이신 또는 관련 화합물이다. 한 양상에서, 박테리아는 스트렙토코커스 뉴모니아에이다.
다른 목적 및 이점들은 본 분야의 전문가들이 아래의 설명을 검토하고 이어서 아래의 도해적인 도면을 참고할 때 명백해질 것이다.
도 1은 첨가된 답토마이신, 반코마이신 또는 PlySs2 리신의 존재하에서 여러 MRSA 균주의 시간-사멸 곡선을 보여준다.
도 2는 첨가된 답토마이신, 반코마이신, 옥사실린 또는 PlySs2 리신의 존재하에서 여러 MSSA 균주의 시간-사멸 곡선을 보여준다.
도 3은 첨가된 답토마이신, 반코마이신 또는 PlySs2 리신의 존재하에서 여러 MRSA 및 MSSA 균주의 시간-사멸 곡선의 정리된 그래프를 보여준다.
도 4의 A 내지 도 4의 F는 시험관내에서 스태필로코커스 아우레우스 세포에 대한 PlySs2 및 항생제의 조합된 시간-사멸 곡선을 보여준다. (A, B) 20가지 MSSA의 한 조와 42가지 MRSA 균주의 한 조에 대한 옥사실린(OXA), 반코마이신(VAN) 및 답토마이신(DAP) 대비 PlySs2의 조합된 시간-사멸 곡선. 각 개별 분석에서 약물 농도는 균주-특이적 1X MIC 값에 해당한다. 평균값(±평균의 표준편차)은 각 시점마다 제시했다. (C, D) 15가지 최근 임상 MSSA 단리물의 한 조와 15가지 최근 임상 MRSA 단리물의 한 조에 대한 PlySs2의 적정 분석. 개개의 분석에서, PlySs2 농도는 균주-특이적 MIC값에 해당한다. 4X, 1X 및 0.25X MIC 농도가 사용되었다. (E, F) 8 g/mL PlySs2로 3초간 치료 전후의 스태필로코커스 아우레우스 세포(균주 MW2)의 투과전자현미경 사진(3300배 확대). 기준자는 2μM에 해당한다. 용해는 어둡게 염색된 세포질 성분들의 손실을 초래한다.
도 5는 MIC 이하의 표기된 용량으로 PlySs2와 반코마이신이 단독으로 또는 병용물로 치료된 MRSA 균주의 시간-사멸 곡선을 보여준다.
도 6은 MIC 이하의 표기된 용량으로 PlySs2와 답토마이신이 단독으로 또는 병용물로 치료된 MRSA 균주에 대한 시간-사멸 곡선을 보여준다.
도 7은 표기된 MIC 또는 용량으로 단독으로 또는 병용물로 첨가된 답토마이신과 PlySs2 리신의 존재하에서 MRSA 균주 650(O52C Tomasz)에 대한 시간-사멸 곡선을 보여준다.
도 8a 내지 도 8f는 시험관내에서 PlySs2가 항생제와 함께 다수의 균주에 대해 상승작용을 나타냄을 보여주며, PlySs2와 옥사실린으로 치료된 MSSA 균주에 대한 시간-사멸 결과(도 8a, 도 8b), PlySs2와 반코마이신으로 치료된 MRSA 균주에 대한 시간-사멸 결과(도 8c, 도 8d) 및 PlySs2와 답토마이신으로 치료된 MRSA 균주에 대한 시간-사멸 결과(도 8e, 도 8f)를 제공한다. 도 8a, 8c 및 8e의 시간-사멸 데이터는 각각 MSSA 균주 JMI 7140, MRSA 균주 JMI 3340 및 MRSA 균주 JMI 3345에 대한 것이다. (도 8a) 값은 성장, 성장 대조군(PlySs2 또는 항생제 없음), PlySs2 0.13X MIC, 옥사실린(OXA) 0.5X MIC, PlySs2+Oxa 병용물의 표기된 약물 농도에 대한 것이다. (도 8c) 값은 성장, 성장 대조군(PlySs2 또는 항생제 없음), PlySs2 0.13X MIC, 반코마이신(VAN) 0.5X MIC, PlySS2+VAN 병용물의 표기된 약물 농도에 대한 것이다. (도 8e) 값은 성장, 성장 대조군(PlySs2 또는 항생제 없음), PlySs2 0.25X MIC, 답토마이신(DAP) 0.5X MIC, PlySs2+DAP 병용물의 표기된 약물 농도에 대한 것이다. 도 8b, 8d 및 8f에서, 병용물-치료된 배양물과 미치료된 성장 대조군간에 6시간 동안의 cfu/ml 로그 변화는 다수의 균주 무리에 대한 것이다. 수평 점선은 시간-사멸 상승작용을 기록하는데 필요한 2 log 컷오프 값을 가리킨다. log10 콜로니 수의 감소(또는 ΔLog10 CFU/ml)은 가장 활성적인 단일 작용제로 치료된 배양물과 약물 병용물로 6시간 치료된 배양물을 비교한 것이다. 상승작용은 CLSI에 의해 CFU/mL의 ≥2 log10 감소로서 정의되며 도면에 파선으로 표시되어 있다. ΔLog10 CFU/mL = log10 콜로니 형성 단위의 차이.
도 9는 환원제(BME)의 존재하에 MRSA 균주 553에 대한 답토마이신과 PlySs2의 병용물이 표기된 농도로 희석된 패널을 제공한다.
도 10은 환원제(BME)의 부재하에 MRSA 균주 553에 대한 답토마이신과 PlySs2의 병용물이 표기된 농도로 희석된 패널을 제공한다.
도 11은 BME의 존재하에 MRSA 균주 223에 대한 답토마이신과 PlySs2의 병용물이 표기된 농도로 희석된 패널을 제공한다.
도 12는 BME의 부재하에 MRSA 균주 223에 대한 답토마이신과 PlySs2의 병용물이 표기된 농도로 희석된 패널을 제공한다.
도 13은 BME의 존재 및 부재하에 MRSA 균주 270에 대한 답토마이신과 PlySs2의 병용물이 표기된 농도로 희석된 패널을 제공한다.
도 14는 BME의 존재 및 부재하에 MRSA 균주 269에 대한 답토마이신과 PlySs2의 병용물이 표기된 농도로 희석된 패널을 제공한다.
도 15는 BME의 존재 및 부재하에 MRSA 균주 241에 대한 답토마이신과 PlySs2의 병용물이 표기된 농도로 희석된 패널을 제공한다.
도 16은 BME의 존재 및 부재하에 MRSA 균주 263에 대한 답토마이신과 PlySs2의 병용물이 표기된 농도로 희석된 패널을 제공한다.
도 17은 BME의 존재 및 부재하에 MRSA 균주 650에 대한 답토마이신과 PlySs2의 병용물이 표기된 농도로 희석된 패널을 제공한다.
도 18은 BME의 존재 및 부재하에 MRSA 균주 828에 대한 답토마이신과 PlySs2의 병용물이 표기된 농도로 희석된 패널을 제공한다.
도 19는 리신 PlySs2의 FIC 값 대 항생제의 FIC 값의 대표적인 아이소볼로그램(isobologram)을 보여준다. PlySs2 대 항생제 옥사실린, 반코마이신 및 답토마이신은 표기된 MSSA 균주와 MRSA 균주에 대해 그래프화한 것이다. 옥사실린과 PlySs2는 MSSA 균주 JMI 33611에 대한 평가이다. PlySs2와 반코마이신은 MSSA 균주 JMI 9365 및 MRSA 균주 JMI 6456에 대한 평가이다. 답토마이신과 PlySs2는 MSSA 균주 JMI 33611 및 MRSA JMI 3345에 대한 평가이다.
도 20의 A 및 도 20의 B는 MIC 이하 용량의 PlySs2의 부재 및 존재하에서 BODIPY-표지된 답토마이신(A) 및 반코마이신(B)에 의한 스태필로코커스 아우레우스 염색의 시간 경과를 제공한다.
도 21은 다양한 양의 계면활성제(1.25 내지 15% 계면활성제)의 존재하에서 PlySs2 또는 답토마이신으로 치료된 MRSA 균주 MW2 및 MSSA 균주 ATCC29213에 대한 MIC의 배수 변동을 보여준다.
도 22는 15% 계면활성제(서반타(Survanta))의 존재하에 MRSA 균주 269에 대한 답토마이신과 PlySs2의 병용물이 표기된 농도로 희석된 패널을 제공한다.
도 23은 박테리아 접종물 농도를 1.1 내지 3.1x106 CFU로 한 몇 차례 실험에서 MRSA 균주 269(MW2)로 챌린지(challenge)되고 답토마이신 또는 PlySs2에 의해 단독으로 또는 병용물로 치료된 마우스(50마리)의 생존율(%)을 편집한 그래프이다.
도 24는 2.65x106 CFU의 MRSA 균주 220으로 챌린지되고 표기된 용량의 답토마이신 또는 PlySs2에 의해 단독으로 또는 병용물로 치료된 마우스의 생존율(%)을 보여준다.
도 25는 1.4x106 CFU의 MRSA 균주 833으로 챌린지되고 표기된 용량의 답토마이신 또는 PlySs2에 의해 단독으로 또는 병용물로 치료된 마우스의 생존율(%)을 보여준다.
도 26은 2.0x106 CFU의 MRSA 균주 833으로 챌린지되고 표기된 용량의 답토마이신 또는 PlySs2에 의해 단독으로 또는 병용물로 치료된 마우스의 생존율(%)을 보여준다.
도 27의 A 내지 도 27의 F는 뮤린 균혈증 모델에 대한 병용 치료요법 대 단독 치료요법의 생존율 곡선을 보여준다. 마우스를 7.5x106 cfu/마우스(저 챌린지 모델 - 도 27의 A) 또는 109 cfu/마우스(높은 도전 모델 - 도 27의 B 내지 도 27의 F)로 복강내 도전하고 항생제, PlySs2, PlySs2와 항생제와의 병용물 또는 대조군으로 치료하였고, 수득된 생존율 데이터는 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 방법으로 분석된 것이다. 모든 용량은 단일 볼루스 용량(single bolus dose)으로 투여되었고, 단 반코마이신(BID, 도 27의 E)와 옥사실린(QID, 도 27의 F)은 처음 24시간에 걸쳐 수회 용량으로 투여되었다. 투여 경로는 PlySs2의 경우 복강내, 답토마이신 및 반코마이신의 경우 피하, 옥사실린의 경우 근육내이다. P 값은 병용물 대 항생제 단독에 대해 계산되었다. (A) 2 mg/kg의 답토마이신과 1.25 mg/kg의 PlySs2와 함께 MRSA 균주 MW2를 이용한 저 챌린지 모델. 접종 후 4시간 경과하여 투약, n=30, P<0.0001. (B) 50 mg/kg의 답토마이신과 5.25 mg/kg의 PlySs2와 함께 MRSA 균주 MW2를 이용한 고 챌린지 모델. 접종 후 2시간 경과하여 투약, n=45, P<0.0001. (C) B와 동일하지만 MRSA 균주 738을 사용, n=30, P<0.0001. (D) B와 동일하지만 MRSA 균주 832를 사용, n=30, P<0.0001. (E) 110 mg/kg BID의 반코마이신과 5.25 mg/kg의 PlySs2와 함께 MRSA 균주 MW2를 사용한 고 챌린지 모델. 접종 후 2시간 경과하여 투약, n=30, P<0.0001. (F) 200 mg/kg QID의 옥사실린과 5.25 mg/kg의 PlySs2와 함께 MSSA 균주 ATCC 25923을 사용한 고 챌린지 모델. 접종 후 2시간 경과하여 투약, n=30, P<0.0001.
도 28은 계대수 및 답토마이신 내성 발생과 함께 MSSA 및 MRSA 균주에 대한 답토마이신 및 PlySs2의 MIC를 보여준다. PlySs2 MIC는 감소하고 이는 PlySs2 민감성 증가와 답토마이신 내성 증가로 나타난다.
도 29는 리신 PlySs2의 아미노산 서열(서열번호 1)과 암호화 핵산 서열(서열번호 2)을 제공한다. PlySs2 리신의 N-말단 CHAP 도메인과 C-말단 SH-3 도메인은 음영처리되어 있고, CHAP 도메인(서열번호 3)은 LNN부터 YIT까지이고, SH-3 도메인(서열번호 4)은 RSY부터 VAT까지이다. PDB 2K3A(Rossi P et al (2009) Proteins 74:515-519)와 상동성으로 동정된 CHAP 도메인 활성 부위 잔기(Cys26, His102, Glu118 및 Asn120)에는 밑줄로 표시되어 있다.
도 30은 다수의 배양물(각 3회 독립 배양물)에서 단독적인 답토마이신 또는 답토마이신과 MIC 이하 용량의 PlySs2 리신의 병용물의 존재하에 내성 선택 조건하에서 연속 계대 일수의 함수로서 답토마이신 MIC 값의 배수(fold) 변동을 보여준다.
도 31은 다수의 배양물(각 3회 독립 배양물)에서 단독적인 답토마이신 또는 답토마이신과 MIC 이하 용량의 PlySs2 리신의 병용물의 존재하에 내성 선택 조건하에서 연속 계대 일수의 함수로서 반코마이신 MIC 값의 배수 변동을 보여준다.
본 분야의 기술에 속하는 통상적인 분자생물학, 미생물학 및 DNA 재조합기술은 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 이러한 기술들은 문헌에 자세히 설명되어 있다(참조문헌: Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III [Ausubel, R. M., ed. (1994)]; "Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volumes I-III [J. E. Celis, ed. (1994))]; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III [Coligan, J. E., ed. (1994)]; "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription And Translation" [B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)]; "Animal Cell Cu1ture" [R.I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984)).
따라서, 다음의 용어들은 본원에서 사용되는 경우 아래에서 정의하는 의미를 갖는다.
용어 "PlySs 리신(들)", "PlySs2 리신", "PlySs2" 및 특정적으로 수록되지 않은 모든 변이체들은 본원에서 서로 교환하여 사용할 수 있고, 본원 명세서 및 특허청구범위 전체에서 한 개 또는 여러 개의 단백질을 포함하는 단백질성 물질을 가리키고 본원에 기술되어 있고 도 29에 그리고 서열번호 1로 제시된 아미노산 서열 데이터 및 본원 명세서 및 특허청구범위에 설명된 활성 프로필을 갖는 단백질을 포괄한다. 따라서, 실질적으로 균등하거나 변이된 활성을 나타내는 단백질도 동일하게 고려된다. 이들 변형은 예를 들어 위치지정돌연변이에 의해 수득된 변형과 같이 인위적일 수 있거나 그 복합체 또는 이의 지명된 아단위의 생산자인 숙주에서의 돌연변이를 통해 수득된 변형과 같이 우연적일 수 있다. 또한, 용어 "PlySs 리신(들)", "PlySs2 리신" 또는 "PlySs2"는 이의 범위안에 본원에 특정적으로 나열된 단백질뿐만 아니라 모든 실질적인 상동성 유사체, 단편 또는 절두형(truncation) 및 형질대립 변이체를 확실히 포함한다. PlySs2 리신은 미국 특허 제61/477,836호 및 국제 특허 PCT/US2012/34456에 기술되어 있다. 최근 논문 Glimer DB et al (2013) Antimicrob Agents Chemother Epub 2013 April 9 [PMID 23571534]에도 PlySs2 리신이 기술되어 있다.
용어 "ClyS" 또는 "ClyS 리신"은 스태필로코커스 아우레우스를 포함하는 스태필로코커스 박테리아에 대한 활성을 갖는 키메라 리신 ClyS를 가리키며, WO2010/002959에 상세히 설명되어 있고 또한 Daniel, A et al (2010) Antimicrobial Agents and Chemother 54(4):1603-1612에도 기술되어 있다. 대표적인 ClyS 아미노산 서열이 서열번호 5로 제공된다.
"용해 효소"는 적합한 조건하에 관련된 기간동안에 하나 이상의 박테리아를 사멸시키는 모든 박테리아 세포벽 용해 효소를 포함한다. 용해 효소의 예로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 여러 가지 아미다제 세포벽 용해 효소가 포함된다. 특정 양상에서, 용해 효소는 박테리오파지 용해 효소를 가리킨다. "박테리오파지 용해 효소"는 박테리오파지로부터 추출되거나 분리된 용해 효소 또는 용해 효소 기능을 유지하면서 유사한 단백질 구조를 갖는 합성 용해 효소를 가리킨다.
용해 효소는 박테리아 세포의 펩티도글리칸에 존재하는 결합을 특이적으로 절단하여 박테리아 세포벽을 붕괴시킬 수 있다. 또한 현재 추정되고 있는 바에 따르면 박테리아 세포벽 펩티도글리칸은 대부분의 박테리아에 고도로 보존되고 있으며 불과 소수의 결합이 절단되더라도 박테리아 세포벽은 붕괴될 수 있다. 이들 결합을 절단하는 용해 효소의 예로는 뮤라미다제, 글루코사미니다제, 엔도펩티다제 또는 N-아세틸-뮤라모일-L-알라닌 아미다제를 들 수 있다. Fischetti 등(1974)은 C1 스트렙토코커스 파지 리신 효소가 아미다제임을 보고하였다. Garcia 등(1987, 1990)은 스트렙토코커스 뉴모니아에 Cp-1 파지로부터의 Cp1 리신이 라이소자임임을 보고하였다. Caldentey와 Bamford(1992)는 phi 6 슈도모나스 파지로부터의 용해 효소가 멜로-디아미노피밀산과 D-알라닌에 의해 형성된 펩타이드 브릿지를 자르는 엔도펩티다제임을 보고하였다. 이. 콜라이 T1 및 T6 파지 용해 효소들은 리스테리아 파지로부터의 용해 효소(ply)와 같은 아미다제이다(Loessner et al, 1996). 또한, 박테리아 세포벽을 절단할 수 있는 본 분야에 알려져 있는 다른 용해 효소들도 있다.
"박테리오파지에 의해 유전자적으로 암호화된 용해 효소"는 예를 들어 숙주 박테리아에 대한 세포벽 용해 활성을 적어도 일부 가짐으로써 숙주 박테리아를 사멸시킬 수 있는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 폴리펩타이드는 천연 서열 용해 효소 및 이의 변이체를 아우르는 서열을 보유할 수 있다. 이 폴리펩타이드는 박테리오파지("파지")와 같은 다양한 기원으로부터 분리하거나 재조합 또는 합성 방법으로 제조할 수 있다. 이 폴리펩타이드는 예를 들어 카르복실 말단부에 콜린-결합 부분을 포함할 수 있고 아미노 말단부에서 세포벽 펩티도글리칸을 절단할 수 있는 효소 활성(예, 펩티도글리칸내의 아미드 결합에 작용하는 아미다제 활성)에 의해 특성화될 수 있다. 다수의 효소 활성을 포함하는, 예를 들면 PlyGBS 리신과 같이 두 개의 효소 도메인을 포함하는 용해 효소들이 공개되어 있다. 또한, 단지 한 개의 촉매 도메인을 함유하고 세포벽 결합 도메인을 전혀 포함하고 있지 않은 다른 용해 효소들이 기술되어 있다.
"고유(naive) 서열 파지 연관된 용해 효소"는 박테리아 게놈(즉, 프로파지)으로부터 유래된 효소와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이와 같은 고유 서열 효소는 분리될 수 있거나 재조합 또는 합성 수단에 의해 생성될 수 있다.
용어 "고유 서열 효소"는 효소의 자연적 발생 형태(예, 선택적 이어맞춤(alternatively spliced) 형태 또는 변이 형태) 및 자연적 발생 변이체를 포함한다. 본 발명의 한 실시형태로서, 고유 서열 효소는 스트렙토코커스 수이스에 대해 특이적인 박테리오파지로부터의 유전자에 의해 유전자적으로 암호화된 성숙 또는 전장 폴리펩타이드이다. 물론, 문헌[예, Lopez et a1., Microbial Drug Resistance 3: 199-211 (1997); Garcia et a1., Gene 86: 81-88 (1990); Garcia et a1., Proc. Nat1. Acad. Sci. USA 85: 914-918 (1988); Garcia et al., Proc. Nat1. Acad. Sci. USA 85: 914­918 (1988); Garcia et al., Streptococcal Genetics (J. J. Ferretti and Curtis eds., 1987); Lopez et a1., FEMS Microbio1. Lett. 100: 439-448 (1992); Romero et al., J. Bacterio1. 172: 5064-5070 (1990); Ronda et a1., Eur. J. Biochem. 164: 621-624 (1987) 및 Sanchez et a1., Gene 61: 13-19 (1987)]에 밝힌 바와 같이 다수의 변이체가 가능하고 공지되어 있다. 이들 각 참고문헌의 내용, 특히, 서열 상동성에 대한 설명을 포함하여 서열을 비교하는 서열목록 및 관련 텍스트는 이들 전체가 특별히 본원에 참고로 삽입된다.
"변이 서열 용해 효소"는 용해 효소의 서열과 다르지만 작용 활성을 유지하는 폴리펩타이드 서열로 특성화된 용해 효소를 포함한다. 용해 효소는, 일부 실시형태로서, 도 29에 그리고 서열번호 1에 제시된 용해 효소 서열(들)과 특정적인 아미노산 서열 동일성을 갖는 PlySs2의 경우와 같이 스트렙토코커스 수이스에 대해 특이적인 박테리오파지에 의해 유전자적으로 암호화될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태로서, 작용상 활성적인 용해 효소는 박테리아의 세포벽을 붕괴시킴으로써 표 1, 2 및 3에 나타낸 것을 포함하여 본원에 제공된 스트렙토코커스 수이스 박테리아 및 다른 민감성 박테리아를 사멸시킬 수 있다. 활성적인 용해 효소는 도 29에 제공된 용해 효소 서열(들)(서열번호 1, 서열번호 3 또는 서열번호 4)과 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 또는 99.5%의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 이와 같은 파지 연관된 용해 효소 변이체들은 예를 들어 도 29에 제공된 용해 효소 서열(들)(서열번호 1)의 N 또는 C 말단에 한 개 이상의 아미노산 잔기가 부가 또는 결실된 용해 효소 폴리펩타이드를 포함한다.
특정 양상에서, 파지 연관된 용해 효소는 고유 파지 연관된 용해 효소 서열과 적어도 약 80% 또는 85% 아미노산 서열 동일성, 특히, 적어도 약 90%(예, 90%) 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 가장 특정적으로는, 파지 연관된 용해 효소 변이체는 PlySs2 리신에 대해 도 29에 제공된 고유 파지 연관된 용해 효소 서열(들)(서열번호 1) 또는 WO2010/002959 및 Daniel et al (Daniel, A et al (2010) Antimicrobial Agents and Chemother 54(4):1603-1612)에 기술된 것 및 서열번호 5를 포함하여 ClyS에 대해 이전에 기술된 것과 같은 고유 파지 연관된 용해 효소 서열(들)과 적어도 약 95%(예, 95%) 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
동정된 파지 연관된 용해 효소 서열과 관련하여 "아미노산 서열 동일성 퍼센트"는, 본원에서, 동일한 리딩 프레임의 서열들을 정렬하고 서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존 치환도 고려하지 않으면서 최고 퍼센트의 서열 동일성을 달성하기 위해 필요한 경우 갭을 도입한 후, 파지 연관된 용해 효소 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다.
본원에 동정된 파지 연관된 용해 효소 서열과 관련하여 "핵산 서열 동일성 퍼센트"는 서열들을 정렬하고 최고 퍼센트의 서열 동일성을 달성하기 위해 필요한 경우 갭을 도입한 후 파지 연관된 용해 효소 서열의 뉴클레오타이드와 동일한 후보 서열의 뉴클레오타이드의 백분율로서 정의된다.
두 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 동일성 퍼센트를 결정하는데 있어서, 그 두 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 제1 뉴클레오타이드 서열에 갭이 도입될 수 있다). 그런 다음, 상응하는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치의 뉴클레오타이드 또는 아미노산이 비교된다. 제1 서열의 위치가 제2 서열의 상응하는 위치와 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산에 의해 점유될 때 이 분자들은 그 위치에서 동일한 것이다. 두 서열간의 동일성 퍼센트는 두 서열에 의해 공유된 동일 위치 수의 함수이다(즉, 동일성(%) = 동일 위치의 수/ 위치의 총 수 x 100).
두 서열 사이에 동일성 퍼센트의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성할 수 있다. 두 서열의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 비제한적인 예는 Karlin 등의 알고리즘(Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877 (1993))으로, 이 알고리즘은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 목적하는 동일성을 갖는 서열을 동정하는데 사용할 수 있는 NBLAST 프로그램에 적용된다. 비교 목적의 갭삽입 정렬을 얻기 위하여, 갭삽입(gapped) BLAST를 Altschul et al., Nucleic Acids Res, 25:3389-3402 (1997)에 기술된 바와 같이 사용할 수 있다. BLAST 및 갭삽입 BLAST 프로그램을 사용할 때 각 프로그램(예, NBLAST)의 기본값(default) 매개변수를 사용할 수 있다(참조: National Center for Biotechnology Information(National Library of Medicine, National Institutes of Health)에 의해 제공된 프로그램).
"폴리펩타이드"는 다수의 아미노산들이 선형으로 결합되어 이루어진 중합체 분자를 포함한다. 일부 실시형태로서, 폴리펩타이드는 자연발생적 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 분자에 상응할 수 있다. 이 폴리펩타이드는 천연 아미노산이 유사한 특성을 가진 아미노산에 의해 치환되고 폴리펩타이드의 기능에 변화를 일으키지 않는 보존치환을 포함할 수 있다.
용어 "변이된 용해 효소"는 셔플링(shuffling)되고/되거나 키메라화(chimerization)된 용해 효소를 포함한다.
특정 파지로 감염된 박테리아에 대해 특이적인 파지 용해 효소는 해당 박테리아의 세포벽을 효과적으로 및 효율적으로 붕괴시키는 것으로 밝혀져 있다. 용해 효소는 단백질분해 효소활성이 없는 것으로 알려져 있고, 이에 따라 박테리아 세포벽을 분해하는 동안 포유류 단백질과 조직이 존재하더라도 이들을 파괴하지 않는다. 게다가, 항생제와 다르게 파지 용해 효소의 작용은 표적 병원균(들)에만 특이적인 것으로 밝혀져 있기 때문에, 정상균총은 반드시 온전하게 남아 있음이 확실하다(M. J. Loessner, G. Wendlinger, S. Scherer, Mol Microbiol 16, 1231-41 (1995)-이 문헌의 내용은 본원에 인용에 의해 포함된다). 실제로, PlySs2 리신은 독특하게 넓은 박테리아 종 및 균주를 사멸시킨다는 것이 입증되어 있는 한편, 본원에 기술된 바와 같이 이. 콜라이를 포함하는 정상균총을 포함하는 박테리아에 대해 비교적으로 특별하게 활성을 나타내지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용해 효소 또는 폴리펩타이드는 감염 증상 환자에게 노출된 사람이 병에 걸리지 않도록 방지하는 예방제 또는 감염되어 이미 병에 걸린 사람을 위한 치유하는 치료제로서 박테리아 유기체가 특정 박테리오파지로 감염된 후에 생성할 수 있거나 재조합 또는 합성에 의해 생성 또는 제조할 수 있다. 리신 폴리펩타이드 서열과 이를 암호화하는 핵산이 본원에 기술되어 있고 이를 참고할 수 있다는 점에서, 용해 효소(들)/폴리펩타이드(들)은 바람직하게는 본원에 예시된 것을 포함하는 본 분야의 표준 방법을 사용하여 파지 게놈으로부터 분리된 용해 효소 유전자를 전달 벡터에 삽입하고 이 전달 벡터를 발현 시스템내로 클로닝함으로써 생성할 수 있다. 용해 효소(들) 또는 폴리펩타이드(들)는 절두형, 키메라형, 셔플링형 또는 "천연형"이고 조합형일 수 있다. 관련된 미국특허 제5,604,109호는 이의 전체 내용이 본원에 인용에 의해 포함된다. "변형된" 용해 효소는 다양한 방법으로 생성할 수 있다. 바람직한 실시형태로서, 파지 게놈으로부터의 변이된 용해 효소 유전자를 전달 또는 이동 벡터, 바람직하게는 플라스미드내에 삽입하고, 플라스미드를 발현 벡터 또는 발현 시스템내로 클로닝한다. 본 발명의 리신 폴리펩타이드 또는 효소를 생성하는 발현 벡터는 이. 콜라이, 바실러스 또는 많은 다른 적당한 박테리아에 적합한 것일 수 있다. 또한, 벡터 시스템은 무세포 발현시스템일 수 있다. 유전자 또는 유전자 세트를 발현시키는 상기 방법들 모두는 본 분야에 알려져 있는 것들이다. 또한, 용해 효소는 스트렙토코커스 수이스를 이 균주에 특이적인 박테리오파지로 감염시킴으로써 생성할 수 있으며, 여기서 상기 용해 효소중 적어도 하나는 존재하는 다른(예, 천연적인 또는 공생적인) 박테리아 균총에 기껏해야 최소의 영향을 미치는, 스트렙토코커스 수이스의 세포벽만을 독단적으로 용해시킨다.
"키메라 단백질" 또는 "융합 단백질"은 이종 폴리펩타이드에 작동가능하게 연결된 본 발명에서 사용되는 폴리펩타이드의 전부 또는 (바람직하게는 생물학적으로 활성적인) 일부를 포함한다. 키메라 단백질 또는 펩타이드는 예를 들면 둘 이상의 활성 부위를 갖는 둘 이상의 단백질을 결합시킴으로써 형성한다. 키메라 단백질 및 펩타이드는 동일 또는 다른 분자에 독립적으로 작용할 수 있고, 그럼으로써 같은 시간에 두 가지 이상의 다른 박테리아 감염을 치료할 수 있는 잠재능을 가진다. 또한, 키메라 단백질 및 펩타이드는 하나 이상의 위치에서 세포벽을 절단하고, 그럼으로써 단일 리신 분자 또는 키메라 펩타이드로부터 보다 더 신속하거나 효과적인 (또는 상승작용적인) 사멸을 잠재적으로 제공함으로써 박테리아 감염을 치료하는데 사용할 수 있다.
DNA 작제물 또는 펩타이드 작제물의 "이종" 영역은 자연에서 더 큰 분자와 결합하고 있는 것으로 발견되지 않는 것으로서 더 큰 DNA 분자내에서 동정가능한 DNA 단편 또는 더 큰 펩타이드 분자내에서 동정가능한 펩타이드 단편이다. 따라서, 이종 영역이 포유류 유전자를 암호화하고 있는 경우, 이 유전자는 기원 유기체의 게놈내에 포유류 게놈 DNA 양쪽에 위치하지 않는 DNA를 인접시키는 것이 보통이다. 이종 암호화 서열의 다른 예는 암호화 서열 자체가 자연에서 발견되지 않는 작제물(예, 게놈 암호화 서열이 인트론을 함유한 cDNA 또는 고유 유전자의 것과 다른 코돈을 갖는 합성 서열)이다. 대립형질 변이 또는 자연 발생적 돌연변이 발생은 본원에 정의된 DNA 또는 펩타이드의 이종 영역을 생성하지 않는다.
용어 "작동적으로 연결된"은 본 발명의 폴리펩타이드와 이종 폴리펩타이드가 프레임내에서 융합되어 있음을 의미한다. 이종 폴리펩타이드는 본 발명의 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 키메라 단백질은 화학적 합성에 의해 효소적으로 생성되거나 DNA 재조합 기술에 의해 생성된다. 많은 키메라 효소들이 생성되고 연구되어 왔다. 유용한 융합 단백질 중 한 예는 본 발명의 폴리펩타이드가 GST 서열의 C-말단에 융합된 GST 융합 단백질이다. 이러한 키메라 단백질은 본 발명의 재조합 폴리펩타이드의 정제를 촉진할 수 있다.
다른 실시형태로서, 키메라 단백질 또는 펩타이드는 이의 N-말단에 이종 시그널 서열을 함유한다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드의 고유 시그널 서열은 제거되어 다른 알려진 단백질로부터의 시그널 서열로 치환될 수 있다.
융합 단백질은 리신 폴리펩타이드를 다른 성능을 갖고 있거나 리신 폴리펩타이드에 추가의 성능 또는 추가의 특성을 제공하는 단백질 또는 폴리펩타이드와 결합시킨 것일 수 있다. 융합 단백질은 본 발명의 폴리펩타이드의 전부 또는 일부가 면역글로불린 단백질 계열의 일원으로부터 유도된 서열과 융합된 면역글로불린 융합 단백질일 수 있다. 면역글로불린은 항체일 수 있고, 예를 들면 민감성 또는 표적 박테리아의 표면 단백질 또는 에피토프에 지향성인 항체이다. 면역글로불린 융합 단백질은 본 발명의 폴리펩타이드의 동족 리간드의 생체이용률을 변경시킬 수 있다. 리간드/수용체 상호작용의 억제는 박테리아-연관된 질병 및 질환의 치료와 세포 생존의 조절(즉, 촉진 또는 억제) 모두를 위해 치료학적으로 유용하다. 융합 단백질은 특정 조직 또는 기관으로 리신을 유도하거나 기구, 플라스틱 또는 막과 같은 표면으로 리신을 유도하는 것을 포함하여 리신을 표적화 또는 유도하는 수단을 포함할 수 있다. 본 발명의 키메라 및 융합 단백질 및 펩타이드는 표준 DNA 재조합 기술에 의해 제조할 수 있다.
본원에 개시된 단백질 또는 펩타이드 및 펩타이드 단편의 변형 또는 변이 형태는 화학적으로 합성되거나 DNA 재조합 기술에 의해 제조되거나 양 방법에 의해 생성되는 단백질 또는 펩타이드 및 펩타이드 단편을 포함한다. 이들 기술은 예를 들어 키메라화 및 셔플링을 포함한다. 본원에서 사용되는, 셔플링된 단백질 또는 펩타이드, 유전자 생성물 또는 한 개 이상의 관련된 파지 단백질 또는 단백질 펩타이드 절편을 위한 펩타이드는 무작위로 절단되고 더 활성적이거나 특이적인 단백질로 재조립되었다. 셔플링된 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드 또는 펩타이드 절편 분자들은 목적하는 기능성을 갖는 분자의 동정을 위해 선택 또는 선별된다. 셔플링은 주형 단백질보다 더 활성적인, 예를 들면 최대 10배 내지 100배 더 활성적인 단백질을 생성하기 위해 사용할 수 있다. 주형 단백질은 다른 여러 종류의 리신 단백질중에서 선택된다. 셔플링된 단백질 또는 펩타이드는 예를 들면 한 개 이상의 결합 도메인과 한 개 이상의 촉매 도메인을 구성한다. 단백질 또는 펩타이드가 화학적 합성에 의해 생성될 때, 이 단백질 또는 펩타이드에는 바람직하게는 화학전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 존재하지 않으며, 즉, 합성된 단백질 또는 펩타이드는 이의 합성에 연루된 화학전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리된다. 따라서, 이와 같은 단백질 작용제는 목적하는 폴리펩타이드외에 다른 화학전구체 또는 화합물을 약 30%, 20%, 10%, 5%(건식중량 기준) 미만으로 갖는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 유용한 폴리펩타이드의 다른 변이체에 관한 것이다. 이와 같은 변이체들은 효능제(agonists)(모사체(mimetics)) 또는 길항제(antagonists)로 작용할 수 있는 변이된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 변이체는 돌연변이유발, 즉 독립적인 점돌연변이 또는 절두에 의해 형성될 수 있다. 효능제는 천연 단백질 형태와 실질적으로 동일한 생물학적 활성 또는 부분 활성을 유지할 수 있다. 단백질의 길항제는 천연 단백질 형태의 활성중 하나 이상을 억제할 수 있으며, 예를 들면 목적하는 단백질을 포함하는 세포 신호전달 체계의 하류 또는 상류 구성원과 경쟁적으로 결합함으로써 억제할 수 있다. 따라서, 특이적인 생물학적 효과들은 기능이 제한적인 변이체로 처치함으로써 유도해낼 수 있다. 천연 단백질 형태의 생물학적 활성중 부분 활성을 갖는 변이체로 대상자를 처치하는 것은 그 천연 단백질 형태로 대상자를 처치한 경우에 비하여 부작용을 적게 유발할 수 있다. 효능제(모사체) 또는 길항제로 작용하는 것으로서 본 발명에서 사용되는 단백질 변이체들은 본 발명에 따른 단백질의 돌연변이체(예, 절두형 돌연변이체)들의 조합 라이브러리를 선별하여 동정할 수 있다. 한 실시형태로서, 변이체들의 다양화 라이브러리는 핵산 수준에서 조합 돌연변이유발로 형성하며 다양화 유전자 라이브러리에 의해 암호화되어 있다. 축퇴성(degenerate) 올리고뉴클레오타이드 서열로부터 본 발명의 잠재적인 폴리펩타이드 변이체의 라이브러리를 생성하기 위해 사용할 수 있는 방법들은 다양하다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 암호화 서열의 절편의 라이브러리들을 사용하여 변이체, 활성 단편 또는 절두형을 선별하고 이어서 선택하기 위한 폴리펩타이드의 다양화 집합체를 형성할 수 있다. 점돌연변이 또는 절두에 의해 생성된 조합 라이브러리의 유전자 생성물을 선별하는 기술과 특정 성질을 갖는 유전자 생성물의 cDNA 라이브러리를 선별하는 기술은 본 분야에 서너 가지가 알려져 있다. 대규모 유전자 라이브러리를 선별하는데 고속처리분석이 가능한 것으로 가장 폭넓게 사용되고 있는 기술들은 복제성 발현 벡터내로 유전자 라이브러리를 클로닝하고, 생성된 벡터 라이브러리로 적당한 세포를 형질전환시키며, 목적하는 활성을 검출하여 검출물 유전자를 암호화하는 벡터의 분리를 촉진하는 조건하에서 조합 유전자를 발현시키는 것을 포함한다. 이러한 맥락에서, 실시형태에 따른 가장 작은 단백질(또는 이 단백질의 암호화 핵산) 부분은 리신 단백질을 생성하는 파지를 특이적인 것으로 인식할 수 있는 에피토프이다. 따라서, 표적 또는 수용체(예, 항체)와 결합할 것으로 기대할 수 있고 일부 실시형태를 위해 유용한 가장 작은 폴리펩타이드(및 이 폴리펩타이드를 암호화하는 관련 핵산)는 길이가 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 75, 85 또는 100개의 아미노산일 수 있다. 비록 길이가 8, 9, 10, 11, 12 또는 15개의 아미노산 정도로 작은 서열들이 표적 또는 에피토프로 작용하기에 충분한 구조를 함유함에는 확실하지만, 길이가 5, 6 또는 7개 아미노산으로 더 짧은 서열들도 일부 조건에서 표적 또는 에피토프 구조를 나타낼 수 있고 가치있는 실시형태이다. 따라서, 도 29에 기술된 것을 포함하여 본원에 제공된 단백질(들)(서열번호 1) 또는 리신 폴리펩타이드의 가장 작은 부분은 길이가 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14 또는 16개 아미노산으로 구성된 작은 폴리펩타이드를 포함한다.
본원에 기술된 실시형태들의 단백질 또는 펩타이드 단편의 생물학적 활성 부분은 본 발명의 리신 단백질의 아미노산 서열과 충분히 동일하거나 이 서열로부터 유도된 아미노산 서열을 포함하고, 전장 리신 단백질보다 적은 수의 아미노산을 포함하며, 전당 리신 단백질의 활성 중 적어도 하나를 나타내는 폴리펩타이드를 포함한다. 전형적으로, 생물학적 활성 부분은 전장 리신 단백질의 활성중 적어도 하나를 갖는 도메인 또는 모티프를 포함한다. 본 발명에 따른 리신의 N 말단 CHAP 도메인에 대한 예시적인 도메인 서열은 도 29에 그리고 서열번호 3에서 제공된다. 본 발명에 따른 리신의 C 말단 SH3 도메인에 대한 예시적인 도메인 서열은 도 29에 그리고 서열번호 4에서 제공된다. 본 발명에 따른 단백질 또는 단백질 단편의 생물학적 활성 부분은 예를 들면 길이가 10, 25, 50, 100개 미만 또는 초과의 아미노산인 폴리펩타이드일 수 있다. 게다가, 단백질의 다른 영역이 결실되거나 부가된 다른 생물학적 활성 부분은 재조합 기술로 제조하고 실시형태들의 고유 폴리펩타이드 형태의 작용 활성중 하나 이상에 대해 평가할 수 있다.
본 분야의 전문가가 인정할 수 있는 정도의 작은 단백질 및/또는 핵산(또는 더 큰 분자의 단백질 및/또는 핵산 영역)과 작용성을 공유하는 상동성 단백질 및 핵산을 제조할 수 있다. 상동성일 수 있는 그와 같은 작은 분자 및 보다 큰 분자의 짧은 영역들은 특별히 실시형태로서 제시된다. 이러한 가치있는 영역들은 도 29에 기술된 것을 포함하여 본원에 제공된 리신 폴리펩타이드와 바람직하게는 적어도 50%, 65%, 75%, 80%, 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 적어도 99%의 상동성을 갖는다. 이들 상동성 퍼센트 값은 보존 아미노산 치환에 의한 변이를 포함하지 않는다.
두 아미노산 서열은 아미노산 잔기의 약 70% 이상(바람직하게는 약 80% 이상, 약 85% 이상 및 바람직하게는 약 90% 또는 95% 이상)이 동일하거나 보존 치환을 나타낼 때 "실질적으로 상동성"이다. 유사 리신들, 예를 들어 유사 PlySs2 리신들 또는 유사 ClyS 리신들의 서열은 리신 폴리펩타이드의 아미노산중 한 개 또는 그 이상, 또는 서너 개, 또는 10%까지, 또는 15%까지 또는 20%까지가 유사한 또는 보존적 아미노산 치환으로 치환되고 유사 리신들이 본원에 개시된 리신(예, PlySs2 리신 및/또는 ClyS 리신)의 활성, 항균효과 및/또는 박테리아 특이적의 프로필을 가질 때 실질적으로 상동성이다.
본원에 기술된 아미노산 잔기는 바람직하게는 "L" 이성체형이다. 그러나, 폴리펩타이드가 목적하는 면역글로불린-결합 작용성을 유지하는 한 어떠한 L-아미노산 잔기도 "D" 이성체형의 잔기로 치환될 수 있다. NH2는 폴리펩타이드의 아미노 말단에 존재하는 유리 아미노기를 가리킨다. COOH는 폴리펩타이드의 카르복시 말단에 존재하는 유리 카르복시기를 가리킨다. 아래 연계표는 폴리펩타이드 표준 명명법(J. Biol. Chem. 243:3552-59 (1969))에 따른 아미노산 잔기의 약어를 보여준다.
Figure pat00001
돌연변이는 아미노산 서열에서거나, 도 29에 기술된 리신 서열(서열번호 1)을 포함하는 본원의 폴리펩타이드 및 리신을 암호화하는 핵산 서열에서거나, 특정 코돈이 다른 아미노산을 암호화한 코돈으로 변경되거나 한 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나 하나 이상의 아미노산이 결실된 활성 단편 또는 절두형에서 이루어질 수 있다. 이러한 돌연변이는 일반적으로 가능한 가장 적은 수의 아미노산 또는 뉴클레오타이드을 변경시킴으로써 달성한다. 이러한 유형의 치환 돌연변이는 생성된 단백질의 아미노산 변경을 비보존 방식으로(예를 들면, 특정 크기 또는 특성을 갖는 아미노산 그룹에 속하는 아미노산으로부터 다른 그룹에 속하는 아미노산으로 코돈을 변경시킴으로써) 또는 보존 방식으로(예를 들면, 특정 크기 또는 특성을 갖는 아미노산 그룹에 속하는 아미노산으로부터 동일 그룹에 속하는 아미노산으로 코돈을 변경시킴으로써) 달성할 수 있다. 이러한 보존 변경은 일반적으로 생성된 단백질의 구조 및 기능에 적은 변화를 유도한다. 비보존 변경은 생성된 단백질의 구조, 활성 또는 기능에 더 많은 변화를 일으킨다. 본 발명은 생성된 단백질의 활성 또는 결합 특성에 유의하게 변화를 일으키지 않는 보존 변경을 함유한 서열을 포함하는 것으로 고려되어야 한다.
따라서, 본 분야의 전문가는 본원에 제공된 PlySs2 리신 폴리펩타이드의 서열을 검토하고 다른 리신 폴리펩타이드에 대한 지식과 공개 정보를 기반으로 하여, 리신 폴리펩타이드 서열에 아미노산 변경 또는 치환을 이룰 수 있다. 아미노산 변경은 본원에 제공된 리신(들)의 서열에서 한 개 또는 그 이상, 한 개 또는 두세 개, 한 개 또는 서너 개, 한 개 내지 다섯 개, 한 개 내지 열 개 또는 이러한 다른 개수의 아미노산을 교체 또는 치환시켜 돌연변이체(mutant) 또는 변이체(variant)를 생성함으로써 달성할 수 있다. 이와 같은 돌연변이체 또는 변이체들은 스태필로코커스, 스트렙토코커스, 리스테리아 또는 엔테로코커스 박테리아를 포함하는 박테리아의 사멸 작용에 대해 예측될 수 있거나, 상기 박테리아의 사멸 작용 또는 사멸 능력 및/또는 본원에 기술되고 특별히 제공된 리신(들)과 유사한 활성의 유무에 대해 검사받을 수 있다. 따라서, 리신의 서열에 변형을 이룰 수 있고 서열에 변형을 갖는 돌연변이체 또는 변이체는 실시예에 있는 것을 포함하여 본원에 기술되고 예시된 검정 및 방법을 사용하여 검사할 수 있다. 본 분야의 전문가는 리신(들)의 도메인 구조를 근거로 치환 또는 교체에 적합한 한 개 또는 그 이상, 한 개 또는 서너 개 아미노산 및/또는 합당한 보존 또는 비보존 치환을 포함하여 치환 또는 교체에 적합하지 않은 한 개 또는 그 이상의 아미노산을 예측할 수 있다.
이러한 양상에서 그리고 PlySs2 리신을 예로 하였을 때 언급하지 않을 수 없는 것은 비록 PlySs2 폴리펩타이드 리신이 프로파지 용해 효소의 다른 부류를 대표하더라도 PlySs2 폴리펩타이드 리신은 도 29에 도시된 N-말단 CHAP 도메인(시스테인-히스티딘 아미도하이드롤라제/펩티다제)(서열번호 3) 및 C-말단 SH3-5형 도메인(서열번호 4)를 포함한다는 점이다. 도메인의 아미노산 서열은 회색의 그림자 영역으로 구분되어 있고, CHAP 도메인은 LNN으로 시작하는 첫번째 그림자 영역의 아미노산 서열에, SH3-5형 도메인은 RSY로 시작하는 두번째 그림자 영역의 아미노산 서열에 해당한다. CHAP 도메인들은 이전에 특성화된 서너 개의 스트렙토코커스 및 스태필로코커스 파지 리신에 포함된다. 따라서, 본 분야 전문가는 PlySs2의 CHAP 도메인 및/또는 SH-3 도메인으로의 치환 또는 교체를 적정하게 만들고 검사할 수 있다. CHAP 및/또는 SH-3 도메인 서열중 어느 하나 또는 둘 다를 진뱅크 데이터베이스와 서열비교하거나 PlySs2 리신 전체 아미노산 서열을 진뱅크 데이터베이스와 서열비교하여 예를 들면 치환을 위한 아미노산을 동정할 수 있다. 예를 들어, 이 CHAP 도메인은 다른 폴리펩타이드의 CHAP 도메인에서 특징적이고 보존되고 있는 시스테인 및 히스티딘 아미노산 서열(CHAP 도메인에서 첫번째 시스테인 및 히스티딘)을 보존적으로 함유한다. 예를 들어, 보존된 시스테인 및 히스티딘 잔기들이 활성 또는 성능이 유지되도록 PlySs2의 돌연변이체 또는 변이체에 유지되어야 한다는 점을 추정하는 것은 타당하다. 도 29의 PlySs2 아미노산 서열(서열번호 1)에서 19번 아미노산의 발린이 알라닌으로 치환된 돌연변이체 또는 변이체가 도 29(서열번호 1) PlySs2 리신과 유사한 방식으로 및 대등한 효능으로 활성적이고 그람 양성 박테리아를 사멸시킬 수 있다는 것은 주목할 만하다.
다음은 아미노산의 다양한 그룹 분류중에서 한 예를 보여준다:
비극성 R 기를 갖는 아미노산
알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌
하전되지 않은 극성 R 기를 갖는 아미노산
글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민
하전된 극성 R 기(pH 6.0에서 음전하)를 갖는 아미노산
아스파트산, 글루탐산
염기성 아미노산(pH 6.0에서 양전하)
리신, 아르기닌, 히스티딘(pH 6.0에서)
다른 그룹 분류는 페닐 기를 가진 아미노산일 수 있다:
페닐알라닌, 트립토판, 티로신
다른 그룹 분류는 분자량(즉, R 기의 크기)에 따라 이루어질 수 있다:
글리신 75 알라닌 89
세린 105 프롤린 115
발린 117 트레오닌 119
시스테인 121 류신 131
이소류신 131 아스파라긴 132
아스파트산 133 글루타민 146
리신 146 글루탐산 147
메티오닌 149 히스티딘 155 (pH 6에서)
페닐알라닌 165 아르기닌 174
티로신 181 트립토판 204
특히, 바람직한 치환은 다음과 같다:
- 양전하가 유지될 수 있도록 Arg을 Lys으로 및 Lys을 Arg으로
- 음전하가 유지될 수 있도록 Asp를 Glu으로 및 Glu을 Asp으로
- 유리 -OH가 유지될 수 있도록 Thr이 Ser으로
- 유리 NH2가 유지될 수 있도록 Asn이 Gln으로
바람직한 보존적 아미노산 치환의 예로는 다음의 것을 포함한다:
글루탐산(E)을 글루타민(Q)으로 및 반대로; 발린(V)을 류신(L)으로 및 반도로; 트레오닌(T)을 세린(S)으로 및 반대로; 발린(V)을 이소류신(I)으로 및 반대로; 글루타민(Q)을 리신(K)으로 및 반대로; 메티오닌(M)을 이소류신(I)으로 및 반대로; 아스파라긴(N)을 세린(S)으로 및 반대로; 메티오닌(M)을 류신(L)으로 및 반대로; 글루탐산(E)을 리신(L)으로 및 반대로; 세린(S)을 알라닌(A)으로 및 반대로; 페닐알라닌(F)을 티로신(Y)으로 및 반대로; 아스파트산(D)을 글루탐산(E)으로 및 반대로; 이소류신(I)을 류신(L)으로 및 반대로; 아르기닌(R)을 리신(K)으로 및 반대로.
또한, 아미노산 치환은 특히, 바람직한 특성을 갖는 아미노산을 도입하기 위해 이루어질 수 있다. 예를 들면, Cys는 다른 Cys와의 이황화 가교(disulfide bridge)를 위한 잠재적 자리로서 도입될 수 있다. His는 특히, "촉매적" 자리로서 도입될 수 있다(즉, His는 산 또는 염기로서 작용할 수 있고 생화학적 촉매반응에서 가장 일반적인 아미노산이다). Pro는 이의 특별한 평면 구조가 단백질 구조에 β-회전(turn)을 유도하기 때문에 도입될 수 있다.
본 발명에 따라, 박테리오파지 리신(들)과 항생제와의 병용을 기반으로 제공되는 조성물 및 방법은 그람 양성 박테리아의 신속하고 효과적인 사멸을 위해 제공된다. 본 발명에 따라, 다수의 박테리아, 특히, 스태필로코커스 및 스트렙토코커스 박테리아 균주를 포함하는 그람 양성 박테리아에 대한 광범위한 사멸 활성을 입증하는 리신 PlySs2는 항생제(들)과의 병용으로 현저한 상승작용을 제공하며 항생제(들)에 요구되는 MIC 유효량을 현저히 감소시킬 수 있다.
본원에서 입증되고 제공되는 리신, 특히, PlySs2 리신은 향상된 살균활성, 더 신속한 항생제 침투 및 및 내성 억제를 특징으로 하는 과정에서 반코마이신, 답토마이신, 리네졸리드 및 옥사실린을 비롯한 다른 유형 및 부류의 항생제를 포함하는 항생제와 상승작용을 일으킬 수 있다. 뮤린 균혈증 모델을 통해 본원에서 입증된 바와 같이, PlySs2와 항생제가 쌍으로 이루어진 병용물들은 단일 작용제의 처방에 비하여 상당히 유의하게 생존율을 높여준다. 따라서, 리신/항생제 병용물은 기존 표준 치료법에 비하여 병원에서보다 효과적인 균혈증 치료법이 될 것이다.
또한, 본 발명은 시험관내 검정을 통해서뿐만 아니라 단일 항생제의 사람 가상 용량이 효과를 보이지 않는 조건하에 스트렙토코커스 아우레우스-유도된 균혈증의 뮤린 모델에서 병용물내 항생제의 PlySs2-의존성 활성증가를 입증한다. 항생제 활성의 PlySs2-매개된 증가의 기전을 도해하고 리신과 항생제사이의 전반적인 상승작용을 가리키는 데이터가 본원에 제시되고 있다. 상승작용은 리신과 항생제의 공동투여를 기초로 마련되는 새롭고 효과적이며 일반적인 항감염 전략에 여러가지 영향을 미친다. 특히, 리신과 항생제 각각의 작용제 및 모두의 작용제는 유의하게 감소된 용량 및 양으로 투여될 수 있어, 살균 및 정균 활성이 증가되고 항생제 또는 항생제의 내성 위험이 감소된다.
리신, 특히, PlySs2 리신은 단일 작용제로서 인식되고 있으나, 본 발명은 리신, 특히, PlySs2 리신이 다양한 항생제와 함께 시험관내 및 생체내에서 유의적인 정도의 상승작용을 나타내는 명백한 증거를 제공한다. 본원 실시예는 다수의 균주와 항생제를 이용하여 시간-사멸 곡선 및 체커보드 검정에 의해 상승작용을 평가하지만, 특히, 시험관내 상승작용 정도는 이중 작용제 MIC 검정에서 0.25X MIC만의 PlySs2에 의해 답토마이신 MIC를 1㎍/mL에서 0.0075㎍/mL로 128배 감소시키면서 예증했다. 이러한 상승작용은 12가지 MRSA 균주에서 64배 내지 256배 범위의 효능 증가 정도로 관찰되었다. 따라서, 두 가지 항균제인 항생제와 리신의 병용물은, 단일 작용제로서 사용된 답토마이신 7.5 ng/ml이 사멸을 위해 매우 부족한 양이기 때문에, 단순하게 순차적으로 사멸시키는 것(리신에 의한 거대 집합균체의 감소에 이어서 항생제에 의한 잔여 박테리아의 사멸) 이상으로 작용하고 있다.
본원에서 제공되고 입증된 균혈증 모델에서, 병용 치료요법은 단일 작용제 항생제 치료요법의 모든 사람 가상 용량을 일관되게 능가하였다. 이것은 MRSA 균혈증의 현 치료기준 항생제인 반코마이신과 답토마이신 둘 다에 대해서뿐만 아니라 MSSA 균혈증의 현 치료기준 항생제인 베타-락탐계 옥사실린에 대해서 입증된다. 이들 결과는 임상적으로 확실한 영향을 미치는 것이며 균혈증뿐만 아니라 다른 중증의 감염을 치료하기 위해 리신(들)과 항생제(들)을 사용하는데 있어 새롭고 효과적인 병용 치료요법을 제공한다. 보다 낮은 용량을 이용하는 리신과 항생제의 병용 치료요법에 기반을 두고 효능의 증가와 내성 위험성의 감소를 제공하는 방법 및 조성물이 제공된다. 사실, 본 발명의 방법 및 조성물은 항생제 내성 스태필로코커스 박테리아를 포함하는 내성 박테리아에 효과적이다.
임상 적용에서 본 발명은 리신/항생제 병용물, 특히, PlySs2/항생제 병용물을 투여함으로써 균혈증을 치료하는 방법을 제공한다. 속효성 리신은 이의 MIC 이상에서 병원균 집합체를 효과적으로 감소시킬 것이다. 일단 리신 농도가 MIC 이하로 떨어지면, 상승작용에 의한 사멸 증가가 진행되는 기간이 연장되는 약 1회 또는 2회 이상의 리신 약동학적 반감기동안에 병용 상대물인 항생제의 활성은 리신의 존재하에서 상승작용적으로 증가할 것이다. 따라서, PlySs2/항생제 병용물들은 현재 이용되고 있는 단일 작용제 치료요법보다 더 강력하고 효과적인 항균 치료요법을 제공할 것이다.
PlySs2 리신은 스태필로코커스, 스트렙토코커스, 리스테리아 또는 엔테로코커스 박테리아를 포함하여 다수의 상이한 그람 양성 박테리아 균주 및 종을 사멸시키는 활성과 능력을 나타낸다. 특히, 중요한 것으로, PlySs2는 스태필로코커스 아우레우스를 포함하는 스태필로코커스 균주, 특히, 항생제-민감성 균주와 뚜렷한 항생제-내성 스태필로코커스 균주 모두를 사멸시키는 활성을 나타낸다. 또한, PlySs2는 스트렙토코커스 균주의 사멸 활성도 나타내며 특히, A그룹 및 B그룹 스트렙토코커스 균주에 대해 효과적인 사멸 활성을 나타낸다. 아래 표 1은 단리물에 대한 시험관내 로그 사멸 평가를 근거로 나열한 PlySs2 리신의 박테리아 사멸능을 보여준다.
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다양한 문법형식으로 표현되는 용어 "모노클로날 항체"는 특정 항원과 면역반응할 수 있는 단지 한 종의 항체 결합 부위만을 가진 항체를 가리킨다. 이에, 모노클로날 항체는 전형적으로 이 항체와 면역반응하는 임의 항원에 대해 단일 결합 친화성을 나타낸다. 따라서, 모노클로날 항체는, 다수의 항체 결합 부위들을 갖고 각각의 항체 결합 부위는 상이한 항원에 대해 면역 특이적인 항체 분자를 포함할 수 있고; 예를 들면 이중 특이적(키메라) 모노클로날 항체이다.
용어 "특이적"은 특이적 결합 쌍의 한 구성원이 이의 특이적 결합 파트너(들)가 아닌 분자들에 대한 유의적 결합을 나타내지 않는 상황을 가리키기 위해 사용될 수 있다. 또한, 이 용어는 예를 들어 항원 결합 도메인이, 다수의 항원이 보유하는 특정 에피토프에 대해 특이적인 경우 적용될 수 있으며, 이 경우, 상기 항원 결합 도메인을 보유한 특이적 결합 멤버는 상기 에피토프를 보유한 여러 항원과 결합할 수 있다.
용어 "포함하는"은 하나 또는 그 이상의 특징 또는 요소들의 존재를 허용함을 의미한다.
용어 "필수적으로 구성되는"은 보다 큰 생성물에 공유 결합하지 않는 한정 개수의 잔기들의 생성물, 특히, 펩타이드 서열을 가리킨다. 그러나, 본 발명의 펩타이드의 경우에서, 본 분야의 전문가는 보호기 등을 부가하기 위해 말단을 화학적으로 변형시키는 것(예, C-말단의 아미드화)과 같이 그 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에서의 작은 변형이 고려될 수 있음을 인식할 것이다.
용어 "단리된"은 본 발명에 따른 리신 폴리펩타이드(들) 또는 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이 존재하는 상태를 가리킨다. 폴리펩타이드 및 핵산은 천연적으로 함께 결합된 물질, 예를 들면 자연 환경에서 함께 발견되거나 시험관내 또는 생체내에서 재조합 DNA 기술로 제조되는 환경(예, 세포 배양물)에서 함께 발견되는 다른 폴리펩타이드 또는 핵산으로부터 유리되어 있거나 실질적으로 유리되어 있다. 폴리펩타이드 및 핵산은 희석제 또는 보조제와 함께 제형될 수 있고 실용 목적상 단리된 상태로 있을 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드는 보통 중합체 또는 점막접착제 또는 다른 담체와 혼합되며, 만일 진단 또는 치료용으로 사용되는 경우는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 혼합된다.
본 발명에 유용하고 응용가능한 스트렙토코커스 수이스 PlySs2 리신 폴리펩타이드(들)를 암호화할 수 있는 핵산들이 본원에서 제공된다. 이러한 맥락에서 대표적인 핵산 서열은 도 29의 폴리펩타이드(서열번호 1)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 엄중한 조건하에서 상기 도 29의 DNA 서열(서열번호 2)들의 상보 서열과 하이브리드화하는 서열이다. 또한, 이들 서열 및 도면에 도시된 것과 하이브리드화하는 핵산 서열의 변이체가 본 발명에 따른 용해 효소의 생성용으로 고려되며, 상기 변이체에는 수득할 수 있는 천연 변이체도 포함된다. 파지 연관된 용해 효소를 암호화하는 아주 다양한 단리된 핵산 서열 또는 cDNA 서열 및 이러한 유전자 서열과 하이브리드화하는 부분 서열은 본 발명의 리신 효소(들) 또는 폴리펩타이드(들)의 재조합 생성에 유용하다.
"레플리콘"은 샹체내에서 DNA 복제의 자율적 단위로 작용하는(즉, 자신의 조절하에 복제할 수 있는) 임의 유전자요소(예, 플라스미드, 염색체, 바이러스)이다.
"벡터"는 다른 DNA 절편이 결합될 수 있고 이 결합된 절편의 복제를 유도하는 레플리콘으로서 예로는 플라스미드, 파지 또는 코스미드를 들 수 있다.
"DNA 분자"는 단일 가닥 형태 또는 이중 가닥 나선으로서 데옥시리보뉴클레오타이드(아데닌, 구아닌, 티민 또는 시토신)의 중합체 형태를 가리킨다. 이 용어는 단지 일차 및 이차 분자 구조만을 가리키며 어떠한 특정 삼차 형태도 이 용어에 포함되지 않는다. 따라서, 이 용어는 특히, 선형 DNA 분자(예, 제한 단편), 바이러스, 플라스미드 및 염색체에서 발견되는 이중 가닥 DNA를 포함한다. 특정 이중 가닥 DNA 분자의 구조를 논의함에 있어서, 본원에서 서열들은, 5'으로부터 3'으로의 방향의 서열만 제공하는 표준 규약하에 비전사 DNA 가닥(즉, mRNA와 상동성인 서열을 갖는 가닥)을 따라 기술될 수 있다.
"복제원"은 DNA 합성에 참여하는 DNA 서열을 가리킨다.
DNA "암호화 서열"은 적절한 조절 서열의 통제를 받도록 배치되었을 때 생체내에서 전사되고 폴리펩타이드로 해독되는 이중 가닥 DNA 서열이다. 암호화 서열의 범위는 5'(아미노) 말단의 출발 코돈과 3'(카르복실) 말단의 해독 정지 코돈에 의해 결정된다. 암호화 서열은 이들로 한정되는 것은 아니지만 원핵생물 서열, 진핵생물 mRNA로부터의 cDNA, 진핵생물(예, 포유류) DNA로부터의 게놈 DNA 서열을 포함하고, 심지어 합성 DNA 서열도 포함할 수 있다. 보통 암호화 서열의 3'에는 폴리아데닐화 시그널 및 전사 종결 서열이 위치한다.
전사 및 해독 조절 서열은 숙주 세포에서 암호화 서열의 발현을 유도하는 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 시그널, 터미네이터 등과 같은 DNA 조절 서열이다.
"프로모터 서열"은 세포내에서 RNA 폴리머라제와 결합하고 하류(3' 방향) 암호화 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 본 발명을 명백히 하기 위한 목적으로서, 프로모터 서열은 그 경계가 3' 말단에서 전사 개시 부위까지이고 상류(5' 방향)로 전사를 배경 이상의 검출가능한 수준으로 개시하는데 필요한 염기 또는 요소들을 최소 수로 포함한다. 프로모터 서열내에는 전사 개시 부위(뉴클레아제 S1을 이용한 지도작성에 의해 간편하게 규명된다)뿐만 아니라 RNA 폴리머라제의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인(공통염기서열)이 발견된다. 진핵생물 프로모터는 항상 그런 것은 아니고 자주 "TATA" 박스와 "CAT" 박스를 포함한다. 원핵생물 프로모터는 -10 및 -35 공통염기서열과 함께 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열을 포함한다.
"발현 조절 서열"은 다른 DNA 서열의 전사 및 해독을 통제하고 조절하는 DNA 서열이다. 암호화 서열은 RNA 폴리머라제에 의해 mRNA로 전사된 다음, 이 암호화 서열에 의해 암호화된 단백질로 해독될 때 세포내에서 전사 및 해독 조절 서열의 "통제 하에" 있다.
"시그널 서열"은 암호화 서열 앞에 포함될 수 있다. 이 서열은 숙주 세포와 교신하여 폴리펩타이드를 세포 표면으로 유인하거나 폴리펩타이드를 배지내로 분비시키는 역할을 하고 폴리펩타이드의 N-말단에 위치하는 시그널 펩타이드를 암호화하며, 이 시그널 펩타이드는 단백질이 세포를 떠나기에 앞서 숙주 세포에 의해 제거된다. 시그널 서열은 원핵생물 및 진핵생물 고유의 여러 단백질과 결합된 상태로 발견될 수 있다.
본 발명의 프로브와 관련하여 본원에서 사용된 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 2개 이상의 리보뉴클레오타이드, 바람직하게는 3개 초과의 리보뉴클레오타이드로 구성된 분자로서 정의된다. 이의 정확한 크기는 많은 요소들에 의해 좌우되며, 이들 요소들은 올리고뉴클레오타이드의 궁극적인 기능과 용도에 의해 좌우된다.
본원에 사용된 용어 "제한 엔도뉴클레아제" 및 "제한효소"는 각각 특정 뉴클레오타이드 서열에서 또는 근처에서 이중 가닥 DNA를 절단하는 박테리아 효소를 가리킨다.
세포가 외인성 또는 이종 DNA에 의해 "형질전환"되었다는 것은 세포내로 그러한 DNA가 도입되었음을 의미한다. 형질전환 DNA는 세포의 게놈을 구성하는 염색체 DNA내로 통합될 수 있거나(공유결합) 그렇지 않을 수 있다. 예를 들어 원핵생물, 효모 및 포유류 세포에서, 형질전환 DNA는 플라스미드와 같은 에피솜 요소에서 유지될 수 있다. 진핵생물 세포에 있어서, 안정하게 형질전환된 세포는 이의 염색체내로 형질전환 DNA가 통합된 후 염색체 복제를 통해 딸세포로 유전되는 과정이 이루어지는 세포이다. 이러한 안정성은 진핵생물세포가 형질전환 DNA를 함유한 딸세포의 집단으로 구성되는 세포주 또는 클론을 수립하는 능력에 의해 입증된다. "클론"은 단일 세포 또는 공통 조상세포가 유사분열하여 형성된 세포 집단이다. "세포주"는 시험관내에서 많은 세대를 거치는 동안에 안정하게 성장할 수 있는 초대 세포의 클론이다.
두 DNA 서열이 "실질적으로 상동성"이다는 것은 이들 DNA 서열의 정해진 길이에서 일치하는 뉴클레오타이드 비율이 적어도 약 75%(바람직하게는, 약 80% 이상, 가장 바람직하게는 약 90% 또는 95% 이상)인 경우를 가리킨다. 실질적으로 상동성인 서열은 서열 데이터 뱅크에서 입수할 수 있는 표준 소프트웨어를 이용하여 서열을 비교하여 동정하거나 서던 하이브리드화 실험을 예를 들어 이의 특정 시스템에 맞춘 엄중한 조건하에서 수행하여 동정할 수 있다. 적합한 하이브리드화 조건을 정하는 것은 본 분야의 전문가에게는 용이한 것이다(참조예: 상기 Maniatis et al.; 상기 DNA Cloning, Vols. I & II; 상기 Nucleic Acid Hybridization).
본원에 특정적으로 개시된 것의 유도체이고 본원에 개시된 것과 뉴클레오타이드의 결실, 부가 또는 치환에 의해 다르지만 리신 폴리펩타이드(들)의 작용성 특징을 가진 단백질을 여전히 암호화하고 있는 DNA 분자 및 뉴클레오타이드 서열이 본 발명에서 고려된다. 또한, 기술된 DNA 분자로부터 유도된 작은 DNA 분자들도 포함된다. 이와 같은 작은 DNA 분자들은 하이브리드화 프로브 또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 프라이머로 사용하기에 적합한 올리뉴클레오타이드를 포함한다. 이에 따라 이들 작은 DNA 분자들은 스태필로코커스 수이스의 박테리오파지에 의해 유전자적으로 암호화된 용해 효소의 절편을 적어도 포함하고, PCR의 목적을 위해서는 그 유전자의 최소 10-15 뉴클레오타이드 서열, 더 바람직하게는 15-30 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 상기된 본 발명의 DNA 분자로부터 유도된 DNA 분자 및 뉴클레오타이드 서열은 또한 개시된 DNA 서열 또는 이의 단편과 엄중한 조건하에서 하이브리드화하는 DNA 서열로서 정의될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태로서, 엄중한 조건은 25% 초과의 서열 변이(또한, "불일치(mismatch)"라고 한다)를 갖는 DNA 분자가 하이브리드화를 이룰 수 없는 조건으로 정의될 수 있다. 더 바람직한 실시형태로서, 엄중한 조건은 15% 초과의 불일치를 갖는 DNA 분자가 하이브리드화를 이룰 수 없는 조건이고, 더 더욱 바람직하게는, 엄중한 조건은 10% 초과의 불일치를 갖는 DNA 서열이 하이브리드화를 이룰 수 없는 조건이다. 바람직하게는, 엄중한 조건은 6% 초과의 불일치를 갖는 DNA 서열이 하이브리드화를 이룰 수 없는 조건이다.
유전자암호의 축퇴성(degeneracy)은 암호화된 단백질의 아미노산 서열을 유지하면서 DNA 분자의 뉴클레오타이드 서열에서 주요 변이를 가능하게 하기 때문에 추가로 실시형태의 범위를 넓혀 준다. 따라서, 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 암호화된 단백질의 아미노산 조성 및 단백질의 특징에 영향을 미치지 않으면서도 그 위치에서 세개 코돈중 임의 것으로 변경될 수 있다. 특정 아미노산에 대한 뉴클레오타이드 코돈의 유전자암호 및 변이는 본 분야의 전문가에게 잘 알려져 있다. 변이 DNA 분자는, 유전자암호의 축퇴성을 기초로, 상기된 표준 DNA 돌연변이유발 기술을 사용하여 본원에 기술된 cDNA 분자로부터 유도하거나 DNA 서열을 합성하여 유도할 수 있다. 유전자암호의 축퇴성에 근거한 서열 변이때문에 개시된 cDNA 서열과 엄중한 조건하에서 하이브리드화하지 않는 DNA 서열은 본원의 설명으로부터 이해되는 부분이다.
따라서, PlySs2 및 PlySs1을 포함하는 본 발명의 리신을 암호화하고 도 29에 제공된 것과 동일한 아미노산 서열(서열번호 1)을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열에 축퇴성인 DNA 서열 또는 도 29에 제공된 예시적인 뉴클레오타이드 서열(서열번호 2)에 축퇴성인 DNA 서열이 본 발명의 범위에 속하는 것은 당연히 받아들여야 한다. 용어 "에 축퇴성"은 특정 아미노산을 정하는데 다른 3문자 코돈이 사용됨을 의미한다. 개개의 특정 아미노산을 암호화하고 상호교환하여 사용할 수 있는 코돈들은 본 분야에 잘 알려져 있다.
본 분야의 전문가는 본원에 기술되어 있고 본 분야에 알려져 있는 DNA 돌연변이유발 기술들로부터 스트렙토코커스 수이스의 박테리오파지 리신을 암호화하면서도 본원에 기술되고 제공된 용해 폴리펩타이드의 필수적인 특성을 유지하는 아주 다양한 DNA 분자를 생성할 수 있음을 인정할 것이다. 또한, 아래에서 보다 자세하게 설명되는 바와 같이, 용해 폴리펩타이드(들)의 특성에 변이를 얻기 위하여, 새롭게 유도된 단백질들을 선택할 수도 있다. 이와 같은 유도체들은 아미노산 서열에 소수의 결실, 부가 및 치환과 같은 변이가 있는 것을 포함한다.
아미노산 서열 변이를 도입하는 부위는 사전에 결정될 수 있으나, 돌연변이 그 자체가 미리 결정될 필요는 없다. 아미노산 치환은 잔기 한 개에서의 치환이 일반적이지만, 1개 또는 그 이상, 1개 또는 서너개, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개 잔기에서 치환이 일어날 수 있고, 삽입은 보통 약 1 내지 10개의 아미노산 잔기 정도이며, 결실은 약 1 내지 30개 잔기이다. 결실 또는 삽입은 아미노산 잔기 1개의 단일 형태로 일어날 수 있으나, 바람직하게는 인접한 한 쌍의 아미노산 잔기들에서 일어날 수 있다(즉, 잔기 2개의 결실 또는 잔기 2개의 삽입). 치환, 결실 및 삽입은 최종 작제물의 생성을 위해 임의로 조합할 수 있다. 치환 변이체는 아미노산 서열로부터 적어도 1개의 잔기가 제거되고 이 자리에 다른 잔기가 삽입된 것이다. 이와 같은 치환은 단백질 특성에 유의적인 영향이 전혀 발생하지 않도록 하기 위해 도입하거나 단백질 특성에 미세한 변화를 주고자 할 때 도입할 수 있다. 단백질내 고유 아미노산을 대신하여 삽입될 수 있고 보존 치환으로서 간주되는 아미노산들은 위에 기술되어 있고 본 분야의 전문가에 의해 인식되는 것들이다.
본 분야에 잘 알려져 있는 바와 같이, DNA 서열은 이를 적절한 발현 벡터내의 발현 조절 서열에 작동적으로 연결하고 이 발현 벡터로 적당한 단세포 숙주를 형질전환시킴으로써 발현시킬 수 있다. 본 발명의 DNA 서열을 발현 조절 서열에 작동적으로 연결한다는 것은 개시코돈 ATG가 DNA 서열의 일부가 아니라고 한다면 당연히 그 개시코돈을 DNA 서열의 상류에서 정확한 판독 프레임에 배치하는 것을 포함한다. 본 발명의 DNA 서열을 발현시킴에 있어서 아주 다양한 숙주/발현 벡터 조합이 이용될 수 있다. 유용한 발현 벡터는 예를 들면 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열의 단편들로 구성될 수 있다. 이들 벡터내에서 본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여 아주 다양한 발현 조절 서열(즉, DNA 서열과 작동적으로 연결되어 DNA 서열의 발현을 조절하는 서열)이 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 DNA 서열을 발현시키는데 아주 다양한 숙주 단세포들이 유용하다. 이들 숙주는 이.콜라이, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균(예, 효모) 및 조직 배양된 동물세포, 인간세포 및 식물세포와 같이 잘 알려진 진핵생물 및 원핵생물 숙주를 포함할 수 있다. 본 분야의 전문가는 본 발명의 범위에서 벗어나지 않고서 목적하는 발현을 달성하는데 과도한 실험부담을 갖지 않으면서도 적당한 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주를 선택할 수 있을 것이다.
본 발명에서 제공된 방법 및 응용에 사용하는 용해 효소(들)/폴리펩타이드(들)를 포함하는 치료학적 또는 약제학적 조성물뿐만 아니라 연관된 사용 방법이 본원에 제공된다. 치료학적 또는 약제학적 조성물은 하나 이상의 항생제와 병용되고 임의로 적합한 부형제, 담체 또는 비히클과 병용되는 하나 이상의 용해 폴리펩타이드(들)를 포함하고, 임의로 천연, 절두형, 키메라 또는 셔플링 용해 효소를 포함한다. 본 발명은 박테리아 감염증 또는 관련 병태를 포함하는 그람 양성 박테리아의 사멸, 완화, 탈콜로니화, 예방 또는 치료용으로 항생제와 병용된 리신(PlySs2를 포함)의 치료학적 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 박테리아 감염증 또는 관련 병태를 포함하는 그람 양성 박테리아의 사멸, 경감, 탈콜로니화, 예방 또는 치료용으로 반코마이신, 리네졸리드 또는 답토마이신과 병용된 리신(PlySs2를 포함)의 치료학적 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 박테리아 감염증 또는 관련 병태를 포함하는 그람 양성 박테리아의 사멸, 완화, 탈콜로니화, 예방 또는 치료용으로 답토마이신과 병용된 리신(PlySs2를 포함)의 치료학적 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공한다. PlySs2의 절두체 또는 변이체를 포함하는 PlySs2 리신을 답토마이신을 포함하는 항생제와 병용하여 포함하는 조성물이 박테리아 감염증 또는 관련 병태를 포함하는 그람 양성 박테리아, 특히, 스트렙토코커스 피오게네스 및 항생제 내성 스태필로코커스 아우레우스를 포함하는 스트렙토코커스, 스태필로코커스, 엔테로코커스 또는 리스테리아의 사멸, 경감, 탈콜로니화, 예방 또는 치료용으로 본원에 제공된다.
치료학적 조성물에 포함되는 효소(들) 또는 폴리펩타이드(들)는 비변이 파지 관련 용해 효소(들), 용해 폴리펩타이드 절두체, 용해 폴리펩타이드(들) 변이체 및 키메라 및/또는 셔플링된 용해 효소 중 하나 이상이거나 임의의 병용물일 수 있다. 추가로, 동일한 박테리아의 치료를 위해 다른 파지에 의해 유전자적으로 암호화된 다른 용해 폴리펩타이드(들)가 사용될 수 있다. 이들 용해 효소는 또한 "비변이" 용해 효소 또는 폴리펩타이드, 용해 폴리펩타이드(들) 절두체, 용해 폴리펩타이드 변이체(들) 및 키메라 및 셔플링된 용해 효소의 임의 병용물일 수 있다. 스트렙토코커스, 스태필로코커스, 엔테로코커스 및 리스테리아를 포함하는 그람 양성 박테리아를 위한 치료학적 또는 약제학적 조성물중의 용해 효소(들)/폴리펩타이드(들)은 단독으로 또는 항생제와 병용되어 사용되거나 치료해야 할 다른 침습성 박테리아 유기체가 있다면 이 표적 박테리아에 대해 특이적인 다른 파지 관련 용해 효소와 병용되어 사용될 수 있다. 용해 효소, 절두형 효소, 변이 효소, 키메라 효소 및/또는 셔플링 용해 효소는 홀린(holin) 단백질과 함께 사용될 수 있다. 홀린 단백질의 양은 또한 다양할 수 있다. 리소스타핀과 함께 또는 리소스타핀 없이 상기 효소(들) 또는 폴리펩타이드(들)를 함유하는 치료학적 조성물에 다양한 항생제들이 임의로 포함될 수 있다. 치료학적 조성물에는 하나 이상의 용해 효소 또는 폴리펩타이드가 포함될 수 있다.
약제학적 조성물은 또한 화학적 합성 또는 재조합 DNA 기술에 의해 생성되는 하나 이상의 변이된 용해 효소를 포함할 수 있고, 변이된 용해 효소에는 이의 이소자임, 유사체 또는 변이체들이 포함된다. 특히, 변이된 용해 단백질은 아미노산 치환, 결실, 절두, 키메라화, 셔플링 또는 이의 조합에 의해 생성될 수 있다. 약제학적 조성물은 하나 이상의 천연 용해 단백질과 하나 이상의 절두, 변이, 키메라 또는 셔플링 용해 단백질의 병용물을 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 동종 또는 이종 박테리아로부터 유도된 적어도 하나의 용해 단백질의 펩타이드 또는 펩타이드 단편과 임의로 첨가되는 하나 이상의 보충제 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 함유할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 특히, 본원에 제공된 하나 이상의 통상적인 항생제를 포함하는 보충제를 함유한다. 항생제는 폭넓게 그람 양성 박테리아에서 세포벽 펩티도글리칸 생합성에 영향을 미치는 것과 DNA 또는 단백질 합성에 영향을 미치는 것으로 분류할 수 있다. 페닐실린 및 이와 유사한 항생제를 포함하는 세포벽 합성 저해제는 단단한 세포외벽을 붕괴시키며, 그 결과로 지지대를 상실한 세포들은 팽윤하고 궁극적으로 터져버린다. 이 보충제는 용해 효소의 치료 효과를 상승작용적으로 증가시키는 유효량의 에리트로마이신, 클라리트로마이신, 아지트로마이신, 록시트로마이신, 매크로라이드 계열의 다른 항생제, 페니실린, 세팔로스포린 및 이의 임의 병용물과 같은 항생제일 수 있다. 실제로 어떠한 다른 항생제도 변이 및/또는 비변이 용해 효소와 함께 사용될 수 있다. 세포벽 펩티도글리칸 생합성에 영향을 주는 항생제는 펩티도글리칸 매트릭스내로 N-아세틸뮤람산(NAM)과 N-아세틸글루코사민(NAG) 펩타이드 아단위의 삽입을 방지함으로써 펩티도글리칸 합성을 억제하는 글리코펩타이드를 포함한다. 입수가능한 글리코펩타이드로는 반코마이신과 테이코플라닌(teicoplanin)이 포함된다. 페니실린은 펩티도글리칸 가교의 형성을 억제한다. 페니실린의 작용기 β-락탐 잔기는 박테리아내의 펩티토글리칸 분자들을 연결하는 DD-트랜스펩티다제와 결합하고 억제시킨다. 가수분해 효소들은 연속해서 세포벽을 파괴하고 삼투압때문에 세포용해 또는 사멸이 일어난다. 보편적인 페니실린으로는 옥사실린, 암피실린 및 클록사실린이 포함되고, 원형질막의 외부에서 펩티도글리칸 빌딩블록을 가져오는 C55-이소프레닐 피로포스페이트의 탈인산화를 저해하는 폴리펩타이드가 또한 포함된다. 세포벽에 충격을 주는 폴리펩타이드는 바시트라신이다. 다른 유용한 관련 항생제로는 반코마이신, 리네졸리드 및 답토마이신이 포함된다.
다른 박테리아 감염의 치료를 위해 다른 용해 효소들이 담체중에 포함될 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 적어도 하나의 용해 단백질의 펩타이드 또는 펩타이드 단편, 하나의 홀린 단백질 또는 적어도 하나의 홀린과 하나의 용해 단백질과 임의로 첨가되는 보충제와 적합한 담체 또는 희석제를 함유할 수 있으며, 상기 용해 및 홀린 단백질은 각각 박테리아 동종 또는 이종으로부터 유도된다.
또한, 생체내에서 유효량의 용해 폴리펩타이드(들) 또는 이의 펩타이드 단편을 단독으로 또는 다른 핵산 분자와 조합되어 발현할 수 있는 핵산 분자를 함유하는 조성물이 제공된다. 또한, 이들 핵산 분자, 폴리뉴클레오타이드 및 이들 분자를 보유하고 시험관내 및 생체내에서 발현하는 벡터를 함유하는 세포 배양물이 제공된다.
치료학적 또는 약제학적 조성물은 다양한 담체와 병용된 용해 폴리펩타이드(들)와 항생제(들)을 포함하여 민감성 그람 양성 박테리아에 의해 유발된 질병을 치료할 수 있다. 담체는 적합하게는 등장성 및 화학안정성을 증가시키는 물질과 같은 첨가제를 소량 함유한다. 이러한 물질은 사용 용량 및 농도에서 피투여자에게 무독성이고 인산염, 시트르산염, 석신산염, 아세트산 및 다른 유기산 또는 이의 염과 같은 완충제; 아스코빈산과 같은 산화방지제; 폴리아르기닌 또는 트리펩타이드와 같은 저분자량(약 10개 미만의 잔기); 혈청알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신; 글루탐산, 아스파트산, 히스티딘 또는 아르기닌과 같은 아미노산; 셀룰로즈 또는 이의 유도체, 글루코즈, 만노즈, 트레할로즈 또는 덱스트린과 같은 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 만니톨 또는 솔비톨과 같은 당 알코올; 나트륨과 같은 반대이온(counterion); 폴리솔베이트, 폴록사머 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)와 같은 비이온성 계면활성제; 및/또는 중성염을 포함한다. 글리세린 또는 글리세롤(1,2,3-프로판트리올)은 약제용으로 판매되고 있다. DMSO는 많은 국소 적용 약물의 침투를 현저하게 증가시키는 능력을 가진 비양자성 용매이다. 담체 비히클은 또한 링거액, 완충액 및 덱스트로즈액을 포함할 수 있고, 특히, 정맥주사액을 준비할 때 포함할 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 본 발명의 변이 또는 비변이 용해 효소/폴리펩타이드(들)의 유효 투약률(dosage rate) 또는 유효량은 부분적으로 용해 효소/폴리펩타이드를 치료학적으로 사용할 것인지 예방적으로 사용할 것인지의 여부, 피투여자가 감염 박테리아에 노출된 기간, 피투여자의 크기 및 중량 등에 의해 결정될 것이다. 또한, 효소/폴리펩타이드(들)를 함유한 조성물의 사용 기간은 예방 목적인지 치료 목적에 따라 결정되며, 예방 목적인 경우는 단기간 동안 매시간, 매일 또는 매주 사용되는 것일 수 있고, 치료 목적인 경우엔 조성물의 용법이 보다 더 집중적일 필요가 있어 용법을 수 시간, 수 일 또는 수 주간 지속할 수 있고/있거나 일일기준으로 또는 그 날 정한 시간 간격으로 지속할 수 있다. 사용되는 투약형은 어떠한 것이라도 최소량의 시간에 최소수의 단위를 제공해야 한다. "장기"방출형 또는 "서"방출형(예, 특정 비강 스프레이 또는 로젠지제)으로 분류되는 담체들은 ml당 저농도의 활성(효소) 단위를 보유 또는 제공할 수 있으나 장기간에 걸쳐 이루어지는 반면, "단기"방출형 또는 "속"방형 담체(예, 가글)는 ml당 고농도의 활성(효소) 단위를 보유 또는 제공할 있으나 단기간에 걸쳐 이루어진다. ml당 활성 단위의 양 및 노출 기간은 감염 유형, 치료가 예방적인지 치료적인의 여부 및 다른 변수들에 의해 결정된다. 상황에 따라서는 ml당 단위용량이 훨씬 더 높거나 낮을 수 있다.
용해 효소/폴리펩타이드(들)는 이의 활성이 나타날 수 있는 pH 환경에 있어야 한다. 안정화 완충제는 리신 효소/폴리펩타이드(들)의 활성을 최적으로 조성할 수 있다. 완충제는 디티오트레이톨 또는 베타 머캅토에탄올(BME)과 같은 환원제를 함유할 수 있다. 안정화 완충제는 또한 에틸렌디아민테트라아세트산 이나트륨 염과 같은 금속 킬레이트화제이거나 이를 포함할 수 있고, 또는 추가로 인산염 또는 시트르산염-인산염 완충제 또는 임의의 다른 완충제를 함유할 수 있다.
치료 부위의 환경 및 특정 양상이 항생제의 효능에 영향을 줄 수 있다는 것은 주목할 점이다. 예를 들어, 답토마이신은 폐 계면활성제와 강렬하게 결합하며, 이 때문에 스태필로코커스 폐렴을 포함하는 세균성 폐렴의 치료에 효과가 없다. 본 발명은 민감성 박테리아에 대한 PlySs2와 답토마이신의 병용물의 현저한 효능과 상승작용을 입증한다. 추가로, PlsSs2 리신과 답토마이신의 병용물은 폐 계면활성제와 유사한 시판 계면활성제의 존재하에서 상당한 효과를 유지한다. 따라서, PlySs2는 항생제, 특히, 답토마이신의 효과를 촉진 및 증가시키며 계면활성제의 존재하에서도 답토마이신의 효과와 활성이 나타나도록 작용한다.
순한 계면활성제가 치료학적 또는 약제학적 조성물에 사용된 용해 효소/폴리펩타이드(들)의 치료 효과를 증가시키는 유효량으로 치료학적 또는 약제학적 조성물에 함유될 수 있다. 순한 계면활성제로 적합한 것은 특히, 폴리옥시에틸렌 솔비탄과 지방산의 에스테르(트윈 시리즈), 옥틸페녹시 폴리에톡시 에탄올(트리톤-X 시리즈), n-옥틸-베타-D-글루코피라노시드, n-옥틸-베타-D-티오글루코피라노시드, n-데실-베타-D-글루코피라노시드, n-도데실-베타-D-글루코피라노시드 및 생물학적 계면활성제(예, 지방산, 글리세라이드, 모노글리세라이드, 데옥시콜레이트 및 데옥시콜레이트의 에스테르)를 포함한다.
또한, 보존제가 본 발명에 사용될 수 있으며, 바람직하게는 조성물의 총 중량의 약 0.05% 내지 0.5%이다. 보존제는 작용제에 미생물이 성장하는 것을 방지 또는 감소시킴으로써 작용제가 미생물에 오염되지 않도록 한다. 본 발명에 유요한 일부 보존제는 메틸파라벤, 프로필파라벤, 부틸파라벤, 클로록실레놀, 나트륨 벤조에이트, DMDM 하이단토인, 3-요오도-2-프로필부틸 카르바메이트, 칼륨 솔베이트, 클로르헥시딘 디글루코네이트 또는 이들의 병용물을 포함한다.
치료학적 조성물은 추가로 민감성 그람 양성 박테리아와 함께 존재하는 임의의 스태필로코커스 아우레우스 박테리아의 치료용 효소 라이소스타핀과 같은 다른 효소를 포함할 수 있다. 스태필로코커스 시뮬란스(Staphylococcus simulans)의 유전자 생성물인 라이소스타핀은 세포벽의 폴리글리신 가교를 효소적으로 분해함으로써 스태필로코커스 아우레우스에 정균 및 살균 효과를 나타낸다(Browder et al., Res. Comm. 19: 393-400 (1965)). 이후 라이소스타핀 유전자는 클로닝 및 서열분석되었다(Recsei et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 1127-1131 (1987)). 치료학적 조성물은 또한 뮤타노리신 및 라이소자임을 포함할 수 있다.
용해 효소/폴리펩타이드(들)와 항생제(들)을 포함하는 치료학적 조성물의 적용 수단은 이들로 한정되는 것은 아니지만 직접, 간접, 매개 및 특별 수단 또는 이의 임의 병용 수단을 포함한다. 용해 효소/폴리펩타이드(들)의 직접 적용은 감염 부위 또는 박테리아 콜로니화 부위에 폴리펩타이드를 직접 접촉시키는 모든 적합한 수단에 의해 이루어질 수 있고, 예를 들면 비측(nasal) 영역(예, 비측 분무제), 진피(dermal) 또는 피부 적용(예, 국소용 연고 또는 작용제), 좌제, 탐폰 적용 등이다. 비측 적용은 예를 들면 비측 분무제, 점비액, 비측 연고제, 세비액, 비측 주사액, 비측 패킹, 기관지분무제 및 흡입제를 포함하고, 또는 인후 로젠지제, 구강세정제 또는 가글의 사용을 통한 간접 적용 또는 비공 또는 안면에 적용되는 연고의 사용을 통한 간접 적용 또는 이들 및 유사 적용 방법의 임의 병용을 포함한다. 용해 효소를 투여할 수 있는 형태는 이로써 한정되는 것은 아니지만 로젠지제, 트로키제, 캔디, 주입제, 츄잉껌, 정제, 산제, 분무제, 액제, 연고 및 에어로졸을 포함한다.
용해 효소와 항생제의 적용 방식은 많은 다른 유형 및 병용의 담체들을 포함하고, 예를 들면 이들로 한정하는 것은 아니지만 수성 액제, 알콜계 액제, 수용성젤, 로션, 연고, 비수성 액상 베이스, 미네랄 오일 베이스, 미네랄 오일과 페트롤라툼의 혼합물, 라놀린, 리포좀, 단백질 담체(예, 혈청, 알부민 또는 젤라틴), 셀룰로즈 카르멜 분말 및 이들의 병용물이다. 담체를 함유한 치료제의 전달 방식은 이들로 한정하는 것은 아니지만 스미어(smear), 스프레이, 지속방출성 패치, 액체-흡수된 와이프(wipe) 및 이들의 조합을 포함한다. 용해 효소는 밴디지에 직접 적용되거나 다른 담체중 하나에 적용될 수 있다. 밴디지(bandage)는 습식 또는 건식으로 판매될 수 있으며, 밴디지위의 효소는 동결건조 형태이다. 이 적용 방법이 피부 감염의 치료에 가장 효과적이다. 국소용 조성물의 담체는 반고체 및 겔유사 비히클을 포함할 수 있고 이의 예로는 고분자 증점제, 물, 보존제, 활성 계면활성제 또는 유화제, 산화방지제, 선스크린 및 용매 또는 혼합용매계가 포함된다. 사용될 수 있는 고분자 증점제는 본 분야의 전문가에게 알려진 것을 포함하며, 예를 들면 화장 및 제약 업계에서 흔히 사용되는 친수성 및 수성알콜성 겔화제이다. 다른 바람직한 겔화 고분자는 하이드록시에틸셀룰로즈, 셀룰로즈 검, MVE/MA 데카디엔 크로스폴리머, PVM/MA 공중합체 또는 이들의 병용물을 포함한다.
용해 효소/폴리펩타이드(들)와 항생제(들)을 포함하는 조성물은 상기도 질환과 연관된 박테리아 감염의 예방 또는 치료를 위해 캔디, 츄잉검, 로젠지제, 트로키제, 정제, 산제, 에어로졸, 액제, 액상 스프레이 또는 치약의 형태로 투여될 수 있다. 용해 효소/폴리펩타이드가 첨가되어 있는 로젠지제, 정제 또는 검(gum)은 당, 옥수수시럽, 다양한 색소, 무가당 감미제, 풍미제, 임의의 결합제 또는 이들의 병용물을 함유할 수 있다. 유사하게, 검계 제품은 아카시아, 카르나우바 왁스, 시트르산, 옥수수전분, 식품착색제, 풍미제, 무가당 감미제, 젤라틴, 글루코즈, 글리세린, 검 베이스, 쉘락(shellac), 사카린나트륨, 당, 물, 백랍, 셀룰로즈, 다른 결합제 및 이들의 병용물을 함유할 수 있다. 로젠지제는 추가로 자당, 옥수수전분, 아카시아, 검 트라가탄트, 아네톨, 아마인, 올레오레진, 미네랄 오일 및 셀룰로즈, 다른 결합제 및 이들의 병용물을 함유할 수 있다. 또한, 대용설탕이 덱스트로즈, 자당 또는 다른 당들을 대신하여 사용될 수 있다. 용해 효소 또는 이의 펩타이드 단편을 포함하는 조성물은 점막 내층으로 침투될 수 있고 여기서 콜로니화 병균을 사멸시킨다. 본원에 개시 및 기술된 점막 내층은 예를 들면 상하기도, 안구, 구강, 코, 직장, 질, 치주포켓, 장 및 결장이다. 점막 조직의 자연적인 제거 또는 청소 기전덕택에 통상적인 투약형은 상당 기간이 경과한 후 적용 부위에서 남아있지 않는다.
점막 조직에 흡착하고 장기간에 걸쳐 하나 이상의 파지 효소 및 다른 보충제와 함께 투여될 물질을 갖는다는 것은 장점이 될 수 있다. 제어 방출능을 갖는 물질이 특히 바람직하며, 지속 방출 점막 점착제의 이용은 상당한 관심 대상이었다. 친수성 물질과 소수성 물질이 조합된 점막 점착제가 이용된 다른 방안들이 알려져 있다. 효소의 방출을 제어하기 위하여 마이셀 및 다층 마이셀이 또한 사용될 수 있다. 플라스틱, 막, 임상실습용 기구와 같은 표면을 표적으로 삼거나 이에 접촉하는 능력을 가진 물질, 특히, 카테터, 밸브, 보철장치, 약물 또는 화합물 펌프, 스텐트, 정형 재료 등과 같이 신체에 이식되고 박테리아 점착 또는 바이오필름 개발에 취약한 물질 또는 성분이 본 발명에서 사용되는 리신(들)과 병용, 혼합 또는 융합될 수 있다.
또한, 본 발명의 치료학적 또는 약제학적 조성물은 생물학적 활성 물질의 방출을 제어하기 위하여 친수성 주쇄와 소수성 그래프트쇄를 갖는 그래프트 공중합체를 포함하는 고분자 점막 점착제를 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은 임의로 폴리(아크릴산), 폴리-(비닐피롤리돈) 및 나트륨 카르복시메틸 셀룰로즈 가소제와 같은 다른 고분자 물질과 다른 약제학적으로 허용되는 담체를 조성물의 점막 점착성에 나쁜 영향을 일으키지 않는 양으로 함유할 수 있다.
본 발명의 용해 효소/폴리펩타이드(들) 및 항생제(들)은 본 발명에 따른 용도를 위해 국소, 경구 또는 비경구를 포함하여 약제학적으로 적용가능한 또는 허용되는 수단으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 용해 효소/폴리펩타이드(들)는 그람 양성 박테리아의 감염을 치료하기 위해 근육내, 척수관내, 피하 또는 정맥내로 투여할 수 있다. 비경구 주사를 투여방식으로 선택한 경우, 등장 작용제를 사용하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 등장용 첨가제는 염화나트륨, 덱스트로즈, 만니톨, 솔비톨 및 락토즈를 포함할 수 있다. 경우에 따라서는 인산완충식염수와 같은 등장액이 바람직하다. 안정화제는 젤라틴 및 알부민을 포함한다. 혈관수축제가 작용제에 첨가될 수 있다. 본 발명의 약제는 무균 및 무발열원 상태로 제공된다.
어떤 화합물의 경우에도 처음에는 세포배양 검정 또는 동물 모델, 보통 마우스, 토끼, 개 또는 돼지에서 치료유효량을 정할 수 있다. 또한, 동물 모델을 사용하여 목적하는 농도 범위와 투여 경로를 정한다. 그런 후 이러한 정보를 사용하여 사람에게 유용한 투여 용량 및 경로를 결정할 수 있다. 정확한 용량은 의사가 치료 대상 환자를 고려하여 선택한다. 용량과 투약은 활성 잔기를 충분한 수준으로 제공하거나 목적하는 효과를 유지하도록 조정한다. 고려할 수 있는 추가의 요소로는 환자의 중증도, 연령, 체중 및 성별, 식습관, 목적하는 치료 기간, 투여 방법, 투여 시간, 투여 횟수, 약물 병용, 반응 민감성 및 치료에 대한 내성/반응이 포함된다. 장기 작용성 약제 조성물은 특별한 제형의 반감기 및 청소율에 따라 매 3 내지 4일, 매주 투여되거나 2주 1회 투여될 수 있다.
용해 효소/폴리펩타이드(들)의 유효 투약율 및 유효량 및 치료 기간은 부분적으로 감염의 중증도, 환자(특히, 사람) 체중, 감염 박테리아에 대한 피투약자의 노출 기간, 피부 또는 조직의 감염 면적(제곱센티미터), 감염 깊이, 감염 중증도 및 여러 가지 많은 변수에 따라 결정된다. 조성물은 장소에 상관없이 하루 또는 일주에 1회 또는 수회 적용될 수 있고, 수일 또는 수주와 같이 단기간 또는 여러 주 또는 여러 달과 같이 장기간 적용될 수 있다. 용법은 수일 또는 수주간 지속될 수 있다. 사용되는 어떠한 투약형도 최소간의 시간에 최소수의 단위를 제공해야 한다. 효소의 유효량 또는 유효투약량을 보장하는 효소의 활성 단위의 농도는 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용 및 적용되는 리신과 항생제는 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 리신과 항생제는 단독적으로 또는 병용물로 단일 용량 또는 수회 용량으로 투여될 수 있다. 리신과 항생제는 동일한 투여 방식에 의해 또는 상이한 투여 방식에 의해 투여될 수 있고, 하나 또는 그 이상이 병용되거나 개별적으로 1회, 2회 또는 수회 투여될 수 있다. 따라서, 리신의 최초 용량이 투여된 후, 특히, 반응 및 박테리아 사멸 또는 탈콜로니화에 따라서 후속 용량 또는 용량들이 투여될 수 있고, 항생제 용량(들)과 병용되거나 항생제 용량으로 교체될 수 있다. 본 발명의 특정 양상에서 및 항생제와 함께 리신, 특히, PlySs2의 투여에 의해 항생제에 대한 내성 발생이 감소한다는 측면에서, 항생제와 리신의 병용물은 장기간 투여할 수 있고 투여 기간은 내성의 위험없이 연장할 수 있다. 추가로, 항생제와 리신을 병용하거나 동시에 또는 순차적으로 공동투여함으로써 항생제와 리신 각각의 효능을 위해 필요한 용량이 유의하게 감소된다는 점을 고려하면, 환자는 내성의 위험없이 또는 내성 위험의 감소하에 보다 더 공격적으로 및 보다 더 연속적으로 치료받을 수 있다.
용어 "작용제(agent)"는 폴리펩타이드, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 화학적 화합물 및 작은 분자를 포함하는 모든 분자를 의미한다. 특히, 용어 "작용제"는 피검 화합물, 첨가된 부가 화합물(들) 또는 리신 효소 화합물과 같은 화합물을 포함한다.
용어 "효능제(agonist)"는 가장 넓은 의미로 수용체와 결합해서 그 수용체를 자극하는 리간드를 가리킨다.
용어 "검정"은 화합물의 특정 성질을 측정하기 위해 사용되는 임의 방법을 의미한다. "선별 검정"은 여러 화합물들의 무리로부터 선별 대상 화합물의 활성을 근거로 선별 대상 화합물을 특성확인(characterization)하거나 선택(selection)하기 위해 사용하는 방법을 의미한다.
용어 "예방하는" 또는 "예방"은 질병 원인균에 노출될 수 있거나 발병에 앞서 그 병에 취약한 대상자가 그 질병에 걸릴 위험 또는 그 병이 발생할 위험을 감소시킴을 의미한다(즉, 그 병의 임상 증상들 중 적어도 하나가 발생하지 않도록 함을 의미한다).
용어 "프로필락시스"는 용어 "예방"과 관련이 있고 이 용어에 내포되며, 질병의 치료 또는 치유보다 질병을 예방하고자 하는 조치 또는 과정을 가리킨다. 프로필락시스 조치의 비제한적 예로는 백신 투여; 예를 들어 부동화 때문에 혈전증의 위험에 있는 입원 환자에게 저분자량 헤파린의 투여; 및 말라리아 유행 지역 또는 말라리아 발병 위험이 높은 지역에 방문하기에 앞서 클로로퀸과 같은 말라리아치료제의 투여가 포함될 수 있다.
"치료학적 유효량"은 의사 또는 다른 임상의에 의해 결정되는 것으로 대상자로부터 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 약물, 화합물, 항미생물제, 항체, 폴리펩타이드 또는 약제의 양을 의미한다. 특히, 그람 양성 박테리아 감염과 그람 양성 박테리아 성장과 관련하여 용어 "유효량"은 살균 및/또는 정균 효과를 나타내는 것을 포함하여 그람 양성 박테리아의 양 또는 감염 정도에서 생물학적으로 유의적인 감소를 일으키는 화합물 또는 물질의 유효량을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "치료학적 유효량"은 감염 박테리아의 성장 또는 양에서 임상적으로 유의적인 변화 또는 다른 병리 특징(예, 감염 박테리아의 존재 및 활성을 가늠할 수 있는 것으로서 발열 또는 백혈구수)을 바람직하게는 적어도 약 30%, 더 바람직하게는 적어도 50%, 가장 바람직하게는 적어도 90% 억제 및 감소시키기에 충분한 양을 의미한다.
질병 또는 감염을 "치료하는" 또는 "치료"란 용어는 한 실시형태로서 그 질병 또는 감염을 완화시킴(즉, 그 질병을 정지시키거나 감염균 또는 감염 박테리아의 증식을 정지시키거나 그 질병의 임상 증상들 중 적어도 하나의 징후, 정도 또는 중증도를 감소시킴)을 의미한다. 다른 실시형태로서, "치료하는" 또는 "치료"는 대상자로부터 확진할 수 없는 적어도 하나의 신체적 변수를 완화함을 의미한다. 또 다른 실시형태로서, "치료하는" 또는 "치료"는 그 질병 또는 감염을 육체적으로 조절하거나(예, 확진된 증상의 안정화), 생리학적으로 조절하거나(신체적 변수의 안정화), 또는 이들 둘다로 조절함을 가리킨다. 추가의 실시형태로서, "치료하는" 또는 "치료"는 질병의 진행을 늦추거나 감염을 감소시키는 것이다.
생체내에서 수행되는 치료 방법 또는 본원 명세서 및 특허청구범위에 따른 의학적 및 임상 치료 방법의 맥락에서 사용되는 용어 대상자, 환자 또는 개인은 사람을 가리킨다.
용어 "그람 양성 박테리아", "그람 양성" 및 특정적으로 수록되지 않은 임의 변이체들은, 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있고 본원 명세서 및 특허청구범위 전반에 걸쳐 사용되는 상기 용어들은, 알려져 있고/있거나 특정 세포벽의 존재 및/또는 세포막 특징 및/또는 그람 염색에 의해 동정될 수 있는 그람 양성 박테리아를 가리킨다. 그람 양성 박테리아는 알려져 있고 쉽게 동정될 수 있으며 이들로 한정하는 것은 아니지만, 리스테리아, 스태필로코커스, 스트렙토코커스, 엔테로코커스, 마이코박테리움, 코리네박테리움 및 클로스트리디움중에서 선택될 수 있고 이들의 임의의 그리고 모든 확인 또는 미확인 종 또는 균주를 포함한다. 본 발명의 양상에서, PlyS 리신 민감성 그람 양성 박테리아는 리스테리아, 스태필로코커스, 스트렙토코커스 및 엔테로코커스 중 하나 이상으로부터 선택된 박테리아를 포함한다.
용어 "살균"은 박테리아 세포를 사멸시킬 수 있는 능력을 가리킨다.
용어 "정균"은 성장하고 있는 박테리아 세포를 억제함을 포함하여 박테리아 성장을 억제할 수 있는 능력을 가리킨다.
용어 "약제학적으로 허용되는"은 사람에 투여되었을 때 생리학적으로 받아들일 수 있고(physiologically tolerable) 일반적으로 알러지 반응 또는 유사 부반응(예, 위역류, 현기증 등)을 일으키지 않는 물질 및 조성물을 가리킨다.
본 발명은 아래의 비제한적인 실시예를 참고로 할 때 이해가 좀 더 용이할 수 있다. 이들 실시예는 본 발명의 예로서 제공되며 본 발명의 바람직한 실시형태를 좀 더 완전하게 입증하기 위해 제시되는 것이므로 어떠한 상황에서든 본 발명의 넓은 범위를 제한하는 것으로 해석해서는 안된다.
실시예 1
PlySs2 리신은, 스태필로코커스 아우레우스의 메티실린 및 반코마이신 내성 및 민감성 균주(MRSA, MSSA, VRSA, VISA), 답토마이신-내성 스태필로코커스 아우레우스(DRSA), 및 리네졸리드-내성 스태필로코커스 아우레우스(LRSA)와 같은 항생제 내성 균주를 포함하는 임상적으로 유의한 그람-양성 박테리아의 다양한 균주를 사멸시키는 능력을 입증한다. PlySs2는, 광범위한 종 사멸 활성을 갖는 고유한 리신이고, 박테리아, 특히, 스태필로코커스, 스트렙토코커스, 엔테로코커스, 및 리스테리아 박테리아 균주를 포함하는 그람-양성 박테리아의 다수의 종을 사멸시킬 수 있다. PlySs2 리신 및 각종 항생제에 대한 스태필로코커스의 민감성(MIC 값 및 uM 농도를 이용하여 표시함)의 도표 작성은 표 2에 나타낸다. 최소 저해 농도(MIC)는, 임상 및 실험실 표준 기관(CLSI) 문서 M07-A9(Methods for dilutional antimicrobial sensitivity tests for bacteria that grow aerobically. Volume 32 (Wayne [PA]: Clinical and Laboratory Standards Institute [US], 2012)의 표준에 따르고 이에 기술된 바와 같이 브로쓰 마이크로희석법(broth microdilution method)을 이용하여 측정하였다. 이 값은, MIC 검정에서 환원제(예를 들면, DTT 또는 BMS)의 존재 하에 측정된 MIC이다. 환원제는, MIC 값 측정시 검정들 간에 및 검정들 사이에서의 재현성을 향상시킬 목적을 위해 첨가한다.
Figure pat00003
각종 그람-양성 및 그람-음성 유기체에 대한 PlySs2의 활성은 표 3에 도표 작성되어 있고, 이는, 상이한 유기체에 대한 MIC 값 및 범위를 포함한다. 항생제-내성 스태필로코커스 아우레우스에 대한 PlySs2의 활성은 표 4에 제공된다. PlySs2는, 103 MSSA 및 120 MRSA 단리물(MIC = 8㎍/mL)뿐만 아니라 A 그룹 및 B 그룹 스트렙토코커스 및 스태필로코커스 루그디엔시스를 포함하는 시험된 모든 스태필로코커스 아우레우스 균주에 대한 강력한 성장 저해 활성을 갖는다(표 3). 시험되는 다른 그람 양성 박테리아뿐만 아니라 모든 그람 음성 박테리아의 무리에 대해 활성이 거의 또는 전혀 관찰되지 않았다. PlySs2가 항생제 내성 및 민감성 에스. 아우레우스뿐만 아니라 다수의 다른 임상적으로 유의한 그람-양성 박테리아를 효과적으로 사멸시키지만, 표 1에, 그리고, 하기 표 5에 나타낸 바와 같이 에스케리키아 콜라이와 같은 다수의 공생 박테리아에는 현저한 효과는 없고, 이는 사람 장내 박테리아의 민감성 및 PlySs2 MIC를 제공한다.
Figure pat00004
Figure pat00005
Figure pat00006
PlySs2는 다수의 상이한 임상적으로 관련된 박테리아에 대해 유효하지만, 넓은 스펙트럼 박테리아 사멸의 결여시 많은 리신의 이로운 특성을 유지하고, 따라서, 많은 항생제로 관찰되는 장내 세균총 혼란과 같은 부작용이 최소화될 것이다. 또한, 리신은, 박테리아 내성의 낮은 가능성을 입증하였다. PlySs2의 현저하게 넓은 임상적으로 관련된 사멸 능력은, 완전히 특성확인되지 않거나 혼합된 박테리아 감염이 존재하는 경우를 포함하는, 임상 현장에 고유하게 적용가능하도록 한다.
스태필로코커스 아우레우스는 몇몇의 중증의 감염 질환의 원인균이고, 항생제 내성 에스. 아우레우스 균주의 출현은 상당한 치료 어려움을 초래하여, 새로운 항균제에 대한 필요성이 강화되어 왔다. 현재, 에스. 아우레우스의 병원내 감염 중 40 내지 60%는 옥사실린에 대해 내성이고(Massey RC et al (2006) Nat Rev Microbiol 4:953-958), 단리물의 60% 초과는 메티실린에 대해 내성이다(Gill SR et al (2005) J Bacteriol 187:2426-2438). 다수의 새로운 항균제, 예를 들면, 리네졸리드, 퀴누프리스틴-달포프리스틴, 답토마이신, 텔라반신, 새로운 글리코펩타이드, 세프타롤린, 및 세프토비프롤이 도입되어 왔고, 임상 개발 하에 있다(Aksoy DY and S Unal (2008) Clin Microbiol Infect 14:411-420). 옵션으로서, MRSA와 같은 균주들이 내성인 현재의 항생제는, 다른 작용제와 병용되어 사용되는 경우 MRSA의 치료에 유력한 후보물로서 되살려 새로운 차원의 잠재적 항-감염제를 제공할 수 있다. 리신 구성성분에 대한 내성 발생의 가능성이 매우 낮기 때문에, 리신을 항생제와 병용한 리신의 적용 및 사용은 박테리아 내성을 피하기 위한 잠재력을 갖는다.
임상학적 스태필로코커스 감염에 대한 PlySs2의 적용성을 보다 더 완벽하게 평가하기 위하여, 메티실린 내성 및 메티실린 민감성 균주를 포함하는 다수의 스태필로코커스 아우레우스 균주에 대해 시간-사멸 연구(time-kill study)를 수행하였다. 시간-사멸 검정은, CLSI 방법(CLSI 문서 M07-A9 컬럼 32 No.2)에 따라 42 메티실린 내성 스태필로코커스 아우레우스(MRSA) 균주 및 20 메티실린 민감성 에스. 아우레우스(MSSA) 균주에 대해 수행하였다. 각 균주의 배양물(출발 접종물 5.5x105 내지 1x106)을 통기하면서 6시간 동안 PlySs2 리신으로 치료하였고, 비교를 위해 항생제 답토마이신, 옥사실린, 또는 반코마이신으로 치료하였다. MRSA 및 MSSA 균주는 PlySs2, 답토마이신, 및 반코마이신으로 치료하였다. MSSA 균주는, 또한, 옥사실린으로도 치료하였다. 상이한 항생제의 1x MIC 농도는, 공개 및 확립된 항생제 MIC 값에 기초하여 사용하였다. PlySs2 리신 치료는 앞서 측정된 바와 같이(상기 표 2 참조) 대략 1X MIC에서 수행하였다. 배양물 분취를 6시간 동안 매시간(15분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간 및 6시간에 분취 시점) 제거하였고, 이를 PBS/목탄 용액에 첨가하였고(각각의 약물을 불활성화하기 위함), 이어서, 연속적으로 희석하였고, 박테리아 생존율을 위해 플레이팅하였다. 각각의 배양물에 대해 얻어진 로그 CFU/mL를 플롯팅하였다. 각각의 균주에 대해 성장 대조군이 포함되었고, 임의의 항균제의 부재 하의 박테리아 성장을 나타낸다. 선택된 MRSA 균주에 대한 예시의 로그 사멸 곡선은 도 1에 도시한다. 선택된 MSSA 균주에 대한 예시의 로그 사멸 곡선은 도 2에 도시한다. MRSA 및 MSSA 균주를 이용한 시간-사멸 연구의 요약 플롯은 도 3에 나타낸다.
인지되어 있고 입수가능한 균주 명칭에 대한 상호-참조를 포함하여, 본원에서 제공된 연구에 사용된 균주의 목록은 하기 표 6에 제공된다.
Figure pat00007
PlySs2는 시험관내에서 신속한 사멸 역학(rapid kill kinetics)을 나타낸다.
전격성 박테리아 감염을 갖는 환자를 치료하기 위한 임상 현장에서는 신속한 사멸 역학이 바람직하다. 시험관내 항균 활성 속도를 시험하기 위해, 본 발명자들은 시간-사멸 검정법(Mueller M et al (2004) Antimicrob Agents Chemotherapy 48:369-377)을 사용하였고, 여기서, 20 상이한 MSSA 및 42 MRSA 균주에 걸쳐 1X MIC 약물 농도를 시험하였다. PlySs2는, 30분 내에 살균 수준(Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Vol. 32 (Wayne (PA): Clinical and Laboratory Standards Institute (US), 2012)(≥3-log10 CFU 감소)에 도달하였다(도 4의 A 및 도 4의 B). 대조적으로, 답토마이신은 살균 수준에 도달하는데 6시간을 필요로 하였고, 한편, 반코마이신 및 옥사실린은 6시간 내에 불과 2-log10 사멸을 달성하였다. 또한, 15 상이한 현대 MSSA(도 4의 C) 또는 MRSA(도 4의 D) 단리물에 대한 PlySs2의 신속한 사멸 역학을 수득하였고, 이는 관련 임상 단리물에 대한 PlySs2의 효과적인 살균 활성을 설명한다. 추가로, PlySs2의 강력한 활성이 전자 현미경으로 확인되었고, 이는 치료 후 불과 15초만에 에스. 아우레우스 코커스의 광범위한 용균 반응을 나타냈고, PlySs2 작용의 속도는 접촉 즉시의 살균 효과와 일치한다(도 4의 E).
시험된 모든 MRSA 및 MSSA 균주는 PlySs2에 의해 신속히 사멸되고, 일반적으로 리신과의 항온배양 최초 1시간 내에 최대 사멸(즉, ≥3 로그 감소)이 관찰되었고, 대부분의 경우에 로그값이 1 로그 CFU/ml(시험의 유효 하한값)로 감소하였다. 답토마이신 또는 반코마이신은, 대부분의 균주에 대해 가장 유효한 답토마이신을 이용한 몇 시간 이상의 항온배양에 걸쳐 일반적으로 관찰시, 대부분의 MRSA 및 MSSA 균주의 성장을 2 내지 3로그만큼 감소시킨다. 옥사실린은 MSSA 균주에 대한 항생제의 최소 유효성이었다. 모든 경우에서, PlySs2의 사멸은 임의의 항생제보다 더 크고 신속하였다.
당해 연구는, 상기 기술된 바와 같은 방법을 이용하여, PlySs2 리신, 답토마이신, 반코마이신, 및 리네졸리드를 이용하여, 반코마이신 중간 민감성 에스. 아우레우스(VISA), 반코마이신 내성 에스. 아우레우스(VRSA), 리네졸리드 내성 에스. 아우레우스(LRSA), 및 답토마이신 내성 에스. 아우레우스(DRSA)를 포함하는 각종 에스. 아우레우스 균주의 시험을 포함하도록 확장되었다. 스태필로코커스 아우레우스의 MSSA, MRSA, VISA, VRSA, LRSA, 및 DRSA 균주로 수행된 연구의 도표 작성은, PlySs2 및 각종 균주에 대해 제공된 각종 항체의 최소 저해 농도(MIC)와 함께 상기 표 2에 제공된다.
실시예 2
상기에 나타낸 바와 같이, PlySs2 리신 단독은 항생제 단독보다 더욱 신속하게 사멸시키지만, 항생제와의 병용에 있어서의 PlySs2의 능력 또는 유효성에 관한 정보는 알려져 있지 않고, 입수가능하지도 않다. 시험관내에서 스태필로코커스 아우레우스에 대하여 PlySs2 리신과 항생제와의 병용물을 평가하기 위해, 박테리아 사멸 연구를 수행하였다.
상기 기술된 바와 같이 시간-사멸 검정은, PlySs2 또는 항생제 단독 또는 병용물을 다양한 농도로 첨가하면서 몇몇의 MRSA 균주에 대해 수행하였다. 각각의 균주의 배양물(출발 접종물 5.5x105 내지 1x106)을 통기하면서 6시간 동안 PlySs2 리신, 항생제(답토마이신 또는 반코마이신), 또는 PlySs2와 항생제와의 병용물로 치료하였다. 각각의 경우, 상승작용 및 향상된 병용물 작용제 유효성을 관찰하기 위하여 MIC 미만 용량의 PlySs2 및 항생제를 사용하였다. 성장 대조군이 각각의 균주에 대해 포함되었고, 임의의 항생제의 부재 하의 박테리아 성장을 나타낸다. 1/2 MIC의 PlySs2와 1/4 MIC의 반코마이신을 첨가하여 얻은 두 MRSA 균주의 시간-사멸 곡선은 도 5에 나타낸다. 이들 MIC 미만 용량에서, 반코마이신 또는 PlySs2는 단독으로 6시간까지 효과가 없거나 효과가 좋지 않았다. 1/2 MIC의 PlySs2와 1/4 MIC의 반코마이신의 병용물은 6시간 이내에 배양물 중에서 4 로그까지의 MRSA의 사멸을 초래한다.
1/4 MIC의 PlySs2와 1/8 MIC의 답토마이신을 첨가하여 얻은 두 MRSA 균주의 로그 사멸 곡선은 도 6에 나타낸다. 1/4 MIC의 PlySs2와 1/8 MIC의 답토마이신의 병용물은 6시간 이내에 배양물 중에서 약 4 로그의 MRSA의 사멸을 초래한다. 도 7은, MRSA 균주 650(O52C 토마쯔 균주 - 출발 접종물 1x109)에 대한 PlySs2와 답토마이신의 1X MIC 값에 근거한 다른 병용 연구를 도시한다. PlySs2 리신은 16㎍/ml로 첨가되고, 답토마이신은 1㎍/ml로 첨가된다. 각각의 단일 작용제는, 첨가된 농도에서 4 내지 5 로그 사멸을 초래하지만, PlySs2와 답토마이신의 병용물은 2시간 이내에 완전한 사멸(검정의 검출 한계로의 로그 사멸)을 제공한다.
실시예 3
병용 치료요법은, 약물이 상승작용적으로 작용할 때 특히, 효과적이다(Cottarel G & Wierzbowski J (2007) Trends Biotechnology 25:547-555). PlySs2와 세포 외피-활성 항생제 사이의 상승작용 평가는, 시간-사멸 검정법, 시험관내에서 상승작용적 항균 활성을 실험하기 위한 바람직한 방법(Mueller M et al (2004) Antimicrob Agents and Chemotherapy 48:369-377; Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, Vol. 32 (Wayne (AP): Clinical and Laboratory Standards Institute(US), 2012)에 의해 수행하였다. 상승작용 연구는, 페니실린 계열의 구성원이고 반코마이신 또는 답토마이신에 비하여 별개의 방식으로 박테리아를 사멸시키는 항생제 옥사실린을 이용하여 추가로 평가되었다. 단독의 또는 리신 PlySs2의 존재시의 옥사실린 연구의 결과는 도 8에 나타낸다. MIC 미만 농도의 PlySs2, 답토마이신, 반코마이신, 및 옥사실린을 단독으로 또는 병용물로 임상 MRSA 단리물(도 8c 내지 도 8f) 또는 MSSA 단리물(도 8a 내지 도 8b)에 대해 사용하여 시간-사멸 곡선을 작성하였다. 상승작용은, 가장 활성인 단일 작용제와 비교하여 병용물에 대한 6시간-시점에서 CFU/mL로 ≥2-log10 감소로서 정의되었다. 이러한 기준에 근거하여, PlySs2는, 평가된 모든 대표적인 MRSA 및 MSSA 균주에 대해, 평가된 모든 항생제와 상승작용적으로 작용하였다(참조: 도 4 내지 도 8). 확장된 세트의 단리물들을 유사하게 실험하였고, 상승 작용은, 옥사실린, 반코마이신 및 답토마이신을 포함하는 별개의 항생제와 병용된 PlySs2로 MSSA의 경우 49회 분석 중 45회에서 상승작용이 관찰되었고, MRSA의 경우는 26회 분석 중 24회에서 상승작용이 관찰되었다(하기에 제공된 표 7 내지 표 11).
Figure pat00008
표 7 내지 표 11의 범례
1ATCC 품질 제어 균주 및 JMI 단리물 번호를 나타낸다.
2상승작용 시간-사멸 실험에 사용된 PlySs2와 항생제의 농도. 이들 값은 범위-발견 연구에서 주의 깊게 측정하였고, PlySs2의 이상적인 수준(즉, 성장 대조군에 비하여 약 2-log10 생존율 감소를 초래함)과 항생제의 이상적인 수준(즉, 성장 대조군에 비하여 <1 log10 생존율 감소를 초래함)에 가장 근접하게 접근하는 농도를 나타낸다.
3log10 콜로니 수(또는 Δlog10 CFU/mL)의 감소는, 가장 활성인 단일 작용제로 처리된 배양물에 비하여, 약물 병용물로 6시간 동안 처리된 배양물에 대해 나타난다.
4상승작용은 CLSI21에 의해 CFU/mL로의 ≥2-log10 감소로 정의된다. 상가적 상호작용은 CFU/mL로의 <2-log10 감소로 정의된다.
5xMIC는, 각각의 농도로 표시되는 MIC의 퍼센트를 나타낸다. 예를 들면, 0.5의 xMIC 값은, 특정 약물에 대한 최적 상승작용 농도가 특정 단리물 또는 균주의 특정 MIC 값의 1/2임을 의미한다. 따라서, xMIC 값은, 환원제의 부재 하에 특정 균주에 대한 해당 약물의 MIC로 나눈 상승작용 시간-사멸 검정에서 사용된 약물의 농도이다.
주요: ΔLog10 CFU/mL = log10 콜로니-형성 단위의 차이; MIC = 최소 저해 농도.
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실시예 4
상기 실시예 1에 대해 상기 기술된 방법(CLSI 방법, CLSI 문서 M07-A9, 컬럼 32 no 2)에 따라 96 웰 패널을 사용하여 브로쓰 마이크로희석 MIC 시험을 수행하였다. 그러나, 본 발명의 연구에서는 PlySs2 리신과 항생제 답토마이신 둘 다가, 상이한 출발 농도로 각각의 웰에 함께 존재한다. 연구는, 12 상이한 MRSA 에스. 아우레우스 균주로 완성하였다. 각각의 경우에서, 해당 균주에 대한 PlySs2의 MIC를 우선 측정하였다. 각 균주에 대한 DAP MIC는, 공개된 방법에 따른 브로쓰 마이크로희석 MIC 시험에 기초하고 시험된 단리물에 대한 입수가능한 공개된 데이터로 확인하였다. 5.5x106 내지 1x106 세포를 각 웰에 첨가하고 다양한 양의 PlySs2 리신과 답토마이신의 존재 하에 통기하지 않고 37℃에서 24시간 동안 성장시켰다. MIC 값을 육안으로 측정하고, 박테리아를 플레이팅하여 96-웰 플레이트의 각 웰에서 생 세포수를 측정함으로써 확인하였다. 배양물은 환원제(예를 들면, 베타 머캅토에탄올(BME), 디티오트레이톨(DTT))의 존재 하에 그리고 부재 하에 평가하였다. MIC 값은 환원제의 존재 하에 상대적으로 더 낮고 환원제에 의해 반복성이 향상된다.
이중 작용제 MIC 측정. 이중 작용제 MIC 검정법은, 표준 브로쓰 마이크로희석 방법(Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically (2012) Vol. 32 (Clinical and Laboratory Standards Institute (US), Wayne (PA))으로부터 유도된다. MIC 검정법은 x축을 따라 1종 약물을 희석시키는 반면, MIC 콤보 검정법들은 x축을 따라 2종 약물을 함께 희석시킨다. 2 내지 4개의 96-웰 폴리프로필렌 마이크로역가 플레이트(Becton, Dickenson, and Company)을 조합하여 원하는 희석 계획을 얻는다. 우선, 컬럼 1에 PlySs2를 수직 하방으로 2배 희석하여 2,048 내지 1㎍/mL의 농도 범위를 얻는다. 이어서, 답토마이신을 고정 농도(4㎍/mL)로 컬럼의 각 웰에 첨가한다. 따라서, 컬럼 1의 모든 웰에 4㎍/mL 답토마이신의 배경에 대해 PlySs2의 희석 범위를 함유한다. 이어서, 컬럼 1을 x축 전체를 따라 2배 희석하여, 컬럼 11의 모든 웰은 0.0037㎍/mL의 답토마이신 농도를 갖도록 한다. 약물 희석 후, 세포를 첨가하고(약 5x105 CFU/mL), 주위 대기에서 35℃에서 24시간 항온배양한 후, 박테리아 성장을 저해하는 가장 희석된 약물 농도로서 MIC를 기록하였다.
도 9 내지 도 18에 8개의 MRSA 균주를 이용한 예시적 결과를 도시한다. 도 9 내지 도 18의 각각에서, 12-웰 2배 희석 범위는, 각각의 패널 횡렬에 대해 우측으로 진행된다. 각각의 패널은 96-웰 플레이트의 웰을 나타낸다. 이어서, 각각의 웰에, 표기된 박테리아 균주를 접종하였고, 성장이 실험되는 24시간 동안 항온배양하였다. 백색 패널은, 약물 병용물이 성장을 저해하는 웰을 나타낸다. 황색(명) 패널은, 성장을 저해한 최저 약물-병용물 농도(근본적으로 MIC에 해당함)를 나타낸다. 적색(암) 패널은, 박테리아 성장(다시 말해서, 성장을 저해하지 않는 작용제 병용물)을 나타낸다. 연구는 환원제의 존재 하에 그리고 부재 하에 수행하였다. 각각의 경우, 환원제의 존재시 또는 부재시, 유의한 상승작용이 관찰되었으며, 리신과 항생제 둘 다가 병용물로 제공되는 경우, 필요한 리신 및 항생제 둘 다의 양은 다중-배수로 감소하였다. 항생제 필요량의 감소는 리신의 첨가에서 특히, 유의하였다.
하기 표 12에, 12 MRSA 균주로의 전체 실험 결과를 요약한다. 하기에 제시되어 있고 도 9 내지 도 18에 도시된 바와 같이, PlySs2와 항생제(답토마이신)를 함께 병용하는 것은, PlySs2의 유효 MIC의 2 내지 4배 감소를 상승작용적으로 달성할 수 있다. 현저하게도, PlySs2와 답토마이신을 함께 병용하는 것은, 항생제 답토마이신의 유효 MIC에서 16 내지 256배 민감성 증가(배수 감소)를 상승작용적으로 달성할 수 있다.
Figure pat00013
실시예 5
체커보드 검정법을 수행하고 분할 저해 농도 지수(FICI) 값(Tallarida RJ (2012) J Pharmacol and Exper Therapeutics 342:2-8)을 산출함으로써 상승작용의 추가 평가를 수행하였다. 이들 연구는, 예시적 항생제 답토마이신, 반코마이신 및 옥사실린을 사용하여 수행하였다. 이 평가를 이용하여, 상승작용은, 두 약물을 함께 첨가함으로써 예상될 수 있는 것보다 더 큰 저해 활성으로서 정의된다(0.5 이하의 FICI). MRSA 및 MSSA 균주에 대한 상이한 항생제들의 대표적인 아이소볼로그램을 도 19에 제공한다. 29 MSSA 균주들 중 79%(답토마이신), 86%(반코마이신), 및 100%(옥사실린)에 대해 상승작용이 관찰되었고, 26 MRSA 균주들 중 89%(답토마이신) 및 69%(반코마이신)에 대해 상승작용이 관찰되었다. 그 결과는 하기 표 13 내지 표 15에 도면작성되어 있다.
Figure pat00014
Figure pat00015
Figure pat00016
체커보드 검정에서, 약물 상호작용은, 각 병용물에 대한 FICmin에 근거하여 상승작용, 상가작용 또는 길항작용으로서 정의된다. 약물에 대한 FIC는 병용물 중의 약물의 MIC를, 단독 사용된 약물의 MIC로 나눈 값으로서 정의된다. FICmin은 각각의 약물의 FIC를 합에 근거한다. 만일 FICmin이 0.5 이하인 경우, 병용물은 상승작용으로, >0.5 내지 ≤2인 경우 상가작용으로, >2인 경우 길항작용으로 해석한다.
실시예 6
PlySs2는 세포 외피에 항생제의 결합을 가속화한다
상승작용 연구의 보완으로서, MIC 미만 수준의 CF-301의 존재 및 부재 하에 BODIPY-플루오레세인-표지된 항생제를 사용하여 답토마이신 및 반코마이신 세포 외피-결합을 실험하였다. 답토마이신 결합의 시간-경과 분석(도 20의 A)은, CF-301의 부재 하에 3시간 후에 항생제 침투가 나타난 반면, CF-301(1/32nd MIC)의 존재 하에서는 불과 15분 후에 항생제 침투를 나타낸다. 유사하게, 반코마이신을 이용한 세포벽-표지화는 CF-301의 부재 하에 30분 내에 발생한 반면, CF-301(1/8th MIC)의 존재 하에서는 불과 5분 내에 발생한다(도 20의 B). 상기 항생제 둘 다에 대해, 박테리아 분열면에서 처음으로 표지화가 관찰되었다.
실시예 7
답토마이신은 폐 계면활성제와 강렬하게 결합하므로 스태필로코커스 폐렴의 치료에 효과적이지 않다. 민감성 박테리아에 대한 병용물 중의 PlySs2와 답토마이신의 효능의 양상에서, 상기에 나타낸 바와 같이, 모사체 폐 계면활성제에 대해, 시판 계면활성제의 존재 하의 PlySs2 리신 및 답토마이신을 단독으로 그리고 병용물로 평가하였다.
이들 연구에 MRSA 균주 MW2와 MSSA 균주 ATCC 29213을 사용하였다. 우선, 답토마이신과 PlySs2 리신을 계면활성제(Survanta, Abbott Laboratories)의 존재 하에 단독으로 평가하였다. 브로쓰 마이크로희석 방법을 사용하여 서반타(Survanta)의 존재 하에 각 균주에 대한 답토마이신의 MIC와 PlySs2의 MIC를 측정하였다. 0% 내지 15% 범위의 농도에서 계면활성제의 존재 및 부재 하에 2배-희석 시리즈를 확립하였다. 24시간째에 육안으로 MIC를 스코어링하고, 모든 웰 내의 CFU 수를 확인하였다. MSSA 균주 581을 이용한 유사한 연구가 문헌[Silverman et al., 2005 (JID, volume 191, 2149-52)]에 보고되어 있다. 이어서, 각각의 계면활성제 농도에서 답토마이신과 CF301에 대한 MIC의 배수 변화(계면활성제의 부재 하에 수득한 MIC와 비교하여)를 산출하였다. 계면활성제 농도에서의 각 균주에 대한 MIC의 배수 변화는 도 21에 도시한다. 계면활성제로서의 서반타의 존재 하에, 답토마이신 MIC는 256배까지 저해된다. 1.25%의 계면활성제 농도에서, 답토마이신은 20배 이상 저해된다. 대조적으로, PlySs2의 MIC는 계면활성제의 1.25% 내지 15% 범위에서 일정하게 8배 저해된다.
병용물 MIC 연구에서 15% 계면활성제(서반타)의 존재 하에서 PlySs2 리신과 답토마이신의 병용물의 효과를 평가하였다. 실험 설정은, 상기한 바와 같이 계면활성제 부재 하의 병용물 MIC 연구(실시예 3 참조)에 대한 설정과 유사하다. 계면활성제의 존재 하의 상승작용 평가 결과는 도 22에 나타낸다. 간략하게, 최좌측 웰에 나타낸 PlySs2 리신 + 답토마이신 농도는 각 횡렬의 12개의 모든 웰을 따라 2배씩 희석되었다. 이어서, 각 웰에 MRSA 균주 269(MW2) 세포(5.5x105 내지 1x106)를 첨가하고 24시간 항온배양한 후 성장을 평가하였다. 백색 웰은 성장 저해를 나타낸다. 황색(명) 웰은, 여전히 성장을 저해하고 있는 가장 희석된 약물 병용물을 나타낸다. 적색(암) 웰은, 성장을 허용하는 약물 병용물을 나타낸다. 시험된 균주에 대한 PlySs2의 상승작용 용량은 2㎍/ml 또는 MIC의 1/8이다. 이 연구에서, 답토마이신은 0.25㎍/ml에 대해 유효하고, 답토마이신 MIC의 1/1024에 해당한다.
실시예 8
균혈증 뮤린 모델에서의 병용물 치료요법 대 단일-작용제 치료요법
균혈증 뮤린 모델에서 생체내 에스. 아우레우스 감염에 대한 항생제와의 병용물로의 PlySs2의 효과를 평가하기 위한 동물 연구를 수행하였다. 다양한 수준의 MRSA 균주 접종물을 BALB/c 마우스에 IP 주사하고, 이어서, 이들 동물에게 항생제, PlySs2 리신, 또는 항생제와 PlySs2의 병용물을 투약하였다.
106 범위의 박테리아 접종물을 이용한 제1 세트의 연구에서, 35㎍의 답토마이신을 단일 용량으로 박테리아 감염 5시간 후에 피하(sc) 주사하였다. 이 용량은 20그램 마우스에 대해 답토마이신 1.75mg/kg의 용량과 등가이고, 한편, 마우스에서 답토마이신의 사람 등가 용량은 50mg/kg이다. 마우스에의 1.75mg/kg의 답토마이신의 투약은 사람 등가 용량의 약 3.5%와 등가이다. 박테리아 감염 5시간, 9시간 및 13시간 후에 15㎍의 PlySs2를 1일 3회(TID) IP 주사하였다(15㎍은 20그램 마우스에 대해 0.8mg/kg의 용량과 대략 동일하다). 감염 후 24시간까지 매 3시간마다 동물을 모니터링하고 생존율(%)을 기록한다. 1.8 x 106, 1.1 x 106, 3.0 x 106 및 3.1 x 106 박테리아의 MRSA(균주 269 또는 MW2) 용량으로 동물 생존율을 평가하였고, 이 MRSA 균주의 생존율 데이터의 편집된 그래프는 도 23에 제공된다. 다른 에스. 아우레우스 균주(균주 220 및 833)로 유사한 연구를 수행하였고, 결과는 비슷하였다(도 24 내지 도 26). 모든 경우에서, PlySs2 리신과 항생제 답토마이신의 병용 투약에 의해 동물 생존율이 현저하게 향상되었다. 이들 연구는, PlySs2 리신, 또는 항생제 답토마이신 단독과 비교한, PlySs2 리신과 항생제 답토마이신의 병용 치료요법의 효능의 생체내 증거를 제공한다.
고용량 접종물 연구
치료 기준(standard-of-care) 항생제의 생체내 효능을 향상시키는 PlsSs2의 능력을 평가하기 위하여 마우스 균혈증 모델에서의 추가적인 동물 연구를 수행하였다. 저 챌린지 모델에서(7 x 106 이하의 CFU 접종물 4시간 후 투약), PlySs2 1.25mg/kg 또는 답토마이신 2mg/kg의 단일 용량으로서 투여된 단일-작용제 치료요법은 각각 72시간째에 13% 및 23% 생존율을 초래하였다(도 27의 A). PlySs2와 답토마이신의 병용시, 73%의 72시간 생존율(p<0.0001)로 유의한 향상이 관찰되었다. 따라서, 저 챌린지 조건 하에 PlySs2와 답토마이신의 병용물은 각각의 작용제 단독에 비하여 우수하였다.
PlySs2 병용물 치료요법이 얼마나 강력한지를 시험하기 위하여, 본 발명자들은 박테리아 접종물을 단일-작용제 항생제의 사람-모의 용량이 좋지 않은 효능을 나타낸 양으로 증가시켰다. 이러한 고 챌린지 모델(109 CFU 접종물 2시간 후 투약)에서, 단일 작용제로서 답토마이신의 사람-모의 용량(1일 1회 50mg/kg) 또는 반코마이신의 사람-모의 용량(1일 2회 110mg/kg)은, 각각 47% 및 20%의 24시간 생존율 및 각각 31% 및 3%의 72시간 생존율을 수득하였다(도 27의 B 및 도 27의 E). 단일 작용제로서 투여된 PlySs2도, 유사하게 56/60%의 24시간 생존율과 18/3%의 72시간 생존율을 수득하였다. 대조적으로, 답토마이신 또는 반코마이신과 병용된 PlySs2는 각각 87% 및 93%의 24시간 생존율과 82% 및 67%의 72시간 생존율을 달성하였고, 이는, 이들 챌린지 감염 조건 하에서 단일-작용제 용법에 비하여 병용물 치료요법의 우수성을 입증한다. 추가의 2 MRSA 균주로 추가의 PlySs2/답토마이신 병용물 실험을 수행하였고, 유사한 결과를 수득하였다(도 27의 C 및 도 27의 D). 추가로 접종물로서 MSSA 균주를 사용하여 PlySs2와 옥사실린의 병용물을 시험한 경우, 이 병용물 치료는, 또한, 단일 작용제 치료에 비해 우수하였다(도 27의 F). 종합하면, 이들 결과는 PlySs2/항생제 병용물들이 단일-작용제 용법보다 균혈증 치료에 더 효과적이고, 다양한 치료기준 항생제 및 다중 에스. 아우레우스 균주에 대해 통계적으로 유의한 결과(모든 경우에서 P<0.0001)가 수득된다는 것을 입증한다.
리신 PlySs2는 생체내에서 용량-반응적이고 신속한 사멸 역학을 입증한다.
뮤린 균혈증 모델에서, PlySs2는 명백한 용량-반응을 나타내고, 0.25mg/kg만큼의 소량으로 모의-주사 대조군에서 관찰된 것에 비해 향상된 생존율과 5mg/kg의 용량으로 유의한 보호를 제공한다(데이터 제시되지 않음). Plyss2의 생체내 살균활성 속도를 평가하기 위하여, PlySs2의 투여 전에 및 후에 감염된 마우스의 혈액에서 MRSA CFU를 측정하였다. 감염 후 2시간째에 5.25mg/kg의 PlySs2를 투약했을 때, 15분 내에 CFU의 0.5-log10 감소가 일어났고, 치료의 60분 내에 2-log10 감소가 관찰되었으며, 이는, 감염된 동물의 혈류 내에서 PlySs2의 신속한 살균 활성을 입증한다(데이터 제시되지 않음).
뮤린 균혈증 모델
체중 16.0 내지 19.5g의 5 내지 7주령 암컷 BALB/c(동계교배 스트레인)를 Jackson Laboratories(Bar Harbor, Maine)로부터 구입하고, 모든 마우스 실험에 사용하였다. 박테리아 세포를 600nm에서 약 0.5의 광학 밀도로 성장시켜 지수기(Exponential phase)의 박테리아 접종물을 생성, 수거, 세척하고, 1.5 x 107 내지 2 x 109 CFU/ml로 농축하였다. 박테리아 펠렛을 5%(w/v)의 적절한 체적의 뮤신(Sigma Lot# SLBD5666V 또는 SLBD5666V)에 현탁시켜 특정 접종물을 형성하고 얼음물(wet ice)에 보관하였다. 500μL(약 7.5 x 106 내지 1 x 109 CFU)를 마우스에 i.p. 주사하였다. 연구 약물 용량을 160 내지 200μL의 주사된 체적으로 중량-조정하였다. 최초 24시간 동안 매 3시간 또는 6시간마다 감염-후, 이어서, 48시간 및 72시간째에 생존율을 평가하였다. 실험은 2 내지 3회 반복하였고, 각 치료 그룹에는 10 내지 20 마리의 마우스가 포함되었다. 감염성 작용제를 이용한 모든 실험 조작은 BSL-2 후드에서 수행하였다. 동물 사체는 사망으로 관찰되었을 때 제거하였다.
실시예 9
답토마이신 내성과 PlySs2 리신을 발생시키고 평가하기 위해 MRSA 균주 ATCC 700699 및 MSSA 균주 ATCC 25923으로 일련의 계대 실험(serial passage experiment)을 수행하였다. 이들 연구는, 답토마이신 내성이 리신 내성 또는 민감성, 특히, PlySs2 리신에 대한 내성 또는 민감성과 상호 관련되어 있는지를 평가하고 결정하기 위해 수행하였다. 우선, 21일간의 시험관내 성장을 통해, 단계적 방식으로 답토마이신 내성 클론을 (MIC 값을 높이면서) 발생시켰다. 이어서, PlySs2 리신 MIC를 평가함으로써 일련의 답토마이신 내성 클론을 리신 MIC 값에 대해 평가하였다. 그 결과는 도 28에 도시한다. 답토마이신 내성 클론에서, 답토마이신 MIC는 1에서 18㎍/mL로 올라간다. PlySs2 리신 MIC는 8에서 2 내지 4㎍/mL로 내려간다. 이들 연구는, 답토마이신 내성이 PlySs2 리신 민감성과 상호 관련이 있음을 보여준다. 이들은 답토마이신 내성과 리신 민감성을 평가하기 위한 최초의 연구이다. 놀랍게도, 이들 조건에서, 답토마이신에 대한 내성은, 리신에 대한 증가된 반응을 부여하고, 이는, 병용 또는 일련의 투여 및 치료요법의 타당성을 향상시켜 준다.
실시예 10
스태필로코커스 아우레우스 감염을 치료하는데 사용되는 다양한 치료기준 항생제와 병용되어 사용된 경우, 항생제 내성의 출현을 억제하는 PlySs2의 능력을 평가하기 위하여 일련의 계대 내성 연구를 수행하였다. 단일-작용제 및 조합적 일련의 계대 실험을 수행하는데 사용되는 방법은, 문헌[Palmer et al (2011) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 55:3345-56] 및 문헌[Berti et al (2012) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 56:5046-53]에 각각 기술되어 있다. 항생제 단독의 존재 하에 또는 항생제 + MIC값 미만의 PlySs2의 존재 하에 성장된 MRSA 스태필로코커스 아우레우스 균주(MW2)에 대한 항생제의 MIC 값의 증가가 3중으로 평가되었다. 균주 MW2에 대한 PlySs2의 MIC는 32㎍/ml(DTT 부재)이다. 따라서, 이들 실험에 대한 PlySs2의 농도로서는 MIC 값 미만의 4㎍/ml(1/8 MIC에 해당) 또는 MIC 값 미만의 8㎍/ml(1/4 MIC에 해당)를 선택하였다. 이 연구에서 예시적인 항생제로서 답토마이신과 반코마이신 둘 다를 시험하였다.
답토마이신 실험의 경우, 30일 연구 과정에 걸쳐 3회의 모든 답토마이신-단독 배양에서 답토마이신 내성이 유의하게 증가한 것으로 밝혀졌다(도 30). 이들 배양에서, 답토마이신 MIC 값은 1㎍/ml의 출발 값에서 각각 128, 128 및 64㎍/ml의 최종 값으로 증가하였다(64 내지 128배 증가). MIC 미만의 양의 PlySs2(4㎍/ml) + 답토마이신의 존재 하에 계대된 배양에서, 30일 일련의 계대 실험의 최종일에 답토마이신 MIC 값은 유의하게 낮은 4, 4 및 4㎍/ml이었다(4배 증가). 따라서, MIC 미만의 농도의 PlySs2는, 답토마이신 내성을 장착하려는 MRSA 균주의 능력을 답토마이신 단독 조건 대비 8 내지 16배까지 억제하였다. PlySs2 리신의 존재 하에 답토마이신에 대한 내성은 불과 약 4배 정도 증가하였다.
반코마이신 실험의 경우, 25일 연구 과정에 걸쳐 3회의 모든 반코마이신-단독 배양에서 반코마이신 내성이 유의하게 증가한 것으로 밝혀졌다. 이들 배양에서, 반코마이신 MIC 값은 1㎍/ml의 출발 값에서 각각 16, 16 및 16㎍/ml의 최종 값으로 증가하였다(16배 증가). MIC 미만의 양의 PlySs2(8㎍/ml) + 반코마이신의 존재 하에 계대된 배양에서, 25일 일련의 계대 실험의 최종일에 반코마이신 MIC 값은 유의하게 낮은 4, 4 및 2㎍/ml이었다(2 내지 4배 증가). 따라서, MIC 미만의 농도의 PlySs2는, 반코마이신 내성을 장착하려는 MRSA 균주의 능력을 반코마이신 단독 조건 대비 4 내지 8배까지 억제하였다. PlySs2 리신의 존재 하에 반코마이신에 대한 내성은 불과 약 4배 정도 증가하였다.
참조 문헌
Figure pat00017
Figure pat00018
Figure pat00019
본 발명은 이의 핵심 또는 본질적인 특징에서 벗어나지 않으면서 다른 형태로 구현되거나 다른 방식으로 실시될 수 있다. 따라서, 본원 내용은 모든 양상에서 제한적인 것이 아니고 예시적인 것으로서 고려되어야 하고, 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위에 의해 확정되며, 균등의 의미 및 범위에 속하는 모든 변화는 분명히 본 발명에 포함된다.
본원 명세서에는 여러 참조문헌들이 인용되고 있는데 각 문헌의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> CONTRAFECT CORPORATION <120> BACTERIOPHAGE LYSIN AND ANTIBIOTIC COMBINATIONS AGAINST GRAM POSITIVE BACTERIA <130> 3136-1-007PCT <150> US 61/644,944 <151> 2012-05-09 <150> US 61/737,239 <151> 2012-12-14 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 245 <212> PRT <213> Streptococcus suis <400> 1 Met Thr Thr Val Asn Glu Ala Leu Asn Asn Val Arg Ala Gln Val Gly 1 5 10 15 Ser Gly Val Ser Val Gly Asn Gly Glu Cys Tyr Ala Leu Ala Ser Trp 20 25 30 Tyr Glu Arg Met Ile Ser Pro Asp Ala Thr Val Gly Leu Gly Ala Gly 35 40 45 Val Gly Trp Val Ser Gly Ala Ile Gly Asp Thr Ile Ser Ala Lys Asn 50 55 60 Ile Gly Ser Ser Tyr Asn Trp Gln Ala Asn Gly Trp Thr Val Ser Thr 65 70 75 80 Ser Gly Pro Phe Lys Ala Gly Gln Ile Val Thr Leu Gly Ala Thr Pro 85 90 95 Gly Asn Pro Tyr Gly His Val Val Ile Val Glu Ala Val Asp Gly Asp 100 105 110 Arg Leu Thr Ile Leu Glu Gln Asn Tyr Gly Gly Lys Arg Tyr Pro Val 115 120 125 Arg Asn Tyr Tyr Ser Ala Ala Ser Tyr Arg Gln Gln Val Val His Tyr 130 135 140 Ile Thr Pro Pro Gly Thr Val Ala Gln Ser Ala Pro Asn Leu Ala Gly 145 150 155 160 Ser Arg Ser Tyr Arg Glu Thr Gly Thr Met Thr Val Thr Val Asp Ala 165 170 175 Leu Asn Val Arg Arg Ala Pro Asn Thr Ser Gly Glu Ile Val Ala Val 180 185 190 Tyr Lys Arg Gly Glu Ser Phe Asp Tyr Asp Thr Val Ile Ile Asp Val 195 200 205 Asn Gly Tyr Val Trp Val Ser Tyr Ile Gly Gly Ser Gly Lys Arg Asn 210 215 220 Tyr Val Ala Thr Gly Ala Thr Lys Asp Gly Lys Arg Phe Gly Asn Ala 225 230 235 240 Trp Gly Thr Phe Lys 245 <210> 2 <211> 738 <212> DNA <213> Streptococcus suis <400> 2 atgacaacag taaatgaagc attaaataat gtaagagctc aggttgggtc cggtgtgtct 60 gttggcaacg gcgaatgcta cgctttggct agttggtacg agcgcatgat tagtccggat 120 gcaactgtcg gacttggcgc tggtgtgggc tgggtcagcg gtgcaatcgg cgatacaatc 180 tctgccaaaa acatcggctc atcatacaac tggcaagcta acggctggac agtttccaca 240 tctggtccat ttaaagcagg tcagattgtg acgcttgggg caacaccagg aaacccttac 300 ggacatgtgg taatcgtcga agcagtggac ggcgatagat tgactatttt ggagcaaaac 360 tacggcggga aacgttatcc cgtccgtaat tattacagcg ctgcaagcta tcgtcaacag 420 gtcgtgcatt acatcacacc gcctggcacg gtcgcacagt cagcacccaa ccttgcaggc 480 tctcgttcct atcgcgagac gggcactatg actgtcacgg tcgatgctct caatgttcgc 540 agggcgccaa atacttcagg cgagattgta gcagtataca agcgtggtga atcatttgac 600 tatgatactg tcatcatcga tgtcaatggc tatgtctggg tgtcttacat aggcggcagc 660 ggcaaacgta actacgttgc gacgggcgct accaaagacg gtaagcgttt cggcaatgct 720 tggggtacat ttaaataa 738 <210> 3 <211> 139 <212> PRT <213> Streptococcus suis <400> 3 Leu Asn Asn Val Arg Ala Gln Val Gly Ser Gly Val Ser Val Gly Asn 1 5 10 15 Gly Glu Cys Tyr Ala Leu Ala Ser Trp Tyr Glu Arg Met Ile Ser Pro 20 25 30 Asp Ala Thr Val Gly Leu Gly Ala Gly Val Gly Trp Val Ser Gly Ala 35 40 45 Ile Gly Asp Thr Ile Ser Ala Lys Asn Ile Gly Ser Ser Tyr Asn Trp 50 55 60 Gln Ala Asn Gly Trp Thr Val Ser Thr Ser Gly Pro Phe Lys Ala Gly 65 70 75 80 Gln Ile Val Thr Leu Gly Ala Thr Pro Gly Asn Pro Tyr Gly His Val 85 90 95 Val Ile Val Glu Ala Val Asp Gly Asp Arg Leu Thr Ile Leu Glu Gln 100 105 110 Asn Tyr Gly Gly Lys Arg Tyr Pro Val Arg Asn Tyr Tyr Ser Ala Ala 115 120 125 Ser Tyr Arg Gln Gln Val Val His Tyr Ile Thr 130 135 <210> 4 <211> 67 <212> PRT <213> Streptococcus suis <400> 4 Arg Ser Tyr Arg Glu Thr Gly Thr Met Thr Val Thr Val Asp Ala Leu 1 5 10 15 Asn Val Arg Arg Ala Pro Asn Thr Ser Gly Glu Ile Val Ala Val Tyr 20 25 30 Lys Arg Gly Glu Ser Phe Asp Tyr Asp Thr Val Ile Ile Asp Val Asn 35 40 45 Gly Tyr Val Trp Val Ser Tyr Ile Gly Gly Ser Gly Lys Arg Asn Tyr 50 55 60 Val Ala Thr 65 <210> 5 <211> 280 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 5 Met Glu Thr Leu Lys Gln Ala Glu Ser Tyr Ile Lys Ser Lys Val Asn 1 5 10 15 Thr Gly Thr Asp Phe Asp Gly Leu Tyr Gly Tyr Gln Cys Met Asp Leu 20 25 30 Ala Val Asp Tyr Ile Tyr His Val Thr Asp Gly Lys Ile Arg Met Trp 35 40 45 Gly Asn Ala Lys Asp Ala Ile Asn Asn Ser Phe Gly Gly Thr Ala Thr 50 55 60 Val Tyr Lys Asn Tyr Pro Ala Phe Arg Pro Lys Tyr Gly Asp Val Val 65 70 75 80 Val Trp Thr Thr Gly Asn Phe Ala Thr Tyr Gly His Ile Ala Ile Val 85 90 95 Thr Asn Pro Asp Pro Tyr Gly Asp Leu Gln Tyr Val Thr Val Leu Glu 100 105 110 Gln Asn Trp Asn Gly Asn Gly Ile Tyr Lys Thr Glu Leu Ala Thr Ile 115 120 125 Arg Thr His Asp Tyr Thr Gly Ile Thr His Phe Ile Arg Pro Asn Phe 130 135 140 Ala Thr Glu Ser Ser Val Lys Lys Lys Asp Thr Lys Lys Lys Pro Lys 145 150 155 160 Pro Ser Asn Arg Asp Gly Leu Asn Lys Asp Lys Ile Val Tyr Asp Arg 165 170 175 Thr Asn Ile Asn Tyr Asn Met Val Leu Gln Gly Lys Ser Ala Ser Lys 180 185 190 Ile Thr Val Gly Ser Lys Ala Pro Tyr Asn Leu Lys Trp Ser Lys Gly 195 200 205 Ala Tyr Phe Asn Ala Lys Ile Asp Gly Leu Gly Ala Thr Ser Ala Thr 210 215 220 Arg Tyr Gly Asp Asn Arg Thr Asn Tyr Arg Phe Asp Val Gly Gln Ala 225 230 235 240 Val Tyr Ala Pro Gly Thr Leu Ile Tyr Val Phe Glu Ile Ile Asp Gly 245 250 255 Trp Cys Arg Ile Tyr Trp Asn Asn His Asn Glu Trp Ile Trp His Glu 260 265 270 Arg Leu Ile Val Lys Glu Val Phe 275 280

Claims (28)

  1. PlySs2 리신 및 하나 이상의 항생제를 포함하는, 그람-양성 박테리아를 사멸시키는데 사용하기 위한 병용물로서,
    상기 PlySs2 리신이 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖고 상기 하나 이상의 항생제의 존재 하에 상기 그람-양성 박테리아를 사멸시키는데 효과적인 이의 변이체를 포함하고,
    상기 하나 이상의 항생제 및/또는 상기 PlySs2 리신의 양이 최소 억제 농도(MIC) 용량 미만인, 그람-양성 박테리아를 사멸시키는데 사용하기 위한 병용물.
  2. 그람-양성 박테리아를 사멸시키는데 효과적인 PlySs2 리신 및 하나 이상의 항생제를 포함하는, 항생제-내성 그람-양성 박테리아를 억제하는데 사용하기 위한 병용물로서,
    상기 PlySs2 리신이 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖고 상기 그람-양성 박테리아를 사멸시키는데 효과적인 이의 변이체를 포함하고,
    상기 하나 이상의 항생제 및/또는 상기 PlySs2 리신의 양이 최소 억제 농도(MIC) 용량 미만인, 항생제-내성 그람-양성 박테리아를 억제하는데 사용하기 위한 병용물.
  3. 하나 이상의 항생제, 및 그람-양성 박테리아를 사멸시키는데 효과적인 PlySs2 리신을 포함하는, 항생제 내성 발생을 감소시키는데 사용하기 위한 병용물로서,
    상기 PlySs2 리신이 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖고 상기 그람-양성 박테리아를 사멸시키는데 효과적인 이의 변이체를 포함하고,
    상기 하나 이상의 항생제 및/또는 상기 PlySs2 리신의 양이 최소 억제 농도(MIC) 용량 미만인, 항생제 내성 발생을 감소시키는데 사용하기 위한 병용물.
  4. PlySs2 리신 및 하나 이상의 항생제를 포함하는, 그람-양성 박테리아 감염의 예방 또는 치료를 위한 치료 방법에서 그람-양성 박테리아를 사멸시키는데 사용하기 위한 병용물로서,
    상기 PlySs2 리신이 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖고 상기 하나 이상의 항생제의 존재 하에 상기 그람-양성 박테리아를 사멸시키는데 효과적인 이의 변이체를 포함하고,
    상기 하나 이상의 항생제 및/또는 상기 PlySs2 리신의 양이 최소 억제 농도(MIC) 용량 미만인, 그람-양성 박테리아 감염의 예방 또는 치료를 위한 치료 방법에서 그람-양성 박테리아를 사멸시키는데 사용하기 위한 병용물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 그람-양성 박테리아 감염이 균혈증 또는 폐렴을 포함하는, 병용물.
  6. PlySs2 리신을 포함하는, 계면활성제(surfactant)-유사 활성을 갖는 생물학적 유액 중의 그람-양성 박테리아에 대한 항생제 활성을 증강(potentiating)시키는데 사용하기 위한 조성물로서, 상기 PlySs2 리신이 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖고 상기 그람-양성 박테리아를 사멸시키는데 효과적인 이의 변이체를 포함하는, 계면활성제-유사 활성을 갖는 생물학적 유액 중의 그람-양성 박테리아에 대한 항생제 활성을 증강시키는데 사용하기 위한 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 조성물이 하나 이상의 항생제를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 항생제 및/또는 상기 PlySs2 리신의 양이 최소 억제 농도(MIC) 용량 미만인, 조성물.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 그람-양성 박테리아가 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae)를 포함하는, 조성물.
  9. 제1항 내지 제5항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 항생제의 양이 MIC 용량 미만이고/이거나 상기 PlySs2 리신 또는 이의 변이체의 양이 MIC 용량 미만인, 병용물 또는 조성물.
  10. 하나 이상의 항생제 및 PlySs2 리신을 포함하는, 하나 이상의 항생제의 유효성을 향상시키는데 사용하기 위한 조성물로서,
    상기 PlySs2 리신이 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖고 상기 그람-양성 박테리아를 사멸시키는데 효과적인 이의 변이체를 포함하고, 상기 항생제가 상기 PlySs2 리신과 병용되어 적어도 10배 더 효과적인, 하나 이상의 항생제의 유효성을 향상시키는데 사용하기 위한 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 적어도 10배 더 효과적인 하나 이상의 항생제가 적어도 16배 더 효과적, 예를 들어 적어도 50배 더 효과적인, 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 상기 하나 이상의 항생제의 부재 하에 상기 PlySs2 리신 또는 이의 변이체의 유효성과 비교하여 상기 PlySs2 리신 또는 이의 변이체는 상기 하나 이상의 항생제와 병용되어 적어도 2배 더 효과적인, 예를 들어 적어도 4배 더 효과적인, 조성물.
  13. 제1항 내지 제5항 및 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 항생제가 글리코펩타이드, 세팔로스포린, 매크로라이드, 옥사졸리디논, 리포펩타이드 및/또는 페니실린을 포함하는, 병용물 또는 조성물.
  14. 제1항 내지 제5항 및 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 항생제가 반코마이신, 테이코플라닌, 에리트로마이신, 클라리트로마이신, 아지트로마이신, 록시트로마이신, 옥사실린, 암피실린, 클록사실린, 리네졸리드 및/또는 답토마이신을 포함하는, 병용물 또는 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PlySs2 리신 또는 이의 변이체가 단일 용량(single dose)으로 제형화되는, 병용물 또는 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PlySs2 리신 또는 이의 변이체가 다중 용량(multiple dose)으로 제형화되는, 병용물 또는 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 병용물 또는 조성물이 정맥내 투여용으로 제형화되는, 병용물 또는 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PlySs2 리신 또는 이의 변이체 및 상기 하나 이상의 항생제가 순차적 투여를 위해 제형화되는, 병용물 또는 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PlySs2 리신 또는 이의 변이체 및 상기 하나 이상의 항생제가 동시 투여를 위해 제형화되는, 병용물 또는 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PlySs2 리신 변이체가 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성, 예를 들어 적어도 95%의 동일성을 갖고 상기 그람-양성 박테리아를 사멸시키는데 효과적인, 병용물 또는 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PlySs2 리신 변이체가 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 99.5%의 동일성을 갖고 상기 그람-양성 박테리아를 사멸시키는데 효과적인, 병용물 또는 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PlySs2 리신이 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 하나 이상의 아미노산 잔기가 상기 PlySs2 리신 서열의 N 또는 C 말단에서 부가되거나 결실되고 상기 그람-양성 박테리아를 사멸시키는데 효과적인, 병용물 또는 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 PlySs2 리신이 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 하나의 아미노산 잔기가 상기 PlySs2 리신 서열의 N 또는 C 말단에서 결실되고 상기 그람-양성 박테리아를 사멸시키는데 효과적인, 병용물 또는 조성물.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 PlySs2 리신이 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열이고, 여기서 하나의 아미노산 잔기가 상기 PlySs2 리신 서열의 N 또는 C 말단에서 결실되고 상기 그람-양성 박테리아를 사멸시키는데 효과적인, 병용물 또는 조성물.
  25. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 PlySs2 리신이 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열이고, 여기서 하나의 아미노산 잔기가 상기 PlySs2 리신 서열의 N 말단에서 결실되고 상기 그람-양성 박테리아를 사멸시키는데 효과적인, 병용물 또는 조성물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 그람-양성 박테리아가 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스태필로코커스 시물란스(Staphylococcus simulans), 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis), 스태필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스트렙토코커스 에퀴(Streptococcus equi), 스트렙토코커스 에퀴 쥬(Streptococcus equi zoo), 스트렙토코커스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 샌귀니스(Streptococcus sanguinis), 스트렙토코커스 고르도니이(Streptococcus gordonii), 스트렙토코커스 디스갈락티에(Streptococcus dysgalactiae), G 그룹 스트렙토코커스, E 그룹 스트렙토코커스 및/또는 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumonia)와 같은 스태필로코커스 및/또는 스트렙토코커스를 포함하는, 병용물 또는 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 스태필로코커스 박테리아가 스태필로코커스 아우레우스를 포함하는, 병용물 또는 조성물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 그람-양성 박테리아가 엔테로코커스(Enterococcus) 및/또는 리스테리아(Listeria)를 포함하는, 병용물 또는 조성물.
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