KR102528412B1 - 신규한 포도상구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
신규한 포도상구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102528412B1 KR102528412B1 KR1020200114435A KR20200114435A KR102528412B1 KR 102528412 B1 KR102528412 B1 KR 102528412B1 KR 1020200114435 A KR1020200114435 A KR 1020200114435A KR 20200114435 A KR20200114435 A KR 20200114435A KR 102528412 B1 KR102528412 B1 KR 102528412B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- igg
- coa
- vwbp
- protein
- human
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 93
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 title claims description 13
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 title description 5
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims abstract description 83
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims abstract description 80
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims abstract description 79
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 40
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 206010041925 Staphylococcal infections Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 192
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 171
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 62
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 56
- 101710198480 Clumping factor A Proteins 0.000 claims description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 29
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 25
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 22
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 claims description 12
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 10
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 8
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 7
- RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N Methicillin Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C(O)=O)C(C)(C)S[C@@H]21 RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N 0.000 claims description 6
- 230000003489 leucocidal effect Effects 0.000 claims description 6
- 229960003085 meticillin Drugs 0.000 claims description 6
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 6
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 claims description 6
- 101710092462 Alpha-hemolysin Proteins 0.000 claims description 5
- 108010065152 Coagulase Proteins 0.000 claims description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 claims description 3
- 101710084578 Short neurotoxin 1 Proteins 0.000 claims 2
- 101710182532 Toxin a Proteins 0.000 claims 2
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 claims 2
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 abstract description 39
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 15
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 abstract description 7
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 abstract description 7
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 abstract description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 abstract description 5
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 abstract description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 109
- 101000743092 Bacillus spizizenii (strain DSM 15029 / JCM 12233 / NBRC 101239 / NRRL B-23049 / TU-B-10) tRNA3(Ser)-specific nuclease WapA Proteins 0.000 description 93
- 101000743093 Bacillus subtilis subsp. natto (strain BEST195) tRNA(Glu)-specific nuclease WapA Proteins 0.000 description 93
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 90
- 102000016550 Complement Factor H Human genes 0.000 description 88
- 108010053085 Complement Factor H Proteins 0.000 description 88
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 87
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 77
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 77
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 74
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 61
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 56
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 49
- 210000003622 mature neutrocyte Anatomy 0.000 description 38
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 35
- 102100022133 Complement C3 Human genes 0.000 description 30
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 28
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 27
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 25
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 25
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 23
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 23
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 23
- 108010078015 Complement C3b Proteins 0.000 description 22
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 21
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 20
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 19
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 18
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 18
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 17
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 17
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 17
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 17
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 17
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 15
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 15
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 15
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 14
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 14
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 14
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 14
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 14
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 14
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 14
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 13
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 13
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 13
- 101100335629 Homo sapiens FH gene Proteins 0.000 description 12
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 12
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 11
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 11
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 11
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 10
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 10
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 10
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 10
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 9
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 9
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 8
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 8
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 8
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 8
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 7
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 7
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 7
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 6
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 6
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 6
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 102100036166 C-X-C chemokine receptor type 1 Human genes 0.000 description 5
- 102100028989 C-X-C chemokine receptor type 2 Human genes 0.000 description 5
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 5
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 5
- 101000947174 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 1 Proteins 0.000 description 5
- 108010018951 Interleukin-8B Receptors Proteins 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 101150085107 clfA gene Proteins 0.000 description 5
- 101150035844 clfB gene Proteins 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 5
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 101150064504 sdrC gene Proteins 0.000 description 5
- 101150009625 sdrD gene Proteins 0.000 description 5
- 101150073644 sdrE gene Proteins 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 5
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 5
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 4
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 4
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 4
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 4
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 4
- 108010014603 Leukocidins Proteins 0.000 description 4
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 4
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 4
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 4
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100031151 C-C chemokine receptor type 2 Human genes 0.000 description 3
- 101710149815 C-C chemokine receptor type 2 Proteins 0.000 description 3
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000737574 Homo sapiens Complement factor H Proteins 0.000 description 3
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 101000606032 Pomacea maculata Perivitellin-2 31 kDa subunit Proteins 0.000 description 3
- 101000606027 Pomacea maculata Perivitellin-2 67 kDa subunit Proteins 0.000 description 3
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 3
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 102000045512 human CFH Human genes 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 239000001974 tryptic soy broth Substances 0.000 description 3
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 3
- 238000012762 unpaired Student’s t-test Methods 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 3
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091007504 ADAM10 Proteins 0.000 description 2
- 102000036664 ADAM10 Human genes 0.000 description 2
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 description 2
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 description 2
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 2
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- 108091006054 His-tagged proteins Proteins 0.000 description 2
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 240000007711 Peperomia pellucida Species 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 239000002776 alpha toxin Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 108700021021 mRNA Vaccine Proteins 0.000 description 2
- 229940126582 mRNA vaccine Drugs 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000001662 opsonic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004476 Acute Coronary Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 101710197219 Alpha-toxin Proteins 0.000 description 1
- 102000005590 Anaphylatoxin C5a Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010059426 Anaphylatoxin C5a Receptor Proteins 0.000 description 1
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 1
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010053555 Arthritis bacterial Diseases 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000031648 Body Weight Changes Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 201000006474 Brain Ischemia Diseases 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010008088 Cerebral artery embolism Diseases 0.000 description 1
- 206010008120 Cerebral ischaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010008132 Cerebral thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 108090000044 Complement Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102100035431 Complement factor I Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 206010051055 Deep vein thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 206010014522 Embolism venous Diseases 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 1
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 1
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 1
- 201000001429 Intracranial Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102100033468 Lysozyme C Human genes 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 208000037942 Methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection Diseases 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 208000008238 Muscle Spasticity Diseases 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 206010031252 Osteomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 208000018262 Peripheral vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 101710124951 Phospholipase C Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 206010036410 Postoperative wound infection Diseases 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 206010062255 Soft tissue infection Diseases 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 208000031650 Surgical Wound Infection Diseases 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229940124691 antibody therapeutics Drugs 0.000 description 1
- 229940038444 antibody-based vaccine Drugs 0.000 description 1
- 206010002906 aortic stenosis Diseases 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 208000025255 bacterial arthritis Diseases 0.000 description 1
- 108010056458 bacterial fibronectin-binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003782 beta lactam antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 239000003130 blood coagulation factor inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000004579 body weight change Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- -1 but not limited to Chemical compound 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000378 calcium silicate Substances 0.000 description 1
- 229910052918 calcium silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012241 calcium silicate Nutrition 0.000 description 1
- OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N calcium;dioxido(oxo)silane Chemical compound [Ca+2].[O-][Si]([O-])=O OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 108010047295 complement receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006834 complement receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 206010014665 endocarditis Diseases 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 229940106780 human fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 201000010849 intracranial embolism Diseases 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000002969 morbid Effects 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000002353 niosome Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 230000004817 opsonic phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000003571 opsonizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 1
- 238000010422 painting Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 1
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 1
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 208000018198 spasticity Diseases 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 101150065190 term gene Proteins 0.000 description 1
- 201000005060 thrombophlebitis Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 208000004043 venous thromboembolism Diseases 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000002132 β-lactam antibiotic Substances 0.000 description 1
- 229940124586 β-lactam antibiotics Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/14—Peptides containing saccharide radicals; Derivatives thereof, e.g. bleomycin, phleomycin, muramylpeptides or vancomycin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/085—Staphylococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
- C07K16/1275—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Streptococcus (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
- C07K16/1271—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Micrococcaceae (F), e.g. Staphylococcus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
본 발명은 포도상구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 포도상구균 감염에 의한 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 포도상구균 독소에 대한 항체들의 교차반응성을 활용하여, 최소한의 항원의 조합 만으로도 포도상구균의 11개 독소에 의한 세포 용해를 빈틈없이 억제할 수 있다. 본 발명은 또한 옵소닌식세포작용을 유도하고 동시에 피감염체에서의 혈액 응고를 효과적으로 제어함으로써, 포도상구균 감염으로 인한 개별적 증상의 단편적 개선에서 벗어나, 감염으로 야기된 종합적인 병적 상태를 포괄적으로 제거 또는 경감시킬 수 있는 효율적인 치료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 포도상구균 유래 톡신들의 특정한 조합을 유효성분으로 포함하는 포도상구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
포도상구균(Staphylococcus aureus)은 인간의 피부, 연조직 및 혈류에서 중증 감염을 야기하는 그람양성균으로, 다양한 경로를 통해 베타-락탐 계열의 항생제인 메티실린에 대해 내성을 갖는 메티실린-내성 균주(methicillin-resistant S. aureus; MRSA)로 변형될 수 있다. 이러한 MRSA 감염은 치료가 어렵고 예후가 좋지 않아 막대한 사회적 비용을 유발하고 있다.
S. aureus 이성분 류코시딘(bi-component leukociodin, BCL)은 포어-형성 톡신(pore-forming toxin, PFT) 패밀리에 속하는 중요한 독성 인자이다. BCL은 숙주 세포를 타겟팅하는 S-성분(크로마토그래피 컬럼에서 느리게 이동하는 LukS-PV, LukE, HlgA, HlgC 및 LukA)과 중합화 F-성분(크로마토그래피 컬럼에서 빠르게 이동하는 LukF-PV, LukD, HlgB 및 LukB)의 2개 서브유닛을 가진다. 반면, LukAB는 이미 결합된 가용성 헤테로다이머 형태로 분비되고, S. aureus α-톡신(Hla)은 β-배럴 PFT를 형성하는 단일성분이다.
S. aureus BCL 톡신과 Hla는 숙주세포 표면에서 특이적으로 발현하는 수용체와 결합함으로써 호중구, 단핵구/대식세포 및 적혈구(RBC)와 같은 숙주세포의 용해를 유도한다. LukSF-PV 및 HlgCB는 C5aR1와 C5aR2를 이용하고, LukED는 CCR5, CXCR1 및 CXCR2를 이용하며, HlgAB 및 LukED는 CXCR1 및 CXCR2를 수용체로써 함께 이용하나 CCR2와 DARC(Duffy antigen receptor for chemokines) 수용체를 이용할 수도 있고, 한편 LukAB는 CD11b와 결합한다. Hla는 RBC, 상피세포, 내피세포 및 호중구, 단핵구/대식세포, T 세포 등의 면역세포의 세포막에서 발현되는 ADAM10 단백질을 인식한다.
현재까지 S. aureus의 침습성 감염을 예방할 목적으로 개발된 백신의 인간 임상시험은 모두 실패하였다. 대부분의 백신들이 S. aureus 표면 항원에 대한 높은 역가의 옵소닌 항체를 생성하였음에도 종국적으로는 유효 백신으로 완성되지 못했는데, 이는 숙주 면역기작과 S. aureus의 감염 메카니즘에 대한 불완전한 이해 및 인간에서 S. aureus에 대한 지속가능한 장기간 면역 유도를 가능하게 하는 수단의 부재 때문이다.
최근, S. aureus 백신 개발을 위한 2가지 새로운 접근이 이루어지고있다. 첫 번째는 면역화로 생성된 항체를 통한 옵소닌식세포작용(opsonophagocytosis)을 유도하기 위해 S. aureus 표면 항원을 이용하는 것이다. 생성된 항체는 박테리아 표면에 결합하여 이를 사멸시킬 것으로 기대되었으나, 이들 옵소닌 항체-기반 백신 후보들은 임상 시험에서 효과를 발휘하지 못하였으며, 몇몇은 실제 S. aureus 감염이 발생하였을 때 해로운 결과를 나타냈다(Fowler VG, et al., 2013, Jama 309:1368-78). 다른 하나는 S. aureus 톡소이드를 백신 후보물질로 사용하는 것으로, 이러한 전략은 다중 톡소이드 항원의 면역화를 통해 중화 항체를 유도하기 위한 것이다.
5개의 S. aureus BCL과 Hla(α-톡신)를 포함하는 총 11개 성분이 숙주세포 및 RBC에서 각각 발현되는 5개의 상이한 수용체 패밀리인 키모카인 수용체, 보체 수용체, CD11b 수용체, DARC 수용체 및 ADAM10 수용체를 특이적으로 인식한다는 사실이 보고되었다(Wilke GA et al., 2010, Proc Natl Acad Sci USA 107:13473-8). 활성을 가진 톡신 성분을 이용한 면역화는 이들의 독성으로 인해 백신으로서 사용이 어려우며, 11개의 톡소이드 단백질 모두를 면역화하는 데에도 제조상의 어려움이 따른다.
이에, 본 발명자들은 면역화를 통해 생성된 항체로 11개의 톡신-매개 세포독성을 광범위하게 차단하기 위한, 톡신 후보물질의 가장 효율적인 조합을 발굴하고자 하였다. 아울러, 본 발명자들은 옵소닌식세포작용을 가장 잘 유도하고 피감염체에서의 혈액 응고를 가장 효과적으로 제어할 수 있는 단백질의 절편 및 이들의 조합을 탐색함으로써, 포도상구균 감염으로 인한 개별적 증상의 단편적 개선에서 벗어나, 감염으로 야기된 종합적인 병적 상태를 포괄적으로 제거 또는 경감시킬 수 있는 실질적인 예방 백신 또는 치료제를 개발하고자 하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 포도상구균 감염으로 인한 세포 독성을 현저히 중화시켜 숙주 세포의 용해를 효율적으로 차단할 수 있는 포도상구균 감염 질환의 예방 또는 치료제 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 이를 위해 본 발명자들은 포도상구균 유래 각 독소에 대한 항체의 교차 반응성을 조사하고 이를 기반으로 가장 광범위한 중화 활성을 발휘하는 최적의 조합을 탐색한 결과, Hla, LukS, LukAB 및 HlgA 단일 독소 중 셋 이상의 독소를 조합할 경우, 보다 구체적으로는 4개의 독소를 모두 조합할 경우 이들을 접종하여 대상체에서 생성된 각 항체들에 의해 모든 포도상구균 독소- 매개 세포 용해 활성이 빈틈없이 차단되고 혈액 용혈 작용이 현저히 억제될 수 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 포도상구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 포도상구균 감염에 의한 혈전성 질환(thrombotic disorder)의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 Hla(alpha-hemolysin), LukS(Leukocidal toxin S), LukAB(Leukocidal toxin AB) 및 HlgA(gamma-hemolysin)로 구성된 군으로부터 선택되는 셋 이상의 포도상구균 유래 독소; 상기 독소를 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 상기 독소를 코딩하는 뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 포도상구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 포도상구균 감염으로 인한 세포 독성을 현저히 중화시켜 숙주 세포의 용해를 효율적으로 차단할 수 있는 포도상구균 감염 질환의 예방 또는 치료제 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 이를 위해 본 발명자들은 포도상구균 유래 각 독소에 대한 항체의 교차 반응성을 조사하고 이를 기반으로 가장 광범위한 중화 활성을 발휘하는 최적의 조합을 탐색한 결과, Hla, LukS, LukAB 및 Hlg 중 셋 이상의 독소를 조합할 경우, 보다 구체적으로는 4개의 독소를 모두 조합할 경우 이들을 접종하여 대상체에서 생성된 각 항체들에 의해 포도상구균의 11개 독소-매개 세포 용해 활성이 빈틈없이 차단되고 혈액 용혈 작용이 현저히 억제될 수 있음을 발견하였다.
본 발명은 각 독소 단백질, 또는 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 대상체에 투여하여 대상체 내에서 각 독소에 대한 항체를 형성시키는 백신의 형태가 될 수도 있고, 각 독소에 대한 분리·정제된 항체를 약리성분으로 하는 항체 치료제 형태로 이용될 될 수도 있다. 이에, 전자의 경우 용어“포도상구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물”은“포도상구균 백신 조성물”과 같은 의미를 가진다.
본 명세서에서 용어 "항체"는 포유류의 면역 체계에 의해 생성된, 항원의 에피토프에 결합하는 하나 이상의 가변 도메인을 포함하여 해당 항원을 특이적으로 인식하는 면역글로불린 단백질을 의미한다. 본 발명에서 이용되는 각 포도상구균 독소를 특이적으로 인식하는 항체로는 다클론 또는 단클론 항체가 모두 사용될 수 있으며, 구체적으로는 교차 반응성을 가지는 다클론 항체를 사용할 수 있다.
본 발명의 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519 (1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,567호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에서 보고된 방법에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; 및 Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984에 상세하게 기재되어 있다.
본 명세서에서 용어“항원 결합 단편(antigen binding fragment)”은 면역글로불린 전체 구조 중 항원이 결합할 수 있는 폴리펩티드의 일부를 의미하며, 예를 들어 F(ab')2, Fab', Fab, Fv 및 scFv를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어, "특이적으로 결합(specifically binding)" 은 "특이적으로 인식(specifically recognizing)"과 동일한 의미로서, 항원과 항체(또는 이의 단편)가 면역학적 반응을 통해 특이적으로 상호작용하는 것을 의미한다.
본 발명은 또한 상술한 4개 독신의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 DNA 백신 또는 mRNA 백신의 형태로 이용될 수도 있다.
본 명세서에서, 용어“뉴클레오타이드”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)). 본 발명이 DNA 백신 또는 mRNA 백신 형태로 이용될 경우 본 발명의 3개 또는 4개의 톡신 유전자를 각각의 유전자 전달체(gene delivery system)에 포함될 수도 있고 복수개의 톡신 항원 유전자를 하나의 유전자 전달체에 동시에 삽입하여 대상체에서 발현시킬 수도 있다.
본 명세서에서 용어“발현시키다”는 대상체가 외래(exogenous) 유전자를 발현하게 하거나 또는 내인성(endogenous) 유전자의 자연적 발현량을 증가시키기 위해 유전자 전달체를 이용하여 인위적으로 이를 도입함으로써 유전자가 대상체 세포 내에서 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 따라서, 용어“발현”은“형질전환(transformation)”, "형질감염(transfection)" 또는 "형질도입(transduction)"과 동일한 의미이다.
본 명세서에서 용어 “유전자 전달체”는 원하는 타겟 유전자를 대상 세포에 도입하여 발현시키기 위한 매개체를 의미한다. 이상적인 유전자 전달체는 인체에 무해하고 대량생산이 용이하며 효율적으로 유전자를 전달할 수 있어야 한다.
본 명세서에서, 용어“유전자 전달”은 유전자가 세포 내로 운반되는 것을 의미하며, 유전자의 세포내 침투(transduction)와 동일한 의미를 가진다. 조직 수준에서, 상기 용어 유전자 전달은 유전자의 확산(spread)과 동일한 의미를 가진다. 따라서, 본 발명의 유전자 전달체는 유전자 침투 시스템 및 유전자 확산 시스템으로 기재될 수 있다.
본 발명의 유전자 전달체을 제조하기 위해, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 적합한 발현 컨스트럭트(expression construct) 내에 존재하고, 발현조절 서열(예를 들어 프로모터, 시그널 서열, 전사조절인자 결합 위치의 어레이)에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다. 본 명세서에서, 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현조절 서열과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명의 유전자 전달체는 다양한 형태로 제작할 수 있는 데, 이는 (ⅰ) 내이키드(naked) 재조합 DNA 분자, (ⅱ) 플라스미드, (ⅲ) 바이러스 벡터, (ⅳ) 상기 내이키드 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드를 내포하는 리포좀 또는 니오좀의 형태, 또는 (v) mRNA를 내포하는 리포좀 형태로 제작할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 Hla는 Hla(alpha-hemolysin) 단백질의 아미노산 서열 중 35번째 아미노산 잔기가 치환된 변이체이다. 보다 구체적으로는, 상기 35번째 아미노산 His 잔기는 Leu으로 치환된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 LukAB는 LukAB(Leukocidin AB) 단백질의 아미노산 서열 중 323번째 Glu 아미노산 잔기가 치환된 변이체이다. 보다 구체적으로는, 상기 323번째 아미노산 Glu 잔기는 Ala으로 치환된다.
본 명세서에서 용어“예방”은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어“치료”는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물을 대상체에 투여하면 포도상구균 유래 11개 독소로 매개되는 광범위한 세포 용해 활성이 효율적으로 억제됨으로써 포도상구균 감염에 의한 증상의 발전을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 이들 질환 치료의 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분과 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어“치료”또는“치료제”는“치료 보조”또는“치료 보조제”의 의미를 포함한다.
본 명세서에서 용어“투여”또는“투여하다”는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다.
본 발명에서 용어“치료적 유효량”은 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하고자 하는 개체에게 조성물 내의 약리성분이 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 정도로 함유된 조성물의 함량을 의미하며, 이에“예방적 유효량”을 포함하는 의미이다.
본 명세서에서 용어“대상체”는 제한없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 포도상구균은 메티실린 저항성 포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA), 메티실린 민감성 포도상구균(methicillin-sensitive Staphylococcus aureus, MSSA) 또는 병원성 포도상구균일 수 있으며, 보다 구체적으로는 메티실린 저항성 포도상구균이다.
포도상구균 감염 질환의 예는 연부조직 감염, 화농성 관절염, 화농성 골수염, 중이염, 폐렴, 패혈증, 급성호흡기 감염(acute respiratory tract infection), 카테터의 사용으로 인한 감염, 수술 후 창상 감염, 균혈증, 심내막염 및 식중독을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 ClfA(Clumping factor A), FnbpA(fibrinectin-binding protein A), FnbpB(fibrinectin-binding protein B) 및 이들의 기능적 일부(functional portion)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질; 상기 단백질을 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 상기 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 포도상구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 뉴클레오타이드 및 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료하고자 하는 포도상구균 감염 질환에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명자들은 또한 포도상구균 특유의 숙주 면역체계 회피 시스템을 무력화함으로써 포도상구균 감염 질환을 예방 또는 치료하거나, 또는 백신을 비롯한 포도상구균 치료 조성물의 치료 민감성을 향상시키는 조성물을 탐색하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, MSCRAMM(microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules)에 속하는 ClfA, FnbpA, FnbpB 및 이들 각 단백질의 기능적 일부로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 조합을 대상체에 투여할 경우, 해당 단백질들이 박테리아 생균 표면의 MSCRAMM 대신 숙주 혈청의 Factor H(인간 보체 인자 H, FH)와 경쟁적으로 결합함으로써 보체 C3b가 iC3b로 가수분해되는 것을 차단하고, 활성이 유지된 C3b에 의해 박테리아에 대한 옵소닌식세포작용이 촉진된다는 사실을 발견하였다.
본 명세서에서 용어“기능적 일부(functional portion)”는 ClfA, FnbpA, FnbpB 단백질의 생물학적 활성을 유지하는 여하한 길이의 일부 절편을 모두 포괄하는 의미이다. 따라서, ClfA, FnbpA, FnbpB 단백질의 기능적 일부라 함은 혈청의 FH와 특이적으로 상호작용할 수 있거나, 박테리아 생균 표면의 MSCRAMM에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 생성을 유도하는 항원으로서 기능할 수 있는 각 단백질의 일부 절편을 의미한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 기능적 일부는 상기 단백질의 N2-N3 도메인을 포함하는 절편이며, 보다 구체적으로는 상기 단백질의 N2-N3 도메인(ClfAN2N3, FnbpAN2N3 및 FnbpBN2N3)이다. ClfAN2N3, FnbpAN2N3 및 FnbpBN2N3와 FH 간의 상호작용은 알려진 바가 없으며, 본 발명자들은 이들 절편이 FH에 경쟁적 결합을 하거나, 이들에 대한 항체가 박테리아 생균 표면의 MSCRAMM과 경쟁적 결합을 함으로써 숙주 혈청의 FH와 박테리아 표면의 MSCRAMM 간의 상호작용이 효율적으로 차단될 수 있음을 처음으로 규명하였다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 ClfA의 N2-N3 도메인을 포함하는 일부 절편 및 FnbpB의 N2-N3 도메인을 포함하는 일부 절편; 상기 절편을 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 상기 절편을 코딩하는 뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 구체적으로는 정맥, 피하 또는 복강 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물이 백신 조성물로 제조될 경우, 본 발명의 복수의 항원과 다양한 형태의 적합한 어주번트가 선택적으로 조합된 하나의 바이얼 (vial) 또는 주사기 (prefilled syringe) 등에 포장되거나, 또는 각각의 항원과 어주번트가 별개의 바이얼에 포장되어 사용 직전에 이를 혼합하여(용시조제, bed side mixing) 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Coa(coagulase), vWbp(von Willebrand factor binding protein) 및 이들의 기능적 일부(functional portion)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질; 상기 단백질을 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 상기 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 포도상구균 감염에 의한 혈전성 질환(thrombotic disorder)의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 숙주 혈관에서 피브린 응고를 유발하는 포도상구균 특유의 숙주 면역 시스템 회피 메카니즘을 효율적으로 차단함으로써 감염 시 혈액 응고로 인한 환자의 전신적 손상을 최소화하고 생존성을 더욱 향상시키는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 포도상구균의 주요 독성인자로 알려진 코아귤라제(Coa) 및 vWF-결합 도메인 단백질(vWbp), 구체적으로는 이들의 특정 기능적 절편을 이용할 경우 이의 접종을 통해 생성된 항체에 의해 혈액 응고가 유의하게 억제됨을 확인하였다.
본 명세서에서 Coa 또는 vWbp 단백질을 언급하면서 사용되는 용어“기능적 일부(functional portion)”는 Coa, vWbp 단백질의 생물학적 활성을 유지하는 여하한 길이의 일부 절편을 모두 포괄하는 의미이다. 따라서, 포도상구균 표면 단백질(예를 들어 Fnbp)에 의해 인식되거나, 또는 포도상구균 감염에 의한 혈액 응고를 유의하게 억제하는 항체의 생성을 유도하는 항원으로서 기능할 수 있는 각 단백질의 일부 절편을 의미한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 Coa의 기능적 일부는 Coa 단백질의 N-말단 절편이며, 보다 구체적으로는 N-말단으로부터 연속된 284개 아미노산 잔기를 포함하는 절편이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 vWbp의 기능적 일부는 vWbp 단백질의 N-말단 절편이며, 보다 구체적으로는 vWbp 단백질의 N-말단으로부터 연속된 253개 아미노산 잔기를 포함하는 절편이다.
본 명세서에서 용어“혈전성 질환”은 혈관의 미세순환계에 혈소판이나 피브린 단백질이 응집되면서 생성된 혈전으로 인해 혈류가 감소 또는 차단되고, 이로 인해 신장, 심장, 뇌 등의 각 기관에 허혈성 손상이 유발되는 전신 질환을 의미한다.
구체적으로는, 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료하고자 하는 포도상구균 감염에 의한 혈전성 질환은 포도상구균 감염에 의한 뇌졸중, 뇌경색, 뇌혈전증, 뇌색전증, 열공성 뇌경색, 급성 관동맥 증후군, 협심증, 대동맥 협착증, 심근경색증, 각차단, 뇌허혈, 급성 허혈성 심혈관질환(acute ischemic arteriovascular event), 혈전성 정맥염, 정맥혈전색전증, 심부정맥혈전증(deep vein thrombosis), 폐색전증(pulmonary embolism), 말초혈관질환, 아테롬성 동맥경화증, 혈관경련 및 재협착증으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환이다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 포도상구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 포도상구균 감염에 의한 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명은 포도상구균 독소에 대한 항체들의 교차반응성을 활용하여, 최소한의 독소 항원의 조합 만으로도 포도상구균의 11개 독소에 의한 세포 용해를 빈틈없이 억제할 수 있다.
(c) 본 발명은 또한 옵소닌식세포작용을 유도하고 동시에 피감염체에서의 혈액 응고를 효과적으로 제어함으로써, 포도상구균 감염으로 인한 개별적 증상의 단편적 개선에서 벗어나, 감염으로 야기된 종합적인 병적 상태를 포괄적으로 제거 또는 경감시킬 수 있는 효율적인 치료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 클로닝된 BCL, Hla 및 세 개의 톡소이드 유전자 산물의 아가로스 전기영동 패턴을 보여주는 그림으로 예상되는 유전자 산물을 수득하였다. (A)는 클로닝된 7개의 단일 성분 유전자를, (B)는 LukAB 다이머 유전자를 포함하는 클로닝된 유전자를; (C)는 Hla 유전자를; (D)는 HlaH35L를; (E)는 LukST244A를; (F)는 LukAE323AB를 각각 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 구축된 재조합 야생형 S. aureus 및 톡소이드 BCL 톡신의 모식도이다.
도 3은 재조합 BCL, 톡소이드, 톡신의 정제 결과 및 이들의 세포용매 및 용혈활성 측정 결과는 보여주는 그림이다. 도 3a는 각 단백질 5μg을 환원 조건 하에서 15% SDS-PAGE에 로딩한 결과이다. 도 3b는 톡소이드 단백질 5μg의 SDS-PAGE 패턴을 보여준다. 도 3c는 인간 PMN(2 x 106 세포)를 0.125μg의 정제된 BCL 및 톡소이드와 1시간 동안 공배양한 결과를 보여준다. 컬럼 1, 톡신 없음; 2, LukST244A-PV+LukF-PV; 3, LukAE323AB; 4, LukS-PV+LukF-PV; 5, LukE+LukD; 6, HlgC+HlgB; 7, HlgA+HlgB; 8, LukAB. 도 3d는 2% 래빗 RBC를 HlaWT (0.25μg) 및 HlaH35L (0.25μg) 톡소이드와 37℃에서 1시간 동안 공배양한 결과를 보여준다. 컬럼: 1, PBS; 2, HlaWT; 3, HlaH35L
도 4는 BCL-면역화된 래빗 혈청에서 정제된 래빗 항-BCL 인식 IgG의 용출 패턴을 보여주는 그림이다. 먼저 래빗 혈청(120mg)을 단백질-A 세파로스 컬럼(Sigma-Aldrich)에 로딩하고 결합된 총 IgG를 0.15M 글리신 완충액(pH 2.2)으로 용출하였다(데이터 미기재). 농축 후, 수집한 IgG를 각 톡신 및 톡소이드-접합 세파로스 컬럼에 로딩하고 0.15 M 글리신 용액(pH 2.2)으로 용출하였다.
도 5는 도트 블롯 면역어세이 상에서 항-BCL IgG가 래빗 단일 BCL를 인식하는 패턴을 보여주는 그림이다. 각 정제된 단일 BCL 성분(1μg)을 PVDF 스트립에 찍어주고 각 동계 항-BCL-IgG와 함께 1시간 동안 상온에서 배양하였다. 세척 후, 각 스트립은 HRP-접합 고트 항-래빗-IgG와 함께 배양하였다.
도 6은 PMN(2 x 106 세포)과 BCL의 동계 S-성분(0.25μg/ml) 및 F-성분(0.25μg/ml)의 혼합물을 공배양시 인간 PMN의 생존율을 보여주는 그림으로, 정제된 항-LukS-PV-IgG(A), 항-HlgA-IgG(B), 항-HlgC-IgG(C) 및 항-LukE-IgG(D)의 존재 하에 실험한 결과를 각각 나타낸다. 컬럼 1, 톡신 없음(녹색); 컬럼 2, HlgA+HlgB(갈색); 컬럼 3, LukE+LukD(연두); 컬럼 4, LukS-PV+LukF-PV(파란색); 컬럼 5, HlgC+HlgB(황색); 컬럼 6, LukAB(주황색).
도 7은 PMN(2 x 106 세포)과 BCL의 동계(cognate) S-성분(0.25μg/ml) 및 F-성분(0.25μg/ml)의 혼합물을 공배양시 인간 PMN의 생존율을 보여주는 그림으로, 정제된 항-LukF-PV-IgG(A), 항-HlgB-IgG(B) 및 항-LukD-IgG(C)의 존재 하에 실험한 결과를 각각 나타낸다. 컬럼 1, 톡신 없음(녹색); 컬럼 2, HlgA+HlgB(갈색); 컬럼 3, LukE+LukD(연두); 컬럼 4, LukS-PV+LukF-PV(파란색); 컬럼 5, HlgC+HlgB(황색); 컬럼 6, LukAB(주황색).
도 8은 PMN(2 x 106 세포)과 BCL의 동계 S-성분(0.25μg/ml) 및 F-성분(0.25μg/ml)의 혼합물을 공배양시 인간 PMN의 생존율을 보여주는 그림으로, 정제된 항-LukE+LukD-IgG(A), 항-HlgA+HlgB-IgG(B), 항-HlgC+HlgB-IgG(C), 항-LukS+LukF-IgG(D) 및 항-LukAB-IgG(E)의 존재 하에 실험한 결과를 각각 나타낸다. 컬럼 1, 톡신 없음(녹색); 컬럼 2, HlgA+HlgB(갈색); 컬럼 3, LukE+LukD(연두); 컬럼 4, LukS-PV+LukF-PV(파란색); 컬럼 5, HlgC+HlgB(황색); 컬럼 6, LukAB(주황색).
도 9는 PMN(2 x 106 세포)과 BCL의 동계 S-성분(0.25μg/ml) 및 F-성분(0.25μg/ml)의 혼합물을 공배양시 인간 PMN의 생존율을 보여주는 그림으로, 정제된 항-LukS-PV+HlgC-IgG(A), 항-LukS-PV+HlgA-IgG(B), 항-LukS-PV+LukE-IgG(C), 항-HlgA+LukE-IgG(D), 항-HlgA+HlgC-IgG(E) 및 항-HlgC+LukE-IgG(F)의 존재 하에 실험한 결과를 각각 나타낸다. 컬럼 1, 톡신 없음(녹색); 컬럼 2, HlgA+HlgB(갈색); 컬럼 3, LukE+LukD(연두); 컬럼 4, LukS-PV+LukF-PV(파란색); 컬럼 5, HlgC+HlgB(황색); 컬럼 6, LukAB(주황색).
도 10은 PMN(2 x 106 세포)과 BCL의 동계 S-성분(0.25μg/ml) 및 F-성분(0.25μg/ml)의 혼합물을 공배양시 인간 PMN의 생존율을 보여주는 그림으로, 정제된 항-LukF-PV+HlgB-IgG(A), 항-LukD+HlgB-IgG(B), 항-LukF-PV+LukD-IgG(C) 및 항-LukF-PV+LukD+HlgB-IgG(D)의 존재 하에 실험한 결과를 각각 나타낸다. 컬럼 1, 톡신 없음(녹색); 컬럼 2, HlgA+HlgB(갈색); 컬럼 3, LukE+LukD(연두); 컬럼 4, LukS-PV+LukF-PV(파란색); 컬럼 5, HlgC+HlgB(황색); 컬럼 6, LukAB(주황색).
도 11은 PMN(2 x 106 세포)과 BCL의 동계 S-성분(0.25μg/ml) 및 F-성분(0.25μg/ml)의 혼합물을 공배양시 인간 PMN의 생존율을 보여주는 그림으로, 정제된 항-LukS-PV+HlgA+LukABE323A-IgG(A), 항-LukE+LukABE323A-IgG(B) 및 항-LukF-PV+HlgB+LukD+LukABE323A-IgG(C)의 존재 하에 실험한 결과를 각각 나타낸다. 컬럼 1, 톡신 없음(녹색); 컬럼 2, HlgA+HlgB(갈색); 컬럼 3, LukE+LukD(연두); 컬럼 4, LukS-PV+LukF-PV(파란색); 컬럼 5, HlgC+HlgB(황색); 컬럼 6, LukAB(주황색).
도 12는 동계 BCL 및 Hla의 각 시점별 발현패턴을 보여주는 그림이다. 레인 1에서, 정제된 재조합 단일 S-성분(0.2μg) 및 F-성분(0.2μg)의 혼합물을 겔에 로딩하였으며, 0시간(레인 2), 1.5시간(레인 3), 4시간(레인 4), 5시간(레인 6) 및 9시간(레인 6)째에 S. aureus USA300 LAC 세포 배양액으로부터 수득한 배양 배지(단백질량 60μg)를 정제하고 15% SDS-PAGE 겔에 로딩하였다. 이후, 친화도-정제된 항-단일 S- 및 F-성분-IgG의 혼합물(각 6μg)을 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
도 13은 선정된 4개의 IgG가 6개 톡신-매개 인간 PMN 세포용해 활성에 미치는 영향(A), 생존한 PMN 세포 수 계측 결과(B), 6개 톡신-처리된 래빗 RBC의 사진(C) 및 405nm 에서의 이들의 흡광도 측정결과(D)를 각각 보여준다.
도 14는 USA300 배양 배지를 처리한 경우(도 14a) 및 배양 배지와 선정된 4개 톡신 및 톡소이드 IgG를 처리한 경우(도 14b)의 인간 PMN의 생존률을 측정한 결과를 보여주는 그림이다.
도 15는 인간 전혈, PBS, 래빗 혈청 또는 4개의 선정된 톡신 및 톡소이드 IgG와 공배양한 후 S. aureus USA300 LAC 세포의 CFU 측정 결과를 보여주는 그림이다. 컬럼 1은 인간 전혈(2 ml)을 PBS (20μl)와 함께 박테리아(2 x 106 세포)와 3시간 동안 37℃에서 공배양한 결과이며; 컬럼 2는 PBS 대신 래빗 혈청(단백질 40μg)을 첨가하였고; 컬럼 3은 선정된 4개 톡신과 톡소이드 IgG를 첨가한 결과이다.
도 16은 S. aureus CWAP 단백질의 도메인 구조(도 16a), 본 발명에서 클로닝된 CWAPN2N3 도메인(도 16b) 및 정제된 7개 CWAPN2N3 도메인에 대한 SDS-PAGE 분석 결과(도 16c)를 각각 보여주는 그림이다. S. aureus CWAP 단백질의 1차 번역 산물은 N-말단에 신호 서열(S)을 가지면서 3개의 독립적으로 폴딩된 도메인인 N1, N2 및 N3가 존재한다. C말단에는 wall-spanning 영역(W)과 분류 신호(sorting signal, SS)를 가진다.
도 17은 CWAPN2N3면역 도트 블롯 분석결과 및 CWAPN2N3/FH/FI 존재 하에서 C3b의 iC3b로의 전환을 보여주는 그림이다. 도 17a는 7개의 CWAPN2N3 도메인(ClfAN2N3,ClfBN2N3, SdrCN2N3, SdrDN2N3, FnbpAN2N3, FnbpBN2N3) 및 BSA를 PVDF 막의 5개 스트립에 스폿팅한 도트 블롯 면역어세이 결과를 나타낸다. 도 17b는 고정 플레이트에서 인간 FH/FI/CWAPN2N3 도메인을 통해 C3b가 iC3b로 절단됨을 보여주는 그림이다.
도 18은 CWAPN2N3 단백질이 FH를 포집하고 C3에서 iC3b로의 전환을 억제함을 보여주는 그림이다. 도 18a는 5μg의 CWAPN2N3도메인 단백질들과 0.5μg의 FH를 100μl PBS에 부유된 S. aureus USA300 LAC 세포(1 x 105 CFU)에 첨가한 SDS-PAGE 겔 전기영동 결과를 보여주는 그림이다. 도 18b는 10μg의 CWAPN2N3 도메인과 0.1μg의 인간 FH를 S. aureus USA300 LAC 세포(1 x 105 CFU)를 함유하는 100μl의 GVB++에 첨가한 SDS-PAGE 겔 전기영동 결과를 보여주는 그림이다.
도 19는 FH와 S. aureus USA300 생균의 결합이 항-FH-결합 CWAP-Fab′2 절편을 처리함으로써 억제됨을 유세포 분석으로 보여주면서(도 19a), 이러한 억제 효과를 박테리아 표면의 FH 축적량을 통해 정량화한 결과(도 19b)를 나타내는 그림이다. *, p≤0.05; **, p ≤0.01; ***, p≤0.001; NS: 통계적 유의성 없음.
도 20은 7개의 CWAPN2N3도메인(ClFAN2N3, ClfBN2N3, SdrCN2N3, SdrDN2N3, SdrEN2N3, FnbpAN2N3 및 FnbpBN2N3)에 대한 정제된 래빗(도 20a) 및 인간(도 20b) 항-CWAP-IgG의 결합 특이성을 나타낸 웨스턴 블롯 결과를 보여주는 그림이다
도 21은 CWAPN2N3도메인과 정제된 인간 또는 래빗 CWAPN2N3 인식 IgG에 의한 S. aureus 사멸 활성을 보여주는 그림이다. 도 21a는 100μl의 S. aureus USA300 LAC 세포(1 x 105 세포/웰)에 5μg의 각각의 정제된 CWAPN2N3 도메인들을 첨가하고 CFU를 측정한 결과를 나타낸다. 통계적 분석은 독립 스튜던트 t-검정으로 수행하였다. *, p≤0.05; NS: 통계적 유의성 없음. 100μl의 S. aureus USA300 LAC 세포(1 x 105 세포/웰)에 정제된 인간(도 21b) 및 래빗(도 21c) IgG를 첨가하고 CFU를 측정한 결과를 나타낸다. 통계적 분석은 독립 스튜던트 t-검정을 이용하여 수행하였다. *, p≤0.05; **, p ≤0.01; ***, p≤0.001; ***, p≤0.0001; NS:통계적 유의성 없음.
도 22는 본 발명 조성물의 작용 기작에 대한 모식도를 나타낸 그림이다. 대부분의 S. aureus 균주는 표면에서 CWAP를 발현하는데, 박테리아가 숙주에 침입하면, 혈청 보체인 FH가 DLL 메카니즘에 의해 CWAPN2N3 도메인에 결합한다(14, 15). 동시에, 박테리아를 인식하자마자 인간 보체 활성화에 의해 C3b가 표면에 축적될 것이며, 이어서 FH가 FI를 끌어들여 축적된 C3b를 iC3b로 전환함으로써 숙주 호중구에 의한 C3b-매개 옵소닌식세포작용을 감소시킨다(가운데 그림). 항-CWAPN2N3-IgG가 박테리아 표면 단백질과 결합하면, FH는 이들 CWAPN2N3 도메인과 결합할 수 없다. FH가 박테리아로 이동하는 것을 억제함으로써, FI-매개 C3b 비활성화 역시 감소되고, 증가된 양의 C3b가 C3b-매개 옵소닌식세포작용을 더 잘 일으키게 된다(좌측 그림). CWAPN2N3 도메인을 S. aureus 감염 부위에 투여하면, 이들 단백질은 혈청 FH를 포집하고 박테리아 표면에 C3b가 더 잘 축적되도록 하여, C3b-매개 옵소닌식세포작용을 강화한다(우측 그림).
도 23은 클로닝된 S. aureus CWAPN2N3 도메인 유전자를 확인한 결과를 보여주는 그림이다
도 24a는 환원(좌측) 및 비환원(우측) 조건 하에서 정제된 항-FH-IgG 및 항-FH-Fab′2의 SDS-APGE 패턴을 보여주는 그림이다. 레인 1, 고트 항-인간 인자 H IgG; 레인 2, 펩신 처리 고트 항-인간 인자 H IgG; 레인 3, 단백질 A 컬럼의 통과(pass-through) 분획; 레인 4, 단백질 A 컬럼 상의 펩신 처리 고트 항-인간 인자 H의 분획. 도 24b는 6개 단백질에 대한 항-FH-IgG 및 항-FH- F(ab')2 절편의 결합 특이성을 나타내는 그림이다. 도 24c는 5개의 항-CWAP- Fab′2 절편의 7개 상이한 CWAPN2N3 도메인에 대한 결합 특이성을 나타내는 그림이다.
도 25는 4개의 인간(도 25a) 및 래빗(도 25b) 항-CWAP-IgG의 용출 패턴을 보여주는 그림이다.
도 26은 정제된 인간(도 26a) 및 래빗(도 26b) 항-CWAP-IgG의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 그림이다. SH(+) 및 SH(-)는 각각 환원 및 비환원 조건을 나타낸다. 레인 1부터 5에는 ClfA-IgG, SdrC-IgG, SdrE-IgG, FnbpA-IgG 및 FnbpB-IgG가 각각 3μg씩 로딩되었다.
도 27은 S. aureus 코아귤라제(Coa) 및 vWF-결합 도메인 단백질(vWbp)의 도메인 구조를 보여주는 그림으로, 제작된 재조합 Coa(도 27a) 및 vWbp(도 27b)의 모식도를 각각 나타내며, 숫자는 S. aureus USA300 LAC 균주의 지놈 서열에 기반한 아미노산 위치를 나타낸다.
도 28는 정제된 재조합 Coa 및 vWbp 도메인 단백질에 대한 SDS-PAGE 분석(15%) 결과를 보여주는 그림이다. 레인 1, Coawhole; 레인 2, CoaN; 레인 3, CoaC; 레인 4, vWbpwhole; 레인 5, vWbpN; 레인 6, vWbpC .
도 29는 Coa(도 29a) 및 vWbp(도 29b)의 상이한 도메인 단백질에 대한 항체-특이성을 도트 블롯 분석을 통해 조사한 결과를 보여주는 그림이다. 레인 1, BSA(3μg); 레인 2, Coawhole(3μg); 레인 3, CoaN(3μg); 레인 4, CoaC(3μg); 레인 5, BSA(3μg); 레인 6, vWbpwhole(3μg); 레인 7, vWbpN(3μg); 레인 8, vWbpC(3μg).
도 30은 S. aureus USA300 배양 동안 Coa(도 30a) 및 vWbp(도 30b) 단백질의 발현 패턴을 각각 나타낸 그림으로, 항-Coawhole-IgG(도 30a) 및 항-vWbpwhole-IgG(도 30b)를 각각 이용한 웨스턴 블롯 분석결과이다. 좌측의 겔은 정제된 Coawhole 및 vWbpwhole의 SDS-PAGE 패턴이다.
도 31은 S. aureus 세포 표면에서 발현되는 Coa(도 31a) 및 vWbp(도 31b)-인식 단백질을 도트 블롯 분석을 통해 동정한 결과를 보여주는 그림이다. 세포벽-관련 단백질(CWAP)의 7개의 N2-N3 도메인(3μg)을 7개 PVDF 막 스트립에 스폿팅하였다. 레인 1, BSA; 레인 2. ClfAN2N3 ; 레인 3, ClfBN2N3; 레인 4, SdrCN2N3; 레인 5, SdrDN2N3; 레인 6, SdrEN2N3; 레인 7, FnbpAN2N ; 레인 8, FnbpBN2N
도 32는 항-Fnbp-F(ab')2 절편을′ 이용하여 Coa 및 Fnbp 단백질 간의 결합 특이성을 확인한 결과를 보여주는 그림이다. S. aureus USA300 LAC 세포(1 x 105 세포)를 CoaC와 함께 1시간 동안 배양하고 박테리아 펠렛을 수득하여 Coa 단백질이 박테리아 표면으로 이동하였음을 확인하였다(레인 1). 대조군으로 박테리아를 CoaC 및 항-SdrC-F(ab')2 절편과 함께 배양해도, CoaC는 박테리아 표면으로 이동하였다(레인 2). 그러나, 박테리아를 CoaC 및 항-FnBp-F(ab')2 절편과 함께 배양할 경우, 첨가된 CoaC의 양은 박테리아 표면에서 크게 감소하였다(레인 3 및 4). 이를 통해 FnBp는 분비되는 CoaC와 선택적인 결합 능력이 있음을 알 수 있다.
도 33은 다양한 용량의 정제된 Coawhole 또는 vWbpwhole에 의한 혈액 응고 유도(도 33a) 및 다양한 용량의 항-Coawhole-IgG 및 vWbpwhole-IgGs에 의한 혈액 응고 억제 효과(도 33b)를 각각 보여주는 그림이다.
도 34는 분비된 Coa 및 vWbp-매개 혈액 응고가 항-Coawhole IgG 또는 항-vWbpwhole IgG에 의해 억제됨을 보여주는 그림이다. 튜브 1, RPMI(100μl) + 인간 혈액(200μl)를 1.5시간 배양; 튜브 2, 1μg의 Coawhole를 혈액(200μl)과 함께 1.5시간 배양. 튜브 3, 5μg의 vWbp를 200μl 혈액에 첨가; 튜브 5, USA300 배양 배지(100μl) + 혈액; 튜브 6, 항-Coawhole IgG (80μg)를 USA300 배양 배지(100μl) + 혈액에 첨가; 튜브 7, 항-vWbpwhole IgG (80μg) + 배양 배지 및 혈액; 튜브 8, USA300 배양 배지(100μl) + 항-코아귤라제whole IgG(40μg) 및 항-vWbpwhole IgG(40μg) ; 튜브 9, USA300 배양 배지(100μl) + 항-Coawhole IgG(80μg) + 항-vWbpwhole IgG (80μg)+ 혈액.
도 35는 CoaN 및 vWbpN 만이 인간 혈액 응고를 유도하고, CoaC 및 vWbpC는 그렇지 않음을 보여주는 그림이다. 튜브 1, 혈액 200μl + RPMI 배지(100μl)를 상온에서 1.5시간 배양; 튜브 2, USA300 배양 배지(100μl) + 인간 혈액; 튜브 3, 혈액 + vWbpN (5μg); 튜브 4, 혈액 + vWbpC(5μg); 튜브 5, 혈액 + CoaN (1μg); 튜브 6, 혈액 + CoaC (1μg)
도 36은 USA300 균 배양액속에 포함된 Coa 또는 vWbp에 의한 혈액 응고(도 36a)와, CoaN 및 vWbpN-매개 응고(도 36b)가 항-CoaN-IgG 및 항-vWbpN-IgG에 의해 억제되지만, 항-CoaC 및 항-vWbpC IgG에 의해 억제되지 않음을 보여주는 그림이다. 도 36a의 튜브 1, 혈액 200μl + RPMI 배지(100μl)를 상온에서 2.5시간 배양; 튜브 2, 혈액 + 배양 배지(100μl); 튜브 3, 혈액 + 배양 배지 + CoaN-Ab (60μg); 튜브 4, 혈액 + 배양 배지 + vWbpN-Ab (60μg); 튜브 5, 혈액 + 배양 배지 + CoaC-Ab; 튜브 6, 혈액 + 배양 배지 + vWbpC-Ab(60μg); 도 36b의 튜브 1, 혈액(200μl) + RPMT(100μl); 튜브 2, 혈액 + CoaN (5μg); 튜브 3, 혈액 + vWbpN(5μg); 튜브 4, 혈액 + CoaN(5μg) + 항-CoaN-Ab (80μg); 튜브 5, 혈액 + vWbpN (5μg) + 항-vWbpN-Ab(80μg).
도 37은 항-Coawhole-IgG 및 vWbpwhole-IgG의 혈액응고 효과를 인 비보 상에서 확인하기 위한 토끼 접종 실험의 모식도이다.
도 38은 PBS 투여 대조군과 항-Coawhole-IgG 및 vWbpwhole-IgG 투여군에 속하는 각 토끼의 최대 167시간 동안의 체중 변화를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 39는 PBS 투여 대조군과 항-Coawhole-IgG 및 vWbpwhole-IgG 투여군의 생존률을 시간별(도 39a) 및 일별(도 39b)로 계산한 결과를 보여주는 그림이다.
도 2는 본 발명에서 구축된 재조합 야생형 S. aureus 및 톡소이드 BCL 톡신의 모식도이다.
도 3은 재조합 BCL, 톡소이드, 톡신의 정제 결과 및 이들의 세포용매 및 용혈활성 측정 결과는 보여주는 그림이다. 도 3a는 각 단백질 5μg을 환원 조건 하에서 15% SDS-PAGE에 로딩한 결과이다. 도 3b는 톡소이드 단백질 5μg의 SDS-PAGE 패턴을 보여준다. 도 3c는 인간 PMN(2 x 106 세포)를 0.125μg의 정제된 BCL 및 톡소이드와 1시간 동안 공배양한 결과를 보여준다. 컬럼 1, 톡신 없음; 2, LukST244A-PV+LukF-PV; 3, LukAE323AB; 4, LukS-PV+LukF-PV; 5, LukE+LukD; 6, HlgC+HlgB; 7, HlgA+HlgB; 8, LukAB. 도 3d는 2% 래빗 RBC를 HlaWT (0.25μg) 및 HlaH35L (0.25μg) 톡소이드와 37℃에서 1시간 동안 공배양한 결과를 보여준다. 컬럼: 1, PBS; 2, HlaWT; 3, HlaH35L
도 4는 BCL-면역화된 래빗 혈청에서 정제된 래빗 항-BCL 인식 IgG의 용출 패턴을 보여주는 그림이다. 먼저 래빗 혈청(120mg)을 단백질-A 세파로스 컬럼(Sigma-Aldrich)에 로딩하고 결합된 총 IgG를 0.15M 글리신 완충액(pH 2.2)으로 용출하였다(데이터 미기재). 농축 후, 수집한 IgG를 각 톡신 및 톡소이드-접합 세파로스 컬럼에 로딩하고 0.15 M 글리신 용액(pH 2.2)으로 용출하였다.
도 5는 도트 블롯 면역어세이 상에서 항-BCL IgG가 래빗 단일 BCL를 인식하는 패턴을 보여주는 그림이다. 각 정제된 단일 BCL 성분(1μg)을 PVDF 스트립에 찍어주고 각 동계 항-BCL-IgG와 함께 1시간 동안 상온에서 배양하였다. 세척 후, 각 스트립은 HRP-접합 고트 항-래빗-IgG와 함께 배양하였다.
도 6은 PMN(2 x 106 세포)과 BCL의 동계 S-성분(0.25μg/ml) 및 F-성분(0.25μg/ml)의 혼합물을 공배양시 인간 PMN의 생존율을 보여주는 그림으로, 정제된 항-LukS-PV-IgG(A), 항-HlgA-IgG(B), 항-HlgC-IgG(C) 및 항-LukE-IgG(D)의 존재 하에 실험한 결과를 각각 나타낸다. 컬럼 1, 톡신 없음(녹색); 컬럼 2, HlgA+HlgB(갈색); 컬럼 3, LukE+LukD(연두); 컬럼 4, LukS-PV+LukF-PV(파란색); 컬럼 5, HlgC+HlgB(황색); 컬럼 6, LukAB(주황색).
도 7은 PMN(2 x 106 세포)과 BCL의 동계(cognate) S-성분(0.25μg/ml) 및 F-성분(0.25μg/ml)의 혼합물을 공배양시 인간 PMN의 생존율을 보여주는 그림으로, 정제된 항-LukF-PV-IgG(A), 항-HlgB-IgG(B) 및 항-LukD-IgG(C)의 존재 하에 실험한 결과를 각각 나타낸다. 컬럼 1, 톡신 없음(녹색); 컬럼 2, HlgA+HlgB(갈색); 컬럼 3, LukE+LukD(연두); 컬럼 4, LukS-PV+LukF-PV(파란색); 컬럼 5, HlgC+HlgB(황색); 컬럼 6, LukAB(주황색).
도 8은 PMN(2 x 106 세포)과 BCL의 동계 S-성분(0.25μg/ml) 및 F-성분(0.25μg/ml)의 혼합물을 공배양시 인간 PMN의 생존율을 보여주는 그림으로, 정제된 항-LukE+LukD-IgG(A), 항-HlgA+HlgB-IgG(B), 항-HlgC+HlgB-IgG(C), 항-LukS+LukF-IgG(D) 및 항-LukAB-IgG(E)의 존재 하에 실험한 결과를 각각 나타낸다. 컬럼 1, 톡신 없음(녹색); 컬럼 2, HlgA+HlgB(갈색); 컬럼 3, LukE+LukD(연두); 컬럼 4, LukS-PV+LukF-PV(파란색); 컬럼 5, HlgC+HlgB(황색); 컬럼 6, LukAB(주황색).
도 9는 PMN(2 x 106 세포)과 BCL의 동계 S-성분(0.25μg/ml) 및 F-성분(0.25μg/ml)의 혼합물을 공배양시 인간 PMN의 생존율을 보여주는 그림으로, 정제된 항-LukS-PV+HlgC-IgG(A), 항-LukS-PV+HlgA-IgG(B), 항-LukS-PV+LukE-IgG(C), 항-HlgA+LukE-IgG(D), 항-HlgA+HlgC-IgG(E) 및 항-HlgC+LukE-IgG(F)의 존재 하에 실험한 결과를 각각 나타낸다. 컬럼 1, 톡신 없음(녹색); 컬럼 2, HlgA+HlgB(갈색); 컬럼 3, LukE+LukD(연두); 컬럼 4, LukS-PV+LukF-PV(파란색); 컬럼 5, HlgC+HlgB(황색); 컬럼 6, LukAB(주황색).
도 10은 PMN(2 x 106 세포)과 BCL의 동계 S-성분(0.25μg/ml) 및 F-성분(0.25μg/ml)의 혼합물을 공배양시 인간 PMN의 생존율을 보여주는 그림으로, 정제된 항-LukF-PV+HlgB-IgG(A), 항-LukD+HlgB-IgG(B), 항-LukF-PV+LukD-IgG(C) 및 항-LukF-PV+LukD+HlgB-IgG(D)의 존재 하에 실험한 결과를 각각 나타낸다. 컬럼 1, 톡신 없음(녹색); 컬럼 2, HlgA+HlgB(갈색); 컬럼 3, LukE+LukD(연두); 컬럼 4, LukS-PV+LukF-PV(파란색); 컬럼 5, HlgC+HlgB(황색); 컬럼 6, LukAB(주황색).
도 11은 PMN(2 x 106 세포)과 BCL의 동계 S-성분(0.25μg/ml) 및 F-성분(0.25μg/ml)의 혼합물을 공배양시 인간 PMN의 생존율을 보여주는 그림으로, 정제된 항-LukS-PV+HlgA+LukABE323A-IgG(A), 항-LukE+LukABE323A-IgG(B) 및 항-LukF-PV+HlgB+LukD+LukABE323A-IgG(C)의 존재 하에 실험한 결과를 각각 나타낸다. 컬럼 1, 톡신 없음(녹색); 컬럼 2, HlgA+HlgB(갈색); 컬럼 3, LukE+LukD(연두); 컬럼 4, LukS-PV+LukF-PV(파란색); 컬럼 5, HlgC+HlgB(황색); 컬럼 6, LukAB(주황색).
도 12는 동계 BCL 및 Hla의 각 시점별 발현패턴을 보여주는 그림이다. 레인 1에서, 정제된 재조합 단일 S-성분(0.2μg) 및 F-성분(0.2μg)의 혼합물을 겔에 로딩하였으며, 0시간(레인 2), 1.5시간(레인 3), 4시간(레인 4), 5시간(레인 6) 및 9시간(레인 6)째에 S. aureus USA300 LAC 세포 배양액으로부터 수득한 배양 배지(단백질량 60μg)를 정제하고 15% SDS-PAGE 겔에 로딩하였다. 이후, 친화도-정제된 항-단일 S- 및 F-성분-IgG의 혼합물(각 6μg)을 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
도 13은 선정된 4개의 IgG가 6개 톡신-매개 인간 PMN 세포용해 활성에 미치는 영향(A), 생존한 PMN 세포 수 계측 결과(B), 6개 톡신-처리된 래빗 RBC의 사진(C) 및 405nm 에서의 이들의 흡광도 측정결과(D)를 각각 보여준다.
도 14는 USA300 배양 배지를 처리한 경우(도 14a) 및 배양 배지와 선정된 4개 톡신 및 톡소이드 IgG를 처리한 경우(도 14b)의 인간 PMN의 생존률을 측정한 결과를 보여주는 그림이다.
도 15는 인간 전혈, PBS, 래빗 혈청 또는 4개의 선정된 톡신 및 톡소이드 IgG와 공배양한 후 S. aureus USA300 LAC 세포의 CFU 측정 결과를 보여주는 그림이다. 컬럼 1은 인간 전혈(2 ml)을 PBS (20μl)와 함께 박테리아(2 x 106 세포)와 3시간 동안 37℃에서 공배양한 결과이며; 컬럼 2는 PBS 대신 래빗 혈청(단백질 40μg)을 첨가하였고; 컬럼 3은 선정된 4개 톡신과 톡소이드 IgG를 첨가한 결과이다.
도 16은 S. aureus CWAP 단백질의 도메인 구조(도 16a), 본 발명에서 클로닝된 CWAPN2N3 도메인(도 16b) 및 정제된 7개 CWAPN2N3 도메인에 대한 SDS-PAGE 분석 결과(도 16c)를 각각 보여주는 그림이다. S. aureus CWAP 단백질의 1차 번역 산물은 N-말단에 신호 서열(S)을 가지면서 3개의 독립적으로 폴딩된 도메인인 N1, N2 및 N3가 존재한다. C말단에는 wall-spanning 영역(W)과 분류 신호(sorting signal, SS)를 가진다.
도 17은 CWAPN2N3면역 도트 블롯 분석결과 및 CWAPN2N3/FH/FI 존재 하에서 C3b의 iC3b로의 전환을 보여주는 그림이다. 도 17a는 7개의 CWAPN2N3 도메인(ClfAN2N3,ClfBN2N3, SdrCN2N3, SdrDN2N3, FnbpAN2N3, FnbpBN2N3) 및 BSA를 PVDF 막의 5개 스트립에 스폿팅한 도트 블롯 면역어세이 결과를 나타낸다. 도 17b는 고정 플레이트에서 인간 FH/FI/CWAPN2N3 도메인을 통해 C3b가 iC3b로 절단됨을 보여주는 그림이다.
도 18은 CWAPN2N3 단백질이 FH를 포집하고 C3에서 iC3b로의 전환을 억제함을 보여주는 그림이다. 도 18a는 5μg의 CWAPN2N3도메인 단백질들과 0.5μg의 FH를 100μl PBS에 부유된 S. aureus USA300 LAC 세포(1 x 105 CFU)에 첨가한 SDS-PAGE 겔 전기영동 결과를 보여주는 그림이다. 도 18b는 10μg의 CWAPN2N3 도메인과 0.1μg의 인간 FH를 S. aureus USA300 LAC 세포(1 x 105 CFU)를 함유하는 100μl의 GVB++에 첨가한 SDS-PAGE 겔 전기영동 결과를 보여주는 그림이다.
도 19는 FH와 S. aureus USA300 생균의 결합이 항-FH-결합 CWAP-Fab′2 절편을 처리함으로써 억제됨을 유세포 분석으로 보여주면서(도 19a), 이러한 억제 효과를 박테리아 표면의 FH 축적량을 통해 정량화한 결과(도 19b)를 나타내는 그림이다. *, p≤0.05; **, p ≤0.01; ***, p≤0.001; NS: 통계적 유의성 없음.
도 20은 7개의 CWAPN2N3도메인(ClFAN2N3, ClfBN2N3, SdrCN2N3, SdrDN2N3, SdrEN2N3, FnbpAN2N3 및 FnbpBN2N3)에 대한 정제된 래빗(도 20a) 및 인간(도 20b) 항-CWAP-IgG의 결합 특이성을 나타낸 웨스턴 블롯 결과를 보여주는 그림이다
도 21은 CWAPN2N3도메인과 정제된 인간 또는 래빗 CWAPN2N3 인식 IgG에 의한 S. aureus 사멸 활성을 보여주는 그림이다. 도 21a는 100μl의 S. aureus USA300 LAC 세포(1 x 105 세포/웰)에 5μg의 각각의 정제된 CWAPN2N3 도메인들을 첨가하고 CFU를 측정한 결과를 나타낸다. 통계적 분석은 독립 스튜던트 t-검정으로 수행하였다. *, p≤0.05; NS: 통계적 유의성 없음. 100μl의 S. aureus USA300 LAC 세포(1 x 105 세포/웰)에 정제된 인간(도 21b) 및 래빗(도 21c) IgG를 첨가하고 CFU를 측정한 결과를 나타낸다. 통계적 분석은 독립 스튜던트 t-검정을 이용하여 수행하였다. *, p≤0.05; **, p ≤0.01; ***, p≤0.001; ***, p≤0.0001; NS:통계적 유의성 없음.
도 22는 본 발명 조성물의 작용 기작에 대한 모식도를 나타낸 그림이다. 대부분의 S. aureus 균주는 표면에서 CWAP를 발현하는데, 박테리아가 숙주에 침입하면, 혈청 보체인 FH가 DLL 메카니즘에 의해 CWAPN2N3 도메인에 결합한다(14, 15). 동시에, 박테리아를 인식하자마자 인간 보체 활성화에 의해 C3b가 표면에 축적될 것이며, 이어서 FH가 FI를 끌어들여 축적된 C3b를 iC3b로 전환함으로써 숙주 호중구에 의한 C3b-매개 옵소닌식세포작용을 감소시킨다(가운데 그림). 항-CWAPN2N3-IgG가 박테리아 표면 단백질과 결합하면, FH는 이들 CWAPN2N3 도메인과 결합할 수 없다. FH가 박테리아로 이동하는 것을 억제함으로써, FI-매개 C3b 비활성화 역시 감소되고, 증가된 양의 C3b가 C3b-매개 옵소닌식세포작용을 더 잘 일으키게 된다(좌측 그림). CWAPN2N3 도메인을 S. aureus 감염 부위에 투여하면, 이들 단백질은 혈청 FH를 포집하고 박테리아 표면에 C3b가 더 잘 축적되도록 하여, C3b-매개 옵소닌식세포작용을 강화한다(우측 그림).
도 23은 클로닝된 S. aureus CWAPN2N3 도메인 유전자를 확인한 결과를 보여주는 그림이다
도 24a는 환원(좌측) 및 비환원(우측) 조건 하에서 정제된 항-FH-IgG 및 항-FH-Fab′2의 SDS-APGE 패턴을 보여주는 그림이다. 레인 1, 고트 항-인간 인자 H IgG; 레인 2, 펩신 처리 고트 항-인간 인자 H IgG; 레인 3, 단백질 A 컬럼의 통과(pass-through) 분획; 레인 4, 단백질 A 컬럼 상의 펩신 처리 고트 항-인간 인자 H의 분획. 도 24b는 6개 단백질에 대한 항-FH-IgG 및 항-FH- F(ab')2 절편의 결합 특이성을 나타내는 그림이다. 도 24c는 5개의 항-CWAP- Fab′2 절편의 7개 상이한 CWAPN2N3 도메인에 대한 결합 특이성을 나타내는 그림이다.
도 25는 4개의 인간(도 25a) 및 래빗(도 25b) 항-CWAP-IgG의 용출 패턴을 보여주는 그림이다.
도 26은 정제된 인간(도 26a) 및 래빗(도 26b) 항-CWAP-IgG의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 그림이다. SH(+) 및 SH(-)는 각각 환원 및 비환원 조건을 나타낸다. 레인 1부터 5에는 ClfA-IgG, SdrC-IgG, SdrE-IgG, FnbpA-IgG 및 FnbpB-IgG가 각각 3μg씩 로딩되었다.
도 27은 S. aureus 코아귤라제(Coa) 및 vWF-결합 도메인 단백질(vWbp)의 도메인 구조를 보여주는 그림으로, 제작된 재조합 Coa(도 27a) 및 vWbp(도 27b)의 모식도를 각각 나타내며, 숫자는 S. aureus USA300 LAC 균주의 지놈 서열에 기반한 아미노산 위치를 나타낸다.
도 28는 정제된 재조합 Coa 및 vWbp 도메인 단백질에 대한 SDS-PAGE 분석(15%) 결과를 보여주는 그림이다. 레인 1, Coawhole; 레인 2, CoaN; 레인 3, CoaC; 레인 4, vWbpwhole; 레인 5, vWbpN; 레인 6, vWbpC .
도 29는 Coa(도 29a) 및 vWbp(도 29b)의 상이한 도메인 단백질에 대한 항체-특이성을 도트 블롯 분석을 통해 조사한 결과를 보여주는 그림이다. 레인 1, BSA(3μg); 레인 2, Coawhole(3μg); 레인 3, CoaN(3μg); 레인 4, CoaC(3μg); 레인 5, BSA(3μg); 레인 6, vWbpwhole(3μg); 레인 7, vWbpN(3μg); 레인 8, vWbpC(3μg).
도 30은 S. aureus USA300 배양 동안 Coa(도 30a) 및 vWbp(도 30b) 단백질의 발현 패턴을 각각 나타낸 그림으로, 항-Coawhole-IgG(도 30a) 및 항-vWbpwhole-IgG(도 30b)를 각각 이용한 웨스턴 블롯 분석결과이다. 좌측의 겔은 정제된 Coawhole 및 vWbpwhole의 SDS-PAGE 패턴이다.
도 31은 S. aureus 세포 표면에서 발현되는 Coa(도 31a) 및 vWbp(도 31b)-인식 단백질을 도트 블롯 분석을 통해 동정한 결과를 보여주는 그림이다. 세포벽-관련 단백질(CWAP)의 7개의 N2-N3 도메인(3μg)을 7개 PVDF 막 스트립에 스폿팅하였다. 레인 1, BSA; 레인 2. ClfAN2N3 ; 레인 3, ClfBN2N3; 레인 4, SdrCN2N3; 레인 5, SdrDN2N3; 레인 6, SdrEN2N3; 레인 7, FnbpAN2N ; 레인 8, FnbpBN2N
도 32는 항-Fnbp-F(ab')2 절편을′ 이용하여 Coa 및 Fnbp 단백질 간의 결합 특이성을 확인한 결과를 보여주는 그림이다. S. aureus USA300 LAC 세포(1 x 105 세포)를 CoaC와 함께 1시간 동안 배양하고 박테리아 펠렛을 수득하여 Coa 단백질이 박테리아 표면으로 이동하였음을 확인하였다(레인 1). 대조군으로 박테리아를 CoaC 및 항-SdrC-F(ab')2 절편과 함께 배양해도, CoaC는 박테리아 표면으로 이동하였다(레인 2). 그러나, 박테리아를 CoaC 및 항-FnBp-F(ab')2 절편과 함께 배양할 경우, 첨가된 CoaC의 양은 박테리아 표면에서 크게 감소하였다(레인 3 및 4). 이를 통해 FnBp는 분비되는 CoaC와 선택적인 결합 능력이 있음을 알 수 있다.
도 33은 다양한 용량의 정제된 Coawhole 또는 vWbpwhole에 의한 혈액 응고 유도(도 33a) 및 다양한 용량의 항-Coawhole-IgG 및 vWbpwhole-IgGs에 의한 혈액 응고 억제 효과(도 33b)를 각각 보여주는 그림이다.
도 34는 분비된 Coa 및 vWbp-매개 혈액 응고가 항-Coawhole IgG 또는 항-vWbpwhole IgG에 의해 억제됨을 보여주는 그림이다. 튜브 1, RPMI(100μl) + 인간 혈액(200μl)를 1.5시간 배양; 튜브 2, 1μg의 Coawhole를 혈액(200μl)과 함께 1.5시간 배양. 튜브 3, 5μg의 vWbp를 200μl 혈액에 첨가; 튜브 5, USA300 배양 배지(100μl) + 혈액; 튜브 6, 항-Coawhole IgG (80μg)를 USA300 배양 배지(100μl) + 혈액에 첨가; 튜브 7, 항-vWbpwhole IgG (80μg) + 배양 배지 및 혈액; 튜브 8, USA300 배양 배지(100μl) + 항-코아귤라제whole IgG(40μg) 및 항-vWbpwhole IgG(40μg) ; 튜브 9, USA300 배양 배지(100μl) + 항-Coawhole IgG(80μg) + 항-vWbpwhole IgG (80μg)+ 혈액.
도 35는 CoaN 및 vWbpN 만이 인간 혈액 응고를 유도하고, CoaC 및 vWbpC는 그렇지 않음을 보여주는 그림이다. 튜브 1, 혈액 200μl + RPMI 배지(100μl)를 상온에서 1.5시간 배양; 튜브 2, USA300 배양 배지(100μl) + 인간 혈액; 튜브 3, 혈액 + vWbpN (5μg); 튜브 4, 혈액 + vWbpC(5μg); 튜브 5, 혈액 + CoaN (1μg); 튜브 6, 혈액 + CoaC (1μg)
도 36은 USA300 균 배양액속에 포함된 Coa 또는 vWbp에 의한 혈액 응고(도 36a)와, CoaN 및 vWbpN-매개 응고(도 36b)가 항-CoaN-IgG 및 항-vWbpN-IgG에 의해 억제되지만, 항-CoaC 및 항-vWbpC IgG에 의해 억제되지 않음을 보여주는 그림이다. 도 36a의 튜브 1, 혈액 200μl + RPMI 배지(100μl)를 상온에서 2.5시간 배양; 튜브 2, 혈액 + 배양 배지(100μl); 튜브 3, 혈액 + 배양 배지 + CoaN-Ab (60μg); 튜브 4, 혈액 + 배양 배지 + vWbpN-Ab (60μg); 튜브 5, 혈액 + 배양 배지 + CoaC-Ab; 튜브 6, 혈액 + 배양 배지 + vWbpC-Ab(60μg); 도 36b의 튜브 1, 혈액(200μl) + RPMT(100μl); 튜브 2, 혈액 + CoaN (5μg); 튜브 3, 혈액 + vWbpN(5μg); 튜브 4, 혈액 + CoaN(5μg) + 항-CoaN-Ab (80μg); 튜브 5, 혈액 + vWbpN (5μg) + 항-vWbpN-Ab(80μg).
도 37은 항-Coawhole-IgG 및 vWbpwhole-IgG의 혈액응고 효과를 인 비보 상에서 확인하기 위한 토끼 접종 실험의 모식도이다.
도 38은 PBS 투여 대조군과 항-Coawhole-IgG 및 vWbpwhole-IgG 투여군에 속하는 각 토끼의 최대 167시간 동안의 체중 변화를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 39는 PBS 투여 대조군과 항-Coawhole-IgG 및 vWbpwhole-IgG 투여군의 생존률을 시간별(도 39a) 및 일별(도 39b)로 계산한 결과를 보여주는 그림이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 포도상구균 톡신의 선정
실험방법
실험윤리
인간 혈액은 4명의 건강한 지원자로부터 수득하였으며, 부산대학교 IRB의 승인 하에 모든 실험이 이루어졌다(PNU IRB/2019_59_BR). 모든 연구 참가자들에게 서면 동의서를 수령하였다.
박테리아
S. aureus USA300 LAC 균주는 TSB(tryptic soy broth)에서 중간-지수기(mid-logarithmic phase)(OD600 0.8-1.5)까지 37℃에서 교반하면서 배양하였다. E. coli DH5α 균주는 37℃에서 교반하면서 10μg/ml 카나마이신(Km)이 보충된 LB(Luria Broth)에서 배양하였다.
재조합 BCL 톡신의 정제 및 톡소이드 생산
폴리히스티딘-태깅된 재조합 톡신을 클로닝하여 E. coli 발현 시스템을 통해 발현시켰다. USA300 지놈 서열로부터 타겟 유전자인 LukS-PV, LukF-PV, LukE, LukD, HlgA, HlgB, HlgC, LukAB, Hla, HlaH35L, LukST244A-PV, LukAE323AB를 Q5 High Fidelity DNA 중합효소(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 PCR로 증폭하였다. PCR 산물을 pET28a-벡터에 클로닝하여 N-말단 또는 C-말단에 6 x His-태깅된 단백질을 수득하였다. LukAB 및 LukAE323AB를 정제하기 위해, 6 x His-태그를 N- 및 C-말단 양쪽에 삽입하고, 수득된 클론을 시퀀싱하여 구조를 확인하였다. 재조합 단백질들은 0.2mM 이소프로필-lβ-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG, 0.2mM 농도)를 이용하여 BL21 pLysS E.coli에서 발현되었다. 발현된 단백질은 Ni-세파로스 6 고유속 레진(GE healthcare, 17-5318-01, 5ml)과 로딩 완충액(20mM 인산나트륨, 0.1% triton X-100, 150mM NaCl, 5mM 이미다졸, pH7.4), 세척 완충액(20mM 인산나트륨, 150mM NaCl, 5mM 이미다졸, pH7.4) 및 용출 완충액(20mM 인산나트륨, 150mM NaCl, 500mM 이미다졸, pH7.4)을 이용하여 정제하였다.
| C-말단 His tag | |
| Vector-pET28a-F | CATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC |
| Vector-pET28a-R | CACCACCACCACCACCACTGAGATC |
| pET28a-6 His-LukS-R | GTGGTGGTGGTGGTGATTATGTCCTTTCACTTTAATTTCATGAGTTTTC |
| pET28a-6 His-LukS-F | CTTTAAGAAGGAGATATACCATG GATAACAATATTGAGAATATTGGTGATGGCG |
| pET28a-6 His-LukST244A-R | CATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC |
| pET28a-6 His-LukST244A-F | CTATTGCCATAGTGTGCTGTTCTTCTAGTAGCATGAG |
| pET28a-6 His-LukF-R | GTGGTGGTGGTGGTG GCTCATAGGATTTTTTTCCTTAGATTGAG |
| pET28a-6 His- LukF-F | CTTTAAGAAGGAGATATACCATG GCTCAACATATCACACCTGTAAGTGAG |
| pET28a-6 His-HlgA-R | GTGGTGGTGGTGGTGCTTAGGTGTGATGCTTTTAATTTTTACTTC |
| pET28a-6 His-HlgA-F | CTTTAAGAAGGAGATATACCATG GAAAATAAGATAGAAGATATCGGCCAAGGTGC |
| pET28a-6 His-HlgC-R | GTGGTGGTGGTGGTG ATTCTGTCCTTTCACCTTGATTTCATG |
| pET28a-6 His-HlgC-F | CTTTAAGAAGGAGATATACCATG CTAACGATACTGAAGACATCGGTAAAGG |
| pET28a-6 His-LukE-R | GTGGTGGTGGTGGTGTTATGTCCTTTCACTTTAATTTCGTGTGTTTTC |
| pET28a-6 His-LukE-F | CTTTAAGAAGGAGATATACCATG AATACTAATATTGAAAATATTGGTGATGGTGCTG |
| pET28a-6 His-LukD-R | GTGGTGGTGGTGGTG TACTCCAGGATTAGTTTCTTTAGAATCCG |
| pET28a-6 His-LukD-F | CTTTAAGAAGGAGATATACCATG GCTCAACATATCACACCTGTAAGCG |
| pET28a-6 His-Hla-R | CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGATTTGTCATTTCTTCTTTTTCCCAAT |
| pET28a-6 His-Hla-F | AAGAAGGAGATATACCATGGCAGATTCTGATATTAATATTAAAACCGG |
| pET28a-6 His-HlaH35L-R | GAAGAACGATCTATCCATTTATCTTTAGTATTGGTAC |
| pET28a-6 His-HlaH35L-F | GATAAAGAAAATGGCATGCTCAAAAAAGTATTTTATAGTTTTATCG |
| N-말단 His tag | |
| Vector-pET28a-R | GTGATGATGATGATGATGGCTG |
| Vector-pET28a-F | CACCACCACCACCACCACTGAGATC |
| pET28a-6 His-hlgB-R | TTGTTAGCAGCCGGATCTCATTTATTGTTTTCAGTTTCTTTTGTATCTAACAAT |
| pET28a-6 His-hlgB-F | ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACGAAGGTAAAATAACACC |
| N-말단 및 C-말단 His tag | |
| pET28a-6His-LukA-R | ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAATTCAGCTCATAAAGACTCTCAAGAC |
| pET28a-6His-LukA-F | TAGTAATCCGCCCTTTCAATATTATCCTTCTTTATAAGGTTTATTGTCATCAG |
| pET28a-6 His-LukB-R | CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTATTTCTTTTCATTATCATTAAGTACTTTTACAAA |
| pET28a-6 His-LukB-F | TATTGAAAGGGCGGATTACTAATGAAGATTAATTCTGAAATCAAACAAGTTTC |
| pET28a-6 His-LukAE323A-F | TAGTAATCCGCCCTTTCAATATTATCCTGCTTTATAAGGTTTATTGTCATCAG |
| pET28a-6 His-LukAE323A-R | ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAATTCAGCTCATAAAGACTCTCAAGAC |
톡신 항체 수득을 위한 래빗의 면역화
500μl PBS에 용해된 6개 S. aureus 톡신 및 이들의 톡소이드 단백질의 정제된 단일 성분 500μg을 프로인트 완전 어쥬번트(Sigma-Aldrich) 500μl와 혼합하여 에멀젼을 제조하였다. 래빗에 각 에멀젼을 피하주사 후 2주 뒤 동량의 항원을 500μl의 프로인트 불완전 어쥬번트(Sigma-Aldrich)와 혼합하여 피하주사하였다. 2주 뒤 래빗 귀정맥에서 채취한 혈액 500μl로부터 각 항원의 IgG 형성 여부를 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. 항체가 형성된 경우, 래빗 전혈을 채취하여 혈청을 수득하고 이를 사용 전까지 -80℃에 보관하였다.
CNBr-활성화된 세파로스 비드에 정제된 단백질의 커플링
재조합 단일 성분 톡신과 CNBr-활성화된 세파로스 비드 간의 커플링을 제조자의 설명서(GE HealthCare)에 따라 수행하였다. 요약하면, CNBr-활성화된 세파로스 비드 1g을 커플링 완충액(3 ml/1회, 0.1 M NaHCO3, pH8.5)으로 3회 세척하였다. 1ml의 커플링 완충액에 용해된 재조합 단백질 5mg을 CNBr-활성화된 비드에 첨가하고 4ml의 커플링 완충액에 부유시켰다. 상온에서 2시간 동안 배양한 뒤, 비드를 커플링 완충액으로 3회 세척하였다. 이후, 비드를 1M 에메탄올아민(pH 8.0) 4ml와 함께 상온에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 후, 비드를 280nm에서 UV 흡광도가 나타나지 않을 때까지 0.1M 인산나트륨(pH7.4)으로 세척하고 사용 전까지 4℃에 보관하였다.
래빗 혈청 유래 IgG를 인식하는 래빗 항-단일 성분의 정제
항원-커플링된 세파로스 컬럼을 세척 완충액(0.1 M NaCl 함유 0.1 M 인산나트륨, pH 7.4)으로 평형화한 다음, 항원-면역화된 래빗 혈청(1 ml, 단백질 60 mg)을 컬럼에 로딩하고 컬럼을 세척 완충액으로 강하게 세척한 뒤 결합된 IgG를 용출 완충액(0.15 M 글리신/HCl, pH 2.2)으로 용출하였다. 수집된 IgG를 중화 완충액(1 M Tris/HCl buffer, pH 9.0)으로 중화시킨 다음 완충액을 PBS로 교체하고, 수집된 IgG를 환원 및 비-환원 조건 하에서 SDS-PAGE로 분석하였다.
도트 블롯 면역어세이
PVDF-막 스트립(Immobilon P, 포어 크기 0.22μm, Millipore)을 메탄올에서 30초 간 활성화시켰다. 이후, 스트립을 부드럽게 교반하면서 H2O로 5분간 세척하였다. 세척 후, 1μg의 재조합 단일 성분 톡신(LukS-PV, LukF-PV, HlgA, HlgB, HlgC, LukE, LukD 및 LukAB)을 스트립에 로딩하였다. 각 단일 성분 및 LukAB 단백질(각 1μg)과, 음성 대조군으로서 S. aureus FnbpAN2N3(프브로넥틴 결합 단백질의 N2-N3 도메인)를 스포팅하였다. 스트립을 상온에서 2시간 동안 건조시킨 후 단백질을 15초간 메탄올로 고정하고 H2O로 3회, 1 X TBS(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl)로 3회 세척하였다. 스트립을 5% 탈지유로 2시간 동안 블로킹하고 단일 성분-톡신으로 면역화된 IgG(5% 탈지유로 1:1600 희석)와 1시간 동안 4℃에서 배양하였다. 배양 후 막을 1 X TBST(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.2% Tween 20)로 3회 세척하였다. 마우스 항-래빗 IgG-HRP(1: 3000희석, Santacruz)을 막에 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이후 막을 1 X TBST로 3회 세척하고 Pico EPD 웨스턴 블롯팅 검출 킷 [ELPIS-Biotech]에 적용하였다.
인간 PMN의 분리
수집된 전혈(2 ml) 및 PolymorphprepTM(2 ml, Axis-shield)을 이용하여 상온에서 둥근바닥 튜브에 다형핵 세포(PMN)를 분리하였다. 시료를 20℃에서 450xg로 30분 간 원심분리하였다. 상등액 제거 후, 단핵세포(위 밴드)와 PMN(아래 밴드)을 포함하는 2개의 백혈구 밴드를 수득하였다. 이후, 수집된 PMN를 RPMI(Gibco)로 2회 세척하고, 400 x g로 20℃에서 10분 간 원심분리 후 수집하였다. 수집된 세포를 2 ml RPMI+0.02% HSA 완충액에서 부드럽게 재부유시키고 혈구계산기(EKDS, Tokyo)로 세포 수를 계산하였다.
래빗 RBC의 분리
래빗 혈액 1 ml를 히루딘-코팅된 진공 튜브(BD, Becton Drive)에 수집하여 귀정맥을 통한 응집을 차단하였다. 이후, 튜브를 4℃에서 9,100 x g로 10분간 원심분리하여 적혈구(RBC)를 수득하였다. RBC를 PBS 함유 0.02% BSA로 2회 세척하고 500 x g로 4℃에서 5분간 원심분리하여 수집하였다. PBS 함유 0.02% BSA로 RBC를 2%로 희석하여 저장액을 제작하였다.
세포용해 및 용혈 어세이
S. aureus BCL 또는 Hla의 존재 여부에 따른 1차 인간 PMN의 인 비트로 생존성을 평가하기 위해, PMN을 48 웰 플레이트(SPL)에 웰당 2 x 106 세포로 씨딩하고 동량의 S- 및 F-성분(각 65 ng)와 함께 혼합하였다(LukAB는 130 ng). 이 혼합물을 37℃에서 5% CO2 c조건으로 1시간 동안 배양하고, 생존한 세포 수를 혈구계산기로 측정하였다.
톡신-매개 RBC 용혈 어세이
인 비트로에서 HlaWT 톡신의 존재 여부에 따른 래빗 RBC의 용혈 어세이를 수행하기 위해, 2% RBC를 96 웰 플레이트에 웰당 100μl로 씨딩하였다. 이후, 0.25μg의 정제된 재조합 HlaWT 톡신을 96 웰플레이트에 첨가하고 37℃에서 5% CO2 조건에서 1시간 동안 배양하였다. 이후, 5 분간 500 x g로 원심분리하여 상등액을 수집하고 분광 광도계(Eppendorf BioPhotomter)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
웨스턴 블롯 분석
정제된 BCL 톡신, Hla 및 톡소이드를 15% SDS-PAGE 겔 전기영동에 적용하고 트랜스퍼 버퍼(192 mM Glycin, 25 mM Tris, 0.02% SDS, 20% MtOH)를 이용하여 100 V, 400 mA로 4℃에서 75분 간 0.45μm PVDF 막으로 옮겼다. 이후 막을 5% 탈지유로 1시간 동안 블로킹하였다. 막을 면역화된 래빗 혈청(1: 6000)과 배양한 다음 5% 탈지유로 4℃에서 1시간 동안 블로킹하였다. 배양 후 막을 1 X TBST(50 mM Tris-HCl, pH 7.5,150 mM NaCl, 0.2% Tween 20)로 3회 세척하였다. 마우스 항-래빗 IgG-HRP (Santacruz)를 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이후 막을 1 X TBST로 3회 세척하고 Pico EPD 웨스턴 블롯팅 검출 킷[ELPIS-Biotech]으로 분석을 수행하였다.
실험결과
정제된 5개의 재조합 S. aureus의 이성분 류코시딘(BCL)과 Hla는 인간 PMN 및 RBC를 각각 가수분해하였으나, 톡소이드는 분해하지 않았다.
S. aureus 톡신 및 톡신-매개된 숙주 세포의 세포독성 간의 관계를 조사하기 위해, 본 발명자들은 우선 5개의 BCL 및 Hla를 클로닝하였다(도 1의 A-C). 발현된 6개의 재조합 톡신의 정제를 위해, His x 6-tag를 타겟 톡신의 N-말단 또는 C-말단 부위에 삽입하였다(도 2). 도 3에서 보는 바와 같이, S. aureus BCL의 4개 S-성분 및 3개 F-성분의 재조합 단백질을 정제하여 균질화하였으나, LukAB의 단량체는 느리게 발현하기 때문에 LukABWT는 이량체 형태로 정제되었다(도 3a). 또한, 재조합 HlaWT 및 HlaH35L, LukST244A 및 LukAE323AB 톡소이드도 균일하게 정제되었다(도 3b). 단일 활성 아미노산 치환을 가지는 Hla 톡소이드(HlaH35L)는 His-35 잔기가 Leu로 치환되었기 때문에 세포 용해 포어(cytolytic pore)를 형성하지 못하지만, 숙주 세포 상의 수용체와 결합하는 능력은 유지하는 것으로 알려졌다(Menzies BE et al., 1994. Infect Immun 62:1843-7; Menzies BE et al., 1996. Infect Immun 64:1839-41). LukS-PV의 Thr-244 잔기가 Ala로 치환될 경우(LukST244A-PV) 인간 백혈구 및 C5a 수용체-발현 미분화 U937 세포 모두와의 결합 친화도가 크게 감소하기 때문에(Laventie BJ et al., 2014. PLoS One 9:e92094), 본 발명에서는 LukST244A 돌연변이를 정제하였다. 또한, LukA의 Glu-323 잔기가 LukAB 세포 독성에 중요하고 LukAB 및 이의 타겟인 CD11b와의 상호작용에 필수적이라고 보고되었으므로(DuMont AL et al., 2014. Infect Immun 82:1268-76), LukAE323AB를 제작하여 사용하였다. 야생형 류코시딘과 톡소이드가 인간 PMN에 대한 세포용해 활성을 보이는지를 확인하기 위해, 동량의 S-성분 및 F-성분을 혼합하여 LukSF-PV, LukED, HlgAB, HlgCB, LukAB와 같은 야생형 류코시딘과 LukST244A-PV 및 LukAE323AB와 같은 비활성 류코시딘을 제작하였다.
BCL의 S-, F-성분, Hla 및 이들의 톡소이드 단백질을 개별적으로 발현 및 정제한 뒤, 인간 PMN 및 RBC를 이용하여 이들의 독성을 시험하였다. 동량의 S- 및 F-성분(각 0.25μg/ml)을 혼합하고 LukAB는 0.5μg/ml로 혼합하자, 5개의 동계 BCL(LukSF-PV, LukED, LukAB, HlgAB, HlgCB)은 모두 인간 다형핵 백혈구(PMN, 2 x 106 세포)를 30분 내에 완전히 분해하였으나, LukST244A- PV 톡소이드(0.25μg/ml) 및 LukF-PV(0.25μg/ml)의 혼합물은 인간 PMN에 대해 독성을 보이지 않았다(도 3c). 또한, LukAE323AB 다이머 톡소이드(0.5μg/ml)도 인간 PMN에 세포 독성을 나타내지 않았다(도 3c). 아울러, 정제된 HlaWT(2.5μg/ml)는 2% 래빗 RBC를 30분 내에 용혈시켰으나, 이의 비활성 톡소이드인 HlaH35L는 래빗 RBC에 대한 용혈 활성을 나타내지 못했다(도 3d). 이를 종합하면, 정제된 S. aureus BCL 및 이들의 톡소이드 단백질이 제대로 클로닝되고 균일하게 정제되었음을 알 수 있다.
단일 S- 또는 F-성분 항-래빗 IgG는 다른 BCL 성분에 대한 교차 반응성을 가진다.
S. aureus BCL은 S-S 또는 F-F 단일 성분 간 높은 서열 상동성을 가지기 때문에, 단일 성분-면역화된 래빗 항체는 S. aureus BCL 톡신의 다른 단일 성분과 결합할 것으로 기대되었다. 그러나, 단일 성분-IgG에 의한 이들의 인식 패턴이 5개의 BCL-매개 세포독성을 포괄적으로 중화하는 BCL-항체를 탐색하는 데에 중요하므로, 본 발명자들은 단일 성분-접합 세파로스 컬럼을 이용한 친화도-정제를 통해 8개의 상이한 단일 성분에 대한 래빗 다클론 항체를 수득하였다(도 4). 또한, 본 발명의 재조합 톡신과 톡소이드는 N- 또는 C-말단에 6 x His-tag을 가지므로, 6 x His-태깅된 S. aureus 피브로넥틴 결합 단백질 A (FnbpAN2-N3)-접합 세파로스 컬럼을 이용하여 His-tag-유래 IgG를 제거하였다(데이터 미기재). 이들 정제된 래빗 단일 성분-인식 IgG를 이용하여, 본 발명자들은 도트 블롯 면역어세이를 통해 BCL 단일-성분 및 정제된 BCL-인식 IgG 간의 교차반응성을 조사하였다(도 5). 사용된 모든 IgG는 음성 대조군 단백질인 FnbpAN2-N3와 결합하지 않았다. 항-LukS-PV-IgG는 4개의 S-성분(LukS-PV >HlgC >HlgA >LukE) 모두를 인식하였으나, 세 개의 F 성분과 LukAB는 인식하지 못했다(도 5의 컬럼 a, 붉은색과 녹색 박스는 각각 동계 및 비-동계 항원을 나타냄). 항-LukE-IgG도 4개의 S-성분(LukE >LukS >HlgC >HlgA)을 인식하였다(도 5의 컬럼 f). 항-HlgA-IgG는 Hlg >HlgC >LukF를 인식하였다(컬럼 c). 항-HlgC-IgG는 HlgC
LukS>HlgA를 인식하였다(도 5의 컬럼 e). F-성분-IgG의 경우, 항-LukF-PV-IgG는 LukF>LukD에 대한 양성 신호를 보였다(도 5의 컬럼 b). 항-HlgB-IgG는 LukF-PV >HlgB >LukD의 세 개 F 성분을 인식하였다(도 5의 컬럼 d). 항-LukD-IgG는 LukD >LukF-PV에 대한 결합 친화도를 나타냈다(도 5의 컬럼 g). 예상대로, LukAB-IgG는 이의 동계 항원인 LukAB 항원에 대해서만 결합 특이성을 보였다(도 5의 컬럼 h). 이를 종합하면, LukS-PV 및 LukE-IgG는 4개의 BCL S-성분에 대해 가장 광범위한 결합 능력을 가짐을 알 수 있다. 그러나, 흥미롭게도 항-HlgA-IgG가 IgG를 인식하는 S-성분임에도 이는 LukF-PV F-성분도 인식하였다(도 5의 컬럼 c 및 g). 항-HlgB-IgG의 경우 세 개의 F-성분(HlgB, LukD, LukF)을 인식하나, 다른 두 개의 F-성분(LukF-PV 및 LukD)은 이들의 동계 F-성분과 하나의 비-동계 F-성분 만을 인식하였다. 종합하면, BCL S- 및 F-성분은 동계 및 비-동계 항원에 대한 상이한 인식 패턴을 가짐을 알 수 있다.
4개의 항-S-성분-IgG는 4개의 BCL-매개 PMN 세포 용해 활성에 대한 부분적인 중화 효과를 보인다.
본 발명자들은 어떻게 인 비트로에서 BCL-매개 호중구 세포용해 활성이 항-S- 또는 F-성분-IgG의 첨가에 의해 중화되는지를 조사하고자 하였다. 인간 PMN를 각 BCL 및 항-LukS-PV-IgG와 함께 공배양하면(도 6a), 항-LukS-PV-IgG는 LukSF-PV-(98.5±0.5%), LukED-(74±1%) 및 HlgCB- (68.1±1%)-매개 PMN 세포용해 활성을 억제하나, HlgAB- 및 LukAB에 의한 PMN 세포 용해 활성은 항-LukS-PV-IgG에 의해 완전히 중화되지 못한다. 반면, 항-HlgA-IgG는 HlgAB-유발(90.3±3 %) 및 LukED-매개 PMN 용해(27.5±4 %) 만을 중화하였으며, LukSF-PV, HlgCB 및 LukAB-매개 PMN 세포독성은 거의 차단되지 못했다(도 6b). 항-HlgC-IgG는 HlgAB-(43.9±0.5%), LukED-(58.5±1%) 및 LukSF-PV-(73.2±0.5%), HlgCB-(85.4±1 %) 및 LukAB-(0%)-매개 PMN 용해를 억제하였다 (도 6c). 예상대로, 항-LukE-IgG는 4개의 BCL-매개 PMN 용해를 70% 이상 억제하였으나, LukAB-유발된 용해(도 6d)는 완전히 억제하지 못했다. 도트 블롯 실험에서(도 5), 항-LukE-IgG는 LukE>LukS-PV를 강하게 인식하였으나, HlgC>HlgA는 약하게 인식하였다. 그러나 4개의 BCL-매개 PMN 용해가 항-LukE-IgG에 의해 75±3% 이상 차단되어, BCL-매개 인간 PMN 세포용해 활성에 있어 도트 블롯 면역 어세이와 단일 S-성분 IgG의 중화 능력 간 차이가 존재함을 알 수 있었다.
3개의 항-F-성분-IgG는 HlgCB-매개 PMN 세포용해 활성을 중화하였다
도 7에서 보는 바와 같이, 항-F-성분-IgG와 인간 PMN 및 BCL를 공배양하면 항-LukF-PV IgG는 LukSF-PV-매개 PMN 용해 활성 및 HlgCB-유발된 PMN 용해 활성을 각각 85±0.5 % 및 74±1 %로 차단하지만, HlgAB, LukED 및 LukAB-매개 PMN 세포용해 활성은 항-LukF-IgG에 의해 거의 중화되지 못한다(도 7a). 또한, 항-HlgB-IgG는 HlgAB- 및 HlgCB-매개된 PMN 용해 활성을 각각 85.8±1% 및 65±0.5%로 억제하지만, LukED-(10± 0.5 %), LukSF-PV-(10±1 %), 및 LukAB-(2±1 %) 매개된 용해 활성의 억제율은 낮다(도 7b). 항-LukD-IgG의 경우 LukED- (84±4 %) 및 HlgCB (77±1 %)-매개 PMN 용해 활성도 억제하지만, HlgAB-(18.4±3%), LukSF-(20.8±0.2 %) 및 LukAB(3±0.1 %)-매개 용해 활성은 잘 중화시키지 못한다(도 7c). 이를 종합하면, 도트 블롯 면역어세이에서 항-LukF-IgG 및 항-LukD-IgG의 두 F-성분-IgG가 HlgB를 인식하지 못하였으나(도 5), 이들 두 F-성분 IgG는 일반적으로 HlgCB-매개 PMN 용해 활성을 중화하여, 이들이 비-동계 HlgB의 특정 서열을 인식함으로써 HlgCB BCL의 중합체화를 억제함을 알 수 있었다.
항-BCL-성분-IgG의 상이한 조합은 BCL-매개 세포독성에 대한 중화능력 차이를 야기한다
본 발명자들은 5개의 BCL-매개 세포독성을 포괄적으로 중화시킬 수 있는 BCL 항-S- 또는 항-F-성분 IgG의 최소한의 조합을 스크리닝한다면 S. aureus 감염에 대한 신규 치료제를 설계하는 데에 중요한 정보가 될 것이라 가정하였다. LukSF-PV 및 HlgCB는 일반적으로 숙주세포 상에서 발현하는 C5aR1 및 C5aR2 수용체를 인식한다고 보고되었다(Spaan AN et al., 2013. Cell Host Microbe 13:584-594). 그러나, LukED는 CCR5, CXCR1 및 CXCR2를 인식하며(Alonzo F, et al., 2013. Nature 493:51-5), HlgAB 및 LukED 모두 CXCR1 및 CXCR2를 수용체로 가지면서 CCR2도 인식하는 반면(Spaan AN et al., 2017. Nat Rev Microbiol 15: 435-447), LukAB는 CD11b에 결합한다(DuMont AL et al., 2014. Infect Immun 82: 1268-76). 도 6 및 도 7의 실험결과에 기반하여, 본 발명자들은 항-단일 성분-IgG 또는 항-톡소이드-IgG의 어떠한 조합이 5개 BCL로 유발된 세포독성을 효율적으로 중화시키는지를 조사하였다. 도 8에서 보는 바와 같이, 항-LukE-IgG(5μg) 및 항-LukD-IgG(5μg)를 인간 PMN 및 5개 BCL과 60분간 공배양할 경우, LukAB를 제외한 4개의 BCL-매개 PMN 세포독성이 이들 두 IgG에 의해 70% 이상 중화되었다(도 8a). 그러나, 항-HlgA- 및 항-HlgB-IgG의 혼합물은 HlgAB-(79.8±5%) 및 HlgCB- (60±1%) -매개 세포 독성만을 중화하였고(도 8b), LukED, LukSF-PV 및 LukAB에 대해서는 억제효과가 나타나지 않았다. 이들 결과로부터 HlgAB 및 LukED이 CXCR1, CXCR2 및 CCR2과 결합한다고 보고되었지만 HlgA 및 HlgB의 IgG 혼합물은 LukED-매개 세포독성을 거의 중화시키지 못함을 알 수 있다. 예상과 달리, 항-HlgA-IgG 및 항-HlgB-IgG 혼합물은 C5aR-인식 HlgCB 세포용해 활성을 억제하였다.
항-HlgC-IgG 및 항-HlgB-IgG의 혼합물은 HlgCB (93.4±0.5%) > LukSF-PV (70±1%) > HlgAB (57.8±1%)의 용해 활성을 중화시킴으로써, C5aR-인식 BCL-래빗 다클론 IgG 혼합물 또한 키모카인-수용체-인식 HlgAB의 세포독성을 억제함을 확인하였다(도 8c). 그러나, 항-LukS-PV-IgG 및 항-LukF-PV-IgG의 혼합물은 LukSF-PV- (93.5±1%) 및 HlgCB-(78.7±1%) 매개된 용해 활성을 중화시켰으며 LukED(68±0.5%)-유발된 PMN 용해 활성도 억제하였다(도 8d). 종합하면, 예상대로 항-LukAB-IgG은 LukAB 세포독성만을 중화하고 다른 4개의 BCL-매개 독성은 억제하지 못함을 확인하였다(도 8e). 이를 통해 항-BCL-IgG의 상이한 조합은 BCL-매개 세포독성에 대한 중화 능력의 차이로 나타나며, LukAB의 독성에는 전혀 영향을 미치지 못함을 알 수 있었다.
항-S-성분-IgG 조합 중, 항-LukS-PV- 및 항-HlgA-IgG의 혼합물이 BCL-매개 세포독성에 대한 가장 높은 중화 활성을 보였다.
다음으로, 동계 BCL S-IgG의 조합에 따른 5개 BCL-매개 PMN 세포용해 활성에 대한 중화 능력을 조사하였다. 이를 위해, 6개의 서로 다른 항-S-성분-IgG의 조합에 따른 5개 BCL-매개 세포용해 활성의 중화 능력을 측정하였다(도 9). 항-S-성분-IgG의 가능한 6개 조합과 인간 PMN를 5개 상이한 BCL와 공배양하여 각 PMN의 생존율을 계산하였다. 각 생존률은 LukS-PV+HlgC, 평균 생존율 59.7%(도 9a); LukS-PV+HlgA, 85.8%(도 9b); LukS-PV+LukE, 45.2%(도 9c); HlgA+LukE, 45.9%(도 9d); HlgA+HlgC, 31.3%(도 9e); HlgC+LukE, 36.8%(도 9f)이다. 이 중 항-LukS-PV 및 항-HlgA-IgG의 혼합물이 나머지 5개 조합에 비하여 4개의 BCL-매개 세포용해 활성을 가장 효율적으로 억제하였다(도 9b). 이를 통해 상기 조합이 4개의 BCL-독성을 억제할 수 있음을 확인하였으며, 단 LukAB의 독성에는 여전히 영향을 미치지 못하였다.
항-F-성분-IgG 조합 중, 항-LukF- 및 항-LukD-IgG의 혼합물이 4개의 BCL-매개 세포독성에 대한 가장 높은 중화 활성을 보였다.
나아가, 본 발명자들은 동계 BCL F-IgG의 조합에 따른 5개 BCL-매개 PMN 세포용해 활성에 대한 중화 능력을 조사하였다. 이를 위해, 4개의 서로 다른 항-F-성분-IgG의 조합에 따른 BCL-매개 세포용해 활성에 대한 중화 능력을 측정하였다(도 10). 각 혼합물의 처리에 따른 PMN의 평균 생존률은 다음과 같다: 항-LukF-PV- 및 항-HlgB-IgG, 52.9%(도 10a); 항-LukD 및 항-HlgB-IgG, 42.6%(도 10b); 항-LukF-PV- 및 항-LukD-IgG, 68.6%(도 10c); 항-LukF-PV-, 항-LukD 및 항-HlgB-IgG, 69.0%(도 10d). 이들 중, 항-LukF-PV- 및 항-HlgB-IgG의 조합이 다른 3개의 조합에 비하여 가장 높은 PMN 생존율을 보였다. 이를 통해 3개의 항-F-성분-IgG가 4개의 BCL-독성에 대해 양호한 중화 활성을 보임을 알 수 있었으며, 단 LukAB의 독성에는 여전히 영향을 미치지 못하였다.
항-LukS-PV-, HlgA- 및 LukA
E323A
B-IgGs 혼합물은 5개의 BCL-매개 PMN 세포용해 활성을 중화시킨다
도 6 내지 도 10에서 보는 바와 같이, 어떠한 BCL-성분-IgG 및 어떠한 IgG 조합도 LukAB-유발된 세포용해 활성을 억제하지 못했다. 이에, 본 발명자들은 항-BCL-성분-IgG을 이용하여 5개 BCL-유발된 독성을 모두 중화시키기 위해서는 항-LukAB 톡소이드-IgG와 다른 선정된 항-BCL-성분-IgG을 함께 사용하여야 한다. 이에, 정제된 재조합 LukAE323AB 톡소이드 및 이의 래빗 항-LukAE323AB IgG를 정제하였다(도 4). 항-LukS-PV- 및 HlgA-IgG의 혼합물이 4개의 BCL-매개 세포용해 활성을 높은 효율로 중화시킴을 확인하였으므로(도 9b), 항-LukS-PV-, 항-HlgA 및 항-LukAE323AB 톡소이드-IgG의 3개 IgG 혼합물이 5개 BCL-매개 세포용해 활성을 중화시킬 것이라 가정하였다. 또한, 3개 항-F-성분 IgG과 항-LukAE323AB 톡소이드-IgG의 혼합물도 유망한 후보가 될 수 있다(도 10d).
이러한 가능성을 검증하기 위해, 인간 PMN를 5개 BCL 및 2개의 상이한 IgG 조합과 합께 배양하였다(도 11). PMN의 평균 생존율 측정 결과, 항-LukS-PV-, 항-HlgA 및 항-LukAE323AB 톡소이드-IgG의 조합(도 11a)과 항-LukF-PV, 항-HlgB- 및 항-LukAE323AB 톡소이드-IgG의 조합(도 11b)을 사용한 경우 각각 94.7% 및 68.0%를 나타내어, 2개의 S-성분 IgG와 1개의 LukAB 톡소이드 IgG를 혼합할 경우 5개의 S. aureus BCL-매개 PMN 세포용해 활성이 현저히 중화됨을 알 수 있었다.
항-LukS-PV-, HlgA-, Hla
H35L
및 LukA
E323A
B-IgG의 혼합물은 고유의 S. aureus 톡신-매개 인간 PMN 세포용해 및 용혈 활성 모두를 억제한다
지금까지, 5개의 재조합 BCL을 사용하여 인 비트로에서 인간 PMN 세포용해 활성을 조사하였다. 이에, 본 발명자들은 정제된 항-BCL IgG가 병원성 S. aureus USA300로부터 분비된 고유의 BCL에 대해서도 작용할 수 있는지를 확인하고자 하였다. 이를 위해 먼저 USA300 배양 시점 별 BCL의 양을 측정하였다. 도 12에서 보는 바와 같이, 5개 BCL 모두 배양 1.5 내지 3시간 째에 다량 분비되고 있음을 확인하였다(도 12a). 동일한 조건에서 Hla는 1.5 내지 9시간 사이에 높게 분비되었다. 이러한 결과를 기반으로, 5개의 BCL 및 Hla 톡신은 일반적으로 배양 3시간째에 축적됨을 알 수 있었다. 따라서, S. aureus USA3000 배양 배지에서 3시간째 배양한 상등액을 수집하고 단백질 농도가 1 mg/ml가 되도록 농축하여 저장액으로 사용하였다. 도트 블롯 분석으로 저장액 내의 분비된 BCL 및 Hla를 정량하자, LukSF-PV, HlgAB, LukED, HlgCB, LukAB 및 Hla의 평균 단백질량은 각각 0.13,0.26, 0.32, 0.37, 0.24 및 1.50μg/ml로 나타났다(표 2).
| 톡신 | 3시간 배양 후 단백질 량(μg/ml) | 평균량(μg/ml） |
| LukS-PV | 0.10 | LukSF-PV 0.13 |
| LukF-PV | 0.16 | |
| HlgA | 0.17 | HlgAB 0.26 |
| HlgB | 0.40 | |
| HlgC | 0.34 | HlgCB, 0.37 |
| LukE | 0.36 | LukED 0.32 |
| LukD | 0.28 | |
| LukA | 0.25 | LukAB 0.24 |
| LukB | 0.22 | |
| Hla | 1.50 | 1.50 |
다음으로, 인간 PMN가 항-LukS-PV-, HlgA, HlaH35L 및 LukAE323AB 톡소이드-IgG의 4개 항체의 혼합물에 의해 인 비트로에서 보호될 수 있는지를 조사하였다(도 13). 인간 전혈로부터 PolymorphprepTM용액을 이용하여 인간 PMN를 제작하자, PMN 밴드가 어떠한 손상도 없이 명확하게 나타났으나(도 13a 좌측), 6개의 재조합 톡신(Hla, LukSF-PV, HlgAB, LukED, HlgCB, LukAB 4μg)을 인간 전혈에 첨가하자, 원심분리 후 백색의 PMN 밴드가 회복되지 못했다(도 13a, 중간). 6개 톡신과 4개 IgG 혼합물(항-HlaH35L, LukS-PV-, HlgA 및 LukAE323AB-IgG 총 64μg)을 인간 전혈에 첨가하자, 원심분리 후 PMN 밴드가 다시 나타났다(도 13a 우측). 나아가, 회복된 PMN의 세포 수를 혈구계수기로 측정한 결과(도 13b), 6개 톡신-처리된 전혈(컬럼 2)로부터 대조군(컬럼 1) 대비 20% PMN 만이 회복되었다. 그러나, 4개의 IgG-처리 인간 전혈(컬럼 3)로부터 95% PMN가 회복되었다. 이를 통해 본 발명에서 선정된 4개의 IgG가 인 비트로에서 6개 톡신-매개 PMN 세포용해 활성을 효율적으로 차단할 수 있음을 확인하였다.
또한, S, aureus Hla 및 BCL는 감염 시 용혈 활성을 유도하는 것으로 알려졌다(Seilie ES, et al., 2017. Semin Cell Dev Biol 72:101-116). 6개 톡신을 래빗 전혈과 배양하자, PBS 처리 혈액 대비 높은 용혈 활성이 관찰되었으나(도 13c, 2번 튜브), 본 발명에서 선정된 4개의 IgG 및 6개 톡신을 래빗 전혈에 투여하자, 용혈 활성을 대조군 대비 50%까지 억제되었다(도 13c 및 13d). 이를 통해 본 발명의 4개 톡신 항체가 S. aureus 톡신-매개 인간 혈액의 용혈 작용을 억제할 수 있음을 확인하였다.
마지막으로, 본 발명자들은 선정된 4개 IgG가 S. aureus 배양 배지-매개 PMN 세포용해 작용을 억제하는 보호 효과를 조사하고자 하였다. 먼저, 인간 PMN(2 x 106 세포)에 대한 독성을 나타내기 위해 S. aureus 배양 배지 내 어느 정도의 단백질 양이 필요한지를 조사하기 위해, 다양한 용량의 배양 배지를 PMN와 배양하였다(도 14a). 16μg/ml의 배양 배지 첨가시 PMN는 대부분 가수분해되었다. 이에 기반하여 인간 PMN(2 x 106 세포)를 37℃에서 250μl의 RPMI로 1시간 동안 배양하자, 100% PMN가 생존하였고(도 14b, 컬럼 1), PMN을 USA300 배양 배지(16μg/ml 최종 농도) 및 항-LukS-PV-, HlgA-, LukAE323AB 및 HlaH35L-IgG의 혼합물(최종농도 총 160μg/ml)과 공배양한 경우, 약 90%의 PMN이 생존하였다(컬럼 2). 예상대로, USA300 배양 배지(16μg/ml 최종 농도)와만 배양한 경우 5%의 PMN 만이 생존하였다(컬럼 3). 이를 통해 6개 톡신-매개 PMN 세포용해로 인한 손상은 인 비트로에서 본 발명에서 선정된 4개의 톡신 및 톡소이드-IgG를 첨가함으로써 보호될 수 있음을 알 수 있다.
4개 래빗 항-톡신-IgG는 인간 전혈 및 S. aureus USA300와 공배양시 박테리아 사멸효과를 보인다
항원의 면역화로 형성된 혈청 항체는 숙주-식세포-매개 옵소닌식세포작용을 유도하여 감염된 병원균을 제거하는 것으로 알려졌다(Miller LS et al., 2020. FEMS Microbiol Rev 44:123-153). 본 발명에서 선정된 4개 항-래빗 톡신 IgG가 S. aureus BCL 및 Hla 톡신-매개 PMN 세포용해와 RBC 용혈 활성에 대한 억제 효과를 가지는 것으로 확인되었으므로, 이들 4개 항체가 S. aureus USA300 세포 및 인간 전혈과 공배양시 박테리아 사멸효과를 가지는지를 조사하고자 하였다. 이를 위해, USA300 세포(2 x 106 세포)를 고유의 정제된 IgG(40μg) 또는 mixture of 4개 톡신-유래 IgG(총 40μg)의 혼합물과 인간 전혈(100μl)을 3시간 동안 공배양하고 잔여 CFU(colony forming unit)을 측정하였다(도 15). 대조군 시료가 2x 106 CFU에 이른 시점에, IgG- 및 4개-톡신-IgG 혼합물을 처리한 시료는 각각 대조군의 25% 및 6% CFU를 보임으로써 4개 항-톡신-IgG 혼합물이 인간 전혈에서 박테리아 사멸효과를 가짐을 알 수 있었다.
실시예 2: 인간 보체인자 H(FH)와 결합하는 CWAP 단백질의 탐색
실험방법
clfA, clfB, sdrC, sdrD, sdrE, fnbpA 및 fnbpB N2-N3 도메인을 포함하는 pET28a 벡터의 정제
클로닝은 Gibson assembly master mix(New England Biolabs, USA)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 6 히스티딘-함유 모티프(6-his-tag)를 가지는 pET28a 플라스미드(Novagen, Germany)를 벡터로 사용하였다. CWAPN2N3 도메인을 발현시키기 위해, S. aureus USA300 LAC 균주의 N2 및 N3 도메인을 포함하는 clfA (215-575), clfB (200-555), sdrC (166-507), sdrD (224-570), sdrE (261-610), fnbpA (180-559) 및 fnbpB (140-500)의 각 유전자의 약 1kbp를 이용하였다. 코딩 영역을 Q5 high-fidelity 중합효소를 이용하여 PCR로 증폭하였다(프라이머 서열은 표 3에 정리). 클로닝된 pET28a-clfA, clfB, sdrC, sdrD, sdrE, fnbpA 및 fnbpB를 E. coli DH5α(Enzynomics, Korea)에 형질전환하고 10μg/ml 카나마이신(Km) (Sigma-Aldrich, USA)을 포함하는 LB 아가 플레이트에 도말한 다음 37℃에서 밤새 배양하였다.
| 유전자명 | 프라이머 서열 |
| clfA-F | ttgttagcagccggatctcatgaattagaatcgctgccagaatctga |
| clfA-R | atgggcagcagccatcatcatcatcatcacgcatttagtttagcggcagtagctg |
| clfB-F | ttgttagcagccggatctcattctgggtcaaccggcggc |
| clfB-R | atgggcagcagccatcatcatcatcatcacgttgctgaaccggtagtaaatgc |
| sdrC-F | ctttaagaaggagatataccatgagaactttaaatcgcatggcagtgaata |
| sdrC-R | cagtggtggtggtggtggtgtgtatcttcccatacatagtcacctag |
| sdrD-F | ctttaagaaggagatataccatggcacctaaacgtttgaatacaagaatgc |
| sdrD-R | cagtggtggtggtggtggtgatatacttcttgaccagctccgc |
| sdrE-F | ttgttagcagccggatctcaaattttgtataacttttcttcaggtttaacagta |
| sdrE-R | atgggcagcagccatcatcatcatcatcacgtaaacgcaaaaatgcgctttgcag |
| fnbpA-F | ctttaagaaggagatataccatggtagcggaagctaaggaagctagtaa |
| fnbpA-R | cagtggtggtggtggtggtgagctgtgtggtaatcaatgtcaagag |
| fnbpB-F | taagaaggagatataccatgatgaaaagatcaactgacgttacagc |
| fnbpB-R | cagtggtggtggtggtggtgcactggcggctctgatttaaa |
| pET28a-C-절편1-F | gcatcctctctcgtttcatcggtatc |
| pET28a-C-절편1-R | caccaccaccaccaccactgagatc |
| pET28a-C-절편2-F | catggtatatctccttcttaaagttaaac |
| pET28a-C-절편2-R | gaaacgagagaggatgctcacgatac |
| pET28a-N-절편1-F | gcatcctctctcgtttcatcggtatc |
| pET28a-N-절편1-R | tgagatccggctgctaacaaagc |
| pET28a-N-절편2-F | gtgatgatgatgatgatggctgc |
| pET28a-N-절편2-R | gaaacgagagaggatgctcacgatac |
| T7 프로모터 | aaattaatacgactcactatagg |
| T7 테미네이터 | atgctagttattgctcagcgg |
pET28a-CWAP 플라스미드 DNA의 E. coli BL21(DE3) pLySs로의 형질전환
pET28a-clfA, clfB, sdrC, sdrD, sdrE, fnbpA 및 fnbpB의 DNA 100ng DNA를 E. coli BL21(DE3) pLySs 세포에 열충격 방법을 이용하여 형질전환하고 10μg/ml 카나마이신(Km) 및 50μg/ml of 클로람페니콜(Cm)을 포함하는 LB 아가 플레이트에 도말한 다음 37℃에서 밤새 배양하였다.
CWAP
N2N3
도메인의 발현 및 정제
pET28a-clfA, clfB, sdrC, sdrD, sdrE, fnbpA 및 fnbpB가 삽입된 E. coli BL21(DE3) pLySs를 LB에서 10μg/ml Km 및 50μg/ml Cm과 함께 37℃에서 밤새 배양하였다. 10ml의 배양 시료를 10μg/ml의 Km과 50μg/ml의 Cm을 포함하는 1L의 LB에 접종하고 37℃에서 1시간 반 내지 2시간 동안 배양하였다. OD600 값이 0.3~0.5에 이르렀을 때, 200μl의 1M IPTG를 1L의 시료에 참가하고, 시료를 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. ClfAN2N3, ClfBN2N3, SdrCN2N3, SdrDN2N3, SdrEN2N3, FnbpAN2N3, FnbpBN2N3 도메인을 정제하기 위해, 배양 용액을 4℃에서 7,000 x g로 20분간 원심분리하였다. -80℃에서 30분간 펠렛을 동결시킨 후, 펠렛을 150 mM NaCl, 5 mM 이미다졸, 0.1% triton X-100, 및 5 mg 라이소자임(Bioshop, Canada)을 포함하는 20 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.4) 40 ml와 completeTM EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일(Merck, USA)에 부유시키고 상온에서 15분간 배양하였다. 박테리아 세포벽을 깨기 위해 시료를 얼음 위에서 30분간 초음파 처리하였다. 혼합물을 4℃에서 20분 간 20,400 x g로 원심분리한 뒤, 상등액을 수집하여 0.45 μm 시린지 막 필터로 여과하였다. 발현된 재조합 단백질을 Ni-세파로스 6 고속 컬럼(GELifeScience, USA)으로 정제하였다. 요약하면, 시료에 적용하기 전 Ni-세파로스 컬럼을 150 mM NaCl 및 5 mM 이미다졸을 함유하는 20 mM 인산나트륨(pH 7.4)(완충액 A)로 평형화하였다. 여과된 용액을 컬럼에 로딩하고, 컬럼을 완충액 A로 세척 후 단백질을 단계적 구배로 150 mM NaCl 및 500 mM 이미다졸 함유 20 mM 인산나트륨(pH 7.4)으로 각각 용출하였다. 용출된 분획을 수집하여 환원 조건 하에서 SDS-PAGE 분석을 수행하였다.
CWAP
N2N3
도메인-커플링된 세파로스 친화도 컬럼의 제작
재조합 CWAPN2N3도메인과 CNBr-활성화된 세파로스 비드(GE Health Care) 간의 커플링은 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 요약하면, CNBr-활성화된 세파로스 비드 1g을 커플링 완충액(0.1M NaHCO3, pH 8.5)으로 3회 세척하고, 1 ml 커플링 완충액에 용해된 5 mg의 CWAPN2N3 단백질을 첨가한 뒤 커플링 완충액 4 ml에 부유시켰다. 2시간 동안 상온에서 배양 후, 비드를 커플링 완충액으로 3회 세척하였다. 이후, 비드를 1M 에탄올아민(pH 8.0) 4ml와 함께 4시간 동안 상온에서 배양한 뒤 280 nm에서 UV 흡광도가 나타나지 않을 때까지 0.1M 인산나트륨(pH 7.2)로 세척하고 4℃에서 보관하였다.
래빗에서 CWAP
N2N3
도메인 인식 항체의 생산
500μl PBS에 용해된 500μg의 정제된 CWAPN2N3도메인을 완전 프로인트 보조제(CFA, Sigma-Aldrich) 500μl와 혼합하여 에멀젼을 수득하였다. 에멀젼을 래빗에 피하주사한 뒤, 동량의 항원을 혼합하여 7일 뒤 500μl의 불완전 프로인트 보조제(IFA, Sigma-Aldrich)와 함께 주사하였다. 일주일 뒤, 래빗 귀정맥에서 혈액 500μl를 채취하고 웨스턴 블롯으로 IgG 생성을 조사하였다. IgG의 형성이 확인되면, 래빗 혈청을 취하여 -80℃로 보관하였다.
래빗 혈청으로부터 항-CWAP
N2N3
인식 IgG의 정제
S. aureus 단백질이 커플링된 세파로스 컬럼(Sigma-Aldrich)을 용출 완충액(0.15 M 글리신/HCl, pH 2.2)으로 세척한 뒤, 컬럼을 세척 완충액(0.1M NaCl 포함 0.1M 인산나트륨, pH 7.4)으로 평형화하였다. 항원-면역화된 래빗 혈청(2 ml, 단백질 약 100 mg)을 컬럼에 로딩한 뒤 컬럼을 세척 완충액으로 세척하고 IgG를 용출 완충액으로 용출하였다. 수집된 IgG를 중화 완충액(1 M Tris/HCl 완충액, pH 9.0)으로 신속히 중화시켰다. 이후 CWAPN2N3도메인-커플링된 세파로스 컬럼으로 교체하고 컬럼을 용출 완충액(0.15M 글리신/HCl, pH 2.2)으로 세척한 뒤, 세척 완충액(0.1M NaCl 포함 0.1M 인산나트륨, pH 7.4)으로 평형화하였다. 단백질 A 컬럼에 수집된 IgG(단백질 약 6mg)를 컬럼에 로딩하고 컬럼을 세척 완충액으로 세척한 뒤 IgG를 용출 완충액으로 용출하였다. 수집된 IgG를 중화 완충액(1 M Tris/HCl 완충액, pH 9.0)으로 신속히 중화시켰다. 완충액을 PBS로 교체 후, 수집된 IgG를 환원 및 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE로 분석하였다.
래빗 IgG로부터 F(ab')2 절편의 제작
본 발명에서 이용되는 F(ab')2 절편은 종래 보고된 방법으로 제조되었다(Hymes AJ et al., 1979. J Biol Chem 254:3148-51). 항-인간 FH-IgG F(ab′)2 절편의 제조 방법은 다른 F(ab')2 절편의 제조에도 전형적으로 적용된다. 먼저, S. aureus 단백질-커플링된 세파로스 컬럼 (Sigma-Aldrich)을 이용하여 고트 항-인간 FH-IgG를 정제하였다. 요약하면, 500μl(단백질 40 mg)의 고트-항-인간 FH(Complement Technology, Inc.)를 완충액 A(0.1 M NaCl 포함 0.1 M 인산나트륨, pH 7.4)로 평형화시킨 단백질 컬럼(1.5 x 8cm, 10 ml)에 로딩하고 컬럼을 완충액 A로 세척 후, 280 nm에서 UV 흡광도를 모니터링하면서 결합된 IgG를 완충액 B(0.15 M 글리신/HCl, pH 2.2)로 용출하였다. 수집된 IgG를 1M Tris/HCl(pH 9.0)로 pH 7.5가 될 때까지 즉시 중화시키고 수집된 IgG를 Centricon(Merck Millipore Ltd.) 상에서 농축한 다음, 2.5 mg의 고트 FH IgG 및 50μg의 펩신(Sigma-Aldrich)을 0.1M 아세테이트 완충액(pH 4.2) 500μl와 혼합한 뒤 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 100 mM NaCl을 포함하는 차가운 인산완충액(pH 7.4) 100 mM로 완충액 교환을 하면서 반응을 종료한 뒤 환원 및 비환원 조건 하에서 IgG가 적절하게 절단되었는지를 확인하였다. 반응 진행시 소화 용액을 농축하여 완충액 A와 교환하고
F(ab')2 절편을 포함하는 단백질 컬럼의 유체 분획을 수집하였다.
인간 IVIg로부터 인간 CWAP
N2N3
인식 IgG의 정제
상업적으로 구입 가능한 정맥주사용 IgG(IVIg, 단백질 500 mg) 5 ml를 CWAPN2N3 커플링된 세파로스 컬럼(SdrE, FnbpA: 1 ml 비드; ClfA, FnbpB: 3 ml 비드)에 로딩하고 상술한 방법으로 세척하였다. 인간 항-CWAPN2N3 인식 IgG를 용출하고 상술한 방법으로 중화하였다. 수득된 인간 IgG를 환원 및 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE로 분석하였다.
도트 블롯 면역어세이
CWAPN2N3(ClfAN2N3,ClfBN2N3, SdrCN2N3, SdrDN2N3, SdrEN2N3, FnbpAN2N3, FnbpBN2N3)의 N2-N3 도메인 3μg 및 음석 대조군인 BSA를 PVDF 막(Immobilon-PSQ Transfer Membrane, Merck, USA)에 스폿팅하고 건조시켰다. 막을 TBS 내 5% 탈지유로 상온에서 2시간 동안 블로킹하고 5% 탈지유 700μl에 용해된 정제된 인간 피브리노겐(Sigma-Aldrich, USA), 정제된 인간 피브로넥틴(Sigma-aldrich, USA), 인간 FH(Complement Technology, USA) 및 인간 FI(Complement Technology, USA) 각 7μg과 함께 배양하였다. 이후, 막을 TBST로 10분 간 3회 세척하고 6000배 희석된 1차 항체[래빗-항-인간 피브리노겐-IgG(Sigma-Aldrich, USA), 래빗-항-인간 피브로넥틴-IgG(Sigma-Aldrich, USA), 고트 항-인간 FH-IgG(Complement Technology, USA) 및 고트 항-인간 factor I-IgG(cat. No. A238, Complement Technology, USA)]와 함께 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 막을 TBST로 10분 간 3회 세척하고 3000배 희석된 2차 항체(마우스 항-래빗 IgG HRP 또는 동키 항-고트-IgG-HRP, Santacruz, USA)와 함께 1시간 동안 상온에서 배양하였다. 이후 막을 10분간 3회 세척하고 증강화학발광(ECL) 시약(pico EPD, Elpis-Biotec, Korea)과 함께 1분간 배양하였다.
유세포 분석
FH와 S. aureus의 결합을 정량하기 위해 FACS 분석을 수행하였다. 박테리아를 혈액 플레이트 상에서 밤새 배양하고 PBS에 부유시켰다. 박테리아를 PBS로 2회 세척 후 600 nm에서 흡광도 측정을 통해 박테리아 수를 계측하였다. ClfAN2N3, SdrCN2N3, SdrEN2N3, FnbpAN2N3, FnbpBN2N3 래빗 F(ab')2 절편의 CWAPN2N3 도메인 20μg을 USA300(2 x 107세포)와 함께 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이후, 시료를 4℃에서 3분 간 1,500 x g로 원심분리 후, 박테리아 펠렛을 200μl PBS로 2회 세척한 다음 박테리아를 PBS에 부유시키고, 30μg의 FH를 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이후, 시료를 4℃에서 3분간 1,500 x g로 원심분리하고, 박테리아 펠렛을 200 μl PBS로 2회 세척하였다. 이후 박테리아를 다클론 고트 항-인간 FH Fab′2-FITC 접합체와 함께 20μl PBS에 재부유하고 얼음 상에서 1시간 동안 배양하였다. S. aureus 세포를 30초간 초음파 처리하여 유세포 분석을 수행하였으며, 10000번의 측정 결과를 기록하였다.
CWAP
N2N3
도메인 존재 하에 인간 FH/FI 복합체에 의한 C3b의 iC3b로의 절단
3μg의 CWAPN2N3 도메인, BSA 및 고트 항-인간 FH-IgG(1000:1 희석)을 포함하는, 25 mM 탄산나트륨과 25 mM 중탄산나트륨(pH 9.6)으로 이루어진 코팅 완충액 20μl를 미세역가 플레이트에 코팅하였다. PBST로 3회 세척 후, 웰을 PBS 내 0.2% BSA 100μl와 함께 상온에서 2시간 동안 배양하고 PBS 내 Tween 20(pH 7.4) 0.05%를 포함하는 PBST로 3회 세척하였다. 이후, 정제된 인간 FH 0.37μg을 첨가하였다. 음성 대조군으로 인간 FH 대신 PBS를 첨가하였다. 30분 간 배양한 뒤, 웰을 PBST로 3회 세척하고, 정제된 C3b 1 μg 및 정제된 인간 FI 1 μg을 포함하는 혼합물 75μl를 각 웰에 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 배양 후, 상등액을 추출하고 6000:1로 희석된 고트 항-인간 C3-IgG(Complement Technology, USA)를 1차 항체로 이용한 웨스턴 블롯을 통해 생성된 iC3b 양을 측정하였다. 이후 막을 TBST로 3회 세척하고 2차 항체인 동키 항-고트-IgG-HRP (Santacruz, USA)와 함께 배양하였다. ECL 시약을 1분간 처리 후, 상술한 방법으로 이미지를 수득하였다.
S. aureus USA 300 LAC 생균 상에서의 인간 FH의 검출
100μl PBS에 박테리아(1 x 105 CFU)를 준비하고 5μg의 CWAPN2N3 도메인과 0.5μg의 FH를 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이후 시료를 4℃에서 3분간 1,500 x g로 원심분리하고, 상등액 90 μl를 수집한 뒤, 박테리아 펠렛을 200μl PBS로 2회 세척하였다. 마지막으로, 박테리아 펠렛을 90μl PBS에 부유시켰다. 각 부유된 박테리아 펠렛과 수집한 상등액을 6-15% 구배 SDS-PAGE 겔에 로딩하였다. 겔 전기영동 후, 4℃에서 0.45 μm PVDF 막(Immobilon-P Transfer Membrane, Merck, USA)으로 옮기고 막을 TBST 내 5% 탈지유로 상온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 이후, 막을 1차 항체인 고트 항-인간 FH-IgG와 함께 배양하고, TBST로 3회 세척한 뒤 2차 항체인 동키 항-고트-IgG-HRP(Santacruz, USA)와 함께 배양하였다. ECL 시약을 1분간 처리한 뒤, 상술한 방법으로 이미지를 수득하였다.
CWAP
N2N3
도메인 존재 하의 iC3b 양의 측정
S. aureus USA300 LAC 균주(1 x 105 CFU)를 GVB++ 100μl에 제작하였다. 10μg의 CWAPN2N3 및 0.1μg의 인간 FH를 첨가 후 4℃에서 1시간 동안 배양한 다음, 시료를 4℃에서 3분간 1,500 x g로 원심분리하고 90μl의 상등액을 수집하였다. 박테리아 펠렛을 200μl PBS로 2회 세척하고 GVB++ 내 1.5μg의 정제된 C3b, 0.25μg의 정제된 인간 FI를 상등액 및 펠렛에 첨가한 다음 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 각 펠렛과 수집된 상등액을 6-15% 구배 SDS-PAGE 겔에 로딩하였다. 겔 전기영동 후, 밴드를 4℃에서 PVDF 막으로 옮겼다. 막을 TBST 내 5% 탈지유로 1시간 동안 상온에서 블로킹한 뒤 1차 항체인 고트 항-인간 C3-IgG와 함께 배양하였다. 이후 막을 TBST로 3회 세척하고 2차 항체인 동키 항-고트-IgG-HRP(Santacruz, USA)와 함께 배양하였다. ECL 시약을 1분간 처리한 뒤, 상술한 방법으로 이미지를 수득하였다.
다른 CWAP
N2N3
도메인에 대한 래빗 항-CWAP-F(ab')2 의 결합 특이성의 조사
1μg의 CWAPN2N3 도메인(ClfAN2N3,ClfBN2N3, SdrCN2N3, SdrDN2N3, SdrEN2N3, FnbpAN2N3, FnbpBN2N3)를 PVDF 막에 스폿팅하고 건조시켰다. 막을 TBS 내 5% 탈지유로 2시간 동안 상온에서 블로킹하고 6,000:1 희석된 1차 항체(항-CWAPN2N3도메인 인식 래빗 Fab′2)와 함께 5% 탈지유에서 1시간 동안 상온에서 배양하였다. 막을 TBST로 10분 간 3회 세척하고 3000:1 희석된 2차 항체(마우스 항-래빗 IgG HRP, Santacruz, USA)와 함께 5% 탈지유에서 1시간 동안 상온에서 배양하였다. 이후, 막을 TBST로 10분 간 3회 세척하고 ECL 시약(pico EPD, Elpis-Biotec, Korea)과 함께 1분간 배양한 다음, 상술한 방법으로 이미지를 수득하였다.
다른 CWAP
N2N3
도메인에 대한 래빗 및 인간 항-CWAP-IgG의 결합 특이성의 조사
200ng의 CWAPN2N3 도메인(ClfAN2N3,ClfBN2N3, SdrCN2N3, SdrDN2N3, SdrEN2N3, FnbpAN2N3, FnbpBN2N3)을 SDS-PAGE 겔에 로딩하였다. 겔 전기영동 후, 밴드를 4℃에서 PVDF 막으로 옮긴 뒤 TBS 내 5% 탈지유로 상온에서 1시간 동안 블로킹하고 6,000:1 희석된 1차 항체(항-CWAPN2N3 도메인 인식 래빗 및 인간 IgG)와 함께 1시간 동안 상온에서 배양하였다. 막을 TBST로 10분 간 3회 세척하고3000:1 희석된 2차 항체(마우스 항-래빗 IgG HRP,고트 항-인간 IgG HRP, Santacruz, USA)와 함께 5% 탈지유에서 1시간 동안 상온에서 배양하였다. 이후, 막을 TBST로 10분 간 3회 세척하고 ECL 시약(pico EPD, Elpis-Biotec, Korea)과 함께 1분 간 배양한 뒤, 상술한 방법으로 이미지를 수득하였다.
인간 전혈에서 CWAP
N2N3
도메인 및 정제된 인간 또는 래빗 CWAP
N2N3
인식 IgG의 S. aureus 사멸 활성
인간 전혈을 이용한 옵소닌식세포작용에 의한 박테리아 사멸 어세이를 종래 보고된 방법에 따라 수행하였다(van der Maten E et al., 2017. Sci Rep 7:42137). 요약하면, 정제된 CWAPN2N3단백질, 인간 및 래빗 항-CWAPN2N3-IgG를 PBS로 0.5mg/ml로 희석하고, 100μl의 신선한 전혈을 1.5 ml 튜브에 첨가한 뒤, 10μl 단백질 또는 IgG(5μg) 혼합물을 동일한 튜브에 첨가하고 볼텍싱하였다. 마지막으로, 100μl의 USA300 세포(1 x 105 세포/웰)을 첨가 후 10회 부유시키고, 10~20초 간 볼텍싱하였다. 혼합물을 37℃에서 3시간 배양 후, 박테리아를 순차 희석하고 TSB 아가 플레이트 또는 양혈(sheep blood) 플레이트에 도말하여 CFU를 측정하였다.
데이터 프로세싱 및 통계적 분석
달리 기재되지 않는 한, 각 실험은 최소 3회 독립적으로 수행되었으며, 실험결과는 평균±표준편차로 나타내었다. 다른 실험결과는 유사한 결과 값을 가지는 최소 3회의 독립적 실험의 대표값이다. 통계적 유의성은 독립 스튜던트 t-검정 또는 GraphPad Prism 소프트웨어를 이용한 로그 순위법을 통해 측정하였다. P 값이 0.05 이하일 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
실험결과
세포벽 관련 단백질(CWAP)의 세 개의 N2-N3 도메인은 인간 보체인자 H(FH)와 결합한다.
포도상구균 CWAP의 N2-N3 도메인(“CWAPN2N3”로 칭함)이 인간 혈청 내 신규한 리간드 분자를 인식하는지를 조사하기 위하여, 7개 CWAPN2N3의 코딩 영역(6 x His로 태깅된 약 350-370 아미노산, 도 16a 및 16b)을 PCR로 증폭하고 PCR 산물(도 S1)을 pET28a 벡터에 클로닝하여 발현 컨스트럭트(pET28a-CWAPN2N3)를 제조하였다. His-태깅된 재조합 CWAPN2N3를 과량 생산하기 위해, pET28a-CWAPN2N3를 가지는 E. coli BL21(DE3) 세포를 0.2 mM IPTG로 37℃에서 3시간 동안 자극하였다. 니켈-친화도 컬럼으로 정제된 단백질은 예상 분자량인 35~45 kDa에 일치하게 SDS-PAGE 상을 이동하였다(도 16c). 정제된 CWAPN2N3의 수율은 배양 배지 1L 당 15-20 mg로 계산되었다.
CWAPN2N3는 유사한 3차원 구조를 가지므로(Arora S, et al., 2016. Front Microbiol 7:540), 본 발명자들은 피브리노겐(Fg), 피브로넥틴(Fn), 보체인자 H(FH) 및 보체인자 I(FI)의 4개 인간 단백질이 7개의 CWAPN2N3 을 인 비트로에서 인식하는지를 조사하고자 하였다. Ponceau S 염색으로 동량의 단백질이 PVDF 막에 블롯팅되었음을 확인한 뒤, 각 PVDF 막 스트립을 각 7μg의 인간 Fg, Fn, FH 및 FI 단백질과 함께 배양하여 도트 블롯 면역어세이를 수행하였다. 미결합 단백질을 세척한 뒤, 막 위의 결합 단백질을 항-Fg-, Fn-, FH- 및 FI-IgG를 이용하여 시험하였다(도 17a). 상기 조건에서, 인간 Fg는 종래 보고된 바와 같이 FnbpAN2N3와 높은 특이적 결합력을 보인 반면(Deivanayagam CC et al., 2002. Embo j 21:6660-72.), Fn은 FnbpBN2N3와 특이적으로 결합하여(Broker BM et al, 2014. Int J Med Microbiol 304:204-14), 두 FnbpN2N3 단백질이 인간 Fg 및 Fn 단백질과 높은 결합력을 가짐을 알 수 있었다. 또한, 인간 FH는 ClfAN2N3, SdrEN2N3, FnbpAN2N3 및 FnbpBN2N3의 4개 CWAPN2N3에 의해 인식된다. 같은 조건에서, ClfAN2N3, SdrCN2N3, SdrEN2N3, FnbpAN2N3 및 FnbpBN2N3의 5개 CWAPN2N3 단백질은 FI에 대한 결합능력을 보였다. 흥미롭게도, ClfBN2N3 및 SdrDN2N3는 이들 4개의 인간 단백질에 대한 결합능을 보이지 않았다. FnbpA 및 Fg, FnbpBN2N3 및 Fn, 그리고 SdrEN2N3 및 FH 또는 FI 사이의 상호작용은 보고된 바 있으나(Sharp JA, et al., 2012. PLoS One 7:e38407; Bingham RJ et al., 2008. Proc Natl Acad Sci USA 105:12254-8; Burke FM e al., 2011. FEBS J 278:2359-71; Zhang Y et al., 2017. Biochem J 474:1619-163130), ClfAN2N3, FnbpAN2N3, FnbpBN2N3 및 FH, FI 간의 상호작용은 알려진 바가 없다.
만약 이들 CWAPN2N3 도메인이 인간 FH와 결합할 수 있다면, FH-결합 CWAPN2N3 도메인은 FI의 존재 하에 보체인 C3b가 iC3b로 전환되도록 유도할 수 있다. 이러한 가능성을 입증하기 위하여, SdrEN2N3 및 항-FH-IgG 단백질을 모두 양성 대조군으로 사용하였는데, 이는 SdrEN2N3가 인간 FH와 결합한다고 알려졌고(Sharp JA et al., 2012. PLoS One 7:e38407; Zhang Y et al., 2017. Biochem J 474:1619-1631), 항-FH-IgG는 FH에 결합하기 때문이다. 도 17b에서 보는 바와 같이, 7개의 CWAPN2N3 단백질을 양성 대조군 단백질과 함께 마이크로플레이트에 코팅하였으며, 음성 대조군으로 BSA도 코팅하였다. FH와 함께 배양한 뒤, 미결합 FH를 ??어냈다. C3b 및 FI를 첨가한 후, 플레이트를 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 형성된 iC3b를 항-C3-mAb를 이용한 웨스턴 블롯으로 검출하였다(도 17b). 예상대로 BSA-코팅된 분획은 FH/C3b/FI를 첨가해도 iC3b의 42 kDa 절편을 거의 형성하지 못하여(레인 1), BSA가 FH를 유인할 수 없음을 알 수 있었다. 그러나, SdrEN2N3- 및 항-FH-IgG-코팅된 분획은 FH/C3b/FI의 존재 하에 42kDa 절편을 뚜렷하게 형성하였으나(레인 11 및 17), FI/C3b만 첨가 시 그렇지 않았으며(레인 12 및 18), 이를 통해 SdrEN2N3 및 항-FH-IgG가 FH를 끌어들여 FI에 의해 C3b를 iC3b로 변환시킴을 알 수 있었다. 동일한 조건에서, ClfAN2N3, FnbpAN2N3 및 FnbpBN2N3-코팅된 분획은 FH, C3b 및 FI를 첨가함으로써 42 kDa 절편을 생성하였으나(각각 레인 3, 13 및 15), FH가 존재하지 않을 경우 그렇지 않았다(레인 4, 14 및 16). 이러한 결과를 통해 ClfAN2N3, FnbpAN2N3, FnbpBN2N3 및 SdrEN2N3 도메인이 인간 FH와 결합할 수 있으며 FH는 FI를 끌어들임으로써, 인 비트로에서 보체 C3b가 iC3b로 가수분해되도록 함을 다시한번 확인할 수 있었다.
FH-결합 CWAP
N2N3
단백질 첨가에 의해 FH가 S. aureus 세포 표면으로 모이지 못하고, 이로 인해 C3b의 C3b로의 변환이 감소한다.
4개의 S. aureus CWAP가 FH에 결합할 수 있음을 확인하였으므로, FH가 CWAP를 발현하는 살아있는 S. aureus 세포로 이동하는 것이 FH-결합 CWAPN2N3 단백질을 첨가함으로써 억제될 수 있는지를 조사하고자 하였다. 이를 위해, S. aureus USA300 LAC 생균 세포를 FH 및 5개 상이한 단백질(ClfAN2N3, SdrEN2N3, FnbpAN2N3, FnbpBN2N3 및 SdrC)과 함께 배양하였다(도 18a). PBS 하에서, 첨가된 모든 FH 단백질은 박테리아 표면(펠렛)으로 이동하였으며(레인 2), 상등액(레인 1)에는 존재하지 않았다. ClfAN2N3, SdrEN2N3 및 FnbpAN2N3의 경우 첨가된 FH의 거의 절반이 상등액(레인 3, 5 및 7)에, 나머지 절반이 펠렛(레인 4, 6 및 8)에 존재하였다. 예상대로, FnbpBN2N3를 첨가하자 박테리아 표면의 FH 증가가 완전히 억제되어(레인 10), 첨가된 FH 대부분이 상등액에 축적되었다(레인 9). 반대로, FH와의 결합능이 없는 것으로 나타난 SdrCN2N3의 경우(도 17a), 첨가된 모든 FH가 상등액이 아닌 박테리아 표면으로 이동함으로써(레인 12), SdrCN2N3 단백질은 FH와 S. aureus의 결합에 역제효과가 없는 것으로 확인되었다(레인 11). 종합하면, 이러한 결과는 FnbpAN2N3, FnbpBN2N3, SdrEN2N3 및 ClfAN2N3의 4개 FH-결합 단백질이 FH와 결합함으로써 박테리아 표면에서 발현되는 CWAP 단백질의 경쟁적 억제제로 기능함을 말해준다. 4개 단백질 중, FnbpBN2N3는 S. aureus 표면으로의 FH 이동을 현저하게 억제하였다.
이러한 관찰 결과를 추가적으로 검증하기 위해, 본 발명자들은 FH-인식 CWAPN2N3 단백질이 S. aureus USA300 세포 표면에서 FH-매개 iC3b 형성을 차단하는지를 조사하고자 하였다. FH-결합 CWAPN2N3 단백질이 없는 조건 하에서 S. aureus 세포를 FH/C3b/FI와 함께 배양할 경우, 박테리아 표면으로 이동한 FH가 100kDa의 C3b로부터 더 많은 양의 43kDa iC3b 절편을 생성할 것이라 예상되었으며, FH-결합 CWAPN2N3 단백질을 첨가할 경우 CWAPsN2N3단백질이 FH를 포집하기 때문에 소량의 FH 만이 박테리아 표면으로 이동하여 더 적은 량의 43kDa iC3b가 박테리아 표면에 축적될 것으로 예상되었다. 이러한 가능성을 확인하기 위해 S. aureus USA300 세포를 FH/C3b/FI 및 각 5개 단백질과 함께 배양하자(도 18b), PBS 및 SdrC 첨가 분획에서 생성된 iC3b의 양은 4개의 FH-결합 CWAPN2N3 단백질에서보다 높았다(각각 레인 1 및 3 vs 레인 2, 4-6). 이러한 결과는 FH-결합 CWAPN2N3 단백질이 FH를 포집함으로써 C3b에서 iC3b로 전환되는 것을 억제하고 이를 통해 박테리아 표면에서 FI-매개된 C3b에서 iC3b로의 전환을 차단함을 보여준다.
래빗 항-CWAP
N2N3
F(ab')
2
절편은 FH의 S. aureus 표면으로의 이동을 억제한다.
다음으로, 래빗 항-FH-결합 CWAPN2N3-IgG 도 역시 S. aureus USA300 생균 세포표면으로 FH가 이동하는 것을 억제할 수 있는지를 조사하고자 하였다. 이를 위해 래빗 항-인간 FH-IgG 또는 래빗 항-CWAPN2N3-IgG를 사용하는 데에는 S. aureus 단백질이 IgG의 Fc 도메인에 결합함으로써 비특이적으로 IgG를 포집한다는 점에서 난점이 있었다. 이를 해결하기 위해, 고유의 FH-IgG에 펩신을 처리하여 6개의 상이한 F(ab')2 절편을 제작하였다(도 23). 도 24a에서 보는 바와 같이, 정제된 항-FH-Fab'2 및 5개의 항-CWAPN2N3 F(ab')2 절편은 비환원 조건에서 100 kDa, 환원조건 하에서 25 kDa 크기를 나타내어 모든 항-F(ab')2 절편이 적절하게 제작되었음을 확인하였다. 동계 항원에 대한 6개의 정제된 항-F(ab')2 절편의 결합 특이성을 조사한 결과, ClfAN2N3, FnbpAN2N3, FnbpBN2N3 및 FH의 4개 F(ab')2 절편이 이들의 동계 항원을 특이적으로 인식하였으나(도 24b 및 24c), SdrCN2N3 및 SdrEN2N3의 2개 F(ab')2 절편은 SdrDN2N3 및 FnbpBN2N3를 각각 약하게 인식하여(도 24c), 제작된 6개 F(ab')2 절편이 원하는 특성을 갖추었음을 확인하였다.
도 19a에서 보는 바와 같이, USA300 세포를 FH와 공배양할 경우 FITC-접합 항-FH-Fab'2 절편은 박테리아 표면으로 이동된 FH를 잘 인식하여 FH가 USA 300 생균 세포의 CWAP 단백질에 결합함을 알 수 있었다. 나아가, 생 박테리아의 4개 CWAPN2-N3 단백질과 FH의 결합 특이성을 조사하기 위해, S. aureus USA300 세포(2 x 107 세포)를 먼저 5개의 상이한 항-CWAP F(ab')2 절편(단백질량 각 20μg)와 배양하고 박테리아 세포를 세척하여 미결합 항-CWAP F(ab')2 절편을 제거하였다. 이후, S. aureus USA300 세포를 정제된 FH(단백질량 각 30μg)와 배양한 뒤 박테리아 세포를 세척하여 미결합 FH를 제거하였다. 이후, 각 항-CWAP F(ab')2 절편-처리된 박테리아 세포 표면으로 이동된 FH의 양을 FITC-접합 항-FH-Fab'2 절편을 이용한 FACS 분석으로 조사하였다(도 19a). 3개의 항-CWAPN2N3-F(ab')2 절편(SdrE, FnbpA 및 FnbpB)을 처리한 박테리아 세포는 항-F(ab')2 절편-미처리 세포에 비하여 FH의 결합이 특이적으로 억제되었으나(도 19a의 c-e vs a), 항-ClfA F(ab')2 절편의 처리는 낮은 수준의 억제 효과만을 보였다(도 19a의 b). 예상대로, 20μg의 항-SdrC-F(ab')2 절편을 처리해도 FH와 USA300 세포의 결합에 영향을 미치지 못했다(도 19a의 f). 종합하면, 이러한 결과는 정제된 4개의 항-CWAPN2N3 항체가 생 박테리아 표면에서 발현되는 CWAP 단백질과 FH의 결합을 차단할 수 있음을 다시 한번 확인하는 것이다.
FACS 데이터에 기반하여, 박테리아 표면으로 이동한 FH 양을 정량하였다(도 19b). 예상대로, 항-FnbpB-F(ab')2 절편은 FH의 S. aureus 세포 표면에의 결합을 대조군 대비 60% 억제하였다(컬럼 6 vs 1). 억제능은 항-SdrE (50%, 컬럼 4) > FnbpA(40%, 컬럼 5) > ClfA-Fab’2(30%, 컬럼 6)의 순서로 점차 감소했다. 항-SdrC-F(ab')2 절편은 거의 억제효과를 보이지 못했으며(10%, 컬럼 3), 이러한 결과는 도 2a의 결과와 일치하는 것이다.
정제된 래빗 FH-결합 CWAP
N2N3
단백질 및 이들의 항체는 S. aureus USA300 세포에 대한 인간 전혈-매개 박테리아 사멸 활성을 강화한다
본 발명자들은 인간 정맥주사 IgG(IVIg) 및 래빗 혈청으로부터 각각 IgG를 인식하는 인간 및 래빗 항-CWAPN2N3 도메인을 수득한다면 이들 항-FH-결합 CWAPN2N3-인식 IgG가 S. aureus CWAP 단백질에 결합할 것이며, 이러한 결합을 통해 S. aureus 표면으로 FH가 이동하는 것을 차단하고, 궁극적으로 숙주 식세포에 의한 C3b-매개 옵소닌식세포작용을 강화할 수 있을 것이라 가정하였다. 이를 입증하고자 항-ClfAN2N3, 항-SdrEN2N3, 항-FnbpAN2N3 및 항-FnbpBN2N3-IgG와 같은 정제된 인간 및 래빗 항-CWAPN2N3 인식 IgG를 정제하였다. 이들 4개 IgG의 정제는 이들의 특이적 단백질-접합 세파로스 컬럼을 이용하여 수행되었다. 건강한 인간 혈청은 항-S. aureus CWAP-특이적-항체를 포함한다고 알려졌으므로(Dryla A et al., 2005. Clin Diagn Lab Immunol 12:387-98), 인간 혈청원으로 상업적으로 구입 가능한 인간 IVIg를 사용하였다. 래빗 혈청은 CWAPN2N3도메인을 래빗에 3회 접종하여 수득하였다. 인간 IVIg 또는 항-CWAPN2N3 도메인-접종된 래빗 혈청을 CWAPN2N3-접합 컬럼에 로딩한 뒤, 래빗 항-CWAPN2N3도메인 인식-IgG(도 24) 및 인간 항-CWAPN2N3 도메인 인식-IgG(도 25)를 용출하였다. 그 결과, 인간 IVIg는 약 0.1%의 항-CWAPsN2N3 도메인-인식 IgG를, 래빗 혈청은 약 1%의 항-CWAPN2N3 도메인-인식 IgG를 각각 함유하였다. 이들 4개 IgG의 순도를 SDS-PAGE에서 환원 및 비환원 조건에서 조사한 결과(도 26), 정제된 IgG는 비환원 조건에서 사량체(tetramer)를 형성함을 할 수 있었다.
다음으로, 정제된 래빗 및 인간 IgG의 각 항원(FnbpAN2N3, FnbpBN2N3, ClfAN2N3 및 SdrEN2N3 도메인)에 대한 특이성을 웨스턴 블롯 또는 도트 블롯으로 각각 조사하였다. 도 20a에서 보는 바와 같이, 4개의 래빗 항-CWAPN2N3-인식 IgG는 7개 CWAPN2N3 도메인에 대한 이들의 동계 항원을 특이적으로 인식하나, 정제된 인간 항-CWAP-IgG는 ClfA을 제외한 광범위한 인식 패턴을 보였다(도 20b). 예를 들어 항-SdrEN2N3-IgG는 ClfA 및 3개의 Sdr 패밀리의 4개 항원을 인식하였다. 또한, 항-FnbpAN2N3 도메인은 3개의 Sdr 및 2개의 FNBP 패밀리의 5개 항원을 인식하였다. 항-FnbpBN2N3-IgG 역시 ClfBN2N3, SdrEN2N3 및 2개의 FnbpN2N3 단백질의 4개의 항원을 인식하였다(도 20b). 이러한 결과는 인간 항-CWAPN2N3-IgG가 래빗 항-CWAPN2N3-IgG에 비해 보다 광범위한 인식 패턴을 가짐을 말해준다.
마지막으로 본 발명자들은 CWAPN2N3 도메인 또는 이들 정제된 항체의 옵소닌식세포작용-매개 박테리아 사멸 활성을 조사하고자 하였다. S. aureus USA300 세포(1 x 105 세포)를 100μl 인간 전혈 내 CWAPN2N3 도메인 단백질(5μg)과 함께 37℃에서 3시간 배양한 뒤, S. aureus USA300 LAC 세포의 CFU(colony-forming unit)를 측정하였다. 각 CWAPN2N3 도메인을 첨가하자, CFU는 대조군에 비해 유의하게 감소하였다(도 21a). 이러한 결과는 CWAPN2N3도메인이 S. aureus 세포 표면으로 FH가 이동하는 것을 억제하여 C3b 축적을 증가시키고 숙주 식세포에 의한 C3b-매개 옵소닌식세포작용을 유도할 수 있음을 뒷받침한다. 마찬가지로, 인간 전혈을 이용하여 S. aureus USA300 LAC 세포에 대한 인간 및 래빗 항-CWAPN2N3-IgG-매개 박테리아 사멸효과를 조사하였다(도 21b 및 21c). 인간 항-CWAPN2N3-IgG(5μg)를 100μl 인간 전혈에서 S. aureus USA300 LAC 세포(1 x 105세포)와 3시간 동안 37℃에서 배양하자, CFU는 PBS, 인간 IVIg 및 순수 래빗 혈청과 같은 대조군에 비해 2-4배 감소하였다(도 21b 및 21c). 나아가, 항-ClfAN2N3 및 FnbpBN2N3 IgG의 혼합물을 박테리아 및 전혈 혼합물에 첨가하자, 역시 CFU가 대조군 대비 감소하였다(도 21b). 또한, 5μg의 래빗 항-ClfA, 항-FnbpB 및 항-FNBPAN2N3-IgG의 혼합물을 박테리아 및 전혈 혼합물에 첨가하자 CFU가 순수 래빗 IgG보다 2배 감소하였다(도 21c). 래빗 IgG의 경우, 4개 IgG 혼합물이 하나의 IgG보다 더 높은 박테리아 사멸 활성을 보였다. 종합하면, 이러한 결과는 항-CWAPN2N3 도메인 IgG가 인간 전혈과 배양 시 S. aureus USA300 LAC 균주에 대한 특이적 박테리아 사멸 활성을 가짐을 말해준다.
실시예 3: 혈액 응고 억제 인자의 선정
실험방법
재조합 Coa 및 vWbp 단백질의 정제
폴리히스티딘-태깅된 6개의 재조합 단백질(Coawhole, CoaN, CoaC, vWbpwhole, vWbpN 및 vWbpC)을 클로닝하고 E. coli 발현 시스템을 이용하여 발현시켰다. 이들의 유전자는 USA300 지놈 서열로부터 Q5 High Fidelity DNA 중합효소(Thermo Fisher Scientific)를 이용한 PCR을 통해 증폭하였다. PCR 산물을 pET28a-벡터로 클로닝하여 N-말단 또는 C-말단에 6 x His-태깅된 단백질을 발현시켰다. 클로닝된 재조합 단백질을 정제하기 위해, 6 x His-태그를 N- 및 C-말단 양쪽에 삽입하고, 수득된 클론을 시퀀싱하여 구조를 확인하였다. 재조합 단백질들은 0.2mM 이소프로필-lβ-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG, 0.2mM 농도)를 이용하여 BL21 pLysS E.coli에서 발현되었다. 발현된 단백질은 Ni-세파로스 6 고속 레진(GE healthcare, 17-5318-01, 5ml)과 로딩 완충액(20mM 인산나트륨, 0.1% triton X-100, 150mM NaCl, 5mM 이미다졸, pH7.4), 세척 완충액(20mM 인산나트륨, 150mM NaCl, 5mM 이미다졸, pH7.4) 및 용출 완충액(20mM 인산나트륨, 150mM NaCl, 500mM 이미다졸, pH7.4)을 이용하여 정제하였다.
정제된 재조합 Coa 및 vWbp 도메인 단백질의 SDS-PAGE 분석
3μg의 각 도메인 단백질(Coawhole, CoaN, CoaC, vWbpwhole, vWbpN, vWbpC)을 4 X 로딩 샘플링 완충액(LSB, SH+)과 혼합하고 15% SDS-PAGE 겔에 1시간 동안 로딩하였다(35mA, 600V, 100W).
Coa 및 vWbp 단백질 항체 수득을 위한 래빗 접종
500μl의 PBS에 용해된 S. aureus Coa 및 vWbp 단백질의 정제된 단일 성분 500μg을 500μl의 완전 프로인트 보조제(Sigma-Aldrich)와 혼합하여 에멀젼을 제작하였다. 각 에멀젼을 래빗에 피하주사 후 2주 뒤, 동량의 항원을 500μl의 불완전 프로인트 보조제(Sigma-Aldrich)와 혼합하여 피하주사하였다. 2주 뒤, 래빗 귀정맥으로부터 혈액 500μl를 취하고 각 항원의 IgG 형성 여부를 웨스턴 블롯으로 조사하였다. 항체가 형성된 경우, 래빗 전혈을 수집하여 혈청을 수득하고 사용 전까지 -80℃에서 보관하였다.
Coa 및 vWbp의 상이한 도메인 단백질에 대한 항체-특이성의 조사
3μg의 각 도메인 단백질(Coawhole, CoaN, CoaC, vWbpwhole, vWbpN, vWbpC) 및 음성 대조군 단백질(BSA)을 PVDF 막(0.22μm, Immobilon-PSQ Transfer Membrane, Merck, USA)dp 스폿팅하고 건조시켰다. 막을 TBS 내 5% 탈지유로 2시간 동안 상온에서 블로킹하고 5% 탈지유에서 3,000:1로 희석된 1차 항체(항-Coawhole, -CoaN, -vWbpwhole, -vWbpN)와 함께 1시간 동안 상온에서 배양하였다. 막을 TBST로 10분간 3회 세척하고 5% 탈지유에서 6000:1로 희석된 2차 항체(마우스 항-래빗 IgG HRP, Santacruz, USA)와 함께 1시간 동안 상온에서 배양하였다. 이후 막을 TBST로 10분간 3회 세척하고 ECL 시약 (pico EPD, Elpis-Biotec, Korea)과 함께 1분 간 배양하였다.
S. aureus USA300 배양 동안 Coa 및 vWbp 단백질의 발현 패턴
USA300를 10ml RPMI에서 37℃, 180 rpm으로 밤새 배양하였다. 이후 1ml의 박테리아 씨드(seed) 배양 용액을 50ml RPMI에 첨가하고, 37℃, 180rpm으로 배양하면서, 각 시간(0 h, 1.5 h, 3 h, 6 h, 9 h, 12 h) 별로 박테리아 배양 용액 1ml를 취하였다. 이후 채취한 박테리아 배양 용액의 흡광도(OD600)를 측정하고, 상온에서 3분 동안 4,400 x g로 원심분리하였다. 20μl의 박테리아 상등액을 15% SDS-PAGE 겔에 로딩하고, 전기영동 후 밴드를 4℃에서 PVDF 막으로 옮겼다. 막을 TBST 내 5% 탈지유로 1시간 동안 상온에서 블로킹하였다. 이후 막을 1차 항체인 항-래빗-Coawhole- 및 항-래빗-rvWbpwhole-IgG와 함께 배양하였다. 막을 TBST로 3회 세척하고 2차 항체인 마우스 항-래빗-IgG-HRP(Santacruz, USA)와 함께 배양하였다. ECL 시약을 1분간 처리한 뒤, 이미지를 수득하였다.
S. aureus 세포 표면에서 발현되는 Coa 및 vWbp-인식 단백질의 동정
3μg의 CoaC 단백질 또는 20μg의 항-FnBp-F(ab′)2′및 음성 대조군인 항-SdrC-F(ab′)2 절편과 함께 박테리아(USA300, 1 x 105 CFU)를 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이후, 시료를 4℃에서 3분 동안 4,400 x g로 원심분리하고 박테리아 펠렛을 500μl PBS로 2회 세척하였다. 각 부유된 박테리아 펠렛을 15% 구배 SDS-PAGE 겔에 로딩하고, 전기영동 후 밴드를 4℃에서 0.45 μm PVDF 막(Immobilon-P Transfer Membrane, Merck, USA)으로 옮겼다. 막을 TBST 내 5% 탈지유로 상온에서 1시간 동안 블로킹하고, 1차 항체인 항-래빗 -CoaC-IgG와 함께 배양하였다. 이후, TBST로 3회 세척하고 2차 항체인 마우스 항-래빗 IgG HRP(Santacruz, USA)와 함께 배양하였다. ECL 시약을 1분간 처리한 후, 이미지를 수득하였다.
정제된 Coa
whole
또는 vWbp
whole
각 용량에 의한 혈액 응고의 유도
히루딘 처리된 인간 혈액 200μl를 5ml 둥근바닥 튜브에 넣고 다양한 용량의 Coawhole 및 vWbpwhole(1μg, 5μg, 10μg, 20μg, 40μg, 50μg) 또는 PBS를 첨가하였다. 시료를 상온에서 배양하고 튜브를 1.5 시간 간격으로 45°각도로 기울이면서 혈액 응고를 확인하였다.
각 용량의 정제된 항-Coa
whole
-IgG 또는 항-vWbp
whole
-IgG에 의한 혈액 응고 차단 측정
히루딘 처리된 인간 혈액 200μl를 5ml 둥근바닥 튜브에 넣고 다양한 용량의 항-Coawhole-IgG 및 항-vWbpwhole-IgG(10μg, 20μg, 40μg, 80μg, 100μg)를 첨가하였다. 이후, 5μg의 Coawhole 및 vWbpwhole 또는 PBS를 첨가하였다. 시료를 상온에서 배양하고 튜브를 1.5 시간 간격으로 45°각도로 기울이면서 혈액 응고를 확인하였다.
항-Coa
whole
IgG 또는 항-vWbp
whole
IgG에 의한 Coa 및 vWbp-매개 혈액응고의 억제효과
S. aureus USA300 LAC 세포를 50ml RPMI에서 2시간 동안 37℃, 180rpm으로 배양하고, 박테리아를 4,400 x g로 4℃에서 3분간 원심분리한 다음 박테리아 상등액 100μl를 히루딘 처리 인간 혈액 200μl에 첨가하였다. 5μg의 vWbpwhole 및 1μg의 Coawhole를 히루딘 처리 인간 혈액 200μl에 첨가하여 양성 대조군으로 사용하였다. 항-Coawhole-IgG 80μg 및 항-vWbpwhole-IgG 80μg 또는 항-Coawhole-IgG와 항-vWbpwhole-IgG 각 40μg 혼합물을 먼저 히루딘 처리 인간 혈액 200μl에 첨가하고, 이후 100μl의 박테리아 상등액을 첨가하였다. 시료를 상온에서 배양하고 튜브를 1.5 시간 간격으로 45°각도로 기울이면서 혈액 응고를 확인하였다.
인 비보에서의 항-Coa
whole
-IgG 또는 vWbp
whole
-IgG에 의한 혈액응고의 억제효과
Coawhole 및 vWbpwhole의 인 비보 효과를 검증하기 위해, 이들을 토끼에 주사하여 수득한 항체로 인 비보 수동 면역(passive immunity) 실험을 수행하였다. 먼저, 4마리 토끼를 2마리씩 2그룹으로 나누었다(도 37). 첫번째 그룹은 PBS를 주사한 후 S. aureus USA300 균을 1.6 x 108 CFU를 귀정맥으로 주사하였고, 두 번째 그룹은 coawhole 단백질-접합 세파로스 컬럼으로 정제한 1 mg의 항-coawhole-IgG와 vWbpwhole 단백질-접합 세파로스 컬럼으로 정제한 1 mg의 항-vWbpwhole-IgG를 혼합하여 왼쪽 귀정맥으로 주사한 후 1 시간 뒤 USA300 균 1.6 x 108 CFU를 오른쪽 귀정맥으로 주사하였다. 이후 각 토끼들의 체중 변화 및 생존률을 조사하였다.
실험결과
재조합 S. aureus 코아귤라제 및 vWF(vonWillebrand Factor)-결합 도메인 단백질(vWbp)의 클로닝과 정제
S. aureus Coa 및 vWbp 단백질이 S. aureus의 주요 독성 인자로 작용한다고 제안되었기 때문에, 본 발명자들은 이들 인자가 감염 과정에서 단순 분비되기 보다는 혈관에서 피브린 응고를 형성함으로써 숙주 면역체계를 회피하기 위하여 특정 수용체를 경유하여 박테리아 표면에 결합할 것이라 가정하였다. 이는 몇몇 밝혀지지 않은 수용체 단백질이 박테리아 표면에 존재함을 시사하는데, 만약 박테리아 표면의 이러한 수용체를 발견할 수 있다면, 이에 대한 항체를 이용하여 Coa 또는 vWbp와 상기 수용체 간의 결합을 차단하여 S. aureus 감염 과정에서의 피브린 응고 형성을 막을 수 있을 것이다. 박테리아 표면에서 발현되는 이들 수용체를 동정하기 위해, Coa 및 vWbp 도메인을 포함하는 재조합 단백질과 이들에 대한 항체를 제조하고자 하였다.
도트 블롯을 이용한 Coa 및 vWbp의 상이한 도메인 단백질에 대한 항체-특이성의 조사
도 27에서 보는 바와 같이, S. aureus USA300 LAC 균주의 지놈 서열을 기반으로 Coa 및 vWbp 전장 단백질, Coa 및 vWbp의 N-말단 D1-D2 도메인 및 Coa 및 vWbp의 C-말단 반복 도메인의 총 6개 단백질을 제작하였다. Coa 및 vWbp 전장 단백질은 각각 607 및 508 아미노산(aa)으로 구성되었고, Coa 및 vWbp의 N-말단 도메인은 284 및 253 aa로, C-말단 반복 도메인은 297 및 233으로 각각 구성되었다. 이들 유전자를 클로닝한 뒤, 6개의 상이한 재조합 단백질(Coa-whole, Coa-N, Coa-C, vWbp-whole, vWbp-N 및 vWbp-C)을 발현시킨 뒤 도 28에서 보는 바와 같이 균일하게 정제하였다. 이들 단백질은 2회 피하 접종을 통해 래빗 다클론 항-Coa 및 vWbp-인식 IgG를 생성시키는 데에 사용되었다. 정제된 각 단백질의 IgG 의 항원 인식 특이성을 조사한 결과 항-Coawhole-IgG는 Coawhole, CoaN 및 CoaC를 인식한 반면 항-CoaN-IgG는 Coawhole 및 CoaN만을 인식하고, CoaC를 인식하지 못하였다(도 29a). 또한, 항-vWbp-IgG 역시 이들의 항원에 대한 특이적 결합을 보였다(도 29b). 이러한 결과는 생성된 4개의 Coa 및 vWbp-IgG가 그들 항원에 대한 적절한 특이성을 가짐을 말해준다.
S. aureus USA300 배양 동안 Coa 및 vWbp 단백질의 발현 패턴
6개의 단백질과 이들의 래빗 다클론 항체를 모두 수득하였으므로, 이들 2개 분비 효소의 발현 패턴을 각 시점 별로 S. aureus USA300 균주를 배양한 RPMI 배지를 이용하여 웨스턴 블롯으로 조사하였다. 도 30a에서 보는 바와 같이, Coawhole 단백질(60kDa)은 1.5시간 배양 시점에서 분비되고, 배양 3시간째에 최대량이 검출된 뒤 점차 감소하면서 9시간째까지 검출 되었다. 예상대로, S. aureus 단백질 A(45 kDa)는 배양 3시간째까지 배양 상등액에 축적되었다(붉은 화살표). 그러나, vWbp(50 kDa)는 배양 1.5시간째에 최대량이 검출된 뒤 점차 감소하면서 12시간째까지 검출되었다(도 30b). 단백질 분비는 Coa와 유사한 패턴을 보였다(도 30b). 이로부터 Coawhole 및 vWbpwhole 단백질이 1.5시간에서 3시간 사이에 최대량이 분비됨을 알 수 있다.
S. aureus 세포 표면에서 발현되는 Coa 및 vWbp-인식 단백질의 동정
본 발명자들은 박테리아가 생장하는 동안 박테리아 표면에서 발현되는, Coa 및 vWbp를 인식하는 단백질을 동정하고자 하였다. 우선, 이들 두 분비 단백질들이 인식할 가능성이 있는 분자로서 S. aureus 세포벽 관련 단백질(CWAP)을 주목하였다. 본 발명자들은 도트 블롯 면역어세이를 이용하여 7개의 재조합 CWAP 단백질을 Coa- 및 vWbp- 인식 단백질의 스크리닝에 적용하였다(도 31). 이들 7개 CWAP 단백질과 대조군인 BSA를 PVDF 막 스트립에 스폿팅한 뒤, 각 스트립을 6개의 정제된 재조합 Coa 및 vWbp 도메인 단백질과 공배양하고 스트립을 각 도메인-특이적 IgG와 배양하여 Coa- 또는 vWbp의 어떠한 도메인이 CWAPN2N3 단백질과 결합하는지를 조사하였다. 도 31a에서 보는 바와 같이, Coawhole, CoaN 및 CoaC 단백질은 FnbpAN2N3 와 FnbpBN2N3 도메인을 특이적으로 인식하였다. 동일한 조건에서, vWbpwhole 단백질은 5개의 상이한 N2-N3 도메인인 ClfBN2N3, SdrCN2N3, SdrEN2N3, FnbpAN2N3 및 FnbpBN2N3 도메인에 대한 결합 능력을 나타냈으며 vWbpN 도메인은 FnbpAN2N3와 강하게 결합하고 나머지 3개의 CWAP 단백질과는 약하게 결합하였다(도 31b). 그러나, vWbp-C 단백질은 ClfAN2N3 및 SdrDN2N3를 제외한 나머지 N2-N3 도메인들에 대해 보다 광범위한 결합력을 보였다. 이러한 결과는 Coa 단백질이 박테리아 표면에서 발현하는 Fnbp 단백질을 인식하며, 이에 2개의 S. aureus Fnbp CWAP 단백질이 Coa-인식 단백질로 기능할 수 있음을 시사한다. 그러나, vWbp 단백질은 몇몇 S. aureus CWAP에 의해 광범위하게 인식된다.
항-Fnbp F(ab')
2
절편을 이용한 Coa와 Fnbp 단백질 간의 결합 특이성 확인
Coa 단백질과 2개의 FnbpN2N3 단백질 간의 특이적 결합이 관찰되었으므로, S. aureus USA300 생균 박테리아, Coawhole 및 항-Fnbp-F(ab')2 절편을 이용하여 이를 다시 확인하고자 하였다. 항-Fnbp-F(ab')2 절편을 제작한 이유는 S. aureus 단백질 A가 IgG Fc 도메인에 결합함으로써 첨가된 IgG를 소모시키는 것으로 알려졌기 때문에 항-Fnbp-IgG가 Coawhole 및 USA300 세포의 Fnbp 단백질 간의 상호작용을 잘 억제하지 못할 것이라 예상되었기 때문이다. 항-Fnbp-F(ab')2 절편을 이용함으로써, Coa 및 2개의 FnbpN2N3 단백질 간의 결합이 특이적인지 여부를 확인할 수 있을 것이라 가정하였다. 도 32에서 보는 바와 같이, S. aureus 세포를 CoaC 단백질 또는 CoaC과 항-SdrC-F(ab')2절편의 혼합물과 함께 배양하면, CoaC-단백질이 박테리아 펠렛으로 이동한다(레인 1 및 2). 그러나, 박테리아 세포를 CoaC 및 항-FnbpAN2N3-F(ab')2 절편 또는 항-FnbpBN2N3-F(ab')2 절편과 함께 배양하면, 첨가된 CoaC는 박테리아 펠렛으로 이동하지 않는데(레인 3 및 4), 이를 통해 박테리아 표면에서 발현하는 Fnbp들과 CoaC 단백질 간의 상호작용은 항-Fnbp-F(ab')2 절편에 의해 특이적으로 억제됨을 알 수 있다. 이러한 결과로부터 Coa 단백질이 박테리아 표면에서 발현되는 Fnbp 단백질을 인식함을 확인하였다.
Coa
whole
또는 vWbp
whole
에 의한 혈액 응고 유도 및 항-Coa
whole
-IgG 또는 vWbp
whole
-IgG에 의한 혈액 응고 억제 효과
다음으로, 본 발명자들은 인간 전혈을 이용하여 재조합 Coawhole 및 vWbpwhole의 생물학적 기능을 조사하고자 하였다. 인간 혈액을 다양한 용량의 Coawhole 단백질과 함께 배양하자, 1μg의 Coawhole 단백질을 첨가할 경우 혈액이 응고되었으며, 5μg의 vWbpwhole을 첨가하자 혈액이 응고되었기에(도 33a), 정제된 재조합 Coawhole 및 vWbpwhole 단백질이 기능적으로 활성인 단백질임을 확인하였다. 다음으로, 본 발명자들은 항-Coawhole-IgG 및 항-vWbpwhole-IgG가 Coa- 및 vWbp-매개 혈액 응고에 미치는 효과를 조사하고자 하였다(도 33b). 80μg의 항-Coawhole-IgG 또는 80μg의 항-vWbpwhole-IgG를 인간 혈액과 5μg의 Coawhole 또는 vWbpwhole 단백질의 혼합물에 첨가하자, 모두 효소-매개 혈액 응고가 억제되었다. 이를 통해, 생성된 항-Coawhole- 및 vWbpwhole-IgG가 인 비트로에서 Coawhole- 또는 vWbpwhole 단백질-매개 혈액응고 반응을 억제함을 확인하였다.
항-Coa
whole
-IgG 및 항-vWbp
whole
-IgG는 USA300 배양 배지-매개 인간 혈액 응고를 억제한다.
도 30에서 보듯 이미 S. aureus 300 LAC 세포 배양시 분비된 Coa 및 vWbp가 검출되었으므로, 분비된 Coa 및 vWbp-매개 혈액 응고가 항-Coawhole-IgG 및 항-vWbpwhole-IgG에 의해 차단되는지를 조사하고자 하였다. 200μl의 인간 전혈을 100μl의 USA300 배양 배지(약 0.5μg의 Coa 및 0.5μg의 vWbp 단백질 함유)와 함께 배양하자, 배양 1.5시간 뒤 혈액이 응고되었다(도 34 튜브 4). 동일한 조건에서 80μg의 정제된 항-Coawhole-IgG 또는 항-vWbpwhole-IgG를 첨가하자, 혈액은 응고하지 않았다(튜브 6 및 7). 또한, 각 40μg의 항-Coawhole-IgG 또는 항-vWbpwhole-IgG를 Coa 또는 vWbp-함유 혈액에 첨가하자 응고가 유도되었다(튜브 8). 이러한 결과를 통해 생균 박테리아에서 분비된 Coa 또는 vWbp가 첨가된 IgG에 의해 억제됨을 알 수 있다.
Coa
N
및 vWbp
N
도메인은 인간 혈액 응고를 유도하였으나 Coa
C
및 vWbp
C
단백질은 그렇지 않았다
Coa 및 vWbp 단백질의 어떠한 도메인이 인간 혈액 응고에 관여하는지를 조사하기 위해, 전혈을 CoaN, vWbpN, CoaC 및 vWbpC의 4개의 단백질과 배양하였다. 배양 1.5시간 뒤, CoaN 및 vWbpN의 2개 N-말단 도메인만이 혈액 응고를 유도하였으나, 두 개의 C-말단 도메인은 그렇지 않았다(도 35). 이러한 결과로부터 피브리노겐-결합 C-말단 도메인이 아닌 프로트롬빈-결합 N-말단 도메인이 인간 혈액 응고에 필수적임을 알 수 있었다.
Coa
N
및 vWbp
N
-매개 인간 혈액 응고 또는 USA300에서 분비된 Coa 및 vWbp에 의한 혈액 응고는 항-Coa
C
및 항-vWbp
C
IgG가 아닌 항-Coa
N
-IgG 및 항-vWbp
N
-IgG에 의해 억제된다
CoaN 또는 vWbpN가 혈액 응고에 중요하다는 사실을 관찰하였으므로, 항-CoaN- 또는 vWbpN-특이적 IgG가 이들 단백질-매개 응고를 차단할 수 있는지를 조사하기 위해 두 개의 트리거(trigger) 단백질을 사용하였다. 하나는 USA300 배양 배지에 포함된 Coa 및 vWbp이고(도 36a), 다른 하나는 정제된 재조합 CoaN 또는 vWbpN이다(도 36b). 항-CoaN-IgG 또는 항-vWbpN-IgG를 배양 배지와 혈액이 담긴 튜브(튜브 2)에 첨가하자 응고가 유도되지 않았으나(튜브 3 및 4), 항-CoaC-IgG 또는 항-vWbpC-IgG를 첨가할 경우 응고가 유도되었다(튜브 5 및 6). 또한, CoaN 및 vWbpN-매개 인간 혈액 응고는 항-CoaN-IgG 및 항-vWbpN-IgG에 의해 억제되었다(도 36b, 튜브 4 및 5). 이러한 결과는 항-CoaN-IgG와 항-vWbpN-IgG가 S. aureus 감염에 의한 Coa 또는 vWbp-매개 혈액 응고의 방지에 중요한 분자임을 말해준다.
인 비보에서의 항-Coa
whole
-IgG 또는 vWbp
whole
-IgG에 의한 혈액응고의 억제효과
본 발명자들은 Coawhole, vWbpwhole, CoaN 및 vWbpN 도메인이 인간 혈액의 응고 유도 활성이 있다는 사실과 이들 4 종류 단백질을 토끼에 접종하여 수득한 각 다클론 항체가 이들 단백질들에 기인하는 혈액응고 반응을 선택적으로 억제함을 관찰하였으므로, Coawhole 및 vWbpwhole 단백질을 토끼에 주사하여 수득한 항체로 인 비보 수동 면역(passive immunity) 실험을 수행하였다.
4마리 토끼 중 첫번째 그룹 2마리에 PBS를 주사 후 S. aureus USA300 균을 1.6 x 108 CFU를 귀정맥으로 주사하였고, 두번째 그룹 2마리에 coawhole 단백질-접합 세파로스 컬럼으로 정제한 1 mg의 항-coawhole-IgG와 vWbpwhole 단백질-접합 세파로스 컬럼으로 정제한 1 mg의 항-vWbpwhole-IgG를 혼합하여 왼쪽 귀정맥으로 주사한 후 1 시간 뒤 USA300 균 1.6 x 108 CFU를 오른쪽 귀정맥으로 주사하였다.
| 그룹 | 토끼 번호 | 체중(g) | USA 300 수 |
| 식염수 | 1 | 3180 | 1.6 x 108 /100μl |
| 4 | 3005 | ||
| 항-coawhole-IgG + 항-vWbpwhole-IgG |
2 | 3220 | |
| 3 | 2980 |
토끼 체중을 12시간 간격으로 측정한 결과, 1군의 1번 토끼는 138시간 후에 죽었지만 2군의 모든 토끼는 167시간 까지 생존하면서 체중 감소도 가장 적게 관찰되었다(도 38). 이를 토대로 생존율을 계산한 결과, 항-vWbpwhole-IgG와 항i-vWbpwhole-IgG를 1 mg 씩 주사한 2 군의 토끼(2번 및 3번)는 7일간 생존하면서 체중도 가장 덜 감소하는 결과를 얻었다(도 39). 이상의 결과를 통해 인 비트로에서 확인된 항-coa-IgG와 항-vWbp-IgG의 혈액 응고 억제 효과를 인 비보 상에서 다시 한번 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Clips
<120> A Novel Composition for Preventing or Treating Staphylococcus
aureus infectious diseases
<130> HPC-9540
<160> 54
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vector-pET28a-F primer
<400> 1
catggtatat ctccttctta aagttaaac 29
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vector-pET28a-R primer
<400> 2
caccaccacc accaccactg agatc 25
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-6 His-LukS-R primer
<400> 3
gtggtggtgg tggtgattat gtcctttcac tttaatttca tgagttttc 49
<210> 4
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-6 His-LukS-F primer
<400> 4
ctttaagaag gagatatacc atggataaca atattgagaa tattggtgat ggcg 54
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-6 His-LukST244A-R primer
<400> 5
catggtatat ctccttctta aagttaaac 29
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-6 His-LukST244A-F primer
<400> 6
ctattgccat agtgtgctgt tcttctagta gcatgag 37
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-6 His-LukF-R primer
<400> 7
gtggtggtgg tggtggctca taggattttt ttccttagat tgag 44
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-6 His-LukF-F primer
<400> 8
ctttaagaag gagatatacc atggctcaac atatcacacc tgtaagtgag 50
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-6 His-HlgA-R primer
<400> 9
gtggtggtgg tggtgcttag gtgtgatgct tttaattttt acttc 45
<210> 10
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-6 His-HlgA-F primer
<400> 10
ctttaagaag gagatatacc atggaaaata agatagaaga tatcggccaa ggtgc 55
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-6 His-HlgC-R primer
<400> 11
gtggtggtgg tggtgattct gtcctttcac cttgatttca tg 42
<210> 12
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-6 His-HlgC-F primer
<400> 12
ctttaagaag gagatatacc atgctaacga tactgaagac atcggtaaag g 51
<210> 13
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-6 His-LukE-R primer
<400> 13
gtggtggtgg tggtgttatg tcctttcact ttaatttcgt gtgttttc 48
<210> 14
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-6 His-LukE-F primer
<400> 14
ctttaagaag gagatatacc atgaatacta atattgaaaa tattggtgat ggtgctg 57
<210> 15
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-6 His-LukD-R primer
<400> 15
gtggtggtgg tggtgtactc caggattagt ttctttagaa tccg 44
<210> 16
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-6 His-LukD-F primer
<400> 16
ctttaagaag gagatatacc atggctcaac atatcacacc tgtaagcg 48
<210> 17
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-6 His-Hla-R primer
<400> 17
cagtggtggt ggtggtggtg atttgtcatt tcttcttttt cccaat 46
<210> 18
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-6 His-Hla-F primer
<400> 18
aagaaggaga tataccatgg cagattctga tattaatatt aaaaccgg 48
<210> 19
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-6 His-HlaH35L-R primer
<400> 19
gaagaacgat ctatccattt atctttagta ttggtac 37
<210> 20
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-6 His-HlaH35L-F primer
<400> 20
gataaagaaa atggcatgct caaaaaagta ttttatagtt ttatcg 46
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vector-pET28a-R primer
<400> 21
gtgatgatga tgatgatggc tg 22
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vector-pET28a-F primer
<400> 22
caccaccacc accaccactg agatc 25
<210> 23
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-6 His-hlgB-R primer
<400> 23
ttgttagcag ccggatctca tttattgttt tcagtttctt ttgtatctaa caat 54
<210> 24
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-6 His-hlgB-F primer
<400> 24
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac gaaggtaaaa taacacc 47
<210> 25
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-6 His-LukA-R primer
<400> 25
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac aattcagctc ataaagactc tcaagac 57
<210> 26
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-6 His-LukA-F primer
<400> 26
tagtaatccg ccctttcaat attatccttc tttataaggt ttattgtcat cag 53
<210> 27
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-6 His-LukB-R primer
<400> 27
cagtggtggt ggtggtggtg ttatttcttt tcattatcat taagtacttt tacaaa 56
<210> 28
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-6 His-LukB-F primer
<400> 28
tattgaaagg gcggattact aatgaagatt aattctgaaa tcaaacaagt ttc 53
<210> 29
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-6 His-LukAE323A-F primer
<400> 29
tagtaatccg ccctttcaat attatcctgc tttataaggt ttattgtcat cag 53
<210> 30
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-6 His-LukAE323A-R primer
<400> 30
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac aattcagctc ataaagactc tcaagac 57
<210> 31
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> clfA-F primer
<400> 31
ttgttagcag ccggatctca tgaattagaa tcgctgccag aatctga 47
<210> 32
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> clfA-R primer
<400> 32
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac gcatttagtt tagcggcagt agctg 55
<210> 33
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> clfB-F primer
<400> 33
ttgttagcag ccggatctca ttctgggtca accggcggc 39
<210> 34
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> clfB-R primer
<400> 34
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac gttgctgaac cggtagtaaa tgc 53
<210> 35
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sdrC-F primer
<400> 35
ctttaagaag gagatatacc atgagaactt taaatcgcat ggcagtgaat a 51
<210> 36
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sdrC-R primer
<400> 36
cagtggtggt ggtggtggtg tgtatcttcc catacatagt cacctag 47
<210> 37
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sdrD-F primer
<400> 37
ctttaagaag gagatatacc atggcaccta aacgtttgaa tacaagaatg c 51
<210> 38
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sdrD-R primer
<400> 38
cagtggtggt ggtggtggtg atatacttct tgaccagctc cgc 43
<210> 39
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sdrE-F primer
<400> 39
ttgttagcag ccggatctca aattttgtat aacttttctt caggtttaac agta 54
<210> 40
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sdrE-R primer
<400> 40
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac gtaaacgcaa aaatgcgctt tgcag 55
<210> 41
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fnbpA-F primer
<400> 41
ctttaagaag gagatatacc atggtagcgg aagctaagga agctagtaa 49
<210> 42
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fnbpA-R primer
<400> 42
cagtggtggt ggtggtggtg agctgtgtgg taatcaatgt caagag 46
<210> 43
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fnbpB-F primer
<400> 43
taagaaggag atataccatg atgaaaagat caactgacgt tacagc 46
<210> 44
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fnbpB-R primer
<400> 44
cagtggtggt ggtggtggtg cactggcggc tctgatttaa a 41
<210> 45
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-C-fragment1-F primer
<400> 45
gcatcctctc tcgtttcatc ggtatc 26
<210> 46
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-C-fragment1-R primer
<400> 46
caccaccacc accaccactg agatc 25
<210> 47
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-C-fragment2-F primer
<400> 47
catggtatat ctccttctta aagttaaac 29
<210> 48
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-C-fragment2-R primer
<400> 48
gaaacgagag aggatgctca cgatac 26
<210> 49
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-N-fragment1-F primer
<400> 49
gcatcctctc tcgtttcatc ggtatc 26
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-N-fragment1-R primer
<400> 50
tgagatccgg ctgctaacaa agc 23
<210> 51
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-N-fragment2-F primer
<400> 51
gtgatgatga tgatgatggc tgc 23
<210> 52
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET28a-N-fragment2-R primer
<400> 52
gaaacgagag aggatgctca cgatac 26
<210> 53
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T7 promoter
<400> 53
aaattaatac gactcactat agg 23
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T7 terminator
<400> 54
atgctagtta ttgctcagcg g 21
Claims (15)
- Hla(alpha-hemolysin)H35L, LukS(Leukocidal toxin S), LukAE323AB(Leukocidal toxin AE323AB) 및 HlgA(gamma-hemolysin)를 포함하는 포도상구균 유래 독소; 또는 상기 독소를 코딩하는 뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 포도상구균 백신 조성물.
- Hla(alpha-hemolysin)H35L, Luk(Leukocidal toxin)S, LukAE323AB(Leukocidal toxin AE323AB) 및 HlgA(gamma-hemolysin)를 포함하는 포도상구균 유래 독소; 또는 상기 독소를 코딩하는 뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 포도상구균 백신 조성물로 면역화하여 수득한 혈청 유래 IgG를 유효성분으로 포함하는 포도상구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 상기 포도상구균은 메티실린 저항성 포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)인 것을 특징으로 하는 포도상구균 백신 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 포도상구균 백신 조성물은 ClfA(Clumping factor A), FnbpA(fibrinectin-binding protein A), FnbpB(fibrinectin-binding protein B) 및 이들의 기능적 일부로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질; 또는 상기 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 포도상구균 백신 조성물.
- 제 7 항에 있어서, 상기 기능적 일부는 상기 단백질의 N2-N3 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 포도상구균 백신 조성물.
- 제 8 항에 있어서, 상기 포도상구균 백신 조성물은 ClfA의 N2-N3 도메인을 포함하는 일부 절편 및 FnbpB의 N2-N3 도메인을 포함하는 일부 절편; 상기 절편을 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 상기 절편을 코딩하는 뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 포도상구균 백신 조성물.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 상기 포도상구균 백신 조성물은 Coa(Coagulase), vWbp(von Willebrand factor binding protein) 및 이들의 기능적 일부로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질; 또는 상기 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 포도상구균 백신 조성물.
- 제 11 항에 있어서, 상기 Coa의 기능적 일부는 Coa 단백질의 N-말단으로부터 연속된 284개 아미노산 잔기를 포함하는 절편인 것을 특징으로 하는 포도상구균 백신 조성물.
- 제 11 항에 있어서, 상기 vWbp의 기능적 일부는 vWbp 단백질의 N-말단으로부터 연속된 253개 아미노산 잔기를 포함하는 절편인 것을 특징으로 하는 포도상구균 백신 조성물.
- 삭제
- 삭제
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200114435A KR102528412B1 (ko) | 2020-09-08 | 2020-09-08 | 신규한 포도상구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물 |
| JP2023515623A JP2023541387A (ja) | 2020-09-08 | 2021-09-08 | 新規なブドウ状球菌感染疾患の予防または治療用組成物 |
| US18/024,800 US20230310543A1 (en) | 2020-09-08 | 2021-09-08 | Novel composition for prevention or treatment of staphylococcus aureus infectious disease |
| PCT/KR2021/012222 WO2022055252A1 (ko) | 2020-09-08 | 2021-09-08 | 신규한 포도상구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물 |
| EP21867117.0A EP4212168A1 (en) | 2020-09-08 | 2021-09-08 | Novel composition for prevention or treatment of staphylococcus aureus infectious disease |
| CN202180061780.9A CN116761619A (zh) | 2020-09-08 | 2021-09-08 | 用于预防或治疗金黄色葡萄球菌感染性疾病的新型组合物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200114435A KR102528412B1 (ko) | 2020-09-08 | 2020-09-08 | 신규한 포도상구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220032735A KR20220032735A (ko) | 2022-03-15 |
| KR102528412B1 true KR102528412B1 (ko) | 2023-05-04 |
Family
ID=80631952
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020200114435A KR102528412B1 (ko) | 2020-09-08 | 2020-09-08 | 신규한 포도상구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230310543A1 (ko) |
| EP (1) | EP4212168A1 (ko) |
| JP (1) | JP2023541387A (ko) |
| KR (1) | KR102528412B1 (ko) |
| CN (1) | CN116761619A (ko) |
| WO (1) | WO2022055252A1 (ko) |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
| US6703025B1 (en) | 1998-08-31 | 2004-03-09 | Inhibitex, Inc. | Multicomponent vaccines |
| CA2777661C (en) * | 1998-08-31 | 2014-10-21 | Inhibitex, Inc. | Multicomponent vaccines |
| KR20210121313A (ko) * | 2012-05-09 | 2021-10-07 | 콘트라펙트 코포레이션 | 그람 양성 박테리아에 대한 박테리오파지 리신과 항생제의 병용물 |
| RU2017139800A (ru) * | 2015-04-17 | 2019-05-17 | Арсанис Байосайенсиз Гмбх | Комбинированный препарат антител против staphylococcus aureus |
-
2020
- 2020-09-08 KR KR1020200114435A patent/KR102528412B1/ko active IP Right Grant
-
2021
- 2021-09-08 JP JP2023515623A patent/JP2023541387A/ja active Pending
- 2021-09-08 WO PCT/KR2021/012222 patent/WO2022055252A1/ko active Application Filing
- 2021-09-08 US US18/024,800 patent/US20230310543A1/en active Pending
- 2021-09-08 CN CN202180061780.9A patent/CN116761619A/zh active Pending
- 2021-09-08 EP EP21867117.0A patent/EP4212168A1/en active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Toxins, 제11권, 339-359면 (2019)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2023541387A (ja) | 2023-10-02 |
| EP4212168A1 (en) | 2023-07-19 |
| CN116761619A (zh) | 2023-09-15 |
| KR20220032735A (ko) | 2022-03-15 |
| US20230310543A1 (en) | 2023-10-05 |
| WO2022055252A1 (ko) | 2022-03-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gutekunst et al. | The novel fibrinogen-binding protein FbsB promotes Streptococcus agalactiae invasion into epithelial cells | |
| JP2013521759A (ja) | 緑膿菌の血清型ｂ型リポ多糖に対する抗体 | |
| JP2013150614A (ja) | モラクセラ・カタラーリスと上皮細胞、細胞外マトリックス蛋白質及び補体系の相互作用 | |
| US20210379173A1 (en) | Staphylococcus pseudintermedius virulence factor compositions | |
| KR102528412B1 (ko) | 신규한 포도상구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물 | |
| US10981979B2 (en) | Human monoclonal antibodies to Staphylococcus aureus lukab toxin | |
| KR20230036828A (ko) | 신규한 포도상구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물 | |
| RU2387715C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНЫЕ ДНК, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЕ ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ Р6, Р7, Р8, ОБЛАДАЮЩИХ ПРОТЕКТИВНЫМИ СВОЙСТВАМИ В ОТНОШЕНИИ STREPTOCOCCUS AGALACTIAE И СЕЛЕКТИВНО-СВЯЗЫВАЮЩИХ IgA | |
| Abouelkhair | Molecular and Functional Characterization of Key Staphylococcus pseudintermedius Virulence Proteins: Paving the Way for Vaccine Development | |
| Hou et al. | Mechanism of Action for an All-in-One Monoclonal Antibody Against Staphylococcus aureus Infection | |
| US20100173842A1 (en) | Vaccine for staphylococcal infections | |
| EP3541424A1 (en) | Chimeric antibodies comprising binding domains of phage lysins, bacterial autolysins, bacteriocins, and phage tail or tail fibers | |
| Lenkey | Using phage display to select peptides binding to type 8 capsular polysaccharide of Staphylococcus aureus | |
| US20090220538A1 (en) | vaccine for staphylococcal infections | |
| Henningham | Characterisation of anchorless cell-surface proteins: novel candidates for a safe and universal group a streptococcal vaccine | |
| Böhm | Immune evasion proteins from Staphylococcus aureus and therapeutic evaluation of staphylococcal complement-controlling proteins |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right |